PL239601B1 - Micro flow system for 3D cell culture - Google Patents

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest mikrosystem przepływowy typu Lab-on-a-chip do przestrzennej hodowli komórek. Tego typu mikrosystemy znajdują zastosowanie głównie w bioanalityce i są wykorzystywane jako narzędzia analityczne w badaniach przedklinicznych nad nowymi lekami i procedurami terapeutycznymi.The subject of the invention is a Lab-on-a-chip flow microsystem for spatial cell culture. These types of microsystems are mainly used in bioanalytical science and are used as analytical tools in preclinical research on new drugs and therapeutic procedures.

Badania przesiewowe nowych leków oraz badania in vitro nad skutecznością nowych procedur terapeutycznych przeprowadzane są zazwyczaj z wykorzystaniem standardowych metod hodowli komórkowej i klasycznych testów toksyczności. Związane jest to z pewnymi ograniczeniami. Tradycyjne hodowle komórkowe in vitro, opierają się na wzroście komórek w monowarstwie (2D), przez co nie odzwierciedlają w pełni warunków panujących w środowisku in vivo. Ponadto, w organizmach żywych komórki otoczone są skomplikowaną siecią włókien białkowych, zwaną macierzą zewnątrzkomórkową ECM (ang. Extracellular Matrix), która zespala komórki ze sobą, umożliwiając im tworzenie trójwymiarowych struktur. Istnieje zatem potrzeba opracowania nowych modeli doświadczalnych in vitro, które lepiej odzwierciedlają środowisko komórek wzrastających in vivo, niż standardowe modele dwuwymiarowe. Odpowiedzią na te potrzeby może być zastosowanie mikrosystemów przepływowych. Badania z wykorzystaniem tradycyjnych metod hodowli wymagają także zużycia dużej ilości drogich odczynników. Mikrosystemy typu Lab-on-a-chip pełnią funkcję zintegrowanego mikrolaboratorium, umożliwiającego przeprowadzenie kompleksowej analizy próbek o objętościach rzędu kilkuset mikrolitrów, co znacznie obniża koszty analizy.New drug screening and in vitro studies of the effectiveness of new therapeutic procedures are usually performed using standard cell culture methods and classical toxicity tests. It is related to certain limitations. Traditional in vitro cell cultures are based on the growth of cells in a monolayer (2D) and therefore do not fully reflect the conditions in the in vivo environment. Moreover, in living organisms, cells are surrounded by a complex network of protein fibers, called the Extracellular Matrix (ECM), which binds cells together, enabling them to form three-dimensional structures. There is therefore a need to develop new in vitro experimental models that better reflect the environment of cells growing in vivo than standard two-dimensional models. The answer to these needs may be the use of flow microsystems. Studies using traditional breeding methods also require the use of large amounts of expensive reagents. Lab-on-a-chip microsystems act as an integrated micro-laboratory, enabling comprehensive analysis of samples with volumes of several hundred microliters, which significantly reduces the costs of analysis.

W stanie techniki znane są rozwiązania z wykorzystaniem mikrostruktur.In the state of the art, solutions using microstructures are known.

W dokumencie WO2014008358 ujawniono trójwymiarową porowatą membranę wytwarzaną z warstwy materiału fotolitograficznego formowaną w urządzeniu mikroprzepływowym. Do usieciowania warstwy materiału fotorezystu dochodzi wskutek działania promieniowania i w ten sposób tworzy się porowata membrana, przy czym fotorezystem jest SU-8. Dokument ujawnia także urządzenie mikroprzepływowe zawierające mikroporowatą membranę otrzymaną sposobem jak opisano powyżej.WO2014008358 discloses a three-dimensional porous membrane made of a layer of photoresist material formed in a microfluidic device. The photoresist material layer is cross-linked by the action of radiation and thus a porous membrane is formed, the photoresist being SU-8. The document also discloses a microfluidic device comprising a microporous membrane obtained by the method as described above.

