Sposób wyodrebniania cefalosporyny C Wynalazek dotyczy wyodrebniania cefalosporyny C z plynów fermentacyjnych.Wyodrebnianie antybiotyków rozpuszczalnych w wodzie stwarza czesto duze trudnosci, zwlaszcza jesli plyn fermentacyjny zawiera równiez substan¬ cje zanieczyszczajace o wlasnosciach zblizonych do wlasnosci fizycznych i chemicznych antybiotyku.Znamy jest sposób stosowania jonitów do wyod¬ rebniania antybiotyków slabo kwasnych lub slabo zasadowych, w tym równiez cefalosporyny C.Zasadnicza wada tego sposobu jest mala selek¬ tywnosc jak i zdolnosc adsorpcyjna jonitów, gdyz jonity moga adsorbowac eefalosporyne C z wyso¬ ka wydajnoscia jedynie z czystych roztworów, a nie z zanieczyszczonych roztworów fermentacyj¬ nych. Stosowanie jonitów poliaminowych, polisty¬ renowych lub stanowiacych pochodne kwasu poli- metakrylowego równiez nie rozwiazuje problemu adsorpcji cefalosporyny z roztworów hodowlanych, podobnie, jak i próby usuniecia zanieczyszczen za pomoca laczenia róznych jonitów, na przyklad kwasnych i zasadowych, w których po wstepnym oczyszczeniu roztworu adsorpcja antybiotyku prze¬ biegala zazwyczaj ze znacznymi stratami.Stwierdzono, ze mozna adsorbowac cefalospory- ne C z roztworów zanieczyszczonych ubocznymi produktami fermentacji, jak i wstepnie oczyszczac te roztwory za pomoca makroporowatych zywic niejonowych o wybitnie rozwinietej powierzchni adsorpcyjnej. Zywice te adsorbuja ilosciowo, z do¬ lo 15 25 30 skonala wydajnoscia rozpuszczalna w wodzie eefa¬ losporyne C z roztworów zwlaszcza fermentacyj¬ nych, przy czym wieksza czesc zanieczyszczen po¬ zostaje w roztworze. Mozna w ten sposób oddzielic do 85% zanieczyszczen, towarzyszacych cefalospo- rynie i zaadsorbowana prawie ilosciowo cefalospo- ryne mozna na przyklad eluowac, wodnym roztwo¬ rem alkoholu. Mozna równiez zwiekszyc zdolnosc adsorpcyjna zywicy przez wstepne ekstrakcyjne usuniecie z niej zanieczyszczen lipofilowyeh.Ekstrakcje przeprowadza sie korzystnie w kwas¬ nym zakresie pH, na przyklad okolo 2, stosujac nie mieszajacy sie z woda rozpuszczalnik lub miesza¬ nine rozpuszczalników, albo korzystnie ciekly jo¬ nit, na przyklad Amberlit LA-2 wraz z rozpuszczal¬ nikiem, nie mieszajacym sie z woda lub mieszani¬ na rozpuszczalników w zakresie pH od okolo 2 — 7. Jako nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki mozna na przyklad stosowac alifatyczne, cykloali- fatyczne, aralifatyczne i aromatyczne weglowodory, o najwyzej 12 atomach wegla, które ewentualnie moga byc podstawione przez atomy chlorowców, jak bromu, fluoru, zwlaszcza chloru, np. heksan, heptan, cykloheksan, benzyna, eter naftowy o tem¬ peraturze wrzenia 110—140°C, nafta o temperaturze wrzenia 210—240°C, czterochlorek wegla, chloro¬ form, chlorek metylenu, metylochloroform, chlorek etylenu, perchloroetylen, perfluoroetylen, bromek