PL238495B1

PL238495B1 - Urządzenie do wykrywania i/lub oznaczania stężenia analitu obecnego w tkance oraz sposób wykorzystujący to urządzenie

Info

Publication number: PL238495B1
Application number: PL420189A
Authority: PL
Inventors: Magdalena Staniszewska; Marcin STANISZEWSKI; Marcin Staniszewski
Original assignee: Sds Optic Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2017-01-14
Filing date: 2017-01-14
Publication date: 2021-08-30
Also published as: PL420189A1; ES2935205T3; WO2018132022A1; EP3612102B1; EP3612102A4; PL3612102T3; US11536651B2; EP3612102A1; US20210063307A1

Description

Opis wynalazku

DZIEDZINA TECHNIKI

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie do wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu obecnego w tkance, obejmujące czujnik, którym jest interferometr światłowodowy, a także sposób wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu obecnego w tkance przy pomocy tego urządzenia i zastosowanie tego urządzenia do wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu obecnego w tkance.

STAN TECHNIKI

W stanie techniki opisano urządzenie do detekcji toksyn w próbkach mleka oparte na biosensorze, w którym powierzchnia interferometru typu Fabry-Perot, będącego mikropłytką szklaną z przepływem kapilarnym, została opłaszczona fragmentami przeciwciał, tzw. Fab’ (Chalyan T et al., Asymmetric Mach-Zehnder Interferometer Based Biosensors for Aflatoxin M1 Detection, Biosensors 2016,6,1; doi:10.3390/bios6010001).

W zgłoszeniu US 10/483,586 (nr publikacji US20040186359 A) opisano urządzenie diagnostyczne wykorzystujące detekcję za pomocą opłaszczonego światłowodu; które wymaga jednak implantacji w organizmie.

W publikacji Clinical Chemistry, 1991, Evaluation of the Fiber-Optic Antibody-Based Fluoroimmunosensor for DNA Adducts in Human Placenta Samples, T. Vo-Dinh, J. P. Alarie, R. W. Johnson, M. J. Sepaniak i R. M. Santella opisano pomiar adduktów DNA za pomocą detekcji sygnału fluorescencyjnego przez pojedyncze włókno światłowodowe z przeciwciałami umieszczonymi w kieszonce na końcu włókna. Urządzenie wykorzystuje światło laserowe do wzbudzania i detekcji sygnału fluorescencyjnego. Pomiar adduktów wymaga przygotowania próbki przez jej hydrolizę w celu osiągnięcia wymaganej czułości.

Podobnie urządzenie i sposób pomiaru przedstawione w publikacji Biosensors and Bioelectronics 2007, Chemiluminescent optical fiber immunosensor for detection of autoantibodies to ovarian and breast cancer-associated antigens. Orly Salama, Sebastien Herrmann, Alina Tziknovsky b, Benjamin Piura, Michael Meirovich, Ilya Trakht, Brent Reed, Leslie I. Lobel, Robert S. Marks wymaga stosowania znacznika, np. chemiluminescencyjnego i przeciwciał drugorzędowych do detekcji. Urządzenie przygotowane jest do prowadzenia pomiaru w roztworze.

W dokumencie Nature Biotechnology 2000, Antibody-based nanoprobe for measurement of a fluorescent analyte in a single cell, Tuan Vo-Dinh, Jean-Pierre Alarie, Brian M. Cullum, i Guy D. Griffin opisano inne urządzenie wykorzystujące światłowód opłaszczony z pomocą przeciwciał, nadające się do stosowania w pojedynczej komórce. W tym urządzeniu pomiar również opiera się jednak na detekcji sygnału fluorescencyjnego, a urządzenie obejmuje pojedyncze włókno światłowodowe podłączone do mikroskopu fluorescencyjnego.

W stanie techniki wskazano już pewne rozwiązania umożliwiające rezygnację ze stosowania znaczników przy detekcji. Publikacja Scientific Reports 2014, Nanoscale Label-free Bioprobes to Detect Intracellular Proteins in Single Living Cells, Wooyoung Hong, Feng Liang, Diane Schaak, Marko Loncar i Qimin Quan opisuje urządzenie wykorzystujące światłowód opłaszczony z pomocą przeciwciał, niewymagające stosowania znaczników fluorescencyjnych, a oparte na technice powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Urządzenie przystosowano do dokonywania pomiaru w pojedynczej komórce i obejmuje ono włókno światłowodowe zakończone nanorurką ze złota pokrytą przeciwciałami. Przyłączenie się analitu powoduje przesunięcie sygnału LSPR. Podobnie w dokumencie Biosensors and Bioelectronics 2014, An enhanced LSPR fiber-optic nanoprobe for ultrasensitive detection of protein biomarkers, Mollye Sanders, Yongbin Lin, Jianjun Wei, Taylor Bono, Robert G. Lindquist opisano analogiczne rozwiązanie, także oparte na sondzie światłowodowej i wykorzystaniu sygnału LSPR z opłaszczonego przeciwciałami złotego nanodysku na końcu sondy. Urządzenie przystosowane jest do oznaczania analitu w roztworze. Nie opisano rozwiązań umożliwiających prowadzenie pomiaru bezpośrednio w tkance.

Obecnie znane rozwiązania nie dają możliwości prostego, mało-inwazyjnego oznaczania analitów bezpośrednio w tkankach, w tym w stałych tkankach, np. ale nie wyłącznie w litym guzie, czy to izolowanych, czy to in situ bezpośrednio u pacjenta, bez konieczności stosowania jakichkolwiek znaczników i bez uprzedniej preparacji tkanek. Obecne rozwiązania diagnostyczne wymagają pobierania próbek, utrwalania i/lub obróbki, przez co nie odzwierciedlają faktycznego stanu tkanki. Dodatkowo, urządzenia wykorzystujące przepływ substancji badanej przez urządzenie (jak w przypadku mikropłytek)

PL 238 495 B1 wymagają znacznych ilości próbki. Zastosowanie mikrosondy wykorzystywanej do pomiaru in situ zapewnia bezpieczeństwo stosowania oraz ogranicza ilość materiału niezbędnego do oznaczenia.

Twórcy niniejszego wynalazku opracowali więc modyfikację urządzenia umożliwiającego wykrywanie i/lub oznaczanie stężenia substancji obecnych w tkankach w ich naturalnym stanie i miejscu. Urządzenie według wynalazku umożliwia pomiar przyżyciowo lub w izolowanej tkance, także w stałej tkance, bez konieczności jakiegokolwiek jej przygotowywania. Wykorzystywana metoda pomiarowa jest szybka i czuła, nie wymaga stosowania znaczników fluorescencyjnych czy chemiluminescencyjnych.

