PL235436B1 - New method for purification of chitinase A, using the affinity chromatography - Google Patents

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Wynalazek dotyczy wykorzystania chromatografii powinowactwa z użyciem białka G do oczyszczania chitynazy. Chitynazy to enzymy należące do dwóch konserwatywnych rodzin: 18. i 19. rodziny hydrolaz glikozydowych. Białka te występują w bardzo wielu typach organizmów począwszy od wirusów, przez bakterie, rośliny i owady aż po ssaki. Chitynazy odpowiadają za hydrolizę drugiego pod względem występowania w naturze polisacharydu - chityny, czyli polimeru składającego się z połączonych ze sobą wiązaniem β-1,4 cząsteczek N-acetyloglukozoaminy. Obecnie stosowane metody oczyszczania chitynazy składają się z kilkustopniowych procedur obejmujących m.in. chromatografię jonowymienną, sączenie molekularne lub chromatografię powinowactwa, o ile rekombinowane białko posiada dodatkowe metki fuzyjne.The invention relates to the use of G protein affinity chromatography to purify chitinase. Chitinases are enzymes belonging to two conserved families: the 18th and 19th families of glycoside hydrolases. These proteins are found in many types of organisms, ranging from viruses, bacteria, plants and insects to mammals. Chitinases are responsible for the hydrolysis of the second most naturally occurring polysaccharide - chitin, i.e. a polymer consisting of N-acetylglucosamine molecules connected with each other by a bond. Currently used methods of chitinase purification consist of several-step procedures, including ion exchange chromatography, molecular filtration or affinity chromatography, as long as the recombinant protein has additional fusion tags.

Chitynazy przyciągają coraz większą uwagę z uwagi na ich potencjalne wykorzystanie w różnych gałęziach przemysłu. Perspektywa zastosowania chitynazy jako przyjaznego środowisku bioinsektycydu pozwoliłaby zastąpić powszechnie używane chemiczne pestycydy w rolnictwie. Enzym ten może zostać również wykorzystany do uzyskiwania oligosacharydów będących pochodnymi chityny. Takie związki mają potencjalne zastosowanie w przetwórstwie żywności jako naturalne konserwanty, jak również w przemyśle farmaceutycznym m.in. jako preparaty o charakterze bakterio- i grzybobójczym, a także związki o potencjale obniżania cholesterolu (pochodne chitozanu). Ze względu na obfitość występowania chityny w środowisku, zastosowanie taniej a zarazem wydajnej metody oczyszczania chitynazy jakim jest opisywany wynalazek, może umożliwić również pozyskanie nowych, alternatywnych i odnawialnych źródeł energii.Chitinases are attracting more and more attention due to their potential use in various industries. The prospect of using chitinase as an environmentally friendly bioinsecticide would replace the commonly used chemical pesticides in agriculture. This enzyme can also be used to obtain chitin-derived oligosaccharides. Such compounds have potential use in food processing as natural preservatives, as well as in the pharmaceutical industry, e.g. as preparations of bactericidal and fungicidal nature, as well as compounds with the potential to lower cholesterol (chitosan derivatives). Due to the abundance of chitin in the environment, the use of a cheap and efficient method of chitinase purification, such as the described invention, may also enable the acquisition of new, alternative and renewable energy sources.

Chitynaza A to enzym o aktywności egzo- i endochitynazy, wykazujący szeroką specyficzność substratową oraz aktywny w znacznym zakresie pH. Enzym ten jest wytwarzany w komórkach zakażonych przez wirusy z rodziny bakulowirusów (Baculoviridae), do której należą wirusy o pałeczkowatym kształcie i genomie zbudowanym z dwuniciowej kolistej cząsteczki DNA. Poznane dotąd bakulowirusy zakażają komórki bezkręgowców ponad 600 gatunków i wykazują bardzo specyficzny gatunkowo tropizm, pomimo dużego podobieństwa w budowie i sekwencji genomu. W szczególności sekwencja aminokwasowa chitynaz pochodzących z bakulowirusów wykazuje znaczne podobieństwo, na co wskazuje duży stopień identyczności w obrębie domeny katalitycznej oraz obecność fragmentu immunoglobulinopodobnego (ang. immunoglobulin-like fold).Chitinase A is an enzyme with exo- and endochitinase activity, showing a broad substrate specificity and active in a wide pH range. This enzyme is produced in cells infected by viruses from the baculovirus family (Baculoviridae), which include rod-shaped viruses with a genome composed of a double-stranded circular DNA molecule. The baculoviruses known so far infect cells of more than 600 species of invertebrates and show a very species-specific tropism, despite the high similarity in structure and sequence of the genome. In particular, the amino acid sequence of the baculovirus-derived chitinases shows a high degree of similarity as indicated by a high degree of identity within the catalytic domain and the presence of an immunoglobulin-like fold.

Białko G to białko ściany komórek bakteryjnych pochodzące z bakterii rodzaju Streptococcus. Dowiedziono, że białko to oddziałuje z fragmentem Fc przeciwciał. W celu zwiększenia powinowactwa do immunoglobulin opracowano szereg modyfikacji tego białka, które są obecnie powszechnie używane do oczyszczania przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa, zwłaszcza przeciwciał ludzkich i mysich.The G protein is a bacterial cell wall protein derived from the genus Streptococcus. This protein has been shown to interact with the Fc fragment of antibodies. In order to increase the affinity for immunoglobulins, a number of modifications of this protein have been developed which are now widely used for the purification of antibodies by affinity chromatography, especially human and murine antibodies.

Celem wynalazku jest dostarczenie metody oczyszczania chitynazy lub białek zawierających sekwencję aminokwasową pochodzącą z chitynazy.An object of the invention is to provide a method for purifying chitinase or proteins containing the amino acid sequence derived from chitinase.

Przedmiotem wynalazku jest kompleks białkowy zawierający białko G i związaną z nim niekowalencyjnie chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy A posiadający powinowactwo do białka G.The subject of the invention is a protein complex containing the G protein and non-covalently related chitinase A, or a protein containing a fragment of chitinase A having an affinity for the G protein.

Chitynaza A w kontekście przedmiotowego zgłoszenia powinna być rozumiana jako białko posiadające aktywność beta-1,4-poly-N-acetylo glukozamidynazową zdolne do rozkładu polimerów chitodekstrynowych i chityny, zawierające domenę katalityczną oraz sekwencję oddziałującą z białkiem G. W korzystnej realizacji wynalazku chitynaza A zawiera fragment immunoglobulinopodobny (ang. immunoglobulin-like fold). W szczególności zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem chitynazą A jest enzym pochodzący z Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) o sekwencji zdeponowanej jako GenBank ID: CAD79454.1 lub jego homolog, w szczególności enzym pochodzący z wirusa należącego do rodziny bakulowirusów (Baculoviridae).Chitinase A in the context of the present application should be understood as a protein having beta-1,4-poly-N-acetyl glucosamidinase activity capable of degrading chitodextrin polymers and chitin, containing the catalytic domain and a sequence interacting with the G protein. In a preferred embodiment of the invention, chitinase A comprises an immunoglobulin-like fold. In particular, according to the present invention, chitinase A is an enzyme derived from Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) with the sequence deposited as GenBank ID: CAD79454.1 or a homologue thereof, in particular an enzyme derived from a virus belonging to the baculovirus family (Baculoviridae).