izopropylu, benzoen, toluen, ksyleny, nastepnie estry, zwlaszcza nisko alkilowe nizszych kwasów tluszczo- 8129581295 3 4 wych, jak octan etylu, octan butylu, octan arnylu, ketony, jak keton metylo-izobutylowy, keton me- tyloizoamylowy, etery, Jak eter dwuizopropylowy albo nie mieszajace sie z woda lub nieznacznie mieszajace sie alkohole, jak butanol, 2-etylobutanol, etyloheksanol, cykiopenitanol, cykloheksanol.Z roztworów cefalosporyny C, otrzymanych przez eluowanie makroporowatych zywic adsorpcyjnych, antybiotyk oczyszcza sie przy pomocy zwyklych jonitów do tego stopnia, ze mozna z tych eluatów wydzielic cefalosporyne C w postaci czystego kwa¬ su lub wykrystalizowac jako trudno rozpuszczalna sól. Tak otrzymany produkt nadaje sie do dalszej bezposredniej przeróbki na kwas 7-amino-cefalo- sporanowy i jetfo aktywne acylowane pochodne.Sposób* wedlug wynalazku polega na tym, ze roztwory, w którycli cefalosporyna C wystepuje w mieszaninie 'zanieczyszczen pochodzacych z pro¬ cesu fermentacji, "Ewentualnie wstepnie oczyszczo¬ ne przez ekstrakcje za pomoca rozpuszczalników lipofilowych i/albo jonitów cieklych w zakresie pH = okolo 2—7, poddaje sie absorbcji na makro¬ porowatych, niejonowych zywicach adsorpcyjnych o aromatycznym usieciowaniu i przecietnej wiel¬ kosci porów 4 — 20 nm i powierzchni 100 — 1000 m2/g w zakresie pH=l — 8, po czym zaadsor- bowany antybiotyk eluuje sie i ewentualnie pod¬ daje dalszemu oczyszczaniu w znany sposób i wy¬ odrebnia w postaci wolnej, badz soli albo zwiazku kompleksowego.Jako makroporowate, niejonowe zywice adsorp- cyjne o aromatycznym usieciowaniu i o przeciet¬ nej srednicy porów od 4 — 20 nm, korzystnie 7 — 10 nm moga byc uzywane zywice polistyrenowe o powierzchni od 100 — 1000 m2/g, na przyklad wystepujace w handlu pod nazwa Amberlit XAD — 1, XAD — 2, XAD — 4, XAD — 5 i inne znane kopolimery styreno-dwuwinylobenzenowe (Rohm, Hass CO).Zywica adsorpcyjna dziala sie celowo w zakre¬ sie pH = 1 — 8, korzystnie w zakresie 2 — 4. Ta¬ ki poziom pH mozna Otrzymac, stosujac dowolny kwas, na przyklad kwas organiczny, jak szczawio¬ wy, lub kwas nieorganiczny, jak solny, fosforowy, a zwlaszcza siarkowy. Wskazane jest zakwaszenie brzeczki fermentacyjnej przed filtracja i nastep¬ nie filtrowanie, celowo w obecnosci pomocniczego srodka filtracyjnego.Roztwór hodowlany, po ewentualnej ekstrakcji wstepnej, poddaje sie w zwykly sposób dzialaniu zywicy adsorpcyjnej. Korzystnie pracuje sie, sto¬ sujac kolumny zawierajace zloze zywicy. Adsorp¬ cja ma miejsce w czasie przeplywu roztworu przez kolumne. Wyciek nie zawiera lub zawiera tylko nieznaczne ilosci antybiotyku.Za pomoca wody wypiera sie pozostaly roztwór z kolumny. Wyciek pochodzacy z przemywania wo¬ da nie zawiera lub zawiera tylko nieznaczne ilosci antybiotyku.Do eluowania antybiotyku z zywicy mozna sto¬ sowac mieszaniny