PL233903B1 - Method for obtaining Lactobacillus rhamnosus bacteria biofilm on metallic surface and the bioelectrode obtained by this method - Google Patents

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biofilmu probiotycznych bakterii Lactobacillus rhamnosus GG na powierzchni złota oraz bioelektroda uzyskana tym sposobem.The subject of the invention is a method of obtaining a biofilm of probiotic Lactobacillus rhamnosus GG bacteria on a gold surface and a bioelectrode obtained in this way.

Mikrobiologiczne układy bioelektrochemiczne (z ang. microbial bioelectrochemical systems, BESs) są intensywnie rozwijającą się dziedziną z pogranicza biologii i elektrochemii. Wykorzystują one zdolność mikroorganizmów zasiedlających anodę lub katodę do przekształcania energii chemicznej w energię elektryczną [1-3], Taki proces jest możliwy dzięki transferowi elektronów pochodzących ze szlaku metabolicznego tych organizmów, zwanych elektrochemicznie aktywnymi mikroorganizmami [1]. Dotychczas BESs znalazły zastosowanie w wielu dziedzinach, zwłaszcza w konstrukcji biosensorów. Przykładem może być wykorzystanie bakterii z rodziny Acetobacter do konstrukcji bioelektrody wchodzącej w skład sensora czułego na nadtlenek wodoru [4]. Kolejnym przykładem jest monitorowanie poziomu glukozy za pomocą sensorów z immobilizowanymi bakteriami Escherichia coli [5], które znalazły również zastosowanie w produkcji energii elektrycznej oraz oczyszczaniu ścieków [6]. Także inne gatunki bakterii, takie jak: Shewanella, Streptococcus, Pseudomonas, znalazły zastosowanie do konstrukcji elektrod wykorzystywanych przy produkcji wodoru, odsalania wód, czy też w syntezie chemicznej [7-11].Microbial bioelectrochemical systems (BESs) are an intensively developing field on the border of biology and electrochemistry. They use the ability of microorganisms inhabiting the anode or cathode to convert chemical energy into electricity [1-3]. Such a process is possible thanks to the transfer of electrons from the metabolic pathway of these organisms, called electrochemically active microorganisms [1]. So far, BESs have found application in many fields, especially in the construction of biosensors. An example may be the use of bacteria from the Acetobacter family for the construction of a bioelectrode included in the sensor sensitive to hydrogen peroxide [4]. Another example is the monitoring of glucose levels using sensors with immobilized Escherichia coli bacteria [5], which have also been used in electricity production and wastewater treatment [6]. Also other species of bacteria, such as: Shewanella, Streptococcus, Pseudomonas, have found application in the construction of electrodes used in the production of hydrogen, water desalination, or in chemical synthesis [7-11].

Znanym rodzajem BESs, są mikrobiologiczne ogniwa paliwowe (ang. microbial fuel cells, MFCs). Ze względu na rosnącą potrzebę pozyskiwania energii z odnawialnych źródeł, cieszą się one coraz większym zainteresowaniem [12-13], Układy MFC oparte są na wytworzonym na anodzie biofilmie, czyli warstwie bakterii, które zasiedlają powierzchnię elektrody i pokryte są otoczką z substancji organicznych i nieorganicznych, a całość wykazuje aktywność elektrochemiczną. Ponadto, możliwe jest także występowanie planktonicznych organizmów w elektrolicie, które również posiadają elektrochemiczną aktywność i mogą znaleźć zastosowanie w konstrukcji ogniw. Zasada działania ogniwa opartego o mikroby polega na tym, że elektrony powstałe w wyniku utleniania związków organicznych przez bakterie zostają przekazane do anody, a następnie do katod y, co powoduje przepływ prądu w układzie [14]. Transfer elektronów może odbywać się na kilka sposobów. Obecnie w literaturze wyróżnia się cztery podstawowe mechanizmy przeniesienia elektronów z biofilmu do powierzchni anody [13,15]:A known type of BESs are microbial fuel cells (MFCs). Due to the growing need to obtain energy from renewable sources, they are becoming more and more popular [12-13]. MFC systems are based on an anode biofilm, i.e. a layer of bacteria that inhabit the electrode surface and are covered with a sheath of organic and inorganic substances and the whole exhibits electrochemical activity. Moreover, it is also possible for planktonic organisms to be present in the electrolyte, which also have electrochemical activity and can be used in cell construction. The principle of the cell based on microbes is based on the fact that the electrons generated as a result of the oxidation of organic compounds by bacteria are transferred to the anode, and then to the y cathode, which causes the current to flow in the system [14]. Electron transfer can take place in several ways. Currently, the literature distinguishes four basic mechanisms of electron transfer from the biofilm to the anode surface [13, 15]:

a) transfer przy pomocy sztucznych mediatorów (głównie syntetycznych barwników),a) transfer with the use of artificial mediators (mainly synthetic dyes),

b) abiotyczne utlenianie na powierzchni elektrody zredukowanych związków organicznych powstałych w wyniku fermentacji bakteryjnej,b) abiotic oxidation of reduced organic compounds on the surface of the electrode resulting from bacterial fermentation,

c) transfer dzięki naturalnym, produkowanym przez bakterie mediatorom;c) transfer thanks to natural mediators produced by bacteria;

d) bezpośredni transfer elektronów do anody.d) direct transfer of electrons to the anode.

To, z jakim mechanizmem mamy do czynienia zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj elektrody, szczep bakterii, a także rodzaj stosowanego elektrolitu.The mechanism we are dealing with depends on many factors, such as the type of electrode, the strain of bacteria, and the type of electrolyte used.