Rozwiązania zaprezentowane w wynalazku WO2014008358 nie umożliwiają prowadzenia trójwymiarowej hodowli komórkowej, gdyż zasadniczą funkcją membrany tu opisanej jest naśladowanie tkanki barierowej w ludzkim ciele, a nie funkcja rusztowania dla komórek. Dodatkowo, membrana przedstawiona w tym wynalazku jest trwale i szczelnie mocowana wewnątrz systemu lub formowana in situ. Takie rozwiązanie uniemożliwia dokonywanie analiz komórek poza systemem.The solutions presented in the invention WO2014008358 do not allow for a three-dimensional cell culture, since the essential function of the membrane described herein is to mimic the barrier tissue in the human body and not the function of a scaffold for cells. Additionally, the membrane of this invention is permanently and sealed within the system or formed in situ. This solution makes it impossible to analyze the cells outside the system.

W dokumencie US8101037 ujawniono sposób formowania kapilar w podłożu do urządzenia mikroprzepływowego, gdzie mikrokanaliki są nadrukowywane, formowane, wytrawiane lub w inny sposób formowane w podłożu z odpowiedniego polimeru a następnie wypełniane cieczą, która po zestaleniu tworzy warstwę protektorową, którą usuwa się po uformowaniu kanalików. Według ujawnienia materiał polimerowy jednego lub obu substratu i pokrywy górnej zawiera tworzywo termoplastyczne, którym jest materiał polimerowy zawierający polimetakrylan metylu) lub poliwęglan lub glikol poli(tereftalan etylenu); materiał protektorowy zawiera wosk parafinowy lub wosk sojowy. Rozwiązanie wg ujawnienia dotyczy zatem separacji cząstek, a nie mikrosystemu przepływowego przeznaczonego do hodowli komórek. Zarówno budowa, geometria, funkcje, zastosowanie jak i wykorzystane materiały są różne, niż te stosowane w mikrosystemach do prowadzenia hodowli komórkowych.US8101037 discloses a method of forming capillaries in a substrate for a microfluidic device where the microchannels are printed, molded, etched or otherwise formed into a suitable polymer substrate and then filled with a liquid which, upon solidification, forms a sacrificial layer which is removed after forming the channels. According to the disclosure, the polymeric material of one or both of the substrate and the top cover comprises a thermoplastic which is a polymeric material containing polymethyl methacrylate or polycarbonate or polyethylene terephthalate glycol; the sacrificial material comprises paraffin wax or soy wax. The solution according to the disclosure therefore relates to particle separation and not to a flow microsystem intended for cell culture. The structure, geometry, functions, application and materials used are different than those used in microsystems for cell culture management.

W dokumencie US2006263242 ujawniono mikrochip do analizy próbek ciekłych, charakteryzujący się tym, że ma strukturę pomiarową do odważania i pobierania zadanej ilości cieczy wzorcowej, przy czym strukturami pomiarowymi jest membrana z porowatego materiału zdolna do pomieszczenia danej ilości próbki cieczy. Mikrochip według ujawnienia ma wlot i wylot dla próbki, oraz element analityczny stosowany do wykrywania składnika testowego w próbce znajdujący się w środku kanału, zaś membrana z porowatego materiału absorbuje określoną ilość próbki cieczy w kontakcie z nadmierną ilością próbki cieczy. Rozwiązanie służy do analizy składników testowych zawartych w próbkach takich jak krew, płyn ustrojowy, mocz lub próbki płynne, a nie jest przeznaczony do hodowli komórek. Rozwiązanie wg ujawnienia nie dotyczy mikrosystemu przepływowego z membraną, gdyż mikrochip zawiera organiczny materiał porowaty, a nie membranę porowatą.Document US2006263242 discloses a microchip for analyzing liquid samples, characterized in that it has a measuring structure for weighing in and taking a predetermined amount of a standard liquid, the measuring structures being a membrane of porous material capable of containing a given amount of sample liquid. The microchip of the disclosure has a sample inlet and outlet, and an analytical element used to detect a test component in a sample in the center of the channel, and the porous material membrane absorbs a predetermined amount of sample liquid when in contact with an excess amount of sample liquid. The solution is designed to analyze test components contained in samples such as blood, body fluid, urine or liquid samples, and is not intended for cell culture. The disclosure solution does not apply to a membrane flow microsystem as the microchip comprises an organic porous material and not a porous membrane.

