PL234421B1 - Sposób wytwarzania na metalach biozgodnych powłok polimerowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania biozgodnych powłok polimerowych na metalach, zwłaszcza takich jak tytan i jego stopy albo stal i jej stopy. Obiekty metalowe z naniesionymi powłokami są przeznaczone do stosowania w dziedzinie medycyny jako implanty.

Metale jako materiały implantacyjne do kardiochirurgii są używane od lat 60. XX wieku. Spośród wszystkich materiałów metalowych, stal nierdzewna jest najpopularniejszym surowcem do produkcji np. stentów - niewielkich urządzeń wszczepianych do naczyń krwionośnych obrośniętych płytką miażdżycową celem przywrócenia ich drożności, lub elementów sztucznego serca, takich jak sztuczne zastawki. Zastosowanie znajdują także stopy chromowo-kobaltowe lub tytanowe [1]. Przykładem zastosowania metali w kardiochirurgii są np. tzw. stenty BMS (ang. bare metal stenf), czyli stenty wykonane ze stali nierdzewnej, bez żadnej dodatkowej powłoki. Stent BMS wyróżnia się doskonałymi właściwościami mechanicznymi, jednak nie nadaje się do długotrwałej implantacji, ponieważ obecność stali w kontakcie z krwią i tkankami pacjenta wywołuje reakcję obronną organizmu - tworzą się skrzepy krwi oraz zostaje zapoczątkowana odpowiedź immunologiczna. Z uwagi na to, takie stenty nie nadają się do naczyń krwionośnych o małych średnicach (wieńcowych) [2]. Istnieje także podejrzenie, że niczym nieosłonięta stal nierdzewna wydziela do tkanek jony niklu i chromu, szkodliwe w dłuższej perspektywie [3]. Istnieje zatem konieczność zmodyfikowania powierzchni metalowego elementu implantacyjnego przy pomocy biozgodnej powłoki, która powstrzyma migrację jonów do tkanek oraz nie będzie wywoływała niepożądanych efektów ze strony krwi. Badania nad wytwarzaniem biozgodnych powłok na metalach do medycyny implantacyjnej są prowadzone od kilku dekad, jednak w dalszym ciągu nie udało się przezwyciężyć wszystkich problemów związanych z integracją elementów metalowych z tkankami.

Powłoki wprowadzane na powierzchnię metali celem poprawienia ich biozgodności można ogólnie podzielić na nieorganiczne, polimerowe oraz złożone z biomolekuł. Osobną kategorię stanowią stenty wydzielające leki (DES, ang. drug eluting stenf).

Znane są metody wytwarzania na metalach powłok nieorganicznych, np. węglowych (DLC, ang. diamond-like carbon) [4] lub z węgliku krzemu (SiC) [2]. Powłoki te wykazują się wysoką twardością, gładkością, niskim współczynnikiem tarcia, są inertne chemicznie oraz obniżają ryzyko wystąpienia skrzepów. Z tego powodu zastosowano je jako pokrycia do wszczepialnych urządzeń wspomagających pracę serca (tzw. VAD, ang. ventricularassist device). [2]. Dużą wadą tego typu rozwiązań jest wysoki koszt wytworzenia pokryć nieorganicznych, ze względu na konieczność użycia metod takich jak napylanie magnetronowe [4], inne metody z wykorzystaniem plazmy [5] lub metoda chemicznego osadzania warstw (tzw. metoda CVD, ang. chemicval vapour deposition) [6]. Poza tym, w toku badań klinicznych okazało się, że pokrycia z DLC oraz z SiC nie nadają się do stentów o małej średnicy (wieńcowych) z uwagi na pękanie takich powłok oraz brak działania obniżającego wykrzepianie krwi w porównaniu z wieńcowym stentem BMS [7].

Podjęto także próby osadzania na metalowych stentach powłoki ze złota, jednak podczas badań klinicznych wykazano, że takie stenty powodują poważne ryzyko restenozy, tj. intensywnego obrastania stentu tkanką, co prowadzi do ponownego zamknięcia światła naczynia krwionośnego, a zatem do stanu sprzed zabiegu [8].

Biozgodne pokrycia polimerowe na metalach zyskały duże zainteresowanie na początku XXI w. Wykazano, że istnieje grupa polimerów syntetycznych mających zdolność minimalizowania ryzyka skrzepów krwi na powierzchni implantu.

Ogromna większość metod wytwarzania powłok polimerowych na metalowych implantach do kardiochirurgii obejmuje metody fizycznej adsorpcji polimeru na powierzchni metalu, głównie bardzo prostą metodą zanurzeniową (ang. dip-coating), polegającą na zanurzeniu elementu pokrywanego w roztworze polimeru, a następnie wyjęciu i wysuszeniu. Tą metodą osadzano na metalach polimery takie jak polilaktyd (PLA) i jego kopolimery, np. z poliglikolem etylenowym (PLA-PEG) [9]. Poliglikol etylenowy (PEG, oznaczany również jako PEO) wykazuje bardzo obiecujące działanie przeciwzakrzepowe dzięki temu, że hydrofilizuje powierzchnię metalu. To znaczy, że powierzchnia staje się dobrze zwilżana przez wodę, a więc także krew, co zapobiega fizycznej adsorpcji hydrofobowych białek z krwi, co mogłoby spowodować wykrzepianie [10]. Dobre właściwości polimeru PEG i jego pochodnych sprawiają, że podjęto liczne próby osadzenia ich na powierzchni implantów metalowych przeznaczonych do kontaktu z krwią [6] [10] [11]. Jednak ze względu na niedoskonałe dotychczas metody osadzania PEG na metalach, brak jest wiarygodnych danych na temat funkcjonowania powłoki PEG w warunkach fizjologicznych.

