PL238286B1 - Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych - Google Patents

Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych Download PDF

Info

Publication number
PL238286B1
PL238286B1 PL428367A PL42836718A PL238286B1 PL 238286 B1 PL238286 B1 PL 238286B1 PL 428367 A PL428367 A PL 428367A PL 42836718 A PL42836718 A PL 42836718A PL 238286 B1 PL238286 B1 PL 238286B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plants
pinguicula
cells
stem cells
rectifolia
Prior art date
Application number
PL428367A
Other languages
English (en)
Other versions
PL428367A1 (pl
Inventor
Bartosz Jan PŁACHNO
Anna Bogucka-Kocka
Janusz Kocki
Original Assignee
Univ Jagiellonski
Univ Medyczny W Lublinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Jagiellonski, Univ Medyczny W Lublinie filed Critical Univ Jagiellonski
Priority to PL428367A priority Critical patent/PL238286B1/pl
Priority to PCT/PL2019/050040 priority patent/WO2020013719A1/en
Publication of PL428367A1 publication Critical patent/PL428367A1/pl
Publication of PL238286B1 publication Critical patent/PL238286B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1369—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. MSC from umbilical blood

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli ludzkich i zwierzęcych komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej otrzymanej z roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Wydzielina gatunków z rodzaju Pinguicula rectifolia ma postać klejącego śluzu.
W roku 1991 roku odkryto i opisano po raz pierwszy mezenchymalne komórki macierzyste (MSCMesenchymal Stem Cells) (Caplan 1991). W kolejnych latach udowodniono, że MSC w hodowlach in vitro po odpowiedniej stymulacji różnicują się w kierunku innych komórek: osteocytów, chondrocytów, neurocytów lub adipocytów. MSC są niezróżnicowanymi komórkami znajdującymi się w różnych tkankach człowieka i mają zdolność do samoodnowy. MSC to naturalny materiał wykorzystywany w medycynie regeneracyjnej. Terapia MSC daje nadzieję na wyleczenie różnych przewlekłych chorób człowieka.
Jednym ze źródeł pozyskiwania MSC jest krew pępowinowa i galareta Whartona pępowiny. Z powodu niewielkiej liczby MSC w materiale wyjściowym konieczne jest prowadzenie hodowli MSC in vitro, w celu uzyskania odpowiednio dużej liczby MSC, które po różnicowaniu można podać pacjentowi jako terapeutyczny materiał biologiczny.
Obecnie jednak największym i nierozwiązanym problemem jest uzyskanie dużej liczby MSC od pacjenta. Można je uzyskać w hodowlach komórkowych in vitro otrzymując materiał spersonalizowany. Dotychczas stosowane sposoby hodowli MSC są nieskuteczne ze względu na trudności MSC w kontakcie z podłożem i sąsiednimi komórkami - co uniemożliwia wzrost MSC i ich proliferację.
Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w niniejszym wynalazku.
Celem wynalazku jest poprawienie wydajności hodowli komórek macierzystyc h prowadzonych in vitro.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych znamienna tym, że stanowi powierzchnię naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach tego gatunku.
W przykładowej realizacji, powierzchnię według wynalazku otrzymuje się poprzez pokrycie powierzchni naczynia hodowlanego wspomnianym śluzem roślinnym. Przed rozpoczęciem hodowli naczynie suszy się i sterylizuje. W przykładowej realizacji, suszenie prowadzi się warunkach sterylnych, pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej, natomiast sterylizację można prowadzić metodą autoklawowania, przykładowo w temperaturze 121°C, pod ciśnieniem 215 kPa, przez 20 minut.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach roślin tego gatunku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie powierzchni naczynia hodowlanego pokrytej zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach roślin tego gatunku, do prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych.
Szczegółowy opis wynalazku
W przykładowej realizacji, hodowanymi komórkami macierzystymi są komórki ludzkie, w szczególności mezenchymalne komórki macierzyste. W przykładowych realizacjach hoduje się komórki mezenchymalne izolowane z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymane wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Za wyjątkiem stosowania specjalnie zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni hodowlanej pozostałe parametry prowadzenia hodowli nie odbiegają od standardowych.
