PL220307B1 - Sposób identyfikacji stymulatora, który zwiększa biogeniczne wytwarzanie metanu w formacji węglowodoronośnej, sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu w formacji węglowodoronośnej i sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu z węgla kopalnego - Google Patents

Abstract

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobów identyfikacji stymulantów do biogenicznego wytwarzania metanu w formacjach węglowodoronośnych. Sposoby obejmują zastosowanie informacji o sekwencji kwasu nukleinowego w celu określenia produktów genów, które stanowią enzymy z różnych szlaków zaangażowanych w przemianie węglowodorów w metan. Enzymy i stymulanty zidentyfikowane sposobami według wynalazku mogą być stosowane w sposobach wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu, na przykład przez dodanie do pokładów węgla lub odwiertów metanowych w złożach węgla.

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób identyfikacji stymulatora, który zwiększa biogeniczne wytwarzanie metanu w formacji węglowodoronośnej, a także sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu w formacji węglowodoronośnej i sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu z węgla kopalnego.

Niniejsze zgłoszenie dotyczy ogólnie molekularnej charakterystyki lokalnych mikroorganizmów wytwarzających metan i ich określonych zespołów w formacjach węglowodoronośnych, takich jak pokłady węgla, a w szczególności analizy danych genomu środowiskowego takich mikroorganizmów i wykorzystania takich danych i mikroorganizmów do wzmagania przemiany i uzyskiwania metanu przy użyciu stymulantów zidentyfikowanych przez określenie obecności enzymów w szlakach zaangażowanych w przemianę węglowodoru w metan.

Metan ze złóż węgla (CBM) jest źródłem naturalnego gazu wytwarzanego zarówno biologicznie lub termogenicznie w złożach węgla. Biogeniczne wytwarzanie CBM jest wynikiem metabolizmu mikroorganizmów i rozkładu węgla z następującym przepływem elektronów pomiędzy wieloma populacjami mikroorganizmów. Termogeniczne wytwarzanie CBM jest wynikiem rozkładu termicznego osadów materii organicznych lub ropy, przejawiającego się następnie uwęgleniem, gdy temperatura wzrasta powyżej poziomu, w którym mogą przeżyć mikroorganizmy wytwarzające metan. W złożach węgla ciśnienie leżących powyżej skał i otaczającej wody powoduje wiązanie się CBM z powierzchnią węgla i absorpcję wolnego gazu do wnętrza stałej matrycy węgla poprzez mikropory i płaszczyzny łupliwości (naturalne spękania węgla), jako gaz rozpuszczony w wodzie, jako gaz zaadsorbowany, utrzymywany przez przyciąganie cząsteczkowe na powierzchni macerałów (składników organicznych tworzących bryłę węgla), mikropory i płaszczyzny łupliwości węgla, oraz jako gaz zaabsorbowany do wnętrza struktury cząsteczkowej węgla.

Węgiel jest skałą osadową o różnych stopniach przepuszczalności, przy czym metan gromadzi się przede wszystkim w płaszczyznach łupliwości węgla. Te spękania węgla są głównymi kanałami umożliwiającymi przepływ CBM. W celu wydobycia CBM w złożu węgla wierci się otwór z obudową stalową, który pozwala obniżyć ciśnienie, dzięki połączeniu z powierzchnią lub odpompowanie małych ilości wody ze złoża węgla (odwodnienie). CBM ma bardzo małą rozpuszczalność w wodzie i z łatwością wydziela się w miarę spadku ciśnienia, pozwalając na odprowadzenie go rurami z odwiertu, oddzielnie od wody. Następnie CBM jest przesyłany do stacji sprężania i do rurociągów gazu naturalnego.

CBM stanowi znaczącą część gazu naturalnego wytwarzanego w Stanach Zjednoczonych i ocenia się, że stanowi on około 10% zasobów gazu naturalnego, około 1,8 bilionów stóp sześciennych (TCF). Zasoby międzynarodowe zapewniają ogromne możliwości przyszłego wytwarzania CBM. Jednym z obszarów o największej wydajności jest San Juan Basin, znajdujące się w Kolorado i Nowym Meksyku. Wobec tak ogromnych zasobów CBM, minimalne poprawienie uzysku CBM mogłoby spowodować znacznie zwiększone wytwarzanie z odwiertu, a w związku z tym opracowywane są różne sposoby zwiększania uzysku CBM z pokładów węgla.

Interwencje czysto fizyczne mogą obejmować optymalizację sposobów wiercenia i szczelinowania. Inne sposoby poprawiania wymagają stosowania zewnętrznych czynników bezpośrednio na złoża węgla. Obejmuje to, na przykład, wstrzykiwanie gazów, takich jak azot (patrz np. Shimizu, S., Akiyama, M., Naganuma, T., Fujioka, M., Nako, M. i Ishijima, Y. 2007. Molecular characterization of microbial communities in deep coal seam groundwater of northern Japan. Geobiology 5 (4): 423-433; patent U.S. nr 4 883 122) i CO2 (patrz np. patent U.S. nr 5 402 847); i wstrzykiwanie gorących płynów, takich jak woda lub para wodna (patrz, np. patent U.S nr 5 072 990). Opracowano różne sposoby w celu zwiększenia przepuszczalności złoża węgla, zarówno fizyczne (patrz np. patent U.S. nr 5 014 788) jak i chemiczne (patrz np. patent U.S. nr 5 865 248).

Ostatnio rozwijane są sposoby polepszenia w celu wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu z istniejących odwiertów. W patencie U.S. nr 5 424 195 ujawniono użycie konsorcjum mikroorganizmów hodowanych in situ lub na zawierającym węgiel substracie, w celu przemiany węgla w metan na drodze biologicznej. W PCT/GB2006/004443 (WO2007/060473) ujawniono sposoby wytwarzania i użycia kultur mikroorganizmów podziemnych. W PCT/US2006/039352 (WO2008/041990) ujawniono sposoby i układy stymulacji biogenicznego wytwarzania przez wprowadzanie wstrzykiwanego płynu, który umożliwia beztlenowy rozkład biologiczny warstwy węglowodorów nie będących w postaci ciekłej, przez lokalne mikroorganizmy. W PCT/US2007/080161 (WO2008/042888) ujawniono sposoby

PL 220 307 B1 obejmujące ogrzewanie in situ warstwy węglowodorów nie będących w postaci ciekłej, umożliwiające biogeniczne wytwarzanie metanu. W patencie U.S. nr 7 426 960 ujawniono sposoby stymulacji biogenicznego wytwarzania metabolitu o zwiększonej zawartości wodoru, obejmujące wstrzykiwanie wody do otworu, w celu rozproszenia w nim konsorcjum mikroorganizmów. W Patencie U.S. nr 6 543 535 ujawniono sposoby stymulacji aktywności konsorcjów mikroorganizmów w podziemnych formacjach węglowodoronośnych, w celu przemiany węglowodorów w metan, przy użyciu informacji otrzymanych z analizy składników formacji i charakteryzujących mikroorganizmy konsorcjów. Chociaż patent U.S. nr 6 543 535 uwzględnia porównanie wyizolowanych mikroorganizmów ze znanymi mikroorganizmami, mające na celu ustalenie ich identyczności filogenetycznej z tymi znanymi mikroorganizmami, nie ujawnia jednak identyfikacji lub zastosowania określonych genów kodujących enzymy zaangażowane w biotransformację węgla w metan, z bakterii metanogennych z konsorcjów, ani zastosowania analizy enzymów w celu zidentyfikowania nowych stymulantów. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2008/0289816 ujawniono sposoby wprowadzania mikroorganizmów do zawierającego węgiel materiału w środowisku beztlenowym, w celu zwiększenia biogenicznego wytwarzania węglowodorów, obejmujące zastosowanie wody złożowej. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2008/0299635 ujawniono sposoby stymulacji wytwarzania metanu z materiału zawierającego węgiel, przy pomocy konsorcjum metanogennego. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2009/0023612 ujawniono sposoby zwiększenia biogenicznego wytwarzania paliwa gazowego z materiału zawierającego węgiel, obejmujące zastosowanie konsorcjum beztlenowego, zawierającego gatunki Pseudomonas. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2009/0023611 ujawniono izolowane konsorcja mikroorganizmów do biogenicznego wytwarzania metanu ze złożonych węglowodorów, zawierające gatunki Thermotoga. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2008/0286855 ujawniono sposób zwiększenia wytwarzania materiałów o zwiększonej zawartości wodoru, obejmujący wprowadzenie konsorcjum zawierającego wyizolowane kultury Thermacetogenium phaeum. W patencie U.S. nr 7 416 879 ujawniono sposoby stymulacji aktywności biologicznej Thermacetogenium phaeum w formacjach geologicznych, obejmujące wprowadzenie dodatków do formacji. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2008/0182318 ujawniono wyizolowane konsorcja mikroorganizmów do biogenicznego wytwarzania metanu zawierające gatunek Deulfuromas. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2007/0295505 ujawniono sposoby stymulacji biogenicznego wytwarzania produktów metabolicznych o zwiększonej zawartości wodoru w formacjach geologicznych obejmujących materiał węglowy, obejmujące dostarczenie zawartym w nich mikroorganizmom związków fosforu. W publikacji zgłoszenia patentowego U.S. nr 2007/0261843 ujawniono sposoby stymulacji biogenicznego wytwarzania produktów metabolicznych o zwiększonej zawartości wodoru w formacjach geologicznych obejmujących materiał węglowy, obejmujące dostarczenie zawartym w nich mikroorganizmom wodoru i związku fosforu. W PCT/US2006/031723 (WO2007/022122) ujawniono systemy wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu, obejmujące wzbogacenie wody CBM i innych ośrodków zawierających mikroorganizmy, zmniejszające konkurencyjność w redukcji siarczanów i zwiększające stężenie materii organicznej.

Biogeniczne wytwarzanie metanu jest produktem wielu możliwych szlaków enzymatycznych, które kolejno rozbijają złożoną wielkocząsteczkową, policykliczną, ligninopochodną materię organiczną. Przykładowo, enzymy ligninolityczne mogą zawierać peroksydazy (peroksydazę manganową, peroksydazę ligninową itp.), oksydazy fenolowe (lakkazy), hydrolazy, esterazy i oksydazy (patrz np. Fakoussa, R.M. i Hofrichter, M. 1999. Biotechnology and Microbiology of Coal Degradation. Appl.Microbiol.Biotechnol, 52:25-40). Po zajściu początkowej fragmentacji angażowane są enzymy uczestniczące w demetylacji i rozszczepieniu pierścieni, utlenianiu grup aromatycznych i alifatycznych, a następnie w szlakach fermentacji i metanogenezy. Uważa się, że mikroorganizmy występujące w formacjach węglowodoronośnych, w tym metanogeny, są bezwzględnymi beztlenowcami.

Istnieje zapotrzebowanie, aby skutecznie stymulować biogeniczne wytwarzanie w formacjach węglowodoronośnych, takich jak węgiel, oraz zwiększyć zdolność wytwarzania CBM istniejących odwiertów. Twórcy wynalazku opracowali nie tylko sposoby służące identyfikacji i zastosowaniu mikroorganizmów obecnych w środowisku formacji, ale także służące identyfikacji dopasowanej interwencji (np. stymulantów, które mogą być wprowadzane do środowiska, w celu wzmagania biogennicznego wytwarzania metanu) po stwierdzeniu obecności określonych produktów genów, zaangażowanych w szlaki metaboliczne prowadzące do wytwarzania metanu.

Wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji stymulatora, który zwiększa biogeniczne wytwarzanie metanu w formacji węglowodoronośnej, przy czym ten sposób obejmuje:

PL 220 307 B1

a) uzyskanie sekwencji kwasu nukleinowego z jednego lub większej liczby mikroorganizmów pochodzących ze środowiska formacji węglowodoronośnej;

b) określenie obecności jednego lub większej liczby produktów genów tej sekwencji kwasu nukleinowego, przy czym produkt genu jest enzymem w szlaku zaangażowanym w przemianę węglowodoru w metan wybranym z grupy obejmującej peroksydazy, oksydazy fenolowe, oksydazy alkoholowe, lakkazy, hydrolazy, hydrolazy glikozylowe, esterazy, eterazy, oksydazy, nitrogenazy, celulazy, amylazy, glukanazy, pullulanazy, reduktazy, dysmutazy, oksygenazy, monooksygenazy, dioksygenazy, katalazy, hydrogenazy, karboksylazy i reduktazy metylowe oraz enzym zaangażowany w homoacetogenezę, metanogenezę, matanogenezę acetoklastyczną lub metanogenezę redukującą CO2; i

c) identyfikację substratu, reagenta lub kofaktora tego enzymu, który podwyższa wytwarzanie metanu, gdy zostanie dostarczony do jednego lub większej liczby mikroorganizmów w tej formacji węglowodoronośnej.

Korzystny jest sposób, w którym jeden lub większa liczba tych mikroorganizmów są wzbogacone przez selekcję z uwagi na zdolność do wzrostu na węglu kopalnym jako jedynym źródle węgla; albo ten co najmniej jeden mikroorganizm jest gatunkiem bakterii lub gatunkiem archeonów zdolnym do przemiany węglowodoru w produkt wybrany z grupy obejmującej wodór, dwutlenek węgla, octan, mrówczan, metanol, metyloaminę i substraty metanogenne; gatunkiem bakterii metanogennych; lub gatunkiem archeonów metanogennych.

Korzystny jest sposób, w którym etap (c) obejmuje:

(i) badanie in vitro jednego lub większej liczby substratów, reagentów lub kofaktorów, w więcej niż jednym stężeniu, w celu obserwacji i optymalizacji wytwarzania metanu w układzie hodowlanym zawierającym co najmniej jeden mikroorganizm wyizolowany z tej formacji węglowodoronośnej, przy czym ponadto układ hodowlany zawiera węgiel kopalny jako jedyne źródło węgla; albo (ii) badanie in vitro jednego lub większej liczby substratów, reagentów lub kofaktorów, w więcej niż jednym stężeniu, w celu obserwacji i optymalizacji wytwarzania metanu w układzie hodowlanym zawierającym określony zespół mikroorganizmów, który to określony zespół mikroorganizmów łączy kulturę pojedynczego szczepu mikroorganizmu z formacji węglowodoronośnej, z co najmniej jedną inną określoną kulturą innego pojedynczego szczepu mikroorganizmu, tak że członkowie tego określonego zespołu mikroorganizmów działają synergicznie w celu wytworzenia metanu; przy czym ponadto układ hodowlany zawiera węgiel kopalny jako jedyne źródło węgla.