Modyfikowanym urządzeniem jest czujnik optyczny wykorzystujący selektywne oddziaływanie z badaną substancją czynników wiążących immobilizowanych na powierzchni światłowodu stanowiącego ramię interferometru, przy czym stanowiący ramię interferometru światłowód zawierający immobilizowany czynnik wiążący umocowany jest wewnątrz prowadnicy, korzystnie metalowej prowadnicy, umożliwiającej wkłucie do tkanki i bezpośredni pomiar substancji obecnej w tkance, pozwalający na jej wykrycie i/lub oznaczanie stężenia. Dzięki takiej konstrukcji urządzenia według wynalazku, możliwe jest zastosowanie czujnika opartego na światłowodzie umożliwiające wprowadzenie czujnika w sposób niezaburzający pomiaru i nieuszkadzający czujnika, bezpośrednio do tkanki. Urządzenie według wynalazku umożliwia także pomiar in situ z zastosowaniem sondy opartej na światłowodzie w sposób bezpieczny i mało inwazyjny dla pacjenta. Prowadnica pozwala także chronić pacjenta przed pozostaniem fragmentu czujnika światłowodowego w tkance, np. w przypadku ewentualnego pęknięcia czy ułamania czujnika. Światłowód może być umocowany w prowadnicy i tym samym osłonięty w części lub na całej swojej długości, co umożliwia zmniejszanie wpływu ewentualnych wstrząsów na wynik pomiaru.

Czujnikiem przygotowywanym według wynalazku i stosowanym w sposobie według wynalazku jest interferometr. Interferometr w urządzeniu według wynalazku umieszczony jest w prowadnicy, korzystnie metalowej, o drugości w przedziale około 0,5 - 30 cm, średnicy wewnętrznej np. od około 0,1 mm - około 5 mm, średnicy zewnętrznej np. około 0,2 - 7 mm oraz kształcie np. zbliżonym do igły biopsyjnej. Interferometer przytwierdzony jest do wejściowego końca prowadnicy w dowolny odpowiedni sposób pozwalający na sterylizację czujnika, np. specjalistycznym klejem epoksydowym. Taki sposób przytwierdzenia zapewnia swobodny dopływ substancji badanej, a równocześnie zapewnia pozostawanie czujnika światłowodowego w odległości od ścianek prowadnicy, tak że ruch prowadnicy nie wpływa na wykonywany pomiar i nie powoduje zaburzenia pomiaru. Sposób przytwierdzenia zapewnia barierę dla przenikania zanieczyszczeń biologicznych i chemicznych oraz substancji, które mogłyby zaburzać pomiar.

Połączenie interferometru z prowadnicy wykonano w taki sposób, że ustawiono interferometr centralnie wewnątrz prowadnicy, tak aby oś rdzenia interferometru nie była przesunięta względem osi prowadnicy o wartość większą od 100 pm (mikrometrów). Następnie wypełniono przestrzeń pomiędzy interferometrem a prowadnicą np. klejem epoksydowym i poddano podgrzaniu w zakresie temperatur od +50°C do +200°C aż do uzyskania całkowitego zastygnięcia kleju. Schładzanie połączonego interferometru z prowadnicą przeprowadzano w kontrolowany sposób, tzn. spadek temperatury nie jest szybszy niż 10°C/s. Kontrolowanie szybkości wychładzania połączonego interferometru z prowadnicą pozwoliło na uzyskanie straty mocy optycznej / tłumienia interferometru na poziomie poniżej 0,02 dB.

Przedmiotem wynalazku jest więc urządzenie do wykrywania i/lub oznaczania stężenia analitu obecnego w tkance, obejmujące czujnik, którym jest interferometr światłowodowy, przy czym jedno ramię interferometru jest opłaszczone immobilizowanym czynnikiem wiążącym umożliwiającym selektywne wiązanie analitu obecnego w tkance, charakteryzujące się tym, że wymienione ramię interferometru opłaszczone immobilizowanym czynnikiem wiążącym umocowane jest wewnątrz prowadnicy umożliwiającej wkłucie do tkanki i dokonanie pomiaru in situ, bez konieczności pobierania czy przygotowywania próbki, przy czym prowadnica wyposażona jest w zamknięte czoło prowadnicy, podłużne perforacje na ściankach bocznych umożliwiające dotarcie analitu do czynnika wiążącego i otwór w wejściowym końcu prowadnicy dla wprowadzenia interferometru z ramieniem opłaszczonym czynnikiem wiążącym do prowadnicy, w wejściowym końcu prowadnicy, przy czym otwór jest uszczelniony, umożliwiając odizolowanie wnętrza prowadnicy od otoczenia, a interferometr mocowany jest w pozycji, w której interferometr nie dotyka ścianek wewnętrznych prowadnicy.

W korzystnym przykładzie urządzenia według wynalazku, interferometr umocowany jest centralnie wewnątrz prowadnicy, tak aby oś rdzenia interferometru nie była przesunięta względem osi prowadnicy o wartość większą od 100 pm.

PL 238 495 B1

W korzystnym przykładzie urządzenia według wynalazku, interferometr umocowany jest w prowadnicy z pomocą kleju epoksydowego.

W korzystnym przykładzie urządzenia według wynalazku, interferometr umocowany jest w prowadnicy z pomocą kleju epoksydowego, przy czym utwardzenie kleju epoksydowego uzyskano przez podgrzanie, po czym przeprowadzano schładzanie interferometru połączonego z prowadnicą w kontrolowany sposób, tak aby spadek temperatury nie przekraczał 10°C/s.

W korzystnym przykładzie wykonania urządzenia według wynalazku, prowadnica ma długość w przedziale 0,5-30 cm, średnicę wewnętrzną 0,1 mm-5 mm, średnicę zewnętrzną np. 0,2-7 mm oraz kształt zbliżony do igły biopsyjnej. Taki korzystny kształt prowadnicy umożliwia wkłucie nawet do twardych tkanek.

W korzystnym przykładzie wykonania urządzenia według wynalazku, czynnikiem wiążącym są przeciwciała, ich fragmenty wiążące antygen lub affibody wiążące antygen.

W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania urządzenia według wynalazku, przeciwciała, ich fragmenty wiążące antygen lub affibody wiążące antygen są przeciwciałem, ich fragmentem wiążącym antygen lub affibody wiążącym antygen dla antygenu z HER2, PSA, AFP, CA19-9, CA125, lub CEA, odpowiednio.

Analitem jest przykładowo marker nowotworowy lub inny marker chorobowy, który można wykorzystać w diagnostyce chorób lub monitorowaniu leczenia.

Przykładowo analitem jest marker nowotworowy HER2, PSA, AFP, CA19-9, CA125, lub CEA.

W innym korzystnym przykładzie wykonania urządzenia według wynalazku, czynnikiem wiążącym jest kwas nukleinowy, korzystnie DNA.

Przedmiotem wynalazku jest też sposób wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu obecnego w tkance za pomocą interferometru w urządzeniu według wynalazku, który obejmuje następujące etapy:

a) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła;

b) detekcji fal świetlnych odbitych od czół ramion interferometru lub propagujących się przez ramiona interferometru;

c) detekcji pierwszego wzoru interferencji dla odbitych lub propagujących się fal świetlnych;

d) kontaktowanie się ramienia interferometru opłaszczonego immobilizowanym czynnikiem wiążącym umocowanego wewnątrz prowadnicy z badaną próbą przyżyciowo u osobnika poprzez bezpośrednie wkłucie się do tkanki za pomocą prowadnicy albo ex vivo poprzez zanurzenie ramienia interferometru w homogenizacie tkanki;

e) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła;

f) detekcji fal świetlnych odbitych od czół ramion interferometru lub propagujących się przez ramiona interferometru;

g) detekcji drugiego wzoru interferencji dla odbitych lub propagujących się fal świetlnych;

h) wykrywanie przesunięcia widmowego pomiędzy pierwszym a drugim wzorem interferencji;

i) oznaczanie ilości analitu w próbie, na podstawie wielkości przesunięcia pomiędzy pierw- szym a drugim wzorem interferencji, obejmujące porównanie wykrytego przesunięcia z krzywą kalibracyjną.

