PL235926B1 - Przepływowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest przepływowe, zamknięte, wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne (bioczip) ze zintegrowanym mechanizmem uszkadzania aksonów oraz rozłączną podstawą do prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych, w szczególności komórek nerwowych (neuronów) w warunkach przepływowych oraz prowadzenia badań neurologicznych. Mikrourządzenie znajduje zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii i inżynierii biomedycznej. Umożliwia prowadzenie badań w kontrolowanych warunkach, w szczególności kontrolowanego wzrostu komórek nerwowych oraz kontrolowanego uszkadzania i regeneracji uszkodzeń aksonów jak również badań wpływu czynników biologicznych, chemicznych i fizycznych na proces regeneracji połączeń nerwowych. W szczególności, urządzenie przeznaczone jest do badań i symulacji zjawisk zachodzących podczas mechanicznego uszkodzenia rdzenia kręgowego oraz procesu regeneracji połączeń nerwowych w rdzeniu kręgowym, w tym z wykorzystaniem kohodowli komórkowych.

Neurony to komórki nerwowe zdolne do przetwarzania i przewodzenia informacji w postaci sygnału elektrycznego. Neurony są podstawowym elementem układu nerwowego ludzi i zwierząt, w szczególności ośrodkowego układu nerwowego, w skład którego wchodzi mózgowie oraz rdzeń kręgowy. Neuron zbudowany jest z ciała komórki (soma) oraz odchodzących od niego wypustek: aksonu i dendrytów. Neurony kontaktują się między sobą poprzez synapsy tworząc sieci neuronowe. Nieprawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego, będące wynikiem zaburzeń przewodzenia bodźców elektrycznych w sieciach neuronowych jest przyczyną nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych takich jak: stwardnienie zanikowe boczne (choroba Charcota, choroba Lou Gehriga, ALS), choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona, stwardnienie rozsiane, choroba Alexandra, choroba Alpersa, choroba Canavan, choroba Spielmeyera-Vogta-Sjogrena i wiele innych. Ponadto urazy mechaniczne rdzenia kręgowego, udary oraz wstrząśnienia mózgu mogą prowadzić do nieodwracalnych zaburzeń w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego. Urazy mechaniczne rdzenia kręgowego prowadzą do utraty jego czynności poniżej miejsca urazu oraz innych objawów, jak: niedowłady, zaburzenia czucia, zaburzenia świadomości czy niewydolność oddechowa. Uraz rdzenia kręgowego możne polegać na jego stłuczeniu, ucisku, naciągnięciu, rozerwaniu, przecięciu, złamaniu i zmiażdżeniu.

Badania z wykorzystaniem hodowli komórek nerwowych są podstawową metodą poznawczą patogenezy oraz metod leczenia chorób neurologicznych. Klasycznie, hodowle komórkowe neuronów prowadzone są na szalkach Petriego lub w komorach Campenota. W tych hodowlach bardzo trudne jest rozróżnienie aksonów od dendrytów i zastosowanie odmiennego mikrośrodowiska hodowli dla aksonów, dendrytów i synaps. Nie ma możliwości pozycjonowania neuronów oraz wymuszenia pożądanej struktury połączeń nerwowych występujących w różnych tkankach nerwowych. Nie jest możliwe prowadzenie hodowli w warunkach dynamicznych w układzie przepływowym. Występują problemy z zachowaniem warunków sterylnych z racji otwartej konfiguracji układów. Dodatkowo, żadne z klasycznych urządzeń wykorzystywanych do hodowli neuronów nie umożliwia uszkadzania aksonów w kontrolowany sposób i zastosowania odmiennego mikrośrodowiska w miejscach ich uszkodzeń, co jest istotne w przypadku prowadzenia badań mechanizmu regeneracji uszkodzeń połączeń nerwowych w obecności czynników stymulujących: fizycznych, chemicznych i biologicznych oraz kohodowli komórkowych. Opracowano szereg konstrukcji mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych, w których częściowo zniwelowano wady układów klasycznych (Park, J. W., Kim, H.J., Kang, M.W., Jeon, N.L., 2013. Advances in microfluidics-based experimental methods for neuroscience research. Lab. Chip 13, 509-521). Znane są z literatury naukowej otwarte, stacjonarne i nieprzepływowe mikrosystemy do hodowli komórek nerwowych, w których zastosowano pneumatyczny system uszkadzania aksonów wykorzystujący bezpośredni strumień wody do ich przecięcia, podciśnienie lub nadciśnienie do rozciągnięcia aksonów (Yap, Y.C., Dickson, T.C., King, A.E., Breadmore, M.C., Guijt, R.M., 2014. Microfluidic culture platform for studying neuronal response to mild to very mild axonal stretch injury. Biomicrofluidics 8, 044110), wiązkę lasera impulsowego do termicznej destrukcji aksonu (Heilman, A.N., Vahidi, B., Kim, H.J., Mismar, W., Steward, O., Jeon, N.L., Venugopalan, V, 2010. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab. Chip 10, 2083-2092) lub pneumatycznie ekspandowane wybrzuszenie do zgniatania aksonów (Hosmane, S., Fournier, A., Wright, R., Rajbhandari, L., Siddique, R., Yang, I.H., Ramesh, K.T., Venkatesan, A., Thakor, N, 2011. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab. Chip 11, 3888-3895).