PL 234 421 B1

Opisano także próby osadzania pochodnych PEG - np. PEGMA (metakrylan poliglikolu etylenowego). Z opisu międzynarodowego zgłoszenia patentowego W O0002599 znany jest sposób osadzania na powierzchni metalicznego stentu powłoki PEG, polegający na tym, że stent pokrywa się roztworem dimetakrylanu glikolu etylenowego, a następnie przeprowadza się polimeryzację, ewentualnie z dodatkiem środka sieciującego. Środkiem sieciującym może być np. dimetakrylan glikolu etylenowego. Polimeryzacja zachodzi pod wpływem temperatury albo promieniowania UV. Przed osadzaniem powłoki powierzchnię metaliczną można potraktować silanem. Osadzanie PEGMA przeprowadzono także innymi metodami, np. z wykorzystaniem techniki plazmowej [12]. Opisano także osadzanie diakrylanu poli(glikolu etylenowego) metodą elektropolimeryzacji z wykorzystaniem rozpadu inicjatora nadsiarczanowego [11]. W tym przypadku katolitem był nadsiarczan amonu, a jako anolit zastosowano 0,025 M kwas siarkowy. Warstwa PEGDA była osadzana na powierzchni tytanu albo Ti6Al4V, a jako przeciwelektrodę stosowano porowaty węgiel szklisty. Uzyskano powłoki bardzo cienkie - ok. 30 nm grubości po spęcznieniu, mimo że powłoki nanoszone były w minimum pięciu cyklach. Autorzy sugerują zastosowanie takiej powłoki jako warstwy wydzielającej leki.

Zdecydowaną większość komercyjnych stentów naczyniowych stanowią stenty posiadające powłokę polimerową, z której stopniowo wydzielają się leki. Przykładem stentu DES jest stent BioFreedom (Biosensors Inc.) wydzielający lek antyproliferacyjny Biolimus A9. Lek ten zapobiega restenozie, czyli nadmiernemu przerostowi tkanki naczynia krwionośnego, prowadzącego do zasklepienia się światła naczynia [1]. Inne wydzielane leki to np. Tacrolimus, Sirolimus, Palitaxel. Zazwyczaj powłoka polimerowa wydzielająca leki nanoszona jest na metalowy stent drogą zanurzeniową, jak np. w przypadku stalowego stentu Cypher (J&J, Cordis), który jest pokryty mieszaniną polimerów PEVA i PBMA z lekiem Sirolimus lub w przypadku stentu Taxus (Boston Scientific) z powłoką z polimeru SIBS wydzielającego lek Paclitaxel przez 90 dni [16] [17]. Stenty DES są obecnie standardem wśród stentów naczyniowych, mimo że nie są wolne od wad. Przede wszystkim, lek zapewniający bezpieczne funkcjonowanie stentu wydziela się jedynie przez kilkanaście tygodni. Po upływie tego czasu prędzej czy później u pacjenta wystąpią efekty uboczne, takie jak odpowiedź immunologiczna, wykrzepianie krwi czy restenoza. Według najnowszych danych ryzyko to dotyczy nawet 40% pacjentów w ciągu pierwszego roku od zabiegu implantacji stentu [18].

Warto zauważyć, że najpopularniejsza obecnie w przemyśle metoda nanoszenia powłok na stenty - metoda zanurzeniowa (dip coating) - sprawia istotne problemy technologiczne. FDA raportuje, że należy tę metodę zastąpić metodą nanoszenia powłok przy pomocy sprayu, jednak także i ta metoda ma swoje ograniczenia. Przede wszystkim, trudno jest w ten sposób pokrywać wiele stentów jednocześnie. Poza tym, ta metoda z pewną częstością generuje wady w otrzymywanym pokryciu, takie jak np. zgrubienia czy miejsca puste [19].

Podsumowując, nie istnieje obecnie metoda otrzymywania biozgodnych pokryć na metalach, która nie budziłaby zastrzeżeń. Złotym standardem są warstwy wydzielające leki, jednak po wydzieleniu się całej zamkniętej w powłoce polimerowej porcji leku pacjenci zaczynają odczuwać niebezpieczne dla życia efekty uboczne. Wprowadzanie do powłoki biomolekuł nie dało oczekiwanego rezultatu. Biorąc pod uwagę obecny stan wiedzy, cenne byłoby znalezienie metody otrzymywania na metalach jednorodnej, stabilnej, biozgodnej powłoki, która spełniałaby swoje zadanie bez konieczności stosowania leków antyproliferacyjnych lub przeciwzakrzepowych oraz bez potrzeby immobilizowania biomolekuł, których działanie nie jest udowodnione in vivo. Obiecująca jest metoda elektropolimeryzacji, niemniej powłoki trzymane tą metodą są bardzo cienkie, nawet po kilkukrotnym nanoszeniu kolejnych warstw.

Obecny wynalazek miał na celu taką modyfikację metody elektropolimeryzacji, aby możliwe było nanoszenie na metal biozgodnej powłoki polimerowej o zadowalającej grubości.

Sposób wytwarzania na metalach biozgodnych powłok polimerowych z dimetakrylanu poli(glikolu etylenowego) metodą elektropolimeryzacji według wynalazku charakteryzuje się tym, że przygotowuje się roztwór wodny o przewodności nie mniejszej niż 10 mS/cm, zawierający od 2,5% do 22% v/v kwasu siarkowego lub azotowego (V), od 0 do granicznego stężenia określonego rozpuszczalnością w wodzie w danej temperaturze rozpuszczalnego w wodzie inicjatora redox oraz od 0,01 M do granicznego stężenia określonego rozpuszczalnością w wodzie w danej temperaturze soli nieorganicznej o reszcie kwasowej analogicznej, jak użyty kwas nieorganiczny. Do tego roztworu wprowadza się obiekt metaliczny i dodaje się: nie mniej niż 0,001% v/v monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu, nie mniej niż 0,001% dimetakrylanu glikolu etylenowego (EGDMA) oraz nie mniej niż 0,1% v/v dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDMA) o masie cząsteczkowej większej od 330 g/mol, po czym prowadzi się elektropolimeryzację, w której jako przeciwelektrodę dla powlekanej powierzchni metalicznej stosuje się włókno

PL 234 421 B1 węglowe. Elektropolimeryzację prowadzi się w czasie od 1 do 180 min, utrzymując natężenie prądu płynącego między elektrodami w zakresie od 4 mA do 500 mA. Następnie powierzchnię z osadzoną powłoką płucze się i suszy. Osadzoną powłokę wygrzewa się w temperaturze od 100 do 350°C, korzystnie 150°C, w czasie od 5 do 60 minut.