Podłużne perforacje na ściankach bocznych prowadnicy w urządzeniu według wynalazku powinny mieć wielkość mniejszą od przewidywanych wielkości ewentualnych odłamków w przypadku uszkodzenia i pęknięcia, lub odłamania się fragmentu światłowodu. Optymalna wielkość będzie więc zależeć od materiału, z którego wykonany jest światłowód. Określenie optymalnej wielkości perforacji pozostaje w zakresie umiejętności znawcy.

W opisywanym korzystnym przykładzie wykonania, w którym przynajmniej jedno ramię interferometru ma drugość różną od pozostałych ramion interferometru, przy czym ta różnica długości (AL) mieści się w zakresie od 5 do 100 gm, wymienione przynajmniej jedno ramię interferometru, którego koniec opłaszczony jest czynnikiem wiążącym, lub ich fragmentami wiążącymi antygen, może być zarówno dłuższe jak i krótsze od pozostałego ramienia (pozostałych ramion) interferometru. Dla tego szczególnie korzystnego przykładu wykonania istotne jest występowanie różnicy długości mieszczącej się we wskazanym wyżej zakresie.

W urządzeniu do wykrywania analitu z wykorzystaniem interferometru światłowodowego szczególnie korzystny efekt uzyskuje się przez zastosowanie odpowiedniego niezrównoważenia ramion

PL 238 495 B1 interferometru, co pozwala na wykrywanie zmian odpowiadających przyłączaniu się analitu do czynników wiążących, np. antygenów do przeciwciał na poziomie grubości warstwy nawet zaledwie 10 nm.

W przypadku korzystania z interferometru światłowodowego o równych ramionach wyk rycie zmian na poziomie grubości warstwy 10 nm jest niemożliwe. Na Figurze 1 przedstawiono interferogram w przypadku interferometru o równych ramionach oraz zmianę tego interferogramu po przyłączaniu się warstwy grubości 10 nm analitu.

Z drugiej strony wprowadzenie zbyt dużego niezrównoważenia (np. AL= 1 mm) też jest niekorzystne, gdyż interferogram (Fig. 2) obserwowany na wyjściu nie pozwala jasno zidentyfikować przesunięcia spektrum odpowiadającego przyłączeniu się warstwy badanego analitu o grubości około 10 nm.

Dopiero odpowiednio dobrane niezrównoważenia (AL) pozwala na dostosowanie urządzenia do wykrywania przyłączanego analitu, czyli przyłączania się nanometrowych warstw. Wówczas, możliwe jest dokonanie czułego i precyzyjnego pomiaru dla grubości przyłączonej warstwy do światłowodu zawierającej się w przedziale około 1-50 nm.

Na Figurze 3 przedstawiono wykres dla niezrównoważenia AL= 20 μm i porównanie spektrum przed i po dołączeniu się warstwy analitu o grubości 10 nm.

Wymieniony korzystny czujnik światłowodowy do wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu do zastosowania w urządzeniu według wynalazku zawiera źródło światła, detektor oraz sprzęgacz, przy czym źródło światła, detektor oraz sprzęgacz mogą być ewentualnie przyłączone do cyrkulatora, przy czym sygnał za sprzęgaczem zostaje rozdzielony na co najmniej dwa światłowody - ramiona interferometru, przy czym przynajmniej jedno ramię jest opłaszczone czynnikiem wiążącym zdolnym do wiązania analitu, i przy czym sygnał świetlny:

(i) odbija się od czół ramion interferometru, po czym sygnał kierowany jest przez sprzęgacz, i ewentualnie przez cyrkulator, do detektora, albo (ii) przechodzi do dzielnika mocy optycznej utrzymującego polaryzację, a następnie do de- tektora, którym jest optyczny analizator widma charakteryzujące się tym, że przynajmniej jedno z ramion interferometru ma długość różną od pozostałych ramion interferometru, i przy czym ta różnica długości (AL) mieści się w zakresie od 5 do 100 μm, na przykład wynosi 10 μm lub 38,9 μm lub 100 μm.

Szczególnie korzystny czujnik światłowodowy do wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu do zastosowania w urządzeniu według wynalazku zawiera źródło światła, detektor oraz sprzęgacz, przy czym źródło światła, detektor oraz sprzęgacz mogą być ewentualnie przyłączone do cyrkulatora, przy czym sygnał za sprzęgaczem zostaje rozdzielony na co najmniej dwa światłowody - ramiona interferometru i przy czym sygnał świetlny odbija się od czół ramion interferometru, przy czym przynajmniej jedno ramię interferometru jest opłaszczone czynnikiem wiążącym zdolnym do wiązania analitu, po czym sygnał kierowany jest przez sprzęgacz, i ewentualnie przez cyrkulator, do detektora, przy czym przynajmniej jedno z ramion interferometru ma drugość różną od pozostałych ramion interferometru, i przy czym ta różnica długości (AL) mieści się w zakresie od 5 do 100 μm, na przykład wynosi 10 μm lub 38,9 μm lub 100 μm.

Sposób wykrywania analitu w próbie, z zastosowaniem czujnika światłowodowego wyposażonego w źródło światła, sprzęgacz i detektor oraz ramiona interferometru, z których przynajmniej jedno opłaszczone jest czynnikiem wiążącym, który jest zdolny do wiązania analitu, może na przykład obejmować etapy:

a) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła;

d) kontaktowania próby z przynajmniej jednym ramieniem interferometru opłaszczonym czynnikiem wiążącym;

e) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła;

h) stwierdzania obecności analitu w badanej próbie w przypadku wykrycia przesunięcia widmowego pomiędzy pierwszym a drugim wzorem interferencji.

PL 238 495 B1

Dodatkowo obecny może być etap

i) oznaczania ilości analitu w próbie na podstawie wielkości przesunięcia pomiędzy pierwszym a drugim wzorem interferencji. W korzystnym przykładzie wykonania urządzenia według wynalazku, prowadnica wykonana jest z metalu.

Czynnikami wiążącymi stosowanymi w urządzeniu według wynalazku mogą być białka, korzystnie przeciwciała lub ich analogi. Przeciwciałami stosowanymi w sposobie według wynalazku mogą być dowolne przeciwciała umożliwiające wykrywanie antygenu. Przeciwciałami mogą być na przykład immunoglobuliny G, np. IgG z surowicy królika. Mogą być to np. przeciwciała monoklonalne jak i poliklonalne, ludzkie, zwierzęce, chimeryczne, humanizowane, bispecyficzne lub należeć do dowolnej innej grupy przeciwciał znanych specjaliście w dziedzinie. W sposobie według wynalazku stosować można również fragment wiążący antygen przeciwciała, którym jest dowolny jego fragment, który zachowuje zdolność do wiązania antygenu. Fragmenty takie są znane specjaliście w dziedzinie i obejmują np. fragmenty Fab, F(ab’)2 lub scFv i inne.

Stosowanym analogiem przeciwciała może być również affibody. W rozumieniu niniejszego opisu, termin „affibody” oznacza rekombinowane białko złożone z jednego łańcucha polipeptydowego, posiadające domenę odpowiedzialną za selektywne oddziaływanie z antygenem, np. markerem nowotworowym HER2, które może być dołączone do innego białka zapewniającego lepsze właściwości wiązania do antygenu, wyższą stabilność oraz dodatkowe funkcje, np. możliwość kontrolowanego połączenia z inną substancją lub powierzchnią stałą. Jego masa zwykle mieści się w przedziale od kilku do kilkunastu daltonów.