PL 235 926 B1

W międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO2004034016 oraz WO2006037033 opisano metodę wytwarzania oraz mikrosystem stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty z separacją hydrauliczną komór za pomocą różnicy ciśnienia hydrostatycznego płynów pomiędzy komorami somalną i dystalną połączonymi krótkimi równoległymi odcinkami mikrokanałów przez które penetrują aksony komórek nerwowych. Komórki nerwowe wewnątrz komór hodowlanych były pozycjonowane za pomocą siły odśrodkowej przy wlotach do mikrokanałów, co promowało penetrację aksonów do wnętrza mikrokanałów łącznikowych. Szerokość bariery pomiędzy komorami wynosiła 450 mikrometrów, co zapobiegało penetracji dendrytów do komory dystalnej, a niewielka średnica mikrokanałów łącznikowych uniemożliwiała migracje komórek nerwowych z komory somalnej do dystalnej.

W kolejnym zgłoszeniu międzynarodowym nr W02010040920 ujawniono stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty układ do hodowli komórkowych, w szczególności komórek nerwowych, złożony z co najmniej dwóch komór połączonych za pomocą sieci mikrokanałów różnych kształtów i zmiennej średnicy, łączących się wzajemnie. Aksony penetrowały z komory somalnej do dystalnej wewnątrz mikrokanałów, a ich złożona struktura wymuszała przestrzenny układ aksonów. Mikrosystem nie był jednak wyposażony w układ do uszkadzania aksonów.

Patent europejski nr EP2470640 oraz zgłoszenie WO2009121555 opisuje zamknięty mikrosystem do hodowli komórkowych oraz metodę funkcjonalizacji jego powierzchni, złożony z dwóch komór przedzielonych łącznikiem. Mikrosystem złożony jest z pokrywy, podłoża oraz ścian połączonych ze sobą w sposób trwały i hermetyczny umożliwiając zachowanie właściwości powierzchniowych oraz sterylnych warunków przez długi okres przechowywania. Powierzchnia kanałów jest miejscowo funkcjonalizowana umożliwiając pozycjonowanie komórek w ich wnętrzu. Mikrosystem wyposażony był dodatkowo w elektrody wymuszające perfuzję substancji czynnych pomiędzy kanałami, jednakże nie był wyposażony w układ do uszkadzania aksonów z kontrolą mikrośrodowiska w miejscu ich uszkadzania.

Z międzynarodowego zgłoszenia nr WO2012174445 znany jest przepływowy układ do hodowli komórkowych, w szczególności nefrocytów, naśladujący dynamiczne warunki przepływu w nerkach. Aparat wyposażony jest w szereg przepływowych komór hodowlanych, w których na podłoże i ściany były naniesione struktury o różnym kształcie w postaci kanałów i wypustek ułatwiające prowadzenie hodowli komórkowych.

Stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty mikrosystem do prowadzenia hodowli neuronów, metodę jego wytwarzania oraz metodykę prowadzenia badań z jego wykorzystaniem ujawniono w zgłoszeniu nr WO2015013804. Układ składał się z czterech cylindrycznych zasobników płynów połączonych z narożnikami równolegle przebiegających mikrokomór hodowlanych, które zostały połączone prostopadłymi odcinkami mikrokanałów.

