PL226895B1 - Zastosowanie odtłuszczonego ekstraktu zwychmielin doleczenia lub prolaktyki cukrzycy oraz srodek farmaceutyczny dotakiego zastosowania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie odtłuszczonego ekstraktu z wychmielin do leczenia lub profilaktyki cukrzycy u ludzi lub zwierząt oraz środek farmaceutyczny do takiego zastosowania.

Pozytywny wpływ związków polifenolowych pochodzenia roślinnego na układ sercowonaczyniowy opisywany jest w licznych pracach przeglądowych (Janeczko, 2004; Peluso, 2006; Rimbach i wsp., 2007; Stangl i wsp., 2007). Różnorodne właściwości chemiczne, fizyczne i biologiczne oraz ich wielokierunkowa aktywność biologiczna jest wynikiem bardzo zróżnicowanej struktury oraz niejednorodności chemicznej związków polifenolowych. Związki te wykazują aktywność antyoksydacyjną, przeciwzapalną, przeciwalergiczną, antyhepatotoksyczną, antymutagenną, przeciwnowotworową i przeciwmiażdżycową (Williamson i Manach, 2005; Manach i wsp., 2005). Ze względu na wielokierunkowe ochronne działanie polifenoli wobec układu krążenia, coraz częściej rozpatrywane jest przygotowanie nowej profilaktyki i strategii leczenia w chorobach sercowo-naczyniowych z zastosowaniem polifenoli roślinnych (Peluso, 2006). Flawonoidy są z powodzeniem wykorzystywane w chorobach układu krążenia, powszechnie znane są wieloskładnikowe preparaty, takie jak rutinoskorbin czy detralex (Janeczko, 2004).

Wśród polifenoli wykazujących bioaktywność wymienia się prenyloflawonoidy, obecne w ekstraktach z szyszek chmielu, a w szczególności chalkony, np. ksantohumol i desmetyloksantohumol. Desmetyloksantohumol jest prekursorem 8-prenyloaringeniny, wykazującej działanie estrogenne silniejsze od innych znanych fitoestrogenów (Milligen et al., 1999). Ksantohumol jest natomiast prekursorem izoksantohumolu, który wykazuje działanie antyproliferacyjne o niezwykle szerokim spektrum mechanizmów inhibicji na etapie inicjacji, promocji i progresji karcynogenezy (Gerhauser et al. 2002).

Wykorzystanie aktywności biologicznej chalkonów zawartych w szyszkach chmielu stało się przedmiotem badań, przy czym badania te nakierowane są na pozyskanie sposobów umożliwiających zwiększenie ilości prenyloflawonoidów zawartych w ekstraktach z chmielu lub opracowanie metod pozwalających na uzyskiwanie określonych kompozycji określonych prenyloflawonoidów wykazujących pożądane właściwości.

Zgłoszenie patentowe EP1543834 ujawnia sposób wytwarzania ekstraktów z chmielu o zwiększonej ilości prenyloflawonoidów lub ich pochodnych posiadających aktywność estrogenną oraz antyproliferacyjną. W ujawnionym sposobie produkt z chmielu poddaje się reakcji izomeryzacji w obecności zasady, co sprzyja zwiększeniu ilości 8-prenylonaringeniny w produkcie, zapewniając wielokrotne zwiększenie aktywności estrogennej preparatu w ten sposób otrzymanego. Jednocześnie, ze względu na proliferacyjne właściwości 8-prenylonaringeniny, zgłaszający podkreślili znaczenie odpowiedniego nadmiaru ksantohumolu w kompozycji uzyskanej ujawnionym sposobem.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe US2005/0042318 ujawnia ekstrakt z chmielu zawierający zwiększoną ilość prenylochalkonów, znajdujący zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce chorób związanych z deficytem estrogenu.

Sposób uzyskiwania związków aktywnych o właściwościach estrogennych z szyszek chmielu został ujawniony w WO83.00701 A1. Ekstrakt z użyciem dwutlenku węgla z szyszek chmielu traktuje się wodą jako czynnikiem azeotropującym, a następnie estrogenne związki aktywne uzyskuje się poprzez ekstrakcję z użyciem eteru lub metod chromatograficznych.