wody i rozpuszczalników orga¬ nicznych, mieszajacych sie z woda, zwlaszcza [roz¬ twory nizszych alkoholi, korzystnie 10 — 20% roztwór izopropanolu w wodzie.Po regeneracji zywicy odpowiednie sa zasadowe wodne lub alkoholowowodne roztwory, na przyklad 1 N roztwór wodorotlenku sodu, w mieszaninie me¬ tanolu i wody (1:1).Pozostalosc lugu sodoWego mozna usunac przez 5 przemywanie kwasem, np. kwasem siarkowym i/lub woda. Regeneracje mozna prowadzic równiez i podchlorynem sodu, przy czym srodek utleniaja¬ cy mozna usunac z kolumny srodkiem redukcyj¬ nym, np. roztworem kwasnego siarczynu sodowego !P lub tiosiarczanu sodowego. Dzialajac kombinacja wymienionych srodków regeneracyjnych, mozna regeneracje uzupelnic acetonem lub mieszanina wody z acetonem.Calkowity proces adsorpcji i regeneracji zywicy 15 mozna prowadzic w zwykly sposób okresowo lub sposobem ciaglym w poszczególnych kolumnach lub w ich bateriach.Eluat, zawierajacy cefalosporyne C, mozna w zwykly sposób dalej oczyszczac, korzystnie na za- 20 sadowych jonitach, jak „Amberlit" IR — 4B (fe- nolopoliamina z pierwszorzedowymi i drugorzedo- wymi grupami aminowymi), „Amberlit" IRA — 68 (spolimeryzowany kwas metakrylowy), „Amberlit" XE — 265 (poliamina), Imac A 13 T, albo Imac 25 A 17 P (firmy Imacti-Maatsch). Jonity te wykazuja, przy adsorpcji cefalosporyny C z eluatu, wyraznie wieksza zdolnosc adsorpcyjna anizeli dla przesa¬ czu brzeczki. Z roztworów w ten sposób oczyszczo¬ nych po zageszczeniu mozna wytracic cefalospory- 30 ne C w postaci wolnego kwasu, np. za pomoca mieszajacych sie z woda rozpuszczalników orga¬ nicznych takich, jak aceton lub izopropanol lub wydzielic w postaci trudno rozpuszczalnych, dro- bno-krystalicznych kompleksów metali ciezkich, 35 np. kompleksu miedzi, rteci, kadmu, olowiu, man¬ ganu, zelaza, kobaltu, niklu, a zwlaszcza w posta¬ ci kompleksu cynku (porównac belgijski patent Nr 734 565).Wynalazek ilustruja nastepujace przyklady, w 40 których temperature podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. Po wytworzeniu maksymalnej ilosci cefalosporyny C przez szczep gatunku Ce- phalosporium, roztwór hodowlany oziebiono do temperatury 15°C, a nastepnie doprowadzono do 45 wartosci pH=2,8 — 3,0 za pomoca 50% (% wagowo objetosciowy) kwasu siarkowego, po czym grzy¬ bnie i pozywke odsaczono za pomoca pomocnicze¬ go srodka filtrujacego, jak „Dicalite", otrzymujac brunatno-zabarwiony przesacz o wartosci pH=3, 50 który zawieral 2,1 g cefalosporyny C i 5,4% wago¬ wych suchej pozostalosci.Nastepnie w znany sposób przygotowano kolum¬ ne adsorpcyjna przez wypelnienie rury szklanej o srednicy 10 cm 6 1 wodnego roztworu zywicy 55 Amberlit XAD — 2, wypelnionej do wysokosci 76 cm, i otrzymany wyzej przesacz w ilosci 6 li¬ trów przepuszczono z szybkoscia 6 l/godzine przez kolumne. Przesacz wypiera sie przy tej