Korzystnie kompleks białkowy według wynalazku ulega dysocjacji w roztworze wodnym o odczynie kwaśnym (pH poniżej 5), korzystnie o pH około 2, zachowując przy tym wysoką aktywność biologiczną chitynazy. Korzystnie, chitynaza pochodzi z wirusa należącego do rodziny bakulowirusów (Baculoviridae). W korzystnej realizacji chitynaza posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. nr 1 lub sekwencję identyczną w co najmniej 50% natomiast białko G posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. nr 3.Preferably, the protein complex according to the invention dissociates in an acidic aqueous solution (pH less than 5), preferably about pH 2, while maintaining the high biological activity of the chitinase. Preferably, the chitinase is derived from a virus belonging to the baculovirus family (Baculoviridae). In a preferred embodiment, the chitinase has the amino acid sequence shown as SEQ. No. 1 or a sequence which is at least 50% identical while the G protein has the amino acid sequence shown as SEQ. no 3.

PL 235 436 B1PL 235 436 B1

Poziom identyczności należy oszacować na podstawie analiz porównawczych znanych ze stanu techniki, np.: Sangar V, Blankenberg DJ, Altman N, Lesk AM. Quantitative sequence-function relationships in proteins based on gene ontology. BMC Bioinformatics 2007, 8:294, doi:10.1186/1471-2105-8-294.The level of identity should be estimated on the basis of comparative analyzes known in the art, e.g. Sangar V, Blankenberg DJ, Altman N, Lesk AM. Quantitative sequence-function relationships in proteins based on gene ontology. BMC Bioinformatics 2007, 8: 294, doi: 10.1186 / 1471-2105-8-294.

Korzystnie, białko G jest dodatkowo immobilizowane na nośniku. W korzystnej realizacji chitynaza A lub jej fragment posiadający powinowactwo do białka G stanowi część białka fuzyjnego.Preferably, the G protein is additionally immobilized on a support. In a preferred embodiment, chitinase A or a fragment thereof having G protein affinity is part of a fusion protein.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania z roztworu wodnego chitynazy A lub białka zawierającego jej fragment posiadający powinowactwo do białka G charakteryzujący się tym, że: a) kontaktuje się białko G z roztworem wodnym zawierającym chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego białko G i związaną z nim niekowalencyjnie chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G, b) oddziela się od roztworu uzyskany kompleks białkowy, c) z uzyskanego kompleksu białkowego oddysocjowuje się chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G,Another object of the invention is a method of isolating from an aqueous solution of chitinase A or a protein containing its fragment having affinity for G protein, characterized in that: a) contacting the G protein with an aqueous solution containing chitinase A or a protein containing a fragment of chitinase having affinity for G protein in in order to obtain a protein complex containing the G protein and non-covalently related chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having an affinity for G protein, b) the obtained protein complex is separated from the solution, c) chitinase A or a protein containing the chitinase fragment is dissociated from the obtained protein complex having an affinity for G protein,

d) z roztworu po dysocjacji wyodrębnia się chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G.d) chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having an affinity for G protein is isolated from the dissociated solution.

Korzystnie w etapie a) uzyskuje się kompleks białkowy według wynalazku określony powyżej.Preferably in step a) a protein complex according to the invention as defined above is obtained.

Korzystnie, w etapie b) wyodrębnianie prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa, przy czym jako złoże stosuje się nośnik chromatograficzny zawierający immobilizowane białko G.Preferably, in step b) the isolation is carried out by affinity chromatography, using a chromatographic support containing immobilized protein G as the medium.

Korzystnie, dysocjację w etapie c) prowadzi się w roztworze wodnym o odczynie kwaśnym (pH < 5), korzystnie o pH 2.Preferably, the dissociation in step c) is carried out in an acidic aqueous solution (pH <5), preferably at pH 2.

W korzystnej realizacji sposobu według wynalazku w etapie d) wyodrębnia się białko fuzyjne zawierające chitynazę A lub jej fragment posiadający powinowactwo do białka G.In a preferred embodiment of the method according to the invention, in step d) a fusion protein containing chitinase A or a fragment thereof having an affinity for G protein is isolated.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zdefiniowanego powyżej sposobu według wynalazku do otrzymywania aktywnych biologicznie preparatów chitynazy A.Another object of the invention is the use of the above-defined method according to the invention for the preparation of biologically active preparations of chitinase A.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zdefiniowanego powyżej sposobu według wynalazku do usuwania chitynazy A z preparatów białkowych.Another object of the invention is the use of a method according to the invention as defined above for the removal of chitinase A from protein preparations.

Zgodnie z korzystną realizacją prezentowany sposób może służyć do oczyszczania metodą chromatograficzną na kolumnie zawierającej złoże zawierające immobilizowane białko G różnych białek, zwłaszcza białek rekombinowanych mających postać białek fuzyjnych składających się z białka docelowego oraz przyłączonej do niego sekwencji aminokwasowej pochodzącej z chitynazy A posiadającej powinowactwo do białka G.According to a preferred embodiment, the presented method can be used for purification by chromatography on a column containing a matrix containing immobilized G protein of various proteins, especially recombinant proteins having the form of fusion proteins consisting of a target protein and the amino acid sequence derived from chitinase A attached to it having affinity for G protein. .

Prezentowany sposób oczyszczania z wykorzystaniem bakteryjnego białka G cechuje się wysoką specyficznością, wydajnością i prostotą.The presented method of purification with the use of bacterial G protein is characterized by high specificity, efficiency and simplicity.

W celu lepszego przedstawienia prezentowanego wynalazku jego opis został uzupełniony o poniższe przykłady wykonania oraz następujące rysunki:In order to better present the present invention, its description has been supplemented with the following embodiments and the following drawings:

Fig. 1 prezentuje rozdział elektroforetyczny frakcji otrzymanych po oczyszczaniu pożywek hodowlanych znad komórek owadzich zakażonych bakulowirusem. Cyframi 1-4 oznaczono numer frakcji zawierającej wyeluowane białko. Końcowa objętość frakcji to 1 ml. Na żel nałożono 25 μl każdej z frakcji. Wizualizacji białek dokonano poprzez ich wybarwienie błękitem kumazyny.Fig. 1 shows the electrophoretic distribution of the fractions obtained after purification of the culture media from baculovirus-infected insect cells. Numbers 1-4 represent the number of the fraction containing the eluted protein. The final volume of the fraction is 1 ml. 25 µl of each fraction was applied to the gel. The proteins were visualized by staining them with cumazine blue.