W znanych przykładach układów bioelektrochemicznych zazwyczaj stosuje się mikroorganizmy chorobotwórcze lub potencjalnie patogenne. Jednym z takich szczepów jest Escherichia coli, czyli pałeczka okrężnicy, która pomimo tego, że występuje w ludzkiej florze bakteryjnej, znana jest ze zdolności wywoływania chorób m.in. układu pokarmowego [16]. Inną grupą bakterii stosowanych w BES są te pozyskiwane ze ścieków, osadów rzecznych czy też gleb [7, 10]. Stosowanie tych szczepów stwarza więc ryzyko powstania wielu zagrożeń, dlatego też pożądane jest dostarczenie rozwiązań opartych na wykorzystaniu mikroorganizmów przyjaznych zarówno dla człowieka, jak i środowiska.Known examples of bioelectrochemical systems typically employ pathogenic or potentially pathogenic microorganisms. One of such strains is Escherichia coli, i.e. the colon rod, which, despite the fact that it occurs in the human bacterial flora, is known for its ability to cause diseases, including digestive system [16]. Another group of bacteria used in BES are those obtained from sewage, river sediments or soil [7, 10]. The use of these strains poses the risk of many threats, therefore it is desirable to provide solutions based on the use of microorganisms that are friendly to both humans and the environment.

Jednym z takich rozwiązań może być zastosowanie szczepu Lactobacillus rhamnosus. Należy ona do bakterii Gram-dodatnich, które występują w postaci pałeczek, a ich cechą charakterystyczną jest tworzenie łańcuchów. Niektóre szczepy, np. Lactobacillus rhamnosus GG, używane są do produkcji probiotyków oraz jogurtów [17]. Pomimo korzystnych właściwości, nie znalazły one jednak dotychczas zastosowania w bioelektrochemii, gdyż bakterie te nie tworzą biofilmu na powierzchniach metalicznych. Szczególnym problemem wymagającym rozwiązania jest zaproponowanie modyfikacji powierzchni elektrod metalicznych tak, aby umożliwić tworzenie się filmu bakteryjnego przez ten szczep.One of such solutions may be the use of Lactobacillus rhamnosus strain. It belongs to the gram-positive bacteria, which occur in the form of rods, and their characteristic feature is the formation of chains. Some strains, such as Lactobacillus rhamnosus GG, are used for the production of probiotics and yoghurts [17]. Despite their favorable properties, they have not been used in bioelectrochemistry so far, as these bacteria do not form a biofilm on metallic surfaces. A particular problem to be solved is to propose a modification of the surface of metal electrodes so as to allow the formation of a bacterial film by this strain.

Ważnym aspektem konstrukcji elementów układu biologicznego do zastosowań elektrochemicznych jest rodzaj i budowa elektrody. Zarówno materiał, z którego zrobiona jest elektroda, jak i jej morfologia mogą mieć znaczący wpływ na zasiedlanie powierzchni przez mikroorganizmy. Obecnie do konstrukcji anod najpowszechniej stosuje się materiały węglowe (grafitowe [1, 18], z tkaniny węglowej, papieru węglowego, szczotek węglowych [1]), które można poddać licznym modyfikacjom. Mają one tęAn important aspect of the construction of biological system elements for electrochemical applications is the type and structure of the electrode. Both the material from which the electrode is made and its morphology can have a significant impact on the colonization of the surface by microorganisms. Currently, the most commonly used materials for the construction of anodes are carbon materials (graphite [1, 18], carbon fabric, carbon paper, carbon brushes [1]), which can be subjected to numerous modifications. They have this

PL 233 903 B1 zaletę, że są tanie, jednakże adhezja bakterii do ich powierzchni może być utrudniona ze względu na zbyt małą chropowatość elektrody. W konsekwencji wydajność takiego ogniwa bądź sensora będzie niewystarczająca. Dlatego też wciąż poszukuje się nowych materiałów, które pozwolą na zwiększenie wydajności generowanego prądu, a jednocześnie nie będą toksyczne dla zasiedlających je bakterii. Metale takie jak miedź, srebro czy złoto mogłyby być obiecującą alternatywą dla materiałów węglowych, jednakże powszechnie znane są ich właściwości bakteriostatyczne czy nawet bakteriobójcze [19-21], Aby umożliwić adhezję i namnażanie się mikroorganizmów na powierzchni takich metali, konieczna jest jej modyfikacja.The advantage is that they are cheap, however, the adhesion of bacteria to their surface may be difficult due to the too low roughness of the electrode. As a consequence, the efficiency of such a cell or sensor will be insufficient. Therefore, new materials are still being sought that will increase the efficiency of the generated electricity, and at the same time are not toxic to the bacteria that inhabit them. Metals such as copper, silver and gold could be a promising alternative to carbon materials, however, their bacteriostatic or even bactericidal properties are well known [19-21]. Modification is necessary to allow adhesion and multiplication of microorganisms on the surface of such metals.

Zasadniczym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania biofilmu Lactobacillus rhamnosus na powierzchni złota.The main object of the present invention is to provide a method of producing a Lactobacillus rhamnosus biofilm on the surface of gold.

Nieoczekiwanie, określone powyżej problemy zostały rozwiązane w niniejszym wynalazku.Unexpectedly, the problems identified above have been solved by the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania biofilmu bakterii na powierzchni metalicznej, charakteryzując się tym, że:The subject of the invention is a method of obtaining a biofilm of bacteria on a metallic surface, characterized by the following:

a) powierzchnię wykonaną ze złota pokrywa się warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu),a) the surface made of gold is covered with a layer of a polymer with a permanent positive charge (polycation),

b) uzyskaną w etapie a) zmodyfikowaną polikationem powierzchnię złota zasiedla się bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG poprzez zanurzenie w zawiesinie tych bakterii.b) the polycation-modified gold surface obtained in step a) is colonized with bacteria of the Lactobacillus rhamnosus GG strain by immersion in the suspension of these bacteria.

Korzystnie, w stosowanym w sposobie według wynalazku polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd, korzystnie dekstran, pululan albo inulina.Preferably, the polycation used in the process of the invention is a polymer selected from the group consisting of: a polymer obtained by polymerization of 3-methacryloylaminopropyltrimethylammonium chloride or a polysaccharide modified with glycidyltrimethylammonium chloride, preferably dextran, pullulan or inulin.