Korzystnie przewodność roztworu wynosi od 10 do 40 mS/cm, najkorzystniej 40 mS/cm.

Korzystnie stosuje się dodatek kwasu siarkowego, korzystnie w ilości 2,5-5% v/v.

Korzystnie inicjator redox stosuje się w stężeniu od 0 do 0,1 M, najkorzystniej 0,1M.

Korzystnie jako inicjator redox stosuje się nadtlenki, nadsiarczany, nadchlorany.

Najkorzystniej stosuje się nadsiarczan amonu.

Korzystnie jako sól o reszcie kwasowej analogicznej, jak użyty kwas nieorganiczny stosuje się siarczan lub azotan sodu lub potasu. Korzystnie sól stosuje się w stężeniu od 0,01 do 0,13M, najkorzystniej w stężeniu 0,13M.

Korzystnie monolaurynianem polioksyetylenosorbitolu jest Tween 20, korzystnie w ilości od 0,1% do 1% (v/v) najkorzystniej 0,1% v/v.

Korzystnie dimetakrylan glikolu etylenowego stosuje się w ilości od 0,01 do 0,1% (v/v), najkorzystniej 0,05% v/v.

Korzystnie dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) stosuje się w ilości od 0,1% do 10%, najkorzystniej 5% v/v. Korzystnie stosuje się PEGDMA o masie cząsteczkowej 750 g/mol.

Korzystnie stosuje się włókno węglowe posiadające co najmniej 40 filamentów w paśmie, najkorzystniej włókno węglowe o 12 000 filamentach w paśmie.

Korzystnie elektropolimeryzację prowadzi się w czasie 10-40 min, utrzymując gęstość prądową w wysokości od 3 do 15 mA/cm² pokrywanego elementu metalowego.

Powierzchnią metalową, na której osadza się powłokę sposobem według wynalazku jest powierzchnia tytanu lub jego stopów albo stali lub jej stopów. Korzystnie przed elektropolimeryzacją powierzchnię metalową płucze się i suszy. Przed elektropolimeryzacją powierzchni stalowej korzystnie nadaje się chropowatość metodą mechaniczną, w obecności kwaśnego roztworu wodnego z detergentem albo metodą zanurzeniową w roztworze nadtlenku wodoru.

W optymalnej wersji przygotowanie powierzchni do osadzenia powłoki sposobem według wynalazku polega na usunięciu głębszych zarysowań oraz usunięciu zanieczyszczeń, przy jednoczesnym zachowaniu lub nadaniu chropowatości powierzchni umożliwiającej trwałe naniesienie powłoki polimerowej.

W przypadku przygotowywania płaskich powierzchni, np. płaskich krążków, można stosować metodę mechaniczną, np. metodę polerowania bębnowego. Zgodnie z tą metodą elementy metaliczne umieszcza się w obracającym się bębnie z dodatkiem kształtek ceramicznych. Do środka bębna wtryskuje się roztwór wodny o odczynie kwaśnym z detergentem, aby na bieżąco obmywać elementy z pyłu i zanieczyszczeń. Proces trwa od kilku do kilkudziesięciu godzin, korzystnie od 5 do 25 godzin. Następnie elementy metaliczne ponownie myje się detergentem oraz płucze, np. w mieszaninie aceton:woda, w stosunku objętościowym 3:1 w wannie sonikacyjnej oraz suszy się.

W przypadku, gdy elementy metaliczne mają skomplikowaną geometrię (np. stenty) zamiast metody mechanicznej oczyszczania powierzchni stosuje się metodę zanurzenia elementów w 30% roztworze nadtlenku wodoru (H2O2) w wodzie na okres od kilkunastu do kilkudziesięciu godzin, korzystnie od 5 do 50 godzin. Nadtlenek wodoru jako znany utleniacz usuwa zanieczyszczenia z powierzchni elementów, a także nadtrawia ich powierzchnie, zapewniając chropowatość. Następnie elementy metaliczne myje się detergentem oraz płucze, np. w mieszaninie aceton:woda, w stosunku objętościowym 3:1 w wannie sonikacyjnej oraz suszy się.

W przypadku elementów tytanowych, zazwyczaj ich powierzchnia jest wystarczająco chropowata. Takie elementy wystarczy poddać myciu w mieszaninie aceton:woda w stosunku objętościowym 3:1 w wannie sonikacyjnej oraz suszeniu w suszarce laboratoryjnej w temperaturze 40°C.

W reakcji elektropolimeryzacji cząsteczki PEGDMA ulegają sieciowaniu pod wpływem rodników powstających podczas rozpadu cząsteczek inicjatora (nadsiarczanu amonu) wywołanego przepływem prądu w roztworze. Obecny w roztworze czynnik sieciujący - EGDMA łączy duże cząsteczki PEGDMA. W ten sposób powstaje produkt - makromer cPEGDMA (usieciowany PEGDMA) osadzający się w formie powłoki na elemencie pokrywanym. Obecność zestawu dodatków, na który składają się kwas siarkowy lub azotowy, monolaurynianem polioksyetylenosorbitolu oraz siarczan lub azotan sodu lub potasu, pozwala na otrzymanie stabilnej powłoki o grubości umożliwiającej zastosowanie do bezpośredniego

PL 234 421 B1 kontaktu z krwią i tkankami. Zdefiniowana przewodność roztworu wpływa istotnie na efektywność procesu tworzenia powłoki polimerowej.

