PL239045B1

PL239045B1 - Epitop specyficzny dla zakaźnych Streptococcus agalactiae oraz sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae

Info

Publication number: PL239045B1
Application number: PL424214A
Authority: PL
Inventors: Sabina GÓRSKA; Sabina Górska; Ewa BRZOZOWSKA; Ewa Brzozowska; Andrzej Gamian; Monika BRZYCHCZY-WŁOCH; Monika Brzychczy-Włoch; Anna DOBRUT; Anna Dobrut
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk; Univ Jagiellonski
Priority date: 2018-01-09
Filing date: 2018-01-09
Publication date: 2021-11-02
Also published as: US20210033607A1; EP3737948A4; PL424214A1; EP3737948A1; WO2019139494A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny służący do wykrywania, w sposób wysoce specyficzny i czuły, zakażeń i nosicielstwa Streptococcus agalactiae (ang. Group B Streptococcus; GBS) u ludzi. W teście diagnostycznym wykorzystane są markery zwane dalej epitopami, które w teście immunoenzymatycznym rozpoznawane są przez przeciwciała ludzkie różnych klas (IgG, IgM i IgA) obecne w surowicy. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae umożliwiającego potwierdzenie zakażeń u kobiet w ciąży, który to sposób wykorzystuje specyficzną reakcję białek immunoreaktywnych otrzymanych z izolatów klinicznych Streptococcus agalactiae z przeciwciałami obecnymi w surowicy pacjentek.

Streptococcus agalactiae, zaliczany do paciorkowców grupy serologicznej B (ang. group B streptococcus - GBS) może kolonizować dolny odcinek przewodu pokarmowego, odbyt i pochwę, nie wywołując żadnych objawów zakażenia. Potwierdzono, że GBS występuje w pochwie lub odbytnicy u około 10-30% ciężarnych kobiet. Kolonizacja ta może mieć charakter przejściowy, przewlekły lub przerywany. Jednakże, obecność paciorkowców grupy B w pochwie u kobiet ciężarnych stanowi istotny czynnik ryzyka wystąpienia zakażeń u noworodków. Do zakażenia wewnątrzmacicznego może dojść w trakcie trwania ciąży, drogą wstępującą, jak również na skutek zaaspirowania zakażonego płynu owodniowego przez płód. Może być to przyczyną zgonu wewnątrzmacicznego, zapalenia płuc w okresie noworodkowym lub posocznicy. Do kolonizacji noworodka może dojść także w czasie porodu, ale w tych przypadkach częściej, dochodzi tylko do bezobjawowej kolonizacji skóry oraz błon śluzowych, a nie do rozwoju zakażenia. Szybka diagnostyka w kierunku zakażeń wywołanych przez GBS jest niezbędna dla możliwości zastosowania celowanej antybiotykoterapii, jednakże obecnie na rynku brak jest testów diagnostycznych, umożliwiających potwierdzenie zakażeń wywołanych przez Streptococcus agalactiae.

W zgłoszeniu patentowym P.404498 zaprezentowano sekwencje czterech białek (NRID1, NRID2, NRID3, NRID4) należących do szczepów Streptococcus agalactiae, wywołujących zakażenia u ludzi, które były wysoce immunoreaktywne z surowicami osób, które przeszły zakażenie o etiologii GBS i nosicieli tych bakterii. Brak podobnej reaktywności zanotowano w przypadku surowic osób niezakażonych oraz niebędących nosicielami S. agalactiae.

Zgłoszenie EP20070825757 dotyczy polipeptydowych pochodnych epitopów białka należącego do Streptococcus agalactiae - GBS80 oraz użycie wspomnianego epitopu do celów diagnostycznych. Diagnostyka dotyczy zakażeń u zwierząt. Epitop polipeptydowy należy do sekwencji białka o nazwie ang. cell wall surace anchore protein in GBS. Są to odmienne epitopy polipeptydowe do tych ujętych niniejszym zgłoszeniem. Inny rodzaj epitopów, które mogą być narzędziem diagnostycznym zakażeń GBS oraz, które różnią się od tych opisywanych w niniejszym zgłoszeniu, ujęty został w zgłoszeniu nr PCT/IB2002/003059.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych metod wykrywania zakażeń wywołanych przez Streptococcus agalactiae oraz środków, które mogą być wykorzystane do realizacji takich metod. Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest epitop specyficzny dla zakaźnych Streptococcus agalactiae posiadający sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 oraz ich pochodnych wybranych spośród Sekw. Nr 16-27.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae, charakteryzujący się tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność epitopu posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 lub przeciwciał specyficznych wobec epitopu posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 lub przeciwciał specyficznych wobec pochodnej epitopu posiadającej sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 16-27, przy czym obecność tego epitopu lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae.