Niemieckie zgłoszenie patentowe DE 199 39 350 A1 ujawnia ekstrakt z chmielu cechujący się zwiększoną zawartością ksantohumolu, ilość w ekstrakcie prenylonaringeniny jest nieokreślona. Wskazane zastosowanie ujawnionego ekstraktu to dodatek do piwa i soków owocowych.

Sposoby ekstrakcji wychmielin, jak również główne składniki uzyskane w tych ekstraktach znane są również z opisów patentowych WO 2009/023710, US2009/291071, WO 2005/058336 oraz publikacji GUO-QING HE ET ALL: „Optimisation of conditions of supercritical fluid extraction of flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) oraz Mirosława Anioła et al.: „Extraction of Spent Hops Using Organic Solvents”. Wymienione publikacje nakierowane są na sposoby zapewniające ekstrakty wzbogacone w związki lipofilne w postaci prenylowanych flawonoidów.

Zgłoszenie międzynarodowe WO2009/023710 ujawnia ekstrakt z chmielu wzbogacony w ksantohumol i izoksantohumol do leczenia miażdżycy i choroby niedokrwiennej serca. W kontekście leczenia miażdżycy również publikacja US 2009/291071 wskazuje na korzystne działanie kompozycji zawierających znaczące ilości prenylowanych flawonoidów. Obie publikacje wyraźnie wskazują na korzyści wynikające ze stosowania ekstraktów bogatych w lipofilne związki w postaci prenylowanych flawonoidów.

PL 226 895 B1

Chociaż ujawnienia ze stanu techniki wskazują na korzystne właściwości prenyloflawonoidów zawartych w ekstraktach z chmielu, to jednocześnie ze stanu techniki wynika, iż znane ekstrakty z chmielu, ze względu na proliferacyjne właściwości 8-prenylonaringeniny, muszą posiadać odpowiedni składnik antyproliferacyjny, np. nadmiar ksantohumolu. Jednocześnie zawartość w ekstrakcie związków lipofilnych utrudnia liofilizację preparatów tego typu.

Procesy związane z aktywacją płytek krwi odgrywają duże znaczenie u chorych z cukrzycą. Powikłania sercowo-naczyniowe są najistotniejszą przyczyną zwiększonej śmiertelności pacjentów z cukrzycą. Istnieje stałe zapotrzebowanie na nowe preparaty wykazujące działanie ochronne na układ sercowo-naczyniowy w stanie utrzymującej się hiperglikemii.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego preparatu polifenolowego mającego zastosowanie jako środek farmaceutyczny. W wyniku badań, twórcy wynalazku stwierdzili, iż odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, tj. odpadów chmielowych, wykazuje nieoczekiwane działanie ochronne w stanie utrzymującej się hiperglikemii.

Przedmiotem wynalazku jest odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy, do zastosowania do leczenia lub profilaktyki cukrzycy u ludzi lub zwierząt.

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny o działaniu ochronnym do zastosowania w stanie utrzymującej się hiperglikemii zawierający substancję czynną oraz ewentualnie środki pomocnicze charakteryzujący się tym, że jako substancję czynną zawiera odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy.

Przez wychmieliny rozumie się stały odpad poprodukcyjny, powstający podczas produkcji olejku chmielowego używanego w piwowarstwie w wyniku ekstrakcji szyszek chmielowych. Wychmieliny są uciążliwym, pylistym odpadem, którego utylizacja jest ważnym problemem ze względu na zanieczyszczenie środowiska. Są to odpady, które nie mogą być odprowadzane do systemów kanalizacyjnych jako ścieki, ponieważ powodują ich blokowanie. Przez odtłuszczony ekstrakt z wychmielin rozumie się ekstrakt z którego usunięte zostały związki lipofilne, w tym prenyloflawonoidy.