Element pokrywany jest podłączony do bieguna ujemnego, natomiast przeciwelektroda do bieguna dodatniego zasilacza. Jako przeciwelektrodę stosuje się włókno węglowe np. przeznaczone do użycia w modelarstwie np. do wykonywania łączeń lub wzmocnień (tzw. rowing węglowy). Materiał przeciwelektrody jest istotny, ponieważ włókno węglowe o zdefiniowanej liczbie pojedynczych nitek znacząco zwiększa powierzchnię kontaktu przeciwelektrody z roztworem, a tym samym podnosi efektywność procesu otrzymywania powłoki polimerowej i istotnie zwiększa grubość powłok. Ponadto znacząco spada koszt procesu. Jako przeciwelektrody można użyć rowingu węglowego TEX800 12K (w skład pojedynczego pasma wchodzi 12 000 filamentów, czyli pojedynczych niteczek węglowych. Oznaczenie TEX800 oznacza, że 1000 m rowingu waży 800 g).

Wygrzewanie elementów pokrytych polimerem w podwyższonej temperaturze przez określony czas ma na celu podniesienie trwałości powłoki. Zaproponowane zgodnie z wynalazkiem parametry wygrzewania dają stabilną i odporną powłokę, a jednocześnie nie powodują odsłonięcia powierzchni metalu.

Sposób według wynalazku pozwala na otrzymanie biozgodnych pokryć na metalach, w tym na stentach, ze stali lub tytanu, z samodzielną warstwą hemozgodną, która jest równomierna, jednorodna, wystarczająca gruba i odporna na pękanie. Te cechy pokrycia są osiągnięte poprzez zastosowanie unikalnego składu roztworu do elektropolimeryzacji, z dodatkiem detergentu i soli, oraz dzięki użyciu przeciwelektrody węglowej o dużej powierzchni kontaktu z roztworem, a także wygrzewaniu w temperaturze niższej od temperatury zeszklenia polimeru. Sposobem według wynalazku możliwe jest pokrycie elementów metalowych o dowolnym kształcie, także stentów wieńcowych o niewielkich rozmiarach: np. stentów o długości 25 mm i średnicy 3 mm. Powłoka otrzymana zgodnie z wynalazkiem może funkcjonować jako pokrycie biozgodne bez obecności leków oraz biomolekuł. PEGDMA hydrofilizuje powierzchnię, co zapobiega fizycznej adsorpcji hydrofobowych białek z krwi, dzięki czemu przeciwdziała wykrzepianiu krwi.

Metoda według wynalazku charakteryzuje się prostotą wykonania, jak również niskim kosztem aparatury.

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM): a. powierzchnia niepokrytego stentu ze stali 316L, b i c: powierzchnia stentu pokrytego biozgodną powłoką polimerową według wynalazku.

Fig. 2 - obrazy SEM powierzchni a) tytanu, b) tytanu pokrytego pokryciem polimerowym.

Fig. 3 - widma FTIR-ATR powierzchni krążka ze stali 316L pokrytego pokryciem biozgodnym według wynalazku: przed płukaniem oraz po 21 dniach ciągłego płukania w roztworze soli fizjologicznej.

Fig. 4 - obrazy SEM powierzchni a) stali 316L niepokrytej, b) stali 316L pokrytej pokryciem według wynalazku.

Fig. 5 - Średnie ilości zaadsorbowanego fibrynogenu na powierzchni stali 316L niezmodyfikowanej oraz pokrytej pokryciem biozgodnym według wynalazku podane jako gęstość optyczna rejestrowana przy długości fali 450 nm (OD 450).

Fig. 6 - średnia żywotność komórek L929 w pośrednim kontakcie z materiałami wyznaczona przy pomocy testu XTT wraz z odchyleniami standardowymi.

Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

P r z y k ł a d 1

Płaskie krążki ze stali 316L o wymiarach: średnica 14 mm, grubość 0,8 mm umieszczono w obracającym się bębnie z dodatkiem kształtek ceramicznych. Do środka bębna wtryskiwano roztwór wodny o odczynie kwaśnym z roztworem surfaktantu anionowego, aby na bieżąco obmywać krążki z pyłu i zanieczyszczeń. Proces trwał 18 godzin. Następnie krążki stalowe umyto detergentem oraz płukano w mieszaninie aceton:woda w stosunku objętościowym 3:1 w wannie sonikacyjnej, a następnie suszono w suszarce laboratoryjnej w temperaturze 40°C. Stenty ze stali 316L o wymiarach: długość 25 mm, średnica 3 mm zanurzono w 30% roztworze nadtlenku wodoru (H2O2) w wodzie na okres 48 h. Następnie stenty płukano w mieszaninie aceton:woda w stosunku objętościowym 3:1 w wannie sonikacyjnej oraz suszono w suszarce laboratoryjnej w temperaturze 40°C.

PL 234 421 B1

W naczyniu przygotowano roztwór wodny zawierający 0,025M H2SO4, 0,10M (NH4)2S2Ob oraz 0,13M Na2SO4. Przewodność roztworu wynosiła 40,5 mS/cm. Elementy pokrywane polimerem włączono do układu tak, aby zachować przewodzenie między elementem pokrywanym a źródłem zasilania. Naczynie z roztworem przygotowanym wraz z elementem mieszającym umieszczono na mieszadle magnetycznym. W roztworze zanurzono elementy pokrywane oraz przeciwelektrodę. Przeciwelektrodę stanowiło włókno węglowe TEX800 12K (w skład pojedynczego pasma wchodzi 12 000 filamentów, czyli pojedynczych niteczek węglowych, 1000 m rowingu waży 800 g).

Włączono mieszanie. Do roztworu dodano kolejne trzy składniki, tak by ich końcowe stężenie wynosiło odpowiednio: 0,001% (v/v) Tween 20®, 0,1% (v/v) EGDMA oraz 5% (v/v) PEGDMA o masie cząsteczkowej (Mn)=750 g/mol.

Włączono zasilacz. Ustalono natężenie prądu płynącego między elektrodami (elementem pokrywanym i przeciwelektrodą węglową) na 30 mA. Odległość między elektrodami wynosiła 3 cm. Proces elektropolimeryzacji prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Natężenie prądu utrzymywano na stałym poziomie 30 mA. Po 30 minutach wyłączono zasilacz i mieszadło, wyjęto element pokrywany z roztworu, wypłukano za pomocą wody destylowanej i wysuszono w suszarce laboratoryjnej w 40°C.

Elementy pokryte polimerem wygrzano w 150°C przez 10 minut.