Korzystny jest sposób, w którym co najmniej jednym mikroorganizmem jest gatunek bakterii wybrany z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospiryllum i Sulfurospirillum; lub gatunkiem archeonów wybranym z grupy obejmującej Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota; albo ten określony zespół mikroorganizmów zawiera co najmniej dwa gatunki mikroorganizmów wybrane z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospiryllum i Sulfurospirillum, Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota.

Korzystny jest sposób, w którym formacja węglowodoronośna jest wybrana z grupy obejmującej węgiel kopalny, torf, węgiel brunatny, łupki naftowe, formacje ropy naftowej, tradycyjny olej czarny, mazut, piaski roponośne oraz piaski bitumiczne.

Korzystny jest sposób, w którym enzym jest wybrany z grupy obejmującej oksygenazy, monooksygenazy i dioksygenazy.

Korzystny jest sposób, w którym substrat, reagent lub kofaktor jest wybrany z grupy obejmującej związek zawierający siarkę, związek zawierający azot, związek zawierający fosfor, pierwiastek śladowy, akceptor elektronów, donor elektronów, chlorowiec, metal, alkohol, kwas organiczny, alkan, alken, alkin, związek aromatyczny, aminę, eter, aldehyd, keton, tiol, octan, węglowodór aromatyczny i gaz.

Wynalazek dotyczy także sposobu wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu w formacji węglowodoronośnej, który obejmuje wprowadzanie stymulatora zidentyfikowanego powyżej opisanym sposobem, do tej formacji węglowodoronośnej.

Korzystny jest sposób, który obejmuje wprowadzanie tlenu do tej formacji węglowodoronośnej.

Korzystny jest sposób, w którym tą formacją węglowodoronośną jest węgiel kopalny.

Korzystny jest sposób, który dodatkowo obejmuje modulację enzymu wybranego z grupy obejmującej peroksydazy, oksydazy fenolowe, oksydazy alkoholowe, lakkazy, hydrolazy, hydrolazy glikozylowe, esterazy, eterazy, oksydazy, nitrogenazy, celulazy, amylazy, glukanazy, pullulanazy, reduktaPL 220 307 B1 zy, dysmutazy, oksygenazy, monooksygenazy, dioksygenazy, katalazy, hydrogenazy, karboksylazy, reduktazy metylowe, enzym zaangażowany w metanogenezę acetoklastyczną i enzym zaangażowany w metanogenezę redukującą CO2.

Korzystny jest sposób, dodatkowo obejmujący identyfikację określonego zespołu mikroorganizmów do przemiany węgla w metan, który obejmuje:

(d) przygotowanie kultury pojedynczego szczepu tego jednego lub większej liczby mikroorganizmów z tego środowiska węgla, przy czym pojedynczy szczep mikroorganizmu zawiera ten jeden lub większą liczbę produktów genów; i (e) połączenie tego wyhodowanego pojedynczego szczepu mikroorganizmu z co najmniej jedną inną kulturą innego pojedynczego szczepu mikroorganizmu w celu dostarczenia określonego zespołu mikroorganizmów;

przy czym członkowie tego określonego zespołu mikroorganizmów działają synergicznie w celu wytworzenia metanu.

Korzystny jest sposób, który ponadto obejmuje:

(f) dostarczanie substratu, reagenta lub kofaktora, do tego określonego zespołu mikroorganizmów, który zwiększa wytwarzanie metanu.

Korzystny jest sposób, w którym ten określony zespół mikroorganizmów zawiera co najmniej dwa gatunki mikroorganizmów wybrane z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospirillum, Sulfurospirilium; Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota.

Wynalazek dotyczy także sposobu wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu z węgla kopalnego, który obejmuje wprowadzenie do złóż węgla kopalnego określonego zespołu mikroorganizmów sposobem jak określono powyżej.

Korzystny jest sposób, który obejmuje wprowadzanie do złoża węgla kopalnego określonego zespołu mikroorganizmów sposobem jak określono powyżej wraz z substratem, reagentem lub kofaktorem.

Wynalazek dostarcza zatem sposoby i procesy identyfikacji i zastosowania stymulantów i enzymów do biogenicznego wytwarzania metanu w formacjach węglowodoronośnych. Sposoby według wynalazku obejmują zastosowanie informacji kwasu nukleinowego, uzyskanych z różnych mikroorganizmów, zidentyfikowanych w formacjach węglowodoronośnych, w celu identyfikacji produktów genów, jakimi są enzymy obecne w mikroorganizmach, które mogą funkcjonować w różnych szlakach, prowadzących od źródła węglowodorowego do wytwarzania metanu. Patrz, przykładowo, FIG. 1.

FIG. 1 przedstawia różnorodne potencjalne szlaki enzymatyczne przemiany węgla w metan.

FIG. 2A i 2B przedstawiają skład taksonomiczny bakterii i archeonów reprezentatywnej kultury wzbogacenia wytwarzającego metan po 10 i 30 dniach w hodowli.

FIG. 3 przedstawia różnorodność bakterii w reprezentatywnej próbce wody złożowej z analizy sekwencji genu RecA z metagenomu.

FIG. 4 przedstawia i porównuje profil oksygenazy w reprezentatywnych próbkach wody złożowej, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i dwóch pojedynczych szczepów, których genomy poddano sekwencjonowaniu.

FIG. 5 przedstawia i porównuje profil oksygenaz w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego i kultury wzbogacenia wytwarzającego metan.

FIG. 6 przedstawia i porównuje profil enzymów odpowiedzi na stres oksydacyjny w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 7 przedstawia i porównuje profil enzymów metanogenezy w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 8 przedstawia i porównuje profil esteraz w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 9 przedstawia i porównuje profil enzymów sacharolitycznych w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 10 przedstawia i porównuje profil hydrogenaz w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 11 przedstawia i porównuje profil białek wiązania azotu w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

PL 220 307 B1

FIG. 12 przedstawia i porównuje profil białek denitryfikacji w reprezentatywnych próbkach ze zbiornika magazynowego, kultury wzbogacenia wytwarzającego metan i z odwiertu.

FIG. 13 przedstawia wytwarzanie metanu zwiększone przez określony zespół mikroorganizmów po stymulacji różnymi akceptorami elektronów i tlenem.

FIG. 14 przedstawia wytwarzanie metanu zwiększone przez określony zespół mikroorganizmów po stymulacji wodorem i octanem.

FIG. 15 przedstawia wytwarzanie metanu zwiększone przez określony zespół mikroorganizmów po stymulacji glicerolem lub trimetyloaminą.

FIG. 16 przedstawia proces wprowadzania czynnika zewnętrznego, takiego jak enzym lub stymulant do złoża węgla przez ponownie wstrzykiwanie wody złożowej, w celu zwiększenia wytwarzania metanu.

Wynalazek dostarcza nowe sposoby i procesy stymulacji biogenicznego wytwarzania metanu w formacjach węglowodoronośnych, takich jak odwierty metanowe w pokładach i złożach węgla, przy użyciu kultury mikroorganizmów pochodzących z formacji. Informacja genetyczna uzyskana z rezydentnych populacji drobnoustrojów zamieszkujących w formacjach węglowodoronośnych jest używana do identyfikacji i stymulacji enzymów zaangażowanych w różne szlaki przemiany węglowodoru w metan, które występują w jednym lub większej liczbie mikroorganizmów w formacji lub są wprowadzone do formacji, korzystnie wraz ze zidentyfikowanym stymulantem.

Sposoby według wynalazku dostarczają stopniowe podejście do identyfikacji stymulantów i/lub DMA przydatnych dla zwiększenia biogenicznego wytwarzania metanu. Podane tutaj przykłady wskazują, że stopniowe podejście do skutecznej identyfikacji stymulantów zwiększa wytwarzanie metanu. W zawartych przykładach próbki wód złożowych, zostały pobrane z odwiertów metanowych złóż węgla w San Juan Basin, których wiek poprzednie badania określiły na 70000000 lat ze względu na oddalenia od powierzchni i brak dowodów na wydarzenia mieszania podpowierzchniowego. Woda może być pobrana z głowicy odwiertu, zbiornika rozdzielającego (oddzielacza bębnowego) lub zbiornika magazynowego, jako że te próbki są najłatwiej dostępne. Próbki wody zawierające żywe mikroorganizmy były następnie przeglądane za pomocą mikroskopii świetlnej, a mikroorganizmy hodowano przy użyciu wody złożowej jako podłoża mineralnego. Kultury mikroorganizmów zostały wzbogacone mikroorganizmami wytwarzającymi metan wykorzystującymi węgiel jako jedynego źródła węgla. Różne kombinacje akceptorów elektronów, takie jak azotan, siarczan lub fosforan żelaza badano jako stymulanty oddychania mikroorganizmów. Następnie za pomocą chromatografii gazowej dokonywano selekcji wzbogaceń mikrobiologicznych pod kątem wytwarzania metanu. Skład hodowanej zbiorowości mikroorganizmów był analizowany przy użyciu markerów filogenetycznych w celu zidentyfikowania dominujących grup mikroorganizmów, a niektóre mikroorganizmy zostały niezależnie hodowane w czystych kulturach (dekonwolucja), w celu zbadania ich profili enzymatycznych, metabolizmu i zdolności do rozkładu węgla. Zbiorowość może zostać odbudowana i przygotowana do zoptymalizowanego wytwarzania metanu z węgla w racjonalny sposób (rekonstytucja) tworząc zaprojektowany złożony ekosystem bakterii lub określony zespół mikroorganizmów (z ang. defined microbial assemblage - DMA).

Skuteczność sposobów według niniejszego wynalazku można stwierdzić w identyfikacji tlenu jako stymulanta zwiększającego biogeniczne wytwarzanie metanu z węgla. Poprzez określenie obecności dużej liczby oksygenaz, monooksygenaz i dioksygenaz w analizach genomowych próbek, tlen został zidentyfikowany jako stymulant. Identyfikacja tych enzymów była niespodziewana ze względu na pochodzenie mikroorganizmów ze środowiska beztlenowego. Bakteryjne dioksygenazy węglowodorów aromatycznych są wieloskładnikowymi układami enzymatycznymi, które dodają ditlen do pierścienia aromatycznego, tworząc cis-diole arenów, celem utleniania benzenu do cis-1,2-dihydroksycyklo-heksa-3,5-dienu (cis-diol benzenu) przez dioksygenazę toluenową (Gibson, DT, Cardini, GE, Maseles, FC, Kallio, RE Incorporation of oxygen-18 into benzene by Pseudomonas putida. Biochemistry. 1970. 9:1631-1635). Inne rodzaje oksygenaz wykryte w analizie genomowej wzbogacenia wytwarzającego metan i wyizolowanego szczepu Pseudomonas są związane z 2,3-dioksygenazą katecholową. Dioksygenazy katecholowe są enzymami z grupy metaloprotein, które dokonują oksydacyjnego rozszczepienia katecholi. Ta klasa enzymów przyłącza ditlen do substratu. Dioksygenazy katecholowe należą do klasy oksydoreduktaz i wykazują kilka różnych specyficzności do substratów, w tym 1,2-dio-ksygenazy katecholowe (EC 1.13.11.1), 2,3-dioksygenazy katecholowe (EC 1.13.11.2), i 3,4-dio-ksygenazy kwasu protokatechowego (EC 1.13.11.3). Miejsce aktywne dioksygenaz katecholowych najczęściej zawiera żelazo, ale znane są również formy zawierające mangan. Reakcje katalizowane przez oksygenazy uwalniają energię, która może być wykorzystana do wzrostu mikroorganiPL 220 307 B1 zmów, a w wyniku tego wzrostu wytwarzane będą inne metabolity, które mogą być zasymilowane przez inne gatunki.

Tlen może być gazem o dużym znaczeniu pod powierzchnią, ponieważ znane są doniesienia, że szczepy tlenowe prawidłowo rozwijają się w środowiskach uznawanych za beztlenowe, takich jak złoża ropy naftowej (Nazina i in. The phylogenetic diversity of aerobic organotrophic bacteria from the

Dagang high temperature oil field. Dagang. 2007. Microbiology 74:343-351). Jednak metody te nie opisują mechanizmu lub trybu działania, a bez takiej wiedzy zdolność do regulowania lub kontrolowania podstawowych procesów biologicznych i odpowiedzi zbiorowości mikroorganizmów na takie bodźce jest ograniczona.

Źródła mikroorganizmów i ich charakterystyka

Stosowane tu określenie „formacja węglowodoronośna” odnosi się do dowolnego źródła węglowodorów, z którego może być wytwarzany metan, w tym, ale nie tylko, węgiel, torf, węgiel brunatny, łupki naftowe, formacje ropy naftowej, tradycyjny olej czarny, mazut, piaski roponośne oraz piaski bitumiczne. W różnych przedstawionych tutaj postaciach, formacja węglowodoronośna lub nawet środowisko formacji węglowodoronośnej mogą obejmować, ale nie tylko, łupki naftowe, węgiel, pokłady węgla, węgiel odpadowy, pochodne węgla, węgiel brunatny, torf, formacje ropy naftowej, piaski bitumiczne, gleby zanieczyszczone węglowodorami, osady ze zbiorników ropy naftowej, zwierciny i tym podobne, a nawet może obejmować te formy lub nawet otoczenie jako dodatek do łupków naftowych, węgla, pokładów węgla, węgla odpadowego, pochodnych węgla, węgla brunatnego, torfu, formacji ropy naftowej, piasków bitumicznych, gleby zanieczyszczonej węglowodorami, osadów ze zbiorników ropy naftowej, zwiercin i tyra podobnych. W niektórych postaciach, niniejszy wynalazek można stosować do formacji węglowodoronośnej in situ, czasami określanej jako środowisko formacji węglowodoronośnej in situ lub środowiska wytwarzania metanu in situ. Postaci mogą obejmować formacje węglowodoronośne ex situ, czasami określane jako środowiska formacji węglowodoronośnej ex situ lub środowiska wytwarzania metanu ex situ. In situ może odnosić się do formacji lub środowiska, w którym źródła węglowodoronośne mogą być w ich pierwotnych, źródłowych lokalizacjach, na przykład środowisko in situ może obejmować formacje podziemne. Ex situ może odnosić się do formacji lub środowiska, w którym formacja węglowodoronośna została usunięta z pierwotnej lokalizacji, a może nawet istnieć w bioreaktorze, reaktorze ex situ, silosie, powyżej struktury ziemi i w podobnych sytuacjach. Jako nieograniczający przykład, bioreaktor może odnosić się do dowolnego urządzenia lub systemu, który podtrzymuje biologicznie czynne środowisko.

