PL240303B1 - Nanostructured lipid carriers stabilized with phosphatidylcholine and method of their preparation - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy nanostrukturalnych nośników lipidowych NLC, charakteryzujących się tym, że zawierają lipid ciekły będący mieszaniną trójglicerydów kwasu kapronowego i kaprylowego, oraz że stabilizowane są amfoterycznym surfaktantem z grupy fosfolipidów a mianowicie 1,2-di-(10E,12Z-oktadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiną oraz niejonowym surfaktantem polioksyetylenowanym monooleinianem sorbitanu. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania tych nanostrukturalnych nośników.The invention concerns nanostructured lipid carriers NLC, characterized by the fact that they contain a liquid lipid which is a mixture of caproic and caprylic acid triglycerides, and that they are stabilized with an amphoteric surfactant from the phospholipid group, namely 1,2-di-(10E,12Z-octadecadienoyl)-sn- glycero-3-phosphocholine and the non-ionic surfactant polyoxyethylene sorbitan monooleate. The invention also relates to a method for obtaining these nanostructured carriers.

Description

PL 240 303 B1PL 240 303 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku są nanostrukturalne nośniki lipidowe stabilizowane fosfatydylocholiną, które mogą znaleźć zastosowanie w formulacjach kosmetycznych oraz farmaceutycznych jako nośniki hydrofobowych związków aktywnych.The subject of the invention are nanostructured lipid carriers stabilized with phosphatidylcholine, which can be used in cosmetic and pharmaceutical formulations as carriers for hydrophobic active compounds.

Koloidalne systemy dostarczania leków, takie jak stałe nanocząsteczki lipidowe (SLN) oraz nanostrukturalne nośniki lipidowe (NLC), od kilku dekad zyskują coraz większe zainteresowanie. W sensie fizykochemicznym są to cząstki lipidowe zdyspergowane w wodzie i stabilizowane dodatkiem środków powierzchniowo czynnych (surfaktantów). Charakteryzują się one kulistym kształtem, dużym stosunkiem pola powierzchni do objętości oraz rozmiarami w zakresie od 50 do 1000 nm. Ich głównymi zaletami jest: brak toksyczności względem organizmów żywych, zwiększenie biodostępności hydrofobowych związków aktywnych, których są nośnikami, ukierunkowanie działania oraz selektywności tych związków pozwalające ograniczyć ich możliwe skutki uboczne i negatywne oddziaływanie na komórki zdrowe. Dodatkowo enkapsulacja związku aktywnego umożliwia jego kontrolowane uwalnianie oraz ochronę przed degradacją wynikającą z działania czynników środowiska, takich jak: tlen, światło czy wilgoć. Tego typu nośniki lipidowe mogą więc być wykorzystywane w opracowywaniu terapii celowanej (S. M. Pyo i inni, Muller, Encapsulation by nanostructured lipid carriers. In Nanoencapsulation Technologies for the Food and Nutraceutical Industries, 2017, 114-137).Colloidal drug delivery systems, such as solid lipid nanoparticles (SLN) and nano-structured lipid carriers (NLC), have gained increasing interest for several decades. In the physicochemical sense, these are lipid particles dispersed in water and stabilized by the addition of surfactants (surfactants). They are characterized by a spherical shape, high surface area to volume ratio and sizes ranging from 50 to 1000 nm. Their main advantages are: no toxicity to living organisms, increased bioavailability of hydrophobic active compounds they are carriers, targeting of action and selectivity of these compounds allowing to limit their possible side effects and negative impact on healthy cells. In addition, the encapsulation of the active compound enables its controlled release and protection against degradation resulting from environmental factors such as oxygen, light or moisture. Such lipid carriers can therefore be used in the development of targeted therapy (S. M. Pyo et al., Muller, Encapsulation by nanostructured lipid carriers. In Nanoencapsulation Technologies for the Food and Nutraceutical Industries, 2017, 114-137).

Dokumenty US5250236(A1) oraz EP605497(B2) ujawniają pierwszą generacją lipidowych nanonośników leków jakimi są stałe nanocząstki lipidowe (SLN), które opracowane zostały jednocześnie przez dwie grupy badawcze. SLN składają się z lipidowego rdzenia o strukturze krystalicznej, który pozostaje stały w temperaturze pokojowej oraz temperaturze ciała. Opracowanie tego typu nośników było odpowiedzią na wady dotychczas stosowanych formulacji na bazie nanoemulsji, wynikające z dużej mobilności (dyfuzji) enkapsułowanego związku z lipidu ciekłego do fazy wodnej. Zastosowanie stałego lipidu o dużej lepkości pozwoliło na ograniczenie procesu dyfuzji, jednakże z uwagi na niską rozpuszczalność związków aktywnych w lipidach stałych, wynikającą z wysokiego stanu uporządkowania rdzenia krystalicznego, zdolność załadunku jest ograniczona, jak również możliwe jest szybsze jego wypieranie podczas długotrwałego przechowywania w wyniku zmian polimorficznych struktury lipidu.Documents US5250236 (A1) and EP605497 (B2) disclose the first generation of lipid drug nanocarriers, which are solid lipid nanoparticles (SLN), which were developed simultaneously by two research groups. SLNs consist of a lipid core with a crystal structure that remains constant at room temperature and body temperature. The development of this type of carriers was a response to the disadvantages of the so far used formulations based on nanoemulsions, resulting from the high mobility (diffusion) of the encapsulated compound from the liquid lipid to the water phase. The use of a solid lipid with high viscosity allowed to limit the diffusion process, however, due to the low solubility of active compounds in solid lipids, resulting from the high order of the crystal core, the loading capacity is limited, as well as its faster displacement during long-term storage due to changes polymorphic lipid structure.