Na Fig. 2 przedstawiono wynik analizy białek metodą Western blot otrzymany po ekspozycji sygnału chemiluminescencyjnego na kliszę rentgenowską. Cyframi 1-4 oznaczono numer frakcji zawierającej wyeluowane białko. Końcowa objętość frakcji to 1 ml. Na żel nałożono 25 μl każdej z frakcji. Wizualizacji białek dokonano poprzez ich wyznakowanie przy pomocy przeciwciał anty-Fc skoniugowanych z peroksydazą chrzanową, a następnie detekcję za pomocą chemiluminescencyjnego substratu dla peroksydazy chrzanowej.Fig. 2 shows the result of the protein Western blot analysis obtained after exposure of the chemiluminescent signal to X-ray film. Numbers 1-4 represent the number of the fraction containing the eluted protein. The final volume of the fraction is 1 ml. 25 µl of each fraction was applied to the gel. Proteins were visualized by labeling them with horseradish peroxidase-conjugated anti-Fc antibodies, followed by detection with a chemiluminescent substrate for horseradish peroxidase.

Na Fig. 3 przedstawiona została identyfikacja cukrów redukujących uwolnionych po trawieniu chitozanu chitynazą A (odczyn Fehlinga). A - chitozan poddany reakcji enzymatycznej z chitynazą A (żółtozielone zabarwienie osadu powstałe poprzez redukcję jonów Cu2+ do jonów Cu+). B - chitozan który nie był poddany działaniu chitynazy A (niebieskie zabarwienie osadu pochodzące od niezredukowanych jonów Cu2+).Fig. 3 shows the identification of reducing sugars released after chitosan digestion with chitinase A (Fehling's reaction). A - chitosan subjected to enzymatic reaction with chitinase A (yellow-green color of the sediment caused by reduction of Cu2 + ions to Cu + ions). B - chitosan that has not been treated with chitinase A (blue color of the precipitate coming from non-reduced Cu2 + ions).

Na Fig. 4 przedstawiono wyniki pomiarów intensywności fluorescencji (Xex = 360 nm, Xem = 455 nm) w zależności od czasu inkubacji enzymu z fluorogennym substratem. Legenda wykresu przedstawia różne stężenia użytej chitynazy (500 pM - 7,8 pM) przy wykorzystaniu stałej ilości substratu (7,5 μM).Fig. 4 shows the results of measurements of the fluorescence intensity (Xex = 360 nm, Xem = 455 nm) as a function of the enzyme incubation time with the fluorogenic substrate. The diagram legend shows the different concentrations of chitinase used (500 pM - 7.8 pM) using a constant amount of substrate (7.5 µM).

PL 235 436 B1PL 235 436 B1

Na Fig. 5 przedstawiono wynik bezpośredniego testu ELISA obrazujący wiązanie białka G do chitynaz pochodzących z różnych organizmów. Pomiaru absorbancji dokonano poprzez pomiar przy długości fali λ = 450 nm. Legenda wykresu przedstawia chitynazy pochodzące z różnych organizmów analizowane pod kątem zdolności do tworzenia kompleksu z białkiem G.Fig. 5 shows the direct ELISA result showing the binding of G protein to chitinases from various organisms. The absorbance was measured by measuring at a wavelength of λ = 450 nm. The legend of the chart shows chitinases from various organisms analyzed for their ability to form a complex with the G protein.

Poniższe przykłady nie powinny być jednak utożsamiane z pełnym zakresem przedmiotowego wynalazku, którego istotę określono powyżej.The following examples, however, should not be construed as the full scope of the present invention as defined above.

P r z y k ł a d 1. Oczyszczanie chitynazy A obejmujące uzyskiwanie kompleksu z białkiem G.Example 1. Purification of chitinase A including complexation with G protein.

Etapy procesu ekspresji i oczyszczania chitynazy A:Stages of the process of chitinase A expression and purification:

1. Ekspresja:1. Expression:

a) zawiesinową hodowlę komórek owadzich SF9 lub High Five™ prowadzono w pożywce ESF 921 firmy ExpressionSystems do momentu otrzymania gęstości 2 m ln komórek/ml pożywki;a) SF9 or High Five ™ insect cells in suspension were grown in ESF 921 medium from ExpressionSystems until a density of 2 mln cells / ml of medium was obtained;

b) komórki zainfekowano bakulowirusem (MOI = 2), a następnie hodowano przez 120 godz. w temperaturze 27°C z mieszaniem (140 rpm).b) cells were infected with baculovirus (MOI = 2) and then cultured for 120 h. at 27 ° C with stirring (140 rpm).

2. Oczyszczanie:2. Cleansing:

a) hodowle komórkowe żwirowano w temperaturze 4°C przez 5 minut przy 10 000 x g;a) the cell cultures were centrifuged at 4 ° C for 5 minutes at 10,000 x g;

b) zebrano nadsącz (pożywka pozbawiona komórek) i podwyższono pH do wartości 7,1 oraz dodano inhibitorów proteaz: PMSF (Sigma-Aldrich) oraz fenantroliny (Bioshop) do końcowego stężenia 1 mM;b) the supernatant (cell free medium) was collected and the pH was raised to 7.1 and the protease inhibitors PMSF (Sigma-Aldrich) and phenanthroline (Bioshop) were added to a final concentration of 1 mM;

c) preparat przesączono za pomocą filtrów o porowatości 0,45 μm;c) the preparation was filtered using filters with a porosity of 0.45 μm;

d) kolumnę chromatograficzną zawierającą immobilizowane białko G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow firmy GE Healthcare Life Sciences) zrównoważono 20 mM buforem fosforanowym o pH 7,1 (przygotowanym z odczynników firmy Bioshop) w ilości 5-krotnej objętości kolumny;d) the column chromatography containing immobilized protein G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow from GE Healthcare Life Sciences) was equilibrated with 20 mM phosphate buffer pH 7.1 (prepared with Bioshop reagents) in an amount of 5 times the column volume;

e) kolumnę wypełniano przygotowanym wcześniej preparatem białkowym przy prędkości przepływu 1 ml/min w temperaturze 4°C;e) the column was packed with a previously prepared protein preparation at a flow rate of 1 ml / min at a temperature of 4 ° C;

f) wypełnioną kolumnę przepłukano 20 mM buforem fosforanowym o pH 7,1 w ilości 10-krotnej objętości kolumny;f) the packed column was washed with 10 times the volume of the column with 20 mM phosphate buffer, pH 7.1;

g) elucji białka dokonano za pomocą wodnego roztworu 0,1 M kwasu cytrynowego o pH 2,0 (Bioshop). Zbierane frakcje o objętości 0,9 ml zneutralizowano poprzez dodanie 100 μl 2 M roztworu TRIS (Bioshop).g) the protein was eluted with an aqueous solution of 0.1 M citric acid, pH 2.0 (Bioshop). The collected 0.9 ml fractions were neutralized by adding 100 µl of 2M TRIS solution (Bioshop).