Gdy jako przykład źródła węglowodoronośnego używany jest węgiel, to wówczas istnieje wiele źródeł mikroorganizmów lokalnych, mogących odgrywać rolę w przemianie węglowodoru w metan, które mogą być analizowane. Węgiel jest złożoną substancją organiczną, która składa się z kilku grup macerałów czyli głównych rodzajów materii organicznej, które gromadzą się w różnych układach depozycyjnych, takich jak torfowiskowe bagna lub moczary. Skład macerałowy, a więc skład węgla, jest zmienny w poziomie i pionie w poszczególnych złożach węgla. Gdy określono, że mikroorganizmy zawierają enzym szlaku zaangażowanego w etap przemiany, stwierdzono, że różne określone zespoły mikroorganizmów lub stymulanty, wskazane przez sposoby według niniejszego wynalazku mogą działać lepiej na konkretne grupy macerałów i dlatego też każde ze złóż węgla może być traktowane jednostkowo, z uwagi na to, jakiego rodzaju mikroorganizm i stymulant są najbardziej wydajne w biokonwersji węgla in situ.

Istnieje wiele naturalnie występujących mikroorganizmów, które są związane z węglem i innymi podpowierzchniowymi osadami bogatymi w substancje organiczne. Z czasem, w wyniku procesu doboru naturalnego, te gatunki bakterii mogą stać się bardzo wydajne w metabolizmie podziemnej materii organicznej. Stosunkowo szybkie przystosowanie bakterii do lokalnych warunków środowiska wskazuje, że mikroorganizmy zebrane z basenów lub poszczególnych pokładów węgla, mogą być niepowtarzalne genetycznie. Po pobraniu tych mikroorganizmów, mogą być one dalej hodowane w kulturach laboratoryjnych, jak to tutaj opisano, w celu oceny i określenia czynników wzmagających i/lub ograniczających przemianę węgla w metan. W niektórych przypadkach może brakować ważnego składnika odżywczego lub pierwiastka śladowego, a dodanie tego czynnika ograniczającego może znacząco zwiększać wytwarzanie metanu. Kiedy bakterie są pozbawione składników odżywczych, zachodzą zmiany fizjologiczne, a jeśli stan głodu trwa w dalszym ciągu, wszystkie układy metaboliczne przestają działać i następuje wstrzymanie metabolizmu bakterii. Kiedy zajdą zmiany warunków, bakterie mogą odzyskać swoją aktywność i ponownie utworzyć żywotną populację. Dlatego też możliwe jest, że w osadach bogatych w substancje organiczne, niektóre bakterie, które osiągnęły stan

PL 220 307 B1 wstrzymania metabolizmu, dla odzyskania aktywności populacji wymagają jedynie dodania brakujących składników odżywczych zgodnie z wynalazkiem. Poprzez specyficzną analizę enzymów obecnych w takich populacjach, możemy zidentyfikować sposoby pobudzania szlaków metabolicznych związanych z przemianą węgla w metan, przeprowadzana przez jednego lub większą liczbę członków tych populacji mikroorganizmów.

Bakterie beztlenowe spod powierzchni mogą być pobrane kilkoma różnymi sposobami, które obejmują (1) wytworzoną lub pobraną wodę złożową, (2) zwierciny, (3) próbki rdzeniowe ścian bocznych (4) pełne próbki rdzeniowe i (5) pełne próbki rdzeniowe pod ciśnieniem. Próbka rdzeniowa pod ciśnieniem może stanowić najlepszą podstawę do pobrania żywych populacji mikroorganizmów, ale odkryliśmy, że pobranie populacji mikroorganizmów z wody złożowej dostarcza reprezentatywną próbkę populacji obecnych mikroorganizmów. Metanogeny są bezwzględnymi beztlenowcami, ale pozostają żywotne w obecności tlenu nawet przez 24 godziny, tworząc wielokomórkowe skupiska. Dodatkowo, mikrośrodowisko beztlenowe/redukujące może potencjalnie przedłużyć żywotność bakterii beztlenowych. W niektórych przypadkach, zwierciny zebrane i umieszczone w szczelnie zamkniętych pojemnikach beztlenowych będą zawierać mikroorganizmy, które są zdolne do przemiany węgla w metan w ciągu kilku godzin, w ten sposób powodując błędne pomiary zawartości gazu.

Zoptymalizowaliśmy sposoby pobierania na miejscu, aby zapewnić w ten sposób optymalny uzysk beztlenowych populacji mikroorganizmów. Niniejszy wynalazek może obejmować pobieranie populacji mikroorganizmów w warunkach beztlenowych, sposobami wcześniej opisanymi w zgłoszeniu PCT nr PCT/US2008/057919 (WO2008/116187) i hodowlę lokalnych mikroorganizmów, zamieszkujących w środowisku formacji węglowodoronośnych, wodzie złożowej z takich formacji lub odwiertach metanowych w złożach węgla.

Dostarczone tutaj sposoby stwarzają także możliwość genetycznej zmiany mikroorganizmów. Poprzez określenie funkcji enzymatycznych rezydentnych mikroorganizmów i stymulantów, które mogą być wykorzystane do zwiększenia wytwarzania metanu, uzyskuje się informacje, które można wykorzystać do inżynierii genetycznej mikroorganizmów, w celu nabrania przez nie zdolności, które mogą być powiązane ze stymulacją i zwiększonym wytwarzaniem metanu. Selekcja mikroorganizmów za pomocą opisanych tutaj metod wzbogaca zdolność wydajnego metabolizowania węgla i innych substratów bogatych w substancje organiczne. Po przeprowadzeniu analizy enzymatycznej kultur wzbogaconych, możemy zoptymalizować docelowe stymulanty i/lub genetycznie zmodyfikowane bakterie. Różne możliwości wzmagania wytwarzania metanu z szybów obejmują wprowadzenie do formacji zidentyfikowanych stymulantów, zidentyfikowanych mikroorganizmów, określonych zespołów organizmów, genetycznie zmodyfikowanych organizmów, lub ich kombinacji.

Zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku lokalne mikroorganizmy są identyfikowane, a następnie stymulowane do przekształcania węglowodorów w metan. Mikroorganizmy występujące naturalnie w formacji są korzystne, ponieważ wiadomo, że są one w stanie przetrwać i prawidłowo rozwijać się w środowisku formacji, oraz powinny dostarczyć składniki enzymatyczne różnych szlaków prowadzących od hydrolizy węglowodorów do metanogenezy. Jednakże niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do wykorzystania lokalnych mikroorganizmów. Korzystne może być połączenie informacji uzyskanych z analizy enzymatycznych profili lokalnych mikroorganizmów z uzyskanymi z mikroorganizmów egzogennych. Informacje te mogą pochodzić ze znanych mikroorganizmów, korzystnie takich, które nadają się do wzrostu w formacjach podziemnych i poprzez analogię, posiadają podobne możliwe procesy enzymatyczne.

Stosowane tutaj określenie „określony zespół mikroorganizmów lub „DMA, odnosi się do kultury obejmującej więcej niż jeden mikroorganizm, w którym różne szczepy są celowo połączone lub wybrane dla optymalizacji przemiany węglowodoru w metan. Mikroorganizmy zespołów są „określone tak, że w dowolnym czasie możemy określić członków populacji za pomocą metod genetycznych, takich jak taksonomia 16S, jak opisano w niniejszym dokumencie. DMA nie musi być statyczny w czasie, ale może się rozwijać w miarę tego, jak zmienia się kultura, w celu optymalizacji hydrolizy węglowodorów i wytwarzania metanu. Optymalnie, DMA jest przygotowany tak, aby dostarczyć mikroorganizmy o silnych profilach enzymatycznych w szlakach przemiany węglowodorów w metan. DMA może składać się z 2 lub większej liczby mikroorganizmów, w dowolnej kombinacji, w celu dostarczenia gatunków bakterii lub archeonów, pozwalających na przemianę węglowodorów do produktów pośrednich, prowadzących do wytwarzania metanu i/lub dowolnych gatunków metanogennych. Na przykład w DMA może być obecnych 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 lub więcej organizmów. CzłonPL 220 307 B1 kowie DMA działają wzajemnie synergicznie w celu wytworzenia metanu lub wraz z mikroorganizmami obecnymi w formacji węglowodoronośnej.

Określenie „mikroorganizmy obejmuje organizmy bakterii i archeonów, jak również dotyczy grzybów, drożdży i pleśni. Jest zrozumiałe, że bakterie i archeony są ogólnie reprezentatywne dla mikroorganizmów zdolnych do rozkładu węglowodorów i przemiany otrzymanych produktów w metan. Linie podziału pomiędzy klasami mikroorganizmów nie zawsze są wyraźne, szczególnie między bakteriami i grzybami. Korzystne jest zatem, aby stosując określenie mikroorganizmy obejmować nim wszystkie mikroorganizmy, zdolne do przemiany węglowodorów w metan, bez względu na to, jakie mogą być powszechnie stosowane klasyfikacje. Spośród tych mikroorganizmów, korzystne są te, które zwykle są klasyfikowane jako bakterie i archeony. Jeśli w opisanych tutaj sposobach używa się egzogennych bakterii i archeonów to inne mikroorganizmy, takie jak grzyby, drożdże, pleśnie i tym podobne również mogą być stosowane.

Stosowane tutaj określenie „mikroorganizmy beztlenowe odnosi się do mikroorganizmów, które mogą żyć i wzrastać w atmosferze zawierającej mniej wolnego tlenu niż powietrze w troposferze (tj. mniej niż 18% mol., wolnego tlenu). Mikroorganizmy beztlenowe obejmują organizmy, które mogą funkcjonować w atmosferach, gdzie stężenie wolnego tlenu wynosi mniej niż około 10% mol., bądź mniej niż około 5% mol., bądź mniej niż około 2% mol., bądź mniej niż 0,5% na mol.

Stosowane tutaj określenie „względne beztlenowce odnosi się do mikroorganizmów, które mogą prowadzić procesy metaboliczne lub wzrastać w środowiskach o zarówno wysokim, jak i niskim stężeniu wolnego tlenu.

Przemiana węglowodorów w metan wymaga aktywnego uczestnictwa metanogenów. Stosowane tutaj określenie „metanogen odnosi się do bezwzględnych i względnych mikroorganizmów beztlenowych, które wytwarzają metan w procesach metabolicznych. Obecność metanogenów w próbkach wskazuje na wysokie prawdopodobieństwo powstawania metanu in situ. Metanogeny zazwyczaj dzieli się na cztery główne grupy mikroorganizmów: Methanobacteriales, Methanomicrobacteria i pokrewne, Methanopyrales i Methanococcales. Uważa się, że wszystkie mikroorganizmy metanogenne wykorzystują te same elementy biochemiczne do syntezy metanu. Metanogeneza dokonuje się poprzez serię reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy zawierające metale. Jednym ze szlaków jest redukcja CO2 do CH4 przez dodanie za jednym razem jednego atomu wodoru (metanogeneza redukująca CO2). Inną drogą jest fermentacja octanu i związków jednowęglowych (innych niż metan) do metanu (fermentacja octanu lub metanogeneza acetoklastyczna). Ostatnim etapem we wszystkich znanych szlakach metanogenezy jest redukcja grupy metylowej do metanu przy użyciu enzymu znanego jako reduktaza metylowa. Ponieważ obecność reduktazy metylowej jest wspólna dla wszystkich metanogenów, jest ona cechą określającą organizmy metanogenne. Korzystnym sposobem identyfikacji obecności metanogenów jest zbadanie bezpośrednio genu metanogenu niezbędnego do wytwarzania enzymu reduktazy metylowej. Alternatywnie obecność metanogenów można ustalić przez porównanie pozyskanego 16S rDNA z biblioteką 16S rDNA archeonów, za pomocą technik znanych fachowcom w dziedzinie (ogólnie określane dalej jako taksonomia 16S).

Klasy metanogenów obejmują miedzy innymi Methanobacteriales, Methanomicrobacteria, Methanopyrales, Methanococcales i Methanosaeta (np. Methanosaeta thermophila). Konkretne przykłady metanogenów to Methanobacter thermoautotorophicus i Methanobacter wolfeii. Metanogeny mogą również wytwarzać metan poprzez metaboliczne przemiany alkoholi (np. metanolu), amin (np. metyloamin), tioli (np. metanotiol), i/lub siarczków (np. siarczku dimetylu). Przykłady tych metanogenów obejmują metanogeny z rodzajów Methanosarcina (np. Methanosarcina barkeri, Methanosarcina thermophila, Methanosarcina siciliae, Methanosarcina acidovorans, Methanosarcina mazeii, Methanosarcinafrisius); Methanolobus (np. Methanolobus bombavensis, Methanolobus tindarius, Methanolobus vulcani, Methanolobus taylorii, Methanolobus oregonensis); Methanohalophilus (np. Methanohalophilus mahii, Methanohalophilus euhalobius); Methanococcoides (np. Methanococcoides methylutens, Methanococcoides burtonii) i/lub Methanosalsus (np. Methanosalsus zhilinaeae). Mogą to być również metanogeny z rodzaju Methanosphaera (np. Methanosphaera stadtmanae i Methanosphaera cuniculi które, jak wykazano, metabolizują metanol do metanu). Ponadto mogą to być metanogeny z rodzaju Methanomethylovorans (np. Methanomethylovorans hollandica, co do której wykazano, że metabolizuje metanol, siarczek dimetylu, metanotiol, monometyloaminę, dimetyloaminę i trimetyloaminę do metanu).

Opisaną tutaj cechą niniejszego wynalazku jest to, że zbiorowiska mikroorganizmów uzyskane z różnych próbek środowiskowych mogą zostać poddane badaniu z użyciem dostarczonych tutaj na10

PL 220 307 B1 rzędzi genomowych, a ponadto populacje mikroorganizmów mogą być hodowane i ewentualnie izolowane i/lub wzbogacane w laboratorium przy użyciu sposobów według wynalazku. Dzięki zastosowaniu tych metod na poziomie genomu i poprzez dokładne określenie profili enzymatycznych mikroorganizmów zaangażowanych w przemianie węglowodorów w metan, możliwe jest podstawowe zrozumienie metabolizmu zbiorowisk mikroorganizmów, a dokładniej, metanogenicznego rozkładu węgla w wodzie złożowej i w pokładach węgla. W związku z tym jesteśmy w stanie określić niszę ekologiczną każdej populacji i w konsekwencji opracować stymulanty i/lub DMA, które mogłyby skutkować wzmożeniem biologicznego wytwarzania metanu.

