PL227760B1 - Process for the preparation of modified oligonucleotides having at least one phosphodiester bond, wherein the non-bridging oxygen atom is replaced by a sulfur atom - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową lub stały nośnik, R¹ oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu, lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznaczają liczby 0-100, przy czym co najmniej 2 z nich są różne od zera, a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 4 w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, z wykorzystaniem mieszanej strategii oksatiafosfolanowo-amidofosforynowej.The subject of the invention is a process for the preparation of modified oligonucleotides containing at least one phosphodiester bond, in which the non-bridging oxygen atom is replaced by a sulfur atom of the general formula I, in which Q is a hydrogen atom or a 5'-hydroxyl function blocking group or a solid support, U is a hydrogen atom or a 3'-hydroxy blocking group or a solid support, R ¹ is hydrogen or an unsubstituted alkyl or aryl residue having 1 to 7 carbon atoms, X is sulfur and Y is oxygen, or X is oxygen and Y is sulfur, k, I and m represent the numbers 0-100, where at least 2 of them are different from zero, and the individual symbols B in the oligodeoxyribonucleotide chain are the same or different and represent the adenine, guanine, cytosine residue of the formulas 2, 3, 4 in which R ³ represents a hydrogen atom or an exoamine function blocking group, or B represents a thymine residue of the formula 5, with individual phosphorothioate atoms of phosphorus are the same or different configurations, or a mixture thereof, using a mixed oxathiaphospholate-phosphoramidite strategy.

Syntetyczne oligonukleotydy stanowią ważną grupę potencjalnych terapeutyków stosowanych w leczeniu chorób o podłożu genetycznym jak również wykazują działanie przeciwwirusowe (tzw. strategia antysensowa) [(a) S. Agrawal, Tibitech., 1996, 14, 376; (b) D. E. Szymkowski, Drug Discovery Today, 1996, 1,415]. Jednakże podatność niemodyfikowanych oligonukleotydów (PO-ODNs) na nukleolityczną degradację katalizowaną przez wewnątrzkomórkowe nukleazy, sprawia, że związki te nie mogą być wykorzystywane do tych celów. Rozwiązaniem problemu jest stabilizacja cząsteczki oligonukleotydu poprzez wprowadzenie trzech typów chemicznych modyfikacji: modyfikacje nukleozasady, modyfikacje reszty cukrowej (szczególnie pozycji 2'rybozy) oraz modyfikacje wiązania internukleotydowego [P. D. Cook, Anti-Cancer Drug Des., 1991, 6, 585]. Jako że niniejszy przedmiot wynalazku dotyczy modyfikacji wiązania internukleotydowego toteż poniższe wprowadzenie koncentruje się wyłącznie na tym typie modyfikacji.Synthetic oligonucleotides constitute an important group of potential therapeutics used in the treatment of genetic diseases as well as exhibit antiviral activity (so-called antisense strategy) [(a) S. Agrawal, Tibitech., 1996, 14, 376; (b) D. E. Szymkowski, Drug Discovery Today, 1996, 1,415]. However, the susceptibility of unmodified oligonucleotides (PO-ODNs) to nucleolytic degradation catalysed by intracellular nucleases makes them unusable for these purposes. The solution to the problem is the stabilization of the oligonucleotide molecule by introducing three types of chemical modifications: nucleobase modifications, modifications of the sugar residue (especially the 2'-ribose position) and modifications of the internucleotide bond [P. D. Cook, Anti-Cancer Drug Des., 1991, 6, 585]. As the present invention relates to modifications of an internucleotide bond, the following introduction focuses exclusively on this type of modification.

Spośród różnorodnych modyfikacji wiązania internukleotydowego najistotniejszą rolę odgrywa zastąpienie jednego z niemostkowych atomów tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym atomem siarki [F. Eckstein, Annu. Rev. Biochem., 1985, 54, 367]. Otrzymane w ten sposób tiofosforanowe oligonukleotydy (PS-ODNs), stanowią główną grupę tzw antysensowych oligonukleotydów pierwszej generacji.Among the various modifications of the internucleotide bond, the most important role is played by the replacement of one of the non-bridge oxygen atoms in the bond with a phosphodiester sulfur atom [F. Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 367]. The resulting phosphorothioate oligonucleotides (PS-ODNs) constitute the main group of the so-called first generation antisense oligonucleotides.