Korzystnie, w etapie a) sposobu według wynalazku warstwę polimeru nanosi się na powierzchnię złota poprzez zanurzenie jej w roztworze zawierającym naładowane dodatnio cząsteczki polimeru (technika „layer by layer”).Preferably, in step a) of the process according to the invention, the polymer layer is applied to the gold surface by dipping it in a solution containing positively charged polymer particles ("layer by layer" technique).

Korzystnie, w etapie b) sposobu według wynalazku zasiedlanie bakteriami Lactobacillus rhamnosus GG odbywa się poprzez zanurzenie powierzchni w zawiesinie tych bakterii w medium hodowlanym zwłaszcza MRS, korzystnie na około 2 h.Preferably, in step b) of the method according to the invention, the colonization with the Lactobacillus rhamnosus GG bacteria takes place by immersing the surface in a suspension of these bacteria in a growth medium, especially MRS, preferably for about 2 hours.

Korzystnie, w etapie b) sposobu według wynalazku zasiedloną powierzchnię dodatkowo pozostawia się w medium hodowlanym na czas od 24 do 72 godzin.Preferably, in step b) of the method according to the invention, the inhabited area is additionally left in the growth medium for 24 to 72 hours.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest bioelektroda, charakteryzująca się tym, że posiada powierzchnię wykonaną ze złota pokrytą warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu) zasiedloną bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG.Another object of the invention is a bioelectrode, characterized in that it has a gold surface covered with a layer of a permanently positively charged polymer (polycation) inhabited by bacteria of the Lactobacillus rhamnosus GG strain.

Korzystnie, polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany w poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd, korzystnie dekstran, pululan albo inulina.Preferably, the polycation is a polymer selected from the group consisting of: a polymer obtained by polymerization of 3-methacryloylaminopropyltrimethylammonium chloride or a polysaccharide modified with glycidyltrimethylammonium chloride, preferably dextran, pullulan or inulin.

Korzystnie, bioelektroda według wynalazku została otrzymana sposobem określonym powyżej.Preferably, the bioelectrode according to the invention has been obtained by the method defined above.

Bioelektrody według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie do wytwarzania ogniwa paliwowego lub biosensora.The bioelectrodes according to the invention can be used for the production of a fuel cell or a biosensor.

W sposobie według wynalazku możliwe jest uzyskanie biofilmu Lactobacillus rhamnosus, zwłaszcza szczepu Lactobacillus rhamnosus GG, na powierzchni złota, która została wstępnie zmodyfikowana poprzez pokrycie jej warstwą polikationu, korzystnie otrzymaną metodą LbL. Nieoczekiwanie, utworzenie polikationowej warstwy na powierzchni złota, umożliwiło bakteriom Lactobacillus rhamnosus GG adhezję na tak zmodyfikowanej powierzchni metalu. Dzięki temu, nie zaobserwowano negatywnego wpływu metalu szlachetnego na przeżywalność mikroorganizmów. Nieoczekiwanie, bakterie nadal rozmnażały się i tworzyły biofilm bakteryjny na powierzchni metalu pokrytej polikationem. Pozwoliło to również na zachowanie aktywności elektrochemicznej przez szczep Lactobacillus rhamnosus GG, umożliwiając na uzyskanie bioelektrody według wynalazku.In the method according to the invention, it is possible to obtain a Lactobacillus rhamnosus biofilm, in particular of the Lactobacillus rhamnosus GG strain, on a gold surface that has been pre-modified by coating it with a polycation layer, preferably obtained by the LbL method. Unexpectedly, the formation of a polycationic layer on the gold surface allowed the Lactobacillus rhamnosus GG bacteria to adhere to the metal surface modified in this way. As a result, no negative influence of the noble metal on the survival of microorganisms was observed. Surprisingly, the bacteria continued to proliferate and form a bacterial biofilm on the polycation-coated metal surface. It also allowed the electrochemical activity to be retained by the Lactobacillus rhamnosus GG strain, enabling the bioelectrode according to the invention to be obtained.

Zgodnie z wynalazkiem przez „biofilm” rozumie się skupisko bakterii żywych, nie pozbawionych aktywności elektrochemicznej manifestującej się możliwością wpływania na potencjał otrzymanej w ten sposób elektrody metalicznej, korzystnie złotej.According to the invention, the term "biofilm" is understood as a group of live bacteria, not devoid of electrochemical activity manifested by the possibility of influencing the potential of the metallic electrode obtained in this way, preferably gold.

Zgodnie z wynalazkiem powierzchnię metalu, zwłaszcza złota, pokrywa się warstwą polikationów. W kontekście wynalazku „polikationy” to wszelkie znane polimery posiadające trwały ładunek dodatni, wynikający z obecności w ich strukturze dodatnio naładowanych ugrupowań, przykładowo będących aminami 4-rzędowymi, na przykład trimetyloamoniowych. Nadające się do wykorzystanie zgodnie z wynalazkiem polimery mogą być pochodzenia naturalnego, takie jak kationowe polisacharydy, lub też syntetycznego. Przykładami kationowych polisacharydów są dekstran, pululan, inulinaAccording to the invention, the surface of the metal, especially gold, is covered with a layer of polycations. In the context of the invention, "polycations" are all known polymers having a permanent positive charge resulting from the presence of positively charged moieties in their structure, for example being 4-order amines, for example trimethylammonium. The polymers to be used according to the invention may be of natural origin, such as cationic polysaccharides, or of synthetic origin. Examples of cationic polysaccharides are dextran, pullulan, inulin

PL 233 903 B1 bądź inny polisacharyd pochodzenia naturalnego, które zostały przekształcone na skutek przyłączenia odpowiedniej aminy. Natomiast przykładem syntetycznych polikationów nadających się do wykorzystania zgodnie z wynalazkiem są produkty polimeryzacji odpowiednich aminopochodnych kwasu metakrylowego bądź akrylowego. Kationowe polimery w roztworach wykazują zazwyczaj dużą toksyczność (analogicznie do kationowych surfaktantów), choć w grupie polikationów naturalnych zdarzają się wyjątki. Związki te często są stosowane do zmieniania własności powierzchni charakteryzujących się ładunkiem dodatnim.PL 233 903 B1 or any other naturally derived polysaccharide that has been transformed by the attachment of an appropriate amine. On the other hand, examples of synthetic polycations that can be used in the invention are the polymerization products of the corresponding amino derivatives of methacrylic or acrylic acid. Cationic polymers in solutions usually show high toxicity (analogous to cationic surfactants), although there are exceptions in the group of natural polycations. These compounds are often used to alter the properties of positively charged surfaces.