Działanie ochronne w stanie utrzymującej się hiperglikemii preparatu można określić poprzez pozytywny wpływ podawania preparatu na poprawę przeżywalności zwierząt obarczonych cukrzycą, przy czym przez zwierzę obarczone cukrzycą rozumie się zwierzę, u którego po podaniu dootrzewnowo iniekcji streptozotocyny w dawce 70 mg/kg masy ciała, 7 dni po iniekcji stwierdza się spadek masy ciała o co najmniej 10% oraz wartość glikemii przekraczającą 200 mg%.

Sposób otrzymywania preparatu zgodnie z wynalazkiem polega na ekstrakcji polifenoli z wychmielin poprzez co najmniej jednokrotną ekstrakcję przy użyciu rozpuszczalnika organicznego. Odpowiedni rozpuszczalnik wybiera się z grupy alkoholi oraz ich wodnych roztworów, ketonów oraz ich wodnych roztworów, bez i z dodatkiem kwasów nieorganicznych lub organicznych, oraz mieszanin wymienionych rozpuszczalników. Rozpuszczalnikiem korzystnym w sposobie według wynalazku jest rozpuszczalnik o średniej polarności, jakim jest np. aceton. W przypadku ekstrakcji wychmielin, korzystne z punktu widzenia wydajności procesu okazało się zastosowanie trzykrotnej ekstrakcji 70% wodnym roztworem acetonu w temperaturze pokojowej, przy zastosowaniu 10-krotnego nadmiaru ekstrahenta w stosunku do ilości substratu. Ekstrakcję prowadzono z zastosowaniem mieszania, po czym ekstrakty odsączano oraz zatężano aż do usunięcia rozpuszczalnika organicznego. Z tak uzyskanego ekstraktu usuwa się związki lipofilne. Można to osiągnąć na przykład poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem takim jak chloroform, przy czym odtłuszczony ekstrakt wodny zatęża się następnie w celu usunięcia pozostałości chloroformu. Dobre efekty osiągnąć można również stosując w miejsce chloroformu inne rozpuszczalniki niepolarne, takie jak heksan. Tak otrzymany preparat ewentualnie poddaje się liofilizacji i przechowuje bez dostępu światła w temperaturze 4°C, w szczelnych opakowaniach. Zawartość polifenoli ogółem wynosi średnio 240 mg/g preparatu w przeliczeniu na kwas galusowy. Przez zawartość polifenoli ogółem w przeliczeniu na kwas galusowy rozumie się zawartość oznaczoną zgodnie z metodą oznaczania zawartości związków polifenolowych Folina-Ciocalteu (Bordonaba i Terry 2008).

Badania przeprowadzone z preparatem według wynalazku wykazały, iż podawanie preparatu w dawkach 2,5 i 5 mg/kg m.c./dobę w przeliczeniu na kwas galusowy zapewnia istotnie dłuższy czas przeżycia u zwierząt obarczonych cukrzycą doświadczalną, pozostając przy tym bez negatywnego wpływu na kondycję zwierząt.

Preparat według wynalazku można stosować jako substancję czynną z grupy środków farmaceutycznych wspomagających leczenie lub profilaktykę cukrzycy. Dopuszcza się połączenie preparatu

PL 226 895 B1 z konwencjonalnie stosowanymi w praktyce farmaceutycznej dodatkami znanymi ze stanu techniki, przy czym preparat można poddawać znanym sposobom pozwalającym na nadanie postaci stałych lub płynnych kompozycji farmaceutycznych, które można podawać drogą doustną lub pozajelitową. Dawka preparatu wykazująca pożądane właściwości preparatu to 5 mg/kg m.c./dobę w przeliczeniu na kwas galusowy.

W poszczególnych przypadkach dawka może być jednak dostosowana przez fachowca w dziedzinie do wielkości odpowiadającej szczególnemu zastosowaniu, przy czym wykonane badania cytotoksyczności preparatu wskazują, iż preparaty według wynalazku zawierające ilość polifenoli ogółem mniejszą niż 30 μg/ml przygotowanego roztworu nie wykazują cytotoksyczności. Ze względu na swoje działanie, preparat może również znaleźć zastosowanie przy wytwarzaniu dodatków żywieniowych (suplementów diety), w szczególności przeznaczonych dla ludzi chorych na cukrzycę. W przypadku zastosowania preparatu według wynalazku do wytwarzania dodatku żywieniowego, możliwy jest dodatek znanych w przemyśle spożywczym materiałów pomocniczych, a ich właściwości i ewentualny dobór w celu wytworzenia odpowiedniej kompozycji jest dobrze opisany w literaturze i nie wykracza poza rutynowe działanie fachowca w danej dziedzinie.