Przeciwciała wykorzystywane są powszechnie w diagnostyce nowotworów, np. w metodzie immunohistochemicznej do wybarwiania skrawków tkanki, a affibody stanowią analogi przeciwciał, zachowując właściwości wiązania do określonych antygenów, ale przy rozmiarach znacznie, np. 10-krotnie mniejszych. Dzięki temu są one bardziej odporne na czynniki fizyczne oraz biologiczne, np. temperaturę, drastyczne warunki wiązania do światłowodu (odczynniki chemiczne) oraz degradację przez enzymy proteolityczne podczas penetracji tkanki. Te właściwości sprawiają, że powłoka światłowodu pokryta cząsteczkami takimi jak affibody jest bardziej stabilna pod względem aktywności wiązania swoistego antygenu, np. markerów nowotworowych. Dodatkowo, korzystnie dzięki wprowadzonej na końcu affibody grupy cysteinowej, możliwa jest ukierunkowana immobilizacja substancji do powierzchni światłowodu. Zapewnia to większą aktywność i zachowanie swoistości do mierzonego w tkance markera.

W innym przykładzie wykonania, czynnikiem wiążącym mogą być kwasy nukleinowe, np. DNA.

Czynniki wiążące mogą być immobilizowane na różne znane w dziedzinie sposoby. Korzystnie, czynniki wiążące wiązane są z powierzchnią światłowodu kowalencyjnie.

Oznaczanymi w tkance analitami mogą być różne substancje, których wykrywanie i/lub oznaczanie stężenia jest pożądane. W korzystnym przykładzie wykonania, oznaczanymi w tkance substancjami mogą być markery nowotworowe, np. HER2, PSA, AFP, CA19- 9, CA125, CEA, lub inne znane w dziedzinie markery, które można wykorzystywać w diagnostyce chorób lub monitorowaniu leczenia.

Urządzenie według wynalazku może być stosowane do wykonywania pomiarów ex vivo lub przyżyciowo u osobnika. Osobnikiem może być zwierzę, korzystnie ssak, najkorzystniej człowiek.

Opłaszczenie przeciwciałami, lub ich fragmentami wiążącymi antygen może być wykonane na różne sposoby. Przykładowy, nieograniczający zakresu wynalazku, proces opłaszczania włókna światłowodowego przeciwciałami, lub ich fragmentami wiążącymi antygen można przeprowadzić według sposobu przedstawionego poniżej.

Opłaszczany koniec światłowodu zanurza się w roztworze alkalicznym, a następnie przepłukuje się wodą demineralizowaną i suszy się. Potem przetrzymuje się przez 10-30 min w wysokiej temperaturze w kwaśnym roztworze silanu. Następnie końcówkę światłowodu przemywa się, suszy, a następnie zanurza się w roztworze czynnika sprzęgającego, po czym ponownie przemywa się i inkubuje z roztworem zawierającym przeciwciała, lub ich fragmenty wiążące antygen. Tak przygotowany światłowód przechowuje się w chłodzie.

W bardziej szczególnym, nieograniczającym przykładzie, opłaszczany koniec światłowodu zanurza się roztworze NaOH o stężeniu od 1 M do 1,3 M w czasie od 5 min do 10 min, a następnie przepłukuje się wodą demineralizowaną i suszy się na powietrzu przez około 15 min. Potem przetrzymuje się przez około 3 godziny w temperaturze około 90°C w 10% roztworze (3-glicydyloksypropylo) trimetoksysilanu (GOPS) z wody (stężenie objętościowe) o pH=2 do pH= 2,5 ustanowionej za pomocy np. 1M roztworu HCI. Następnie końcówkę światłowodu przemywa się w etanolu, po czym suszy się w czasie od 10 h do 13 h w temperaturze około 105°C w próżni lub w atmosferze argonu. Następnie zanurza się w roztworze

PL 238 495 B1

100 mg/ml 1,1 ’-karbonylodiimidazolu (CDI) w acetonitrylu (ACN) przez około 20 min, po czym przemywa się acetonitrylem i roztworem buforu fosforanowego i (PBS) i inkubuje w roztworze 1,2 mg/ml PBS zawierającym przeciwciała, np. immunoglobuliny G z surowicy królika w czasie 4 dni w temperaturze około 4°C lub w czasie 1-2 dni w temperaturze pokojowej, po czym przechowuje się w roztworze PBS przez 12 h w temperaturze 4°C. Tak przygotowany światłowód zostaje odpowiednio zabezpieczony i przechowywany jest w temperaturze 4°C z zanurzoną końcówką w roztworze PBS.

Zaletami takiego sposobu opłaszczania są utrzymanie aktywności przeciwciał, lub ich fragmentów wiążących antygen na poziomie powyżej 95%, duża ilość dołączanych przeciwciał lub ich fragmentów wiążących antygen, stosunkowo niskie koszty materiałowe oraz łatwa możliwość zwielokrotnienia produkcji.

Proces opłaszczania włókna światłowodowego przeciwciałami, lub ich fragmentami wiążącymi antygen można przeprowadzić także z wykorzystaniem metody alternatywnej. Przykładowo, po odtłuszczeniu światłowód zanurza się w wodzie destylowanej i gotuje się. Po wyjęciu z wody umieszcza się go w roztworze silanu. Następnie płucze się światłowód w rozpuszczalniku, a następnie zanurza w roztworze czynnika sprzęgającego. Po wypłukaniu światłowód umieszcza się w roztworze przeciwciał, lub ich fragmentów wiążących antygen.

W bardziej szczególnym, nieograniczającym przykładzie wykonania, światłowód odtłuszcza się najpierw za pomocą alkoholu izopropylowego, by usunąć zanieczyszczenia. Następnie światłowód zanurza się w wodzie destylowanej i gotuje się przez około 10-20 minut. Po wyjęciu z wody światłowód umieszcza się w roztworze 1-3% 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu (MPTS) w toluenie. Po upływie 20-45 minut światłowód wyciąga się i płucze w toluenie a następnie zanurza w roztworze 4-maleimidomaślanu N-sukcynoimidylu (GMBS) o stężeniu 4-8 mg/10 ml etanolu o stężeniu 96%. Światłowód trzyma się w tym roztworze przez 60-90 minut. Następnie płucze się go raz w etanolu oraz trzykrotnie w wodzie destylowanej. Później światłowód umieszcza się w roztworze przeciwciał o stężeniu 0.2-1 mg/ml w roztworze buforu fosforanowego. Opłaszczony światłowód wyciąga się z roztworu po upływie 12-18 godzin i płucze w wodzie destylowanej.

Wynalazek zapewnia więc możliwość pomiaru ważnych biologicznie cząsteczek w sposób bezpośredni, bez użycia znaczników, natychmiastowy (następujący w czasie rzeczywistym) bez konieczności preparacji tkanki oraz małoinwazyjny ze względu na rozmiar wykorzystywanego czujnika (korzystnie około 0,1-50 mikronów średnicy). Dzięki kowalencyjnemu związaniu przeciwciał lub ich pochodnych (affibody) zminimalizowane jest ich uwalnianie do organizmu, co zwiększa potencjał kliniczny takiego urządzenia.