Chociaż tiofosforanowe oligonukleotydy wykazują wiele pozytywnych cech (odporność na degradację nukleolityczną, aktywowanie RNAzy H, korzystne własności farmakokinetyczne) [(a) J. M. Campbell, T. A. Bacon, and E. Wickstrom, J. Biochem. Biophys. Methods, 1990, 20, 259; (b) M. I. Phillips and Y. C. Zhang, Methods Enzymol., 2000, 313, 46-56 (c) S. T. Crooke, Methods Enzymol., 2000, 313, 3]. to niestety, nie są pozbawione działań niepożądanych takich jak niesekwencyjnie specyficzne wiązanie z białkami komórkowymi, zależna od stężenia kompetycyjna inhibicja różnych nukleaz i polimeraz [(a) S. T. Crooke Therapeutic Application of Oligonucleotides 1995, pp. 63 R. G. Landes Co., Austin, TX; (b) M. A. Guvakova, L. A. Yakubov, I. Vlodavsky, J. L. Tonkinson and C. A. Stein, J. Biol. Chem., 1995, 270, 2620; (c) D. A. Brown, S.-H. Kang, S. M. Gryaznov, L. DeDionisio, O. Heidenreich, S. Sullivan, X. Xu and M. I. Neerenberg, J. Biol. Chem., 1994, 43, 26801]. Jakkolwiek powody tego niespecyficznego oddziaływania z białkami są do tej pory niewyjaśnione to mogą one być toksyczne dla komórki. Jednakże, jak wykazały liczne badania, modyfikacja każdego wiązania internukleotydowego w cząsteczce oligonukleotydu nie jest konieczna do podwyższenia jego nukleolitycznej stabilności [(a) J. P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fishback and B. Froehler, NucleicAcids Res., 1991, 19, 747; (b) G. D. Hoke, K. Draper, S. M. Freier, C. Gonzalez, V. B. Driver, M. C. Zounes and D. J. Ecker, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 5743].Although the phosphorothioate oligonucleotides exhibit many positive traits (resistance to nucleolytic degradation, RNAse H activation, favorable pharmacokinetic properties) [(a) J. M. Campbell, T. A. Bacon, and E. Wickstrom, J. Biochem. Biophys. Methods 1990, 20, 259; (b) M. I. Phillips and Y. C. Zhang, Methods Enzymol., 2000, 313, 46-56 (c) S. T. Crooke, Methods Enzymol., 2000, 313, 3]. unfortunately, they are not without side effects such as non-sequentially specific binding to cellular proteins, concentration-dependent competitive inhibition of various nuclease and polymerases [(a) S. T. Crooke Therapeutic Application of Oligonucleotides 1995, pp. 63 R. G. Landes Co., Austin, TX; (b) M. A. Guvakova, L. A. Yakubov, I. Vlodavsky, J. L. Tonkinson and C. A. Stein, J. Biol. Chem., 1995, 270, 2620; (c) D. A. Brown, S.-H. Kang, S. M. Gryaznov, L. DeDionisio, O. Heidenreich, S. Sullivan, X. Xu and M. I. Neerenberg, J. Biol. Chem., 1994, 43, 26801]. Although the reasons for this nonspecific interaction with proteins are as yet unclear, they can be toxic to the cell. However, as numerous studies have shown, modification of each internucleotide linkage in an oligonucleotide molecule is not necessary to increase its nucleolytic stability [(a) JP Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fishback and B. Froehler, NucleicAcids Res., 1991 , 19, 747; (b) G. D. Hoke, K. Draper, S. M. Freier, C. Gonzalez, V. B. Driver, M. C. Zounes and D. J. Ecker, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 5743].

Tak zwane chimeryczne oligonukleotydy, które w jednej cząsteczce posiadają zarówno niemodyfikowane fosforanowe jak i tiofosforanowe wiązania internukleotydowe (PO/PS-ODNs) wykazują zwiększone powinowactwo do docelowej sekwencji wybranego mRNA i obniżone powinowactwo do białek. Ponadto PO/PS oligonukleotydy są znacząco bardziej odporne na działanie exo- i endonukleaz w porównaniu z niemodyfikowanymi PO oligonukleotydami [(a) W.-Y. Gao, F.-S. Han, Ch. Storm, W. Egan and Y.-Ch. Cheng, Mol. Pharmacol. 1992, 41, 223; (b) M. K. Ghosh, K. Ghosh and J. S. Cohen, Anti-Cancer Drug Des., 1993, 8, 15; (c) H. Soreq, D. Patinkin, E. Lev-Lehman, M. Grifman,So-called chimeric oligonucleotides which have both unmodified phosphate and phosphorothioate internucleotide linkages (PO / PS-ODNs) in one molecule show increased affinity for the target sequence of the selected mRNA and decreased affinity for proteins. Moreover, PO / PS oligonucleotides are significantly more resistant to exo- and endonucleases compared to unmodified PO oligonucleotides [(a) W.-Y. Gao, F.-S. Han, Ch. Storm, W. Egan and Y.-Ch. Cheng, Mol. Pharmacol. 1992, 41, 223; (b) M. K. Ghosh, K. Ghosh and J. S. Cohen, Anti-Cancer Drug Des., 1993, 8, 15; (c) H. Soreq, D. Patinkin, E. Lev-Lehman, M. Grifman,

D. Ginzberg, F. Eckstein, Zakut, H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91,7907].D. Ginzberg, F. Eckstein, Zakut, H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, 91, 7907].

Biorąc pod uwagę budowę chemiczną chimeryczne oligonukleotydy można podzielić na dwa typy. Pierwszy z nich posiada wiązania tiofosforanowe w naprzemiennych pozycjach, podczas gdy drugiWhen considering their chemical structure, chimeric oligonucleotides can be divided into two types. The former has phosphorothioate bonds in alternating positions, while the latter

PL 227 760 B1 zawiera połączone klastery oligofosforanów i tiofosforanów. W tym przypadku zakłada się, że tiofosforanowe fragmenty znajdujące się na końcach będą zapewniały większą nukleolityczną stabilność, podczas gdy centralny niemodyfikowany fragment fosforanowy zwiększa własności hybrydyzacyjne „chimerycznej” cząsteczki w porównaniu z PS-ODNs i ułatwia działanie RNAzy H na dupleks wytworzony z docelowym RNA [B. T. Monia, J. F. Johnston, H. Sasmor and L. L. Cummins, J. Biol. Chem. 1996, 271, 14533].The PL 227 760 B1 contains linked oligophosphate and phosphorothioate clusters. In this case, it is assumed that the phosphorothioate fragments located at the ends will provide greater nucleolytic stability, while the central unmodified phosphate fragment increases the hybridization properties of the "chimeric" molecule compared to PS-ODNs and facilitates the action of RNAse H on the duplex produced with the target RNA [ B. T. Monia, J. F. Johnston, H. Sasmor and L. L. Cummins, J. Biol. Chem. 1996, 271, 14533].