W trakcie oczyszczania dochodzi do niekowalencyjnego oddziaływania białka G z chitynazą A. Białko G to białko o masie ok. 21,6 kDa, natomiast masa molowa chitynazy A w przybliżeniu równa jest 65 kDa. Masa molowa powstającego kompleksu szacowana jest na ok. 87 kDa. Na Fig. 1 przedstawiono rozdział zebranych frakcji w żelu poliakryloamidowym SDS-PAGE (warunki redukujące) uwidocznionych błękitem kumazyny.During purification, a non-covalent interaction of G protein with chitinase A. Protein G is a protein with a mass of about 21.6 kDa, while the molar mass of chitinase A is approximately 65 kDa. The molar mass of the resulting complex is estimated at approx. 87 kDa. Fig. 1 shows the separation of the collected fractions on a SDS-PAGE polyacrylamide gel (reducing conditions) visualized with cumazine blue.

P r z y k ł a d 2. Identyfikacja chitynazy A oczyszczonej metodą obejmującą uzyskiwanie kompleksu z białkiem G.Example 2. Identification of chitinase A purified by a method involving complex formation with protein G.

Frakcje białek rozdzielone w żelu poliakryloamidowym według przykładu 1 poddano elektrotransferowi na membranę PVDF, którą następnie zablokowano roztworem 5% mleka w buforze TBS. Membranę inkubowano z roztworem przeciwciał anty-mysie IgG (specyficzne do fragmentu Fc) sprzęgniętymi z peroksydazą chrzanową przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Po odpłukaniu tego roztworu na membranę nałożono substrat chemiluminescencyjny dla peroksydazy chrzanowej i dokonano ekspozycji sygnału na kliszę rentgenowską. Na Fig. 2 przedstawiono otrzymany wynik.Protein fractions separated on the polyacrylamide gel of Example 1 were electrotransferred to a PVDF membrane, which was then blocked with a 5% milk solution in TBS buffer. The membrane was incubated with a solution of anti-mouse IgG (Fc fragment specific) antibodies conjugated to horseradish peroxidase for 3 hours at room temperature. After rinsing this solution, a chemiluminescent substrate for horseradish peroxidase was applied to the membrane and the signal was exposed to x-ray film. Fig. 2 shows the result obtained.

Aby jednoznacznie zidentyfikować otrzymane białko oznaczono fragment jego sekwencji aminokwasowej poczynając od N-końca. Analizie poddano 20 reszt aminokwasowych; uzyskano następujący wynik: IPGTP VIDWADRNY ALVEIN.To unambiguously identify the obtained protein, a fragment of its amino acid sequence was marked starting from the N-terminus. 20 amino acid residues were analyzed; the following result was obtained: IPGTP VIDWADRNY ALVEIN.

Otrzymaną sekwencję porównano z sekwencjami białek zebranych w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot. Analiza wykazała jednoznacznie, iż otrzymane białko to chitynaza A pochodząca z Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV).The obtained sequence was compared with the protein sequences collected in the UniProtKB / Swiss-Prot database. The analysis clearly showed that the obtained protein is chitinase A derived from Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV).

P r z y k ł a d 3. Badanie aktywności enzymatycznej chitynazy A oczyszczonej metodą obejmującą uzyskiwanie kompleksu z białkiem G.Example 3. Testing of the enzymatic activity of chitinase A purified by a method involving obtaining a complex with G protein.

Za pomocą dwóch niezależnych testów wykazano, iż chitynaza oczyszczona za pomocą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem białka G jest aktywna biologicznie.Two independent tests showed that the chitinase purified by G-protein affinity chromatography was biologically active.

PL 235 436 B1PL 235 436 B1

Pierwszy test wykonano poprzez oznaczenie cukrów redukujących powstałych po hydrolizie chitozanu wskutek aktywności enzymatycznej wyizolowanej chitynazy (test Fehlinga). W teście tym redukcji ulegają jony miedzi Cu2+ (zabarwienie niebieskie) do jonów Cu+ (zabarwienie żółto-zielone) pod wpływem obecności cukrów redukujących w badanej próbce (Fig. 3).The first test was performed by determining the reducing sugars formed after chitosan hydrolysis due to the enzymatic activity of the isolated chitinase (Fehling's test). In this test, Cu2 + ions (blue) are reduced to Cu + ions (yellow-green) due to the presence of reducing sugars in the tested sample (Fig. 3).

Drugim testem był pomiar fluorescencji produktu (4-metylolumbelliferonu) powstałego po enzymatycznym trawieniu substratu, który jest analogiem chityny (4-metylolumbelliferylo-3-D-N,N’,N”-triacetylochitotriozyd, MUF-triNAG), przez wyizolowaną chitynazę. Na wykresie (Fig. 4) przedstawiono zależność intensywności fluorescencji (proporcjonalnej do ilości produktu) od czasu prowadzonej reakcji. W teście wykorzystano stałe stężenie substratu (7,5 μ-M) oraz zmienną ilość chitynazy (od 500 pM do 7,8 pM). Wzbudzenie fluorescencji prowadzone było przy 360 nm, natomiast pomiaru fluorescencji dokonywano przy 455 nm przez 100 minut.The second test was the measurement of the fluorescence of the product (4-methylolumbelliferone) resulting from enzymatic digestion of the substrate, which is an analog of chitin (4-methylolumbelliferyl-3-D-N, N ', N "-triacetylchitotrioside, MUF-triNAG) by isolated chitinase. The graph (Fig. 4) shows the dependence of the fluorescence intensity (proportional to the product amount) on the reaction time. The test used a constant substrate concentration (7.5 μ-M) and a variable amount of chitinase (from 500 pM to 7.8 pM). Fluorescence excitation was carried out at 360 nm, while fluorescence measurement was performed at 455 nm for 100 minutes.