W przykładowych realizacjach hodowle komórkowe prowadzi się w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej ilości komórek, zwłaszcza w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. W szczególności, w trakcie hodowli komórki pasażuje się po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny. W przykładowych realizacjach stosuje się podłoże o następującym składzie: 10% FBS (Fetal Bovine
PL 238 286 B1
Serum), 0,5% penicyliny ze streptomycyną, 0,5% amfoterycyny, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
Istota wynalazku polega na dostarczeniu sposobu zwiększenia przylegania (adherencji) MSC do podłoża w celu zwiększenia ich proliferacji (podziałów komórkowych). W tym celu wykorzystano śluz roślin z gatunku Pinguicula rectifolia. Istotą sposobu prowadzenia hodowli komórkowych według wynalazku jest zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia do pokrycia dna naczynia hodowlanego (szklanego lub plastikowego) co zwiększa adherentność MSC a przez to uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC jako materiału przeszczepowego.
Nieoczekiwanie ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia poprawiają adherentność komórek macierzystych i zwiększają proliferację w hodowlach komórkowych, jednocześnie pozostając bez niepożądanego wpływu cytotoksycznego - co zostało udowodnione w przeprowadzonych testach in vitro.
Zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia wywołało pozytywne efekty w hodowlach krótko- i długoterminowych komórek macierzystych człowieka.
Wydzielinę pozyskiwano z roślin z gatunku Pinguicula rectifolia, nanoszono na podłoża stałe (szklane lub plastikowe) tworzące komórkowe naczynia hodowlane, które suszono i sterylizowano. Po zalaniu medium hodowlanym prowadzono długoterminowe hodowle komórek macierzystych pozyskanych z różnych tkanek. Do oceny sposobu hodowli komórek macierzystych z zastosowaniem wydzieliny roślinnej zastosowano znane procedury badawcze: obserwacje przyżyciowe komórek, obserwacje żywotności z zastosowaniem testu z MTT i aneksyną V/jodek propidiowy, analiza cytometryczna i ocena ekspresji wybranych genów.
Wyniki przeprowadzonych badań pozwoliły na stwierdzenie pozytywnego wpływu wydzieliny roślinnej na przebieg hodowli komórek macierzystych.
Ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia nie powodują niepożądanego wpływu cytotoksycznego na ludzkie komórki macierzyste.
Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania AMIG01 i CLDN1 - odpowiedni o 7% i 28%. Zatem, wydzieliny roślin Pinguicula rectifolia wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomórkowym. Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Pinguicula rectifolia poprawiają adherentność ludzkich komórek macierzystych.
Ponadto, nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych: POU5F1 i KLF4. W ten sposób śluz roślin Pinguicula rectifolia wpływa pozytywnie na potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek prowadzonych bez wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Pinguicula rectifolia poprawia potencjał pluripotencji komórek macierzystych oraz przeciwdziała ich różnicowaniu się w hodowlach komórkowych.
Ponadto, nieoczekiwanie okazało się, że wydzieliny (śluzy) roślin Pinguicula rectifolia zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję: SOX2 i SOX9 (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli jest niezwykle ważne dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych jako źródła komórek macierzystych do przeszczepów i eksperymentów. Test na obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 charakterystycznych dla komórek macierzystych potwierdził, iż komórki w kontakcie z wydzieliną roślinną utrzymują swoje właściwości.
Reasumując, nieoczekiwanie stwierdzono, że wydzieliny (śluz) roślin Pinguicula rectifolia poprawiają utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli.
PL 238 286 B1
P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie wydzieliny z roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
W badaniach wykorzystano rośliny gatunku Tłustosz Pinguicula rectifolia (rodzina Lentibulariaceae). Rośliny pochodziły z uprawy w Instytucie Botaniki UJ. Pinguicula rectifolia jest rośliną mięsożerną chwytającą owady za pomocą lepkich liści. Wydzielina roślin z gatunku Pinguicula ma postać klejącego śluzu produkowanego przez emergencje (gruczoły) trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach. Na szczytach gruczołów znajdują się krople śluzu.
Krople śluzu mogą być zbierane dowolnymi znanymi metodami.
W opisywanym przykładzie krople śluzu zbierano z powierzchni liści wykorzystując w tym celu szklaną bagietkę.
P r z y k ł a d 2. Nanoszenie wydzieliny roślinnej na powierzchnie do hodowli komórek macierzystych.