Zgodnie ze sposobami według niniejszego wynalazku mikroorganizmy obecne w środowisku formacji węglowodoronośnych (lokalne mikroorganizmy), i/lub enzymy występujące w tych mikroorganizmach są identyfikowane, a następnie stymulowane lub modulowane w celu przemiany węglowodorów w metan. Mikroorganizmy występujące naturalnie w formacji są korzystne, ponieważ wiadomo, że są one w stanie przetrwać i prawidłowo rozwijać się w środowisku formacji. Jednakże wynalazek nie jest ograniczony do zastosowania lokalnych mikroorganizmów. Możliwe jest również zidentyfikowanie mikroorganizmów egzogennych, odpowiednich do wzrostu w formacjach podziemnych i pochodzących z nich enzymów, i wprowadzenie tych mikroorganizmów lub enzymów do formacji przez znane techniki wstrzyknięcia przed, w trakcie lub po zastosowaniu sposobu według niniejszego wynalazku. Na przykład, jeśli formacja zawiera tylko dwa mikroorganizmy z pożądanego trójskładnikowego konsorcjum, lub tylko dwie z trzech pożądanych funkcji enzymu, szlaku enzymatycznego przemiany węglowodoru w metan, to brakujący mikroorganizm, enzym, lub stymulant dla takich mikroorganizmów lub enzymu może być wstrzyknięty do formacji. Mikroorganizmy, lokalne lub egzogenne, mogą być również organizmami modyfikowanymi rekombinacyjnie lub syntetycznymi.

Analizy metagenomiczne i kwasu nukleinowego

W niniejszym wynalazku zaproponowano nowe podejście i potencjalnie paradygmat dla wzmagania wytwarzania metanu. Dotyczy to opisu genomów i metagenomów, najbardziej podstawowych jednostek biologicznych w przyrodzie. Poprzez określenie genomu całej zbiorowości, znanego również jako metagenom, w miejscach wytwarzania metanu możliwe jest podstawowe zrozumienie mikrobiologicznego wytwarzania metanu, w tym wykorzystywanych substratów i otrzymywanych produktów pośrednich i produktów. Ponadto możliwe jest wyjaśnienie interakcji i działań synergicznych wśród różnych populacji poprzez przeniesienie elektronu, które skutkuje ostatecznie kaskadowym przeniesieniem energii w kierunku metanu. Dane z hodowli w połączeniu z wynikami genomowymi sugerują, że populacja mikroorganizmów, a tym samym wytwarzanie gazu pod ziemią, może być stymulowana przez interwencję obejmującą suplementację substratami, reagentami lub czynnikami wzrostu i/lub zaszczepienie określonymi mikroorganizmami, które powodują zwiększenie wytwarzania metanu. Sposoby według niniejszego wynalazku i uzyskane wyniki stanowią pierwsze studium mikrobiologii podziemnej, łączącej metagenomikę, hodowlę mikroorganizmów i analizy genomu z izolowanych szczepów. Przedstawione wyniki wskazują że współzależność tych dziedzin jest niezbędn a w celu wyczerpującego zrozumienia ekosystemu.

Stosowane tutaj określenie „metagenom” lub „metagenomika” odnosi się do materiału genetycznego, oraz analizy tego materiału genetycznego, z próbek środowiskowych, reprezentujących profil wszystkich mikroorganizmów obecnych w próbce. Metagenomika określana jest również w dziedzinie jako „genomika zbiorowości” lub „genomika środowiska”. Zazwyczaj metagenomika obejmuje sekwencjonowanie kwasu nukleinowego i analizę całkowitego DNA populacji organizmów uzyskanych ze środowiska, na przykład, połączone uzyskiwanie DNA ze wszystkich mikroorganizmów w próbce bez potrzeby oddzielnej hodowli szczepów poszczególnych członków populacji mikroorganizmów.

Na ogół, najpierw izolowane jest DNA całej zbiorowości mikroorganizmów, czyli metagenom, a następnie amplifikowane przy użyciu starterów specyficznych dla genu (powszechnie uniwersalnych starterów 16S) i technologii PGR. Następnie fragmenty oczyszcza się przez wiele technik i poddaje ligacji do nośników molekularnych (np. DNA plazmidowe) i przenosi do bakterii (zwykle E. coli) w ramach procesu klonowania, celem wytworzenia dużej liczby wyizolowanych fragmentów DNA. Kultury poszczególnych kolonii bakterii stosowane są do izolowania pojedynczych klonów (rekombinowane DNA plazmidowe), a następnie te klony są sekwencjonowane z zastosowaniem starterów specyficznych dla sekwencji docelowej. Uzyskane sekwencje DNA są następnie porównywane z sekwencjami DNA znanych szczepów z molekularnych baz danych genetycznych. W większości przypadków tożsamość mikroorganizmów można wywnioskować, gdy występują bliskie dopasowania do znanych mikroorganizmów o znanej charakterystyce fizjologicznej i ekologicznej.

PL 220 307 B1

Zazwyczaj DNA jest izolowane metodami znanymi w dziedzinie z DNA środowiska, a następnie cięte na fragmenty, które są wykorzystywane przy konstruowaniu biblioteki klonów DNA. Biblioteki klonów mogą być bibliotekami zawierającymi małe lub średnie inserty (rozmiar insertu 2-15 kb) lub duże inserty sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC) lub bibliotekami fozmidów (rozmiar insertu do 150 kb), które mogą być sekwencjonowane na sposób losowy lub ukierunkowany.

Dalsze analizy metagenomu obejmują niezależną od kultury analizę 16S rRNA w celu określenia filogenetycznej różnorodności (dalej taksonomia 16S), a ponadto analizy sekwencji w celu zidentyfikowania genów w metagenomie będących przedmiotem zainteresowania. W losowym podejściu do sekwencjonowania, klony są losowo wybierane i sekwencjonowane, a otrzymane sekwencje łączone są w większe ciągłe elementy („contig”), poprzez dopasowanie pokrywających się sekwencji. Uzyskane dane są contigami o różnych długościach, jak również krótszymi niepołączonymi fragmentami. Dostępność całkowicie zsekwencjonowanych genomów „odniesienia może pomóc w procesie łączenia blisko spokrewnionych genomów. W przypadku ich braku, contigi mogą być przyporządkowane do różnych „skrzynek” w oparciu o ich zawartość G + C, użycie kodonów, obszaru pokrywania się sekwencji, obecność krótkich n-merów (częstotliwość nukleotydu), i innych parametrów, co pozwala podzielić je na grupy, które mogą być postrzegane jako „gatunek”. Sekwencje kodujące (CDS, geny) są wówczas za pomocą różnych metod przewidywane z tych danych. Często w podejściu sekwencjonowania losowego zidentyfikowanych genów nie można przypisać do konkretnego gatunku mikroorganizmów (np. nie ma przynależności taksonomicznej lub filogenetycznej), reprezentują one jednak możliwości ogólnej zbiorowości mikroorganizmów i mogą ujawniać cechy ich środowiska. W „ukierunkowanym” podejściu do sekwencjonowania, klony są najpierw przesiewane pod kątem obecności pożądanego genu (np. przez amplifikację PCR) lub funkcji genu (w teście funkcjonalnym). Sekwencjonowanie docelowych klonów dużych insertów w całości umożliwia odzyskanie pełnych operonów, np. tych które kodują szlaki metaboliczne.

Powszechnym podejściem jest ukierunkowanie na fozmidy, przenoszące geny filogenetycznie informacyjne, takie jak 16S rRNA. W metodzie tej, zwanej „filogenetycznym zakotwiczen iem”, jeśli wykrywany jest gen 16S rRNA, insert fozmidowy jest sekwencjonowany w całości, co pozwala na przypisanie sekwencji DNA genomowego do konkretnego filotypu. Takie podejście pozwala powiązać filogeny (rRNA) z domniemanymi funkcjonalnymi genami (przewidywanymi z sekwencji otaczających insertów). Fozmidy przenoszące geny specyficzne dla procesu lub biomarkery (np. w przypadku procesów, które mogą dominować w otoczeniu podczas badań, takich jak utlenianie metanu lub denitryfikacja) mogą być również celem sekwencjonowania w celu rozszerzenia informacji na temat szlaków tych procesów. Przez połączenie obu podejść; losowego i ukierunkowanego, geny będące przedmiotem zainteresowania (np. geny 16S rRNA z nieznanych filotypów) lub nowe geny zidentyfikowane w fazie sekwencjonowania losowego, mogą być zastosowane do przesiewania i dobierania innych klonów do sekwencjonowania lub identyfikacji klonów łączących i rozszerzania obszaru pokrywania genomu.

W specyficznej analizie porównawczej, geny zidentyfikowane z metagenomu i/lub reprezentowanych w nim mikroorganizmów można porównać do znanych rodzin białek w celu określenia obecności produktów genów kodujących enzymy zaangażowane w szlaki przemiany węglowodoru w metan. Na przykład, baza danych Pfam jest dużym zbiorem rodzin białek, z których każda reprezentowana jest przez wielokrotne porównania liniowe sekwencji i ukryte modele Markowa (HMM). Białka na ogół składają się z jednego lub większej liczby regionów funkcjonalnych, powszechnie określanych mianem domen. Różne kombinacje domen stanowią podstawę różnego rodzaju białek występujących w naturze. Identyfikacja domen, które występują w białkach może zatem umożliwić wgląd w ich funkcję. Patrz: The Pfam protein families database: R.D.Finn, J.Tate, J.Mistry, P.C.Coggill, J.S.Sammut, H.R.Hotz, G.Ceric, K.Forslund, S.R.Eddy, E.L.Sonnhammer i A.Bateman, Nucleic Acids Research (2008) Database Issue 36:D281-D288. Poprzez porównanie informacji genomu z bazą danych Pfam, określone tutaj sposoby dostarczają profil enzymatycznych funkcji obecnych w metagenomie, poszczególnych szczepach mikroorganizmów, DMA lub ich dowolnych kombinacjach.

Identyfikacja stymulantów

Stosowane tutaj określenie „stymulant odnosi się do każdego czynnika, który może być zastosowany do zwiększenia lub stymulacji biogenicznego wytwarzania metanu w formacjach węglowodoronośnych. Korzystnie, stymulant jest substratem, reagentem lub kofaktorem dla enzymu, który jest zaangażowany w szlak przemiany węglowodoru w metan. W pewnych przypadkach stymulant jest dodawany w celu modulowania enzymu (zwiększenia, zmniejszenia lub modulowania w dowolny spo12

PL 220 307 B1 sób), który jest obecny w mikroorganizmach istniejących w formacjach węglowodoronośnych. W pewnych przypadkach stymulantem może być sam enzym, mikroorganizm (np. mikroorganizm eksprymujący enzym lub inne białko w celu modulacji odpowiedniego enzymu, lub taki mikroorganizm wytworzony na drodze rekombinacji lub syntetycznie) lub określony zespół mikroorganizmów. W każdym przypadku funkcją stymulanta jest pobudzanie istniejącego wytwarzania poprzez zwiększenie poziomu aktywności lub wzrostu mikroorganizmu, lub zwiększenie, zmniejszenie lub modulowanie w dowolny sposób aktywności enzymatycznej enzymu zaangażowanego w szlak przemiany węglowodoru w metan, w celu optymalizacji końcowego wytwarzania metanu w formacjach węglowodoronośnych.

Stymulanty mogą powodować wzmocnienie, wymianę lub dodanie jakiegokolwiek enzymu, który nie jest optymalnie reprezentowany lub funkcjonalny w środowisku węglowodoronośnym. Celem jest optymalizacja i/lub uzupełnienie szlaku od węglowodorów do metanu. Zazwyczaj wymaga to reprezentacji enzymów lub mikroorganizmów eksprymujących enzymy, które są zdolne do przemiany węglowodoru w produkt taki jak wodór, dwutlenek węgla, octan, mrówczan, metanol, metyloamina lub dowolne inne substraty metanogenne i enzymów metanogennych. Ogólne kategorie enzymów zawierają enzymy zdolne do hydrolizy węgla o niskim stopniu uwęglenia, depolimeryzacji węgla, beztlenowej lub tlenowego rozkładu policyklicznych węglowodorów aromatycznych (PAH), homoacetogenezy i metanogenezy (w tym wodorotrofowej lub redukującej CO2 i acetoklastycznej), lub ich kombinacji, aby osiągnąć przemianę węglowodoru w metan. Enzymy zapewniające takie funkcje mogą obejmować na przykład: peroksydazy, oksydazy fenolowe, oksydazy alkoholowe, lakkazy, hydrolazy, hydrolazy glikozylowe, esterazy, eterazy, oksydazy, nitrogenazy, celulazy, amylazy, glukanazy, pullulanazy, reduktazy, dysmutazy, oksygenazy, monooksygenazy, dioksygenazy, katalazy, hydrogenazy i karboksylazy.

Przykładami stymulantów są liofilizowane mikroorganizmy, takie jak metanogeny, syntrofy, mikroorganizmy fermentacyjne i/lub hydrolityczne; lub stymulant, substrat, reagent lub kofaktor może mieć charakter chemiczny i obejmować takie związki jak azot, fosfor, potas, witaminy, metale śladowe, ekstrakt drożdżowy, związek zawierający siarkę, związek zawierający azot, związek zawierający fosfor, pierwiastek śladowy, akceptor elektronu, donor elektronów, chlorowiec, metal, alkohol, kwas organiczny, alkan, alken, alkin, związek aromatyczy, amina, eter, aldehyd, keton, tiol, octan, węglowodór aromatyczny i gaz.

Po zidentyfikowaniu enzymu sposobem według wynalazku, można zidentyfikować odpowiedni dla danego enzymu substrat, reagent lub kofaktor.