Kolejnym testem było sprawdzenie zdolności chitynaz pochodzących z: Autographa californica nucleopolyhedrovirus (enzym oczyszczony według przykładu 1), Streptomyces griseus (Sigma-Aldrich), Trichoderma viride (Sigma-Aldrich) oraz rekombinowanej ludzkiej chitynazy (Sino Biological Inc.) do tworzenia kompleksów z białkiem G. W tym celu przeprowadzono bezpośredni test ELISA. Studzienki płytki do testu ELISA opłaszczono chitynazami pochodzącymi z różnych organizmów stosując roztwory białek o stężeniu 8 μg/ml w 50 mM buforze boranowym o pH 8,3; opłaszczanie prowadzono przez noc w temperaturze 4°C. Następnie, w celu zablokowania wolnych miejsc na powierzchni studzienek płytki, zastosowano 3% roztwór albuminy wołowej (BSA) w buforze PBS; inkubację prowadzono przez 1 godz. w temperaturze 37°C. Po tym czasie do studzienek płytki nałożono roztwór zbiotynylowanego białka G o końcowym stężeniu 1 μg/ml w 0,5% roztworze BSA w buforze PBS; inkubację prowadzono przez 2 godz. w temperaturze 37°C. Niezwiązane białko G odpłukano buforem PBS. Do detekcji powstałych kompleksów białka G i chitynazy wykorzystano roztwór streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową (GE Helthcare) w rozcieńczeniu 1:500 w 0,5% BSA w buforze PBS; inkubacja w temperaturze 37°C trwała 45 minut. Po przepłukaniu studzienek płytki roztworem PBS dodano do nich roztwór chromogennego substratu dla peroksydazy chrzanowej, a po rozwinięciu sygnału (ok. 20 minut) reakcję zatrzymano poprzez dodanie 0,1 M roztworu kwasu solnego. Pomiaru absorbancji dokonano przy długości fali λ = 450 nm. Wynik (przedstawiony na Fig. 5) wskazał, iż tylko chitynaza A pochodząca z Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) wykazuje zdolność do tworzenia kompleksu z białkiem G.Another test was to check the ability of chitinases from: Autographa californica nucleopolyhedrovirus (enzyme purified according to example 1), Streptomyces griseus (Sigma-Aldrich), Trichoderma viride (Sigma-Aldrich) and recombinant human chitinase (Sino Biological Inc.) to form complexes with the protein G. For this purpose, a direct ELISA test was performed. The wells of the ELISA plate were coated with chitinases from various organisms using 8 µg / ml protein solutions in 50 mM borate buffer pH 8.3; coating was carried out overnight at 4 ° C. Then, a 3% solution of bovine albumin (BSA) in PBS buffer was used to block free spots on the surface of the wells of the plate; incubation was carried out for 1 hour. at 37 ° C. After this time, a biotinylated G protein solution with a final concentration of 1 µg / ml in 0.5% BSA in PBS buffer was applied to the wells of the plate; incubation was carried out for 2 hours. at 37 ° C. Unbound G protein was washed away with PBS buffer. A solution of streptavidin conjugated with horseradish peroxidase (GE Helthcare) at a dilution of 1: 500 in 0.5% BSA in PBS was used to detect the resulting complexes of G protein and chitinase; incubation at 37 ° C lasted 45 minutes. After washing the wells of the plate with PBS solution, a chromogenic substrate solution for horseradish peroxidase was added to them, and after developing the signal (approx. 20 minutes), the reaction was stopped by adding 0.1 M hydrochloric acid solution. The absorbance was measured at the wavelength λ = 450 nm. The result (shown in Fig. 5) indicated that only chitinase A derived from Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) shows the ability to complex with the G protein.

W obrębie sekwencji aminokwasowej chitynazy A otrzymanej z AcMNPV w pozycjach 14-121 znajduje się fragment immunoglobulinopodobny (ang. immunoglobulin-like fold), którego brak w sekwencji innych badanych chitynaz. Przeprowadzona analiza bioinformatyczna wskazuje, że co najmniej kilkadziesiąt chitynaz wytwarzanych w różnych organizmach posiada fragment aminokwasowy, który wykazuje homologię nie mniejszą niż 50% do fragmentu immunoglobulinopodobnego chitynazy A z AcMNPV.Within the amino acid sequence of chitinase A obtained from AcMNPV at positions 14-121 there is an immunoglobulin-like fold, which is missing from the sequence of other tested chitinases. The bioinformatics analysis carried out shows that at least several dozen chitinases produced in various organisms have an amino acid fragment that shows homology not less than 50% to the immunoglobulin-like fragment of chitinase A from AcMNPV.

Powyższe przykłady wykonania dowodzą, że aktywną biologicznie chitynazę A wytwarzaną przez zakażone bakulowirusem komórki owadzie linii SF9, SF21 oraz High Five™ udaje się oczyścić poprzez wiązanie enzymu z dużym powinowactwem do białka G. Wynalazek umożliwia oczyszczanie chitynazy A, która należy do grupy enzymów stosowanych w przemyśle m.in. do ochrony roślin, a potencjalnie także jako terapeutyk grzybobójczy oraz narzędzie enzymatyczne w wielu innych dziedzinach (m.in. do otrzymywania farmaceutyków i paliw). Wynalazek pozwala na oczyszczanie enzymu, który został otrzymany za pomocą dowolnego systemu ekspresji. W szczególności oczyszczana może być chitynaza pochodząca z bakulowirusowego systemu ekspresji białek, który jest powszechnie używany do produkcji rozmaitych białek rekombinowanych. Ponieważ przy każdym procesie otrzymywania białek rekombinowanych, do którego wykorzystywany jest bakulowirusowy system ekspresyjny generowane są produkty uboczne zawierające chitynazę (lizaty komórek owadzich, frakcje po wstępnym oczyszczaniu białek itd.) możliwe jest ich dalsze wykorzystanie w celu oczyszczania chitynazy A za pomocą niniejszego wynalazku.The above embodiments prove that the biologically active chitinase A produced by baculovirus-infected insect cells of the lines SF9, SF21 and High Five ™ can be purified by binding the enzyme with high affinity to the G protein. The invention enables the purification of chitinase A, which belongs to the group of enzymes used in industry incl. for plant protection, and potentially also as a fungicidal therapeutic and enzyme tool in many other fields (e.g. for the production of pharmaceuticals and fuels). The invention allows for the purification of the enzyme which has been obtained with any expression system. In particular, chitinase derived from a baculovirus protein expression system that is commonly used for the production of a variety of recombinant proteins can be purified. Since chitinase-containing by-products (insect cell lysates, fractions after preliminary protein purification, etc.) are generated in each recombinant protein production process for which the baculovirus expression system is used, it is possible to use them for the purification of chitinase A with the present invention.

Z drugiej strony zastosowanie wynalazku powinno być pomocne w procedurze oczyszczania innych białek, zwłaszcza ekspresjonowanych w systemie bakulowirusowym, w celu usunięcia chitynazy A z otrzymywanych preparatów białkowych.On the other hand, the use of the invention should be helpful in the purification procedure of other proteins, especially those expressed in the baculovirus system, in order to remove chitinase A from the resulting protein preparations.