Z amerykańskiego zgłoszenia nr US20100323434 znany jest również wieloprzedziałowy i wielokomorowy otwarty mikrosystem do hodowli komórek nerwowych zaopatrzony w szereg kanałów wiodących aksony do prowadzenia równoległych hodowli i kohodowli komórkowych. Szereg komór somalnych i dystalnych zostało rozmieszczonych po okręgu na jednej podstawie.

Natomiast w zgłoszeniu patentowym nr WO2013017770 opisano otwarte mikrourządzenie w postaci perforowanej płytki do hodowli komórek nerwowych, a w zgłoszeniu nr WO2015092141 platformę mikrofluidalną do hodowli i badań procesu mielinizacji włókien nerwowych.

Żadne z przytoczonych oraz ze znanych urządzeń mikrofluidalnych nie wykorzystuje rozłącznej podstawy zbudowanej z dwóch warstw materiału o odmiennych właściwościach: spodniej sprężystej i wierzchniej elastycznej, która to podstawa wraz z nieruchomą listwą tworzy mechanizm kontrolowanego, precyzyjnego uszkadzania aksonów poprzez kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego, a tym samym zaburzania mikrośrodowiska hodowli. Znane rozwiązania z literatury patentowej oraz naukowej w postaci otwartych, stacjonarnych i nieprzepływowych mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych nie umożliwiają prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych w stabilnych, sterylnych warunkach w długim okresie czasu. W wyniku procesów metabolicznych przebiegających w żywych komórkach następuje ciągły i sukcesywny ubytek substancji odżywczych i tlenu z medium hodowlanego oraz wzrost stężenia metabo litów w komorach hodowlanych w mikrosystemach stacjonarnych, nie przepływowych. Pociąga to za sobą konieczności częstej wymiany medium hodowlanego w komorach mikrosystemu. Wahania składu medium hodowlanego zaburzają mikrośrodowisko hodowli komórkowych.

PL 235 926 B1

W otwartych, stacjonarnych i nieprzepływowych urządzeniach mikrofluidalnych separację hydrauliczną komór hodowlanych uzyskuje się dzięki precyzyjnie kontrolowanej wysokości cieczy w jej zasobnikach, co jest trudne i kłopotliwe w długim okresie czasu z racji jej ubytków spowodowanych parowaniem. Układy przepływowe z racji ciągłej wymiany płynu w komorach nie wymagają precyzyjnej kontroli ciśnień hydrostatycznych w ich wnętrzu, a efekty niewielkich przepływów cieczy pomiędzy komorami są niwelowane ciągła wymianą płynów w komorach. Nie występuje też efekt parowania cieczy z układu.

Znane z literatury pneumatyczne systemy uszkadzania aksonów stosowane w otwartych urządzeniach mikrofluidalnych są złożone, przez co trudne w wykonaniu, kontroli oraz zawodne i kłopotliwe w stosowaniu. Wymagają stosowania zewnętrznych układów generowania i kontroli ciśnienia. Podwyższone ciśnienie w kanałach roboczych mikrourządzenia często prowadzi do nieodwracalnego odkształcenia ścian mikrosystemu, jego rozwarstwienia i utraty szczelności. Z kolei zastosowanie wiązki laserowej nie pozwala na oddanie efektu kompresji aksonu w miejscu jego uszkodzenia, jak również prowadzi do wystąpienia niekorzystnych efektów termicznych. Ponadto zastosowanie bezpośrednich metod uszkadzania aksonów nie jest możliwe w zamkniętych układach przepływowych.

W rezultacie wynikła potrzeba opracowania nowego rozwiązania konstrukcyjnego rozwiązującego powyższe problemy.

Przepływowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych, według wynalazku, składa się z rozłącznej, dwuwarstwowej sprężystej i elastycznej podstawy utworzonej z dwóch warstw: spodniej wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) oraz wierzchniej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS), warstwy funkcjonalnej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS) lub niestechiometrycznej mieszaniny tioli i związków enowych w postaci tetratiolu i triallilu (OSTE), warstwy szklanej, warstwy klejowej wykonanej z błony klejowej oraz wieka wykonanego z polimetakrylanu metylu (PMMA) , przy czym w warstwie funkcjonalnej wykonane są komory hodowlane: somalna, uszkodzeń aksonów oraz dystalna, przy czym w komorze uszkadzania aksonów usytuowana jest nieruchoma listwa wykonana z polidimetylo siloksanu (PDMS), która wraz z wierzchnią warstwą podstawy, w której wykonane są kanały wiodące aksony, tworzy mechanizm uszkadzania aksonów.