Szczególne stymulanty obejmują na przykład: ekstrakt drożdżowy, NH4CI, NaNO3, K2HPO4. Koenzym M, PO4, zestaw witamin minus fosforany, metale śladowe, O2, H2, związki fosforu, kwas mlekowy, dodatki mineralne (takie jak chlorek amon, fosforan, sód, potas, magnez i wapń), dodatki metali (takich jak Mn, Fe, Co, Zn, Cu, Ni, Se, W lub Mo), dodatki witamin (np. pirydoksyna, tiamina, ryboflawina, wapń, pantotenian, kwas tiooctowy, kwas p-aminobenzoesowy, kwas nikotynowy, witamina B12, biotyna, kwas foliowy i kwas merkaptoheptanosulfonowy, pirogronian, alkohole alkilowe, metanol, etanol, 2-propanol, 2,3-butanodiol, sól kwasu waniliowego, glicyna, cysteina, mrówczan, etanoloamina, i 3,4,5-trimetoksybenzoesan, dodatek wody, mrówczan, octan, mleczan, pirogronian, NaCl, celuloza, roztwór mineralny, kwas cynamonowy, kwas benzoesowy, DNG, Alasan, kompozycja nawozów, chityna, chitozan, chloran, nadchloran oraz dowolne ich kombinacje.

Włączenie stymulantów w celu zwiększenia wytwarzania metanu.

Sposoby i procesy według wynalazku mogą być łatwo wykorzystane do zastosowania w warunkach polowych i wzmagania wytwarzania metanu in situ lub ex situ z formacji węglowodoronośnych takich jak węgiel. Istnieje kilka sposobów lub kombinacji technik wstrzykiwania, znanych w dziedzinie, które można zastosować in situ. Stymulanty, DMA lub mikroorganizmy zidentyfikowane sposobem według niniejszego wynalazku mogą być wstrzykiwanie bezpośrednio do spękań w formacji. Ukierunkowanie spękań, obecne ukierunkowanie naprężeń in situ, geometria złoża (węgla i/lub łupków) i lokalne struktury są czynnikami, które należy wziąć pod uwagę. Na przykład, istnieją dwie główne sieci (zwane płaszczyznami łupliwości) w pokładach węgla, zwane układem czołowych płaszczyzn łupliwości i stykowych płaszczyzn łupliwości. Czołowe płaszczyzny łupliwości są często bardziej ciągłe bocznie i przepuszczalne, a stykowe płaszczyzny łupliwości (które graniczą z czołowymi płaszczyznami łupliwości) są mniej ciągłe i przepuszczalne. Podczas stymulacji odwiertów metanowych pokładów węgla, wywołane spękania przecinają się z pierwotnymi czołowymi płaszczyznami łupliwości, co pozwala na większą dostępność do złoża. Jednak, gdy obecne ukierunkowanie naprężeń in situ jest prostopadłe do czołowych płaszczyzn łupliwości, ciśnienie naprężeń zamyka ciosy podłużne zmniejPL 220 307 B1 szając tym samym przepuszczalność, ale jednocześnie ciśnienia in situ zwiększają przepuszczalność układu stykowych płaszczyzn łupliwości. W tych warunkach, wywołane spękania są prostopadłe do kierunku stykowych płaszczyzn łupliwości, zapewniając lepszy dostęp do naturalnego układu spękań w złożu. Geometria wstrzyknięcia i odwiertów produkcyjnych, oraz to czy dla dostępu do złoża używane są poziome wiercenia, czy nie, zależą w dużej mierze od lokalnych warunków geologicznych i hydrologicznych.

W celu hydraulicznej stymulacji spękań metanem z pokładów węgla, jak w konwencjonalnych odwiertach ropy i gazu, jest tworzenie sieci wywołanych spękań, które łączą się z naturalnie występującymi sieciami spękań złoża. Stymulanty, DMA lub mikroorganizmy zidentyfikowane sposobem według wynalazku mogą być wprowadzane do naturalnie występujących i sztucznie wywołanych spękań pod ciśnieniem, w celu skierowania mieszaniny do naturalnie występujących spękań w głąb złoża, w celu maksymalizacji stopnia i wydajności biokonwersji. Podczas stymulacji spękań złóż, do formacji przez wiertnicę mogą być pompowane pod dużym ciśnieniem propant piasku i różne substancje chemiczne.

Stymulanty, DMA, czy mikroorganizmy mogą być wstrzykiwane do złoża w tym samym czasie co stymulacja spękań i/lub powstają spękania hydrauliczne. Większość zastosowań mikroorganizmów in situ będzie miała miejsce po stymulacji spękań i usunięciu wypełniających je płynów, gdy przywrócone zostaną podziemne warunki beztlenowe. Jednakże przy jednoczesnej stymulacji mikroorganizmami in situ i stymulacji spękań, korzystne jest stosowanie płynów stymulujących w warunkach beztlenowych lub o niskiej zawartości tlenu, tak aby utrzymywane były warunki beztlenowe w złożu, lub aby można je było łatwo osiągnąć po stymulacji. Wstrzyknięcie bakterii tlenowych przy jednoczesnej stymulacji doprowadzi do szybkiego zużycia tlenu i powrotu do warunków beztlenowych.

W niektórych przypadkach, płyny do obróbki wstępnej, które modyfikują węgiel, łupki węglowe lub łupki bogate w substancje organiczne, mogą być w biokonwersji stosowane łącznie z płynami spękań. Jednakże korzystnym sposobem pobudzania biokonwersji materii organicznej in situ jest wstrzyknięcie stymulantów, DMA lub mikroorganizmów pod ciśnieniem i w warunkach beztlenowych po stymulacji hydraulicznej spękań, a następnie płukaniu odwiertu.

Stymulanty, DMA lub mikroorganizmy zidentyfikowane sposobami według niniejszego wynalazku mogą zostać wprowadzone przez ponowne wprowadzenie wody złożowej pod powierzchnię, jak przedstawiono na FIG. 16. W skrócie, metan i wody złożowe są pompowane z orurowania odwiertu 1 do zbiornika rozdzielającego 2 (znanego także jako oddzielacz bębnowy) w celu usunięcia gazów z wody. Woda złożowa jest przechowywana w zbiorniku magazynowym 3, z którego może zostać przesłana do stacji konsolidacji lub skierowana do ponownego wprowadzenia pod powierzchnię. Stymulanty, DMA lub mikroorganizmy można następnie dodać do zbiornika przygotowawczego 4 i mieszać z wodą złożową. Sprężarka 5 lub system ciśnieniowy mogą być następnie wykorzystane do wprowadzenia stymulantów, DMA lub mikroorganizmów w wodzie złożowej pod ziemię.

Rozpuszczony tlen obecny w wodach złożowych in situ, może nie być dostępny dla mikroorganizmów w pokładach węgla, a tym samym staje się czynnikiem ograniczającym wzmożone wytwarzanie metanu. Wprowadzenie stymulantów, DMA lub mikroorganizmów, lub dostarczenie gazów, cieczy, żeli lub substancji stałych może zapewnić środowisko odpowiednie dla zwiększenia ilości metanu, w tym szczepy zdolne do tlenowego rozkładu węglowodorów w połączeniu z tlenem. Na przykład w przykładowej postaci, inokulum składające się z odpowiednich lokalnych szczepów, takich jak Pseudomonas w liczbie 10⁷ komórek na ml, można mieszać z żelem składającym się z substratów organicznych, takich jak gliceryna, następnie może być używane jako odżywka stymulująca wzrost w procesie fermentacji i wydzielanie metabolitów, w tym wodoru, które mogą być wykorzystywane przez metanogeny. Po zasymilowaniu żel będzie powoli uwalniał optymalne ilości tlenu, które z kolei będą wykorzystywane przez szczepy o zdolności do tlenowego rozkładu węglowodorów. Zmiany te i wynikający z nich metabolizm pobudzi przepływ elektronów do wytwarzania metanu w większej ilości i wydajności w porównaniu do odwiertów kontrolnych w tym samym złożu, w które nie interweniowano. Jest to szczególnie korzystne dla szczepów posiadających możliwość wzrostu tlenowego lub beztlenowego, które mogą dostosować metabolizm do celów rozkładu węglowodorów. W innej postaci, woda złożowa o wysokim stężeniu rozpuszczonego tlenu wstrzykiwana jest do odwiertu w celu rozprowadzenia tlenu, potrzebnego do reakcji katalizowanych oksygenazą. Tlen może być rozpuszczony w wodzie złożowej przez napowietrzanie w układach mechanicznych, takich jak wirnik lub inne mechanizmy. Alternatywnie, wykorzystany może być pośredni mechanizm wprowadzania tlenu do środowiska beztlenowego. Na przykład użyty może zostać chloran, jako akceptor elektronów, służący

PL 220 307 B1 generowaniu uwalniania tlenu przez enzymy reduktazy chloranowej i dysmutazy chlorynowej, które były obecne w analizie metagenomicznej.

W alternatywnej postaci, użyty może być sposób oparty na cząstkach, w celu rozprowadzenia stymulantów, DMA lub mikroorganizmów (łącznie: środków interwencyjnych) procesu podczas szczelinowania. Celem jest wprowadzenie tych środków interwencyjnych w celu trwałego wzmożenia wytwarzania metanu. Ulepszony układ dostarczania wstrzykuje środki głęboko do szczelin odwiertu i pozwala na rozłożone w czasie rozprzestrzenianie. Na przykład, środek interwencyjny odwiertu może być sformułowany zarówno jako stopniowo uwalniana w czasie powłoczka ziaren piasku używanych w procesie szczelinowania lub jako twarde cząstki, które powoli rozpuszczają się w miarę upływu czasu, o rozmiarze pomyślanym jako mniej więcej takie same, jak ziarna piasku stosowane w procesie szczelinowania i mogą być zmieszane razem przed dodaniem do roztworu gumy guar znanego jako propant. Niezależnie od postaci, gdy propant i cząstki pompowane są pod ciśnieniem do odwiertu, powlekane ziarna piasku lub twarde cząstki mieszane z piaskiem, są pod ciśnieniem wstrzykiwane w spękania odwiertu, utrzymując je otwarte, w celu ułatwienia uwalniania gazu lub ropy naftowej. Ponieważ środki interwencyjne są formułowane w taki sposób, aby zachodziło uwalnianie w czasie, podobnie do niektórych środków farmaceutycznych, związki i /lub bakterie będą rozpuszczać się powoli i dyfundować do otaczającej wody złożowej i do stykowych płaszczyzn łupliwości (lub drobnych pęknięć skalnych w przypadku ropy naftowej), gdzie prawdopodobnie przylegające bakterie osiadają. W ten sposób środki rozpuszczając się, stale pobudzają biogeniczną przemianę węgla w metan. Preparaty mogą być wymodelowane tak, aby uwalniać środek interwencyjny w ciągu godzin, dni, tygodni lub miesięcy w celu optymalizacji procesu stymulacji metanu. Powłoczka lub cząstki mogą być przygotowane w nieobecności tlenu w celu utrzymania żywotności ściśle beztlenowych bakterii, ale mogą również przenosić gazy, które stymulują wytwarzanie metanu.

Poniższe przykłady przedstawiono dla zilustrowania wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Pobieranie próbek i wzbogacanie mikroorganizmów wytwarzających metan z odwiertów metanowych złóż węglowych.

Objętość 200 l wody złożowej pobrano ze zbiornika magazynowego, a objętość 20 l ze zbiornika rozdzielającego odwiertu metanowego złoża węgla znajdującego się w San Juan Basin, Kolorado, USA. Próbki wody następnie przefiltrowano poprzez serię sterylnych sit od 1 mm do 45 μm, aby usunąć duże kawałki węgla i olejów, które zebrano razem z wodą złożową. Podpróbę następnie przeniesiono do 1 l jałowej butelki i przepuszczano N2 za pomocą przenośnego zbiornika i szklanej pipety. Butelki następnie szczelnie zamknięto korkiem butylowym i używano do inokulacji.

Pożywkę składającą się z bazy mineralnej i surowego węgla kopalnego jako źródła węgla, umieszczono w probówkach Hungate z 5 ml kultury i 0,5 g węgla kopalnego jako jedynego źródła węgla.

Skład pożywki dla kultur wzbogacenia metanogennego oraz czystych:

Na 1 l wody sterylnej:

NH4CI 0,5 g

KH2PO4 0,75 g

K2HPO4 1,5 g dostępne w handlu (ATCC) roztwory witamin i pierwiastków śladowych po 10 ml każdego.

Sterylizowano w 1 atm przez 15-30 minut, a następnie dodano z roztworu podstawowego: ekstrakt drożdżowy 0,05% stężenia końcowego

Na2Sx9H2O 3 mM stężenia końcowego cysteina-HCl 3 mM stężenia końcowego

Sterylizowano w 1 atm przez 15-30 minut, a następnie dodano z roztworu podstawowego odpowiednie źródło węgla i energii dla metanogenezy:

mieszaninę gazów CO2:H2/20; 80 do 2 atm.

W niektórych kulturach, do stymulacji oddychania beztlenowego i wzrostu użyto mieszaniny akceptorów elektronów składającej się z azotanu sodu (10 MM), siarczanu sodu (10 mM) i fosforanu żelaza (10 mM). Pożywka została przygotowana w warunkach beztlenowych przez dozowanie wszystkich składników w komorze beztlenowej w atmosferze z 5% H2, 5% CO2 zrównoważonej N2. Inne kultury obejmowały wykorzystanie autoklawowanego węgla. Do przygotowania pożywki nie użyto środków redukujących, takich jak siarczek sodu lub cysteina. Próbki zostały zaszczepione bezpośrednio w terenie, przez pobranie 1 ml beztlenowe z 1 l butelki przy pomocy strzykawki i igły, które wcześniej były trzy razy

PL 220 307 B1 przemyte N2. Zaszczepione probówki inkubowano w temperaturze 30°C i transportowano do laboratorium. Po kilku tygodniach wzrostu, próbki sprawdzano pod katem wzrostu pod mikroskopem, a wytwarzanie metanu mierzono metodą chromatografii gazowej. Wzbogacenia wybrano z uwagi na ich zdolność do wzrostu na węglu kopalnym jako jedynym źródle węgla i wytwarzanie metanu. Najwyższe stężenie metanu wykryto w kulturach, gdzie pominięto akceptory elektronów. Po sześciu kolejnych przeniesieniach z podstawowego wzbogacenia, wytwarzanie metanu okazało się być powtarzalne i skalowalne, dając stały wynik 3% fazy gazowej nad roztworem. Zbiorowość wybrana dla ciągłej charakterystyki została następnie przeniesiona do butelek z surowicą, metan był wytwarzany stale na poziomie około 3% fazy gazowej, w okresie między 10 a 30 dniem w temperaturze 30°C.