Korzystnie, badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA.

Równie korzystnie, jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500 - 10000 razy.

W szczególnej realizacji obecność epitopu lub przeciwciał świadczy o nosicielstwie przez pacjenta szczepu Streptococcus agalactiae.

Szczegółowy opis

PL 239 045 B1

Ujawnione zostały sekwencje aminokwasowe dwóch białek immunoreaktywnych chorobotwórczych szczepów Streptococcus agalactiae, a mianowicie NRID5 i NRID6 (Sekw. Nr 1 i 2, Fig. 1), a także, co najmniej, 13 epitopów rdzennych, wchodzących w skład sekwencji aminokwasowych poznanych białek immunoreaktywnych (tj. NRID2, NRID4, NRID5 i NRID6) pochodzących z klinicznych szczepów Streptococcus agalactiae (Tab. 2). Epitopy polipeptydowe oznaczono kolejno symbolami Ep1 - Ep13 (Tab. 1). Przy czym, w wyniku modyfikacji epitopów rdzennych uzyskano epitopy pochodne rozpoznawane przez ludzkie przeciwciała z możliwie największą swoistością. Modyfikacja polega na skracaniu od N i/lub C-końca epitopów rdzennych oraz/lub podstawieniu jednego innym aminokwasem (Tab. 4, Fig. 4). Nieoczekiwanie, niektóre modyfikacje doprowadziły do uzyskania epitopów o wyższej immunoreaktywności niż obserwowana dla epitopu naturalnego.

Białka o sekwencjach oznaczonych NRID5 i NRID6 nieoczekiwanie okazały się być wysoce immunoreaktywnymi białkami produkowanymi przez szczepy Streptococcus agalactiae wywołujące zakażenia u ludzi. Białka te powodują naturalną immunizację, co manifestuje się ich wysoką immunoreaktywnością z surowicami osób zakażonych GBS oraz nosicieli tych bakterii (patrz Tab. 3). Brak podobnej reaktywności zanotowano w przypadku surowic osób niezakażonych oraz niebędących nosicielami Streptococcus agalactiae (patrz Fig. 2).

Ujawniony sposób jest rozwiązaniem umożliwiającym szybką, czułą i specyficzną diagnostykę zakażenia i nosicielstwa wywołanego przez Streptococcus agalactiae. Nowatorskim podejściem w opracowanym teście jest wykorzystanie epitopów pojedynczo i/lub w kombinacji, które są rozpoznawane przez przeciwciała ludzkie. Epitopy Ep1 - Ep13 oraz ich pochodne mogą dalej posłużyć do wytworzenia wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych.

Ujawniony sposób obejmuje metody immunochemiczne, takie jak np. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

W korzystnej realizacji sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:

a) Płytki 96-cio dołkowe opłaszcza się epitopem pojedynczym i/lub w kombinacji po kilka epitopów immunoreaktywnych, będącymi markerami zakażeń i/lub nosicielstwa szczepów Streptococcus agalactiae, korzystnie w stężeniu 1,0-100 pg/ml w buforze o pH zasadowym. Poddaje się reakcji blokowania wolnych miejsc przy użyciu czynnika blokującego, korzystnie 0,5-5,0% BSA w buforze fosforanowym.

b) Przeprowadza się reakcję z surowicą ludzką rozcieńczoną 500-10000 razy, inkubuje na kołysce w 37°C przez godzinę, odmywa się nadmiar przeciwciał przy użyciu buforu fosforanowego z detergentem, korzystnie z Tween-20 w stężeniu 0,01-0,5%.

c) Wykonuje się reakcję z koniugatem przeciwciał antyludzkich z zasadową fosfatazą w rozcieńczeniu 500-10000 razy na kołysce w 37°C przez 1 godzinę. Nadmiar koniugatu odmywa się przy użyciu buforu fosforanowego z Tween-20.

d) Test wizualizuje się przy użyciu substratów dla zasadowej fosfatazy.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony na przykładzie.