W dokumencie US2011253629 ujawniono urządzenie do oczyszczania, rozdzielania i syntezy płynów w mikroskali, w szczególności urządzeń posiadających membrany polimerowe do filtrowania płynów takich jak dializator. Dializator według ujawnienia składa się z półprzepuszczalnej membrany połączonej ze zbiorem mikrokanalików w formie trójkątnych słupków do dostarczania krwi i dializatu oraz wymiennika ciepła. Membrany wykorzystane w przedstawionym mikrosystemie nie mogłyby pełnićUS2011253629 discloses a device for the purification, separation and synthesis of fluids on a microscale, in particular devices having polymer membranes for filtering fluids such as a dialyzer. The dialyzer of the disclosure comprises a semipermeable membrane connected to a collection of triangular microchannels for blood and dialysate supply and a heat exchanger. The membranes used in the presented microsystem could not function

PL 239 601 B1 funkcji podporowej dla komórek, ponieważ są membranami półprzepuszczalnymi. Taki rodzaj membrany nie może zostać wykorzystany do hodowli komórkowej.Since they are semipermeable membranes, they are used to support cells. This type of membrane cannot be used for cell culture.

Celem wynalazku jest zapewnienie mikrosystemu dedykowanego do hodowli komórek.The aim of the invention is to provide a microsystem dedicated to cell culture.

Mikrosystem według wynalazku stanowi hybrydowy układ składający się z dwóch hydrofobowych płytek polimerowych z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), który jest materiałem przezroczystym, przepuszczalnym dla gazów, nieprzepuszczalnym dla wody i biokompatybilnym, oraz znajdującej się między nimi porowatej membrany polimerowej, korzystnie wykonanej z poli(tereftalanu etylenu) (PET). Wszystkie elementy układu są ze sobą trwale połączone za pomocą plazmy tlenowej. Górna płytka i dolna płytka z PDMS wyposażone są w analogiczne mikrostruktury przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie. Każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi i jednym kanałem odprowadzającym. Proces łączenia płytek polimerowych wyposażonych w symetryczne mikrostruktury odbywa się w ten sposób, że wzór mikrostruktury znajdujący się na jednej z płytek ułożony jest naprzemianlegle w stosunku do wzoru mikrostruktury znajdującego się na drugiej płytce. W wyniku takiego łączenia symetryczne mikrostruktury na obu płytkach nakładają się tylko częściowo. Miejsca nałożenia mikrostruktur z obu płytek stanowią miejsca analizy komórek wprowadzanych do układu. Otwory wlotowe połączone z mikrokanałami doprowadzającymi i otwory wylotowe, połączone z mikrokanałami odprowadzającymi zawiesiny komórkowe, medium hodowlane, reagenty oraz produkty przemiany materii wywiercone są tylko w górnej płytce polimerowej, co ułatwia obserwacje mikroskopowe komórek hodowanych w mikrosystemie za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego lub fluorescencyjnego.The microsystem according to the invention is a hybrid system consisting of two hydrophobic polymer plates made of poly (dimethylsiloxane) (PDMS), which is a transparent, gas-permeable, water-impermeable and biocompatible material, and a porous polymeric membrane, preferably made of polyamide, between them. (ethylene terephthalate) (PET). All elements of the system are permanently connected with each other by means of an oxygen plasma. The upper plate and the lower plate of PDMS are provided with analogous microstructures, the microstructures being rotated by 180 ° horizontally to each other. Each of the microstructures consists of six longitudinal microcells connected by a network of symmetrical, sinusoidal microchannels with two supply channels and one discharge channel. The process of joining polymer plates with symmetrical microstructures is carried out in such a way that the microstructure pattern on one of the plates is alternating with the microstructure pattern on the other plate. As a result of such joining, the symmetrical microstructures on both plates only partially overlap. The sites of overlapping microstructures from both plates are sites for the analysis of cells introduced into the system. Inlet openings connected with feeding microchannels and outlet openings connected with micro-channels draining cell suspensions, culture medium, reagents and metabolic products are drilled only in the upper polymer plate, which facilitates microscopic observation of cells grown in the microsystem using inverted optical or fluorescence microscopy.

Korzystnie wszystkie mikrostruktury: mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm.Preferably, all microstructures: microchannels and microchamber are 50 μm high.

Korzystnie porowata membrana PET jest okrągłego kształtu, o średnicy 25 mm, wyposażona w pory o średnicy 0.4 μm, rozmieszczone na membranie z gęstością 2 x 106 cm^-2.Preferably, the porous PET membrane is circular in shape, 25 mm in diameter, provided with pores 0.4 µm in diameter, distributed over the membrane at a density of 2 x 106 cm ^-2 .

Mikrosystem według wynalazku charakteryzuje się tym, że w prosty sposób umożliwia wytworzenie zaawansowanej trójwymiarowej hodowli komórek różnych linii komórkowych, dzięki wykorzystaniu dodatkowego elementu konstrukcyjnego w postaci porowatej membrany polimerowej. Hodowla komórek w tym mikrosystemie daje możliwość wykorzystania wynalazku jako narzędzia do szybkiej wstępnej oceny skuteczności nowych leków oraz procedur terapeutycznych w warunkach in vitro, które lepiej odzwierciedlają warunki in vivo niż standardowe techniki hodowli komórkowej.The microsystem according to the invention is characterized by the fact that it easily enables the production of an advanced three-dimensional cell culture of various cell lines, thanks to the use of an additional structural element in the form of a porous polymeric membrane. Culturing cells in this microsystem makes it possible to use the invention as a tool for the rapid initial evaluation of the effectiveness of new drugs and therapeutic procedures in vitro that better reflect in vivo conditions than standard cell culture techniques.

Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, że umożliwia jednoczesną hodowlę dwóch adherentnych linii komórkowych po dwóch różnych stronach porowatej membrany polimerowej. W żadnym z opisywanych w stanie techniki rozwiązań nie jest możliwym prowadzenie takiej hodowli. Zgodnie z wynalazkiem, w pierwszym etapie komórki pierwszej linii wprowadzane są dwoma kanałami doprowadzającymi do przestrzeni znajdujących się nad membraną polimerową. Po 24 godzinach od wprowadzenia komórki ulegają adhezji do membrany. Po tym czasie komórki drugiej linii komórkowej wprowadzane są dwoma innymi kanałami doprowadzającymi, znajdującymi się po przeciwnej stronie układu. Po wprowadzeniu komórek mikrosystem jest odwracany o 180° i utrzymywany w ten sposób przez kolejne 24 godziny (do momentu adhezji komórek drugiej linii komórkowej do drugiej strony membrany). Mikrosystem daje także możliwość hodowli tej samej linii komórkowej po dwóch różnych stronach membrany.The microsystem of the invention is designed in such a way that it allows the simultaneous cultivation of two adherent cell lines on two different sides of a porous polymeric membrane. In none of the solutions described in the prior art it is possible to carry out such breeding. According to the invention, in a first step, the first line cells are introduced through two feed channels into the spaces above the polymer membrane. 24 hours after introduction, cells adhere to the membrane. After this time, the cells of the second cell line are introduced through two other delivery channels on the opposite side of the array. After the cells are introduced, the microsystem is inverted through 180 ° and held in this way for a further 24 hours (until the cells of the second cell line adhere to the other side of the membrane). The microsystem also makes it possible to grow the same cell line on two different sides of the membrane.

Mikrosystem według wynalazku daje możliwość tworzenia trójwymiarowej (3D) hodowli komórkowej. Struktura przestrzenna otrzymywana jest dzięki nałożeniu dwóch monowarstw komórkowych rosnących po dwóch różnych stronach membrany, które pozostają ze sobą w bezpośrednim kontakcie dzięki obecności porów w membranie. Porowatość membrany umożliwia tworzenie się połączeń międzykomórkowych występujących naturalnie w strukturach tkankowych, tworzenie wspólnej dla obu hodowli macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zachowanie aktywności szlaków sygnałowych komórka-komórka i komórkaECM charakterystycznych dla przestrzennych struktur komórkowych. Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w celu tworzenie modelu komórkowego użytecznego w analizie skuteczności kombinacji różnych procedur terapii przeciwnowotworowych oraz do analizy migracji komórkowej.The microsystem according to the invention makes it possible to create a three-dimensional (3D) cell culture. The spatial structure is obtained by the superposition of two cell monolayers growing on two different sides of the membrane, which are in direct contact with each other due to the presence of pores in the membrane. The porosity of the membrane enables the formation of intercellular connections that occur naturally in tissue structures, the formation of an extracellular matrix common to both cultures, and the maintenance of the cell-cell and ECM signaling pathways characteristic of spatial cell structures. The microsystem of the invention has been designed to create a cellular model useful in the analysis of the effectiveness of a combination of various anticancer therapy procedures and in the analysis of cell migration.

Mikrosystem według wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia schemat mikrostruktury układu w widoku z góry, Fig. 2 przedstawia przekrój poprzeczny mikrokomór hodowlanych i membrany porowatej wzdłuż linii A-A, Fig. 3 przedstawia warstwy mikrosystemu, a Fig. 4 przedstawia mikroukład w rzucie ukośnym.The microsystem according to the invention is illustrated in an embodiment in the drawing, in which Fig. 1 shows a diagram of the microstructure of the system in top view, Fig. 2 shows a cross-section of the culture microcells and the porous membrane along the line AA, Fig. 3 shows the layers of the microsystem, and Fig. 4 shows the microcircuit in a diagonal projection.

Mikrosystem według wynalazku wykonano z górnej płytki polimerowej 1 wykonanej z PDMS, porowatej membrany PET 2 oraz z górnej płytki polimerowej 3 wykonanej z PDMS. Górna płytka 1 i dolnaThe inventive microsystem was made of an upper polymer plate 1 made of PDMS, a porous PET membrane 2 and an upper polymer plate 3 made of PDMS. Top plate 1 and bottom plate

PL 239 601 B1 płytka 3 z PDMS wyposażone są w analogiczne mikrostruktury przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie. Każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór 4 połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi 5 i jednym kanałem odprowadzającym 6. W górnej płytce polimerowej 1 znajdują się otwory doprowadzające 7 i otwory odprowadzające 8 do odprowadzania zawiesin komórkowych, mediów hodowlanych oraz reagentów. Wszystkie mikrostruktury: mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm. Porowata membrana PET jest okrągłego kształtu, o średnicy 25 mm, wyposażona w pory o średnicy 0.4 μm, rozmieszczone na membranie z gęstością 2 x 10⁶ cm^-2.The PDMS plate 3 is provided with analogous microstructures, the microstructures being rotated in relation to each other by 180 ° horizontally. Each of the microstructures consists of six elongated microcells 4 connected by a network of symmetrical, sinusoidal microchannels with two feed channels 5 and one discharge channel 6. The upper polymer plate 1 has feed holes 7 and drain holes 8 for draining cell suspensions, culture media and reagents . All microstructures: microchannels and microchamber are 50 μm high. The porous PET membrane is circular in shape, 25 mm in diameter, provided with pores 0.4 μm in diameter, distributed over the membrane with a density of 2 × 10 ⁶ cm ^-2 .