Nowsza generacja lipidowych nanonośników - nanostrukturalne nośniki lipidowe (NLC), poprzez zastosowanie mieszaniny lipidu stałego z ciekłym o przestrzennie różnej budowie cząsteczek powoduje zmniejszenie stopnia uporządkowania struktury krystalicznej matrycy i przez to zwiększenie możliwości załadunku związku aktywnego, a także zmniejsza zjawisko jego wypierania z wnętrza rdzenia lipidowego (P. Ganesan i D. Narayanasamy, Sustainable Chemistry and Pharmacy, 2017, 6, 37-56).The newer generation of lipid nanocarriers - nanostructured lipid carriers (NLC), through the use of a mixture of solid and liquid lipids with a spatially different structure of molecules, reduces the degree of ordering of the crystal structure of the matrix and thus increases the possibility of loading the active compound, and reduces the phenomenon of its displacement from the inside of the lipid core (P. Ganesan and D. Narayanasamy, Sustainable Chemistry and Pharmacy, 2017, 6, 37-56).

Podstawowymi składnikami formulacji lipidowych nanocząsteczek jest faza dyspersyjna - woda lub jednorodna mieszanina wody i rozpuszczalników organicznych, która stanowi od 70 do nawet 99%. Składnikami fazy zdyspergowanej, w której zamykany jest związek aktywny są związki niepolarne lipidy, takie jak: woski, mono-, di- lub trójglicery średnio lub długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, wolne kwasy tłuszczowe, alkohole tłuszczowe czy steroidy (np. cholesterol). Stanowią one zwykle od kilku do kilkunastu procent składu formulacji. Większość z lipidowych komponentów nanocząstek SLN i NLC posiada status GRAS (z ang. Generally Recognised As Safe) co oznacza, że są one nietoksyczne dla organizmów żywych. Najczęściej wykorzystywanymi lipidami stałymi do produkcji nanocząstek lipidowych są: trimirystynian oraz tristearynian glicerolu, monobehenian, monostearynian lub monopalmitynian glicerolu, kwas stearynowy, palmitynowy, behenowy, palmitynian cetylu, alkohol stearynowy lub cetylowy. W nanocząstkach typu NLC wykorzystuje się również lipidy ciekłe - oleje, takie jak: trójglicerydy kwasu kapronowego i kaprylowego, kwas oleinowy lub naturalne oleje (olej sojowy, rycynowy) (S.U. Rawal i M.M. Patel, Lipid nanoparticulate systems. Lipid Nanocarriers for Drug Targeting, 2018, 49-138).The basic components of the lipid nanoparticle formulations are the dispersion phase - water or a homogeneous mixture of water and organic solvents, which makes up from 70 to even 99%. The components of the dispersed phase in which the active compound is enclosed are non-polar compounds, lipids, such as waxes, mono-, di- or triglycers of medium or long-chain fatty acids, free fatty acids, fatty alcohols or steroids (e.g. cholesterol). They usually constitute from a few to a dozen or so percent of the formulation composition. Most of the lipid components of SLN and NLC nanoparticles have the GRAS status (Generally Recognized As Safe), which means that they are non-toxic to living organisms. The most commonly used solid lipids for the production of lipid nanoparticles are: glycerol trimristate and tristearate, glycerol monobehenate, monostearate or monopalmitate, stearic acid, palmitic acid, behenic acid, cetyl palmitate, stearic alcohol or cetyl alcohol. NLC type nanoparticles also use liquid lipids - oils such as caproic and caprylic acid triglycerides, oleic acid or natural oils (soybean oil, castor oil) (S.U. Rawal and M.M. Patel, Lipid nanoparticulate systems. Lipid Nanocarriers for Drug Targeting, 2018 , 49-138).

Surfaktanty i emulgatory w swojej budowie posiadają hydrofilową głowę oraz hydrofobowy ogon. Dzięki swojej amfipatycznej budowie powodują obniżenie napięcia powierzchniowego pomiędzy dwoma niemieszającymi się fazami - fazą wodną oraz lipidem. Odgrywają dzięki temu dwie bardzo ważne role: ułatwiają dyspergowanie roztopionego lipidu w fazie wodnej, co jest niezbędne do wytworzenia odpowiednio małych cząstek oraz stabilizują nanocząstki po ochłodzeniu wytworzonej w wyniku homogenizacji emulsji. Surfaktanty, ze względu na ich chemiczną strukturę, można sklasyfikować jako: jonowe (kationowe i anionowe), niejonowe i amfoteryczne. Dobierając odpowiedni surfaktant podczas opracowywania składu formulacji nanocząstek lipidowych należy wziąć pod uwagę szereg czynników takich jak: wpływ na wielkość i polidyspersyjność, sposób podania postaci leku, rolę jaką będzie odgrywałSurfactants and emulsifiers in their structure have a hydrophilic head and a hydrophobic tail. Due to their amphipathic structure, they reduce the surface tension between the two immiscible phases - the water phase and the lipid phase. Thanks to this, they play two very important roles: they facilitate the dispersion of the lipid melt in the aqueous phase, which is necessary to produce sufficiently small particles, and they stabilize the nanoparticles after cooling the emulsion produced as a result of homogenization. Due to their chemical structure, surfactants can be classified as: ionic (cationic and anionic), non-ionic and amphoteric. When selecting the appropriate surfactant, when developing the composition of lipid nanoparticle formulations, a number of factors should be taken into account, such as: the impact on the size and polydispersity, the method of administration of the drug form, the role it will play

PL 240 303 B1 surfaktant podczas degradacji lipidu w układach in vivo. Co więcej, należy również zwrócić uwagę na toksyczność, kompatybilność z innymi składnikami formulacji, możliwie jak najmniejszą jego ilość użytą do przygotowania formulacji, niski koszt wytworzenia formulacji i jej, wszechstronne zastosowanie (R. Shah i inni, Springer Briefs in Pharmaceutical Science & Drug Development, 2015, 1-93). Zwykle zawartość surfaktantu w formulacjach SLN i NLC zawiera się w zakresie od 0,5% do 5% (w/v) (J. Pardeike, i inni, International Journal of Pharmaceutics, 2009, 366 (1-2), 170-184). Surfaktanty niejonowe mają tą przewagę nad jonowymi, że charakteryzują się znacznie niższą toksycznością i efektem drażniącym, co jest istotne gdy lek ma być podawany doustnie lub pozajelitowo (D. McCIements i J. Rao, Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2011,51 (4), 285-330).Surfactant during lipid degradation in in vivo systems. Moreover, attention should also be paid to the toxicity, compatibility with other ingredients of the formulation, the smallest possible amount used to prepare the formulation, the low cost of the formulation and its versatile application (R. Shah et al., Springer Briefs in Pharmaceutical Science & Drug Development , 2015, 1-93). Typically, the surfactant content of SLN and NLC formulations ranges from 0.5% to 5% (w / v) (J. Pardeike, et al., International Journal of Pharmaceutics, 2009, 366 (1-2), 170-184 ). Non-ionic surfactants have the advantage over ionic surfactants that they are characterized by a much lower toxicity and irritating effect, which is important when the drug is to be administered orally or parenterally (D. McCIements and J. Rao, Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2011,51 ( 4), 285-330).