P r z y k ł a d 1

Określenie immunoreaktywności epitopów z wykorzystaniem metody PEPSCAN [J. Mark Carter 1996]

Bibliotekę kilkudziesięciu epitopów uzyskano w wyniku syntezy chemicznej na polietylenowych pinach (NCP Block of 96 gears - Mimotopes, nr kat.: MIA10750001) z wykorzystaniem Fmoc pochodnych aminokwasów wg procedury:

1. DEPROTEKCJA - piny inkubowano w 20% roztworze piperydyny (PIP) rozpuszczonej w dimetyloformamidzie (DMF) przez 1 godzinę.

2. PŁUKANIE - piny płukano jednokrotnie w DMF przez 2 minuty, następnie czterokrotnie w metanolu (MeOH) przez 2 minuty i osuszano.

3. SPRZĘGANIE (acylacja aminokwasów) - piny aktywowano w DMF przez 5 minut, a następnie sprzęgano z 60 mM pochodną aminokwasu rozpuszczoną w DMF z 65 mM 1-hydroksy-7-azabenzotriazolem (HoAt) i 60 mM diisopropylokarbodiimidem (DIC) i 50 μM błękitem bromofenolowym, stosowanym jako indykator końca reakcji acylacji. Aminoacylacja prowadzona była w temperaturze pokojowej (~22°C) przez całą noc lub przez 4 godziny w szczelnie zamkniętym naczyniu, aby zapobiec parowaniu roztworu.

4. PŁUKANIE

Wariant A: jeżeli synteza była kontynuowana piny jednokrotnie płukano w MeOH przez 5 minut, suszono na powietrzu przez 5 minut, a następnie inkubowano przez 5 minut w DMF.

PL 239 045 B1

Wariant B: przy zakończeniu syntezy piny jednokrotnie płukano w MeOH przez 5 minut, suszono na powietrzu przez 5 minut, następnie inkubowano w DMF przez 5 minut. Po jej zakończeniu piny dwukrotnie płukano w MeOH przez 2 minuty i suszono na powietrzu przez 30 minut.

5. ELONGACJA - polegała na cyklicznym powtarzaniu etapów 1-4.

6. N-ACETYLACJA (opcjonalnie) - acetylację grup α-aminowych zsyntetyzowanych peptydów prowadzono w dołkach płytki polietylenowej za pomocą koktajlu acetylującego (3% bezwodnik octowy, 0,5% N,N-diizopropyloetyloamina (DIEA) rozpuszczone w DMF) przez 90 minut.

7. PŁUKANIE - piny jednokrotnie płukano w MeOH przez 10 minut i suszono na powietrzu przez 15 minut.

8. ODBLOKOWANIE / USUNIĘCIE GRUP BOCZNYCH - boczne grupy blokujące usuwano z aminokwasów poprzez 3-4 godzinną inkubację w łaźni z koktajlem odblokowującym (2,5% anizol, 2,5% 1,2 ditioetan w kwasie trifluorooctowym (TFA)).

9. PŁUKANIE - piny jednokrotnie płukano w MeOH przez 10 minut po czym inkubowano je w roztworze kwasu octowego (0,5% kwasu octowego, 50% MeOH rozcieńczonych w wodzie) przez 60 minut. Następnie piny dwukrotnie płukano w MeOH przez 2 minuty i suszono przez noc nad żywicą osuszającą.

10. DYSRUPCJA - piny umieszczono w sonikatorze wypełnionym buforem do dysrupcji (1% siarczan dodecyl sodu, 0,1% 2-merkaptoetanol, 0,1 M fosforan sodu; pH 7,2) podgrzanym do temperatury ok. 60°C i sonikowano przez 10 minut (7 kW/25 kHz). Następnie piny usuwano z buforu i opłukiwano w wodzie ogrzanej do 60°C.