Korzystnie grubość wierzchniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 1 mikrometr i nie większa niż 20 mikrometrów.

Korzystnie grubość spodniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.

Korzystnie wykonane w wierzchniej warstwie podstawy mikrokanały wiodące aksony są wzajemnie równoległe.

Korzystnie długość kanałów wiodących jest nie mniejsza niż szerokość komory uszkadzania aksonów wraz ze ścianami okalającymi po dłuższych bokach tą komorę, najkorzystniej długość kanałów wiodących jest równa sumie szerokości komór hodowlanych: somalnej, uszkadzania aksonów i dystalnej wraz z oddzielającymi je ścianami.

Korzystnie wysokość listwy do uszkadzania aksonów jest nie większa niż wysokość warstwy funkcjonalnej i nie mniejsza niż jedna dziesiąta jej wysokości.

Korzystnie szerokość listwy do uszkadzania aksonów odpowiada planowanej długości odcinka uszkodzenia aksonu.

Korzystnie obie warstwy podstawy zostały połączone z warstwą funkcjonalną w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny.

Korzystnie warstwa szklana połączona jest z warstwą funkcjonalną w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.

Korzystnie warstwa klejowa łączy warstwę szklaną z wiekiem w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.

Korzystnie komory hodowlane mają wydłużony kształt i w swej części roboczej przebiegają równolegle do siebie.

Korzystnie każda z komór hodowlanych posiada wlot i wylot.

Korzystnie wysokość komór hodowlanych jest nie mniejsza niż 30 mikrometrów i nie większa niż 1 mm.

Korzystnie warstwa szklana posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.

Korzystnie warstwa klejowa ma grubość o nie mniejszą niż 50 mikrometrów i nie większą niż 200 mikrometrów.

PL 235 926 B1

Korzystnie warstwa klejowa posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.

Korzystnie warstwa klejowa posiada wolną przestrzeń w obszarze detekcji odsłaniającą powierzchnię mikrosystemu przeznaczoną do prowadzenia obserwacji mikroskopowych.

Korzystnie wieko zaopatrzone jest w porty przyłączeniowe doprowadzające i odprowadzające płyny do/z urządzenia.

Korzystnie porty przyłączeniowe rozlokowane są na bocznych ścianach wieka.

Korzystnie wszystkie warstwy posiadają rozlokowane w jednakowych miejscach otwory pozycjonujące.

Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.

Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.

Korzystnie warstwy wykonane są z materiałów biokompatybilnych.

Przepływowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych, według wynalazku umożliwia prowadzenie długookresowych hodowli komórek nerwowych (neuronów) w stabilnych i kontrolowanych warunkach, samodzielnie lub wraz z innymi komórkami (tzw. kohodowli) przy zastosowaniu odmiennego mikrośrodowiska hodowli dla ciała komórki i dendrytów, aksonów w miejscach ich uszkodzenia oraz końcowych odcinków aksonów zakończonych synapsami, umożliwia prowadzenie hodowli w układzie zamkniętym, przepływowym z możliwością dynamicznej zmiany warunków prowadzenia badań w każdej ze stref niezależnie: natężeń przepływu, składu oraz właściwości fizycznych medium hodowlanego bez konieczności precyzyjnej kontroli ciśnień hydrostatycznych, ponadto umożliwia prowadzenia hodowli na rozłącznym podłożu, co ułatwia czyszczenie i sterylizację mikrosystemu, jak również utrwalenie, konserwację oraz obserwację komórek po hodowli poza urządzeniem mikrofluidalnym, oraz umożliwia precyzyjne i kontrolowane punktowe uszkadzanie wybranych aksonów podczas obserwacji mikroskopowych z wykorzystaniem mikromanipulatora poprzez punktowy nacisk na podstawę urządzenia mikrofluidalnego, a dzięki jej sprężystemu odkształceniu, kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładzie wykonania oraz na rysunku na którym:

fig. 1 przedstawia urządzenie mikrofluidalne wraz z portami przyłączeniowymi, fig. 2 przedstawia układ warstw w urządzeniu mikrofluidalnym, fig. 3 przedstawia układ komór hodowlanych w urządzeniu mikrofluidalnym, fig 4 przedstawia mechanizm uszkadzania aksonów w przekroju wzdłuż listwy uszkadzającej aksony:

fig. 4A - w stanie spoczynku, fig. 4B - w stanie pracy, fig. 5 przedstawia układ kanałów wiodących aksony.