Ze względu na małą biozgodność stosowanych syntetycznych surfaktantów i możliwość wywołania przez nie niepożądanych efektów ubocznych, coraz większą uwagę kieruje się w stronę wykorzystania w tej roli związków naturalnych, a zatem nietoksycznych, mających właściwości emulgujące i dyspergujące, takich jak na przykład fosfolipidy (PL).Due to the low biocompatibility of the synthetic surfactants used and the possibility of causing undesirable side effects by them, more and more attention is being paid to the use of natural compounds, therefore non-toxic, having emulsifying and dispersing properties, such as, for example, phospholipids (PL).

Fosfolipidy to związki naturalne będące podstawowym składnikiem budulcowym błon komórkowych organizmów żywych, a zatem wykazujące z nimi biozgodność. W swojej strukturze fosfolipidy posiadają fragment hydrofilowy składający się z reszty fosforanowej połączonej estrowo z alkoholoaminą (choliną lub etanoloaminą) lub inozytolem, wykazujący duże powinowactwo do wody i innych polarnych rozpuszczalników oraz część niepolarną (hydrofobową) składającą się z dwóch łańcuchów reszt kwasów tłuszczowych związanych estrowo ze szkieletem węglowym glicerolu w pozycji sn-1 i sn-2. W literaturze naukowej i patentowej dostępnych jest wiele doniesień na temat wytwarzania lipidowych nanocząstek z wykorzystaniem naturalnych fosfolipidów w charakterze surfaktantu, takich jak chemicznie czysta fosfatydylocholina (PC), lecytyna pochodząca z żółtka jaja kurzego lub lecytyna sojowa.Phospholipids are natural compounds that are the basic building blocks of cell membranes in living organisms, and therefore exhibit biocompatibility with them. In their structure, phospholipids have a hydrophilic fragment consisting of a phosphate residue ester linked to an alcoholamine (choline or ethanolamine) or inositol, showing a high affinity for water and other polar solvents, and a non-polar (hydrophobic) part consisting of two chains of fatty acid residues esterically bound to carbon skeleton of glycerol in sn-1 and sn-2 positions. There are many reports in the scientific and patent literature on the preparation of lipid nanoparticles using natural phospholipids as a surfactant, such as chemically pure phosphatidylcholine (PC), egg yolk-derived lecithin or soy lecithin.

W publikacji międzynarodowej zgłoszenia WO2013105101 (A1) opisano sposób wytwarzania nanocząstek lipidowych do enkapsulacji hydrofilowych i amfifilowych leków takich jak izoniazyd, ryfampicyna, pirazynamid i innych. Jako składnik matrycy lipidowej stałych nanocząstek lipidowych (SLN) w podanych przykładach przygotowania wykorzystano behenian glicerolu lub kwas stearynowy lub mieszaninę tych dwóch lipidów, a jako stabilizator użyto niejonowych surfaktantów - polisorbatu 80 oraz lecytyny sojowej (PHOSPHOLIPON® 90H), gdzie lecytyna stanowiła 99% całkowitej ilości surfaktantów. Zastosowana metoda tworzenia mikroemulsji opierała się na przygotowaniu w pierwszej fazie mieszaniny surfaktantów w wodzie oraz stopienia lipidów. Obie fazy podgrzewano do temperatury 90°C, a następnie do lipidu dodawano roztwór surfaktantów i leku przy ciągłym mieszaniu. Tak przygotowaną mikroemulsję wlewano do zimnej wody (2°C) przy ciągłym mieszaniu (5 000 rpm), które kontynuowano przez 30 minut lub przez roztwór mikroemulsji przepuszczano azot przez czas 2 h w celu uzyskania nanocząstek SLN. Otrzymane w ten sposób nanocząstki lipidowe charakteryzowały się wielkością w przedziale 110-130 nm oraz niskim indeksem polidyspersyjności (<0,3).The international publication WO2013105101 (A1) describes a method of producing lipid nanoparticles for the encapsulation of hydrophilic and amphiphilic drugs such as isoniazid, rifampicin, pyrazinamide and others. As a component of the lipid matrix of solid lipid nanoparticles (SLN) in the given preparation examples, glycerol behenate or stearic acid or a mixture of these two lipids were used, and non-ionic surfactants - polysorbate 80 and soy lecithin (PHOSPHOLIPON® 90H) were used as a stabilizer, where lecithin constituted 99% of the total the amount of surfactants. The method of creating a microemulsion was based on the preparation in the first phase of a mixture of surfactants in water and the melting of lipids. Both phases were heated to 90 ° C, and then a solution of surfactants and drug was added to the lipid with continuous mixing. The microemulsion prepared in this way was poured into cold water (2 ° C) with continuous stirring (5,000 rpm) which was continued for 30 minutes or nitrogen was purged through the microemulsion solution for 2 h in order to obtain SLN nanoparticles. The obtained lipid nanoparticles were characterized by a size in the range of 110-130 nm and a low polydispersity index (<0.3).