W pierwszym etapie geometrię mikrosystemu zaprojektowano w programie AutoCAD, a następnie wzór odzwierciedlający geometrię naświetlono na foli, w wysokiej rozdzielczości 3600 dpi, tworząc maskę. Maskę wykorzystano do wytworzenia pieczątki, czyli wypukłej mikrostruktury ze światłoczułego materiału, korzystnie filmu kapilarnego, za pomocą metody fotolitografii. Metoda fotolitografii polega na naświetleniu i utwardzeniu filmu kapilarnego światłem UV w wybranych miejscach oraz odmyciu filmu kapilarnego z miejsc nienaświetlonych. W kolejnym etapie na pieczątkę z wypukłą strukturą, umieszczoną w formie, wylano płynny PDMS, czyli odgazowaną mieszaninę prepolimeru i czynnika sieciującego w stosunku 10 : 1, a następnie PDMS sieciowano w temperaturze 70°C przez 90 minut. Usieciowaną górną płytkę polimerową 1 zamrożono w ciekłym azocie, a następnie wywiercono otwory 7 doprowadzające i otwory odprowadzające 8 zawiesiny komórkowe, medium hodowlane oraz reagenty. Obie płytki polimerowe 1 i 3 oraz membranę polimerową 2 połączono ze sobą za pomocą plazmy tlenowej, tak, aby membrana PET znajdowała się miedzy płytkami z PDMS, dokładnie w miejscu nakładania się mikrokomór hodowlanych 4. W wykonanych otworach umieszczono wężyki. W procesie łączenia elementów mikrosystemu naprzemianlegle ułożone mikrostruktury utworzyły nienakładające się sieci mikrokanałów doprowadzających 5 i odprowadzających 6.In the first stage, the geometry of the microsystem was designed in AutoCAD, and then the pattern reflecting the geometry was exposed on the foil at a high resolution of 3600 dpi, creating a mask. The mask was used to produce a stamp, i.e. a convex microstructure from a photosensitive material, preferably a capillary film, using the photolithography method. The method of photolithography consists in irradiating and hardening the capillary film with UV light in selected places and washing the capillary film from unexposed places. In the next step, liquid PDMS, i.e. a degassed mixture of prepolymer and cross-linking agent in the ratio of 10: 1, was poured over the stamp with a convex structure, placed in the mold, and then PDMS was cross-linked at the temperature of 70 ° C for 90 minutes. The cross-linked upper polymer plate 1 was frozen in liquid nitrogen, and then holes 7 for feeding and drainage holes 8 for cell suspensions, culture medium and reagents were drilled. Both polymer plates 1 and 3 and the polymer membrane 2 were connected with each other by means of oxygen plasma, so that the PET membrane was placed between the PDMS plates, exactly at the overlapping point of the culture microcells 4. Tubes were placed in the holes made. In the process of joining the elements of the microsystem, alternately arranged microstructures formed non-overlapping networks of supply 5 and outgoing microchannels 6.