Aby pozbyć się drobnych nierówności w powłoce, proces tworzenia powłoki powtórzono 3x. Otrzymano jednorodne powłoki o grubości około 4 pm.

Na Fig. 1 przedstawiono obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) powierzchni stentów ze stali 316L (powiększenie ok. 500x). Fig. 1a przedstawia niepokrytą powierzchnię stentów, natomiast Fig. 1b i 1c pokazują powierzchnie stentów z pokryciem polimerowym. Pokrycie polimerowe jest widoczne jako ciemna warstwa, natomiast niepokrytą stal jako jasna powierzchnia. Widać, że cała powierzchnia została równomiernie pokryta polimerem.

P r z y k ł a d 2

Płaskie krążki z biomedycznego tytanu anodowanego (3 szt.) o wymiarach: średnica 14 mm, grubość 1 mm poddano pokrywaniu polimerem.

Anodowanie jest procesem elektrochemicznego pokrywania tytanu warstwą jego tlenków w celu ujednolicenia powierzchni i nadania jej odpowiedniej chropowatości, wymaganej np. gdy element tytanowy ma zostać użyty w ortopedii do wspomagania zrastania się kości. Krążki tytanowe użyte w eksperymencie posiadały warstwę tlenków o grubości ok. 40-50 nm. Ze względu na silnie rozwiniętą powierzchnię tytanu i spowodowany tym intensywniejszy przebieg elektropolimeryzacji na jego powierzchni, zmieniono natężenie prądu podczas procesu elektropolimeryzacji z 30 mA na 10 mA oraz proces otrzymywania powłoki polimerowej przeprowadzono dwukrotnie. Wszystkie pozostałe parametry oraz stężenia pozostały jak w Przykładzie 1. Otrzymano jednorodne powłoki o grubości ok. 4 pm. Otrzymane powierzchnie analizowano przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego w 5 losowych punktach na powierzchni każdego krążka.

Fig. 2 przedstawia obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM, 500x) czystej powierzchni tytanu oraz powierzchni tytanu pokrytej polimerem. Powierzchnia czystego tytanu obfituje w liczne niedoskonałości. Widoczne jest to, że pokrycie polimerowe zniwelowało defekty powierzchni. Wszystkie uzyskane obrazy SEM wyglądały podobnie. Jednolite pokrycie było obecne w każdym analizowanym punkcie. Zdjęcia te potwierdzają, że opisywana metoda otrzymywania pokryć polimerowych może być również zastosowana do tytanu i także w tym przypadku pozwala na otrzymanie jednorodnych powłok.

P r z y k ł a d 3

a. Odporność pokrycia na długotrwałe płukanie roztworem soli fizjologicznej - sprawdzenie trwałości pokrycia.

Badano płaskie krążki ze stali 316L z powłoką osadzoną zgodnie z Przykładem 1. Jako metodę analizy jakości pokrycia zastosowano spektroskopię w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR), za pomocą aparatu dostosowanego do badania powierzchni dzięki obecności przystawki do analizy tzw. całkowitego wewnętrznego odbicia (ATR). Metoda FTIR-ATR pozwala na identyfikację grup funkcyjnych związków chemicznych, dlatego pozwala na bardzo dokładne potwierdzenie obecności pokrycia polimerowego na powierzchni krążka stalowego.

Pięć stalowych krążków umieszczono w naczyniu w roztworze soli fizjologicznej (PBS) o pH=7,4. Warunki te imitowały warunki fizjologiczne. Naczynie umieszczono na termostatowanej wytrząsarce la

PL 234 421 B1 boratoryjnej o obrotach 100 RPM, w temperaturze 37°C. Krążki wyjmowano z roztworu, suszono i poddawano analizie FTIR-ATR. Krążki analizowano po 1,3, 5, 7, 14 i 21 dniach. W każdym punkcie czasowym analizowano po 5 losowo wybranych punktów na powierzchni wszystkich 5 krążków. Zawsze otrzymywano widma zbliżone do siebie. Eksperyment zakończono po 21 dniach, ponieważ ten czas jest często podawany w literaturze jako czas potwierdzający trwałość pokryć medycznych.

Fig. 2 przedstawia widma FTIR-ATR powierzchni stalowego krążka pokrytego polimerem przed rozpoczęciem eksperymentu oraz po 21 dniach ciągłego płukania. Zaznaczono sygnały charakterystyczne dla polimeru budującego pokrycie - PEGDMA. Sygnały te są obecnie także w widmie uzyskanym dla powierzchni krążka płukanego przez 21 dni. Dobra jakość tych sygnałów, tj. ich wysoka intensywność oraz brak szumów świadczą o jednolitości pokrycia po płukaniu.

b. Hemozgodność powłoki polimerowej

Norma ISO 10933-4 dotycząca testowania materiałów medycznych mających kontaktować się z krwią krążącą w krwioobiegu ogólnie podaje, że materiały hemokompatybilne nie mogą mieć negatywnego wpływu na składniki krwi, to znaczy np. nie mogą wywoływać ich niewłaściwej aktywacji. Norma ta nie podaje ścisłego opisu metod, które powinny być zastosowane do sprawdzenia hemokompatybilności materiałów; zamiast tego zbiera szereg przykładowych testów [20].

Badano hemozgodność (zgodność z krwią) powłoki polimerowej wykonując dwa testy uwzględnione w ISO 10933-4 jako odpowiednie: test adhezji płytek oraz adsorpcję fibrynogenu (białka z krwi) na powierzchni materiałów. Zarówno wzmożona adhezja płytek krwi, jak i duża ilość zaadsorbowanego fibrynogenu są zjawiskami negatywnymi mogącymi prowadzić do wytworzenia skrzepu krwi. Oczekiwano, że obecność pokrycia polimerowego zminimalizuje oba te niechciane efekty. Ze względu na dbałość o jakość wyników eksperymentu, wykorzystano płaskie krążki ze stali 316L o wymiarach średnica 14 mm, grubość 0,8 mm.