W amerykańskim opisie US20130243848(A1) ujawniono sposób wytwarzania nanocząstek lipidowych o przedłużonym uwalnianiu mogących znaleźć zastosowanie w terapii genowej. Skład tych nanocząstek zawierał koniugat siRNA z lipidem kationowym znajdujący się w matrycy złożonej z lipidu stałego (tristearynian glicerolu) otoczonego monowarstwą lipidową złożoną z lecytyny sojowej ora z 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-(metoksy(polietylenoglikolu) (DSPE-PEG) w proporcji lecytyna : DSPE-PEG 0,2-0,5 : 0,1-0,2. Zgodnie z opisaną metodą otrzymano nanocząstki o wymiarach 150-800 nm.US20130243848 (A1) discloses a method for producing sustained release lipid nanoparticles that can be used in gene therapy. The composition of these nanoparticles consisted of a conjugate of siRNA with a cationic lipid contained in a matrix composed of a solid lipid (glycerol tristearate) surrounded by a lipid monolayer composed of soy lecithin ora with 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (methoxy (polyethylene glycol)). ) (DSPE-PEG) in the ratio of lecithin: DSPE-PEG 0.2-0.5: 0.1-0.2 According to the method described, nanoparticles with dimensions of 150-800 nm were obtained.

Z amerykańskiego opisu zgłoszenia US20170035701(A1) znany jest również sposób wytwarzania formulacji farmaceutycznych będącymi dyspersją lipidów stabilizowanych przez naturalne fosfolipidy lub glikol polialkilenowy zakończony fragmentem lipidowym. Wskazano ich zastosowanie jako nanonośniki leków (docetaksel, amfoterycyna B, irynotekan), składników aktywnych nutraceutycznie (kurkumina, resweratrol, honokiol, magnolol, kwercetyna) lub tych słabo rozpuszczalnych w wodzie. Jako surfaktant stosowano lecytynę sojową, lecytynę z żółtka jaja kurzego lub syntetyczne fosfolipidy osobno lub wraz z koniugatami lipidu z polietylenoglikolem lub PEGylowanymi fosfolipidami. Otrzymane nośniki charakteryzowały się wielkością cząstek w zakresie 90-155 nm, indeksem polidyspersyjności w przedziale 0,05-0,8 i stopniem enkapsulacji powyżej 50%.From the US application US20170035701 (A1) there is also known a method of producing pharmaceutical formulations being a dispersion of lipids stabilized by natural phospholipids or a polyalkylene glycol terminated with a lipid fragment. Their use as nanocarriers for drugs (docetaxel, amphotericin B, irinotecan), nutraceutical active ingredients (curcumin, resveratrol, honokiol, magnolol, quercetin) or poorly soluble in water has been indicated. Soy lecithin, egg yolk lecithin or synthetic phospholipids alone or together with lipid conjugates with polyethylene glycol or PEGylated phospholipids were used as the surfactant. The obtained carriers had a particle size in the range of 90-155 nm, a polydispersity index in the range of 0.05-0.8 and the degree of encapsulation over 50%.

Powyższe przykłady zastosowania fosfolipidów w formulacjach farmaceutycznych odnoszą się do związków, których główną funkcją jest emulgowanie i stabilizowanie dyspersji nanocząsteczek lipidowych. Do tej pory w literaturze naukowej i patentowej opisano nieliczne zastosowania fosfolipidów będących koniugatami z biologicznie aktywnymi związkami pochodzenia naturalnego (PL-BAC, z ang.The above examples of the use of phospholipids in pharmaceutical formulations relate to compounds whose main function is to emulsify and stabilize the dispersion of lipid nanoparticles. So far, the scientific and patent literature describes a few applications of phospholipids being conjugates with biologically active compounds of natural origin (PL-BAC).

PL 240 303 B1 biologically active compound), takimi jak izomery sprzężonego kwasu linolowego (CLA), gdzie fosfolipid występuje w charakterze surfaktantu, będącego składnikiem powierzchni międzyfazowej lipidowych nanonośników. Przykładem może być zastosowanie fosfatydylocholiny związanej kowalencyjnie w pozycji sn-1 i sn-2 z mieszaniną izomerów cis-9,trans-11 (46%) i trans-10,cis-12 CLA (45%). W opisanej w publikacji (A. Pucek, N. Niezgoda i inni, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2017, 532, 377-388) metodzie homogenizacji wysokociśnieniowej otrzymano nanocząstki SLN i NLC z zastosowaniem mieszaniny polioksyetylenowej pochodnej sorbitanu (Tween® 80) oraz fosfatydylocholiny modyfikowanej sprzężonym kwasem linolowym w stosunku, odpowiednio 1:1 do 1:5 jako surfaktantów. Opracowana metoda pozwoliła uzyskać nanonośniki lipidowe charakteryzujące się wielkością w zakresie 160-230 nm o indeksie polidyspersyjności poniżej 0,29 oraz wartości potencjału zeta (ζ) pomiędzy -2,7 a -10,4 mV.The biologically active compound), such as conjugated linoleic acid (CLA) isomers, where the phospholipid acts as a surfactant that is a component of the lipid nanocarrier interface. An example would be the use of phosphatidylcholine covalently linked at sn-1 and sn-2 with a mixture of cis-9, trans-11 (46%) and trans-10, cis-12 CLA (45%) isomers. In the high-pressure homogenization method described in the publication (A. Pucek, N. Niezgoda et al., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2017, 532, 377-388), SLN and NLC nanoparticles were obtained using a polyoxyethylene sorbitan derivative mixture (Tween® 80) and phosphatidylcholine modified with conjugated linoleic acid in a ratio of 1: 1 to 1: 5, respectively, as surfactants. The developed method allowed to obtain lipid nanocarriers with a size in the range of 160-230 nm with a polydispersity index below 0.29 and zeta potential (ζ) values between -2.7 and -10.4 mV.