Po dysrupcji piny przechowywano w warunkach bezwodnych (np. w obecności substancji pochłaniającej wodę lub w eksykatorze w warunkach próżniowych) lub używano bezpośrednio do ELISA.

P r z y k ł a d 2

Test ELISA [Andersson, et al., 1989]

1. Syntetyczne epitopy na pinach zanurzano w buforze blokującym Tris/HCl z Tween 20 (TBS-T) zawierającym 1% BSA i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

2. Piny przemywano trzykrotnie buforem TBS-T przez 5 minut.

3. Po odpłukaniu piny inkubowano w roztworze surowicy ludzkiej rozcieńczonej 1:1000 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

4. Piny przemywano trzykrotnie buforem TBS-T przez 5 minut.

5. Piny zanurzono w roztworze z przeciwciałami kozimi anty-ludzkimi sprzężonymi z alkaliczną fosfatazą rozcieńczonymi 1:10 000 i inkubowano przez 1 godzinę.

6. Piny przemywano trzykrotnie buforem TBS-T przez 5 minut.

7. Po przemyciu, piny zanurzono w roztworze z substratem dla alkalicznej fosfatazy i przez 30 minut wywoływano barwną reakcję.

8. Piny wyjmowano i odczytano absorbancję przy λ = 405 nm.

P r z y k ł a d 3

Synteza na żywicy Wanga metodą Fmoc stosowana do uzyskania epitopów rdzennych oraz ich modyfikowanych pochodnych [Bachem, 2016]

1. Żywicę aktywowano w 20% roztworze piperydyny (PIP) rozcieńczonej w dimetyloformamidzie (DMF) przez 15 minut.

2. Żywicę sześciokrotnie opłukiwano 2 ml DMF.

3. Do żywicy przyłączano kolejne aminokwasy, dodając odpowiednią ich ilość określoną według wzoru:

mzwiązku = n(miejsc aktywnych)*2,5 eq*Mzwiązku oraz 43,7 μl 1-hydroksy-7-azabenzotriazolu (HoAt) i 43,9 μl diisopropylokarbodiimidu (DIC). Inkubację prowadzono od 6 do 36 godzin w zależności od charakteru przyłączanego aminokwasu.

4. Żywicę sześciokrotnie opłukiwano 2 ml DMF.

5. Etapy 2-4 powtarzano cyklicznie do momentu uzyskania peptydu o pożądanej sekwencji.

6. Peptyd usuwano z żywicy przy użyciu 95% roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA) rozpuszczonego w wodzie.

7. Peptyd wytrącano eterem i wirowywano, następnie rozpuszczano w wodzie i liofilizowano.

PL 239 045 B1

Wyniki i wnioski

W wyniku przeprowadzonych eksperymentów zidentyfikowano 13 epitopów rdzennych (Tab. 1), które w sposób wysoce specyficzny rozpoznawane były przez ludzkie przeciwciała obecne w surowicy krwi pępowinowej pacjentek zakażonych i/lub nosicielek GBS (GBS+). Reakcji nie obserwowano z surowicą osób GBS negatywnych (GBS-) (Fig. 3).

Modyfikacje polegające na podstawianiu poszczególnych aminokwasów m.in. alaniną, czy glicyną oraz biotynylacja peptydów spowodowały wzrost immunoreaktywności w granicach od 7 do 80%, co jest rezultatem nieoczywistym (Fig. 4). Wykazano również, że użycie w teście kombinacji pochodnych epitopów po dwa i/lub trzy, zwiększa specyficzność w reakcji z przeciwciałami krwi pępowinowej do ok. 40% w stosunku do pojedynczego epitopu.

PIŚMIENNICTWO:

Andersson G., Ekre H.P., Alm G., Perlmann P. Monoclonal antibody two-site ELISA for human IFNgamma. Adaptation for determinations inhuman serum or plasma. J Immunol Methods. 1989; 125: 89-96.

Solid phase synthesis Bachem (002363) published by Global Marketing, Bachem Group, February 2016.

Carter J.M. Epitope Mapping of a Protein Using the Geysen (PEPSCAN) Procedure. The Protein Protocols Handbook; 1996, Part V, 581-593.

