Przedmiotem wynalazku jest srodek dezodoru¬ jacy, zawierajacy jako substancje czynna inhibi¬ tor proteinazy pochodzenia bakteryjnego.'Wiadomo, ze niektóre inhibitory proteinaz po¬ chodzenia roslinnego lub zwierzecego mozna sto¬ sowac jako dezodoranty (DOS nr 1939 419).Wymienione inhibitory proteinaz mozna stosowac jedynie w roztworach wodnych, poniewaz z po¬ wodu ich nieznacznej rozpuszczalnosci w rozpusz¬ czalnikach organicznych, np. metanolu, etanolu, izopropanolu i butanolu nie moga byc stosowane w srodkach aerozolowych. Ponadto sposób ich wy¬ twarzania w porównaniu z baikteryjnyni sposobem wytwarzania jest znacznie drozszy.Stwierdzono, ze inhibitor proteinazy o wzorze podanym na rysunku ma silne dzialanie dezodo¬ rujace zarówno w postaci czystej, lub jako suro¬ wy inhibitor, otrzymany w procesie [mikrobiolo¬ gicznym bez dokladnego oczyszczania.Niespodziewanie inhibitor o podanym wzorze wykazuje silniejsze dzialanie dezodorujace, niz juz znane inhibitory zwierzecego lub roslinnego po¬ chodzenia. Dzialanie dezodorujace inhibitora o podanym wzorze polega na inaktywacji enzy¬ mów zarówno proteolitycznych, jak i estrolitycz- nych. Inhibitor proteinaz o podanym wzorze wzbogaca zatem stan techniki w tej dziedzinie.Inhibitor proteinaz o podanym wzorze jest juz znany (The Journal of Amtibiotios, tom XXV, nr 4, strony 263—270 (1972) i Enzyme Inhibitors of Microbial Origin by H. Umezawa, Universi,ty Park Press, Baltimore (1972) strony 29—32).Do jego wytworzenia mozna stosowac równiez szczepy rodzaju Streptomyces michiganensis CBS 538.68. Rodzaj Streptomyces michiganensis jest opisany przez Korbaza et al., Arch. Microbiol. 26 (1957) strona 192.Szczególnie odpowiedni szczep CBS 538.68 jest juz zlozony od roku 1968 w Centraalibureau voor Schimmelcultures w Baarn, Holandia. Ponadto szczepy Ami 634, Halde 1160 opisane w Arch.Microbiol. 32 (1959) strona 187, wytwarzajace in- hibitor proteinaz, sa zlozone w Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn Holandia pod numerami CBS 194.73 i CBS 193.73.Do wytwarzania inhibitora o podanym wzorze stosuje sie pozywki oraz temperature zwykle sto- B0 sowane przy hodowli Streptomycetes.Do wytwarzania inhibitora nadaje sie zwlasz¬ cza pozywka, skladajaca sie ze skrobi kukury¬ dzianej, glikozy, hydrolizatu kazeiny i wyciagu drozdzowego. Zamiast skrobi kukurydzianej i gli- kozy mozna tez stosowac gliceryne, sorbit, mannit i inazyt oraz mieszaniny tych substancji, bedacych zródlem wegla. Równiez zamiast hydrolizatu ka¬ zeiny i wyciagu drozdzowego mozna stosowac make sojowa lub pepton, lub wyciag miesny.W pewnych pozywkach produkcje substancji czyn- 886243 88624 4 nej moze przyspieszyc dodatek soli stabilizuja¬ cych wartosc pH, np. CaCOs lub fosforanów po¬ tasu, lub sodu.Stezenie substancji odzywczych w pozywce moze wahac sie w szerokim przedziale. Korzyst¬ nie do wytworzenia inhibitora o podanym wzo¬ rze stosuje sie pozywke o skladzie: 2% kwasu maleinowego, 1% glikozy, 0,5% hydrolizatu ka zeiny, 1% ekstraktu drozdzowego^ i 0,4% CaCOs.Sterylizacje prowadzi sie przez 1 godzine w tem¬ peraturze 121°C. Przy przeprowadzaniu sposobu pozywki sterylizuje sie w zwykly sposób za po¬ moca pary. Kulture zaszczepia sie 0,3—10%, ko¬ rzystnie 1—5% kultury posiewowej i prowadzi sie fermentacje przy intensywnym napowietrzeniu w temperaturze 20^0°G, korzystnie 25—30°C do uzyskania maksymalnego stezenia inhibitora, co trwa korzystnie 2—5 dni.Wydzielenie surowego inhibitora z cieczy po¬ fermentacyjnej po oddzieleniu z niej grzybni przez odwirowanie lub odsaczenie mozna przepro¬ wadzic w rózny sposób. a) Zateza sie ciecz pofermentacyjna pod zmniej¬ szonym cisnieniem (10—50 tor) w temperaturze lazni 20—100°€, korzystnie 40—80°C do okolo 1/5—1/10 objetosci poczatkowej. Zatezony ekstrakt saczy sie lub odwirowuje i klarowny przesacz (klarowna ciecz znad osadu) liofilizuje sie. b) Wytraca sie nieaktywne substancje towarzy¬ szace z cieczy pofermentacyjnej lub z cieczy za- tezonej wedlug a) przez dodanie rozpuszczalnych w wodzie rozpuszczalników organicznych np. al¬ koholi lub ketonów, korzystnie metanolu, etanolu, acetonu do zawartosci 60—80%. Wytracony osad oddziela sie przez odwirowanie lub odsaczenie i przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizuje. c) Wysala sie nieaktywne substancje towarzy¬ szace z cieczy pofermentacyjnej lub cieczy zate- zonej wedlug a), na przyklad za pomoca siarcza¬ nu amonu, soli kuchennej, itp. Wytracony osad oddziela sie przez odwirowanie lub saczenie i przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i po uprzednim odsoleniu liofilizuje sie. d) Ekstrahuje sie inhibitor z cieczy pofermenta¬ cyjnej lub cieczy zatezonej wedlug a) przez wy¬ trzasanie z n-butanolem. Wyciag butanolowy za¬ teza sie pod zmniejszonym cisnieniem i liofilizuje. e) Adsorbuje sie nieaktywne substancje czynne na wymiennikach jonowych, korzystnie na slabo zasadowych wymiennikach odmiany Amberlite 45 OH- z cieczy pofermentacyjnej lub cieczy zate¬ zonej wedlug a). Eluat zateza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. f) Traktuje sie ewentualnie zatezona wedlug a) ciecz pofermentacyjna adsorbentami, korzystnie weglem aktywnym i/lub mikroporowata zywica polistyrenowa, przy czym praktycznie inhibitor wiaze sie calkowicie. Desorpcje prowadzi sie za pomoca rozpuszczalnych w wodzie rozpuszczalni¬ ków organicznych, np. metanolem, etanolem, izo- propanolem, acetonem, korzystnie 80% etanolem, w srodowisku kwasnym lub obojetnym, korzyst¬ nie przy pH = 2, w temperaturze 30—80°C, ko¬ rzystnie 60°C.Desorbat zateza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem i liofilizuje sie.Inhibitor o podanym na rysunku wzorze otrzy¬ muje sie kazdorazowo w postaci stalego surowego inhibitora i wedlug ogólnie znanych .sposobów (np. chromatografii na wymiennikach jonowych, chro¬ matografii adsorpcyjnej i/lub elektroforezy) moz¬ na go doprowadzic do czystej postaci.Stosujac Streptomyces michiganensis, mozna otrzymac w malych ilosciach inne inhibitory pro- teinazy typu zwiazków o podanym wzorze, które równiez maja wlasciwosci dezodorujace.Substancje czynne o podanym wzorze wykazuja przy dobrej tolerancji (brak dzialan ubocznych równiez u osób wrazliwych) silne dzialanie dezo¬ dorujace u ludzi.Inhibitor o podanym wzorze mozna stosowac w postaci czystej, a równiez bardzo korzystnie w postaci surowej otrzymanej w procesie mikrobio¬ logicznym, zawierajacej substancje towarzyszace, które nie przeszkadzaja. Mozna zatem eliminowac proces dokladnego oczyszczania, który wymaga du¬ zych nakladów i jest drogi.Preparaty zawieraja substancje czynna o po¬ danym wzorze w postaci czystej lub w postaci su¬ rowej, uzyskanej w procesie mikrobiologicznym bez dalszego oczyszczania, substancje pomocnicze takie, jak nietoksyczne, obojetne niedrazniace skó¬ ry stale, pól stale i ciekle rozcienczalniki, roz¬ puszczalniki, wypelniacze, srodki pomocnicze, sub¬ stancje kosmetyczne, srodki konserwujace i/lub zapachowe i w przypadku aerozoli substancje ae- rozolotwórcze.Preparatami, zawierajacymi substancje czynna o podanym wzorze w postaci czystej lub surowej, otrzymanej w procesie mikrobiologicznym bez dal¬ szego oczyszczania, sa np. preparaty w postaci roztworów emulsji, masci, kremów, zeli, plynów do zmywan, mydla, pudrów, aerozoli i kredek.Zasadniczo mozna otrzymywac wszystkie pre¬ paraty, stosowane w kosmetyce jako srodki de¬ zodorujace (Hermann Rompp, Chemae-Dexicon, 6 wydanie, tom 1, wiersze 1402—1403).Na przyklad mascie, pasty, kremy, zele moga zawierac oprócz substancji czynnej wszystkie zwy¬ kle stosowane substancje pomocnicze, np. tlusz¬ cze roslinne i zwierzece woski, parafine, skrobie, tragakant, pochodne celulozy, glikole polietyleno¬ we, silikony, bentonity, kwas krzemowy, talk, tle¬ nek cynku i mieszaniny tych substancji.Równiez pudry i aerozole moga zawierac oprócz substancji czynnej zwykle substancje pomocnicze, np. cukier mlekowy, talk, kwas krzemowy, wo¬ dorotlenek glinu, krzemian wapnia i proszek po¬ liamidowy lub mieszaniny tych substancji. Aero¬ zole moga zawierac zwykle -substancje aerozolo- twórcze np. chlorofluoroweglowodory.Roztwory i emulsje moga zawierac oprócz sub¬ stancji czynnej zwykle substancje pomocnicze, np. rozpuszczalniki, rozcienczalniki i emulgatory, np. wode, alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, weglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, 36 40 45 .50 95 0088624 6 benzoesan, benzylu, glikol propylenowy, 1,3-buty- lenoglikol,' dwumetyloformamid, oleje, zwlaszcza olej bawelniany, arachidowy, kukurydziany, oli-% we, olej rycynusowy i sezamowy, gliceryne, glice- 5 rynoformal, alkohol czterowodorofurfurylowy, gli¬ kole polietylenowe i estry kwasów tluszczowych z sorbitanem lub mieszaniny tych substancji. Ae¬ rozole zawieraja zwykle stosowane srodki aerozo- lotwórcze, np. fluorochloroweglowodory. 10 Ze wzgledu na wysoka skutecznosc i dobra to¬ lerancje przez organizm substancji czynnej o po¬ danym wzorze zawartosc substancji czynnej w po¬ danych preparatach moze wahac sie w bardzo sze¬ rokich granicach. 16 Szczególnie korzystne sa preparaty zawierajace substancje czynne o podanym wzorze w ilosci okolo 0,05—10, korzystnie 0,1—1, zwlaszcza 02— —0,5 czesci wagowej. Optymalna zawartosc sub¬ stancji czynnej moze latwo ustalic fachowiec na 3° podstawie swej wiedzy.Preparaty substancji czynnej moga zawierac oprócz substancji czynnej o podanym wzorze, rów¬ niez inne dzialajace dezodorujace substancje bio¬ chemiczne lub chemiczne. • Wyzej wymienione preparaty wytwarza sie we¬ dlug ogólnie znanych sposobów np. przez zmie¬ szanie substancji czynnej o podanym wzorze z kazdorazowymi substancjami pomocniczymi, a w przypadku wytwarzania uformowanych ksztaltek 30 przez nastepne odlewanie lub prasowanie miesza¬ nin w odpowiednich formach.Substancje czynna o podanym wzorze oraz jej preparaty stosuje sie w postaci srodków dezodo- rujacych, stosowanych u ludzi naskórnie dla za- as pobiegania, zmniejszania lub usuwaniu niepoza^ danego zapachu ciala.Substancja czynna wzglednie preparaty zawie¬ rajace ja, mozna nanosic na skóre w dowolny rózny sposób, np. przez smarowanie, opryskiwa- *° nie itp. Ze wzgledu na bardzo wysoka skutecz¬ nosc i tolerowanie przez skóre substancji o poda¬ nym wzorze ilosc substancji czynnej naniesiona na skóre moze zawierac sie w bardzo szerokim przedziale. Ciekle preparaty mozna nanosic np. 45 w ilosci 0,1 ml/cm2 skóry. W odpowiednich ilos¬ ciach mozna stosowac pozostale preparaty. Opty¬ malna dawke w zaleznosci od preparatu moze ustalic\ fachowiec na podstawie swej wiedzy.Przyklady dezodorujacych preparatów, zawiera- 6° jacych substancje czynna o podanym wzorze w postaci czystej lub surowej.Aerozol. Miesza sie 0,2 g substancji czynnej o wzorze podanym na rysunku, 0,7 g perfum, 0,7 gliceryny, 0,7 g mirystynianu izopropylu, 3,5 g *5 glikolu dwupropylowego i 64,2 g etanolu i w na¬ czynku cisniendowym traktuje sie 12 g CC12F2 i 18 g C2ClaF4.Aerozol: Miesza sie 1,0 g substancji czynnej o wzorze podanym na rysunku, 0,5 g perfumy, w 90,0 g izopropanolu i 10,0 g jednooctanu glicery¬ ny. 20 g takiej mieszaniny traktuje sie w naczyn¬ ku cisnieniowym 80 g mieszaniny CC12F2 i C2C12F2.Kredka: Miesza sie 8,0 g stearynianu sodu, ,0 g sorbitu, 75,0 g glikolu propylenowegOj 10,0 g ¦* wody, 1,75 g perfum, i 0,25 g substancji czynnej- o podanym wzorze i w odpowiedniej formie od¬ lewa sie w postaci kredek.Krem: Miesza sie 19 g fenolosulfonianu glinu, ,0 g alkoholu cetylowego, 25,0 g parafiny, 12,0 g laurylosiarczanu sodowego i 3,0 g wody. Miesza sie 9,9 g tak otrzymanej mieszaniny z 0,1 g sub¬ stancji czynnej o wzorze podanym na rysunku.Krem: Miesza sie 20,0 g substancji czynnej o wzorze podanym na rysunku. 35,0 g etoksylo- wanych estrów kwasów tluszczowych i sorbita- nu (Tween 60R), 30,0 g estrów kwasów tluszczo¬ wych i sorbitanu, 150, g lanoliny, 30,0 g oleju arachidowego, 5,0 g oleju silikonowego, 5,0 g al¬ koholu cetylowego, 20,0 g tylozy, 75,0 g sorbitu i 620,0 g wody.Puder: 5,0 g tlenku cynku, 0,9 substancji czyn¬ nej o wzorze podanym ha rysunku, 5,0 g dwu¬ tlenku tytanu, 10,0 g CaC03, 0,9 g lanoliny, 1,0 g alkoholu cetylowego, 30 g siarczanu glinowo-so- dowego, 5,0 g kwasu salicylowego, 2,0 g kwasu bornego traktuje sie perfumami i talkiem do otrzymania 100 g mieszaniny. Skladniki miesza sie dokladnie.Puder: Miesza sie 1,5 g dw-ulauryndaniu glicery¬ ny, 0,8 g substancji czynnej o wzorze podanym na rysunku, 0,£ g stearynianu glinu, 0,3 g tlenku cynku, 52,0 g talku i 45 g skrobi kukurydzianej.Doskonale dzialanie dezodorujace inhibitora po¬ twierdzaja nizej podane próby.Do prób przystapilo 20 kobiet i f4 mezczyzn wykonywujacych w oiagu dnia srednia do ciezkiej prace fizyczna.Dwaj pracownicy wyszkoleni w branzy kosme¬ tyczne-perfumeryjnej prowadzilo niezaleznie oce¬ ne zapachu w podwójnej próbie.Wyniki podano w tablicach 1—4.Próba 1 Osoby doswiadczalne myly rano pierwszego dnia próby miejsca pod pachami tylko woda i nie uzy¬ waly preparatów dezodorujacych i mydla. Na po¬ czatku pracy przeprowadzono test zapachowy pod pachami.Nastepnie jedno miejsce pod pacha natarto 1 ml roztworu 0,2 g inhibitora wedlug wynalazku o po¬ danym wzorze w 99 g mieszaniny alkohol-woda (1:1). Nastepnie osoby poddawane próbie udaly sie do normalnej pracy. Po zakonczeniu pracy, a wiec po 9 godzinach poddano testowi zapacho¬ wemu miejsca pod pachami traktowane i nie- traktowane.Osoby poddawane próbie nie mogly sie myc ani wieczorem ani jutro rano srodkami dezodoruja- cymi lub mydlem. Dozwolono jedynie scieranie suchym recznikiem.Rano nastepnego dnia {drugiego) przeprowadzo¬ no test zapachowy na poczatku pracy.Próba 2 Porównanie z inhibitorem proteinazy pochodze¬ nia zwierzecego.Próbe przeprowadzono tak, jak próbe 1 Jako substancje porównawcza stosowano inhi¬ bitor proteinazy wolowej, bedacy zasadowym po- lipeptydem o ciezarze czasteczkowym 6512, zawie-7 88624 8 stosowano inhibitor proteinazy z ziemniaka w 4°/o- -owym roztworze wodnym. Okazalo sie, ze dezo- dorujace dzialanie 0,2°/o-owego roztworu zwiaz¬ ku o wzorze, podanym na rysunku, odpowiada okolo 4%-owemu roztworowi substancji porów¬ nawczej.Ocene intensywnosci zapachu przeprowadzono wedlug nastepujacych liczb umownych (tablice 1—«. 0 = brak zapachu ciala; + = umiarkowany zapach ciala; + + — wyrazny zapachciala; J + + + = nieprzyjemnie silny zapach ciala.Tablica 1 A. Kobiety Oisoba testowana Nr 1 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 16 17 1 18 1 19 1 20 Test poczat¬ kowy rano 1 dnia nie- traktowane 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +' + + + +; + + + + Wieczorem 1 dnia Nietrak- towane 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1 + + Trakto¬ wane 4 + + + + ¦+ + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Rano Nietrak- towane + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 dnia Trakto¬ wane 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Tablica 2 B. Mezczyzni Osoba testowana Nr 1 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 1 14 Teist poczat¬ kowy rano 1 dnia nie- traktowane 2 + + + + + + + + + +,+ + + + + 0 0 0 + 0 + 0 + Wieczorem 1 dnia Nietrak- towane 3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Trakto¬ wane 4 + + + + + + + + 0 0 0 + 0 + 0 +4- Rano 2 dnia' Nietrak- towane + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Trakto¬ wane 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1 + +¦'-' 1 rajacym 16 róznych aminokwasów w lancuchu za¬ wierajacym ogólem 58 reszt aminokwasów (inhi¬ bitor kallikreiny/RMrypsyny).Substancje czynna o podanym wzorze stosowano 6 w stezeniu 0,2% wagowych, a substancje porów¬ nawcza w stezeniu l°/o wagowy. Jako rozpusz¬ czalnik stosowano mieszanine woda-etanol 1: 1.Próba 3 Porównanie z inhibitorem proteinazy roslinnego io pochodzenia.Próbe przeprowadzono tak, jak próbe 1 Substancje stosowano w postaci 0,2%-owego roztworu wodnego. Jako substancje porównawcza88624 Tablica 3 A. Kobiety Osoba testowana Nr 1 2 3 4 1 5 6 7 8 9 1 10 Test poczat¬ kowy rano 1 dnia nie- traktowane + + + + + + + + + + + + + + + + + + Wieczorem 1 dnia 1 + + 0 + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + Rano 2 dnia 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + 2 + + + ++ + +(+) ++ ++ + + + +(+) + + + + + + 1 = inhibitor o podanym wzorze 2 = inhibitor Kalitkreiny (R) — trypsyny z narzadów bydlecych (178 FIP — TIE mg) Tablica 4 B. Mezczyzni Osoba testowana Nr 1 2 3 4 6 7 8 1 9 Test poczat¬ kowy rano 1 dnia nie- traktowane ++ + ++ + ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Wieczorem 1 dnia 1 + + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Rano 2 dnia 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + +¦+ + + 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Wyniki prób podane w tablicach 1 i 2 wyka¬ zuja, ze w przypadku stosowania 0,2tyo wagowo wodno-alkoholowego roztworu inhibitora wyste¬ puje bardzo dobre do dobrego dzialania dezodo- rujace, które utrzymuje sie w wystarczajacym okresie czasu. Wodny 0,2°/o wagowo roztwór in¬ hibitora wykazuje podobne dzialanie.Wyniki podane w tablicach 3 i 4 oraz próba 3 wykazuja jednoznacznie przewage substancji czyn¬ nej o wzorze podanym na rysunku nad inhibito¬ rami pochodzenia zwierzecego i roslinnego. • Taikie same wyniki, jak w przypadku stosowa¬ nia czystego zwiazku o podanym wzorze osiaga sie równiez stosujac surowy inhibitor, otrzymany w procesie mikrobiologicznym i nie poddany oczyszczaniu, przy czym w próbach stosowano za¬ miast 0,2f/o wagowo czystego inhibitora lf/o wa¬ gowo surowy inhibitor.Sposób wytwarzania substancji czynnej o wzo¬ rze podanym na rysunku, zwlaszcza wytwarzania surowego inhibitora objasniaja nizej podane przy¬ klady.Przyklad I. Do termentetora wprowadza sie 45 55 60 05 120 litrów pozywki o skladzie: 2Vo skrobi kuku¬ rydzianej, l°/o glikozy, l°/« wyciagu drozdzowego, 0,5% hydrolizatu kazeiny i 0,4°/o CaCOs, odpie- nionej przed sterylizacja za pomoca 0,1% obje¬ tosciowego silikonowego srodka przeciwpianowe- go, zaszczepia sie w sterylnych warunkach 1 li¬ trem kultury posiewowej szczepu CBS 538.68 (otrzymanej w tych samych warunkach w kol¬ bach wstrzasanych) i inkubuje sie w temperatu¬ rze 28°C przy silnym mieszaniu i napowietrzaniu i otrzymuje sie po 41 godzinnej fermentacji ciecz pofermentacyjna, zawierajaca wedlug nizej opi¬ sanego testu 120 FIP — TIE/ml.Po oddzieleniu grzybni przez odwirowanie prze¬ sacz kultury (100 litrów) traktuje sie weglem ak¬ tywnym o uziarnieniu 3 mm (75 mg/ml), miesza sie przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Wegiel aktywny wydziela sie z roztworu i nie¬ aktywny przesacz odrzuca sie.Inhibitor desorbuje sie z wegla aktywnego w temperaturze 60°C 40 litrami 80tyo-owego etano¬ lu, zawierajacego kwas solny (pH == 2) i proces ten powtarza sie. stosujac 30 litrów etanolu, za-88624 11 12 kwaszonego kwasem solnym (pH = 2). Polaczone desorbaty alkalizuje sie za pomoca NaOH do pH = = 6,8 i zateza sie do okolo 2,5 litrów. Nastepnie ; litrów rozcienczonego wocia 1: 1Q ekstraktu z » wegla aktywnego traktuje sie 3 kg wstepnie trak¬ towanej (przemytej czystym metanolem) mikro- / porowatej zywicy polistyrenowej i miesza, sie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po od¬ saczeniu nieaktywnej cieczy eluuje sie inhibitor 10 stopniowo mieszaninami o róznym stezeniu etanolu i wody. Najwieksza- czesc inhibitora desorbuje z zywicy 30*/t etanolem (3 X 10 litrów).Celem odbarwienia ciemnobrazowego koncen¬ tratu traktuje sie slabo zasadowym wymiennikiem 15 jonowym w postaci OH" przez zanurzenie i eluat zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem i liofili¬ zuje.Aktywnosc wlasciwa inhibitora, uzyskanego w ten sposób wynosi 182 F.I.P. — jednostefc/mg. Wy- 20 dajnosc: otrzymuje sie T g substancji stalej, za¬ wierajacej inhibitor o podanym wzorze, który mozna stosowac bezposrednio jako substancje de- zodorujaca.Przyklad II. Do 1 litrowej kolby Erlenma- -*. yera wprowadza sie pozywke- o ^skladzie: 2% skro¬ bi kukurydzianej, 1% glikozy, l°/o wyciagu droz¬ dzowego, 0,5V» hydrolizatu kazeiny i 0,4°/o CaCOs, sterylizuje sie przez 1 godzine w temperaturze 121°C, zaszczepia sie 1 ml 3 dniowej kultury po- *° siewowej szczepu CBS 538.68 w takiej samej po¬ zywce i inkubujesie przez 3 dni w wytrzasarce w temperaturze 28°C, otrzymujac ciecz pofermen¬ tacyjna, która wedlug nizej opisanego..testu za¬ wiera 100 F.I.P. Jednostek inhibitora trypsyny 35 w 1 ml.Obróbke koncowa/prowadzi sie wedlug przykla¬ duI. [\ Przyklad III. Do 1 litrowej kolby Erlen- 40 mayera wprowadza sie 120 ml pozywki o skla¬ dzie: 2*/o skrobi kukurydzianej, le/o glikozy, l°/o wyciagu drozdzowego, 0,5% hydrolizatu kazeiny i 9,4«/« CaCpj, sterylizuje sie przez 1 godzine w temperaturze 121°C, zaszczepia sie i ml* 2 dnio¬ wej kultury:posiewowej szczepu Ami 634 = CBS 194-73 w takiej samej pozywce i po/inkubacji w ciagu 2 dni VW wytrzasarce w temperaturze 28°C otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, która we¬ dlug nizej podanego testu zawiera w 1 ml 2,75 FIP jednostek inhibitora trypsyny. M ~ Obróbka prowadzi sie wedlug przykladu I.Przyklad: IV. Do litrowej kolby Erlenmayera wprowadza sie- 120 ml pozywki ó skladzie: 2% skrobi kukurydzianej, "l§/o glikozy, !•/• ekstraktu drozdzowego, 0,5*/o hydrolizatu kazeiny i 0;4*/o w GaCO,, sterylizuje sie przez 1 godzine w tempe¬ raturze 121?C; po czym zaszczepia sie 1 ml 3 dnio¬ wej ^kultury posiewowej szczepu Halde 1160 = = CBS 193.73 w takiej samej pozywce i po 3 dniowej inkubacji w wytrzasarce w temperaturze w 28°C otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, która «wedlug: nizej, podanego testu zawiera w 1 ml 130 FIR t.jechjostek; inhibitora . trypsyny. _ _ £r Obróbke^ koncowa -prowadzi. sie^- wedlug przy- Przyklad V. Do 1 litrowej kolby Erlenma¬ yera wprowadza sie 120 ml pozywki o skladzie: 3% maki sojowej, 3% gliceryny, 0*2§/t CaCO,, ste¬ rylizuje sie przez 1 godzine w temperaturze 121°C, po czym zaszczepia 1 ml 3 dniowej kultury po¬ siewowej "szczepu 538.68 w takiej samej pozywce i po 3 dniowej inkubacji w wytrzasarce w tem¬ peraturze 28°C otrzymuje sie ciecz pofermenta¬ cyjna, o zawartosci 90 FIP TIE/ml.Obróbke koncowa prowadzi sie wedlug przy¬ kladu I Przyklad VI. Do 1 litrowej kolby Erlen¬ mayera wprowadza sie 120 ml pozywki o skla¬ dzie: 0,5Vo peptonu, O^/o wyciagu miesnego, 0,2ty« wyciagu drozdzowego, 0,030/o hydralizatu kazeiny, l*/o inozytu, l°/o sorbitu, 1% mannitu, !•/• glikozy, 0,l°/o K2HP04, 0,5«/o KCl, 0,05°/o MgS04, 0,Ol°/o FeS04, sterylizuje sie przez 1 godzine w tempe¬ raturze 121°C, po czym zaszczepia sie 1 ml 3 dnio¬ wej kultury posiewowej szczepu CBS 538.68 w ta¬ kiej samej pozywce i po 3 dniowej inkubacji w wytrzasarce w temperaturze 28°C otrzymuje sie ciecz pofermentacyjna, która wedlug nizej poda¬ nego testu zawiera FIP — TIE/ml.Obróbke koncowa prowadzi sie wedlug przy¬ kladu L Substancje, otrzymane w przykladach I—VI, za¬ wieraja substancje czynna o podanym wzorze, któ¬ ra mozna wydzielic z tych substancji w znany sposób. Poniewaz substancje towarzyszace nie przeszkadzaja, mozna równiez stosowac surowe produkty. ¦.Inaktywujace dzialanie na enzymy surowego in¬ hibitora mozna ustalic, stosujac nastepujaca me¬ tode.Test trypsyny i inaktywatora trypsyny wedlug FIP H. Ruyssen, Symposium on Pharmaceutical Enzymes and their Assay, Mai 24, 1968.Odczynniki: 0,02 m BAEE/chlorowodorek estru etylowego N^a-benzoilo-,argininy, 0,0015 m bufor boranowy pH = 8,0, 0,1 n NaOH, trypsyna 100-FIP jednostek/ml, roztwór inhibitora.Sposób wykonania: Mierzenie hamowanja estrólitycznej aktywnosci w stalej temperaturze (25°C) i stalej wartosci pH (8,0) w autatitratorze.D e f J n i c j a je d n o s tk i FIP. Jednostka in¬ hibitora trypsyny FIP jest jego ilosc w mg, która inaktywuje calkowicie jednostke FIP trypsyny (wyrazona jako szybkosc hydrolizy mikrompla BAEE na minute. PL