Nadającą się do wykorzystania w sposobie według wynalazku metodą, która pozwala na naniesienie na powierzchnię metalu warstwy polikationu, jest metoda „layer by layer”. W technice tej materiał o danym znaku potencjału powierzchniowego zostaje zanurzony w roztworze zawierającym makromolekuły o przeciwnym ładunku. W skutek oddziaływań (m.in. elektrostatycznych) pomiędzy powierzchnią i adherującymi cząsteczkami dochodzi do samoistnego formowania się na niej warstwy tych molekuł. Możliwe jest też tworzenie wielowarstw poprzez zanurzanie materiału naprzemiennie w roztworach zawierających polimery o dodatnim i ujemny potencjale powierzchniowym, z pośrednimi etapami przemywania powierzchni wodą. Modyfikacja powierzchni materiału metodą layer by layer może korzystnie zmieniać jej właściwości (np. hydrofobowa powierzchnia może stać się hydrofilowa).The method suitable for use in the method according to the invention, which allows for the application of a polycation layer on the metal surface, is the "layer by layer" method. In this technique, a material with a given surface potential sign is immersed in a solution containing macromolecules with the opposite charge. As a result of interactions (including electrostatic) between the surface and the adhering molecules, a layer of these molecules forms spontaneously on it. It is also possible to create multilayers by dipping the material alternately in solutions containing polymers with positive and negative surface potential, with intermediate steps of washing the surface with water. Modification of the surface of the material by the layer by layer method may advantageously change its properties (e.g. a hydrophobic surface may become hydrophilic).

Dla lepszego zrozumienie istoty wynalazku jego opis został wzbogacony poniższymi przykładami wykonania oraz załączonymi rysunkami.For a better understanding of the essence of the invention, its description has been enriched with the following examples and the attached drawings.

Na Figurze 1 przedstawiony został schemat opisanej w przykładzie 5 bioelektrody według wynalazku z biofilmem bakteryjnym L. rhamnosus uzyskanej na bazie blaszki miedzianej pokrytej cienką warstwą złota oraz polikationem naniesionym metodą LbL.Figure 1 shows the scheme of the bioelectrode according to the invention described in example 5 with the bacterial L. rhamnosus biofilm obtained on the basis of a copper plate covered with a thin layer of gold and a polycation applied by the LbL method.

Na Figurze 2 przedstawione zostały mikrofotografie SEM filmów bakteryjnych uzyskanych na różnych podłożach: Cu - blaszka miedziana; Cu/DEX-G - blaszka miedziana z naniesioną warstwą LbL kationowej pochodnej dekstranu; Cu/Au - blaszka miedziana pokryta warstwą złota; Cu/Au/DEX-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej dekstranu; Cu/Au/PMAPTAC - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej MAPTAC; Cu/Au/INU-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej inuliny; Cu/Au/PUL-G - blaszka miedziana pokryta warstwą złota oraz warstwą LbL kationowej pochodnej pululanu.Figure 2 shows SEM micrographs of bacterial films obtained on different substrates: Cu - copper plate; Cu / DEX-G - a copper plate with an LbL layer of a cationic derivative of dextran; Cu / Au - a copper plate covered with a layer of gold; Cu / Au / DEX-G - a copper plate covered with a layer of gold and an LbL layer of a cationic derivative of dextran; Cu / Au / PMAPTAC - a copper plate covered with a layer of gold and an LbL layer of the cationic MAPTAC derivative; Cu / Au / INU-G - a copper plate covered with a layer of gold and an LbL layer of a cationic derivative of inulin; Cu / Au / PUL-G - a copper plate covered with a layer of gold and a layer of LbL of a cationic derivative of pullulan.

Na Figurze 3 przedstawione zostały przykładowe krzywe woltamperometryczne dla badanych elektrod, (a) porównanie krzywych CV dla elektrod nie pokrytych filmem bakteryjnym (Cu/Au oraz Cu/Au/dex) oraz z biofilmem,L. rhamnosus (żywe) zarejestrowane w medium; (b) krzywe CV zarejestrowane dla elektrody z biofilmem w elektrolicie mieszanym (medium: KNO3) dla różnych szybkości skanowania.Figure 3 shows exemplary voltammetric curves for the tested electrodes, (a) comparison of CV curves for electrodes not covered with bacterial film (Cu / Au and Cu / Au / dex) and with biofilm, L. rhamnosus (live) recorded in the medium; (b) CV curves recorded for a biofilm electrode in a mixed electrolyte (medium: KNO3) at different scanning rates.

P r z y k ł a d 1. Synteza dekstranu modyfikowanego chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym (GTMAC) [22] g dekstranu 40 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 12 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru oczyszczano (dializowano) przez 5 dni, stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 12 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.Example 1. Synthesis of dextran modified with glycidyltrimethylammonium chloride (GTMAC) [22] g of 40 kDa dextran was dissolved in 100 ml of distilled water, and then 0.4 g of NaOH and 12 ml of GTMAC (90% solution in water) were added. The solution thus obtained was stirred at 60 ° C for 4 hours. The polymer solution was then purified (dialyzed) for 5 days using a cellulose tube permeable to particles smaller than 12 kDa. After this time, the polymer was isolated by lyophilization. The degree of modification was approximately 0.5 GTMAC molecules for each glucose unit.