Wydzielinę pozyskiwano z roślin z gatunku Pinguicula rectifolia, nanoszono za pomocą pędzelka na podłoża stałe (szklane lub plastikowe) tworzące naczynia hodowlane. Następnie naczynia hodowlane posiadające zmodyfikowane w ten sposób powierzchnie suszono w jałowej komorze laminarnej (Komora laminarna SafeFast Elite 212S) i sterylizowano w autoklawie LABOKLAV 55V.
Suszenie prowadzono w warunkach sterylnych, pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze pokojowej, natomiast sterylizację prowadzono metodą autoklawowania, w temperaturze 121°C, pod ciśnieniem 215 kPa, przez 20 minut.
Warunki suszenia: ciśnienie atmosferyczne, temp. pokojowa.
Parametry sterylizacji: temperatura 121°C, ciśnienie 215 kPa, ekspozycja 20 minut, wolne schładzanie, odpowietrzanie grawitacyjne.
P r z y k ł a d 3. Hodowla komórek macierzystych na powierzchniach pokrytych wydzieliną z roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
W celu ustalenia wpływu zmodyfikowanej zgodnie z wynalazkiem powierzchni do hodowli komórek macierzystych na przebieg hodowli przeprowadzono testy porównujące wyniki hodowli przykładowych ludzkich komórek macierzystych w standardowych warunkach na standardowych powierzchniach naczyń hodowlanych oraz w tych samych warunkach na powierzchniach zmodyfikowanych zgodnie z wynalazkiem.
Do badań użyto dwóch rodzajów komórek macierzystych człowieka - mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych z tkanki tłuszczowej (KT) otrzymanych wg standardowej procedury liposukcji, po trawieniu enzymatycznym kolagenazą typu I oraz komórki mezenchymalne z galarety Whartona (GW), otrzymane drogą eksplantów komórkowych.
Hodowle komórkowe przeprowadzono w czasie 21 dni (z pasażowaniem co 3 dni) w inkubatorze Brunswick New Galaxy 170R w standardowych warunkach: w temp. 37°C w standardowym stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Komórki hodowano w komercyjnie dostępnych naczyniach hodowlanych, a następnie pasażowano po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu z zastosowaniem trypsyny.
Skład podłoża: 10% FBS (Fetal Bovine Serum, firmy Sigma), 0,5% penicyliny ze streptomycyną (firmy Sigma), 0,5% amfoterycyny (firmy Sigma), DMEM (firmy Sigma).
P r z y k ł a d 4. Efekt hodowli komórek macierzystych na powierzchniach hodowlanych według wynalazku.
W celu ustalenia wpływu zmienionych zgodnie z wynalazkiem warunków hodowli na przebieg hodowli komórek macierzystych zastosowano następujące procedury badawcze:
- hodowle komórkowe,
- barwienie przyżyciowe komórek w celu ustalenia żywotności komórek,
- obserwacje w mikroskopie świetlnym i skaningowym mikroskopie elektronowym w celu potwierdzenia prawidłowej morfologii komórek, oraz oceny adhezji komórek do podłoża,
- ocenę ekspresji genów (izolację RNA, oznaczanie stężenia RNA, reakcję odwrotnej transkrypcji, PCR w czasie rzeczywistym).
Hodowle komórkowe. Komórki wyizolowane z galarety Whartona ze sznura pępowinowego hodowano w naczyniach hodowlanym przystosowanym do hodowli komórek adherentnych o powierzchni 25 cm2 TC Flask T25 firmy Sarstedt. Komórki hodowano w podłożu hodowlanym zawierającym: pożywkę hodowlaną DMEM/F-12 50/50 1X + L-glutamine firmy Corning, 10% płodową surowicę bydlęcą FBS Good Filtrated Bovine Serum firmy Pan Biotech i 1% roztwór antybiotyków Antibiotic-Antimycotic
PL 238 286 B1 (100X) Penicylina, Streptomycyna, Amfoterycyna B firmy Gibco. Hodowle komórkowe inkubowano w inkubatorze Galaxy 170R firmy New Brunswick w warunkach: temperatura 37°C, stężenie tlenu 4%, stężenie dwutlenku węgla 5% i wilgotność 95%. Podłoże hodowlane zmieniano co 3 dni, z mikroskopową hodowanych komórek przy użyciu mikroskopu odwróconego Olympus CX 41. Komórki przygotowywano do analizy cytometrycznej oraz izolacji RNA. Hodowle komórkowe prowadzono w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej liczby komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. W trakcie hodowli komórki pasażowano po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny.