Obok korzystnych właściwości, jakie wykazuje preparat, dodatkowo dzięki odtłuszczeniu pozbawiony wykazującej proliferacyjne i estrogenne właściwości prenylonaringeniny, zaletą rozwiązań według wynalazku jest również prostota procesu otrzymywania preparatu, łatwa dostępność oraz niski koszt surowca podstawowego, stanowiącego w istocie uciążliwy materiał odpadowy.

Poniżej przedstawiono opis załączonych figur:

Fig 1. przedstawia krzywą kalibracyjną do oznaczania polifenoli metodą Folina-Ciocalteu

Fig. 2 przedstawia krzywą kalibracyjną do oznaczania zawartości katechiny

Fig. 3 przedstawia krzywe przeżycia zwierząt z cukrzycą suplementowanych preparatem polifenolowym.

Fig. 4 przedstawia zmianę masy ciała zwierząt z cukrzycą suplementowanych preparatem polifenolowym.

Fig. 5 przestawia dane dotyczące glikemii u zwierząt z cukrzycą suplementowanych preparatem polifenolowym.

Rozwiązanie według wynalazku zostało przedstawione w sposób bardziej szczegółowy w przykładach realizacji wynalazku zamieszczonych poniżej. Poniższe przykłady w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

1. Otrzymywanie preparatu polifenolowego z wychmielin

Naważkę rozdrobnionych wychmielin, poddano procesowi trzykrotnej ekstrakcji 70% roztworem acetonu w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut (I ekstrakcja) oraz 15 minut (II i III ekstrakcja). Stosowano każdorazowo 10-krotny nadmiar ekstrahenta w stosunku do masy surowca (v/w). Ekstrakcję prowadzono z zastosowaniem mieszadła magnetycznego. Uzyskane ekstrakty sączono. W kolejnym etapie, połączone ekstrakty, zatężono 6-krotnie na wyparce próżniowej w temperaturze <40°C w celu usunięcia rozpuszczalnika organicznego. Uzyskany wodny ekstrakt następnie 4-krotnie ekstrahowano chloroformem (1:1, v/v) celem usunięcia związków lipofilnych. Odtłuszczony ekstrakt wodny następnie około 2-krotnie zatężano w celu usunięcia pozostałości chloroformu i liofilizowano. Rozdrobniony stały preparat polifenolowy do czasu analizy przechowywano w zamkniętych szklanych naczyniach w temperaturze 4°C bez dostępu światła.

2. Przygotowanie roztworu podstawowego

W celu dokonania analizy otrzymanego preparatu polifenolowego, roztwór podstawowy do analizy przygotowano w następujący sposób: odważono 20 mg preparatu polifenolowego i rozpuszczono ₃ w 10 cm³ 10% wodnego roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie próbki wstawiano na 5 minut do łaźni ultradźwiękowej. Tak przygotowany roztwór poddano analizie na oznaczenie zawartości związków polifenolowych.

3. Oznaczanie zawartości związków polifenolowych metodą Folina-Ciocalteu [Bordonaba i Terry, 2008]

Metoda ta oparta jest na właściwościach redukujących związków polifenolowych. Odczynnik Folina-Ciocalteu zawiera kompleks związków wolframowo-molibdenowych (H3PW12O40 i H3PMo12O40), które przy utlenianiu polifenoli przechodzą w niebiesko zabarwione formy tlenowe (W8O23 i Mo8O23), posiadające maksimum absorbancji przy 760 nm.

PL 226 895 B1

Intensywność barwy jest proporcjonalna do ilości występujących w roztworze substancji fenolowych.