Urządzenie według wynalazku, zawiera czujnik światłowodowy, będący specjalnie przygotowanym interferometrem, źródło światła oraz detektor. Czujnik jest przygotowany poprzez immobilizację na powierzchni włókna światłowodowego czynnika wiążącego, na przykład w korzystnym przykładzie wykonania, substancji białkowej zdolnej do specyficznego oddziaływania z markerem nowotworowym. Ilość związanej do interferometru oznaczanej substancji (np. w korzystnym przykładzie wykonania markera nowotworowego) mierzona jest jako przesunięcie spektrum.

Wielkość przesunięcia widma wyznaczana jest z pomocą substancji wzorcowej o znanym stężeniu i dana wartość przesunięcia przypisywana jest do konkretnej ilości markera.

KRÓTKI OPIS FIGUR

Figura 1 przedstawia interferogram w przypadku interferometru znanego w stanie techniki o równych ramionach oraz zmianę tego interferogramu po przyłączeniu się warstwy grubości 10 nm antygenów.

Figura 2 przedstawia interferogram w przypadku interferometru o niezrównoważeniu ramion AL=1 mm oraz zmianę tego interferogramu po przyłaczeniu się warstwy antygenów o grubości 10 nm.

Figura 3 przedstawia interferogram dla niezrównoważenia AL= 20 μm i porównanie spektrum przed i po dołączeniu się warstwy antygenów o grubości 10 nm.

Figura 4 przedstawia przykład wykonania czujnika światłowodowego do wykrywania analitu.

Figura 5 przedstawia rozkład spektralny obserwowany na detektorze dla czujnika z Figury 4.

Figura 6 przedstawia alternatywny, korzystny przykład wykonania czujnika światłowodowego do wykrywania analitu.

Figura 7 przedstawia rozkład spektralny obserwowany na detektorze dla czujnika z Figury 6.

Figura 8 przedstawia alternatywny, korzystny przykład wykonania czujnika światłowodowego do wykrywania analitu.

PL 238 495 B1

Figura 9 przedstawia rozkład spektralny obserwowany na detektorze dla czujnika z Figury 8.

Figura 10 przedstawia schemat konstrukcji urządzenia według przykładu wykonania wynalazku.

PRZYKŁADY

P r z y k ł a d 1. Czujnik do wykrywania analitu

Przyk ł ad 1A

W korzystnym przykładzie wykonania przedstawionym na Figurze 4, czujnik do wykrywania analitu zawiera źródło światła 1, detektor 2 oraz sprzęgacz 4 przyłączone do cyrkulatora 3. Źródłem światła 1, w tym szczególnym przypadku, jest dioda superluminescencyjna SLED 1550 nm Exalos o numerze EXS210048-02, a detektorem 2, w tym szczególnym przypadku, jest optyczny analizator widma OSA ANDO AQ-6315B. Wykorzystano światłowód Corning SMF-28e+ i sprzęgacz FBT 50:50 produkcji Fibrain.

Sygnał ze źródła światła 1 jest doprowadzony do cyrkulatora 3, skąd następnie jest doprowadzany do sprzęgacza 4 poprzez włókna światłowodowe jednomodowe. Sygnał za sprzęgaczem 4 zostaje rozdzielony na dwa światłowody - ramiona interferometru. Sygnał odbija się od czół światłowodów, przy czym jedno z ramion 5 jest opłaszczone przeciwciałami. Sygnał wraca przez sprzęgacz 4 do cyrkulatora 3, skąd jest dalej prowadzony do detektora 2.

Ramię interferometru, którego koniec nie jest opłaszczony, jest dłuższe o AL = 38,9 pm.

Jedno z ramion interferometru jest opłaszczone przeciwciałami, którymi w tym szczególnym przypadku jest immunoglobulina G (IgG) z surowicy królika. Przeciwciała te umożliwiają wykrywanie antygenu, którym w tym szczególnym przypadku jest antyimmunoglobulina królika (uzyskana w wyniku umieszczenia IgG królika w osoczu kozy i odseparowania antygenu) znakowana markerem luminescencyjnym FITC (Anty-lgG-FITC). Na detektorze widać prążki interferencyjne w dziedzinie długości fali, których przesunięcie wskazuje na przyłączenie się antygenów do przeciwciał.

Proces opłaszczania włókna światłowodowego przeciwciałami został przeprowadzony według sposobu przedstawionego poniżej. Opłaszczany koniec światłowodu zanurzono w roztworze NaOH o stężeniu od 1 M na 10 min, a następnie przepłukano wodą demineralizowaną i suszono na powietrzu przez 15 min. Potem przetrzymywano przez 3 godziny w temperaturze 90°C w 10% roztworze (3-glicydyloksypropylo) trimetoksysilanu (GOPS) z wodą (stężenie objętościowe) o pH=2 ustanowionej za pomocą 1M roztworu HCI. Następnie końcówkę światłowodu przemyto w etanolu, po czym suszono przez 13 h w temperaturze 105°C w próżni lub w atmosferze argonu. Następnie zanurzono w roztworze 100 mg/ml 1,1’-karbonylodiimidazolu (CDI) w acetonitrylu (ACN) przez 20 min, po czym przemywano acetonitrylem i roztworem buforu fosforanowego (PBS), i inkubowano w roztworze 1,2 mg/ml PBS zawierającym przeciwciała immunoglobulin G z surowicy królika w czasie 4 dni w temperaturze 4°C, po czym przechowywano w roztworze PBS przez 12 h w temperaturze 4°C.

W celu dokonania pomiaru urządzenie wprowadzane jest w kontakt z próbą, tak aby obecny w próbie analit mógł zostać związany z czynnikiem wiążącym.

Na Figurze 5 przedstawiono rozkład spektralny obserwowany na detektorze. Dołączenie się antygenów spowodowało przesunięcie się spektrum o 0,6 nm. W celu oznaczania ilości analitu przygotowuje się roztwory wzorcowe o znanych stężeniach analitu i wyznacza krzywą kalibracyjną zależności zmiany przesunięcia spektrum od ilości analitu. Z pomocą tak otrzymanej krzywej kalibracyjnej wyznacza się stężenie analitu w próbie.

Obliczanie grubości optycznej warstw przyłączonych w układzie interferometru:

Spis oznaczeń:

Xi - Długość fali, na której następuje minimum spektralne przed przyrostem grubości warstw λ2 - Długość fali, na której następuje minimum spektralne po przyroście grubości warstw φ φ - Faza światła dla danej długości fali po przejściu przez układ optyczny Lp - Początkowa długość niezrównoważenia intorferometru np - Współczynnik załamania materiału zapewniającego początkowe niezrównoważenie interferometru

Al - zmiana długości materiału na czole interferometru nA - Współczynnik załamania materiału, który jest materiałem przyrastającym

PL 238 495 Β1

Minimum przed przyrostem warstw traktujemy, jako początkową fazę światła φ-ι. Po przyroście grubości optycznej warstwy taki sam warunek fazowy φ2 zostanie spełniony dla innej długości fali. Warunek taki można zapisać, jako:

2π(ί._ρη_ρ + Δί(η_Δ — 1))

Zakładając = Ψ1

Uzyskujemy

2π(£_ρη_ρ) 2n(L_pn_p + AL(n& — 1)) A A_z

W związku z tym po przekształceniach można otrzymać zależność:

Zależność ta określa zmianę fizycznej długości warstwy, która przyłączyła się w układzie. Bardziej szczegółowe objaśnienia dotyczące sposobu obliczeń znaleźć można także w Hariharan, P. (2007). Basics of Interferometry. Elsevier Inc.

Przykład 1B

W alternatywnym, korzystnym przykładzie wykonania przedstawionym na Figurze 6 czujnik do wykrywania analitu zawiera źródło światła 1, detektor 2 oraz sprzęgacz 4. Źródłem światła 1, w tym szczególnym przypadku jest źródło typu supercontinuum SLED 1540 nm Yenista OSICS SLD 1550, a detektorem 2, w tym szczególnym przypadku jest spektrometr OSA Yokogawa AO6370D. Wykorzystywano światłowód Standard Singlemode Fibrę (SSMF) zgodny z zaleceniami ITU-T, G.652 firmy Draka oraz sprzęgacz 10202A-50 firmy Thorlabs.

Sygnał ze źródła światła 1 jest doprowadzony do sprzęgacza 4 poprzez światłowody. Sygnał za sprzęgaczem 4 zostaje rozdzielony na dwa światłowody - ramiona interferometru. Sygnał odbija się od czół światłowodów, przy czym jedno z ramion 5 jest opłaszczone przeciwciałami. Sygnał wraca przez sprzęgacz 4 do detektora 2.

Ramię interferometru, którego koniec jest opłaszczony, jest dłuższe o AL = 10 pm.

Jedno z ramion interferometru jest opłaszczone przeciwciałami, którymi w tym szczególnym przypadku jest immunoglobulina G (IgG) z surowicy królika. Przeciwciała te umożliwiają wykrywanie antygenu, którym w tym szczególnym przypadku jest antyimmunoglobulina królika (uzyskana w wyniku umieszczenia IgG królika w osoczu kozy i odseparowania antygenu) znakowana markerem luminescencyjnym FITO (Anty-lgG-FITC). Na detektorze widać prążki interferencyjne w dziedzinie długości fali, których przesunięcie wskazuje na przyłączenie się antygenów do przeciwciał.

Proces pokrywania jednego z ramion interferometru przeciwciałami składał się z kilku etapów. Najpierw światłowód został odtłuszczony za pomocą alkoholu izopropylowego, w celu usunięcia zanieczyszczenia. Następnie światłowód zanurzono w wodzie destylowanej i gotowano ją przez 15 minut. Po wyjęciu z wody światłowód umieszczono w roztworze 2% 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu (MPTS) w toluenie. Po upływie 30 minut światłowód wyciągnięto i opłukano w toluenie, a następnie zanurzono w roztworze 4-maleimidomaslanu N-sukcynoimidylu (GMBS) o stężeniu 6 mg/10 ml etanolu o stężeniu 96%. Światłowód trzymano w tym roztworze przez 60 minut. Następnie opłukano go raz w etanolu oraz trzykrotnie w wodzie destylowanej. Później światłowód umieszczono w roztworze przeciwciał o stężeniu 1 mg/ml w roztworze buforu fosforanowego. Opłaszczony światłowód wyciągnięto z roztworu po upływie 12 godzin i opłukano w wodzie destylowanej.

Na Figurze 7 przedstawiono rozkład spektralny obserwowany na detektorze. Dołączenie się antygenów spowodowało przesunięcie się spektrum o 0,5 nm. W celu oznaczania ilości analitu przygotowuje się roztwory wzorcowe o znanych stężeniach analitu i wyznacza krzywą kalibracyjną zależności

PL 238 495 B1 zmiany przesunięcia spektrum od ilości analitu. Z pomocą tak otrzymanej krzywej kalibracyjnej wyznacza się stężenie analitu w próbie. Sposób obliczania grubości warstwy przyłączonego analitu jest taki jak w Przykładzie 1 A.

P r z y k ł a d 1C

W korzystnym przykładzie wykonania przedstawionym na Figurze 8, urządzenie do wykrywania analitu zawiera diodę super luminescencyjną 1 (S5FC1018S - SM Benchtop SLD Source) emitującą spolaryzowane światło o centralnej długości fali widma 1310 nm i szerokości połówkowej widma 50 nm, przyłączoną do światłowodu podtrzymującego polaryzację typu PANDA (PM1300-XP firmy Thorlabs) jednomodowego na długości fali 1260 nm lub większej, dzielnik mocy optycznej 6 typu PLC o podziale mocy optycznej 50%:50% dla długości fali 1310 nm, dwa światłowody utrzymujące polaryzacje typu PANDA jednomodowe na długości fali 1260 nm i większej o długościach L1= 50 mm L2= 50 mm, z których jeden zawiera w środku swojej długości przerwę 9, dzielnika mocy optycznej 7 utrzymującego polaryzację i optycznego analizatora widma 5. Zastosowano sprzęgacz PMC1310-50B-FC firmy Thorlabs.

Sygnał ze źródła światła 1 jest doprowadzony do dzielnika 6. Sygnał za dzielnikiem 6 zostaje rozdzielony na dwa światłowody - ramiona interferometru. Sygnał propaguje się poprzez ramiona interferometru, których różna długość zapewnia początkowe niezrównoważenie interferometru. Jeden ze światłowodów zawiera w środku swojej długości przerwę 9, a końce z obu stron przerwy 9 znajdują się w odległości 0,1 mm od siebie. Sygnał trafia poprzez sprzęgacz 7 do optycznego analizatora widma 8.

Jedna z końcówek obciętego światłowodu jest opłaszczona przeciwciałami tak jak w Przykładzie 1A, którymi w tym szczególnym przypadku jest immunoglobulina G (IgG) z surowicy królika. Przeciwciała te umożliwiają wykrywanie antygenu, którym w tym szczególnym przypadku jest antyimmunoglobulina królika (uzyskana w wyniku umieszczenia IgG królika w osoczu kozy i odseparowania antygenu) znakowana markerem luminescencyjnym FITC (Anty-IgG-FITC). Opłaszczony koniec światłowodu przesunięto z powrotem do końcówki drugiej w takiej samej odległości jak poprzednio.

Pomiar dokonywany jest przez kontaktowanie opłaszczonego końca światłowodu z badaną próbą, tak aby analit mógł zostać związany przez czynnik wiążący.

Na detektorze widoczne są prążki interferencyjne w dziedzinie długości fali (Fig. 9), których przesunięcie o 0,5 nm wskazuje na przyłączenie się warstwy antygenów grubości 115 nm do przeciwciał. W celu oznaczania ilości analitu przygotowuje się roztwory wzorcowe o znanych stężeniach analitu i wyznacza krzywą kalibracyjną zależności zmiany przesunięcia spektrum od ilości analitu. Z pomocą tak otrzymanej krzywej kalibracyjnej wyznacza się stężenie analitu w próbie. Sposób obliczania grubości warstwy przyłączonego analitu jest taki jak w Przykładzie 1 A.

P r z y k ł a d 1D. Opłaszczanie z pomocą affibody

W korzystnym przykładzie wykonania przedstawionym na Figurze 4, urządzenie do wykrywania analitu zawiera źródło światła 1, detektor 2 oraz sprzęgacz 4 przyłączone do cyrkulatora 3. Źródłem światła 1, w tym szczególnym przypadku, jest dioda superluminescencyjna SLED 1550 nm Exalos o numerze EXS210048-02, a detektorem 2, w tym szczególnym przypadku, jest optyczny analizator widma OSA ANDO AQ-6315B. Wykorzystano światłowód Corning SMF-28e+ i sprzęgacz FBT 50:50 produkcji Fibrain.

Sygnał ze źródła światła 1 jest doprowadzony do cyrkulatora 3, skąd następnie jest doprowadzany do sprzęgacza 4 poprzez włókna światłowodowe jednomodowe. Sygnał za sprzęgaczem 4 zostaje rozdzielony na dwa światłowody - ramiona interferometru. Sygnał odbija się od czół światłowodów, przy czym jedno z ramion 5 jest opłaszczone affibody. Sygnał wraca przez sprzęgacz 4 do cyrkulatora 3, skąd jest dalej prowadzony do detektora 2.

Ramię interferometru, którego koniec nie jest opłaszczony, jest dłuższe o AL = 38,9 μm.

W przypadku affibody wykorzystuje się immobilizację za pomocą grup tiolowych używając dostępnych odczynników (Thermofisher Scientific, Waltham, MA). W tym celu koniec interferometru jest zanurzany w 1M kwasie siarkowym na 1 godz., a następnie przemywany wodą destylowaną i zanurzany na 15 min w etanolu oraz na kolejne 15 min w acetonie. Oczyszczony koniec światłowodu zanurza się następnie w bezwodnym acetonie zawierającym 2% APTES (3-aminopropylotrietoksysilan) na 0,5-5 min. Po zakończeniu reakcji światłowód płukany jest w bezwodnym acetonie i suszony na powietrzu przez 15-30 min. Następnie światłowód inkubowany jest w buforze sieciującym (50 mM fosforan sodu, 0,15 M NaCI, 10 mM EDTA, pH 7,2) zawierającym 2 mg/ml Sulfo-SMCC (sulfosukcynimidylo 4-(N-maleimidometylo)cycloheksano-1-karboksylan) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej. Po wypłukaniu w buforze sieciującym i wysuszeniu na powietrzu przez 30 min światłowód jest przechowywany w 4°C w desykatorze do momentu inkubacji z affibody.

PL 238 495 B1

W celu zredukowania terminalnych grup tiolowych do roztworu affibody o stężeniu 1 mg/ml w buforze redukującym (50 mM fosforan sodu, 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 7,5) dodaje się DTT (ditiotreitol) do uzyskania końcowego stężenia 20 mM, a następnie inkubuje się przez 1-2 godzin w temperaturze pokojowej lub przez 45 min w 37°C. Nadmiar DTT należy usunąć przez filtrację na kolumnie np. z Sephadex G-25 zrównoważonej buforem sieciującym. Zebrany eluent zawierający affibody ze zredukowaną grupą tiolową należy natychmiast wykorzystać do modyfikacji wcześniej przygotowanego światłowodu. W tym celu koniec światłowodu inkubuje się w roztworze affibody przez 2-4 godzin w temperaturze pokojowej a następnie przemywa za pomocą buforu sieciującego i przechowuje w roztworze soli fizjologicznej (PBS) w 4°C.

P r z y k ł a d 2. Urządzenie do wykonywania oznaczenia bezpośrednio w tkance

Interferometr 10 według Przykładu 1A lub 1B, lub 1C, lub 1D, umieszczony jest w metalowej prowadnicy 30 o długości w przedziale 0,5-30 cm, średnicy wewnętrznej 0,1 mm - 5 mm, średnicy zewnętrznej 0,2 - 7 mm oraz kształcie zbliżonym do igły biopsyjnej. Interferometer 10 wprowadzony jest przez otwór 32 w wejściowym końcu 34 prowadnicy i przytwierdzony jest do wejściowego końca 34 prowadnicy 30 specjalistycznym klejem epoksydowym np. MULTIBOND-1101 firmy MULTIBOND, tak że powierzchnia interferometru nie dotyka ścianek prowadnicy (jak na Fig. 10). Połączenie interferometru z prowadnicą wykonano w taki sposób, że ustawiono interferometr centralnie wewnątrz prowadnicy, tak aby oś rdzenia interferometru nie była przesunięta względem osi prowadnicy o wartość większą od 100 pm (mikrometrów). Następnie wypełniono przestrzeń pomiędzy interferometrem a prowadnicą klejem epoksydowym i poddano podgrzaniu w zakresie temperatur od +50°C do +200°C aż do uzyskania całkowitego zastygnięcia kleju. Schładzanie połączonego interferometru z prowadnicą przeprowadzano w kontrolowany sposób, tzn. spadek temperatury nie był szybszy niż 10°C/s. Kontrolowanie szybkości wychładzania połączonego interferometru z prowadnicą pozwoliło na uzyskanie straty mocy optycznej / tłumienia interferometru na poziomie poniżej 0,02 dB.

Przeprowadzono badania pokazujące wpływ uszczelnienia na tłumienność.

Zastosowana aparatura pomiarowa:

Zestaw do pomiaru i monitoringu zmian tłumienności wtrąceniowej:

W pomiarach użyto zintegrowany w postaci panelowej przyrząd firmy EXFO-IQ203, wyposażony w:

□ źródło laserowe (IQ2123 ORL) o dwóch długościach fali: 1310 nm +20/-25 nm i 1550 nm +10/-40 nm, szerokości widma 45/65 nm (1310/1550 nm), stabilności temperaturowej 0,03 dB (t=8 h T=0...50°C) oraz □ detektor InGaAs (IQ1103) zakres pomiarowy 800-1700 nm, i dokładność względna pomiaru mocy 0,015 dB. Wyniki przeprowadzonych testów przedstawione są w poniższej Tabeli 1:

PL 238 495 Β1

Tabela 1

Wyniki badań zmian tłumienności wtrąceniowej Δ IL na połączeniach hermetycznych wykonane po teście
nr. Próbki	Pwej. [pW] [przed uszczelnieniem]	Pwyj, [pW] [po uszczelnieniu]	Δ IL [dB]	Wyniki testu (Zmiana tłumienności po teście nie powinna przekroczyć 0,2dB dla kryteriów Telcordia GR1221) P- pozytywny Nnegatywny
1	5,373	5,342	0,00	P
2	6,338	6,338	0,00	P
3	6,695	6,679	0,01	P
4	6,203	6,177	0,02	P
5	6,811	6,790	0,01	P
6	6,510	6,513	0,00	P
7	6,708	6,709	0,00	P
8	6,614	6,613	0,00	P
9	6,844	6,834	0,01	P
10	6,371	6,359	0,01	P
11	5,831	5,827	0,00	P
12	5,750	5,755	0,00	P
13	6,227	6,231	0,00	P
14	6,285	6,275	0,01	P
15	6,502	6,488	0,01	P
16	5,968	5,945	0,02	P
17	6,281	6,285	0,00	P
18	6,330	6,324	0,00	P
19	6,480	6,451	0,02	P
20	6,524	6,520	0,00	P
21	6,174	6,173	0,00	P
średnia	0,01

Interierom eter przytwierdzony do wejściowego końca prowadnicy zapewnia możliwość sterylizacji czujnika i zapewnia swobodny dopływ substancji badanej, a równocześnie zapewnia pozostawanie czujnika światłowodowego w odległości od ścianek prowadnicy, tak że ruch prowadnicy nie wpływa na wykonywany pomiar. Taki sposób przytwierdzenia zapewnia barierę dla przenikania zanieczyszczeń biologicznych i chemicznych oraz substancji, które mogłyby zaburzać pomiar.