Sprzężony kwas linolowy (CLA) to grupa izomerów pozycyjnych i geometrycznych (cis,trans) kwasu linolowego, w którego strukturze występuje układ dwóch sprzężonych ze sobą wiązań podwójnych. Zostało udowodnione, że CLA wykazuje szereg prozdrowotnych właściwości, między innymi wpływa pozytywnie na funkcjonowanie układu immunologicznego, działa przeciwnowotworowo, przeciwmiażdżycowo, przeciwcukrzycowo, obniża ciśnienie krwi oraz wpływa na redukcję tkanki tłuszczowej i przyrost masy mięśniowej (B. Yang i inni, Journal of functional foods, 2015, 15, 314-325; K. Koba i inni, Obesity Research & Clinical Practice, 2014, 8(6), e525-e532). Do najlepiej poznanych izomerów CLA należy cis-9,trans-11 występujący naturalnie głównie w mleku i tłuszczu zwierząt przeżuwających, a który stanowi od 76 do 84% wszystkich izomerów CLA (Y. W. Park i inni, Small Ruminant Research, 2007, 68, 88-113) oraz trans-10,cis-12 CLA znajdujący się w produktach naturalnych w nieznacznej ilości. CLA otrzymywany jest głównie na drodze syntetycznej w procesie izomeryzacji kwasu linolowego w środowisku zasadowym w obecności wysokowrzących polarnych rozpuszczalników organicznych takich jak glikol etylenowy, glikol propylenowy i glicerol. W wyniku tak przeprowadzonego procesu w zależności od stosowanych warunków temperaturowych otrzymuje się około równomolową mieszaninę izomerów cis-9,trans-11 i trans-10,cis-12.Conjugated linoleic acid (CLA) is a group of positional and geometric (cis, trans) isomers of linoleic acid, in the structure of which there is a system of two conjugated double bonds. It has been proven that CLA has a number of pro-health properties, including a positive effect on the functioning of the immune system, has anti-cancer, anti-atherosclerotic and anti-diabetic properties, lowers blood pressure, and reduces body fat and increases muscle mass (B. Yang et al., Journal of functional foods , 2015, 15, 314-325; K. Koba et al., Obesity Research & Clinical Practice, 2014, 8 (6), e525-e532). The best known CLA isomers include cis-9, trans-11, found naturally mainly in the milk and fat of ruminants, and which accounts for 76 to 84% of all CLA isomers (Y. W. Park et al., Small Ruminant Research, 2007, 68, 88- 113) and trans-10, cis-12 CLA found in natural products in a small amount. CLA is obtained mainly by synthetic isomerization of linoleic acid in alkaline medium in the presence of high-boiling polar organic solvents such as ethylene glycol, propylene glycol and glycerol. As a result of the process carried out in this way, depending on the temperature conditions used, an approximately equimolar mixture of cis-9, trans-11 and trans-10, cis-12 isomers is obtained.

Poszczególne izomery CLA różnią się między sobą właściwościami biologicznymi. Badania cytotoksyczne przeprowadzone w warunkach in vitro w stosunku do różnych typów komórek nowotworowych udowodniły, że dany izomer może posiadać silną aktywność antyproliferacyjną względem jednego rodzaju nowotworu, natomiast w stosunku do innego może nie wykazywać takiego efektu, bądź nawet stymulować komórki do wzrostu. Na przykład izomer trans-10,cis-12 posiada zdolność do inhibicji wzrostu komórek raka jelita grubego (HT-29) podczas gdy cis-9,trans-11 nie wykazuje takiego efektu (H. J. Cho, i inni, 2006, Journal of Nutrition, 136(4), 893-898). W innych badaniach dotyczących komórek raka jelita grubego (HCT116, SW480) obserwowano apoptozę wywołaną działaniem izomeru trans-10,cis-12 w dawce 25-50 μM po czasie inkubacji 72 h, natomiast nie zaobserwowano takiego efektu w przypadku izomeru cis-9,trans-11. Podobne zjawisko selektywnego działania izomeru trans-10,cis-12 ale nie cis-9,trans-11 CLA zaobserwowano w przypadku hamowania proliferacji komórek raka prostaty (PC-3) oraz raka piersi (MCF-7) (J. D. Palombo i inni, 2002, Cancer letters, 177(2), 163-172; P. Tanmahasamut i inni, 2004, The Journal of Nutrition, 134(3), 674-680).Individual CLA isomers differ in their biological properties. In vitro cytotoxic studies on various types of cancer cells have proven that a given isomer may have a strong antiproliferative activity against one type of cancer, while against another it may not have such an effect, or even stimulate cells to grow. For example, the trans-10, cis-12 isomer has the ability to inhibit the growth of colon cancer cells (HT-29) while cis-9, trans-11 does not (H. J. Cho, et al., 2006, Journal of Nutrition, 136 (4), 893-898). In other studies on colorectal cancer cells (HCT116, SW480), apoptosis induced by the trans-10, cis-12 isomer at a dose of 25-50 μM was observed after an incubation time of 72 h, but no such effect was observed for the cis-9, trans isomer. -11. A similar phenomenon of the selective action of the trans-10, cis-12, but not cis-9, trans-11 CLA isomer was observed in the inhibition of proliferation of prostate cancer (PC-3) and breast cancer (MCF-7) cells (J. D. Palombo et al., 2002 , Cancer letters, 177 (2), 163-172; P. Tanmahasamut et al., 2004, The Journal of Nutrition, 134 (3), 674-680).

W obliczu tych doniesień korzystnym wydaje się stosowanie aktywnych biologicznie izomerów CLA w formie czystej izomerycznie (>90%) zarówno jako preparatów w postaci wolnych kwasów tłuszczowych lub też koniugatów fosfolipidowych gdzie aktywny izomer CLA związany jest z sn-glicero-3-fosfocholiną wiązaniem estrowym. W publikacji (N. Niezgoda i inni, Australian Journal of Chemistry, 2015, 68(7), 1065-1075) opisano metodę syntezy 1,2-di-(10E,12Z-octadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny (PC-t10,c12-CLA). Badania in vitro wykazały, że PC-t10,c12-CLA hamował proliferację komórek raka jelita grubego (HT-29) przy dawce 95,5±39,9 μΜ po 24 godzinnej inkubacji komórek z tym związkiem.In view of these reports, it seems advantageous to use biologically active CLA isomers in pure isomeric form (> 90%), both as preparations in the form of free fatty acids or phospholipid conjugates, where the active CLA isomer is bound to sn-glycero-3-phosphocholine by an ester bond. The publication (N. Niezgoda et al., Australian Journal of Chemistry, 2015, 68 (7), 1065-1075) describes the method of synthesis of 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine ( PC-t10, c12-CLA). In vitro studies showed that PC-t10, c12-CLA inhibited the proliferation of colon cancer cells (HT-29) at a dose of 95.5 ± 39.9 μΜ after 24 hours incubation of cells with this compound.

Nieoczekiwanie okazało się, że wprowadzenie związku wykazującego aktywność biologiczną, takiego jak izomer trans-10,cis-12 CLA do struktury fosfatydylocholiny jako cząsteczki o amfifilowym charakterze, posiadającej zdolności do łatwego przenikania przez błony biologiczne, jest korzystne ze względu na możliwość zwiększenia przyswajalności związku aktywnego oraz wykorzystania takiej fosfatydylocholiny w charakterze proleku. Z uwagi na właściwości powierzchniowo czynne koniugaty fostatydylocholiny z biologicznie aktywnymi związkami posiadają również duży potencjał jako surfaktant stabilizujący dyspersję nanonośników.Unexpectedly, it turned out that the introduction of a compound showing biological activity, such as the trans-10 isomer, cis-12 CLA, into the structure of phosphatidylcholine as a molecule of amphiphilic nature, having the ability to easily penetrate biological membranes, is advantageous due to the possibility of increasing the bioavailability of the active compound and the use of such phosphatidylcholine as a prodrug. Due to their surfactant properties, conjugates of phosphatidylcholine with biologically active compounds also have great potential as a surfactant stabilizing the dispersion of nanocarriers.

PL 240 303 B1PL 240 303 B1

Zlokalizowanie różnych związków aktywnych w dwóch obszarach nanocząstki ogranicza ich wzajemną chemiczną i fizyczną interakcję oraz powoduje, że zwiększa się sumaryczna ilość substancji aktywnych możliwych do wprowadzenia w strukturę nośnika. Powyższa koncepcja budowy lipidowych nanocząsteczek ma na celu skorelowanie aktywności terapeutycznych poszczególnych jego komponentów w jednej nanocząstce, by zapewnić wzmocnienie efektu terapeutycznego, stwarzając możliwość ich zastosowania w medycynie personalizowanej, gdzie terapia antynowotworowa może być dobrana indywidualnie do potrzeb pacjenta.Locating different active compounds in two areas of the nanoparticle limits their mutual chemical and physical interaction and increases the total amount of active substances that can be incorporated into the structure of the carrier. The above concept of the structure of lipid nanoparticles is aimed at correlating the therapeutic activities of its individual components in one nanoparticle to ensure the enhancement of the therapeutic effect, making it possible to use them in personalized medicine, where anti-cancer therapy can be individually tailored to the patient's needs.

Istotą rozwiązania według wynalazku są nanostrukturalne nośniki lipidowe charakteryzujące się tym, że składają się z lipidu ciekłego będącego mieszaniną trójglicerydów kwasu kapronowego i kaprylowego, oraz że stabilizowane są amfoterycznym surfaktantem z grupy fosfolipidów a mianowicie 1,2-di-(10E,12Z-oktadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiną oraz niejonowym surfaktantem polioksyetylenowanym monooleinianem sorbitanu.The essence of the solutions according to the invention are nanostructured lipid carriers, characterized by the fact that they consist of a liquid lipid being a mixture of caproic and caprylic acid triglycerides, and that they are stabilized with an amphoteric surfactant from the phospholipid group, namely 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine and a non-ionic polyoxyethylene sorbitan monooleate surfactant.

Korzystnie jest, gdy niejonowym surfaktantem polioksyetylenowanym monooleinianem sorbitanu jest polisorbat 80.Preferably, the nonionic polyoxyethylene sorbitan monooleate surfactant is polysorbate 80.

Sposób otrzymywania nanostrukturalnych nośników lipidowych polega na tym, że w pierwszej kolejności przygotowuje się fazę wodną ze związkami powierzchniowo czynnymi stanowiącą mieszaninę 1,2-di-(10E,12Z-oktadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny, w ilości wagowej od 0,15 do 0,45% oraz niejonowego surfaktantu polioksyetylenowanego monooleinianu sorbitanu, korzystnie polisorbatu 80, w ilości od 0,25 do 0,75%. Całość podgrzewa się przy delikatnym mieszaniu do całkowitego zdyspergowania fosfatydylocholiny ale w temperaturze nie wyższej niż 70°C. Kolejno przygotowuje się fazę lipidową w stężeniu wagowym od 2 do 4% wszystkich składników formulacji, stanowiącą mieszaninę stopionego lipidu, stałego w temperaturze pokojowej i temperaturze ciała człowieka oraz lipidu ciekłego będącego mieszaniną trójglicerydów kwasu kapronowego i kaprylowego. Ilość lipidu ciekłego stanowi od 15 do 45% fazy lipidowej. Następnie wlewa się fazę wodną do fazy lipidowej i poddaje się mieszaniu przy obrotach 16000-24000 rpm w temperaturze zapewniającej stan ciekły fazy lipidowej, do momentu zdyspergowania lipidu. Mikroemulsję poddaje się działaniu ultradźwięków, otrzymując po ochłodzeniu opalizującą lub mleczną, termodynamicznie stabilną zawiesinę nanostrukturalnych nośników lipidowych.The method of obtaining nanostructured lipid carriers is based on the fact that, first of all, a water phase with surfactants is prepared, which is a mixture of 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine, in an amount by weight from 0 , 15 to 0.45% and a non-ionic polyoxyethylene sorbitan monooleate surfactant, preferably polysorbate 80, in an amount from 0.25 to 0.75%. The whole is heated with gentle stirring until the phosphatidylcholine is completely dispersed, but at a temperature not exceeding 70 ° C. The lipid phase is successively prepared in a concentration of 2 to 4% by weight of all formulation components, which is a mixture of a molten lipid, solid at room temperature and human body temperature, and a liquid lipid, which is a mixture of caproic and caprylic acid triglycerides. The amount of liquid lipid accounts for 15 to 45% of the lipid phase. The aqueous phase is then poured into the lipid phase and subjected to stirring at 16,000-24,000 rpm at a temperature ensuring the liquid state of the lipid phase until the lipid is dispersed. The microemulsion is sonicated to obtain, after cooling, an opalescent or milky thermodynamically stable suspension of nano-structured lipid carriers.

Jako lipid stały można zastosować mieszaninę tri-, mono- i diglicerydów kwasów tłuszczowych o długości łańcucha węglowego C8-C18 albo wosk pszczeli albo palmitynian cetylu,As the solid lipid, a mixture of tri-, mono- and diglycerides of fatty acids with a carbon chain length of C8-C18 or beeswax or cetyl palmitate may be used.

Zaletą wytwarzanych stałych nanonośników lipidowych według wynalazku są: bardzo duża homogeniczność produktu, jednorodność otrzymanych nanocząstek, nanoskopowa wielkość (<200 nm), właściwa dla efektywnego wnikania nanocząstek przez błony biologiczne komórek, duża stabilność fizyczna, mała lepkość. Zastosowanie formulacji nanocząsteczek według wynalazku jest potencjalnie korzystne dla aplikacji kosmetycznych i farmaceutycznych zwłaszcza dla terapii przeciwnowotworowej.The advantages of the produced solid lipid nanocarriers according to the invention are: very high homogeneity of the product, homogeneity of the obtained nanoparticles, nanoscopic size (<200 nm), appropriate for the effective penetration of nanoparticles through the biological membranes of cells, high physical stability, low viscosity. The use of the nanoparticle formulations according to the invention is potentially advantageous for cosmetic and pharmaceutical applications, especially for anti-cancer therapy.

Zaletą wykorzystania 1,2-di-(10E,12Z-octadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny jest uzyskanie przedziałowości w strukturze nanonośnika lipidowego, gdzie jeden związek aktywny, np. trans-10,cis-12 CLA, związany jest kowalencyjnie z PL, a zatem zlokalizowany jest w powierzchni międzyfazowej i stanowi prolek, podczas gdy inny składnik aktywny farmaceutycznie, np. lek przeciwnowotworowy może zostać załadowany w lipidowym rdzeniu nanocząstek.The advantage of using 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine is to obtain compartmentalization in the structure of the lipid nanocarrier, where one active compound, e.g. trans-10, cis-12 CLA, is covalently bound with PL and thus located at the interface and is a prodrug, while another pharmaceutically active ingredient, e.g. an anti-cancer drug, can be loaded into the lipid core of the nanoparticles.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony bliżej w przykładzie wykonania, wzorem 1, a także na rysunku, o fig. 1-6, gdzie na fig. 1 przedstawione zostały wyniki badań wielkości średnicy hydrodynamicznej (Dh) uzyskanych w wyniku pomiaru metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS) dla formulacji nanostrukturalnych nośników lipidowych opisanych w przykładzie wykonania. Na fig. 2 prze dstawiono wyniki pomiaru potencjału zeta (ζ) uzyskanych metodą DLS. Na fig. 3 przedstawiono zdjęcie nanocząstek NLC wykonane transmisyjnym mikroskopem elektronowym (TEM). Fig. 4 przedstawia wyniki testów stabilności przechowalniczej otrzymanych dyspersji nanostrukturalnych nośników lipidowych po czasie 2 i 7 dni przechowywania w temperaturze 4, 20 lub 40°C wyrażonych jako współczynnik niestabilności obliczony na podstawie wyników uzyskanych podczas wirowania w technice sedymentacji wirówkowej za pomocą analizatora dyspersji LUMiSizer®. Współczynnik niestabilności (z ang. instability index, Inl) oblicza się na podstawie zmian w transmitancji światła o danej długości fali (tutaj 865 nm) na całej długości wirowanej próbki spowodowanych separacją faz poprzez śmietankowanie powstałe na skutek działania siły odśrodkowej w warunkach wirowania (tutaj 4000 rpm, 25°C) w określonym czasie trwania analizy, podzielonym przez maksymalną uzyskaną transmitancję podczas wirowania. Indeks niestabilności jest liczbą bezwymiarową i waha się od 0 (bardziej stabilny) do 1 (bardziej niestabilny). Fig. 5 ukazuje profil rozdziału kinetycznego nanocząstek NLC przechowywanych przez czas 2 dniThe subject of the invention is presented in more detail in the embodiment, by the formula 1, and also in the drawing in Figs. 1-6, where in Fig. 1 the results of the tests of the hydrodynamic diameter (Dh) values obtained as a result of the dynamic light scattering (DLS) method are presented. for the formulation of the nano-structured lipid carriers described in the embodiment. Fig. 2 shows the results of the zeta potential (ζ) measurements obtained by the DLS method. Figure 3 is a Transmission Electron Microscope (TEM) image of the NLC nanoparticles. Fig. 4 shows the results of storage stability tests of the obtained dispersions of nanostructured lipid carriers after 2 and 7 days of storage at 4, 20 or 40 ° C expressed as the instability coefficient calculated on the basis of the results obtained during centrifugation in the centrifugal sedimentation technique with the LUMiSizer® dispersion analyzer . The instability index (Inl) is calculated on the basis of changes in the transmittance of light of a given wavelength (here 865 nm) over the entire length of the spun sample caused by phase separation by creaming resulting from the centrifugal force under centrifugation conditions (here 4000 rpm, 25 ° C) for the specified analysis duration divided by the maximum transmittance obtained during the centrifugation. The instability index is a dimensionless number and ranges from 0 (more stable) to 1 (more volatile). Fig. 5 shows the kinetic resolution profile of NLC nanoparticles stored for 2 days

Claims (2)

PL 240 303 B1 w temperaturze 4°C uzyskany za pomocą analizatora dyspersji LUMiSizer®. Fig. 6 przedstawia wyniki badań cytotoksyczności uzyskanych w standardowym teście MTT podczas inkubacji (24 h) prawidłowych komórek nabłonkowych jajnika (linia CHO-K1) z odpowiednio rozcieńczonymi dyspersjami nanocząstek lipidowych. Stężenie nanocząstek NLC na rysunku fig. 6 podano w przeliczeniu na ilość związku aktywnego 1,2-di-10E,12Z-oktadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny stanowiącego składnik fazy surfaktantu wyrażoną w mikromolach na dm³.PL 240 303 B1 at 4 ° C obtained with a LUMiSizer® Dispersion Analyzer. Fig. 6 shows the results of cytotoxicity studies obtained with the standard MTT assay during incubation (24 h) of normal ovarian epithelial cells (CHO-K1 line) with appropriately diluted dispersions of lipid nanoparticles. The concentration of NLC nanoparticles in Figure 6 is given in terms of the amount of 1,2-di-10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine active compound component of the surfactant phase, expressed in micromoles per dm ³ . P r z y k ł a d:Example: Roztwór surfaktantu stanowiący fazę wodną, o składzie:Surfactant solution constituting the water phase, with the following composition: • 4952,5 mg wody dejonizowanej • 22,5 mg (0,45% wagowych) 1,2-di-(10E,12Z-octadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiny otrzymanej zgodnie z opisaną metodą (N. Niezgoda i inni, Australian Journal of Chemistry, 2015, 68(7), 1065-1075) o składzie izomerycznym reszt sprzężonego kwasu linolowego (wg GC): trans-10,cis-12 - 96,5%; cis-9,trans-11 - 2,8%; - 2,5%; inne izomery - 0,7% • 25 mg (0,5% wagowych) polisorbatu 80 (Tween® 80), miesza się przy pomocy mieszadła magnetycznego w temperaturze 55°C przez 1 h, do całkowitego zdyspergowania fosfatydylocholiny, a następnie stabilizuje w temperaturze 53°C przez 20 minut.• 4952.5 mg of deionized water • 22.5 mg (0.45% by weight) 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine obtained according to the method described (N. Niezgoda and others, Australian Journal of Chemistry, 2015, 68 (7), 1065-1075) with the isomeric composition of conjugated linoleic acid residues (according to GC): trans-10, cis-12 - 96.5%; cis-9, trans-11 - 2.8%; - 2.5%; other isomers - 0.7% • 25 mg (0.5% by weight) of polysorbate 80 (Tween® 80), mixed with a magnetic stirrer at 55 ° C for 1 h, until phosphatidylcholine completely disperses, and then stabilized at temperature 53 ° C for 20 minutes. Fazę lipidową stanowiącą 2% wagowych wszystkich składników formulacji (100 mg), o składzie: • 70 mg mieszany glicerydów kwasów tłuszczowych o długości łańcucha węglowegoLipid phase constituting 2% by weight of all formulation ingredients (100 mg), composed of: • 70 mg mixed fatty acid glycerides with a carbon chain length C8-C18 (Gelucire® 43/01) • 30 mg lipidu ciekłego (Miglyol® M812N) - trójgliceryd kwasu kapronowego i kaprylowego (30% wagowych fazy lipidowej), podgrzewa się w temperaturze 53°C do rozpuszczenia i stabilizuje w temperaturze 53°C przez czas 20 minut. Do tak przygotowanej fazy lipidowej wlewa się roztwór surfaktantów i miesza w stałej temperaturze 53°C przy pomocy wysokoobrotowego homogenizatora stosując obroty 24000 rpm przez 2 minuty, następnie otrzymaną mikroemulsję niezwłocznie poddaje się działaniu ultradźwięków za pomocą sonikatora o mocy 130 W i częstotliwości 20 kHz przez 3 minuty stosując moc równą 90% amplitudy. Po tym czasie pozostawia się otrzymaną nanoemulsję do ochłodzenia w temperaturze pokojowej otrzymując mleczną dyspersję nanostrukturalnych nośników lipidowych, których średnica hydrodynamiczna (Dh) wynosi 109,6±2,3 nm; indeks polidyspersyjności (Pdl) równy jest 0,159±0,002; a potencjał zeta (ζ) to -11,9±0,16 mV.C8-C18 (Gelucire® 43/01) • 30 mg of liquid lipid (Miglyol® M812N) - triglyceride of caproic and caprylic acid (30% by weight of the lipid phase), heated at 53 ° C to dissolve and stabilized at 53 ° C for 20 minutes. The surfactant solution is poured into the lipid phase prepared in this way and stirred at a constant temperature of 53 ° C using a high-speed homogenizer, rotating at 24,000 rpm for 2 minutes, then the resulting microemulsion is immediately subjected to ultrasound using a 130 W sonicator with a frequency of 20 kHz for 3 minutes. minutes using a power equal to 90% of the amplitude. After this time, the obtained nanoemulsion is allowed to cool down at room temperature to obtain a milky dispersion of nano-structured lipid carriers, the hydrodynamic diameter (Dh) of which is 109.6 ± 2.3 nm; the polydispersity index (Pdl) is 0.159 ± 0.002; and the zeta potential (ζ) is -11.9 ± 0.16 mV. Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Nanostrukturalne nośniki lipidowe NLC, znamienne tym, że składają się z lipidu ciekłego będącego mieszaniną trójglicerydów kwasu kapronowego i kaprylowego, oraz że stabilizowane są amfoterycznym surfaktantem z grupy fosfolipidów a mianowicie 1,2-di-(10E,12Z-octadekadienoilo)-sn-glicero-3-fosfocholiną o wzorze 1 oraz niejonowym surfaktantem polioksyetylenowanym monooleinianem sorbitanu.1. Nanostructured NLC lipid carriers, characterized in that they consist of a liquid lipid being a mixture of caproic and caprylic acid triglycerides, and that they are stabilized with an amphoteric surfactant from the phospholipid group, namely 1,2-di- (10E, 12Z-octadecadienoyl) -sn glycero-3-phosphocholine of the formula I and a non-ionic polyoxyethylene sorbitan monooleate surfactant. 2. Nanostrukturalne nośniki lipidowe NLC według zastrz. 1, znamienne tym, że niejonowym surfaktantem polioksyetylenowanym monooleinianem sorbitanu jest polisorbat 80.2. Nanostructured NLC lipid carriers according to claim 1, The process of claim 1, wherein the polyoxyethylene sorbitan monooleate nonionic surfactant is polysorbate 80.