Do eksperymentów użyto ludzkiej krwi od 26-letniej zdrowej kobiety. W celu uzyskania osocza, krew po pobraniu zwirowano (RCF = 192xg, 30 min). Zebrano supernatant, którym jest osocze bogatopłytkowe (PRP, ang. platelet rich plasma). W celu uzyskania osocza ubogopłytkowego (PPP, ang. platelet poor plasma) osocze PRP wirowano dalej (RCF = 2000xg, 15 min), a następnie zebrano górną połowę osocza, co stanowiło PPP.

Test adhezji płytek krwi: krążki stalowe niepokryte (5 szt.) oraz pokryte polimerem (5 szt.) zostały poddane wstępnemu myciu w roztworze soli fizjologicznej przez 1 h i w temperaturze 37°C, a następnie inkubacji z osoczem PPP w takich samych warunkach. W celu obserwacji płytek krwi obecnych na powierzchni materiałów ich powierzchnie utrwalono według następującej procedury: umieszczono je w 2% roztworze glutaraldehydu w PBS na 24 h w 4°C, a następnie poddano odwodnieniu w roztworach wodnych o wzrastającym stężeniu etanolu: 50, 60, 70, 80, 90, 100%. Na koniec materiały wysuszono, pokryto cienką warstwą złota (tzw. napylenie złotem) i obserwowano za pomocą mikroskopu SEM.

Fig. 3 przedstawia uzyskane obrazy: dla stali niepokrytej (a) oraz dla krążków pokrytych pokryciem biozgodnym według wynalazku (b). Można łatwo zaobserwować, iż na powierzchni stali widoczne są liczne płytki krwi, które dodatkowo są zaktywowane, o czym świadczą ich wypustki cytoplazmatyczne przytwierdzające je do powierzchni materiału. Stal pokryta polimerem nie przyciąga ani jednej płytki krwi w polu widzenia. Wszystkie zdjęcia SEM wyglądały podobnie. Można z całą pewnością stwierdzić, że pokrycie polimerowe przeciwdziała adhezji płytek krwi bez zastosowania dodatkowym składników, takich jak leki i biomolekuły.

c. Test adsorpcji fibrynogenu

Krążki stalowe niepokryte (3 szt.) oraz pokryte polimerem (3 szt.) zostały poddane wstępnemu myciu w roztworze soli fizjologicznej przez 1 h i w temperaturze 37°C, a następnie inkubacji z osoczem PRP w takich samych warunkach. Ilość zaadsorbowanego fibrynogenu wyznaczono przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Test ten wykorzystuje zdolność selektywnego łączenia się przeciwciała z jego antygenem, którym w tym wypadku są cząsteczki fibrynogenu. Pierwszym krokiem był tzw. blocking, czyli inkubacja materiałów w roztworze 5% mleka odtłuszczonego w PBS przez 1 h w temperaturze pokojowej, a następnie płukanie w PBS. W kolejnym etapie materiały poddano inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym kozim anty-fibrynogen (Sigma-Aldrich, F8512) przez 1 h w temperaturze pokojowej oraz płukaniu. Następnie przeprowadzono reakcję z przeciwciałem drugorzędowym anty-kozim (Sigma-Aldrich, A5420) - wiążącym się z przeciwciałem pierwszorzędowym oraz tworzącym w kolejnym kroku barwny produkt. Po płukaniu materiały poddano reakcji w celu wytworzenia barwnego produktu, powstającego w ilościowej proporcji 1:1 do

PL 234 421 B1 cząsteczek fibrynogenu obecnych na powierzchni materiałów. Uzyskane roztwory analizowano spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm i w ten sposób wyznaczono ilość zaadsorbowanego fibrynogenu.

Fig. 4 przedstawia średnie ilości zaadsorbowanego fibrynogenu na powierzchni stali 316L niezmodyfikowanej oraz pokrytej pokryciem biozgodnym według wynalazku wraz z odchyleniami standardowymi w formie wykresu kolumnowego. Pokrycie polimerowe zmniejszyło ilość fibrynogenu na powierzchni, co tym samym redukuje ryzyko powstawania skrzepu krwi w porównaniu do czystej stalowej powierzchni. Poza tym, dość wysoka wartość odchylenia standardowego dla ilości fibrynogenu na powierzchni stali świadczy o niejednorodności powierzchni stali - najprawdopodobniej krążki stalowe różnią się między sobą chropowatością powierzchni i w sposób niejednakowy adsorbują fibrynogen. Natomiast pokrycie polimerowe wygładza powierzchnię, o czym świadczy niskie odchylenie standardowe.

d. Biozgodność powłoki polimerowej

Biozgodność powłoki polimerowej według wynalazku zbadano przy pomocy tzw. testu cytotoksyczności krótkiej według normy ISO 10993-5. Test polega na inkubacji komórek mysich (fibroblastów linii L929) z tzw. ekstraktami z materiałów, tj. z płynem, który wcześniej kontaktował się z badanymi materiałami przez 24 h. Płynem jest pożywka do hodowli komórek L929. W ciągu tego czasu z materiałów do pożywki przedostają się wszystkie rozpuszczalne w nim związki. Następnie poddaje się ocenie żywotność komórek i na podstawie wyników stwierdza się, czy dany materiał jest toksyczny dla komórek. Krążki stalowe niepokryte (3 szt.) oraz pokryte polimerem (3 szt.) zostały poddane wstępnemu myciu w roztworze soli fizjologicznej przez 1 h i w temperaturze 37°C, a następnie każdy krążek osobno umieszczono w naczyniu z pożywką DMEM w/o Phenol Red (Gibco™ Thermo Fisher), zgodnie z protokołem hodowli komórek L929 suplementowaną 10% FBS, 1% streptomycyny i 1% glutaminy. Zgodnie z proporcją wyznaczoną przez normę ISO 10993-5, na każdy krążek przypadało 1,5 ml pożywki. Materiały inkubowano przez 24 h w inkubatorze hodowlanym w temperaturze 37°C, 5% CO2. W dołkach płytki hodowlanej 96-dołkowej umieszczono po 100 gl zawiesiny komórek L929 o gęstości 104/100 gl i inkubowano przez 24 h w inkubatorze hodowlanym temperaturze 37°C, 5% CO2. Po upływie tego czasu wymieniono pożywkę znad komórek w dołkach na ekstrakty z materiałów (po 100 gl na dołek) i inkubowano przez 24 h. Równolegle prowadzono hodowlę kontrolną: kontrolę pozytywną - KP (komórki L929 hodowane z pożywką z dodatkami toksycznymi: pożywka DMEM w/o Phenol Red suplementowana jak wyżej z dodatkiem 0,1% Triton X) oraz kontrolę negatywną - KN (komórki L929 hodowane z pożywką bez dodatków toksycznych: pożywka DMEM w/o Phenol Red suplementowana jak wyżej). Po upływie 24 h inkubacji komórek z ekstraktami oceniono ich żywotność w odniesieniu do kontroli negatywnej przy pomocy testu XTT. Test XTT jest testem mierzącym aktywność enzymu dehydrogenazy mitochondrialnej w komórkach. Enzym ten przekształca bezbarwną sól tetrazolową do barwnego produktu - formazanu. Im wyższa aktywność enzymu, tym wyższa żywotność komórek. Powstały produkt jest rozpuszczalny w wodzie, nie ma konieczności rozpuszczania powstałych kryształów w rozpuszczalniku organicznym, co ogranicza możliwość błędu pomiaru. Po uzyskaniu barwnych roztworów zmierzono ich absorbancję i odniesiono do KN.

Fig. 5 przedstawia średnią żywotność komórek L929 w pośrednim kontakcie z materiałami wyznaczoną przy pomocy testu XTT wraz z odchyleniami standardowymi. Żywotność wyniosła ponad 87% w przypadku kontaktu komórek z ekstraktami z materiałów pokrytych pokryciem biozgodnym według wynalazku, co stanowi większy odsetek niż w przypadku kontaktu komórek z powierzchnią czystej stali 316L. Oznacza to, iż już po 24 h z powierzchni stali uwalniają się związki, które działają toksycznie na komórki. Najprawdopodobniej są to jony niklu i chromu. Pokrycie biozgodne hamuje wydzielanie tych jonów. Biorąc pod uwagę wytyczne normy ISO 10993-5, według powyższych wyników stal 316 z pokryciem biozgodnym można uznać za materiał nieposiadający właściwości cytotoksycznych, ponieważ żywotność komórek dla tego materiału przekracza 70%. Czysta stal 316L posiada potencjał cytotoksyczny (żywotność 57,801%).

Literatura [1] M.-Y. Ho, C.-C. Chen, C.-Y. Wang, S.-H. Chang, M.-J. Hsieh, C.-H. Lee, V. Wu, and I-C. Hsieh, “The Development of Coronary Artery Stents: From Bare-Metal to Bio-Resorbable Types,” Metals (Basel)., vol. 6, no. 7, p. 168, 2016.

[2] S. K. Jaganathan, E. Supriyanto, S. Murugesan, A. Balaji, and M. K. Asokan, “Biomaterials in cardiovascular research: Applications and clinical implications,” Biomed Res. Int., vol. 2014, 2014.

[3] T. Santonen and H. Stockmann, Review on toxicity of stainless steel. 2010.

PL 234 421 Β1 [4] M. Santin, L. Mikhalovska, A. W. Lloyd, S. Mikhalovsky, L. Sigfrid, S. P. Denyer, S. Field, and D. Teer, “In vitro host response assessment of biomaterials for cardiovascular stent manufacture,” J. Mater. Sci. Mater. Med., vol. 15, no. 4, pp. 473-477, 2004.

[5] K. Zhang, T. Liu, J. A. Li, J. Y. Chen, J. Wang, and N. Huang, Surface modification of implanted cardiovascular metal stents: From antithrombosis and antirestenosis to endothelialization, vol. 102, no. 2. 2014.

[6] I. H. Jaffer, J. C. Fredenburgh, J. Hirsh, and J. I. Weitz, “Medical device-induced thrombosis: What causes it and how can we prevent it?,” J. Thromb. Haemost., vol. 13, no. S1, pp. S72-S81,2015.

[7] G. Sydow-Plum and M. Tabrizian, “Review of stent coating strategies: clinical insights,” Mater. Sci. Technol., vol. 24, no. 9, pp. 1127-1143, 2008.

[8] M. Santin, P. Colombo, and G. Bruschi, “Interfacial biology of in-stent restenosis.,” Expert Rev. Med. Devices, vol. 2, no. 4, pp. 429-443, 2005.

[9] K. M. Hansson, S. Tosatti, J. Isaksson, J. Wettero, M. Textor, T. L. Lindahl, and P. Tengvall, “Whole blood coagulation on protein adsorption-resistant PEG and peptide functionalised PEG-coated titanium surfaces,” Biomaterials, vol. 26, no. 8, pp. 861-872, 2005.

[10] V. G. Gavalas, M. J. Berrocal, and L. G. Bachas, “Enhancing the blood compatibility of ionselective electrodes Analytical and Bioanalytical Chemistry, vol. 384, no. 1. pp. 65-72,

2006.

[11] E. De Giglio, S. Cometa, C. Satriano, L. Sabbatini, and P. G. Zambonin, “Electrosynthesis of hydrogel films on metal substrates for the development of coatings with tunable drug delivery performances,” J. Biomed. Mater. Res. - Part A, vol. 88, no. 4, pp. 1048-1057, 2009.

[12] F. Zhang, E. Kang, K. Neoh, P. Wang, and K. Tan, “Surface modification of stainless steel by grafting of poły (ethylene glycol) for reduction in protein adsorption,” Biomaterials, vol. 22, no. 5, pp. 1541-1548, 2001.

[13] S. Murugesan, J. Xie, and R. J. Linhardt, “Immobilization of Heparin: Approaches and Applications,” October, vol. 8, no. 2, pp. 80-100, 2008.

[14] J. E. Sousa, M. A. Costa, and A. Abizaid, “lnterventional Cardiology Stent Placement to Prevent Restenosis After Prevention of Distal Embolization During Coronary,” ACC Curr. J. Rev., vol. 104, no. 2001-11, pp. 53-54, 2002.