Mikrosystem według wynalazku został wykorzystany do hodowli komórek prawidłowych i nowotworowych jajnika w ułożeniu przestrzennym. Do wysterylizowanego mikroukładu wprowadzono medium hodowlane. Następnie, przez kanały doprowadzające do przestrzeni mikrokomór hodowlanych znajdujących się nad membraną wprowadzono zawiesinę prawidłowych komórek jajnika o gęstości około 105 komórek mL-¹. Mikrosystem z komórkami inkubowano przez 24 h w inkubatorze (T = 37°C, CO2 = 5%) do momentu, kiedy komórki uległy adhezji do membrany. Po 24 h do przestrzeni mikrokomór znajdujących się pod membraną wprowadzono zawiesinę komórek nowotworowych jajnika o gęstości około 105 komórek mL^-1. Mikrosystem odwrócono o 180° i inkubowano w inkubatorze (T = 37°C, C02 = 5%) przez kolejne 24 h, do momentu adhezji komórek nowotworowych do drugiej strony membrany. Tak otrzymaną hodowlę przestrzenną monitorowano za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, a następnie wykorzystano do przeprowadzenia procedury chemioterapii. Do hodowanych komórek wprowadzano roztwory doksorubicyny w różnych stężeniach, zawiązek inkubowano z komórkami 24 h, a następnie oceniano niezależnie żywotność komórek prawidłowych i nowotworowych, wykorzystując różnicowe barwienie komórek barwnikami fluorescencyjnymi: kaleceiną-AM i jodkiem propidyny.The microsystem according to the invention was used to cultivate normal and neoplastic ovarian cells in a spatial arrangement. A culture medium was introduced into the sterilized microcircuit. ^{Then, a suspension of normal ovarian cells with a density of about 105 mL-1} cells was introduced through the supply channels into the space of culture microcells located above the membrane. The microsystem with cells was incubated for 24 h in an incubator (T = 37 ° C, CO2 = 5%) until cells adhered to the membrane. After 24 h, a suspension of ovarian cancer cells with a density of about 105 mL ^-1 cells was introduced into the microcellular space under the membrane. The microsystem was inverted 180 ° and incubated in an incubator (T = 37 ° C, CO 2 = 5%) for another 24 h, until tumor cells adhered to the other side of the membrane. The thus obtained spatial culture was monitored with an inverted optical microscope and then used for the chemotherapy procedure. Doxorubicin solutions in various concentrations were introduced into the cultured cells, the germ was incubated with the cells for 24 h, and then the viability of normal and neoplastic cells was assessed independently, using differential staining of cells with fluorescent dyes: calecin-AM and propidium iodide.

Zastrzeżenia patentowePatent claims

Claims (3)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Mikrosystem przepływowy do trójwymiarowej hodowli komórek, zawierający dwie płytki polimerowe z poli(dimetylosiloksanu), zaopatrzone w sieć mikrokanałów, komory hodowlane oraz otwory wlotowe i wylotowe, znamienny tym, że pomiędzy płytką górną (1) a płytką dolną (2) znajduje się porowata membrana polimerowa a górna płytka (1) i dolna płytka (3) wyposażone są w analogiczne mikrostruktury, przy czym mikrostruktury obrócone są wobec siebie o 180° w poziomie i każda z mikrostruktur składa się z sześciu podłużnych mikrokomór (4) połączonych siecią symetrycznych, sinusoidalnych mikrokanałów z dwoma kanałami doprowadzającymi (5) i jednym kanałem odprowadzającym (6), a ponadto otwory doprowadzające (7) i otwory odprowadzające (8) znajdują się w górnej płytce polimerowej (1), przy czym porowata membrana polimerowa (2) ma kształt okrągły i śred nicę 25 mm oraz wykonana jest z poli(tereftalanu etylenu).1. A flow microsystem for three-dimensional cell culture, comprising two poly (dimethylsiloxane) polymer plates, provided with a network of microchannels, culture chambers and inlet and outlet openings, characterized in that there is a position between the upper plate (1) and the lower plate (2) porous polymer membrane and the upper plate (1) and lower plate (3) are equipped with analogous microstructures, where the microstructures are rotated by 180 ° horizontally and each microstructure consists of six elongated microcells (4) connected by a symmetrical network, of sinusoidal microchannels with two supply channels (5) and one discharge channel (6), moreover, supply openings (7) and discharge openings (8) are provided in the upper polymer plate (1), the porous polymer membrane (2) having the shape round with a diameter of 25 mm and made of poly (ethylene terephthalate). 2. Mikrosystem według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie mikrokanały oraz mikrokomory mają wysokość 50 μm.2. The microsystem according to claim The method of claim 1, wherein all the microchannels and microchamber are 50 Pm high. 3. Mikrosystem według zastrz. 1, znamienny tym, że pory w membranie (2) mają średnicę 0.4 μm i gęstość 2 x 10⁶ cm^-2.3. The microsystem according to claim The method of claim 1, characterized in that the pores in the membrane (2) have a diameter of 0.4 Pm and a density of 2 x ¹⁰⁶ cm ^-2 .