samej pre¬ dkosci przeplywu 3 litrami odjonizowanej wody, 60 po czym kolumne eluowano 10% wodnym roztwo¬ rem izopropanolu.Wycieki z adsorpcji i przemywania zbiera sie w 1,5 litrowych frakcjach, a zólto-pomaranczowy elu¬ at w 1 litrowych. Zywice „Amberlite" XAD-2 re- 65 generuje sie 1 n roztworem wodno-metanolowym5 81295 6 wodorotlenku sadu, po wymyciu od którego woda zywica gotowa jest do ponownej adsorpcji.W wyniku przeprowadzonych oznaczen stwier¬ dzono, iz zarówno odciek, jak i woda z przemycia oraz pierwsze frakcje eluatu zawieraja okolo 65 — 70% zanieczyszczen, przy czym pierwsze frak¬ cje eluatu zawieraly sladowe ilosci cefalosporyny.Zebrano 12 1 eluatu, w którym znajdowalo sie 95% cefalosporyny C, obok 20 — 25 % zanieczysz¬ czen, zawartych uprzednio w macierzystym roztwo¬ rze. Eluat nie zawieral jonów nieorganicznych.Przyklad II. 4 1 przesaczu hodowlanego, za¬ wierajacego 2,2 g cefalosporyny C w litrze, otrzy¬ manego w sposób, jak opisano w przykladzie I, lecz zakwaszonego kwasem szczawiowym zamiast kwa¬ sem siarkowym, poddaje sie adsorpcji w sposób, jak opisano w przykladzie I, ale z ta róznica, ze przesacz przepuszcza sie z szybkoscia 12 1/godz, przez te sama zywice „Amberlite" XAD-2, po czym reszte przesaczu usuwa sie 3 1 odjonizowanej wo¬ dy i kolumne eluuje 12 1 10% wodnego roztworu alkoholu izopropylowego.Celem regeneracji jonitu „Amberlite" XAD-2 przeprowadza sie przez kolumne roztwór podchlo¬ rynu sodowego, zawierajacy 3% aktywnego chloru, a nastepnie 4 1 0,2% roztworu kwasnego siarczynu sodowego, po czym ponownie zaczyna sie cykl ad¬ sorpcji przy uzyciu 4 1 przesaczu hodowlanego. Po kilku nastepujacych po sobie cyklach, przecietna wydajnosc cefalosporyny C w aktywnych frakcjach eluatu, niezawierajacego jonów nieorganicznych, wynosi 85,2%, przy czym 9,2% cefalosporyny C znaj¬ duje sie w pierwszych frakcjach eluatu, zawiera¬ jacych jeszcze jony nieorganiczne, z których mozna wyodrebnic antybiotyk za pomoca jeszcze jednej ekstrakcji adsorpcyjnej. Aktywne eluaty glówne zawieraja 30 — 35% zanieczyszczen zawartych w filtracie hodowlanym.Przyklad III. 30 1 przesaczu hodowlanego, zawierajacego 2,10 g cefalosporyny C w 1 litrze roztworu, otrzymanego w sposób, jak opisano w przykladzie I, poddaje sie adsorpcji z predkoscia 30 l/godzine w kolumnie o srednicy 15 cm, wypel¬ nionej 30 1 jonitu „Amberlite" XAD — 2. Przesacz hodowlany wypiera sie z kolumny 15 1 odjonizo¬ wanej wody, a kolumne eluuje 60 1 10% wodnego alkoholu izopropylowego, z predkoscia 60 1/godz.Wiekszosc cefalosporyny C znajduje sie w 45 1 eluatu. Jonit „Amberlite" XAD — 2 poddaje sie nastepnie regeneracji przez nastepujace po sobie perkolacje 15 1 1 n lugu sodowego, 10 1 0,2 n kwa¬ su siarkowego i 30 1 wody, po czym na nowo uzy¬ wa sie do adsorpcji 30 1 przesaczu hodowlanego.Srednia wydajnosc cefalosporyny