P r z y k ł a d 2. Synteza pululanu modyfikowanego GTMAC [22] g pululanu 200 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 24 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru dializowano przez 5 dni stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 12 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.Example 2. Synthesis of GTMAC modified pullulan [22] g of 200 kDa pullulan was dissolved in 100 ml of distilled water, and then 0.4 g of NaOH and 24 ml of GTMAC (90% solution in water) were added. The solution thus obtained was stirred at 60 ° C for 4 hours. The polymer solution was then dialyzed for 5 days using a cellulose tube permeable to particles smaller than 12 kDa. After this time, the polymer was isolated by lyophilization. The degree of modification was approximately 0.5 GTMAC molecules for each glucose unit.

P r z y k ł a d 3. Synteza inuliny modyfikowanej GTMAC [22] g inuliny 5 kDa rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej, a następnie dodano 0,4 g NaOH oraz 24 ml GTMAC (90% roztwór w wodzie). Tak otrzymany roztwór mieszano w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Następnie roztwór polimeru oczyszczano przez 5 dni stosując tubę celulozową przepuszczalną dla cząstek mniejszych niż 3 kDa. Po tym czasie polimer wyizolowano stosując liofilizacje. Stopień modyfikacji wyniósł około 0,5 cząsteczek GTMAC na każda jednostkę glukozową.Example 3. Synthesis of modified inulin GTMAC [22] g of 5 kDa inulin was dissolved in 100 ml of distilled water, and then 0.4 g of NaOH and 24 ml of GTMAC (90% solution in water) were added. The solution thus obtained was stirred at 60 ° C for 4 hours. The polymer solution was then purified for 5 days using a cellulose tube permeable to particles smaller than 3 kDa. After this time, the polymer was isolated by lyophilization. The degree of modification was approximately 0.5 GTMAC molecules for each glucose unit.

PL 233 903 B1PL 233 903 B1

P r z y k ł a d 4. Synteza polimeru powstałego na skutek polimeryzacji chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowegoExample 4. Synthesis of the polymer resulting from the polymerization of 3-methacryloylaminopropyltrimethylammonium chloride

Przez 6 ml wody destylowanej przepuszczano przez 0,5 h argon w celu usunięcia tlenu. Następnie dodano do tej objętości 6 g 50% roztworu monomeru MAPTAC (chlorku metakrylamidopropylotrimetyloamoniowego) oraz 15 mg inicjatora kwasu 4,4’-Azobis(4-cyjanowalerianowego). Całość mieszano przez 4 h w temperaturze 70°C. Otrzymaną mieszaninę dializowano do wody destylowanej przez 5 dni. Polimer wyizolowano stosując liofilizator.Argon was bubbled through 6 ml of distilled water for 0.5 h to remove oxygen. Thereafter, 6 g of a 50% MAPTAC monomer solution (methacrylamidopropyltrimethylammonium chloride) and 15 mg of the 4,4'-Azobis (4-cyanovaleric acid) initiator were added to this volume. The mixture was stirred for 4 h at 70 ° C. The resulting mixture was dialyzed against distilled water for 5 days. The polymer was isolated using a freeze dryer.

P r z y k ł a d 5. Budowa i formowanie elektrodyP r z k ł a d 5. Construction and formation of the electrode

a) Przygotowanie powierzchni elektrody pokrytej złotema) Preparation of the gold-plated electrode surface

Jako materiał wyjściowy zastosowano odpowiednio przygotowaną folię miedzianą. Odtłuszczone próbki zostały poddane polerowaniu (elektrochemicznemu i chemicznemu), a następnie były płukane w wodzie destylowanej i etanolu i suszone na powietrzu. Tak przygotowane próbki napylano cienką warstwą złota (około 20 nm), którą następnie pogrubiano chronopotencjometrycznie. Proces prowadzono w konwencjonalnym standardowym układzie trójelektrodowym, gdzie elektrodę pracującą stanowiła napylona próbka, a elektrody odniesienia i porównawczą siatki platynowe. Jako elektrolit zastosowano komercyjnie dostępny roztwór złota (Auruna®5000), zawierający 7 g/dm³ złota. Proces prowadzono przy zadanej wartości prądu (1,5 mA/cm²) przez 300 s. Następnie próbkę przepłukano wodą destylowaną i etanolem i suszono na powietrzu.A properly prepared copper foil was used as the starting material. The degreased samples were subjected to polishing (electrochemical and chemical), then rinsed in distilled water and ethanol, and air dried. The samples prepared in this way were sputtered with a thin layer of gold (about 20 nm), which was then thickened chronopotentiometrically. The process was carried out in a conventional standard three-electrode system, where the working electrode was a sputtered sample, and the reference and control electrodes were platinum grids. A commercially available gold solution (Auruna® 5000) containing 7 g / dm ³ gold was used as the electrolyte. The process was carried out at the set current value (1.5 mA / cm ² ) for 300 s. Then the sample was rinsed with distilled water and ethanol and dried in air.

b) Modyfikacja powierzchni elektrody polikationami - metoda layer by layerb) Modification of the electrode surface with polycations - layer by layer method

Sporządzono roztwory polikationów uzyskanych w przykładach 1-4 w buforze fosforanowym (PBS) o pH = 7,4 i stężeniu 0,1 g/dm³. Wcześniej przygotowane podłoża metaliczne zanurzano na 15 min w odpowiednich roztworach polikationów, a następnie przepłukiwano wodą destylowaną i umieszczano w roztworze PBS.Solutions of the polycations obtained in Examples 1-4 were prepared in phosphate buffer (PBS) at pH = 7.4 at a concentration of 0.1 g / dm ³ . The previously prepared metal substrates were immersed for 15 minutes in appropriate polycation solutions, then rinsed with distilled water and placed in the PBS solution.

c) Tworzenie biofilmu Lactobacillus rhamnosus na metalicznych elektrodachc) Formation of Lactobacillus rhamnosus biofilm on metallic electrodes