P r z y k ł a d 2

Charakterystyka zbiorowości mikroorganizmów z odwiertu metanowego złoża węgla i mikroorganizmów wzbogacenia wytwarzającego metan

Wyizolowano całkowity DNA zbiorowości z próbek wody złożowej sposobami zoptymalizowanymi pod kątem wydajnego oddzielenia kwasów nukleinowych od węgla obecnego w wodach źródłowych i wzbogaceniach. Z próbek wody ze zbiornika magazynowego, przy użyciu wielu metod, utworzono biblioteki genomowe w celu oceny potencjalnego błędu systemowego i w celu wydajnego ujęcia łącznej populacji mikroorganizmów, w tym bakterii, archeonów i eukariontów. Poprzednie analizy genomu ze zbiornika magazynowego wykazały względnie niską złożoność w porównaniu do złożoności w środowiskach, takich jak gleby lub morska woda powierzchniowa. W szczególności uderzający był brak komórek eukariotycznych. Występowały dwie główne linie komórek w danych genomowych, odpowiadające Proteobacteria, Arcobacter i Chrysiogenes, których genomy mogą być ponownie złożone z DNA zbiorowości. Ich metabolizm może być powiązany z rozkładem olejów i innych węglowodorów i oddychaniem arseninami.

Przygotowanie DNA

Wodę przesianą do wielkości mniejszej niż 45 μm przesączono następnie przez serię membran o wielkości porów 3, 0,8 i 0,1 μm, połączone szeregowo. Membrany zostały zebrane z urządzenia filtrującego, zamrożone z buforem Tris-EDTA w temperaturze -20°C i przetransportowane do laboratorium. DNA poddano ekstrakcji z membran w następujący sposób.

Filtry poddano kąpieli przez 45 minut w temperaturze pokojowej na obracającym się kole w nadmiarowej objętości buforu do lizy (50 mM NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA, 5% SDS, 4% poliwinylopirolidonu, 1% glikolu polietylenowego (8000), 0,5 M glukozy, 200 mM beta-merkaptoetanolu, 10 mM spermidyny, 10 mm kwasu askorbinowego, 20 μm/ml bisbenzamidu i 100 μg/ml tRNA drożdży). Zebrano supernatanty każdej próbki, komórki rozbito przez dodanie pięciu kulek o rozmiarze 1/8 i jednej 3/8 ze stali nierdzewnej do każdej próbki, jak również 1 g 0,5 mm szklanych kulek oraz wytrząsanie próbek przez 4 minuty przy 1500 uderzeń na minutę w Geno/Grinder 2000. Do każdej próbki dodano chlorku sodu do 0,8 M, próbkę raz wyekstrahowano układem fenol-chloroform, raz chloroformem i strącano w izopropanolu.

Alternatywnie do przesączania wodę złożową najpierw osadzono przez wirowanie przy 10000 obr./min. przez 30 minut w 4°C, supernatant usunięto do nowego pojemnika, osad komórek/ szczątek przeprowadzono w zawiesinę w buforze do lizy i DNA oczyszczono w ten sam sposób jak opisano powyżej. Pozostały materiał biologiczny został odzyskany z supernatantu przez dodanie glikolu polietylenowego 8000 do 10%, inkubację w 4°C przez noc, a następnie odwirowanie przy 10000 obr./min. przez 30 minut w 4°C, zawieszenie osadu w buforze do lizy i powtórzenie protokołu oczyszczania opisanego powyżej. DNA uzyskane z oczyszczenia rozpuszczono w niewielkiej objętości 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA i przeanalizowano za pomocą spektroskopii i elektroforezy na żelu.

Przygotowanie biblioteki genomowej

Bibliotekę genomową skonstruowano przez cięcie metagenomicznego DNA z powyższej puli mikroorganizmów, do średniej wielkości 1-8 kb za pomocą Genomic Solutions GeneMachines HydroShear wyposażonej w standardowy zestaw do cięcia. DNA zostało rozdzielone ze względu na wielkość na żelu agarozowym, przyłączone do adapterów DNA i poddane ligacji do wektora do klonującego E. coli o średniej liczbie kopii przy użyciu standardowych procedur znanych w dziedzinie. Produkt ligacji został umieszczony w E. coli poprzez elektroporację, wybrano losowe klony, hodowano w 1 ml kultury i pobrano plazmidowe DNA. Każdy klon zsekwencjonowano dwukierunkowo metodą Sangera.

PL 220 307 B1

Analizy sekwencji

Różnorodność taksonomiczną wody złożowej (zbiornik magazynowy) analizowano porównując sekwencje genów 16S bezpośrednio z metagenomu (sekwencje z biblioteki środowiskowej) lub poprzez amplifikację sekwencji genu 16S z próbek DNA wykorzystywanych do konstrukcji biblioteki metagenomowej. Analizy te wykazały, że zbiorowość składa się z archeonów i bakterii, ale brak było komórek eukariotycznych.

Poszczególne odczyty metagenomiczne poddano opatentowanemu procesowi anotacji bioinformatycznej pipeline, w wyniku czego najpierw zidentyfikowano wszystkie otwarte ramki odczytu (ORF) większe niż 50 aminokwasów. Aby przypisać domniemane funkcje dla każdego ORF, były one najpierw analizowane pod kątem rodzin PFAM, TIGRFAM i SUPERFAM w porównaniu z aktualnymi zbiorami wielokrotnych porównań liniowych sekwencji i ukrytych modeli Markowa dla poszczególnych rodzin białek, przy użyciu oprogramowania HMMER. Dodatkowo, zastosowano BLASTp w celu porównania białek zidentyfikowanych w metagenomie wobec bazy danych nieredundantnych białek GenBank. Anotacje wynikające z oprogramowania pipeline następnie przeszukiwano i przeprowadzono porównanie między metagenomem ze zbiornika magazynowego, kultur wzbogacenia wytwarzającego metan i szczepów izolowanych. Analizy wykazały dużą liczbę genów, które wymagają tlenu, takich jak dioksygenaz (nitropropanu, fitanoil-CoA, metylobenzoesanu, bifenylo-2,3-diolu i diterpenoidów) i monooksygenazy (P450, alkanów, amoniaku i 2,4-dichloro). Wraz z enzymami wymagającymi tlenu była też znacząca liczba enzymów, które pomagają uchronić się przed tlenem, takich jak katalazy, dysmutaza ponadtlenkowa, rubredoksyna i tioredoksyna.

Wzbogacenia wytwarzające metan, przeanalizowano taksonomicznie za pomocą sekwencji genów 16S z domen bakterii i archaeowców, przy czym te ostatnie zawierały metanogeny. Zbiorowość poddano analizie w 10 i 30 dniu inkubacji poprzez amplifikację tego fragmentu ze zbiorowości, tworząc biblioteki fragmentów 16S, przez wklonowanie ich do wektora, transformację E. coli i sekwencjonowanie sklonowanych fragmentów jak opisano powyżej. Sekwencje te zostały następnie porównane z publicznymi bazami danych, aby znaleźć najbliższe wyhodowane organizmy pokrewne. Jak pokazano na FIG. 2A, różnorodność bakterii była zdominowana przez organizmy należące do Pseudomonas, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio po upływie 10 dni, a Spirochaeta, Erysipelothrlx, Thauera, Clostridium, Acholeplasma i Magnetospirillum były mniej liczne zarówno po upływie 10 jak i 30 dni. Jak pokazano na FIG. 2B, populacja archeonów była zdominowana przez metanogen Methanolobus w 10 dniu, a w 30 dniu przez Methanocalculus i pojawił się niescharakteryzowany przedstawiciel Crenarcheaota. FIG. 3 przedstawia różnorodność bakterii w reprezentatywnej próbce wody złożowej w analizie sekwencji genu RecA z metagenomu.

Próbki z głowicy odwiertu - przedstawienie taksonomii 16S bakterii

Dictyoglomus

Planctomycetaceae

Rubrobacteraceae

Thermodesulfovibrio

Clostridiales

Bacteroidales

Thermacetogenium

Thermotoga

Thermosediminibacter

Deltaproteobacteria

Syntrophomonas

Bacteroidetes

Bacteroidales

Termodesulfovibrio

Magnetobacterium

Sporomusa

Deferribacteraceae

Thermotoga

Clostridiales

Sulfurospirillum

Proteiniphilum

Coprothermobacter

Anaerosinus

PL 220 307 B1

Azospira

Ceillonellaceae

Nitrospiracaea

Thermoanaerobacterium

Ruminococcaceae

Clostridia

Therminocola

Peptococcaceae

Clostridiales

Proteobacteria

Ralstonia

Ruminococcaceae

Bactersidales

Propionibacteriaceae

Niastella

Serratia

Thermodesulfovibrio

Niastella

Chryseobacterium

Smithella

Gammaproteobacteria

Magnetobacterium

Proteiniphilum

Spirochaetaceae

Przedstawienie taksonomii 16S archeonów - metanogeneza

Thermoprotei

Methanothrix

Methanofollis

Methanobacterium

Methanomicrobiales

Metbanocorpusculum

Desulfurococcales

Izolacja szczepu

Funkcjonalne wzbogacenie i próbki środowiska zostały użyte do izolowania poszczególnych szczepów poprzez środowiskową rozdzieloną hodowlę mikroorganizmów (EMCC, jak opisano w PCT/US2008/057919, WO2008/116187) lub standardowe metody, takie jak wytrząsane hodowle agarowe. Metoda EMCC została wykonana przez umieszczenie zawiesiny komórek w mikroporcjach żelu (GMDs) i inkubacji w warunkach tlenowych w temperaturze 30°C. Komórki tworzyły kolonie, które zostały posortowane w jałowych pożywkach, w celu uzyskania subkultur. Powstałe kultury komórkowe były następnie analizowane metodą 16S, aby określić jednostkowe szczepy. Druga metoda zawiera stopiony agar, na którym umieszczono zawiesinę komórek w serii rozcieńczeń. Probówki następnie szczelnie zamknięto, a fazę gazową zastąpiono N2:CO2 i H2:O2 i inkubowano do chwili, gdy komórki zaczęły tworzyć kolonie, które zebrano i hodowano jako subkultury. Wybrane szczepy wyizolowano, a następnie hodowano beztlenowe, niektóre z nich mają zdolność do wzrostu tlenowego lub beztlenowego.

W celu wyizolowania poszczególnych szczepów ze wzbogacenia wytwarzającego metan, próbkę 100 μΐ rozcieńczono i zaszczepiono w probówkach Hungate z agarem i węglem, w celu utworzenia kolonii i zapewnienia izolacji szczególnych linii. Dodatkowo, wzbogacenie zostało zamknięte i inkubowane tlenowo w celu utworzenia mikrokolonii, które zostały rozmieszczone na 96-dołkowych płytkach szybkiego sortera komórek. Działania te doprowadziły do izolacji szczepów, które były następnie identyfikowane za pomocą sekwencji genów 16S (jak pokazano na FIG. 2A i 2B). Poszczególne szczepy tego pierwszego wzbogacenia wytwarzającego metan były kulturami Pseudomonas, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Thauera, Acholeplasma i Methanocalculus pumilus. Poszczególne szczepy mogły być następnie odtworzone w zbiorowości w kulturze funkcjonalnej wzbogacenia, takiej jak kultura określonych zespołów mikroorganizmów (DMA). Niektóre izolowane szczepy były również wykorzystywane do sekwencjonowania genomu w celu identyfikacji genów i szlaków biorących udział w rozkładzie węgla. Na przykład, szczep Pseudomonas wykazywał obecność oksygenaz biorących udział w rozkładzie nie18

PL 220 307 B1 których policyklicznych węglowodorów aromatycznych takich jak między innymi dioksygenaza 3-fenylpropionianowa, monooksygenazy alkanosiarczanowe i 2,3-dioksygenazy katecholowe.

Izolowane kultury komórkowe - taksonomia 16S

Przypisany rodzaj (16S)	Kultury komórkowe	Przypisany rodzaj (16S)	Kultury komórkowe
Acetobacterium	5	Nitrospira	1
Acholeplasma	1	Paenibacillus	3
Achromobacter	5	Paludibacter	1
Acinetobacter	1	Pannonibacter	2
Aeromonas	97	Parabacteroides	3
Aquimonas	1	Petrotoga	1
Azoarcus	2	Pseudomonas	1636
Azonexus	1	Raoultella	3
Azospira	82	Rhodobacter	2
Bacillus	47	Rhodopseudomonas	1
Brevibacillus	15	Shewanella	44
Burkholderia	1	Staphylococcus	1
Butyrivibrio	2	Sulfurospirillum	23
Carnimonas	2	Thalassospira	7
Citrobacter	9	Thauera	2
Delftia	2	Thiobacillus	1
Desulfovibrio	2	Tistrella	2
Devosia	2	niesklasyfikowany „Bacillaceae 2”	1
Dysgonomonas	3	niesklasyfikowany Bacillus	33
Enterobacter	5	niesklasyfikowany Bacteroidales	2
Ewingella	12	niesklasyfikowany Enterobacteriaceae	1
Geobacillus	43	niesklasyfikowany Rhodocyclaceae	1
Halomonas	3	niesklasyfikowany Rikenellaceae	3
Halovibrio	1	niesklasyfikowany Sphingomonadaceae	1
Hvphomonas	1	niesklasyfikowany Xanthomonadaceae	1
Levilinea	1	Vibrio	2
Methanocalculus	1	Wolinella	2
Micrococcineae	1

Hodowla tolerujących tlen szczepów mikroorganizmów z wody złożowej

Zaszczepienie zebranej beztlenowo wody złożowej do pożywki tlenowej doprowadziło do wzrostu różnych linii komórkowych zdolnych do asymilacji zewnętrznych źródeł węgla, takich jak wyciąg z drożdży, ale przede wszystkim, zdolnych do wzrostu w wodzie złożowej i surowym węglu kopalnym jako jedynym źródle węgla. Sugeruje to, że w środowisku są komórki posiadające genetyczne i fizjologiczne możliwości tlenowego rozkładu węglowodorów. Te szczepy obejmują zróżnicowanych genetycznie członków grupy Pseudomonas, takich jak Pseudomonas sp., Pseudomonas 3CB6, Pseudomonas sp.SCT, Pseudomonas sp. G-R2A7 i inne, takie jak Hyphomonas polymorpha, Staphylococcus haemolyticus, niehodowane bakterie, niehodowane bakterie denitryfikacyjne (Thalassospira, Pannonibacter phragmatis (Achromobacter), Azoarcus (Betaproteobacteria), Tistrella mobilis i niehodowane

PL 220 307 B1 bakterie (Thaurea). Wiele z nich może rozwijać się w obecności węgla kopalnego jako jedynego źródło węgla oraz wytwarzać znaczne ilości biomasy.