Rozważając biologiczną aktywność tiofosforanowych oligonukleotydów (PS ODNs) należy brać pod uwagę chiralność atomu fosforu, co sprawia, że tiofosforanowe analogi występują w postaci mieszaniny 2ⁿ (liczba chiralnych atomów fosforu) diastereoizomerów, gdyż standardowo PS-ODNs syntetyzowane są przy użyciu niestereoselektywnej metody amidofosforynowej [W.J. Stec, A. Wilk, Angew. Chem. 1994, 106, 747; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 709]. Badania dotyczące stereoselektywnej metody syntezy PS-ODNs były prowadzone w licznych laboratoriach i obecnie mogą one być otrzymane w oparciu o jedną z trzech możliwych metod syntezy: metodologię oksatiafosfolanową [(a) W.J. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, W.J. Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], metodę wykorzystującą jako monomery 3'-O-(3-N-acylo)oksazafosfolidynowe pochodne nukleozydów [A. Wilk, A. Grajkowski, L.R. Phillips, S.L. Beaucage J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2149] lub stereoselektywne monomery nukleozydowe pochodne 3'-O-oksazafosfolidynowe [N.Oka, T. Wada, K. Saigo J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307; N. oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031].When considering the biological activity of phosphorothioate oligonucleotides (PS ODNs), the chirality of the phosphorus atom should be taken into account, which makes the phosphorothioate analogs appear in the form of a mixture of 2 ⁿ (number of chiral phosphorus atoms) diastereoisomers, because standard PS-ODNs are synthesized using a non-stereoselective amide-selective method WJ Stec, A. Wilk, Angew. Chem. 1994, 106, 747; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 709]. Research on the stereoselective method of PS-ODNs synthesis was carried out in numerous laboratories and now they can be obtained on the basis of one of three possible synthesis methods: oxathiophospholate methodology [(a) WJ Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, WJ Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], the method using as monomers 3'-O- (3-N-acyl) oxazaphospholidine derivatives of nucleosides [A. Wilk, A. Grajkowski, LR Phillips, SL Beaucage J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2149] or stereoselective 3'-O-oxazaphospholidine derivative nucleoside monomers [N.Oka, T. Wada, K. Saigo J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307; N. eye, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031].

W literaturze nie opisano dotychczas prób syntezy fosforanowo/tiofosforanowych chimerycznych oligonukleotydów z wykorzystaniem mieszanej strategii oksatiafosfolanowo-amidofosforynowej. Stereozdefiniowane internukleotydowe wiązania tiofosforanowe w cząsteczce oligodeoksyrybonukleotydu w sposobie według wynalazku są tworzone w oparciu o metodologię oksatiafosfolanową [(a) W.J. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, W.J. Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], która jako monomeryczne nukleotydy wykorzystuje poszczególne diastereomery odpowiednio blokowanych 3'-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolano)nukleozydów. Natomiast fosforanowe segmenty oligonukleotydów są otrzymywane z wykorzystywaniem powszechnie stosowanej metodologii amidofosforynowej.So far, no attempts have been made in the literature to synthesize phosphate / phosphorothioate chimeric oligonucleotides using a mixed oxathiophospholate-phosphoramidite strategy. The stereodefined internucleotide phosphorothioate bonds in the oligodeoxyribonucleotide molecule in the method of the invention are formed based on the oxathiophospholate methodology [(a) of W.J. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, W.J. Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], which uses as monomeric nucleotides individual diastereomers of appropriately blocked 3'-O- (2-thio-1,3,2-oxathiaphospholano) nucleosides. In contrast, phosphate segments of oligonucleotides are obtained using the commonly used phosphoramidite methodology.

Połączenie tych dwóch metodologii nie było dotychczas możliwe, gdyż odczynnik (mieszanina jod/woda) standardowo stosowany do utlenienia przejściowo tworzącego się fosforynowego wiązania internukleotydowego utlenia również tiofosforanowe wiązanie internukleotydowe utworzone w czasie elongacji łańcucha oligonukleotydowego za pomocą metodologii oksatiafosfolanowej.The combination of these two methodologies has not been possible so far, because the reagent (iodine / water mixture) normally used to oxidize the transiently formed internucleotide phosphite bond also oxidizes the internucleotide phosphorothioate linkage formed during the elongation of the oligonucleotide chain using the oxathiophosphate methodology.

Rozwiązanie tego problemu znaleziono stosując sposób według wynalazku, polegający na zastosowaniu specjalnie dobranego odczynnika utleniającego, który generuje wiązanie PO i w obecności, którego wiązanie PS pozostaje stabilne.A solution to this problem was found by using the method according to the invention, which consists in the use of a specially selected oxidizing reagent which generates the PO bond and in the presence of which the PS bond remains stable.

Sposób wytwarzania fosforanowo/tiofosforanowych oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową lub stały nośnik, R¹ oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznaczają liczby 0-100, przy czym co najmniej dwie z nich są różne od zera a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 lub 4, w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, według wynalazku polega na tym, że kondensację prowadzi się osadzając na nośniku nukleozyd o wzorze 8a w którym Z¹ oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6a w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7a, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6a, w którym B i Z¹ mają wyżej podane znaczenie a R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7a, w którym B i Z¹ mają wyżej podane znaczenie, a R¹ i R² oznaczają niepodstawione reszty alkilowe lub arylowe zawierające od 1 do 7 atomów węgla, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnejA method for the preparation of phosphate / phosphorothioate oligonucleotides of general formula I, in which Q is a hydrogen atom or a 5'-hydroxyl function blocking group or a solid support, U is a hydrogen atom or a 3'-hydroxyl function blocking group or a solid support, R ¹ is a hydrogen atom or unsubstituted alkyl or aryl residue having 1 to 7 carbon atoms, X is sulfur and Y is oxygen or X is oxygen and Y is sulfur, k, I and m are 0-100, with at least two of of them are different from zero and the individual symbols B in the oligodeoxyribonucleotide chain are the same or different and represent an adenine, guanine, cytosine residue of the formulas 2, 3 or 4, where R ³ is a hydrogen atom or an exoamine function blocking group, or B is a residue thymines of formula 5, where the configurations of the individual phosphorothioate atoms are the same or different or a mixture thereof, according to the invention, the condensation is carried out depositing on the support a nucleoside of formula 8a in which Z ¹ is a blocking group for the 5'-hydroxyl function, B is as defined above and U is a chain extended solid support and is added sequentially, alternately in the presence of a basic catalyst such as 1,8- diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, nucleotide derivatives of formula 6a in the form of the same or different diastereomers or mixtures thereof, and with an acid catalyst such as tetrazole, nucleotide derivatives of formula 7a, where X or Y is sulfur nucleotide derivatives have the general formula 6a, where B and Z ¹ are as defined above and R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ are hydrogen, simple alkyl, cycloalkyl or aryl with 1 to 6 carbon atoms, and when X or Y represents an oxygen atom, the nucleotide derivatives have the general formula 7a, where B and Z ¹ are as defined above, and R ¹ and R ² are unsubstituted alkyl or aryl residues containing from 1 to 7 carbon atoms, each condensation step with using after chodna