Przykład realizacji

Zamknięte, przepływowe urządzenie mikrofluidalne o wymiarach 24/60/6 mm (szerokość/długość/wysokość) do prowadzenia hodowli komórek nerwowych zostało przedstawione na fig. 1, 2, 3, 4 i 5. Na fig. 1 zostało uwidocznione urządzenie mikrofluidalne w widoku ogólnym wraz z portami przyłączeniowymi 1 rozlokowanymi w bocznych ścianach urządzenia, obszarem detekcji 2, układem komór hodowlanych 3 oraz otworami pozycjonującymi 4. Urządzenie mikrofluidalne składa się z pięciu warstw: podstawy - złożonej z dwóch warstw: sprężystej 5A wykonanej z PET o grubości 100 mikrometrów oraz elastycznej 5B wykonanej z PDMS o grubości 8 mikrometrów, warstwy funkcjonalnej 6 wykonanej z PDMS o grubości 120 mikrometrów, warstwy szklanej 7 wykonanej ze szkła borokrzemowego trzeciej klasy hydrolitycznej o grubości 150 mikrometrów, warstwy klejowej 8 o grubości 100 mikrometrów oraz wieka 9 wykonanego z PMMA o grubości 5 mm.

Urządzenie posiada sześć bocznych portów przyłączeniowych w postaci otworów o średnicy 1 mm, dopasowanej do zewnętrznej średnicy mikrowęży doprowadzających i odprowadzających płyny do/z urządzenia.

Urządzenie posiada jedno centralnie rozmieszczone pole detekcji obejmujące obszar roboczy komór hodowlanych o wymiarach 14/9 mm (długość/szerokość), umożliwiające obserwację i detekcję procesów pod mikroskopem w sposób niezakłócony, bez zniekształceń optycznych, w świetle widzialnym oraz UV.

PL 235 926 B1

Urządzenie posiada trzy komory hodowlane: komorę somalną 3A, komorę uszkodzeń aksonów 3B oraz komorę dystalną 3C o przebiegu wzajemnie równoległym w obrębie obszaru roboczego urządzenia mikrofluidalnego, każda o szerokości 2 mm i długości przestrzeni roboczej 14 mm. Każda z komór hodowlanych jest komorą przepływową oraz posiada wlot i wylot podłączone do odpowiednich portów przyłączeniowych mikrourządzenia. W osi symetrii komory uszkodzeń aksonów, położona równolegle do ścian komory, znajduje się listwa 10 uszkadzająca aksony o wymiarach 12000/50/120 mikronów (długość/szerokość/wysokość). Elastyczna listwa 10 uszkadzająca aksony wraz z sprężysto-elastyczną podstawą tworzą mechanizm uszkadzania aksonów przedstawiony na fig. 4, który działa w ten sposób, że po zastosowaniu punktowym niewielkiej siły zgodnie z kierunkiem przedstawionym na rysunku 4B za pomocą strzałki, następuje odwracalne odkształcenie podstawy i zgniecenie aksonu 11. Po ustaniu działania siły, mechanizm uszkadzania aksonów samoczynnie powraca do pozycji wyjściowej przedstawionej na fig. 4A.

W dnie komór hodowlanych, w obszarze roboczym urządzenia mikrofluidalnego, przebiega prostopadle do ścian, w poprzek komór hodowlanych, sześćdziesiąt osiem prostoliniowych kanałów wiodących aksony 12. Kanały wiodące mają szerokość 30 mikrometrów i wysokość 8 mikrometrów.

Urządzenie posiada cztery otwory pozycjonujące rozmieszczone w narożach urządzenia, umożliwiające precyzyjne wzajemne pozycjonowanie warstw mikrourządzenia.

Warstwy podstawy 5A i 5B połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Podstawa połączoną jest z warstwą 6 w sposób rozłączny i hydraulicznie szczelny. Warstwy 6-9 połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Warstwy 5A-7 połączone są ze sobą bez użycia kleju, a jedynie w wyniku modyfikacji właściwości powierzchniowych. Warstwa klejowa 8 łączy ze sobą warstwy 7 i 9. W warstwach 7 i 8 wykonane zostały otwory przelotowe 13 umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi warstwami.