Na₂WO₄/Na₂MoO₄ ((polifenol) - MoW₁₁O₄₀)^-4

Mo(VI) (żółty) + e Mo(V) (niebieski)

Oznaczenie wykonano w następujący sposób:

₃

Próba właściwa: 10 cm³ wody destylowanej, ₃

0,2 - 2 cm³ roztworu próby badanej, ₃

0,5 cm³ odczynnika Folina-Ciocalteu, cm³ 20% Na2CO3.

₃

Całość uzupełniano wodą do 50 cm³.

Próba odniesienia nie zawierała próby badanej. Po 20 min mierzono absorbancję próby właściwej wobec próby odniesienia przy długości fali 760 nm. Zawartość polifenoli wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej przedstawionej na fig. 1, do sporządzenia której użyto metanolowego roztworu ₃ kwasu galusowego o stężeniu 0,2 mg/cm³.

4. Oznaczanie zawartości flawanoli metodą wanilinową [Swain-Hillis, 1959]

Preparat podstawowy otrzymany zgodnie z pkt. 2 Przykładu 1 przebadano na zawartość flawanoli zgodnie z poniżej przedstawioną metodyką.

Metoda wanilinowa oparta jest na reakcji waniliny z monomerami i polimerami katechin. Charakterystyczna czerwona barwa jest stabilna w środowisku 70% H2SO4 i posiada maksimum absorpcji przy λ = 500 nm.

Wykonanie oznaczenia:

Przygotowano następujące próby:

₃ a - 0,2-0,4 cm³ badanego roztworu podstawowego rozcieńczonego 5 razy dopełniano wodą 3 3 3 destylowaną do 2 cm³ i dodawano 4 cm³ odczynnika wanilinowego (1 g waniliny w 100 cm³ 70%

H2SO4), ₃ b - 0,2-0,4 cm³ badanego roztworu podstawowego rozcieńczonego 5 razy dopełniano wodą 33 destylowaną do 2 cm³ i dodawano 4 cm³ 70% H2SO4, c - do 2 cm³ wody destylowanej dodawano 4 cm³ odczynnika wanilinowego, d - do 2 cm³ wody destylowanej dodawano 4 cm³ 70% H2SO4,

Próby umieszczano w zimnej łaźni wodnej, aby ich temperatura nie przekroczyła 35°C. Po 15 minutach mierzono absorbancję prób a, b, c względem próby d przy λ = 500 nm. Z krzywej wzorcowej odczytywano stężenie katechiny w próbce, odpowiadające absorbancji A = Aa - (Ab+Ac).

Do sporządzenia krzywej wzorcowej użyto wodnego roztworu (+)katechiny o stężeniu 0,05 ₃ mg/cm³. Krzywą zależności absorbancji A = Aa - (Ab+Ac) w funkcji stężenia (+) katechiny przedstawiono na fig. 2.

5. Oznaczenie proantocyjanidyn [Rosch et al., 2003]

Preparat podstawowy otrzymany zgodnie z pkt. 2 Przykładu 1 przebadano na obecność proantocyjanidyn zgodnie z poniżej przedstawioną metodą. Procyjanidyny ogrzewane w temperaturze 100°C w środowisku zakwaszonego kwasem solnym butanolu ulegają depolimeryzacji i utlenieniu do odpowiednich barwnych antocyjanidyn:

Wykonanie oznaczenia:

3 3 Do 0,2-0,4 cm³ roztworu podstawowego uzupełnionego do 0,4 cm³ 10% DMSO dodano 9,6 cm³ mieszaniny zawierającej butanol i stężony kwas solny (9:1, v/v).

PL 226 895 B1

Następnie próby ogrzewano 90 min we wrzącej łaźni wodnej. Po oziębieniu próby przesączono, ₃ uzupełniono do objętości 10 cm i zmierzono absorbancję (A) przy długości fali λ = 550 nm wobec mieszaniny butanol/HCI. Zawartość proantocyjanidyn przeliczono na cyjanidynę stosując molowy ₃ współczynnik absorpcji ε = 17360 dm /mol*cm.