PL 227 760 B1 nukleotydu o wzorze 7a, w którym B, Z¹, R¹, R² mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik albo kondensację prowadzi się stosując w pierwszym jej cyklu nukleozyd o wzorze 8b w którym Z² oznacza grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a Q oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5,4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6b w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7b, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6b, w którym B i Z² mają wyżej podane znaczenie a R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, a pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7b w którym B i Z² mają wyżej podane znaczenie, a R¹ i R² oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z², B, R¹, R² mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik.For nucleotide of formula 7a, in which B, Z ¹ , R ¹ , R ² are as defined above, an oxidizing reagent selected from the group of organic peroxides and hydroperoxides, especially silylated tert-butyl hydroperoxide, is used and each reaction cycle is repeated, until the oligodeoxyribonucleotide with the desired sequence and the desired configurations at the internucleotide phosphorus phosphorus atom is produced, and after the synthesis is completed, the blocking groups are optionally removed from the obtained product, and the carrier or condensation is carried out in the first cycle using a nucleoside of formula 8b in which Z ² is a blocking group the 3'-hydroxyl function, B is as defined above and Q is a chain extended solid support and is added sequentially, alternately in the presence of a basic catalyst such as 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, nucleotide derivatives of formula 6b in the form of the same or different diastereomers or mixtures thereof, and in the presence of an acid catalyst ego as tetrazole nucleotide derivatives of formula 7b, where when X or Y is a sulfur atom the nucleotide derivatives have the general formula 6b, in which B and Z ² are as defined above and R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ represent a hydrogen atom , straight alkyl, cycloalkyl or aryl with 1 to 6 carbon atoms, and when X or Y is oxygen and the nucleotide derivatives have the general formula 7b where B and Z ² are as defined above, and R ¹ and R ² are alkyl residues or aryl, wherein after each condensation step using a nucleotide derivative of formula 7b, in which Z ² , B, R ¹ , R ² are as defined above, an oxidizing agent selected from the group of organic peroxides and hydroperoxides, especially silylated tert-hydroperoxide, is used. butyl and each reaction cycle is repeated until the oligodeoxyribonucleotide is produced with the desired sequence and configurations at the internucleotide phosphorothioate atom, and after the end of the synthesis, the groups are optionally removed from the obtained product locking and carrier.

Równocześnie z odszczepieniem oligodeoksyrybonukleotydu od stałego nośnika usuwa się grupy blokujące funkcję egzoaminowe, z wytworzeniem związku o wzorze 1, w którym Q=H, U=H, B ma wyżej podane znaczenie, k, I, m, mają wyżej podane znaczenie a R=H.Simultaneously with the cleavage of the oligodeoxyribonucleotide from the solid support, the groups blocking the exoamine function are removed, giving a compound of formula 1, where Q = H, U = H, B is as defined above, k, I, m are as defined above and R = H.

Do zabezpieczenia grup 5'-hydroksylowych stosuje się znane grupy blokujące, korzystnie acylową, benzylową, trifenylometylową, trialkilosililową, 4-metoksytrifenylometylową, a zwłaszcza 4,4-dimetoksytrifenylometylową.For the protection of the 5'-hydroxyl groups, known blocking groups are used, preferably acyl, benzyl, triphenylmethyl, trialkylsilyl, 4-methoxytriphenylmethyl, in particular 4,4-dimethoxytriphenylmethyl.

Do ochrony grup egzoaminowych stosuje się korzystnie, grupę fenoksyacetylową, izopropoksyacetylową, izobutyrylową, benzoilową, (dialkiloamino)metylenową, (dialkiloamino)etylidenową.For the protection of exoamino groups, preferably phenoxyacetyl, isopropoxyacetyl, isobutyryl, benzoyl, (dialkylamino) methylene, (dialkylamino) ethylidene groups are used.

Po każdym cyklu kondensacji usuwa się grupy blokujące funkcję 5'-hydroksylową, aby przyłączyć następny nukleotyd.After each condensation cycle, groups that block the 5'-hydroxyl function are removed to add the next nucleotide.

Reakcję prowadzi się w bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu, chlorku metylenu, N,N-dimetyloformamidzie.The reaction is carried out in an anhydrous organic solvent, preferably acetonitrile, methylene chloride, N, N-dimethylformamide.

Jako katalizator zasadowy reakcji tworzenia wiązania internukleotydowego stosuje się nienukleofilowe alkoholany, korzystnie tert-butanolan potasowy oraz 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en.Non-nucleophilic alkoxides, preferably potassium tert-butoxide, and 1-methylimidazole, 4-dimethylaminopyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene are used as the basic catalyst for the internucleotide bond formation reaction.

Jako katalizator kwasowy reakcji tworzenia wiązania internukleotydowego korzystnie stosuje się takie związki jak triazol, tetrazol.Compounds such as triazole, tetrazole are preferably used as the acid catalyst for the internucleotide bond formation reaction.