Najpierw przygotowano mikrobiologiczne medium zawierające 20 g/dm³ glukozy, poprzez rozpuszczenie 12,75 g medium MRS Broth w 250 ml wody destylowanej oraz dodanie 250 gl Tween®80. Następnie roztwór autoklawowano przez 15 min w temperaturze 121°C. Do tak przygotowanego medium wprowadzono zawartość kapsułki probiotyku (Dicoflor®60, Bayer) i wytrząsano 24 h w temperaturze 37°C. Niemodyfikowane oraz modyfikowane metodą layer by layer podłoża przepłukiwano roztworem medium i umieszczano w jałowych szalkach Petriego. Następnie nanoszono na nie roztwór medium zawierający bakterie i pozostawiano na około 2 h w celu inokulacji bakterii na powierzchni elektrod. Po tym czasie odpłukiwano nadmiar mikroorganizmów roztworem PBS oraz medium i umieszczano w probówkach z medium. Tak przygotowane próbki pozostawiano na 24 h lub 72 h, aby ułatwić tworzenie się biofilmu bakteryjnego. Schemat powstałej elektrody przedstawiono na Fig 1.First, a microbial medium containing 20 g / dm ^{3 of} glucose was prepared by dissolving 12.75 g of MRS Broth medium in 250 ml of distilled water and adding 250 g of Tween®80. The solution was then autoclaved for 15 min at 121 ° C. The contents of a probiotic capsule (Dicoflor®60, Bayer) were introduced into the thus prepared medium and shaken for 24 h at 37 ° C. Unmodified and layer by layer modified substrates were rinsed with a medium solution and placed in sterile Petri dishes. Then a solution of the medium containing bacteria was applied to them and left for about 2 h to inoculate the bacteria on the surface of the electrodes. After this time, the excess of microorganisms was rinsed with the PBS solution and the medium and placed in test tubes with the medium. The samples prepared in this way were left for 24 or 72 hours to facilitate the formation of bacterial biofilm. The diagram of the resulting electrode is shown in Fig 1.

P r z y k ł a d 6. Potwierdzenie zasiedlania elektrody przy pomocy mikroskopii elektronowejP r z k ł a d 6. Confirmation of electrode colonization by electron microscopy

W celu potwierdzenie zasiedlenia elektrod przez mikroorganizmy, próbki zostały utrwalone zgodnie z procedurą przedstawioną poniżej. Elektrody po hodowli bakteryjnej przepłukiwano roztworem PBS, a następnie umieszczano w 3% roztworze aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym na około 30 min. Następnie przepłukiwano je roztworem PBS oraz wodą. Bakterie odwadniano w wodnym szeregu alkoholowym o następujących, zwiększających się stężeniach: 60% < 70% < 80% <90% <100%. Każdy etap trwał 5 min. Ostateczne odwodnienie i suszenie przeprowadzano przy użyciu heksametylodisilazanu. Próbki zanurzano w tym roztworze na około 1 min, a następnie suszono na powietrzu. Tak przygotowane elektrody napylano złotem i obrazowano ich powierzchnię przy pomocy skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Figura 2 przedstawia mikrofotografie otrzymanych próbek.In order to confirm the colonization of the electrodes by microorganisms, the samples were fixed according to the procedure outlined below. After the bacterial culture, the electrodes were rinsed with a PBS solution and then placed in a 3% glutaraldehyde solution in phosphate buffer for about 30 min. Then they were rinsed with PBS solution and water. Bacteria were dehydrated in the water alcohol series with the following increasing concentrations: 60% <70% <80% <90% <100%. Each stage lasted 5 minutes. Final dehydration and drying was carried out using hexamethyldisilazane. The samples were immersed in this solution for about 1 min and then air dried. The electrodes prepared in this way were sputtered with gold and their surface was imaged using a scanning electron microscope (SEM). Figure 2 shows micrographs of the samples obtained.

Przedstawione mikrofotografie potwierdzają, że bakterie L. rhamnosus adherują, dzielą się i tworzą film bakteryjny tylko na elektrodach miedzianych pokrytych warstwą złota i modyfikowanych kationowymi pochodnymi polimerów. Elektrody miedziane, zarówno czyste, jak i pokryte tylko polimerem, bądź tylko złotem nie wpływają korzystnie na wzrost bakterii. Na zdjęciach SEM widocznie widać mniejszą ilość zaadherowanych bakterii. Co więcej, komórki bakteryjne są zniszczone i nie tworzą charakterystycznych dla tego gatunku bakterii łańcuszków. Potwierdza to ostatecznie, że warstwowa konstrukcja elektrody (metal - złoto - kationowa pochodna polimerów) jest najkorzystniejsza dla tworzenia się biofilmu tego szczepu bakterii.The presented micrographs confirm that L. rhamnosus bacteria adhere, divide and form a bacterial film only on copper electrodes covered with a gold layer and modified with cationic derivatives of polymers. Copper electrodes, both pure and coated only with a polymer or only with gold, do not favor the growth of bacteria. The SEM photos clearly show a smaller amount of adhered bacteria. Moreover, bacterial cells are destroyed and do not form chains characteristic of this species of bacteria. This finally confirms that the layered structure of the electrode (metal - gold - cationic derivative of polymers) is the most favorable for the formation of a biofilm of this bacterial strain.

P r z y k ł a d 7. Potwierdzenie aktywności elektrochemicznej stworzonej elektrodyP r z k ł a d 7. Confirmation of the electrochemical activity of the created electrode

Przygotowane złote elektrody pokryte warstwą polikationu i zasiedlone biofilmem bakteryjnym zostały poddane wstępnym testom elektrochemicznym. Przeprowadzono pomiary woltampePrepared gold electrodes covered with a polycation layer and populated with bacterial biofilm were subjected to preliminary electrochemical tests. Voltampe measurements were taken

PL 233 903 B1 rometrii cyklicznej (CV) w celu sprawdzenia, czy testowane elektrody dają odpowiedź prądową. Do badań zastosowano dwa elektrolity: (i) medium hodowlane oraz (ii) mieszaninę medium hodowlanego i 0,1-molowego roztworu KNO3 (1:1 obj.). Woltamperogramy rejestrowano dla zakresu potencjałów - 0,6 - 0,5 V względem nasyconej elektrody kalomelowej (SCE). Krzywe rejestrowano dla niepokrytej polimerem elektrody złotej, elektrody z warstwą LbL dekstranu oraz dla elektrody z biofilmem bakteryjnym. Wyniki przedstawione na Fig. 3 dowodzą, że w przeciwieństwie do niezasiedlonych elektrod, bakterie L. rhamnosus tworzące biofilm na elektrodzie złotej pokrytej warstwą polimeru dają odpowiedź prądową. Widoczne są dwa piki (utleniania i redukcji), odpowiadające reakcjom elektrodowym zachodzącym w układzie.Using cyclic (CV) rometry to verify that the electrodes under test are giving a current response. Two electrolytes were used for the tests: (i) the culture medium and (ii) the mixture of the culture medium and the 0.1 molar KNO3 solution (1: 1 vol.). The voltamperograms were recorded for the potential range - 0.6 - 0.5 V relative to the saturated calomel electrode (SCE). Curves were recorded for the non-polymer coated gold electrode, the electrode with the LbL dextran layer and for the electrode with bacterial biofilm. The results presented in Fig. 3 show that, in contrast to the uninhabited electrodes, the L. rhamnosus bacteria forming a biofilm on the gold electrode coated with a polymer layer give a current response. Two peaks (oxidation and reduction) are visible, corresponding to the electrode reactions taking place in the system.

Przedstawione na Fig. 3 woltamperogramy potwierdzają, że wytworzony na opisanych elektrodach biofilm wykazuje aktywność elektrochemiczną. Daje to dobre podstawy do wykorzystania takiego układu, np. w konstrukcji elektrody do ogniwa paliwowego bądź też biosensora.The voltamperograms presented in Fig. 3 confirm that the biofilm produced on the described electrodes shows electrochemical activity. This provides a good basis for the use of such a system, e.g. in the construction of an electrode for a fuel cell or a biosensor.

Literatura:Literature:

[1] Xie X., Criddle C., Cui Y., Energy Environ. Sci. 2015, 8, 3418-3441.[1] Xie X., Criddle C., Cui Y., Energy Environ. Sci. 2015, 8, 3418-3441.

[2] Logan B.E., Rabaey K., Science 2012, 337, 686-690.[2] Logan B.E., Rabaey K., Science 2012, 337, 686-690.

[3] Rittmann B.E., Krajmalnik-Brown, Halden R.U., Nat. Rev. Microbiol. 2008, 6, 604-612.[3] Rittmann B.E., Krajmalnik-Brown, Halden R.U., Nat. Rev. Microbiol. 2008, 6, 604-612.

[4] Rajasekar S., Rajasekar R., Narasimhan K.C., Bull. Electrochem., 16, 25-28.[4] Rajasekar S., Rajasekar R., Narasimhan K.C., Bull. Electrochem., 16, 25-28.

[5] Ito Y., Yamazaki S., Ikeda T., Biosens. Bioelectron., 2002, 17, 993-998.[5] Ito Y., Yamazaki S., Ikeda T., Biosens. Bioelectron., 2002, 17, 993-998.

[6] Zhang T., Zeng Y., Chen S., Ai X., Yang H., Electrochem. Commun., 2007, 9, 349-353.[6] Zhang T., Zeng Y., Chen S., Ai X., Yang H., Electrochem. Commun., 2007, 9, 349-353.

[7] Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R., Science 2002, 295, 483-485.[7] Bond D.R., Holmes D.E., Tender L.M., Lovley D.R., Science 2002, 295, 483-485.

[8] Chaudhuri S.K., Lovley D.R., Nat. Biotechnol., 2003, 21, 1229-1232.[8] Chaudhuri S.K., Lovley D.R., Nat. Biotechnol., 2003, 21, 1229-1232.

[9] Cao X., Huang X., Liang P., Xiao K., Zhou Y., Zhang X., Logan B.E., Environ. Sci. Technol.,[9] Cao X., Huang X., Liang P., Xiao K., Zhou Y., Zhang X., Logan B.E., Environ. Sci. Technol.,

2009, 43,7148-7152.2009, 43.7148-7152.

[10] Butler C.S., Clauwaert P., Green S.J., Verstraete W., Nerenberg R., Environ. Sci. Technol.,[10] Butler C.S., Clauwaert P., Green S.J., Verstraete W., Nerenberg R., Environ. Sci. Technol.,

2010, 44, 4685-4691.2010, 44, 4685-4691.

[11] Liang S., Wenzhao J., Changjun H., Yu L., Biosens. Bioelectron., 2011,26, 1788-1799.[11] Liang S., Wenzhao J., Changjun H., Yu L., Biosens. Bioelectron., 2011, 26, 1788-1799.

[12] Cheng K.Y., Cord-Ruwisch R., Ho G., Bioelectrochem. 2009, 74, 227- 231.[12] Cheng K.Y., Cord-Ruwisch R., Ho G., Bioelectrochem. 2009, 74, 227-231.

[13] Lovley D.R., Curr. Opin. Biotechnol. 2006, 17, 327-332.[13] Lovley D.R., Curr. Opin. Biotechnol. 2006, 17, 327-332.

[14] Borole A.P., Reguera G., Ringeisen B., Wang Z.W., Feng Y., Kim B.H., Energy Environ. Sci., 2011,4, 4813-4834.[14] Borole A.P., Reguera G., Ringeisen B., Wang Z.W., Feng Y., Kim B.H., Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4813-4834.

[15] Dulon S., Parot S., Delia M.-L., Bergel A., J. Appl. Electrochem., 2007, 37, 173 - 179.[15] Dulon S., Parot S., Delia M.-L., Bergel A., J. Appl. Electrochem., 2007, 37, 173-179.

[16] Ochoa T.J., Contreras C.A., Curr. Opin. Infect. Dis., 2011,24, 478-483.[16] Ochoa T.J., Contreras C.A., Curr. Opin. Infect. Dis., 2011,24,478-483.

[17] Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.C., Cummings J.H., Franck A., Gibson G.R., Isolauri E., Moreau M.C., Roberfroid M., Rowland L, British J. Nutr., 80, S147-S171.[17] Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A., Gibson GR, Isolauri E., Moreau MC, Roberfroid M., Rowland L, British J. Nutr., 80, S147- S171.

[18] Liu Y., Harnisch F., Fricke K., Schroder U., Climent V., Felin J.M., Biosens. Bioelectron., 2010, 25,2167-2171.[18] Liu Y., Harnisch F., Fricke K., Schroder U., Climent V., Felin J.M., Biosens. Bioelectron., 2010, 25, 2167-2171.

[19] Grass G., Rensing C., Solioz M., Appl. Environ. Microbiol., 2011,77, 1541-1547.[19] Grass G., Rensing C., Solioz M., Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, 1541-1547.

[20] Morones J.R., Elechiguerra J.L., Camacho A., Holt K., Kouri J.B., Ramirez J.T., Yacaman M.J., Nanotechnology, 2005, 16, 2346-2353.[20] Morones J.R., Elechiguerra J.L., Camacho A., Holt K., Kouri J.B., Ramirez J.T., Yacaman M.J., Nanotechnology, 2005, 16, 2346-2353.

[21] Fricker S.P., Transition Met. Chem., 1996, 21,377-383.[21] Fricker S.P., Transition Met. Chem., 1996, 21, 377-383.

[22] Kamiński K., Płonka M., Ciejka J., Szczubiałka K., Nowakowska M., Lorkowska B., Korbut R., Lach R., J. Med. Chem., 2011,54, 6586-6596.[22] Kamiński K., Płonka M., Ciejka J., Szczubiałka K., Nowakowska M., Lorkowska B., Korbut R., Lach R., J. Med. Chem., 2011, 54, 6586-6596.

Claims (8)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Sposób otrzymywania biofilmu bakterii na powierzchni metalicznej, znamienny tym, że:1. Method of obtaining bacterial biofilm on a metallic surface, characterized in that: a) powierzchnię wykonaną ze złota pokrywa się warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu), przy czym polikation wybiera się z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub polisacharyd modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym.a) the surface made of gold is covered with a layer of a permanently positively charged polymer (polycation), the polycation being selected from the group consisting of: a polymer obtained by polymerization of 3-methacryloylaminopropyltrimethylammonium chloride or a polysaccharide modified with glycidyltrimethylammonium chloride. b) uzyskaną w etapie a) zmodyfikowaną polikationem powierzchnię metaliczną zasiedla się bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG poprzez zanurzenie w zawiesinie tych bakterii.b) the polycation-modified metallic surface obtained in step a) is colonized with bacteria of the Lactobacillus rhamnosus GG strain by immersion in the suspension of these bacteria. PL 233 903 Β1PL 233 903 Β1 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) jako modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharyd stosuje się modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym dekstran lub pululan albo modyfikowaną chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym inulinę.2. The method according to p. A method as claimed in claim 1, characterized in that in step a) the polysaccharide modified with glycidyltrimethylammonium chloride is dextran or pullulan modified with glycidyltrimethylammonium chloride or inulin modified with glycidyltrimethylammonium chloride. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie a) warstwę polimeru nanosi się na powierzchnię metaliczną poprzez zanurzenie jej w roztworze zawierającym dodatnio naładowane cząsteczki polimeru (technika „layer by layer”).3. The method according to p. 3. Method according to claim 1, characterized in that in step a) the polymer layer is applied to the metallic surface by immersing it in a solution containing positively charged polymer particles ("layer by layer" technique). 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) powierzchnię zanurza się, korzystnie na około 2 h, w zawiesinie bakterii w medium hodowlanjm zwłaszcza MRS.4. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that in step b) the surface is immersed, preferably for about 2 h, in the bacterial suspension in the culture medium, especially MRS. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że w etapie b) zasiedloną powierzchnię dodatkowo pozostawia się w medium hodowlanym na czas od 24 do 72 godzin.5. The method according to p. The method of claim 1 or 4, characterized in that in step b) the populated area is additionally left in the growth medium for a period of 24 to 72 hours. 6. Bioelektroda, znamienna tym, że posiada powierzchnię wykonaną ze złota pokrytą warstwą polimeru o trwałym ładunku dodatnim (polikationu) zasiedloną bakteriami szczepu Lactobacillus rhamnosus GG, przy czym polikationem jest polimer wybrany z grupy obejmującej: polimer otrzymany poprzez polimeryzację chlorku 3-metakryloilaminopropylotrimetyloamoniowego lub polisacharyd modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym.6. Bioelectrode, characterized in that it has a surface made of gold covered with a layer of a polymer with a permanent positive charge (polycation) inhabited by bacteria of the Lactobacillus rhamnosus GG strain, the polycation being a polymer selected from the group consisting of: a polymer obtained by polymerization of 3-methacryloylaminoproponium chloride or polysimethylaccharide modified with glycidyltrimethylammonium chloride. 7. Bioelektroda według zastrz. 6, znamienna tym, że modyfikowanym chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym polisacharydem jest modyfikowany chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym dekstran lub pululan albo modyfikowana chlorkiem glicidylotrimetyloamoniowym inulina.7. Bioelectrode according to claim 6. The method of claim 6, wherein the modified glycidyl trimethyl ammonium polysaccharide is dextran or pullulan modified with glycidyl trimethyl ammonium chloride or inulin modified with glycidyl trimethyl ammonium chloride. 8. Bioelektroda według zastrz. 6, znamienna tym, że została otrzymana sposobem określonym w zastrz. 1-5.8. Bioelectrode according to claim 6, characterized in that it has been obtained by a method according to claim 6, 1-5.