Prowadnica 30 ma zamknięte czoło 31 prowadnicy, a w ściankach bocznych podłużne perforacje 33 umożliwiające dotarcie analitu do interferometru 10. Otwór 32 w wejściowym końcu prowadnicy,

PL 238 495 B1 stanowiący wejście dla włókna światłowodowego, interferometru 10 do prowadnicy 30 jest uszczelnione, umożliwiając hermetyczne odizolowanie wnętrza prowadnicy od otoczenia.

Urządzenie w tym przykładzie wykonania zawiera również, poza źródłem światła 1 i detektorem 2, także monitor 21 i drukarkę 22.

P r z y k ł a d 3. Pomiar stężenia markera nowotworowego HER2

P r z y k ł a d 3A. Pomiar z pomocą przeciwciał

Do pomiaru markera nowotworowego HER2 włókno światłowodowe preparowane jest poprzez immobilizacje przeciwciał selektywnie wiążących marker nowotworowy HER2 (monoklonalne przeciwciała anty-HER2, R&D Systems, Minneapolis, MN), jak opisano w Przykładzie 1, z tą różnicą, że czynnikiem wiążącym jest immunoglobulina selektywnie wiążąca marker nowotworowy HER2 (monoklonalne przeciwciała anty-HER2, R&D Systems, Minneapolis, MN). Pomiar stężenia markera nowotworowego wykonuje się przez wprowadzenie na 5 sec - 15 min do tkanki sondy optycznej opisanej w przykładzie 1A lub 1B,lub 1C, umieszczonej wewnątrz metalowej prowadnicy, jak opisano w Przykładzie 2, poprzez jej bezpośrednie wkłucie do tkanki guza w ciele pacjenta (podobnie jak podczas biopsji diagnostycznej wykonywanej igłą biopsyjną) lub bezpośrednio po wycięciu guza, lub zanurzenie w homogenizacie tkanki uzyskanym przez mechaniczne jej rozdrobnienie. Stężenie markera znajdującego się w tkance odpowiada ilości markerów przyłączonych do powierzchni interferometru, a wartość stężenia wyznacza się na podstawie przesunięcia widma.

P r z y k ł a d 3B. Pomiar z pomocą affibody

Sposób wykonania sondy optycznej rożni się od tego z przykładu 3A tym, że zamiast przeciwciał immobilizuje się affibody z wykorzystaniem grup tiolowych, jak opisano w przykładzie 1D. Czujnik umieszcza się w prowadnicy jak opisano w Przykładzie 2. Pomiar markera nowotworowego, np. HER2 wykonuje się podobnie jak w przykładzie 3A.

LISTA OZNACZEŃ

- źródło światła

- detektor

- cyrkulator

- sprzęgacz

- ramię interferometru opłaszczone czynnikiem wiążącym

- dzielnik mocy optycznej

- dzielnik mocy optycznej utrzymujący polaryzację

- optyczny analizator widma

- przerwa w przebiegu światłowodu

- interferometr

- monitor

- drukarka

- prowadnica

- czoło prowadnicy

- otwór w wejściowym końcu prowadnicy

- perforacje

- wejściowy koniec prowadnicy

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Urządzenie do wykrywania i/lub oznaczania stężenia analitu obecnego w tkance, obejmujące czujnik, którym jest interferometr światłowodowy, przy czym jedno ramię interferometru jest opłaszczone immobilizowanym czynnikiem wiążącym umożliwiającym selektywne wiązanie analitu obecnego w tkance, znamienne tym, że wymienione ramię (5) interferometru opłaszczone immobilizowanym czynnikiem wiążącym umocowane jest wewnątrz prowadnicy (30) umożliwiającej wkłucie do tkanki i dokonanie pomiaru in situ, bez konieczności pobierania czy przygotowywania próbki, przy czym prowadnica (30) wyposażona jest w zamknięte czoło (31) prowadnicy, podłużne perforacje (33) na ściankach bocznych umożliwiające dotarcie analitu do czynnika wiążącego i otwór (32) w wejściowym końcu (34) prowadnicy dla wprowadzenia inteferometru (10) z ramieniem (5) opłaszczonym czynnikiem wiążącym do prowadnicy (30)

PL 238 495 B1 w wejściowym końcu (34) prowadnicy, przy czym otwór (32) jest uszczelniony, umożliwiając odizolowanie wnętrza prowadnicy (30) od otoczenia, a interferometr (10) mocowany jest w pozycji, w której interferometr (10) nie dotyka ścianek wewnętrznych prowadnicy.
2. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że interferometr (10) umocowany jest centralnie wewnątrz prowadnicy (30), tak aby oś rdzenia interferometru nie była przesunięta względem osi prowadnicy o wartość większą od 100 μm.
3. Urządzenie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że inteferometr (10) umocowany jest w prowadnicy (30) z pomocą kleju epoksydowego.
4. Urządzenie według zastrz. 3, znamienne tym, że utwardzenie kleju epoksydowego uzyskano przez podgrzanie, po czym przeprowadzano schładzanie interferometru (10) połączonego z prowadnicą (30) w kontrolowany sposób, tak aby spadek temperatury nie przekraczał 10°C/s.
5. Urządzenie według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienne tym, że prowadnica wykonana jest z metalu.
6. Urządzenie według dowolnego z zastrz. 1-5, znamienne tym, że prowadnica ma długość w przedziale 0,5-30 cm, średnicę wewnętrzną 0,1 mm-5 mm, średnicę zewnętrzną 0,2-7 mm.
7. Urządzenie według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że czynnikiem wiążącym są przeciwciała lub ich fragmenty wiążące antygen lub affibody wiążące antygen.
8. Urządzenie według dowolnego z zastrz. 1-6, znamienne tym, że czynnikiem wiążącym jest kwas nukleinowy, korzystnie DNA.
9. Sposób wykrywania i/lub oznaczania ilościowego analitu obecnego w tkance z pomocą interferometru w urządzeniu jak określone w dowolnym z zastrz. 1 -8, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła (1);

b) detekcji fal świetlnych odbitych od czół ramion interferometru lub propagujących się przez ramiona interferometru;

c) detekcji pierwszego wzoru interferencji dla odbitych lub propagujących się fal świetlnych;

d) kontaktowanie się ramienia (5) interferometru opłaszczonego immobilizowanym czynnikiem wiążącym umocowanego wewnątrz prowadnicy (30) z badaną próbą przyżyciowo u osobnika poprzez bezpośrednie wkłucie się do tkanki za pomocą prowadnicy (30) albo ex vivo poprzez zanurzenie ramienia (5) interferometru w homogenizacie tkanki;

e) emitowania sygnału świetlnego ze źródła światła (1);

f) detekcji fal świetlnych odbitych od czół ramion interferometru lub propagujących się przez ramiona interferometru;

g) detekcji drugiego wzoru interferencji dla odbitych lub propagujących się fal świetlnych;

h) wykrywanie przesunięcia widmowego pomiędzy pierwszym a drugim wzorem interferencji;

i) oznaczanie ilości analitu w próbie, na podstawie wielkości przesunięcia pomiędzy pierwszym a drugim wzorem interferencji, obejmujące porównanie wykrytego przesunięcia z krzywą kalibracyjną.