Jako odczynnik utleniający, który generuje internukleotydowe wiązanie fosforanowe (P=O) stosuje się nadtlenki i wodoronadtlenki organiczne, korzystnie sililowany wodoronadtlenek t-butylowy (t-butyloperoksytrimetylosilan).Organic peroxides and hydroperoxides, preferably silylated t-butyl hydroperoxide (t-butylperoxytrimethylsilane), are used as the oxidizing agent that generates the internucleotide phosphate bond (P = O).

Jak już wspomniano, zastosowanie sposobu według wynalazku zapewnia stereospecyficzność syntezy tiofosforanowych (P=S) segmentów chimerycznego oligodeoksyrybonukleotydu na stałym nośniku.As already mentioned, the use of the method according to the invention ensures the stereospecificity of the synthesis of phosphorothioate (P = S) segments of a chimeric oligodeoxyribonucleotide on a solid support.

Poniżej przedstawiono szczególnie korzystny przebieg procedury według wynalazku.A particularly advantageous procedure according to the invention is illustrated below.

W związku o wzorze 8a, w którym B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, Z¹ oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem, odblokowuje się grupę 5'-hydroksylową na drodze kwaśnej hydrolizy i poddaje się kondensacji w obecności katalizatora zasadowego takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, ze związkiem o wzorze ogólnym 6a, w którym B, Z¹ mają wyżej podane znaczenie, a R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, U mają wyżej podane znaczenie, Q=Z¹, które ma wyżej podane znaczenie, R¹ oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki, a k=0, l=0, m=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i przyłącza się, w obecności katalizatora zasadowego takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en kolejny związek o wzorze 6a, w którymIn a compound of formula 8a, in which B is an adenine, guanine, cytosine residue of the formulas 2, 3, 4, in which R ³ is a hydrogen atom or an exoamine function blocking group, or B is a thymine residue of formula 5, Z ¹ is a group blocking the 5'-hydroxyl function, U is a chain extended solid support, the 5'-hydroxyl group is deprotected by acidic hydrolysis and condensed in the presence of a basic catalyst such as 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7- en, with a compound of general formula 6a, in which B, Z ¹ are as defined above, and R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ are hydrogen, simple alkyl, cycloalkyl or aryl with 1 to 6 carbon atoms, giving a compound of formula I in which B, U are as defined above, Q = Z ¹ as defined above, R ¹ is hydrogen, X is sulfur, and k = 0.1 = 0, m = 1. The 5'-hydroxyl function is then deblocked by acidic hydrolysis and a further compound of formula 6a is attached in the presence of a basic catalyst such as 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene

PL 227 760 B1PL 227 760 B1

B, Z¹, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ mają wyżej podane znaczenie, powtarzając pierwszy cykl reakcji m-razy, aż do wytworzenia o żądanej sekwencji i o żądanej konfiguracji przy internukleotydowym atomie fosforu oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q i U mają wyżej podane znaczenie, R¹ oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki a k=0 i l=0. Następnie przyłącza się w obecności katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol związek o wzorze 7a, w którym B ma wyżej podane znaczenie, Z¹ jest grupą blokującą, a R¹, R² oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, po czym do kolumienki reakcyjnej wprowadza się odczynnik utleniający otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, Q i U mają wyżej podane znaczenie, X ma wyżej podane znaczenie, R¹ ma wyżej podane znaczenie, Y oznacza atom tlenu, m ma wyżej podane znaczenie a k=0, 1=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i powtarza się ostatni cykl reakcji l-razy aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q, U, R¹ X i Y mają wyżej podane znaczenie, a k=0. Następnie po odblokowaniu 5'-hydroksylowej funkcji na drodze kwaśnej hydrolizy w obecności katalizatora zasadowego przyłącza się związek o wzorze 6a, w którym B, Z¹, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ mają wyżej podane znaczenie, otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, Q, U, R¹, X i Y mają wyżej podane znaczenie,B, Z ¹ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ have the meaning given above, repeating the first reaction cycle m-times until an oligodeoxyribonucleotide of formula 1 with the desired sequence and configuration is produced at the internucleotide phosphorus atom, in which B , Q and U are as defined above, R ¹ is hydrogen, X is sulfur and k = 0 and l = 0. Subsequently, in the presence of an acid catalyst, such as tetrazole, a compound of formula 7a, in which B is as defined above, Z ¹ is a blocking group, and R ¹ , R ² represent alkyl or aryl residues, and an oxidizing reagent is introduced into the reaction column. to give the compound of formula I in which B, Q and U are as defined above, X is as defined above, R ¹ is as defined above, Y is oxygen, m is as defined above and k = 0, 1 = 1. The 5'-hydroxy function is then deblocked by acidic hydrolysis and the last reaction cycle is repeated 1-times until an oligodeoxyribonucleotide of formula 1 is formed, wherein B, Q, U, R ^1, X and Y are as defined above, k = 0. Then, after deprotection of the 5'-hydroxyl function by acidic hydrolysis in the presence of a basic catalyst, a compound of formula 6a is attached, in which B, Z ¹ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ are as defined above, thus obtaining a compound of formula 1, in which B, Q, U, R ^1, X and Y are as defined above,

I i m mają wyżej podane znaczenie a k=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową na drodze kwaśnej hydrolizy i powtarza się ostatni cykl reakcji k-razy aż do wytworzenia o żądanej sekwencji i o żądanej konfiguracji przy internukleotydowym atomie fosforu oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q, U, R¹ X i Y mają wyżej podane znaczenie, k, I, m mają wyżej podane znaczenie. Odcięcie oligonukleotydu i usunięcie internukleotydowych grup ochronnych zachodzi w środowisku zasadowym i prowadzi do wytworzenia związku o wzorze 1, w którym X i Y mają wyżej podane znaczenie, B oznacza reszty niechronionych na grupach egzoaminowych nukleozasad takich jak adenina, guanina, cytozyna, tymina, Q, U, R¹ oznaczają atom wodoru.And they have the meaning given above, ak = 1. Then the 5'-hydroxyl function is deprotected by acidic hydrolysis and the last reaction cycle is repeated k-times until an oligodeoxyribonucleotide of formula 1 is produced with the desired sequence and configuration at the internucleotide phosphorus atom, where B, Q, U, R ¹ X and Y are as defined above, k, I, m are as defined above. Cleavage of the oligonucleotide and removal of internucleotide protecting groups takes place in an alkaline environment and leads to the formation of a compound of formula 1, where X and Y are as defined above, B represents residues unprotected on exoamine groups of nucleobases such as adenine, guanine, cytosine, thymine, Q U, R ¹ are hydrogen.

Wynalazek ilustrują niżej podane przykłady:The following examples illustrate the invention:

P r z y k ł a d IP r z k ł a d I

Synteza fragmentu o sekwencji TpsTpsTpsTpoTpoTpoTpsTpsTpsTohSynthesis of the fragment with the sequence TpsTpsTpsTpoTpoTpoTpsTpsTpsToh

A. Przez kolumienkę o pojemności 150 pl, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-0-{4,4’-dimetoksytrifenylometylo) tymidyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.A. 2 x 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was passed through a 150 µl column, protected on both sides with filters, containing 1 μΜ 5'-O- {4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) thymidine bound to a solid support, for 1 min, washed with 1 ml of methylene chloride and then 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) was dried under argon and then under high vacuum.

B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μΜ 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer mniej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.B. 150 μl of acetonitrile solution containing 20 μΜ 5'-O- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -thymidyl-3'-O- (2-thio-1,3,2-oxathiaphospholane) (diastereomer less mobile) and 50 µM 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -undec-7-ene. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum, then 150 μl of A + B (1: 1) solution were passed through the column for 1 min [A-12% solution acetic anhydride in a mixture of pyridine-THF (10: 8), B-7g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. Then 2 x 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was introduced to depressurize the 5'-hydroxyl function. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

C. Procedurę opisaną w punkcie B powtórzono dwukrotnie.C. The procedure described in point B was repeated twice.

D. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4,-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu i 20 μΜ tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono x 5 μl 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcjiD. Then 150 μL of acetonitrile solution containing 20 μM 5'-O- (4,4, -dimethoxytriphenylmethyl) -thymidyl-3'-O- (O-3-cyanoethyl-N, N-diisopropyl) phosphoramidite and 20 μM was added to the column. μΜ tetrazole. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under high vacuum. Then 150 µl of A + B (1: 1) solution was passed through the column for 1 min [A-12% acetic anhydride in pyridine-THF (10: 8), B-7 g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. 150 μl of a solution containing 50 μM of silylated tert-butyl hydroperoxide was introduced into the column prepared in this way. The reaction was carried out for 30 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), and then x 5 μl of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was introduced to unlock the function.

PL 227 760 B1PL 227 760 B1

5’-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.5′-hydroxy. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

E. Procedurę opisaną w punkcie D powtórzono dwukrotnieE. The procedure described in point D was repeated twice

F. Następnie procedurę opisaną w punkcie B powtórzono trzykrotnieF. Then the procedure described in point B was repeated three times

G. Do kolumienki wprowadzono 150 pl 10% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 1 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDI-MS [(M-1)m/z 3075; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].G. 150 µl of a 10% solution of piperidine in CH 3 CN was introduced into the column, then after 1 hr. the solution was removed and the column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), then the content of the column was poured into a vial containing 1 ml of 25% aqueous ammonia solution to cut the oligonucleotide from the solid support. After 1 hour the solution was filtered and the bed was washed with ammonia, then the combined solutions were concentrated under high vacuum and analyzed by MALDI-MS [(M-1) m / z 3075; M-16 peak absent which indicates the lack of oxidation of the P = S bond].

P r z y k ł a d IIP r z x l a d II

T poT poT poT poT pod(ApsApsApsAoH)T poT poT poT poT pod (ApsApsApsAoH)

A. Przez kolumienkę o pojemności 150 pl, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-O-(4,4,-dimetoksytrifenylometylo)-N⁶-benzoilo-deoksyadenozyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.A. Through a 150 µl column, protected on both sides with filters, containing 1 µΜ 5'-O- (4,4, -dimethoxytriphenylmethyl) -N ⁶ -benzoyl-deoxyadenosine bound to a solid support, 2 x 5 ml of 2% were passed through dichloroacetic acid in methylene chloride for 1 min, washed with 1 ml of methylene chloride followed by 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-0-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N⁶-benzoilodeoksyadenozyno-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer mniej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.B. 150 μl of acetonitrile solution containing 20 μM 5'-0- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -N ⁶ -benzoyl-deoxyadenosine-3'-O- (2-thio-1,3,2-oxathiaphospholate) were introduced into the column prepared in this way. ) (less mobile diastereomer) and 50 µM 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -undec-7-ene. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum, then 150 μl of A + B (1: 1) solution were passed through the column for min [A-12% anhydride solution acetic acid in a pyridine-THF mixture (10: 8), B-7 g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. Then, x 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was introduced to depressurize the 5-hydroxyl function. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), dried under argon and then under high vacuum.

C. Procedurę opisaną w punkcie B powtórzono dwukrotnie.C. The procedure described in point B was repeated twice.

D. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu 20 μM tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.D. Then 150 μl of acetonitrile solution containing 20 μM 5'-O- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -thymidyl-3'-O- (O-3-cyanoethyl-N, N-diisopropyl) phosphoramidite 20 μM was introduced into the column. tetrazole. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under high vacuum. Then 150 µl of A + B (1: 1) solution was passed through the column for 1 min [A-12% acetic anhydride in pyridine-THF (10: 8), B-7 g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. 150 μl of a solution containing 50 μM of silylated tert-butyl hydroperoxide was introduced into the column prepared in this way. The reaction was carried out for 30 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and then charged with 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride to depressurize the 5'-hydroxyl function. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

E. Procedurę opisaną w punkcie D powtórzono czterokrotnieE. The procedure described in point D was repeated four times

F. Następnie procedurę opisaną w punkcie B powtórzono trzykrotnieF. Then the procedure described in point B was repeated three times

G. Do kolumienki wprowadzono 150 μl 10% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika i odblokowania funkcji egzoaminowych zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 24 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDI-MS [(M-1)m/z 2758.2; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].G. 150 μl of a 10% solution of piperidine in CH3CN were introduced into the column, then after 1 hour. the solution was removed and the column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), then in order to cut the oligonucleotide from the solid support and deprotect the exoamine functions, the content of the column was poured into a vial containing 1 ml of 25% aqueous ammonia solution. After 24 hours the solution was filtered and the bed was washed with ammonia, then the combined solutions were concentrated under high vacuum and analyzed by MALDI-MS [(M-1) m / z 2758.2; M-16 peak absent which indicates the lack of oxidation of the P = S bond].

PL 227 760 B1PL 227 760 B1

P r z y k ł a d III d(ApoCps ApoCpsApoCpsApoCpsCoh)P r z k ł a d III d (ApoCps ApoCpsApoCpsApoCpsCoh)

A. Przez kolumienkę o pojemności 150 μ|, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N⁴-benzoilodeoksycytydyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.A. Through a 150 μl column, protected on both sides with filters, containing 1 μΜ 5'-O- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -N ^4- benzoyl-deoxycytidine bound to a solid support, 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride for 1 min, washed with 1 ml of methylene chloride and then with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N⁴-benzoilodeoksycytydyno-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer bardziej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.B. 150 μl of acetonitrile solution containing 20 μM 5'-O- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -N ⁴ -benzoyl-deoxycytidine-3'-O- (2-thio-1,3,2-oxathiaphospholate) were added to the column prepared in this way. ) (more mobile diastereomer) and 50 µM 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -undec-7-ene. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum, then 150 μl of A + B (1: 1) solution were passed through the column for 1 min [A-12% solution acetic anhydride in a mixture of pyridine-THF (10: 8), B-7 g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. Then 2 x 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was introduced to depressurize the 5'-hydroxyl function. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

C. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 20 μΜ 5'-O-(4,4'-dimetoksytrifenylometylo)-N⁶-benzoilodeoksyadenozyno-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu i 20 μΜ tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min. [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.C. Then 150 μl of a solution containing 20 μΜ 5'-O- (4,4'-dimethoxytriphenylmethyl) -N ⁶ -benzoylodeoxyadenosine-3'-O- (O-3-cyanoethyl-N, N-diisopropyl) phosphoramidite was introduced into the column. and 20 μΜ of tetrazole. The reaction was carried out for 15 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under high vacuum. Then 150 μl of the A + B solution (1: 1) was passed through the column for 1 min. [A-12% acetic anhydride solution in a pyridine-THF mixture (10: 8), B-7g DMAP in 100 ml THF]. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum. 150 μl of a solution containing 50 μM of silylated tert-butyl hydroperoxide was introduced into the column prepared in this way. The reaction was carried out for 30 minutes at room temperature. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), and then 2 x 5 ml of 2% dichloroacetic acid in methylene chloride was introduced to depressurize the 5'-hydroxyl function. The column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1) and dried under argon and then under high vacuum.

D. Powtórzono procedurę opisaną w punkcie B.D. The procedure described in point B was repeated.

E. Powtórzono procedurę opisaną w punkcie C.E. The procedure described in point C was repeated.

F. Procedury opisane w punktach B i C powtarzano dwukrotnie.F. The procedures described in steps B and C were repeated twice.

G. Do kolumienki wprowadzono 150 μl 1.0% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika i odblokowania funkcji egzoaminowych zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 24 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDIMS [(M-1)m/z 2699.1; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].G. 150 μl of a 1.0% solution of piperidine in CH3CN were introduced into the column, then after 1 hour. the solution was removed and the column was washed with 8 ml of acetonitrile-methylene chloride (1: 1), then in order to cut the oligonucleotide from the solid support and deprotect the exoamine functions, the content of the column was poured into a vial containing 1 ml of 25% aqueous ammonia solution. After 24 hours the solution was filtered and the bed was washed with ammonia, then the combined solutions were concentrated under high vacuum and analyzed by MALDIMS [(M-1) m / z 2699.1; M-16 peak absent which indicates the lack of oxidation of the P = S bond].

Sposobem analogicznym do opisanego w przykładach l-III otrzymano następujące fragmenty:The following fragments were obtained in a manner analogous to that described in Examples 1-3:

d (GpoGpoApoApoApsAoh) d(GpoGpoApoApSApSAoH) d(ApsApsAps)T poT poT poT poT pod(ApsApsApsAoH)d (GpoGpoApoApoApsAoh) d (GpoGpoApoApSApSAoH) d (ApsApsAps) T poT poT poT poT under (ApsApsApsAoH)

T poT poT poT poT Pod(CpsCpsCpsCoH) d(ApsApsAps)T poT poT poT poT pod (ApsApsApsAoh)T poT poT poT poT Pod (CpsCpsCpsCoH) d (ApsApsAps) T poT poT poT poT pod (ApsApsApsAoh)

Claims (2)

1. Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki, o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcjęA method for the preparation of modified oligonucleotides containing at least one phosphodiester bond, in which the non-bridging oxygen atom is replaced by a sulfur atom, of the general formula, in which Q is a hydrogen atom or a function-blocking group PL 227 760 B1PL 227 760 B1 5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3’-hydroksylową lub stały nośnik, R¹ oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznacza liczbę 0-100, przy czym co najmniej dwie z nich są różne od zera a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 lub 4, w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, znamienny tym, że kondensację prowadzi się osadzając na nośniku nukleozyd o wzorze 8a w którym Z¹ oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6a w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7a, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6a, w którym B i Z¹ mają wyżej podane znaczenie a R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7a, w którym B i Z¹ mają wyżej podane znaczenie, a R¹ i R² oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7a, w którym B, Z¹, R¹, R² mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy (tert-butyloperoksytrimetylosilan) i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik albo kondensację prowadzi się stosując w pierwszym jej cyklu nukleozyd o wzorze 8b w którym Z² oznacza grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a Q oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6b w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7b, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6b, w którym B i Z² mają wyżej podane znaczenie a R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, a pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7b w którym B i Z² mają wyżej podane znaczenie, a R¹ i R² oznaczają niepodstawione reszty alkilowe lub arylowe zawierające od 1 do 7 atomów węgla, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z², B, R¹, R² mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik.5'-hydroxyl or solid carrier, U is hydrogen or a blocking function of the 3'-hydroxyl or solid carrier, R ¹ is hydrogen or an unsubstituted alkyl or aryl group containing 1 to 7 carbon atoms, X is sulfur and Y is oxygen atom or X is oxygen atom and Y is sulfur atom, k, I and m is the number 0-100, with at least two of them being different from zero and individual symbols B in the oligodeoxyribonucleotide chain are the same or different and represent the adenine residue , guanine, cytosines of the formulas 2, 3 or 4, in which R ³ is a hydrogen atom or an exoamine function blocking group, or B is a thymine residue of the formula 5, where the configurations of the individual phosphorothioate atoms are the same or different or a mixture thereof , characterized in that the condensation is carried out by depositing a nucleoside of formula 8a on the support in which Z ¹ is a group blocking the 5'-hydroxyl function, B is as defined above, and U is a solid support with p and added sequentially, alternately in the presence of a basic catalyst such as 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, nucleotide derivatives of formula 6a in the form of the same or different diastereomers or mixtures thereof, and in the presence of an acid catalyst such as tetrazole nucleotide derivatives of formula 7a, where when X or Y is a sulfur atom the nucleotide derivatives have the general formula 6a, in which B and Z ¹ are as defined above and R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ represent a hydrogen atom , straight alkyl, cycloalkyl or aryl of 1 to 6 carbon atoms, and when X or Y is oxygen, the nucleotide derivatives have the general formula 7a, where B and Z ¹ are as defined above, and R ¹ and R ² are alkyl residues or aryl, wherein after each condensation step using a nucleotide derivative of formula 7a, in which B, Z ¹ , R ¹ , R ² are as defined above, an oxidizing agent selected from the group of organic peroxides and hydroperoxides, especially silylated hydroperoxides, is used tert-butyl oxide (tert-butylperoxytrimethylsilane) and each reaction cycle is repeated until an oligodeoxyribonucleotide with the desired sequence and configuration at the internucleotide phosphorothioate atom is produced, and after the synthesis is completed, the obtained product is optionally removed, the blocking groups are removed or the carrier is removed or condensation is removed. using in its first cycle a nucleoside of formula 8b in which Z ² is a group blocking the 3'-hydroxyl function, B is as defined above, and Q is a chain extended solid support and is added successively, alternately in the presence of a basic catalyst such as 1, 8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene, nucleotide derivatives of formula 6b in the form of the same or different diastereomers or mixtures thereof, and with an acid catalyst such as tetrazole nucleotide derivatives of formula 7b, where when X or Y is the sulfur atom and the nucleotide derivatives have the general formula 6b, in which B and Z ² are as defined above and R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ are hydrogen, simple alkyl, cycloalkyl or aryl with 1 to 6 carbon atoms, and when X or Y is oxygen and the nucleotide derivatives have the general formula 7b where B and Z ² have as defined above, and R ¹ and R ² are unsubstituted alkyl or aryl residues containing from 1 to 7 carbon atoms, each condensation step using a nucleotide derivative of formula 7b, wherein Z ² , B, R ¹ , R ² are as defined above, an oxidizing reagent selected from the group of organic peroxides and hydroperoxides, especially silylated tert-butyl hydroperoxide, is used, and each reaction cycle is repeated until an oligodeoxyribonucleotide is produced with the desired sequence and configuration at the internucleotide phosphorothioate from the obtained product, optionally the blocking groups and the carrier are removed. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7a, w którym, Z¹ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, a R¹, R⁴ oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, lub po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z² oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, a R¹, R² oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R³ oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5 stosuje się odczynnik utleniający z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, korzystnie sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy (tert-butyloperoksytrimetylosilan).2. The method according to p. A process according to claim 1, characterized in that after each condensation step using a nucleotide derivative of formula 7a, in which, Z ¹ represents a hydrogen atom or a group blocking the 5'-hydroxyl function, and R ¹ , R ⁴ represent alkyl or aryl residues, B represents the residue adenine, guanine, cytosine of the formulas 2, 3, 4, in which R ³ is a hydrogen atom or an exoamine function blocking group, or B is a thymine residue of the formula 5, or after each condensation step using a nucleotide derivative of formula 7b, in which Z ² represents a hydrogen atom or a group blocking the 5'-hydroxyl function, and R ¹ , R ² represent alkyl or aryl residues, B represents an adenine, guanine, cytosine residue of the formulas 2, 3, 4, in which R ³ represents a hydrogen atom or a group or B is a thymine residue of the formula V, an oxidizing agent from the group of organic peroxides and hydroperoxides, preferably silylated tert-butyl hydroperoxide (tert-butylperoxytrimethylsilane) is used. PL 227 760 Β1PL 227 760 Β1