W świetle powyższych przykładów wykonania możliwe jest wykorzystanie fragmentu sekwencji białkowej chitynazy A jako nowego typu metki fuzyjnej, którą można zastosować jako narzędzie do oczyszczania białek rekombinowanych przy pomocy białka G.In view of the above embodiments, it is possible to use a fragment of the chitinase A protein sequence as a new type of fusion tag that can be used as a tool for purifying recombinant proteins with G protein.

PL 235 436 B1PL 235 436 B1

Sposób zastosowania chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem białka G do oczyszczania chitynazy A według wynalazku jest szybki, wydajny i jednoetapowy. Ponadto wykorzystanie bezpośredniego oddziaływania chitynazy z białkiem G eliminuje konieczność wprowadzania metek w obrębie chitynazy, które mogą zaburzać funkcje białka, a ich odcięcie wiąże się z dodatkowym etapem trawienia i oczyszczania.The method of using affinity chromatography using protein G to purify chitinase A according to the invention is fast, efficient and one step. In addition, the use of direct interaction of chitinase with G protein eliminates the need to introduce tags within the chitinase, which may interfere with the protein's functions, and their cutting off involves an additional step of digestion and purification.

Literatura:Literature:

[1] P. Jolles and R. A. A. Muzzarelli, Chitin and Chitinases. Springer, 1999.[1] P. Jolles and R. A. A. Muzzarelli, Chitin and Chitinases. Springer, 1999.

[2] N. Dahiya, R. Tewari, and G. S. Hoondal, Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes:[2] N. Dahiya, R. Tewari, and G. S. Hoondal, Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes:

a review, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 71, no. 6, pp. 773-782, Aug. 2006.a review, Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 71, no. 6, pp. 773-782, Aug. 2006.

[3] H. Merzendorfer and L. Zimoch, Chitin metabolism in insects: structure, function andregulation of chitin synthases and chitinases, J. Exp. Biol, vol. 206, no. Pt 24, pp. 4393-4412, Dec. 2003.[3] H. Merzendorfer and L. Zimoch, Chitin metabolism in insects: structure, function andregulation of chitin synthases and chitinases, J. Exp. Biol, vol. 206, no. Fri 24, pp. 4393-4412, Dec. 2003.

[4] R. E. Hawtin, T. Zarkowska, K. Arnold, C. J. Thomas, G. W. Gooday, L. A Ring, J. A Kuzio, and[4] R. E. Hawtin, T. Zarkowska, K. Arnold, C. J. Thomas, G. W. Gooday, L. A Ring, J. A Kuzio, and

R. D. Possee, Liquefaction of Autographa californica nucleopolyhedrovirus-infected insects is dependent on the integrity of virus-encoded chitinase and cathepsin genes, Virology, vol. 238, no. 2, pp. 243-253, Nov. 1997.R. D. Possee, Liquefaction of Autographa californica nucleopolyhedrovirus-infected insects is dependent on the integrity of virus-encoded chitinase and cathepsin genes, Virology, vol. 238, no. 2, pp. 243-253, Nov. 1997.

[5] K. Vega and M. Kalkum, Chitin, Chitinase Responses, and Invasive Fungal Infections, Int. J. Mi- crobiol., vol. 2012, pp. 1-10, 2012.[5] K. Vega and M. Kalkum, Chitin, Chitinase Responses, and Invasive Fungal Infections, Int. J. Microbiol., Vol. 2012, pp. 1-10, 2012.

[6] J. E. Barboza-Corona, O. B. Gutierrez-Acosta, M. Imperial-Cervantes, D. K. Bideshi, N. de la[6] J. E. Barboza-Corona, O. B. Gutierrez-Acosta, M. Imperial-Cervantes, D. K. Bideshi, N. de la

Fuente-Salcido, M. Bautista-Justo, and R. Salcedo-Hernandez, Generation of antibacterial oligosaccharides derived from chitin using heterologous endochitinase synthesized in Escherichia coli, J. Appl. Microbiol., vol. 105, no. 5, pp. 1511-1520, Nov. 2008.Fuente-Salcido, M. Bautista-Justo, and R. Salcedo-Hernandez, Generation of antibacterial oligosaccharides derived from chitin using heterologous endochitinase synthesized in Escherichia coli, J. Appl. Microbiol., Vol. 105, no. 5, pp. 1511-1520, Nov. 2008.

[7] B. B. Aam, E. B. Heggset, A. L. Norberg, M. S0rlie, K. M. Varum, and V. G. H. Eijsink, Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine, Mar. Drugs, vol. 8, no. 5, pp. 1482-1517, 2010.[7] B. B. Aam, E. B. Heggset, A. L. Norberg, M. S0rlie, K. M. Varum, and V. G. H. Eijsink, Production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine, Mar. Drugs, vol. 8, no. 5, pp. 1482-1517, 2010.

[8] R. Rao, L. Fiandra, B. Giordana, M. de Eguileor, T. Congiu, N. Burlini, S. Arciello, G. Corrado, and F. Pennacchio, AcMNPV ChiA protein disrupts the peritrophic membrane and alters midgut physiology of Bombyx mori larvae, Insect Biochem. Mol. Biol., vol. 34, no. 11, pp. 1205-1213, Nov. 2004.[8] R. Rao, L. Fiandra, B. Giordana, M. de Eguileor, T. Congiu, N. Burlini, S. Arciello, G. Corrado, and F. Pennacchio, AcMNPV ChiA protein disrupts the peritrophic membrane and alters midgut physiology of Bombyx mori larvae, Insect Biochem. Moth. Biol., Vol. 34, no. 11, pp. 1205-1213, Nov. 2004.

[9] A. Di Maro, I. Terracciano, L. Sticco, L. Fiandra, M. Ruocco, G. Corrado, A Parente, and R. Rao,[9] A. Di Maro, I. Terracciano, L. Sticco, L. Fiandra, M. Ruocco, G. Corrado, A Parente, and R. Rao,

Purification and characterization of a viral chitinase active against plant pathogens and herbivores from transgenic tobacco, J. Biotechnol., vol. 147, no. 1, pp. 1-6, May 2010.Purification and characterization of a viral chitinase active against plant pathogens and herbivores from transgenic tobacco, J. Biotechnol., Vol. 147, no. 1, pp. 1-6, May 2010.

[10] A. Grigorian, L. Araujo, N. N. Naidu, D. J. Place, B. Choudhury, and M. Demetriou, N-acetylglucosamine inhibits T-helper 1 (Th1)/T-helper 17 (Th17) cell responses and treats experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Biol. Chem., vol. 286, no. 46, pp. 40133-40141, Nov. 2011.[10] A. Grigorian, L. Araujo, NN Naidu, DJ Place, B. Choudhury, and M. Demetriou, N-acetylglucosamine inhibits T-helper 1 (Th1) / T-helper 17 (Th17) cell responses and treats experimental autoimmune encephalomyelitis, J. Biol. Chem., Vol. 286, no. 46, pp. 40133-40141, Nov. 2011.