Stężenie cyjanidyny w mieszaninie reakcyjnej obliczono z zależności:

₃

Ccyjanidyny = 0,0165 A [mg/cm ]

6. Charakterystyka polifenoli w otrzymanych preparatach z wychmielin

Poniżej przedstawiona tablica 1 zawiera dane pochodzące z oznaczeń zawartości 9 preparatów otrzymanych z wychmielin sposobem według wynalazku. W tablicy przedstawiono zawartość polifenoli ogółem (oznaczoną zgodnie z pkt. 3 niniejszego przykładu), flawanoli (oznaczonych zgodnie z pkt. 4 niniejszego przykładu) oraz proantocyjanidyn oznaczonych zgodnie z pkt. 5 niniejszego przykładu).

T a b e l a 1

Zawartość polifenoli w preparacie wychmielin

Nr preparatu	Zawartość (mg/g preparatu)
Polifenole ogółem	Flawanole	Proantocyjanidyny
1	232,99 ± 21,62	119,83 ± 5,78	93,40 ± 4,37
2	244,83 ± 15,34	121,41 ± 2,64	87,82 ± 4,17
3	247,24 ± 14,63	126,10 ± 5,25	98,47 ± 3,04
4	198,50 ± 10,33	85,18 ± 3,20	81,09 ± 3,19
5	229,55 ± 5,67	100,10 ± 3,67	96,64 ± 7,16
6	242,59 ± 13,38	123,01 ± 7,06	95,91 ± 6,73
7	258,07 ± 11,03	134,85 ± 3,42	99,23 ± 8,07
8	252,82 ± 17,26	121,01 ± 5,85	87,11 ± 2,20
9	248,41 ± 2,94	127,09 ± 5,08	106,03 ± 3,45
średnia	239,44 ± 17,75	117,62 ± 15,32	93,97 ± 7,54

P r z y k ł a d 2

Ocena wpływu podawania preparatu polifenolowego na przeżywalność szczurów z cukrzycą eksperymentalną.

Zwierzęta poddane badaniu

W eksperymencie wykorzystano samce szczurów szczepu Sprague-Dawley o masie 250-300 g. Zwierzęta, zarówno w trakcie hodowli jak i w trakcie eksperymentu, karmione były paszą bezsojową o obniżonej zawartości fitoestrogenów.

Wywoływanie cukrzycy i podział na grupy eksperymentalne

Cukrzycę doświadczalną wywoływano przez dootrzewnową iniekcję streptozotocyny w dawce 70 mg/kg masy ciała. Zwierzęta po iniekcji znakowano numerowanymi klipsami. 7 dni po iniekcji zwierzęta ważono i wykonywano pomiar glikemii we krwi żylnej. Warunkiem uznania zwierzęcia za obarczone cukrzycą i włączenia do eksperymentu było jednoczesne spełnienie następujących warunków:

• spadek masy ciała o co najmniej 10% • wartość glikemii przekraczająca 200 mg%.

Zwierzęta spełniające jednocześnie powyższe kryteria alokowano w sposób losowy do 4 grup eksperymentalnych liczących po 40 osobników każda. Utworzono grupy eksperymentalne otrzymujące następujące dawki preparatu:

• 0 mg kwasu galusowego/kg masy ciała/ dobę • 2,5 mg kwasu galusowego/kg masy ciała/ dobę • 5 mg kwasu galusowego /kg masy ciała/ dobę • 10 mg kwasu galusowego /kg masy ciała/ dobę

W badaniach założono standaryzację badanego preparatu na zawartość kwasu galusowego, dlatego dawki wyrażone są jako masa polifenoli ogółem w preparacie w przeliczeniu na kwas galusowy. W dalszej części niniejszego przykładu badany preparat polifenolowy otrzymany sposobem określonym w przykładzie 1 określany jest jako EO4.

PL 226 895 B1

Podawanie preparatu EO4

Na podstawie wcześniejszych doświadczeń wykazano, że obecność badanego preparatu w najwyższej testowanej dawce w wodzie pitnej nie wpływa na ilość płynu spożywanego przez zwierzęta. Na tej podstawie przyjęto tę drogę podawania badanego preparatu. Zwierzęta w grupie kontrolnej otrzymywały czystą wodę pitną.