Miejsca występowania metanu w złożach węgla i towarzyszących im wodach złożowych są uważane za beztlenowe i aktualne modele wskazują, że dominujący metabolizm wydaje się być powiązany z fermentacją i beztlenowym oddychaniem azotanowym, siarczanowym i innymi końcowymi akceptorami elektronów, ale nie tlenem. Jednak metagenomiczne analizy wody złożowej ujawniły mikroorganizmy, które mogą być podatne na hodowlę przy użyciu wody złożowej jako pożywki mineralnej, a węgla kopalnego jako jedynego źródła węgla i różnych kombinacji akceptorów elektronów w tym tlenu, azotanu, siarczanu, fosforanu żelaza w celu stymulowania oddychania mikroorganizmów. Jak pokazano na FIG 4, stwierdzono szeroką reprezentację monooksygenaz i dioksygenaz w próbkach wody złożowej, kultur wzbogacenia metanu, jak również wyizolowanych szczepach Pseudomonas i Thallasospira.

Identyfikacja rodziny enzymów

Dane metagenomiczne uzyskane z próbek zbiornika magazynowego i kultur wzbogacenia metanu, pozwoliły na rozpoznanie kilku klas enzymów, które mogłyby służyć do interwencji w celu zwiększenia wytwarzania metanu z formacji węglowodoronośnych. Tabela 1 poniżej przedstawia rodziny enzymów

Pfam, które zostały zidentyfikowane, jako działające na różnych etapach enzymatycznych przemiany węglowodorów w węgiel. FIG. 5-12 ilustrują różnorodność enzymów zidentyfikowanych w wielu Pfam.

T a b e l a 1

Proces metaboliczny	Organizm	Enzym
1	2	3
Hydroliza niskowęglowego węgla	Dictyoglomus Thermotoga Desulfurococca- les	PF02446 4-alfa-glukanotransferaza PF05448 Esteraza acetyloksylanowa (AXE1) PF02806 Alfa-amylaza, domena C-końca całkowicie beta PF02903 Alfa-amylaza, domena N-końca immunoglobinopodobna PF09261 Alfa-mannozydaza, domena środkowa PF07821 Alfa-amylaza, domena C-końca beta-kartka PF09071 Alfa-amylaza, C-końca PF05270 Alfa-L-arabinofuranozydaza B (ABFB) PF09206 Alfa-L-arabinofuranozydaza B, katalityczna PF06964 C-koniec alfa-L-arabinofuranozydazy PF08531 Domena N-końca alfa-L-ramnozydazy PF06202 Amylo-alfa-1,6-glukozydza PF05592 Bakteryjna Alfa-L-ramnozydaza PF05592 Bakteryjna Alfa-L-ramnozydaza PF03714 Bakteryjna domena związana z pullulanazą PF02929 Krótki łańcuch beta-galaktozydazy PF02449 Beta-galaktozydaza PF08533 C-koniec beta-galaktozydazy PF08532 Domena trimeryzacji beta-galaktozydazy PF03856 Beta-glukozydaza (rodzina SUN) PF02018 Domena wiążąca węglowodany PF02839 Domena wiążąca węglowodany PF03425 Domena wiążąca węglowodany (rodzina 11) PF03426 Domena wiążąca węglowodany (rodzina 15) PF03424 Domena wiążąca węglowodany (rodzina 17/28) PF03427 Domena wiążąca węglowodany (rodzina 19) PF03423 Domena wiążąca węglowodany (rodzina 25) PF09478 Domena wiążąca węglowodany CBM49 PF03422 Moduł wiążący węglowodany (rodzina 6) PF09212 Moduł wiążący węglowodany 27 PF00553 Domena wiążąca celulozę PF00942 Domena wiążąca celulozę PF02013 Domena wiążąca celulozę lub białka PF01607 Domena perytrofiny-A wiążąca chitynę PF00182 Chitynaza klasy I PF03174 Domena chitobiazy/beta-heksozoaminidazy C-końca PF06452 Domena o nieznanej funkcji(DUF1083) PF09081 Domena o nieznanej funkcji (DUF1921) PF09154 Domena o nieznanej funkcji (DUF1939)

PL 220 307 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
		PF09260 Domena o nieznanej funkcji (DUF1966) PF02056 Hydrolaza glikozylowa rodziny 4 PF00734 Grzybowa domena wiążąca celulozę PF09137 Glukodekstranaza, domena N PF07915 Białko podobne do podjednostki beta glukozydazy II PF03198 Białko powierzchniowe zakotwiczone na glikolipidzie PF00232 Rodzina hydrolaz glikozylowych 1 PF00331 Rodzina hydrolaz glikozylowych 10 PF01670 Rodzina hydrolaz glikozylowych 12 PF01373 Rodzina hydrolaz glikozylowych 14 PF00728 Rodzina hydrolaz glikozylowych 20, domena katalityczna PF02838 Rodzina hydrolaz glikozylowych 20, domena 2 PF02156 Rodzina hydrolaz glikozylowych 26 PF01915 Rodzina hydrolaz glikozylowych 3, domena C-końca PF00933 Rodzina hydrolaz glikozylowych 3, domena N-końca PF02015 Rodzina hydrolaz glikozylowych 45 PF01374 Rodzina hydrolaz glikozylowych 46 PF01532 Rodzina hydrolaz glikozylowych 47 PF02011 Rodzina hydrolaz glikozylowych 48 PF03718 Rodzina hydrolaz glikozylowych 49 PF03512 Rodzina hydrolaz glikozylowych 52 PF07745 Rodzina hydrolaz glikozylowych 53 PF03065 Rodzina hydrolaz glikozylowych 57 PF02057 Rodzina hydrolaz glikozylowych 59 PF03443 Rodzina hydrolaz glikozylowych 61 PF03664 Rodzina hydrolaz glikozylowych 62 PF03632 Rodzina hydrolaz glikozylowych 65, środkowa domena katalityczna PF03633 Rodzina hydrolaz glikozylowych 65, domena C-końca PF03636 Rodzina hydrolaz glikozylowych 65, domena N-końca PF07477 Rodzina hydrolaz glikozylowych 67, C-koniec PF07488 Rodzina hydrolaz glikozylowych 67, środkowa domena PF03648 Rodzina hydrolaz glikozylowych 67, N-koniec PF00840 Rodzina hydrolaz glikozylowych 7 PF02324 Rodzina hydrolaz glikozylowych 70 PF03659 Rodzina hydrolaz glikozylowych 71 PF03663 Rodzina hydrolaz glikozylowych 76 PF03662 Rodzina hydrolaz glikozylowych 79, domena N-końca PF03639 Rodzina hydrolaz glikozylowych 81 PF03644 Rodzina hydrolaz glikozylowych 85 PF07470 Rodzina hydrolaz glikozylowych 88 PF00759 Rodzina hydrolaz glikozylowych 9 PF07971 Rodzina hydrolaz glikozylowych 92 PF08306 Rodzina hydrolaz glikozylowych 98 PF08307 Rodzina hydrolaz glikozylowych 98, domena C-końca PF00457 Rodzina hydrolaz glikozylowych 11 PF00723 Rodzina hydrolaz glikozylowych 15 PF00722 Rodzina hydrolaz glikozylowych 16 PF00332 Rodzina hydrolaz glikozylowych 17 PF00704 Rodzina hydrolaz glikozylowych 18 PF00703 Rodzina hydrolaz glikozylowych 2, domena immunoglobinopodobna beta-kanapka PF02837 Rodzina hydrolaz glikozylowych 2, domena wiążąca cukry PF02836 Rodzina hydrolaz glikozylowych 2, domena baryka TIM PF01183 Rodzina hydrolaz glikozylowych 25 PF00295 Rodzina hydrolaz glikozylowych 28 PF01055 Rodzina hydrolaz glikozylowych 31 PF08244 Rodzina hydrolaz glikozylowych 32 C-końcowa PF00251 Rodzina hydrolaz glikozylowych 32 N-końcowa PF01301 Rodzina hydrolaz glikozylowych 35 PF07748 Rodzina hydrolaz glikozylowych 38 domena C-końca

PL 220 307 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
		PF01074 Rodzina hydrolaz glikozylowych 38 domena N-końca PF01229 Rodzina hydrolaz glikozylowych 39 PF04616 Rodzina hydrolaz glikozylowych 43 PF01341 Rodzina hydrolaz glikozylowych 6 PF01270 Rodzina hydrolaz glikozylowych 8 PF01630 Hialuronidaza PF02922 Domena N-końca izoamylazy PF02435 Lewanosacharaza/Inwertaza PF03200 Glukozydaza mannozowooligosacharydowa PF02065 Melibiaza PF08305 Domena NPCBM/NEW2 PF02927 N-końcowa immunoglobinopoodobna domena celulazy PF02055 Rodzina hydrolaz O-glikozylowych 30 PF07691 Domena PA14 PF09113 Peptydo-N-glikoozydaza F, C-końcowa PF09112 Peptyd-N-glicozydaza F, N-końcowa PF01522 Deacetylaza polisacharydowa PF03173 Domniemana domena wiążąca węglowodany PF03173 Domniemana domena wiążąca węglowodany PF06204 Domniemana domena wiążąca węglowodany PF07944 Domniemana hydrolaza glikozylowa o nieznanej funkcji (DUF1680) PF03370 Domniemana podjednostka regulująca fosfatazę PF00686 Domena wiążąca skrobię
Depolimeryzacja węgla	Chlostridium Petrotoga Planctomycetaceae	PF05448 Esterasa acetyloksylanowa (AXE1) PF01095 Pektynoesteraza PF00135 Karboksyloesteraza Chelatazy Wytwarzanie kwasów organicznych o małej masie cząsteczkowej
Beztlenowy (lub tlenowy) rozkład PAH	Thermoprotei Anaerovorax Smithella Anaerobaculum Thermacetogenium Aeromonas Dechloromonas Pseudomonas Thauera Marinobacter Alcanivorax Desulfuromonas Desulfovibrio Spirochaeta Azoarcus	PF00067 Cytochrom P450 PF00171 Rodzina dehydrogenaz aldehydowych PF00775 Dioksygenaza PF00848 Podjednostka alfa hydroksylująca pierścienie (domena katalityczna) PF00866 Podjednostka beta hydroksylująca pierścienie PF01188 Racemaza fenylohydroksyoctowa/enzym laktozujący śluzan, domena C-końcowa PF01231 2,3-dioksygenaza indoloaminowa PF01361 Enzym tautomerazy PF01596 O-metylotransferaza PF01689 Hydrataza/dekarboksylaza PF01731 Aryloesteraza PF01738 Rodzina hydrolazy dienolaktonowej PF01869 Rodzina BadF/BadG/BcrA/BcrD ATPazy PF01883 Domena o nieznanej funkcji DUF59 PF02332 Hydroksylaza Metanowa/Fenolowa/Toluenowa PF02426 Delta-izomeraza mukonolaktonowa PF02461 Monooksygenaza amoniakowa PF02578 Niescharakteryzowane ACR, rodzina YfiH COG1496 PF02626 Podjednostka hydrolazy allofanianowej 2 PF02627 Rodzina dekarboksylaz karboksymukonolaktonowych PF02668 Dioksygenaza katabolizmu tauryny TauD, rodzina TfdA PF02746 Racemaza fenylohydroksyoctowa / enzym laktozujący śluzan, domena N-końcowa PF02798 S-transferaza glutationowa, domena N-końcowa PF02900 Podjednostka katalityczna LigB dioksygenazy otwierającej pierścień aromatyczny PF02962 Izomeraza 5-karboksymetylo-2-hydroksyśluzanowa PF00067 Cytochrom P450 PF00171 Rodzina dehydrogenaz aldehydowych

PL 220 307 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
		PF00775 Dioksygenaza PF00848 Podjednostka alfa hydroksylująca pierścienie (domena katalityczna) PF00866 Podjednostka beta hydroksylująca pierścienie PF01 188 Racemaza fenylohydroksyoctowa/enzym laktozujący śluzan, domena C-końcowa PF03079 Rodzina ARD/ARD' PF03171 Superrodzina oksygenaz 2OG-Fe(II) PF03241 Rodzina 3-hydroksylaz 4-hydroksyfenylooctanowych PF03301 2,3-dioksygenaza tryptofanowa PF03349 Białko transportujące białka zewnętrznej błony (OMPPl/FadL/TodX) PF03594 Białko transportujące benzoesany przez błony PF04209 1,2-dioksygenaza homogentyzynianowa PF04303 Białko o nieznanej funkcji (DUF453) PF04444 N-koniec dioksygenazy katecholowej PF04663 Region konserwatywny hydroksylazy fenolowej PF04744 Białko podjednostki B monooksygenazy PF04896 Monooksygenaza amoniakowa/monooksygenaza metanowa, podjednostka C PF05145 Domniemana monooksygenaza amoniakowa PF05494 Tolerancja toluenowa, Ttg2 PF05721 Dioksygenaza fitanoilo-CoA (PhyH) PF05870 Dakarboksylaza kwasu fenolowego (PAD) PF06052 Dioksygenaza kwasu 3-hydroksyantranilowego PF06099 Podjednostka hydroksylazy fenolowej PF06234 Białko B układu tolueno-4-monooksygenazy (TmoB) PF06917 Liaza pektynowa peryplazmatyczna PF07424 TrbM PF07746 Dioksygenaza otwierająca pierścień aromatyczny LigAB, podjednostka Lig A PF07976 Hydroksylaza fenolowa, domena C-końcowa dimeryzacji PF08201 Białko BssC/TutF PF08282 Hydrolaza chlorowcokwasu dehalogenazopodobna PF08803 Domniemana monooksygenaza ydhR PF08883 Rodzina 4,5-dioksygenaz Dopa PF09448 Metyloizomeraza metylomukolaktonowa PF09459 Dehydrogenaza etylobenzenowa PF09662 Podjednostka gamma karboksylazy fenylofosforanowej (Fenyl P gamma)
Homoaceto- geneza		PF01268 Syntetaza formylotetrahydrofolianowa PF03598 Dehydrogenaza CO/syntaza acetylo-CoA, podjednostka kompleksu beta PF03599 Dehydrogenaza CO/syntaza acetylowa-CoA, podjednostka delta
Metanogeneza (wodorotrofowa i acetyloklastyczna)	Methanothrix Methanosarcina Methanofolis Methanobacterium Methanolobus Methanocalculus Methanomicrobiales Methanocorpo- sculum Methanosarcina	PF01913 Formylotransferaza formylometanofuranowotetrahydrometanopterynowa PF01993 Dehydrogenaza metylenotetrahydrometanopterynowa PF02007 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, H PF02240 Reduktaza gamma metylo-koenzymu M PF02241 Reduktaza beta metylo-koenzymu M, C-końca PF02249 Reduktaza alfa metylo-koenzymu M, C-końca PF02289 Cyklohydrolaza metenylowo-tetrahydrometanopterynowa PF02505 Reduktaza metylo-koenzymu M, białko D PF02663 Dehydrogenaza wolframoformylometanofuranowa, FwdE PF02741 Formylotransferaza formylometanofuranowotetrahydrometanopterynowa PF02745 Reduktaza alfa metylokoenzymu M, N-końca PF02783 Reduktaza beta metylokoenzymu M, N-końca