[11] R. E. Hawtin, K. Arnold, M. D. Ayres, P. M. de A. Zanotto, S. C. Howard, G. W. Gooday, L. H. Chappell, P.l A. Kitts, L. A King, R. D. Possee, Identification and Preliminary Characterization of a Chitinase Gene in the Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Genome, Virology, vol. 212, no. 2, pp. 673-685, Oct. 1995.[11] RE Hawtin, K. Arnold, MD Ayres, PM de A. Zanotto, SC Howard, GW Gooday, LH Chappell, Pl A. Kitts, L. A King, RD Possee, Identification and Preliminary Characterization of a Chitinase Gene in the Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus Genome, Virology, vol. 212, no. 2, pp. 673-685, Oct. 1995.

[12] Patent US6352850B1 - Chitinase and method for preparing the same[12] Patent US6352850B1 - Chitinase and method for preparing the same

[13] Zgłoszenie patentowe nr P337060 - Materiały i metody związane z chitynazą (odpowiednik zgłoszenia PCTnr WO9747752A1).[13] Patent application No. P337060 - Materials and methods related to chitinase (equivalent to PCT application WO9747752A1).

[14] Bjorck L., Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 1984 Aug; 133(2):969-74.[14] Bjorck L., Kronvall G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent. J Immunol. 1984 Aug; 133 (2): 969-74.

[15] Lund LN1, Christensen T., Toone E., Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 2011 Nov-Dec;24(6):945-52. doi: 10.1002/jmr.1140.[15] Lund LN1, Christensen T., Toone E., Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 2011 Nov-Dec; 24 (6): 945-52. doi: 10.1002 / IU 1140.

[16] Moks T, Abrahmsen L, Nilsson B, Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur J Biochem. 1986 May 2; 156(3):637-43.[16] Moks T, Abrahmsen L, Nilsson B, Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains. Eur J Biochem. 1986 May 2; 156 (3): 637-43.

[17] Sangar V., Blankenberg D.J., Altman N., Lesk A.M., Quantitative sequence-function relationships in proteins based on gene ontology, BMC Bioinformatics 2007, 8:294, doi: 10.1186/1471-2105-8-294.[17] Sangar V., Blankenberg D.J., Altman N., Lesk A.M., Quantitative sequence-function relationships in proteins based on gene ontology, BMC Bioinformatics 2007, 8: 294, doi: 10.1186 / 1471-2105-8-294.

PL 235 436 Β1PL 235 436 Β1

Wykaz sekwencjiSequence Listing

Sekw. nr 1Seq. No. 1

MLYKLLNVLWLVAVSNAIPGTPVIDWADRNYALVEINYEATAYENLIKPKEQVDVQVSWNVWNGDIGD IAYVLFDEQQVWKGDAESKRATIKVLVSGQFNyRVKLCNEDGCSVSDPVLVKVADTDGGHLAPLEYTW LENNKPGRREDKIVAAYFVEWGVYGRNFPVDKVPLPNLSHLLYGFIPICGGDGINDALKTISGSFESL QRSCKGREDFKVAIHDPWAAVQKPQKSVSAWNEPYKGNFGQLMAAKLANPHLKILPSIGGWTLSDPFY FMHDVEKRNVFVDSVKEFLQVWKFFDGVDVDWEFPGGKGANPSLGDAERDAKTYILLLEELRAMLDDL EAQTGRVYELTSAISAGYDKIAWNYAEAQKSLGKIFLMSYDFKGAWSNTDLGYQTTVYAPSWNSEEL YTTHYAVDALLKQGVDPNKIIVGVAMYGRGWTGVTNYTNDNYFSGTGNGPVSGTWEDGWDYRQIQKD LNNYVYTFDSAAQASYVFDKSKGDLISFDSVDSVLGKVKYVDRNKLGGLFAWEIDADNGDLLNAINAQ FKPKDELMLYKLLNVLWLVAVSNAIPGTPVIDWADRNYALVEINYEATAYENLIKPKEQVDVQVSWNVWNGDIGD IAYVLFDEQQVWKGDAESKRATIKVLVSGQFNyRVKLCNEDGCSVSDPVLVKVADTDGGHLAPLEYTW LENNKPGRREDKIVAAYFVEWGVYGRNFPVDKVPLPNLSHLLYGFIPICGGDGINDALKTISGSFESL QRSCKGREDFKVAIHDPWAAVQKPQKSVSAWNEPYKGNFGQLMAAKLANPHLKILPSIGGWTLSDPFY FMHDVEKRNVFVDSVKEFLQVWKFFDGVDVDWEFPGGKGANPSLGDAERDAKTYILLLEELRAMLDDL EAQTGRVYELTSAISAGYDKIAWNYAEAQKSLGKIFLMSYDFKGAWSNTDLGYQTTVYAPSWNSEEL YTTHYAVDALLKQGVDPNKIIVGVAMYGRGWTGVTNYTNDNYFSGTGNGPVSGTWEDGWDYRQIQKD LNNYVYTFDSAAQASYVFDKSKGDLISFDSVDSVLGKVKYVDRNKLGGLFAWEIDADNGDLLNAINAQ FKPKDEL

Chitinase [Autographa californica nucleopolyhedrovirus (,AcMNPV)], GenBank: CAD79454.1,Chitinase [Autographa californica nucleopolyhedrovirus (, AcMNPV)], GenBank: CAD79454.1,

Sekw. nr 2Seq. no 2

AIPGTPVIDWADRNYALVEINYEATAYENLIKPKEQVDVQVSWNVWNGDIGDIAYVLFDEQQVWKGDA E SKRATIKVLVSGQ FNMRYKLCNE DGCSVSDPVLVKVAIPGTPVIDWADRNYALVEINYEATAYENLIKPKEQVDVQVSWNVWNGDIGDIAYVLFDEQQVWKGDA E SKRATIKVLVSGQ FNMRYKLCNE DGCSVSDPVLVKV

Immunoglobu.1 iη-1ike fold (17-1211 from Chitinase [Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)], GenBank: CAD79454.1,Immunoglobu.1 iη-1ike fold (17-1211 from Chitinase [Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)], GenBank: CAD79454.1,