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt

SEQUENCE LISTING <110? Uniwersytet Jagielloński <120> Test diagnostyczny do wykrywania zakażeń i/lub nosicielstwa

Streptococcus <130> PK/4506/RW <160> 27 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 493 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <4Θ0> 1

Met Ser Asn Trp Asp Thr Lys Phe

5

Leu Lys Lys Gly Phe Thr Phe Asp

15

Asp Val Leu Leu Ile Pro Ala Glu 20

Ser His Val Leu Pro Asn Glu Val

30

Asp Met Asn Thr Lys Leu Ala Asp

40

Asn Leu Thr Leu Asn Ile Pro Ile

Ile Thr Ala Ala Met Asp Thr Val

55

Thr Asp Ser Lys Met Ala Ile Ala 60

Ile Ala Arg Ala Gly Gly Leu Gly 65 70

Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile

80

Val Asp Gin Ala Glu Glu Val Arg 85

Lys Val Lys Arg Ser Glu Asn Gly

95

Val Ile Ile Asp Pro Phe Phe Leu

100

Thr Pro Asp Asn Thr Val Ser Glu

105 110

Ala Glu Glu Leu Met Gin Asn Tyr

115 120

Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val

125

PL 239 045 Β1

Glu Thr Leu Glu Asn Arg Lys

130 135

SEQLTXT.txt

Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp

140

Met Arg Phe Ile Ser Asp Tyr

145 150

Gin Leu Ile Ser Glu His Met Thr

155 160

Ser Gin Asn Leu Val Thr Ala

165

Ile Gly Thr Asp Leu Glu Thr Ala

170 175

Glu Arg Ile Leu His Glu His

180

Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp

185 190

Asp Glu Gly Arg Leu Ser Gly

195

Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys

205

Val Ile Glu Phe Pro Lys Ala

210 215

Lys Asp Glu Phe Gly Arg Leu Leu

220

Val Ala Gly Ala Val Gly Val

225 230

Ser Asp Thr Phe Glu Arg Ala Glu

235 240

Ala Leu Phe Glu Ala Gly Ala

245

Ala Ile Val Ile Asp Thr Ala His

250 255

Gly His Ser Ala Gly Val Leu 260

Lys Ile Ala Glu Ile Arg Ala His 265 270

Phe Pro Asn Arg Thr Leu Ile

275

Gly Asn Ile Ala Thr Ala Glu Gly

285

Ala Arg Ala Leu Tyr Asp Ala

290 295

Val Asp Val Val Lys Val Gly Ile

300

Gly Pro Gly Ser Ile Cys Thr

305 310

Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val

315 320

Pro Gin Ile Thr Ala Ile Tyr

325

Ala Ala Ala Val Ala Arg Glu Tyr

330 335

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt

Gly Lys Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Tyr Ser Gly Asp Ile

340 345350

Val Lys Ala Leu Ala Ala Gly Gly Asn Ala Val Met Leu Gly Ser Met

355 360365

Phe Ala Gly Thr Asp Glu Ala Pro Gly Glu Thr Glu Ile Phe Gin Gly

370 375380

Arg Lys Phe Lys Thr Tyr Arg Gly Met Gly Ser Ile Ala Ala Met Lys

385 390 39540Θ

Lys Gly Ser Ser Asp Arg Tyr Phe Gin Gly Ser Val Asn Glu Ala Asn

405 410415

Lys Leu Val Pro Glu Gly Ile Glu Gly Arg Val Ala Tyr Lys Gly Ser

420 425430

Val Ala Asp Ile Val Phe Gin Met Leu Gly Gly Ile Arg Ser Gly Met

435 440445

Gly Tyr Val Gly Ala Ala Asn Ile Lys Glu Leu His Asp Asn Ala Gin

450 455460

Phe Val Glu Met Ser Gly Ala Gly Leu Lys Glu Ser His Pro His Asp

465 470 475480

Val Gin Ile Thr Asn Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Val His

485490 <210>2 <211> 540 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400>2

Met Ala Lys Asp Ile Lys Phe Ser Ala Asp Ala 1510

Arg Ser Ala Met Val

Arg Gly Val Asp Ile Leu Ala Asp Thr Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt 25