Claims (23)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych w warunkach przepływowych, znamienne tym, że składa się z rozłącznej, sprężysto-elastycznej podstawy utworzonej z dwóch warstw: spodniej (5A) wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) oraz wierzchniej (5B) wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS), warstwy funkcjonalnej (6) wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS) lub niestechiometrycznej mieszaniny tioli i związków enowych w postaci tetratiolu i triallilu (OSTE), warstwy szklanej (7), warstwy klejowej (8) wykonanej z błony klejowej oraz wieka (9) wykonanego z polimetakrylanu metylu (PMMA), przy czym w warstwie funkcjonalnej (6) wykonane są komory hodowlane: somalna (3A), uszkodzeń aksonów (3B) oraz dystalna (3C), przy czym w komorze uszkodzeń aksonów (3B) usytuowana jest nieruchoma listwa do uszkadzania aksonów (10) wykonana z polidimetylo siloksanu (PDMS), która wraz z wierzchnią warstwą podstawy (5B), w której wykonane są kanały wiodące aksony (12), tworzy mechanizm uszkadzania aksonów.
2. 2. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że grubość wierzchniej warstwy podstawy (5B) jest nie mniejsza niż 1 mikrometr i nie większa niż 20 mikrometrów.
3. 3. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że grubość spodniej warstwy podstawy (5A) jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.
4. 4. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że kanały wiodące aksony (12) są wzajemnie równoległe.
5. 5. Urządzenie według zastrz. 4, znamienne tym, że długość kanałów wiodących aksony (12) jest nie mniejsza niż szerokość komory uszkodzeń aksonów (3B) wraz ze ścianami okalającymi po dłuższych bokach tą komorę, w szczególności długość kanałów wiodących aksony (12) jest równa sumie szerokości komór hodowlanych: somalnej (3A), uszkadzania aksonów (3B) i dystalnej (3C) wraz z oddzielającymi je ścianami.
6. 6. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wysokość listwy do uszkadzania aksonów (10) jest nie większa niż wysokość warstwy funkcjonalnej (6) i nie mniejsza niż jedna dziesiąta jej wysokości.
7. 7. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że szerokość listwy do uszkadzania aksonów (10) odpowiada planowanej długości odcinka uszkodzenia aksonu.

   PL 235 926 B1
8. 8. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że dwuwarstwowa podstawa (6A, 6B) została połączona z warstwą funkcjonalną (6) w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny.
9. 9. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa szklana (7) połączona jest z warstwą funkcjonalną (6) w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.
10. 10. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa klejowa (8) łączy warstwę szklaną (7) z wiekiem (9) w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.
11. 11. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że komory hodowlane (3A, 3B, 3C) mają wydłużony kształt i w swej części roboczej przebiegają równolegle do siebie.
12. 12. Urządzenie według zastrz. 11, znamienne tym, że każda z komór hodowlanych (3A, 3B, 3C) posiada wlot i wylot.
13. 13. Urządzenie według zastrz. 11, znamienne tym, że wysokość komór hodowlanych (3A, 3B, 3C) jest nie mniejsza niż 30 mikrometrów i nie większa niż 1 mm.
14. 14. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa szklana (7) posiada otwory przelotowe (13) umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.
15. 15. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa klejowa (8) wykonana jest z błony klejowej o grubości nie mniejszej niż 50 mikrometrów i nie większej niż 200 mikrometrów.
16. 16. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa klejowa (8) posiada otwory przelotowe (13) umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.
17. 17. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że warstwa klejowa (8) posiada wolną przestrzeń w obszarze detekcji (2) odsłaniającą powierzchnię mikrosystemu przeznaczoną do prowadzenia obserwacji mikroskopowych.
18. 18. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wieko (9) zaopatrzone jest w porty przyłączeniowe (1) doprowadzające i odprowadzające płyny do/z urządzenia.
19. 19. Urządzenie według zastrz. 18, znamienne tym, że porty przyłączeniowe (1) rozlokowane są na bocznych ścianach wieka (9).
20. 20. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wszystkie warstwy (5A, 5B, 6, 7, 8, 9) posiadają rozlokowane w jednakowych miejscach otwory pozycjonujące (4).
21. 21. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wszystkie warstwy (5A, 5B, 6, 7, 8, 9) wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.
22. 22. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wszystkie warstwy (5A, 5B, 6, 7, 8, 9) wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.
23. 23. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że wszystkie warstwy (5A, 5B, 6, 7, 8, 9) wykonane są z materiałów biokompatybilnych.