Sekw. nr 3Seq. no 3

MEKEKKVKYFLRKSAFGLASVSAAFLVGSTVFAVDSPIEDTPIIRNGGELTNLLGNSETT LALRNEESATADLTAAAVADTVAAAAAENAGAAAWEAAAAADALAKAKADALKEFNKYGV SDYYKNLINNAKTVEGVKDLQAQVVESAKKARISEATDGLSDFLKSQTPAEDTVKSIELA EAKVLANRELDKYGVSDYHKNLINNAKTVEGVKDLQAQVVESAKKARISEATDGLSDFLK SQTPAEDTVKSIELAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALPK TDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPEMEKEKKVKYFLRKSAFGLASVSAAFLVGSTVFAVDSPIEDTPIIRNGGELTNLLGNSETT LALRNEESATADLTAAAVADTVAAAAAENAGAAAWEAAAAADALAKAKADALKEFNKYGV SDYYKNLINNAKTVEGVKDLQAQVVESAKKARISEATDGLSDFLKSQTPAEDTVKSIELA EAKVLANRELDKYGVSDYHKNLINNAKTVEGVKDLQAQVVESAKKARISEATDGLSDFLK SQTPAEDTVKSIELAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALPK TDTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEKPE

VIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDAT KTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGV DGVWTYDDATKTFTVTEMVTEVPGDAPTEPEKPEASIPLVPLTPATPIAKDDAKKDDTKK EDAKKPEAKKEDAKKAETLPTTGEGSNPFFTAAALAVMAGAGALAVASKRKEDVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDAT KTFTVTEKPEVIDASELTPAVTTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGV DGVWTYDDATKTFTVTEMVTEVPGDAPTEPEKPEASIPLVPLTPATPIAKDDAKKDDTKK EDAKKPEAKKEDAKKAETLPTTGEGSNPFFTAAALAVMAGAGALAVASKRKED

Immunoglobulin G-binding protein G [Streptococcus sp. GX7805], GenBank: CAA684S9.1Immunoglobulin G-binding protein G [Streptococcus sp. GX7805], GenBank: CAA684S9.1

Claims (16)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Kompleks białkowy zawierający białko G i związaną z nim niekowalencyjnie chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy A posiadający powinowactwo do białka G.1. Protein complex containing the G protein and its non-covalently related chitinase A or a protein containing a chitinase A fragment with affinity for the G protein. 2. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że ulega on dysocjacji w roztworze wodnym o odczynie kwaśnym (pH<5), korzystnie o pH 2.2. The complex according to claim 1 The method of claim 1, characterized in that it dissociates in an acidic aqueous solution (pH <5), preferably at a pH of 2. 3. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że chitynaza pochodzi z wirusa należącego do rodziny bakulowirusów (Baculoviridae).3. The complex according to p. The method of claim 1, wherein the chitinase is derived from a virus belonging to the baculovirus family (Baculoviridae). 4. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że chitynaza posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. nr 1 lub sekwencję identyczną w co najmniej 50%.4. The complex according to p. The method of claim 1, wherein the chitinase has the amino acid sequence shown as SEQ. # 1 or a sequence that is at least 50% identical. PL 235 436 B1PL 235 436 B1 5. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że chitynaza zawiera fragment immunoglobulinopodobny (ang. immunoglobulin-like fold).5. The complex according to p. The method of claim 1, wherein the chitinase comprises an immunoglobulin-like fold. 6. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że chitynaza zawiera domenę o sekwencji aminokwasowej przedstawionej jako Sekw. nr 2 lub sekwencji identycznej w co najmniej 50%.6. The complex according to p. The method of claim 1, wherein the chitinase comprises a domain with the amino acid sequence shown as SEQ. # 2 or at least 50% identical sequence. 7. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że białko G posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako Sekw. nr 3.7. The complex according to claim 1 The method of claim 1, wherein the G protein has the amino acid sequence shown as SEQ. no 3. 8. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że białko G jest dodatkowo immobilizowane na nośniku.8. The complex according to claim 1 The method of claim 1, wherein the G protein is additionally immobilized on a support. 9. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że chitynaza A lub jej fragment posiadający powinowactwo do białka G stanowi część białka fuzyjnego.9. The complex according to claim 1 The method of claim 1, wherein chitinase A or a fragment thereof having affinity for G protein is part of the fusion protein. 10. Sposób wyodrębniania z roztworu wodnego chitynazy A lub białka zawierającego jej fragment posiadający powinowactwo do białka G, znamienny tym, że:10. A method of isolating chitinase A or a protein containing its fragment having affinity for G protein from an aqueous solution, characterized in that: a) kontaktuje się białko G z roztworem wodnym zawierającym chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G w celu uzyskania kompleksu białkowego zawierającego białko G i związaną z nim niekowalencyjnie chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G,a) contacting the G protein with an aqueous solution containing chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having affinity for G protein in order to obtain a protein complex containing the G protein and non-covalently related chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having affinity for G protein, b) oddziela się od roztworu uzyskany kompleks białkowy,b) the obtained protein complex is separated from the solution, c) z uzyskanego kompleksu białkowego oddysocjowuje się chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G,c) chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having an affinity for G protein is dissociated from the obtained protein complex, d) z roztworu po dysocjacji wyodrębnia się chitynazę A lub białko zawierające fragment chitynazy posiadający powinowactwo do białka G.d) chitinase A or a protein containing a chitinase fragment having an affinity for G protein is isolated from the dissociated solution. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w etapie a) uzyskuje się kompleks białkowy określony w zastrz. 1-6.11. The method according to p. A protein complex according to claim 10, characterized in that in step a) the protein complex according to claim 10 is obtained. 1-6. 12. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w etapie b) wyodrębnianie prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa, przy czym jako złoże stosuje się nośnik chromatograficzny zawierający immobilizowane białko G.12. The method according to p. 10. A method according to claim 10, characterized in that in step b) the isolation is carried out by affinity chromatography, wherein the medium is a chromatographic carrier containing immobilized G protein. 13. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dysocjację w etapie c) prowadzi się w roztworze wodnym o odczynie kwaśnym (pH < 5), korzystnie o pH 2.13. The method according to p. A process as claimed in claim 10, characterized in that the dissociation in step c) is carried out in an acidic aqueous solution (pH <5), preferably at a pH of 2. 14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w etapie d) wyodrębnia się białko fuzyjne zawierające chitynazę A lub jej fragment posiadający powinowactwo do białka G.14. The method according to p. A method according to claim 10, characterized in that in step d) a fusion protein containing chitinase A or a fragment thereof having an affinity for G protein is isolated. 15. Zastosowanie sposobu jak określono w zastrz. 10 do otrzymywania aktywnych biologicznie preparatów chitynazy A.15. The use of a method as defined in claim 1 10 for the preparation of biologically active preparations of chitinase A. 16. Zastosowanie sposobu jak określono w zastrz. 10 do usuwania chitynazy A z preparatów białkowych.16. The use of a method as defined in claim 1 10 to remove chitinase A from protein preparations.