Lys Gly

Thr Asn

Phe Glu 65

Asn Asp

Arg Asn 35

Asp Gly

Asn Met

Ile Ala

Ala Ile

Val Arg

100

Ile Gly

Ile Arg 115

Glu Leu

130

Lys Glu

Gin Val

145

Ala Ala

Ser Glu

Ala Met

Glu Ser

Arg Gly

180

Phe Asp

Arg Gly 195

Met Val

210

Ser Glu

Val Val

Val Thr

Gly Ala

Gly Asp 85

Glu Gly

Arg Gly

Ile Ala

Val Ser

150

Glu Arg 165

Met Glu

Tyr Leu

Leu Glu

Leu Glu 40

Ile Ala 55

Lys Leu

Gly Thr

Leu Lys

Lys Ala

Lys Glu

Val Ser

Thr Thr

Asn Val

105

Phe Gly

Ile Glu

Glu Val 75

Ala Thr

Thr Ala

Ile Glu

120

Thr Ala

Val Ser

Gin Pro 135

Val Ser

Gly Lys

140

Ser Arg

Val Gly

Thr Glu

Ser Gin

200

Asn Pro

215

Ser Glu

Lys Val

155

Asn Asp

170

Gly Val

Leu Glu

185

Val Val

Tyr Met

Val Thr

Tyr Ile

Leu Ile

220

Ser Pro 45

Leu Glu

Ala Ser

Val Leu

Gly Ala

110

Ala Ala 125

Glu Ala

Gly Glu

Ile Thr

Glu Gly

190

Asp Asn 205

Thr Asp

Leu Ile

Asp His

Lys Thr 80

Thr Gin 95

Asn Pro

Val Glu

Ile Ala

Tyr Ile

160

Ile Glu

175

Met Gin

Glu Lys

Lys Lys

Ile Ser Asn Ile Gin Glu Ile Leu Pro Leu Leu Glu Glu Val Leu Lys

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt

225

230 235 240

Thr Asn Arg Pro Leu Leu Ile Ile Ala Asp Asp Val Asp Gly Glu Ala 245 250255

Leu Pro Thr Leu Val Leu Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Asn Val Val 260 265270

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Glu 275 280285

Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Thr Val Val Thr Glu Asp Leu Gly 290 295300

Leu Asp 305

Leu Lys Asp Ala Thr Met Gin Val Leu

310315

Gly Gin Ser Ala Lys

320

Val Thr Val Asp Lys Asp Ser Thr Val Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

325 330335

Ser Ser Ala Ile Ala Asn Arg Val Ala Ile Ile Lys Ser Gin Met Glu

340 345350

Ala Thr Thr Ser Asp Phe Asp Arg Glu Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala

355 360365

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu

370 375380

Thr Glu Leu Lys Glu Met Lys Leu Arg Ile Glu Asp Ala Leu Asn Ala

385 390 395400

Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ser Gly Gly Gly Thr Ala

405 410415

Leu Val Asn Val Ile Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Leu Asn Gly Asp

420 425430

Glu Glu Thr Gly Arg Asn Ile Val Leu Arg Ala Leu Glu Glu Pro Val

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt 435 440 445

Arg

Gin

450

Ile

Ala

Tyr

Asn

Ala

455

Gly

Tyr

Glu

Gly

Ser

460

Val

Ile

Glu

Arg 465

Leu

Lys

Gin

Ser

Glu

470

Ile

Gly

Thr

Gly

Phe

475

Asn

Ala

Asx

Gly 480

Glu

Trp

Val

Asp

Met

485

Val

Thr

Gly

Ile

490

Ile

Asp

Pro

Val

Lys

495

Val

Thr

Arg

Ser

Ala

500

Leu

Gin

Asn

Ala

505

Ser

Val

Ala

Ser

Leu

510

Ile

Leu

Thr

Glu

515

Ala

Val

Ala

Asn

520

Lys

Pro

Glu

Pro

Glu

525

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

530

Ala

Met

Asp

Pro

Ser

535

Met

Gly

Phe

540 <210> 3 <211> 16 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400> 3

Arg Ala Ala Ala Asp Tyr Leu Glu Val 1 5

Pro Leu Tyr Ser Tyr Leu Gly

15 < 210> 4 < 211> 14 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400 > 4

Asp Arg Ala Met Ile Ala Leu Asp Gly Thr Pro Asn Lys Gly 15 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt < 213> Streptococcus agalactiae <400> 5