[15] B. W. Nolan, M. L. Schermerhorn, and E. Rowell, “Long-term Outcome of Transcatheter Secundum- type Atrial Septal Defect Closure Using Amplatzer Septal Occluders Outcomes of Renal Artery Angioplasty and Stenting Using Low-Profile Systems Association of Interatrial Shunts and Migraine Headaches: Impact o,” ACC Curr. J. Rev., vol. 41, no. June, pp. 46-52, 2005.

[16] M. A. Turco, J. A. Ormiston, and J. J. Pompa, “Polymer-Based, Paclitaxel-Eluting TAXUS Liberte Stent in De Novo Lesions,” J. Am. Coli. Cardiol., vol. 49, no. 16, pp. 1676-1683,

2007.

[17] J. Z. Zhu, X. W. Xiong, R. Du, Y. J. Jing, Y. Ying, X. M. Fan, T. Q. Zhu, and R. Y. Zhang, “Hemocompatibility of drug-eluting coronary stents coated with sulfonated poły (styreneblock-isobutylene-block-styrene)”, Biomaterials, vol. 33, no. 33, pp. 8204-8212, 2012.

[18] “Cardiac Health.” [Online], Available: http://www.cardiachealth.org/. [Accessed: 26-Dec2016], [19] Μ. K. Mcdermott and S. Chatterjee, “Application of the QbD (Ouality by Design) Approach for Coating Drug Eluting Stents ( DES) The QbD approach,” no. January, pp. 1-30, 2014.

[20] M. Sanak, B. Jakieła, and W. Węgrzyn, “Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests,” Buli. Polish Acad. Sci., vol. 58, no. 2, pp. 317-322, 2010.

PL 234 421 B1

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania na metalach biozgodnych powłok polimerowych z dimetakrylanu poli(glikolu etylenowego) metodą elektropolimeryzacji, z wykorzystaniem kwasu mineralnego i inicjatora redox oraz materiału węglowego jako przeciwelektrody, znamienny tym, że przygotowuje się roztwór wodny o przewodności nie mniejszej niż 10 mS/cm, zawierający od 2,5% do 22% v/v kwasu siarkowego lub azotowego (V), od 0 do granicznego stężenia określonego rozpuszczalnością w wodzie w danej temperaturze rozpuszczalnego w wodzie inicjatora redox oraz od 0,01 M do granicznego stężenia określonego rozpuszczalnością w wodzie w danej temperaturze soli nieorganicznej o reszcie kwasowej analogicznej, jak użyty kwas nieorganiczny, do tego roztworu wprowadza się obiekt metaliczny i dodaje się nie mniej niż 0,001% v/v monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu, nie mniej niż 0,001% dimetakrylanu glikolu etylenowego oraz nie mniej niż 0,1% v/v dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) o masie cząsteczkowej większej od 330 g/mol, po czym prowadzi się elektropolimeryzację, w której jako przeciwelektrodę dla powlekanej powierzchni metalicznej stosuje się włókno węglowe, przy czym elektropolimeryzację prowadzi się w czasie od 1 do 180 min, utrzymując natężenie prądu płynącego między elektrodami w zakresie od 4 mA do 500 mA, a następnie powierzchnię z osadzoną powłoką płucze się i suszy, po czym osadzoną powłokę wygrzewa się w temperaturze od 100 do 350°C, w czasie od 5 do 60 minut.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przewodność roztworu wynosi od 10 do 40 mS/cm.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatek kwasu siarkowego, korzystnie w ilości 2,5-5% v/v.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inicjator redox stosuje się w stężeniu od 0 do 0,1M.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako inicjator redox stosuje się nadtlenki, nadsiarczany, nadchlorany.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako inicjator redox stosuje się nadsiarczan amonu.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako sól o reszcie kwasowej analogicznej, jak użyty kwas nieorganiczny stosuje się siarczan lub azotan sodu lub potasu.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sól stosuje się w stężeniu od 0,01 do 0,13M.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że monolaurynianem polioksyetylenosorbitolu jest Tween 20, korzystnie w ilości od 0,1% do 1% (v/v).
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dimetakrylan glikolu etylenowego stosuje się w ilości od 0,01 do 0,1% (v/v).
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) stosuje się w ilości od 0,1% do 10%.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dimetakrylan poli(glikolu etylenowego) o masie cząsteczkowej 750 g/mol.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się włókno węglowe posiadające co najmniej 40 filamentów w paśmie.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że elektropolimeryzację prowadzi się w czasie 10-40 min, utrzymując gęstość prądową w wysokości od 3 do 15 mA/cm².
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed elektropolimeryzacją powierzchnię metalową płucze się i suszy.
16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że powierzchnią metalową, na której osadza się powłokę jest powierzchnia tytanu lub jego stopów albo stali lub jej stopów.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed elektropolimeryzacją powierzchni stalowej nadaje się chropowatość metodą mechaniczną, w obecności kwaśnego roztworu wodnego z detergentem albo metodą zanurzeniową w roztworze nadtlenku wodoru.

    PL 234 421 Β1

    Rysunki

    Fig. 1

    PL 234 421 Β1

    a)

    b)

    Fig. 3

    PL 234 421 Β1

    »)

    b)

    Fig. 4

    PL 234 421 Β1 !

    Ilość zaadsorbowanegofibrynogenu na powierzchni materiałów i

    OD 450

    1,200 _T~

    1,000

    0,800

    0,600

    0,400

    0,200

    0,000

    0,721 ± 0,338

    I

    0,408 ±0,026 stal stal z pokryciem biozgodnym

    Fig. 5

    120,000 % żywotności komórek L929

    100,000

    Żywotność komórek L929 wyznaczona przy pomocy testu ΧΤΤ

    80,000

    60,000

    40,000

    0,000

    20,000

    57,801 87,133 ±16,709 ±19,163

    5,023 ±0,444 stal z pokryciem „_n l\r biozgodnym

    Fig. 6

    100,00 ±7,00

    KN