PL 220 307 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
		PF04029 Fosfataza 2-fosfosulfomleczanowa PF04206 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, E PF04207 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, D PF04208 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, A PF04210 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, G PF04211 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, C PF04422 Hydrogenaza beta koenzymu F420, N-końca PF04432 Hydrogenaza beta koenzymu F420, C-końca PF04609 Reduktaza metylokoenzymu M, białko C PF05440 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, B PF08979 Domena o nieznanej funkcji (DUF1894) PF09176 Dehydrogenaza metylenotrahydrometanopterynowa, N-końca PF09472 S-metylotransferaza tetrahydrometanopterynowa, F

P r z y k ł a d 3

Stymulacja wytwarzania metanu

Zdolność określonego zespołu mikroorganizmów do wytwarzania metanu z węgla in vitro, jak również zestaw szczepów zdolnych do tlenowego rozkładu węgla poddano eksperymentom laboratoryjnym, w których różne stymulanty badano pod kątem ich wpływu na wytwarzanie metanu. FIG. 13 przedstawia wyniki stymulacji układu hodowlanego różnymi ilościami tlenu (2%, 4% i 10% O2) i akceptorów elektronów, siarczanu (0,1 mM, 1 mM i 10 mM) i azotanu (na 0,1 mM, 1 mM i 10 mM).

Największy wzrost wytwarzania metanu obserwowano w odpowiedzi na ograniczone impulsy tlenu, co sugeruje, że czynnikiem ograniczającym wytwarzanie metanu z węgla może być przepływ elektronów pochodzących z tlenowego rozkładu węglowodorów. Rozkład ten jest stymulowany przez dodanie tlenu jako reagenta dla enzymów klasy oksygenaz, obecnych w niektórych szczepach, zawartych w DMA. Jednakże, gdy tlen jest stosowany w wyższych poziomach niż optymalne to hamuje metanogenezę, prawdopodobnie z powodu zastępowania CO2, jako ostatecznego akceptora elektronów i/lub utleniania enzymów wrażliwych na tlen, zarówno w metanogenach jak i innych grupach bakterii beztlenowych.

Tabela 2 poniżej przedstawia listę domniemanych oksygenaz i odpowiednich organizmów gospodarzy określonych przez analizę 16S genomu.

T a b e l a 2

Domniemana oksygenaza	Domniemane organizmy gospodarzy
1	2
1,2-dioksygenaza 2,3-dihydroksyfenylpropionianowa	Bradyrhizobium sp. ORS278
dioksygenaza 2-nitropropanowa, NPD	Alkaliphilus metalliredigens QYMF
oksygenaza 2OG-Fe(II)	Methylobacillus flagellatus KT
dioksygenaza 4-hydroksyfenylopirogronianowa	Pseudomonas aeuruginosa PA7
1-monooksygenaza alkanowa	Pseudomonas mendocina ymp
Monooksygenaza biosyntezy antybiotyków	Candidatus Desulfococcus oleovorans Hxd3
1,2-dioksygenaza benzoesanowa, podjednostka alfa	Burkholderia pseudomallei 668
Dioksygenaza otwierająca pierścień aromatyczny	Pseudomonas entomophila L48
1,2-dioksygenaza bifenylo-2,3-diolowa III-powiązane białka	Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N1696
Katalityczna podjednostka LigB dioksygenazy otwierającej pierścień aromatyczny	Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo-bovis L55
2,3-dioksygenaza katecholowa	Azoarcus sp. BH72
Monooksygenaza cykloheksanonowa	Parvibaculum lavamentivorans DS-1
Dioksygenaza pokrewna do dioksygenazy 2-nitropropanowej	Pseudomonas entomophila L48

PL 220 307 B1 cd. tabeli 2

1	2
Dioksygenaza diterpenoidowa	Mycobacterium sp. JLS
Dioksygenaza ekstradiolowa rozszczepiająca pierścień, enzym III klasy, podjednostka	Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 89031
Glioksalaza/białko/dioksygenaza odporności na bleomycynę	Dechloromonas aromatica RCB
1,2-dioksygenaza homogentyzynianowa	Chromobacterium violaceum ATCC 12472
Monooksygenaza luciferazopodobna	Burkholderia mallei NCTC 10247
Oksygenaza fenylooctano-CoA, podjednostka PaaG	Burkholderia pseudomallei 1710b
Prawdopodobna podjednostka dioksygenazy hydroksylująca pierścień	Pseudomonas aeruginosa PAO1
Domniemana monooksygenaza amoniakowa	Jannaschia sp. CCS1
Domniemana dioksygenaza ekstradiolowa rozszczepiająca pierścień	Bradyrhizobium sp. BTAil
Domniemana 3,4-dioksygenaza protokatechusanowa, białko łańcucha beta	Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633
1,2-dioksygenaza metylobenzoesanowa, komponent przeniesienia elektronu	Pseudomonsa aeruginosa PA7

FIG. 4 porównuje profil raonooksygenaz i dioksygenaz wykryte przez analizę 16S genomu mikroorganizmów z wody złożowej, kultury wzbogacania metanu, jak również wyizolowanych szczepów

Pseudomonas i Thallasospira.

Dodanie tlenu do DMA może spowodować wzrost wytwarzania metanu, jeżeli nie zostaną uszkodzone organizmy ściśle beztlenowe. Tolerancja na tlen bakterii beztlenowych i archeonów metanogennych zostały opisane niedawno (Boga, HI i Brune, A. 2003. Hydrogen-dependent oxygen reduction by homoacetogenic bacteria isolated from termite guts. Appl. Environ. Microbiol, 69:779-786), a tolerancja w stosunku do tlenu czystej kultury wchodzącej w skład DMA może być zbadana.

FIG. 14 przedstawia wytwarzanie metanu zwiększone po stymulacji H2 i octanem w kulturach wzrastających przy wykorzystaniu węgla kopalnego jako jedynego źródła węgla.

FIG. 15 przedstawia wytwarzanie metanu zwiększone po stymulacji trimetyloaminą w kulturach wzrastających przy wykorzystaniu węgla kopalnego jako jedynego źródła węgla.

Claims (16)

1. Sposób identyfikacji stymulatora, który zwiększa biogeniczne wytwarzanie metanu w formacji węglowodoronośnej, znamienny tym, że ten sposób obejmuje:

a) uzyskanie sekwencji kwasu nukleinowego z jednego lub większej liczby mikroorganizmów pochodzących ze środowiska formacji węglowodoronośnej;

b) określenie obecności jednego lub większej liczby produktów genów tej sekwencji kwasu nukleinowego, przy czym produkt genu jest enzymem w szlaku zaangażowanym w przemianę węglowodoru w metan wybranym z grupy obejmującej peroksydazy, oksydazy fenolowe, oksydazy alkoholowe, lakkazy, hydrolazy, hydrolazy glikozylowe, esterazy, eterazy, oksydazy, nitrogenazy, celulazy, amylazy, glukanazy, pullulanazy, reduktazy, dysmutazy, oksygenazy, monooksygenazy, dioksygenazy, katalazy, hydrogenazy, karboksylazy i reduktazy metylowe oraz enzym zaangażowany w homoaceto-genezę, metanogenezę, matanogenezę acetoklastyczną lub metanogenezę redukującą CO2; i

c) identyfikację substratu, reagenta lub kofaktora tego enzymu, który podwyższa wytwarzanie metanu, gdy zostanie dostarczony do jednego lub większej liczby mikroorganizmów w tej formacji węglowodoronośnej.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że jeden lub większa liczba tych mikroorganizmów są wzbogacone przez selekcję z uwagi na zdolność do wzrostu na węglu kopalnym jako jedynym źródle węgla; albo

PL 220 307 B1 ten co najmniej jeden mikroorganizm jest gatunkiem bakterii lub gatunkiem archeonów zdolnym do przemiany węglowodoru w produkt wybrany z grupy obejmującej wodór, dwutlenek węgla, octan, mrówczan, metanol, metyloaminę i substraty metanogenne; gatunkiem bakterii metanogennych; lub gatunkiem archeonów metanogennych.

3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że etap (c) obejmuje:

(i) badanie in vitro jednego lub większej liczby substratów, reagentów lub kofaktorów, w więcej niż jednym stężeniu, w celu obserwacji i optymalizacji wytwarzania metanu w układzie hodowlanym zawierającym co najmniej jeden mikroorganizm wyizolowany z tej formacji węglowodoronośnej, przy czym ponadto układ hodowlany zawiera węgiel kopalny jako jedyne źródło węgla; albo (ii) badanie in vitro jednego lub większej liczby substratów, reagentów lub kofaktorów, w więcej niż jednym stężeniu, w celu obserwacji i optymalizacji wytwarzania metanu w układzie hodowlanym zawierającym określony zespół mikroorganizmów, który to określony zespół mikroorganizmów łączy kulturę pojedynczego szczepu mikroorganizmu z formacji węglowodoronośnej, z co najmniej jedną inną określoną kulturą innego pojedynczego szczepu mikroorganizmu, tak że członkowie tego określonego zespołu mikroorganizmów działają synergicznie w celu wytworzenia metanu; przy czym ponadto układ hodowlany zawiera węgiel kopalny jako jedyne źródło węgla.

4. Sposób według zastrzeżenia 3, znamienny tym, że co najmniej jednym mikroorganizmem jest gatunek bakterii wybrany z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospiryllum i Sulfurospirillum; lub gatunkiem archeonów wybranym z grupy obejmującej Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota; albo ten określony zespół mikroorganizmów zawiera co najmniej dwa gatunki mikroorganizmów wybrane z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospiryllum i Sulfuro-spirillum, Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota.

5. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że formacja węglowodoronośna jest wybrana z grupy obejmującej węgiel kopalny, torf, węgiel brunatny, łupki naftowe, formacje ropy naftowej, tradycyjny olej czarny, mazut, piaski roponośne oraz piaski bitumiczne.

6. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że enzym jest wybrany z grupy obejmującej oksygenazy, monooksygenazy i dioksygenazy.

7. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że substrat, reagent lub kofaktor jest wybrany z grupy obejmującej związek zawierający siarkę, związek zawierający azot, związek zawierający fosfor, pierwiastek śladowy, akceptor elektronów, donor elektronów, chlorowiec, metal, alkohol, kwas organiczny, alkan, alken, alkin, związek aromatyczny, aminę, eter, aldehyd, keton, tiol, octan, węglowodór aromatyczny i gaz.

8. Sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu w formacji węglowodoronośnej, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie stymulatora zidentyfikowanego sposobem według zastrzeżenia 1, do tej formacji węglowodoronośnej.

9. Sposób według zastrzeżenia 8, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie tlenu do tej formacji węglowodoronośnej.

10. Sposób według zastrzeżenia 9, znamienny tym, że tą formacją węglowodoronośną jest węgiel kopalny.

11. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje modulację enzymu wybranego z grupy obejmującej peroksydazy, oksydazy fenolowe, oksydazy alkoholowe, lakkazy, hydrolazy, hydrolazy glikozylowe, esterazy, eterazy, oksydazy, nitrogenazy, celulazy, amylazy, glukanazy, pullulanazy, reduktazy, dysmutazy, oksygenazy, monooksygenazy, dioksygenazy, katalazy, hydrogenazy, karboksylazy, reduktazy metylowe, enzym zaangażowany w metanogenezę acetoklastyczną i enzym zaangażowany w metanogenezę redukującą CO2.

12. Sposób według zastrzeżenia 1, dodatkowo obejmujący identyfikację określonego zespołu mikroorganizmów do przemiany węgla w metan, znamienny tym, że obejmuje:

PL 220 307 B1

d) przygotowanie kultury pojedynczego szczepu tego jednego lub większej liczby mikroorganizmów z tego środowiska węgla, przy czym pojedynczy szczep mikroorganizmu zawiera ten jeden lub większą liczbę produktów genów; i

e) połączenie tego wyhodowanego pojedynczego szczepu mikroorganizmu z co najmniej jedną inną kulturą innego pojedynczego szczepu mikroorganizmu w celu dostarczenia określonego zespołu mikroorganizmów;

przy czym członkowie tego określonego zespołu mikroorganizmów działają synergicznie w celu wytworzenia metanu.

13. Sposób według zastrzeżenia 12, znamienny tym, że ponadto obejmuje:

f) dostarczanie substratu, reagenta lub kofaktora, do tego określonego zespołu mikroorganizmów, który zwiększa wytwarzanie metanu.

14. Sposób według zastrzeżenia 12, znamienny tym, że ten określony zespół mikroorganizmów zawiera co najmniej dwa gatunki mikroorganizmów wybrane z grupy obejmującej rodzaje Pseudomonas, Arcobacter, Desulfuromonas, Pelobacter, Desulfovibrio, Spirochaeta, Erysipelothrix, Thauera, Clostridium, Acholeplasma, Magnetospirillum, Sulfurospirillum; Methanolobus, Methanocalculus i członków gromady Crenarcheaota.

15. Sposób wzmagania biogenicznego wytwarzania metanu z węgla kopalnego, znamienny tym, że obejmuje wprowadzenie do złóż węgla kopalnego określonego zespołu mikroorganizmów sposobem jak określono w zastrzeżeniu 12.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że obejmuje wprowadzanie do złoża węgla kopalnego określonego zespołu mikroorganizmów sposobem jak określono w zastrzeżeniu 12 wraz z substratem, reagentem lub kofaktorem.