Leu Thr Ala Ala Ile Thr Thr Val Leu Ala Arg Arg Leu Pro 15 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae <400> 6

Gly Gin Val Leu Ala Lys Pro Gly Ser Ile Asn Pro His Thr Lys Phe 15 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae <400> 7

Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg 15 10 15 <210> 8 <211> 10 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400> 8

Gin Gly Arg Lys Phe Lys Thr Tyr Arg Gly

10 < 210> 9 < 211> 10 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400> 9

Lys Ala Phe Gly Ser Pro Leu Ile Thr Asn

10

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 10

Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala 15 10 <210> 11 <211> 12 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae <400> 11

Met Val Thr Thr Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys Val 15 10 < 210> 12 < 211> 10 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400> 12

Lys Leu Gin Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala

10 <210> 13 < 211> 13 < 212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 13

Ala Ala Thr Glu Thr Glu Leu Lys Glu Met Lys Leu Arg 15 10 <210> 14 <211> 10 < 212> PRT < 213> Streptococcus agalactiae < 400> 14

Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gin Asn Ala

PL 239 045 Β1

	SEQLTXT.txt 10
1 5
<210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus agalactiae <400> 15
Leu Gin Asn Ala Ala Ser 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> pochodna epitopu <400> 16	Val Ala Ser Leu Ile Leu Thr Thr Glu 10 15
Met Val Thr Thr Gly Ile 1 5 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220> <223> pochodna epitopu <400> 17	Ile Asp Pro Val Ala 10
Met Val Thr Thr Gly Ile 1 5	Ile Asp Pro Ala Lys 10

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> pochodna epitopu <400> 18

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt

Met Val Thr Thr Gly Ile Ile Asp Ala Val Lys 15 10 <210> 19 < 211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> pochodna epitopu < 400> 19

Met Val Thr Thr Gly Ile Ile Ala Pro Val Lys 15 10 < 210> 20 < 211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> pochodna epitopu < 400> 20

Met Val Thr Thr Gly Ile Ala Asp Pro Val Lys 15 10 < 210> 21 < 211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

<223> pochodna epitopu <400> 21

Met Val Thr Thr Gly Ala Ile Asp Pro Val Lys

10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <220>

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt <223> pochodna epitopu <400> 22

Met Val Thr Thr Ala Ile Ile Asp Pro Val Lys 15 10 <210> 23 <211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> pochodna epitopu < 400> 23

Met Val Thr Ala Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys 15 10 <210> 24 <211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

<223> pochodna epitopu <400> 24

Met Val Ala Thr Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys 15 10 <210> 25 <211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> pochodna epitopu < 400> 25

Met Ala Thr Thr Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys 15 10 <210> 26 <211> 11

PL 239 045 Β1

SEQLTXT.txt <212> PRT <213> artificial <220>

<223> pochodna epitopu <400> 26

Ala Val Thr Thr Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys

10 <210> 27 <211> 11 < 212> PRT < 213> artificial <220>

< 223> pochodna epitopu < 400> 27

Met Val Thr Thr Gly Ile Ile Asp Pro Val Lys

10

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Epitop specyficzny dla zakaźnych Streptococcus agalactiae posiadający sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 oraz ich pochodnych wybranych spośród Sekw. Nr 16-27.
2. Sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae, znamienny tym, że w pobranej od pacjenta próbce sprawdza się obecność epitopu posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 lub przeciwciał specyficznych wobec epitopu posiadającego sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 3-15 lub przeciwciał specyficznych wobec pochodnej epitopu posiadającej sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 16-27, przy czym obecność tego epitopu lub takich przeciwciał świadczy o zakażeniu pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że badanie przeprowadza się z wykorzystaniem znanych metod immunochemicznych, zwłaszcza Western Blotting lub ELISA.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako badaną próbkę wykorzystuje się surowicę ludzką, zwłaszcza w rozcieńczeniu 500 - 10000 razy.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obecność epitopu lub przeciwciał świadczy o nosicielstwie przez pacjenta szczepu Streptococcus agalactiae.

PL 239 045 Β1

Tabela 1. Polipeptydowe epitopy rdzenne Streptococcus agalactiae.