Izolacja RNA. Izolację komórkowego RNA przeprowadzono za pomocą metody Chomczyńskiego i Sacchi przy użyciu odczynników: Tri Reagent Solution firmy Ambion, chloroform firmy Sigma-Aldrich, izopropanol firmy Sigma i alkohol etylowy bezwodny 99,8% firmy POCh. Komórki umieszczono w probówkach typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Następnie do każdej z probówek dodano po 0,5 ml odczynnika Tri Reagent i homogenizowano komórki przy użyciu pipety, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Kolejno próby inkubowano przez 5 min. w temperaturze pokojowej, po czym do każdej próbki dodano po 100 pl chloroformu, wytrząsano ręcznie i ponownie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min.
Spektrofotometryczne oznaczanie stężenia RNA. Następnie próbki wirowano przez 15 min w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 13,2 tys. obr./min. w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu zebrano fazę wodną do nowych probówek typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml po czym dodano 250 pl izopropanolu, a kolejno próbki mieszano ręcznie, inkubowano przez 20 min w temperaturze pokojowej i wirowano przez 20 min w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 13,2 tys. obr./min. w temperaturze 4°C. Po odwirowaniu pozbywano się supernatantu, a do powstałego osadu dodano 0,5 ml schłodzony 75% etanol. Po zwirowaniu supernatant zlano i pozostawiono próbki przez 10 min w celu wysuszenia osadu. Następnie próbki rozpuszczano w 12 pl wody ultraczystej i umieszczano na lodzie. Do oznaczania stężenia i czystości RNA wykorzystano 2 pl próbki. Pomiary próbek wykonano kilkukrotnie przy użyciu aparatu NanoDrop 2000c firmy Thermofisher. Próbki o stosunku wartości absorbancji 260/280 zawierające się w zakresie 1,8-2,0 wykorzystano do dalszych badań.
Reakcja odwrotnej transkrypcji. Po wstępnym oznaczeniu stężenia w aparacie NanoDrop Agilent doprowadzano próbki do koncentracji 1 pg/pl RNA. Następnie przeprowadzano reakcję odwrotnej transkrypcji polegającą na przepisaniu mRNA na komplementarne cDNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy zgodnie z protokołem poniżej: 10x RT Buffer - 2 pl, 25x dNTP Mix (100 mM) - 0.8 pl, 10x RT Random Primers - 2.0 pl, MultiScribe Reverse Transcriptase - 1.0 pl, RNase Inhibitor - 1.0 pl i Nuclease-free H2O - 3.2 pl. Po dodaniu wszystkich odczynników z zestawu High-Capacity cDNA Transcrption Kits firmy Applied Biosystems kolejno dodano 10 pl RNA o stężeniu 1 pg/pl, następnie próbki wymieszano przy użyciu aparatu Vortex MS3 basic firmy IKA, wirowano przez 10 s w wirówce 5415R firmy Eppendorf z prędkością 2 tys. obr./min po czym umieszczano w termocyklerze Veriti firmy Applied Biosystems w cyklach: 10 min w temperaturze 25°C, 2 godziny w temperaturze 37°C i 5 min w temperaturze 85°C. Po zakończonej reakcji próbki przechowywano w temperaturze -20°C.