C, otrzymanej w kilku kolejno po sobie nastepujacych cyklach, zawartej w aktywnych frakcjach eluatu, wolnych od nieorganicznych anionów, wynosi 95%, przy czym 3% cefalosporyny C znajduje sie w pierw¬ szych frakcjach eluatu, które zawieraja jony chlo¬ ru i jony siarczanowe. Z tych frakcji mozna otrzy¬ mac antybiotyk przez przeprowadzenie jeszcze je¬ dnej ekstrakcji adsorpcyjnej.Aktywne eluaty glówne zawieraja 28% zawartej w filtracie hodowlanym suchej masy. Jonit „Am¬ berlite" IRA — 68 zawiesza sie w 10% wodnym roztworze alkoholu izopropylowego, po czym za¬ wiesina wypelnia kolumne szklana o 5 cm sredni¬ cy. Objetosc wypelnienia wynosi 1 litr. Na te kolumne podaje sie 45 1 poprzednio otrzymanego 5 eluatu, zawierajacego 1367 mg cefalosporyny C w 1 litrze, przy zawartosci substancji stalych 0,684%.Predkosc adsporpcji wynosi 10 l/godzine. Roztwór adsorpcyjny wypiera sie 1 1 wody uzyskujac wy¬ cieki adsorpcyjny i po przemyciu zawierajace 3% io cefalosporyny C i okolo 35 — 40% zanieczyszczen, zawartych w roztworze adsorpcyjnym.Cefalosporyne C eluuje sie buforem pirydyno-oc- tanowym o stezeniu 0,44 M pirydyny i 0,2 M kwa¬ su octowego o wartosci pH=5,5. Predkosc eluowa- 15 nia wynosi 1 litr/godzine. 92,3% doprowadzonej ilosci cefalosporyny znaj¬ duje sie w 3 1 eluatu glównych frakcji o zawartos¬ ci 18,5 g cefalosporyny C w litrze. Dalsze 3% znaj¬ duje sie w 1,25 1 frakcji ubocznych. 20 Frakcje glówne o pH=4,9 zadaje sie 185 g octa¬ nu cynku. Do klarownego roztworu doprowadza sie, mieszajac, 3 1 alkoholu izopropylowego w cia¬ gu 20 minut. Przy koncu wprowadzania tego alko¬ holu zaczyna krystalizowac kompleks cefalospory- 25 ny C z cynkiem. Mieszanine oziebia sie do tempe¬ ratury 2°C i miesza w tej temperaturze w ciagu czterech godzin. Wydzielony osad odsacza sie na nuczy i przemywa dwa razy, po 300 ml wody i 300 ml acetonu, a nastepnie suszy pod obnizonym cis- 30 nieniem w temperaturze 40°C.Wydajnosc kompleksu cefalosporyny C z cyn¬ kiem wynosi 36,6 g. Jest to bialy proszek, w któ¬ rym pomiar adsorpcji w ultrafiolecie wykazuje za¬ wartosc 91,6 % cefalosporyny. 35 Przyklad IV. Proces adsorpcji i eluowania przeprowadzono wedlug sposobu, opisanego w przykladzie III, ale z ta róznica, ze zastosowano „Amberlite" XE — 265, zamiast „Amberlite" IRA — 68, przy czym adsorpcji poddano cefalosporyne 40 C z 50 litrów eluatu, otrzymanego wedlug przykla¬ du III z kolumny wypelnionej Amberlitem XAD — 2. Wyciek po adsorpcji i przemyciu zawiera 5,9 % doprowadzonej cefalosporyny C i okolo 40 — 45% zanieczyszczen, zawartych w roztworze ad- 45 sorpcyjnym.Cefalosporyne C eluuje sie buforem pirydyno-oc- tanowym w sposób, jak opisano w przykladzie III; 75,4% doprowadzonej ilosci cefalosporyny C znaj¬ duje sie w 4 1 eluatu glównych frakcji o zawartos- 50 ci 12,05 g cefalosporyny C w litrze. Dalsze 9,5% znajduje