Zwierzęta umieszczone były w klatkach po nie więcej niż 5 osobników w jednej (położenie klatek na półkach w pokoju bytowania zwierząt zmieniano w sposób sterowany). Co 7 dni dokonywano pomiarów masy ciała. Na tej podstawie obliczano masę preparatu jaką powinny w ciągu doby spożyć zwierzęta w danej klatce, by przyjąć określoną dawkę. Codziennie odpowiednia masa preparatu była rozpuszczana w 0,5 litra wody pitnej i podawana zwierzętom.

Obserwację prowadzono przez 34 tygodnie. Codziennie rejestrowano padnięcia zwierząt, a co 7 dni ich masę i glikemię.

Wyniki

W grupach zwierząt suplementowanych EO4 stwierdzono dłuższy czas przeżycia, co ilustrują dane przedstawione na fig. 3 oraz w tabeli 2.

Fig. 3 przedstawia krzywe przeżycia u zwierząt suplementowanych preparatem EO4 po podawaniu czterech różnych dawek preparatu: 0, 2,5, 5 i 10 mg/kg masy ciała na dobę, zaś tabela 2 przestawia średni czas przeżycia zwierząt cukrzycowych suplemetowanych preparatem EO4.

T a b e l a 2

Średni czas przeżycia zwierząt cukrzycowych suplementowanych preparatem EO4.

grupa eksperymentalna	średni czas przeżycia (95% przedział ufności) [tygodnie]
0 mg/kg m.c./d	26,4(23,4-29,5)
2,5 mg/kg m.c./d	31,0 (29,2-32,8)
5 mg/kg m.c./d	31,3 (30,1-32,5)
10 mg/kg m.c./d	28,5(25,8-31,2)

Porównanie krzywych przeżycia testem Gehana-Breslowa-Wilcoxona (z poprawką na porównania wielokrotne) wykazuje istotne różnice dla grup suplementowanych EO4 w dawce 2,5 i 5 mg/kg m.c./dobę w stosunku do grupy placebo.

Przeżycie grupy suplementowanej EO4 w dawce 10 mg/kg m.c./dobę nie różniło się istotnie od grupy placebo, co przedstawiają dane w tabeli 3.

T a b e l a 3

Porównanie krzywych przeżycia zwierząt cukrzycowych suplementowanych preparatem EO4.

porównywane grupy	wartości p - test Gehana-Breslowa-Wilcoxona (po uwzględnieniu poprawki Bonferroniego na porównania wielokrotne)
0 vs. 2,5 mg/kg m.c./d	p<0,01
0 vs. 5 mg/kg m.c./d	p<0,01
0 vs. 10 mg/kg m.c./d	n.s.

Do podobnych wniosków prowadzi zestawienie wartości proporcjonalnego ryzyka (hazard ratio) (tabela 4).

T a b e l a 4

Zestawienie wartości proporcjonalnego ryzyka (hazard ratio) dla krzywych przeżycia zwierząt cukrzycowych suplementowanych preparatem EO4.

porównywane grupy	wartości proporcjonalnego ryzyka (95% przedział ufności)
0 vs. 2,5 mg/kg m.c./d	3,10 (1,45-6,59)
0 vs. 5 mg/kg m.c./d	3,18 (1,50-6,74)
0 vs. 10 mg/kg m.c./d	1,89 (0,86-4,14)

PL 226 895 B1

Nie zaobserwowano wpływu podawania preparatu na masę ciała, co ilustrują dane wskazane na fig. 4. (zmiana masy ciała zwierząt suplementowanych EO4). Podawanie preparatu pozostało również bez wpływu na glikemię suplementowanych zwierząt, co ilustrują dane przedstawione na fig. 5.

Suplementacja preparatem EO4 w dawkach 2,5 oraz 5 mg/kg m.c./dobę istotnie poprawia przeżywalność zwierząt cukrzycowych pozostając bez wpływu na oznaczone podstawowe parametry opisujące stan i kondycję organizmu w nieleczonej cukrzycy.