PCR w czasie rzeczywistym. W trakcie badania, po 6 pasażach izolowano całkowity komórkowy RNA metodą Chomczyńskiego i Sacchii (Chomczyński i wsp., 1987), w celu wykonania ekspresji genów - w komórkach kontrolnych (hodowanych bez wydzieliny roślinnej) i w komórkach hodowanych na podłożu z wydzieliną roślinną. Metodami standardowymi oceniano preparaty mRNA, wykonano syntezę cDNA i analizę ekspresji genów techniką qPCR w aparacie StepOnePlus firmy Applied Biosystems, wykorzystując zestawy odczynników firmy Applied Biosystems, reakcje prowadzono w objętości 25 pl/dołek. Poziomy ekspresji (ACT) badanych genów obliczono według wzoru znanego z publikacji Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001; 25:402-408. W celu ustalenia wartości ACT, AACT oraz RQ skorzystano z poniższych wzorów:
ACT badanego genu = CT badanego genu - CT GAPDH
ACT genu kalibratora = CT genu kalibratora - CT GAPDH
AACT= ACT badanego genu - ACT kalibratora, gdzie ACT kalibratora stanowi średnia wyników ACT genu kalibratora w grupie kontrolnej RQ=2-AACT
PL 238 286 B1
Analizowano poziomy ekspresji genów związanych z procesem apoptozy oraz proliferacji, w odniesieniu do kontroli endogennej - genem referencyjnym był gen GAPDH (sonda Hs. Stosowano następujące sondy firmy ThermoFisher dla badanych genów: POU5F1 (Hs00999634_gH), KLF4 (Hs00358836_m1), SOX2 (Hs04234836_s1), SOX9 (Hs00165814_m1), AMIG01 (Hs00827030_g1) i CLDN1 (Hs00221623_m1).
Zastosowane procedury te umożliwiły pozytywną ocenę wpływu wydzieliny roślinnej na przebieg hodowli komórek macierzystych, które łatwiej się przyklejały do podłoża i szybciej proliferowały.
Oceniano również testem z MTT i aneksyną V/jodek propidiowy wpływ wydzieliny roślinnej na komórki i wykluczono efekty cytotoksyczne. Jednocześnie wykonano dokumentację hodowanych komórek stosując mikroskopię świetlną i elektronową.
Wyniki i ich dyskusja
Wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia poprawiają adherentność ludzkich komórek macierzystych wyizolowanych z galarety Whartona pępowiny. Zbadano ekspresję wybranych genów kodujących białka błony komórkowej, które umożliwiają przyleganie komórek do siebie lub do substancji (macierzy) międzykomórkowej. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomórkowym. Wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny.
Na Fig. 1 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów AMIGO1 i CLDN1 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki kontrolne (bez wydzieliny). Zaobserwowano średni wzrost ekspresji genu AMIGO1 o 7% (Fig. 1) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Jednocześnie zaobserwowano średni wzrost ekspresji genu CLDN1, kodującego klaudynę 1 o 28% (Fig. 1) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej.
Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania A MIGO1 i CLDN1 - odpowiedni o 7% i 28% (Fig. 1). Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Stwierdzono również, że śluz roślin gatunku Pinguicula rectifolia zwiększa potencjał pluripotencji oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek bez obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Zasadniczy efekt techniczny uzyskiwany dzięki wynalazkowi dotyczy zwiększenia przylegania (adherencji) MSC do podłoża w celu zwiększenia ich proliferacji (podziałów komórkowych). W tym celu wykorzystano wydzieliny (śluz) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia. Istotą sposobu prowadzenia hodowli komórkowych według wynalazku jest zastosowanie wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia do pokrycia dna naczynia hodowlanego (szklanego lub plastikowego) co zwiększa adherentność MSC a przez to uzyskanie odpowiednio dużej liczby MSC jako materiału przeszczepowego. W przeprowadzonych eksperymentach hodowlanych in vitro nieoczekiwanie ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Drosophyllum poprawiają adherentność komórek macierzystych i zwiększają proliferację w hodowlach komórkowych, jednocześnie pozostając bez niepożądanego wpływu cytotoksycznego.
Następnie badano wpływ wynalazku na ekspresję badanych genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych.
Na Fig. 2 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów POU5F1 i KLF4 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki kontrolne (bez wydzieliny). Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genu POU5F1 - średni wzrost ekspresji o 7% (Fig. 2) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Gen koduje białko odpowiedzialne za zachowywanie cech pluripotencji komórek macierzystych. Równie nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genu KLF4 - średni wzrost ekspresji o 5,5% (Fig. 2) - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Gen koduje białko odpowiedzialne za zachowywanie cech macierzystości i przeciwdziała różnicowaniu komórek - co jest bardzo istotną cechą w uzyskaniu dużej liczby komórek macierzystych do przeszczepów.
Następnie badano wpływ wynalazku na ekspresję badanych genów kodujących czynniki transkrypcyjne związane z utrzymywaniem pluripotencji komórek macierzystych. Nieoczekiwanie okazało
PL 238 286 Β1 się, że wydzieliny (śluzy) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych:
Na Fig. 3 przedstawiono wyniki pomiaru poziomu ekspresji genów S0X2 i S0X9 w komórkach macierzystych. Wartość LogRQ dla komórek badanych (hodowle z wydzieliną) vs. komórki kontrolne (bez wydzieliny). Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji genów S0X2 i S0X9 (Fig. 3) - regulujących transkrypcję (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Wykazano średni wzrost ekspresji genu S0X2 o 38% - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej. Jednocześnie wykazano średni wzrost ekspresji genu S0X9 o 13% - w stosunku do komórek hodowanych w tych samych warunkach bez wydzieliny roślinnej.
Następnie, stosując technikę cytometrii przepływowej (cytometr Navios) oceniono obecność antygenów charakterystycznych dla komórek macierzystych i porównano w obu grupach hodowanych komórek: w obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia i w hodowlach bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Komórki te charakteryzowała obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 przy jednoczesnym braku CD45, CD34, CD14. Wyniki przedstawiono w poniższej tabeli:
Badany antygen Średni odsetek komórek macierzystych hodowanych w obecności wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula Średni odsetek komórek macierzystych hodowanych bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula
CD105+ 97,00 97,70
CD73+ 94,30 98,60
CD90+ 93,8 97,30
CD45+ 0 0
CD34+ 0 0
CD14+ 0 0
Korzystnie, w przykładowych realizacjach hodowle komórkowe prowadzi się w czasie pozwalającym na uzyskanie odpowiedniej ilości komórek, korzystnie w czasie 21 dni w standardowych warunkach: w temp. 37°C, w stężeniu tlenu na poziomie 21% oraz 5% CO2. Korzystnie, w trakcie hodowli komórki pasażuje się po osiągnięciu odpowiedniej fazy wzrostu, zwłaszcza co 3 dni, z zastosowaniem trypsyny. Korzystnie, w przykładowych realizacjach stosuje się podłoże o następującym składzie: 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 0,5% penicyliny ze streptomycyną, 0,5% amfoterycyny, DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium).
Na Fig. 4 przedstawiono komórki macierzyste hodowane z wydzielinami (śluzami) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Wnioski
W wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że właściwości wydzieliny roślin z gatunku Pinguicula rectifolia nie powodują niepożądanego wpływu cytotoksycznego na ludzkie komórki macierzyste.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzielina z roślin D Pinguicula rectifolia poprawia adherentność ludzkich komórek macierzystych. Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów kodujących białka przylegania AMIGO1 i CLDN1 - odpowiedni o 7% i 28%. Czyli wydzieliny (śluz) roślin Pinguicula rectifolia wpływają korzystnie na ekspresję genów kodujących cząsteczki adhezyjne - zwiększające przyleganie komórek do podłoża, przez co poprawiające ich potencjał wzrostowy i proliferacyjny. Białka te również wytyczają kierunek migracji hodowanych komórek w środowisku zewnątrzkomorkowym. Jest to bardzo istotna informacja dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek adherentnych (rosnących na podłożu a nie w zawiesinie), w tym komórek macierzystych.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzielina roślin Pinguicula rectifolia poprawia potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych. Nieoczekiwanie kontakt komórek macierzystych z wydzieliną roślinną wpłynął na wzrost ekspresji dwóch genów związanych z utrzymywaniem potencjału pluripotencji komórek macierzystych:
PL 238 286 B1
POU5F1 i KLF4. W ten sposób (śluz) roślin Pinguicula rectifolia wpływa pozytywnie na potencjał pluripotencji („macierzystości”) oraz przeciwdziała różnicowaniu w hodowlach komórkowych - są to bardzo korzystne właściwości efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych, nie uzyskiwane w takich samych warunkach hodowli tych samych komórek bez wydzieliny (śluzu) roślin z gatunku Pinguicula rectifolia.
Ponadto, w wyniku przeprowadzonych badań ustalono, że wydzieliny roślin Pinguicula rectifolia poprawiają utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli. Nieoczekiwanie okazało się, że wydzieliny roślin Pinguicula rectifolia zwiększają ekspresję genów regulujących transkrypcję: SOX2 i SOX9 (kodują czynniki transkrypcyjne), utrzymujących pluripotencję komórek macierzystych. Utrzymanie pluripotencji komórek macierzystych w hodowli jest niezwykle ważne dla efektywnego prowadzenia hodowli komórek macierzystych jako źródła komórek macierzystych do przeszczepów i eksperymentów. Test na obecność antygenów powierzchniowych CD105, CD73, CD90 charakterystycznych dla komórek macierzystych potwierdził, iż komórki w kontakcie z wydzieliną roślinną utrzymują swoje właściwości.

Claims (3)

1. Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, znamienna tym, że stanowi powierzchnię naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach roślin tego gatunku.
2. Sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych w znanych warunkach i w znanym medium hodowlanym, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się na stałej powierzchni naczynia hodowlanego pokrytą zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach roślin tego gatunku.
3. Zastosowanie powierzchni naczynia hodowlanego pokrytej zewnętrzną powłoką zawierającą śluz wydzielany przez rośliny z gatunku Pinguicula rectifolia, korzystnie śluz wydzielany przez gruczoły trzoneczkowe występujące na liściach i kwiatostanach roślin tego gatunku, do prowadzenia hodowli adherentnej komórek macierzystych.
PL428367A 2018-07-10 2018-12-30 Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych PL238286B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL428367A PL238286B1 (pl) 2018-12-30 2018-12-30 Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych
PCT/PL2019/050040 WO2020013719A1 (en) 2018-07-10 2019-07-10 Stem cell culture method using plant secretion

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL428367A PL238286B1 (pl) 2018-12-30 2018-12-30 Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL428367A1 PL428367A1 (pl) 2020-07-13
PL238286B1 true PL238286B1 (pl) 2021-08-02

Family

ID=71512363

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL428367A PL238286B1 (pl) 2018-07-10 2018-12-30 Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL238286B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL428367A1 (pl) 2020-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Danisovic et al. Effect of long-term culture on the biological and morphological characteristics of human adipose tissue-derived stem cells
Chae et al. Stromal vascular fraction shows robust wound healing through high chemotactic and epithelialization property
TWI637055B (zh) 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法
Danišovič et al. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering
Soleimannejad et al. Fibrin gel as a scaffold for photoreceptor cells differentiation from conjunctiva mesenchymal stem cells in retina tissue engineering
US20230092739A1 (en) Stem cell compositions and methods of producing stem cells for therapeutic applications
Schosserer et al. Urine is a novel source of autologous mesenchymal stem cells for patients with epidermolysis bullosa
RU2433172C2 (ru) Способ получения гомогенной популяции стволовых клеток и ее применение
Lisini et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells for clinical application: An efficient isolation approach
CN111084905A (zh) 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法
JP5636174B2 (ja) 間葉系細胞または軟骨細胞の製法ならびに発癌性の抑制方法
KR101760239B1 (ko) 세포배양 삽입체를 이용한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 세포의 분리방법
KR102015502B1 (ko) 인간 제대로부터 줄기세포를 분리하는 방법
PL238286B1 (pl) Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób prowadzenia hodowli adherentnych komórek macierzystych
JP6711756B2 (ja) 間葉系幹細胞から誘導された万能幹細胞を利用して脂肪細胞に分化させる方法
PL238285B1 (pl) Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie oraz sposób hodowli adherentnych komórek macierzystych
WO2020013719A1 (en) Stem cell culture method using plant secretion
KR20180092506A (ko) 이종 동물 혈청이 첨가된 배지 없이 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법
PL237158B1 (pl) Powierzchnia do hodowli adherentnych komórek macierzystych, jej zastosowanie i sposób hodowli komórek macierzystych
RU2821926C1 (ru) Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих
Straka et al. Effect of long-term cultivation on morphological and biological characteristics of human periodontal ligament stem cells
CN115011554B (zh) 骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用
RU2722173C1 (ru) Способ прогнозирования скорости роста культуры по количеству альдегиддегидрогеназа-положительных мезенхимальных клеток костного мозга доноров
Nor et al. Growth Factor Cocktail to Facilitate Epithelial Differentiation of Exfoliated Deciduous Teeth Stem Cells
KR102435452B1 (ko) 노화가 감소되고 줄기세포능이 보존된 초기 중간엽 줄기세포, 및 그 배양방법