sie w 2,75 1 frakcji ubocznych.Glówne frakcje zageszcza sie do 400 ml i otrzy¬ many koncentrat wprowadza, przy mieszaniu, do 4,8 1 alkoholu izopropylowego. Obfity osad odsacza 55 sie na nuczy, przemywa 200 ml alkoholu izopropy¬ lowego i 200 ml acetonu i nastepnie suszy pod obnizonym cisnieniem w temperaturze 40°C, otrzy¬ muje sie 45 g substancji w postaci proszku o bar¬ wie bezowej, który wedlug testu biologicznego skla- 60 da sie w 84,3 % z cefalosporyny C. Wydajnosc re¬ akcji stracania wynosi 56 %. Pozostala ilosc cefa¬ losporyny C, zawarta w lugu pokrystalicznym, mo¬ zna w wiekszosci wydzielic po zageszczeniu i po¬ nownym wytraceniu. 65 p r z y k l a d V. Kolumne szklana o srednicy7 81295 8 2,5 cm napelnia sie 200 ml jonitu, „Amberlite" XAD-2 w wodzie, po czym na kolumne wprowa¬ dza sie 200 ml przesaczu hodowlanego, otrzymane¬ go wedlug przykladu I, zawierajacego 1,96 g cefalo- sporyny C w 1 litrze roztworu, który uprzednio zakwasza sie kwasem siarkowym do pH=2. Utrzy¬ muje sie szybkosc przeplywu 400 ml/godzine, po czym przesacz wypiera sie 100 ml dejonizowanej wody, a cefalosporyne C eluuje sie 10% wodnym roztworem alkoholu izopropylowego. Kolumne re¬ generuje sie w sposób, jak opisano w przykladzie II, i stosuje ponownie do adsorpcji.Perkolat i frakcje z przemywania nie zawieraja cefalosporyny C. Pierwsze frakcje eluatu, wykazu¬ jace jeszcze obecnosc nieorganicznych anionów, za¬ wieraja 8 °/o, a pozostale frakcje eluatu 90 % cefa¬ losporyny C, zawartej uprzednio w filtracie hodo¬ wlanym.Przyklad VI. 30 litrów filtratu hodowlanego, otrzymanego w sposób, jak opisano w przykladzie II, a zawierajacego 2,12 g cefalosporyny C i okolo 34 g zanieczyszczen w litrze, poddaje sie ekstrakcji przeciwpradowej za pomoca 15 1 roztworu, zawie¬ rajacego 5 % jonitu „Amberlite" LA — 2 w po¬ staci wolnej zasady w etyloheksanolu. Ilosc czesci rozpuszczalnych w ekstrahowanym filtracie hodo¬ wlanym zmniejsza sie z 3,6 °/o na okolo 3,35 %, 12 1 ekstrahowanego przesaczu hodowlanego zakwa¬ sza sie 50 °/o kwasem siarkowym do poziomu pH odpowiadajacego 2,7 i przeprowadza z predkoscia 6 litrów na godzine przez 6 litrów jonitu „Amberli¬ te" XAD — 2, a nastepnie wypiera 3 litrami dejo¬ nizowanej wody.Wyciek nie zawiera cefalosporyny C. Zaadsorbo- wana cefalosporyne C eluuje sie 12 1 10 °/o wodne¬ go roztworu alkoholu izopropylowego. Eluat zawie¬ ra 97 % zawartej w filtracie hodowlanym cefalo¬ sporyny C (okolo 2 % znajduje sie w zawierajacej sole frakcji wstepnej). W eluacie obecne sa jeszcze zanieczyszczenia, pochodzace z filtratu hodowlane¬ go w ilosci 15 °/o.„Amberlite" XAD — 2 poddaje sie regeneracji w sposób podany w przykladzie II i dodatkowo przepuszcza jeszcze 3 litry roztworu aceton — wo¬ da w stosunku 1:1. Aceton wypiera sie woda, po czym kolumna gotowa jest do nastepnej adsorpcji. PL PL