P r z y k ł a d 3

Oznaczenie cytotoksyczności

Oznaczenie cytotoksyczności dla preparatu otrzymanego zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 1, a w dalszej części niniejszego przykładu określanego jako EO4, zostało wykonane w oparciu o wieloparametryczne zautomatyzowane badanie cytotoksyczności HCS „Cell health assay”, przy użyciu aparatu Thermo Scientific Cellomics® ArrayScan umożliwiającym automatyczną analizę mikroskopową, co pozwala na zbadanie uszkodzeń struktur komórkowych wywołanych przez analizowany preparat. Dzięki użyciu 3 barwników fluorescencyjnych (MitoTracker - Invitrogen, YO-PRO 1 Invitrogen, Hoechst 33342 - Sigma) przeprowadzono ocenę wpływu badanych ekstraktów na rozmiar i morfologię jądra, integralność błony cytoplazmatycznej oraz aktywność mitochondriów. Testy przeprowadzono na płytkach 96-dołkowych przy użyciu 5 linii komórkowych (HepG2, HMEC-1, A549, Caco-2, 3T3). Pomiary przeprowadzono przy użyciu automatycznej stacji pipetującej JANUS firmy Perkin Elmer. Preparat zbadano w 5 stężeniach, pomiary wykonano w duplikatach w 5 niezależnych powtórzeniach.

Na podstawie nieprzetworzonych danych eksperymentalnych przeprowadzono analizę statystyczną znamienności zaobserwowanych różnic w wartościach średnich dla trzech wybranych parametrów pomiarowych, mierzących natężenie fluorescencji i powierzchnię wybarwioną w komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych. Wybrane parametry obrazują:

1. Powierzchnię jądra komórkowego (Hoechst (Sigma)

2. Akumulację barwnika YO-PRO1 (Invitrogen) wskazującą na uszkodzenie błony cytoplazmatycznej

3. Potencjał mitochondrialny (MitoTracker - Invitrogen)

Następnie, statystycznie znamiennym różnicom dla każdego testowanego stężenia każdej substancji, które wskazują na zmiany morfologiczne i funkcjonalne w komórkach obrazujące działanie cytotoksyczne, przypisano wartości punktowe zgodnie z przedstawionym poniżej schematem oceny obserwowanych efektów.

Różnice podlegające punktacji :

1. Zmniejszenie lub zwiększenie powierzchni jądra

2. Wzrost akumulacji YO-PRO1

3. Spadek potencjału mitochondrialnego

Poniższa tabela 5 ilustruje przypisane wartości punktowe przyznawane badanym preparatom w teście „Cell health assay”.

T a b e l a 5

Wartości punktowe przyjęte w teście „Cell health assay”.

Zdarzenie	Punkty	Maksymalna liczba pkt.
Istotna różnica w jednej linii komórkowej	0.2 za każde zdarzenie	3
Ta sama różnica w więcej niż jednej linii komórkowej	1 za każdą kolejną linię	12
Więcej niż jedna różnica w jednej linii	1 za każdą kolejną różnicę	10

Poniżej przestawiona tabela 6 ilustruje działanie cytotoksyczne preparatu polifenolowego (EO4) w oparciu o kumulatywny indeks cytotoksyczności obliczany dla każdej z badanych substancji na podstawie wyników uzyskanych w wieloparametrycznym pomiarze „cell health assay”

PL 226 895 B1

T a b e l a 6

Pomiar cytotoksyczności preparatu polifenolowego z zastosowaniem naringiny jako kontroli negatywnej oraz kampferolu jako kontroli pozytywnej.

	5 g/ml	10 pg/ml	30 pg/ml	40 pg/ml	50 pg/ml	Suma
Naringina	0.0	0.0	0.2	1.4	0.2	1.8
EO4	0.0	0.0	0.2	2.6	5.0	7.8
Kaempferol	2.6	1.4	8.4	8.4	6.2	27.0

Uzyskane wyniki wskazują, że badany preparat polifenolowy nie jest cytotoksyczny w stężeniach mniejszych niż 30 pg/ml.

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy, do zastosowania do leczenia lub profilaktyki cukrzycy u ludzi lub zwierząt.
2. 2. Środek farmaceutyczny o działaniu ochronnym do zastosowania w stanie utrzymującej się hiperglikemii, zawierający substancję czynną oraz ewentualnie środki pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy.