PL219272B1 - Sekwencja DNA oraz sposób otrzymywania rekombinowanego alergenu pyłku traw Phl p4 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku

Wynalazek dotyczy dostarczenia sekwencji genetycznej głównego alergenu pyłku traw Phi p 4. Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym. Rekombinowane cząsteczki DNA i pochodzące od nich polipeptydy, fragmenty czy też nowe kombinacje i warianty sekwencji częściowych mogą zostać wykorzystywane w terapii chorób alergicznych wywoływanych przez pyłki. Białka wytworzone metodą rekombinacji mogą być zastosowane w diagnostyce in vitro i in vivo alergii na pyłki.

Stan techniki

Alergie typu I mają duże znaczenie światowe. Aż 20% populacji państw uprzemysłowionych cierpi na schorzenia o podłożu alergicznym takie jak zapalenie nosa, zapalenie spojówek, czy też dychawica oskrzelowa. Alergie te wywoływane są przez znajdujące się w powietrzu alergeny (aeroalergeny), które pochodzą z różnych źródeł takich jak pyłki roślin, kleszcze, koty lub psy. Z kolei aż u około 40% alergików należących do opisywanego typu I występuje specyficzna reaktywność IgE z alergenami pyłków traw (Freidhoff et al., J. Allergy Clin. Immunol. 78,1190-2001).

Do substancji wywołujących alergie I typu należą białka, glikoproteiny oraz polipeptydy. Po przeniknięciu błony śluzowej alergeny takie u osób uwrażliwionych reagują z cząsteczkami IgE znajdującymi się na powierzchni komórek tucznych. Jeśli dwie cząsteczki IgE łączą się ze sobą przez alergen, dochodzi do uwolnienia mediatorów (np. histamin i prostaglandyn) oraz cytokin przez komórkę efektorową, a tym samym do odpowiednich symptomów klinicznych.

W zależności od względnej częstotliwości reakcji poszczególnych cząsteczek alergenów z przeciwciałami IgE alergików, wyróżniamy alergeny główne i alergeny poboczne (drugorzędowe).

W przypadku tymotki łąkowej (Phieum pratense) jako alergeny główne zidentyfikowano dotychczas: Phi p 1 (Petersen et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phi p 5 (Matthiesen i Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phi p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54), Phi p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phi p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189198) oraz Phi p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

Phi p 4 opisywana jest jako zasadowa glikoproteina o masie cząsteczkowej od 50 do 60 kDa (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268). Cząsteczka Phi p 4 jest oporna na działanie trypsyny (Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) i 70-88% alergików uczulonych na pyłki traw posiada przeciwciała IgE przeciwko niej skierowane (Valenta et al., 1993, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294; Rossi et al., 2001, Allergy 56:1180-1185; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy 33: 43-51). Opisano homologiczne cząsteczki ze spokrewnionych gatunków traw (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; 14-17); takie homologiczne cząsteczki traw (łac.: Poaceae) tworzą grupę alergenów 4, których molekuły wykazują wysoką immunologiczną reaktywność krzyżową między sobą jak również z monoklonalnymi przeciwciałami myszy oraz z ludzkimi przeciwciałami IgE (Fahlbusch et al., 1993 Clin. Exp. Allergy 23: 51-60; Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97: 210; Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6): 361-367; Stumvoll et al. 2002, Biol. Chem. 383: 1383-1396; Grote et al., 2002, Biol. Chem. 383: 1441-1445; Andersson und Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130: 87107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1): 43-51).

W przeciwieństwie do wyżej wymienionych alergenów głównych Phieum pratense (Phi p 1, Phi p 2/3, Phi 5a i 5b, Phi p 6 i Phi p 13), struktura pierwszorzędowa Phi p 4 nie jest jeszcze jasna. Pełna sekwencja cząsteczek grupy 4 z innych gatunków traw również jest jeszcze niedostępna.

Ustalenie N-terminalnej sekwencji aminokwasowej nie zakończyło się do tej pory sukcesem. Jednak przyczyny tego nie są znane. Fischer et al. (J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198) wysuwają przypuszczenie o zablokowaniu N-końca, udało im się jednakże oczyścić peptyd wewnętrzny po rozcięciu endopeptydazą i ustalić jego sekwencję: IVALPXGMLK (SEQ ID NO 7). Peptyd ten wykazuje homologię z sekwencjami peptydowymi alergenów 3-krostawca-Amb a1 i -Amb a2, jak również podobieństwo do sekwencji białek kukurydzy (Zm 58.2), pomidora (lat 59, lat 56) i tytoniu (G10) (FiPL 219 272 B1 scher et al., 1996; J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198). Dla fragmentów peptydowych zasadowych alergenów grupy 4 w przypadku życicy trwałej (Lolium perenne) ustalono następujące sekwencje:

FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 8) oraz

GLIEFPAGV (SEQ ID NO 9) (Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348).

W wyniku enzymatycznego rozcięcia uzyskano peptydy alergenów grupy 4 z Dactylus glomerata i poddano je sekwencjonowaniu:

DIYNYMEPYVSK (P15, SEQ ID NO 10),

VDPTDYFGNEQ (P17, SEQ ID NO 11),

ARTAWVDSGAQLGELSY (P20, SEQ ID NO 12) oraz

GVLFNIQYVNYWFAP (P22, SEQ ID NO 13) (Leduc-Brodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

Poprzez proteolizę otrzymano także peptydy alergenów grupy 4 subtropikalnego gatunku psioząba palczastego (Cynodon dactylon) i poddano je sekwencjonowaniu:

KTVKPLYIITP (S, SEQ ID NO 14),

KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (V49L, SEQ ID NO 15),

TVKPLYIITPITAAMI (T33S, SEQ ID NO 16),

LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (T35L, SEQ ID NO 17),

KWQTVAPALPDPNM (P2, SEQ ID NO 18),

VTWIESVPYIPMGDK (V26L, SEQ ID NO 19),

GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (L25L, SEQ ID NO 20),

TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (T22L, SEQ ID NO 21),

YRDLDLGVNQVVG (P3, SEQ ID NO 22),

SATPPTHRSGVLFNI (V20L, SEQ ID NO 23) oraz

AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (V14L, SEQ ID NO 24) (Liaw et al., 2001, Biochem. Biophys. Research Communication 280: 738743).

Jednakże, opisane powyżej sekwencje peptydowe Phi p 4 i alergenów grupy 4 nie wystarczają do odtworzenia pełnej struktury pierwszorzędowej alergenów grupy 4.

Celem wynalazku jest zatem dostarczenie pełnej sekwencji DNA Phi p 4 jak również odpowiadających mu rekombinantów DNA, na bazie których alergen Phi p 4, mógłby zostać wyrażony jako białko i znaleźć znaczące zastosowanie farmakologiczne, jako takie lub w formie zmodyfikowanej.

Wykaz figur rysunku

Figura 1: wewnętrzna sekwencja DNA (SEQ ID NO 25) genu Phi p 4. Amplimery otrzymane z genomowego DNA zostały sklonowane i zsekwencjonowane z wykorzystaniem zdegenerowanych starterów nr 30 (sensowny) i nr 37 (antysensowny) - oba zaznaczono kursywą. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 6 klonów. Specyficzny starter sensowny nr 82 zaprojektowany na podstawie tej sekwencji jest podkreślony.

Figura 2: koniec 3' sekwencji kwasu nukleinowego (SEQ ID NO 26) genu Phi p 4. W wyniku reakcji amplifikacji na matrycy cDNA Phieum pratense techniką 3'-RACE PCR odcinka flankowanego specyficznym starterem nr 82 (zaznaczony kursywą) i starterem zakotwiczającym otrzymano amplimery i zsekwencjonowano je. Przedstawiona sekwencja jest zgodna w przypadku 3 procedur sekwencjonowania i obejmuje koniec 3' genu Phi p 4 do kodonu stop (podwójnie podkreślone). Zakresy sekwencji wykorzystanych do konstrukcji startera antysensownego nr 85 i nr 86 są podkreślone.

Figura 3: lokalizacja peptydu Phi p 4 w przypuszczalnej sekwencji aminokwasów alergenu Phi p 4 (SEQ ID NO 2). Sekwencje aminokwasowe peptydów P1-P6 (SEQ ID NO 27-32) otrzymanych przy okazji procesu sekwencjonowania aminokwasów oczyszczonego i pofragmentowanego alergenu Phi p 4 można jednoznacznie przyporządkować odpowiadającym im sekwencjom nukleotydowym genu Phi p 4.

Figura 4: udowodnienie identyczności rekombinowanego Phi p 4 (rPhl p 4) techniką Western Blot z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał monoklonalnych 5H1 (Blot A) i 3C4 (Blot B).

Ścieżka 1: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhi p 4.

Ścieżka 2: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhl p 4.

Ścieżka 3: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhl p 4.

Ścieżka 4: oczyszczony nPhi p 4 z Phieum pratense.

PL 219 272 B1 (^): rozerwane lub zdegradowane fragmenty C-terminalnego odcinka rPhi p 4, bądź całej cząsteczki rPhl p 4.

Figura 5: udowodnienie techniką Western Blot reaktywności rekombinowanego Phi p 4 (rPhi p 4) z IgE pochodzącymi z surowicy alergików uczulonych na pyłki traw. Ekstrakty stransformowanych komórek E. coli, w których ekspresyjny ulegał cały gen Phi p 4 gen lub tylko N-terminalny fragment 1-200, bądź C-terminalny fragment 185-500, zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE i przeniesione na błonę nitrocelulozową. Naniesione na błonę peptydy inkubowano z surowicą alergików uczulonych na pyłki traw typu A, B lub C, a następnie połączone IgE z właściwymi im alergenami reagowały ze stosowanymi w tej metodzie skoniugowanymi z alkaliczną fosfatazą przeciwciałami anti-human-lgE, co umożliwiło kolorymetryczną detekcję związanych IgE.

Ścieżka 1: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 1-200 rPhl p 4.

Ścieżka 2: ekstrakt z wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających fragment 185-500 rPhi p 4.

Ścieżka 3: ekstrakt wszystkich komórek bakteryjnych E. coli zawierających rPhi p 4.

Ścieżka 4: oczyszczony nPhI p 4 z Phieum pratense.

Powyżej i poniżej stosowane określenia sekwencji nukleotydowych bądź aminokwasowych „SEQ ID NO” opierają się na nazewnictwie zawartym w dołączonym protokole sekwencji.

Istota wynalazku

Wynalazek po raz pierwszy ujawnia sekwencje genową głównego alergenu pyłku traw Phi p 4, o trzech odkrytych dominujących sekwencjach (SEQ ID NO 1, 3 i 5) wynikających z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphisms - SNPs).

Wynalazek dotyczy zatem cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowej wyselekcjonowanej z grupy zawierającej sekwencje SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3 oraz SEQ ID NO 5, względnie cząsteczki DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowej genu kodującego alergen główny Phi p 4 z Phieum pratense.

W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej cechującej się względem sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 homologią sekwencji wynoszącą co najmniej 91,8%.

W szczególności, istotą wynalazku jest także cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO 1 z co najmniej jedną pojedynczą zmianą nukleotydową wybraną z grupy obejmującej: T85A,

C130A, G159A, A160C, G169A, C185T, C186A, G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C273T,

C285T, C286T, G298A, A299C, C303T, C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T,

C411T, T420C, A421C, A423C, G424A, T425C, C456G, C462A, G522C, C525G, G567A, C618T,

A655C, G657A, G662A, C680T, G684C, C690A, G691A, G693A, C703T, C703A, A710C, G711A,

C713T, G743A, G750A, C768T, A773C, G790A, G798C, G801A, C804G, C809A, G834C, C844A,

A859T, A865G, G879C, G895C, G900C, G900A, G918A, A961G, A962C, A964C, G987C, A994T,

G1020A, G1023C, G1036C, C1040T, G1041C, C1047A, A1051G, G1052A, G1052C, G1053A,

G1053C, G1053T, G1056C, T1069C, G1073A, C1084G, G1086C, C1090T, G1098C, G1151C,

G1152C, G1155C, G1161C, C1185G. G1229C, G1133C, A1239C, T1240C, G1242C, G1257C,

C1266T, C1269T, A1278C, A1278G, C1305G, C1308T, 01311A, G1335C, G1350C, T1357A,

A1359G, G1370C, Tl3770, T1378A, T1379A, G13830, C1398T, T14110, C1414G, C1425A, C1428T, G14430, 01449T, G1464A, G1485A i A14980.

Wynalazek dotyczy także fragmentów, nowych kombinacji sekwencji częściowych i mutantów punktowych o działaniu hipoalergicznym.

Wynalazek dotyczy zatem również odpowiednich sekwencji częściowych, kombinacji sekwencji częściowych, względnie mutantów powstałych na skutek eliminacji lub addycji, które kodują immunomodulacyjny fragment alergenu grupy 4 rodziny Poaceae odpowiedzialny za reakcję z limfocytami T.

Oprócz alergenów grupy 4 innych gatunków traw, wynalazek dotyczy także alergenów grupy 13, ponieważ charakteryzują się podobną masą cząsteczkową do alergenów grupy 4, co wykazano techniką SDS-PAGE oraz są trudne do rozdziałem technikami biochemicznymi (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Za pomocą białka i sekwencji DNA według wynalazku, którą ujawniono po raz pierwszy, można jednak jednoznacznie wykazać zasadnicze różnice w sekwencji aminokwasowej pomiędzy grupami 4 i 13.

PL 219 272 B1

Dzięki znajomości sekwencji DNA naturalnie występujących alergenów jest obecnie możliwe wytworzenie tych alergenów w postaci rekombinowanych białek, które mogą znaleźć zastosowanie w diagnostyce i terapii chorób alergicznych (Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

Klasycznym sposobem postępowania w efektywnym leczeniu alergii jest specyficzna immunoterapia lub obniżenie wrażliwości (hiposensybilizacja) (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562). Pacjentom podaje się wówczas podskórnie zastrzyki z naturalnych ekstraktów alergenów zwiększając dozowanie. Przy tej metodzie istnieje jednak niebezpieczeństwo wywołania reakcji alergicznych a nawet szoku anafilaktycznego. Celem zminimalizowania tego ryzyka stosuje się innowacyjne preparaty w postaci alergoidów. Są to chemicznie zmodyfikowane ekstrakty alergenów, które charakteryzują się znacznie zredukowaną reaktywnością z IgE, ale taką samą jak w naturalnych ekstraktach reaktywnością z komórkami T (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Jeszcze większą optymalizację terapii umożliwiłoby zastosowanie alergenów wyprodukowanych z wykorzystaniem procesu rekombinacji. Zdefiniowane, w danym wypadku dostosowane do indywidualnego stopnia uczulenia pacjenta koktajle wytworzonych na drodze rekombinacji alergenów o wysokiej czystości mogłyby zastąpić ekstrakty z naturalnych źródeł alergenów, gdyż w ekstraktach takich oprócz różnych alergenów znajduje się duża liczba nie oddziałujących alergennie, jednakże posiadających właściwości immunogenne białek towarzyszących.

Zastosowanie celowo zmutowanych rekombinowanych alergenów ze specyficzną delecją epitopów IgE nie wpływającą ujemnie na niezbędne w terapii epitopy rozpoznawane przez komórki T, otwiera realistyczne perspektywy bezpiecznej hiposensybilizacji produktami ekspresji. (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).

Inną możliwością terapeutycznego wpływania na zaburzoną równowagę komórek TH u alergików jest immunoterapeutyczne szczepienie DNA. Polega ono na zastosowaniu funkcjonalnego DNA kodującego odpowiednie alergeny. Pierwszych dowodów na specyficzny dla alergenu wpływ na odpowiedź immunologiczną dostarczyły badania przeprowadzone na gryzoniach polegające na iniekcji DNA kodującego alergeny (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).

Odpowiednie białka wytworzone z wykorzystaniem technik rekombinacji mogą być zastosowane w terapii jak również w in vitro- i in vivo- diagnostyce alergii na pyłki.

W celu wytworzenia rekombinowanego alergenu klonowany odcinek kwasu nukleinowego jest wbudowywany w wektor ekspresyjny i konstrukcja ta ulega ekspresji w organizmie gospodarza. Rekombinowany alergen po biochemicznym oczyszczeniu można wykryć odpowiednią metodą z wykorzystaniem przeciwciał IgE.

Wynalazek dotyczy zatem także rekombinowanego wektora ekspresyjnego zawierającego opisaną powyżej lub poniżej cząsteczkę DNA funkcjonalnie połączoną z ekspresyjną sekwencją kontrolną oraz organizm gospodarza stransformowany wymienioną cząsteczką DNA lub wymienionym wektorem ekspresyjnym.

W szczególności istotą wynalazku jest rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający cząsteczkę DNA według wynalazku, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.

Wynalazek dotyczy również zastosowania przynajmniej jednej dotychczas opisanej cząsteczki DNA lub przynajmniej jednego dotychczas opisanego wektora ekspresyjnego do produkcji środka leczniczego wykorzystywanego w immunoterapeutycznym szczepieniu DNA pacjentów cierpiących na alergie, które wywołane są alergenami grupy 4 Poaceae i/lub w zapobieganiu takim alergiom.

Jak już wspomniano, wynalazek może znaleźć zastosowanie w specyficznej immunoterapii jako główny składnik preparatu zawierającego rekombinowany alergen lub kwas nukleinowy. Pojawia się tu więcej możliwości. Z jednej strony składnikiem preparatu może być białko o niezmienionej strukturze pierwszorzędowej. Z drugiej strony dla uniknięcia niepożądanych skutków ubocznych w terapii może być według wynalazku wykorzystywana hipoalergiczna forma alergoidu powstałego z pełnej cząsteczki w wyniku specyficznej delecji epitopów IgE, bądź przez wytworzenie pojedynczych fragmentów kodujących epitopy rozpoznawane przez komórki T. W końcu preparatem leczniczym może być sam w sobie kwas nukleinowy, który jeżeli wklonowany w eukariotyczny wektor ekspresyjny, daje preparat, który przy podaniu bezpośrednim zmieniałby stan immunologiczny w sensie terapeutycznym.

Wynalazek dotyczy także rekombinowanej cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencjom SEQ ID NO 1, 3 lub 5, przy czym sekwencja nukleotydową w pozycji 1-69 pochodzi z sekwencji aminokwasowej N-końca Phi p 4. Zostały wykorzystane przy tym kodony często występujące u E. coli. Od pozy6

PL 219 272 B1 cji 70 sekwencja DNA odpowiada takim sekwencjom, które zostały zidentyfikowane w DNA genomowym i cDNA Phieum pratense.

Wynalazek dotyczy zatem także cząsteczki DNA obejmującej sekwencję nukleotydową zgodną z sekwencjami SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, względnie SEQ ID NO 5, rozpoczynającą się w pozycji

70, która koduje polipeptyd o właściwościach alergenu głównego Phi p 4 z Phieum pratense.

Ponadto, wynalazek dotyczy polipeptydów kodowanych przez jedną lub większą liczbę dotychczas opisanych cząsteczek DNA, a szczególnie pod kątem ich właściwości leczniczych.

Chodzi tu szczególnie o polipeptydy o sekwencji zgodnej z sekwencjami SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4 lub SEQ ID NO 6, gdzie pozycję aminokwasów 1-33 ustalono przez N-końcowe sekwencjonowanie aminokwasów wyizolowanego naturalnego alergenu Phi p 4. Sekwencje w pozycji 24-500 wywodzą się z sekwencji DNA według SEQ ID NO 1, 3 oraz 5. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 ustalono na podstawie N-końcowego sekwencjonowania białek z różnych preparatów naturalnego Phi p 4 (tabela 1).

Istotą wynalazku jest również cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, która charakteryzuje się tym, że rzeczony polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej: - polipeptyd mający sekwencję SEQ ID NO; 2 z jedną lub większą liczbą zmian aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej: A6L, A7K,

K8N, E9D, S29T, I54L, V57I, A62V, G76T, G76N, G76S, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, V142T, T189K, K219Q, R221K, P227L, V231I, P235T, P235S, K237T, A238V, R248K, D258A, V264I, T270K, Q282K, M287L, S289G, A299P, N321A, I322L, T332S, E346Q, P347L, R351E, R351T, F357L, S358N, L362V, P364S, W384S, G410A, E419D, F456Y, S457A, S457N, L460K, K468M, Q472E i K498Q.

Odpowiednio do powyższego, istotą wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu kodowanego sekwencją DNA zdefiniowaną według wynalazku poprzez hodowanie organizmu żywiciela transformowanego cząsteczką DNA zdefiniowaną według wynalazku lub wektorem ekspresyjnym według wynalazku i izolowanie odpowiedniego polipeptydu z kultury hodowlanej.

Wynalazku dotyczy również zastosowanie co najmniej jednego z dotychczas opisanych polipeptydów do produkcji preparatów leczniczych do diagnozy i/lub terapii alergii, które wywoływane są przez grupę 4 alergenów Poaceae jak również w zapobieganiu takim alergiom.

Polipeptydy takie lub białka zgodne z wynalazkiem, które mają oddziaływanie alergenne na organizm ludzki zawarte są w ziarnkach pyłku Phieum pratense. Ziarnka pyłku innych gatunków należących do rodziny Poaceae jak np. między innymi Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus zawierają homologiczne cząsteczki alergenów (alergeny grupy 4). Homologią tych cząsteczek została udowodniona przez ich krzyżową reaktywność immunologiczną zarówno z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi jak i ludzkimi przeciwciałami IgE.

Z tego względu, wynalazek dotyczy również sekwencji homologicznych do sekwencji DNA Phi p 4, bądź odpowiadającej jej cząsteczki DNA alergenów grupy 4 z innych gatunków Poaceae, jak na przykład Lolium perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon, Holcus lanatus, Triticum aestivum oraz Hordeum vulgare, które przez istniejącą homologię sekwencji, hybrydyzują z DNA Phi p 4 w ściśle określonych warunkach bądź wykazują krzyżową reaktywność immunologiczną względem Phi p 4.

W procesie wykrywania sekwencji DNA i sekwencji białek Phi p 4 postępowano następująco.

Naturalny alergen Phi p 4 oczyszczano i izolowano według opisanych sposobów (Fahlbusch et al. 1998, Glin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al. 2000, Clin. Exp. Allergy 30; 1395-1402). W celu dokładnego oczyszczenia i pozbycia się śladów alergenów grupy 13 postępowano zgodnie ze sposobem opisanym przez Suck et al. (2000, Glin. Exp. Allergy 30: 1395-1402). Analizę reszty N-terminalnej sekwencji aminokwasowej wyizolowanego z Phieum pratense Phi p 4 ustalono sposobem Edmana. Zamieszczone w tabeli 1 sekwencje N-terminalne (P1a-f) zostały ustalone na podstawie różnych wsadów Phi p 4. Jako sekwencję zgodną dla pierwszych 15 pozycji ustalono następującą sekwencję: YFPP'P'AAKEDFLGXL (SEQ ID NO 33). Nie udało się ustalić pozycji 14, prawdopodobnie jest ona podstawiona przez cysteinę. Różne aminokwasy w pozycjach 6, 7, 8 i 9 o różnych wsadach świadczą o występowaniu izoform. Pozycje 4 i 5 są podstawione hydroksyproliną (P'), co ustalono jednoznacznie na podstawie specyficznej analizy preparatów p1-a i -b.

Przez poddanie zdenaturowanych SDS Phi p 4 działaniu endopeptydazy Glu-G (Promega, Heidelberg, Niemcy) otrzymano różne peptydy. Ustalono sekwencję aminokwasową dwóch peptydów (P2 i P3) przedstawionych w tabeli 1. Po rozszczepieniu endopeptydazą Lys-C (Roche, Mannheim,

PL 219 272 B1

Niemcy) dwa peptydy (P4 i P5) zostały oczyszczone i zsekwencjonowane (tabela 1). Z zastosowaniem rozszczepienia CNBr wyizolowano i ustalono sekwencję kolejnego peptydu (P6) (tabela 1).

Podstawą konstrukcji zdegenerowanych starterów była N-terminalna sekwencja aminokwasowa oraz sekwencje wewnętrznych peptydów 2 i 6. Amplimery z genomowego DNA Phieum pratense otrzymano z wykorzystaniem startera sensownego nr 30 i startera antysensownego nr 37 (tabela 2). Klony uzyskane z tych amplimerów poddano sekwencjonowaniu (figura 1) i wykorzystano do konstrukcji specyficznych starterów sensownych nr 82 (tabela 2). Za pomocą cDNA otrzymanego z reprezentatywnej populacji mRNA z pyłku Phieum pratense oraz z wykorzystaniem specyficznego startera sensownego nr 82 według wynalazku oraz startera zakotwiczającego AUAP (Life Technologies, Karlsruhe, Niemcy), przeprowadzono reakcję PCR (ang. polymerase chain reaction - łańcuchowa reakcja polimerazy) w ściśle określonych warunkach. Otrzymany amplimer wielkości ok. 450 kb został zsekwencjonowany i zidentyfikowano dzięki temu brakującą sekwencję genu Phi p 4 przy końcu 3' (fig. 2). W oparciu o tą C-terminalną sekwencję Phi p 4 określoną według wynalazku skonstruowano specyficzne startery antysensowne nr 85 i nr 86 (tabela 2). W oparciu o N-terminalną sekwencję aminokwasową peptydu P1-a Phi p 4 (tabela 1) skonstruowano zdegenerowany starter sensowny nr 29 pochodzący z DNA kodującego pozycję aminokwasów 24-33 (LYAKSSPAYP (SEQ ID NO 34)).

Z użyciem starterów nr 29 i nr 86 przeprowadzono reakcję PCR na matrycy genomowego DNA Phieum pratense. Otrzymany produkt PCR posłużył jako matryca kolejnej reakcji PCR (zagnieżdżonej [ang. nested] PCR) z użyciem starterów nr 29 i nr 85. Amplimery te poddano insercji do wektora pGEM T-easy (Promega, Heidelberg, Niemcy), sklonowane i zsekwencjonowane. Sekwencja ta ma swój początek w pozycji 24 licząc od N-końca, względnie w pozycji 70 sekwencji DNA zgodnej z sekwencjami SEQ ID NO 1, 3 lub 5 i sięga w kierunku startera nr 85 (pozycja 1402 w SEQ ID NO 1, 3 lub 5), który zlokalizowany jest w już określonym C-terminalnym odcinku genu Phi p 4. Na podstawie otrzymanych danych z sekwencjonowania aminokwasów pierwszych 33 pozycji i z ustalonej, na podstawie zamplifikowanych klonów z użyciem starterów nr 29/nr 85 oraz nr 82/starter zakotwiczający przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej 477 pozycji, może zostać skonstruowana pełna sekwencja cząsteczki Phi p 4. Oba klony zachodzą na siebie w 197 pozycjach ich sekwencji nukleotydowych. Peptyd kodowany przez klon nr 29/nr 85 zachodzi na 10 pozycji aminokwasowych ustalonych poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie aminokwasów sekwencji N- terminalnej (pozycje 1-33) Phi p 4, przy czym obie zastosowane metody wskazują na obecność tych samych aminokwasów.

Sekwencja aminokwasowa Phi p 4 bazująca na bezpośrednio ustalonych aminokwasach N-terminalnych i przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej odpowiada sekwencjom przedstawionym w protokole sekwencji pod symbolami SEQ ID NO 2, 4 oraz 6.

Produkty reakcji PCR przygotowano ze specyficznego startera sensownego nr 88 (tabela 2) oraz specyficznego startera antysensownego nr 86, z wykorzystaniem zarówno genomowego, jak i cDNA Phieum pratense i poddano sekwencjonowaniu. Umożliwia to wykluczenie błędów reakcji PCR oraz odkrycie genetycznych zmienności (polimorfizmy pojedynczego nukleotydu).

Wykryte polimorfizmy pojedynczego nukleotydu dla sekwencji DNA o symbolu SEQ ID NO 1 przedstawiono w tabeli 3. Niektóre z polimorfizmów pojedynczego nukleotydu powodują zamianę aminokwasów. Są one przedstawione w tabeli 4. Zsekwencjonowano następnie klony DNA, których występowanie warunkowało obecność odmiennych aminokwasów w stosunku do dominujących sekwencji o symbolach SEQ ID NO 2, 4 i 6 (tabela 5).

Ta zmienność aminokwasów warunkuje występowanie izoform cząsteczki Phi p 4. Istnienie takich izoform zaobserwowano na podstawie heterogennego izoelektrycznego zachowania naturalnego Phi p 4. Wśród wszystkich dotąd poznanych alergenów pyłku można wyróżnić omawiane izoformy. Fakt, że odcinek DNA flankowany starterami nr 29 i nr 86 faktycznie koduje białko identyczne z naturalnym alergenem Phi p 4, może być udowodniony między innymi tym, że w zgodnej z wynalazkiem wydedukowanej sekwencji aminokwasów rekombinowanej cząsteczki Phi p 4 znaleziono (fig. 3) homologiczne sekwencje peptydowe do zidentyfikowanych wewnętrznych peptydów P3, P4 i P5 (tabela 1) naturalnego Phi p 4. Z opisanej sekwencji aminokwasowej Phi p 4 wynika, że jest on zasadową cząsteczką zbudowaną z 500 aminokwasów o punkcie izoelektrycznym wynoszącym 8,99 (SEQ ID NO 2), 8,80 (SEQ ID NO 4) lub 9,17 (SEQ ID NO 6). Ilościowe zestawienie aminokwasów przedstawiono w tabeli 6. Obliczona masa cząsteczkowa rekombinowanego Phi p 4 wynosi 55,762 (SEQ ID NO 2), 55,734 (SEQ ID NO 4), bądź 55,624 (SEQ ID NO 6) Daltonów. Ta wyliczona masa cząsteczkowa zgadza się bardzo dobrze z masą cząsteczkową naturalnego Phi p 4 wynoszącą 55kDA, ustaloną

PL 219 272 B1 metodą SDS-PAGE (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807 i Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402).

Także dla alergenów grupy 4 spokrewnionych gatunków traw opublikowano masy cząsteczkowe wynoszące pomiędzy 50 a 60 kDa (Su et al., 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 449-455; Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342348; Jaggi et al., 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 83: 845-852; LeducBrodard et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072; 14-17).

Celem wyprodukowania rekombinowanego białka Phi p 4, sekwencja kodująca Phi p 4 zgodna z sekwencjami SEQ ID NO 1, 3 i/lub 5 została wklonowana w wektor ekspresyjny (np. pProEx, pACro, pSE 380). Dla poznanych w wyniku sekwencjonowania białek aminokwasów N-terminalnych zastosowano zoptymalizowane kodony E. coli.

Rekombinowany Phi p 4 poddano transformacji w bakteriach szczepu E. coli, ekspresji i oczyszczaniu przy zastosowaniu różnych technik rozdzielania, a otrzymane białko zostało poddane procesowi wtórnego składania.

Z tak uzyskanego białka rPhi p 4 otrzymuje się pojedyncze pasmo w elektroforezie SDS-PAGE, które wędruje w takim samym zakresie wartości mas cząsteczkowych jak naturalny Phi p 4. Reaktywność immunologiczna rPhi p 4 mogła zostać udowodniona poprzez reakcję z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi 5H1 i 3C4, które zostały wyindukowane w wyniku oddziaływania naturalnego Phi p 4 i reagują krzyżowo z homologicznymi białkami (grupa 4) Poaceae (fig. 4) (Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6); 361-367). rPhi p 4 wchodzi w reakcję z przeciwciałami IgE alergików, które charakteryzują się udowodnioną reaktywnością IgE z naturalnym Phi p 4. Ta reaktywność wobec IgE, a poprzez to oddziaływanie jako alergen mogło zostać udowodnione zarówno w teście-Dot, metodą Western-Blot i techniką adsorpcji alergenów na polistyrenowych mikropłytkach.

Detekcję metodą Western-Blot przedstawiono na rysunku fig. 5. W wyniku reakcji rPh1 p 4 z leukocytami zasadochłonnymi alergików uczulonych na alergeny grupy 4 pyłku traw, leukocyty zasadochłonne pobudzane są do zwiększonej ekspresji markera aktywującego CD 203c. Taka aktywacja leukocytów zasadochłonnych przez rPhi p 4 świadczy wyraźnie o funkcjonalnej czynności tego białka jako alergenu. Taki alergen rPhi p 4 może zatem zostać wykorzystywany do wysoko specyficznej diagnostyki alergików uczulonych na pyłki traw. Diagnostyka ta może przebiegać w warunkach in vitro poprzez detekcję specyficznych przeciwciał (IgE, lgG1-4, IgA) i reakcje z komórkami efektorowymi (np. leukocytami zasadochłonnymi z krwi) upakowanymi IgE lub w warunkach in vivo poprzez test reakcji skórnej i narażenie na organ reakcji.

Reakcja rPhi p 4 z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw może być dowiedziona przez specyficzną co do alergenu stymulację limfocytów T do proliferacji i syntezy cytokin dotyczącą komórek T ze świeżo spreparowanych limfocytów krwi, jak również założonych linii komórkowych limfocytów T i klonów nPhi p 4-reaktywnych.

Bazując na przedstawionej sekwencji DNA rPhi p 4 sekwencje częściowe kodujące peptydy posiadające od 50 do 350 aminokwasów zostały wklonowane w wektory ekspresyjne. Sekwencje częściowe pokrywają kolejno pełną sekwencję rPhi p 4, przy czym mamy do czynienia z zachodzeniem na siebie co najmniej 12 aminokwasów. Funkcjonalne peptydy odpowiadają fragmentom Phi p 4. Fragmenty te - pojedyncze lub połączone w różnych kombinacjach - nie reagują z przeciwciałami IgE alergików lub reakcja zachodzi na niskim poziomie, co pozwala zaklasyfikować je jako hipoalergiczne. W przeciwieństwie do tego mieszanina tych fragmentów jest zdolna w takim samym stopniu jak cała cząsteczka rekombinowanego lub naturalnego Phi p 4 do stymulacji limfocytów T alergików uczulonych na pyłki traw Phi p 4.

Na rysunku fig. 4 przedstawiono jako przykład charakterystykę dwóch takich fragmentów Phi p 4, odpowiadających aminokwasom 1-200 i 185-500, poprzez ich wiązanie z Phi p 4-specyficznymi mysimi przeciwciałami monoklonalnymi. Fragment C-końcowy 185-500 reaguje tylko z przeciwciałem monoklonalnym 5H1, podczas gdy fragment N-terminalny 1-200 reaguje wyraźnie tylko z przeciwciałem monoklonalnym 3C4. Z rysunku fig. 5 jasno wynika, iż fragment 185-500 reaguje słabiej z IgE pochodzącymi z surowicy alergików B i C, jest zatem mniej alergenny niż fragment 1-200, który wykazuje zredukowaną IgE-reaktywność (właściwości hipoalergiczne) względem surowicy pacjenta C.

Zatem, wynalazek dotyczy również opisanej powyżej i poniżej cząsteczki DNA kodującej fragment 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4, jak również cząsteczki DNA kodującej fragment 285-500 z aminokwasami 285-500 Phi p 4.

PL 219 272 B1

W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA według wynalazku kodująca immunomodulatorowy fragment Phi p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:

- fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4 oraz

- fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phi p 4.

Triplety kodujące cysteinę zostały w wyniku mutagenezy ukierunkowanej tak zmienione, że kodują inne aminokwasy, a korzystnie serynę. Zostały wyprodukowane zarówno warianty, w których zamianie uległy pojedyncze reszty cystein, jak również takie, w których zamienione zostały różne kombinacje dwóch reszt cysteinowych względnie wszystkich pięciu cystein. Funkcjonalne białka tych mutantów punktowych pod względem cysteiny wykazują silnie zredukowaną względnie brak reaktywności z przeciwciałami IgE alergików, są jednakże zdolne do reakcji z limfocytami T tych pacjentów. Zatem, wynalazek dotyczy także opisanej powyżej i poniżej cząsteczka DNA, w której wskutek ukierunkowanej mutagenezy jeden, kilka lub wszystkie rodniki cysteinowe odpowiedniego polipeptydu uległy zamianie na inny aminokwas.

W szczególności, istotą wynalazku jest cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej według wynalazku, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, która charakteryzuje się tym, że rzeczona mutacja obejmuje zastąpienie co najmniej jednej cysteiny odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.

Immunomodulatorowa aktywność fragmentów hipoalergicznych, odpowiadających polipeptydom posiadającym epitopy limfocytów T, jak również hipoalergicznych mutantów punktowych (np. polimorfizmów cysteiny) jest potwierdzona ich reakcją z limfocytami T alergików uczulonych na pyłki traw.

Takie hipoalergiczne fragmenty, bądź mutanty punktowe cysteiny mogą znaleźć zastosowanie w produkcji preparatów do obniżania wrażliwości (hiposensybilizacji) alergików, ponieważ reagują one z taką samą reaktywnością z limfocytami T, jednakże w związku z ich zmniejszoną lub brakiem reaktywności względem IgE, wywołują minimalne skutki uboczne spowodowane przez oddziaływanie z IgE.

W przypadku wklonowania odcinków kwasów nukleinowych kodujących hipoalergiczne warianty Phi p 4 lub kodujących niezmienione DNA Phi p 4 w ludzkie wektory ekspresyjne, konstrukcje takie mogą znaleźć zastosowanie w immunoterapii (szczepienie DNA).

W końcu wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznych zawierających co najmniej jedną z dotychczas opisanych cząsteczek DNA lub co najmniej jeden z dotychczas opisanych wektorów ekspresyjnych i opcjonalnie składniki aktywne i/lub pomocnicze do immunoterapeutycznego szczepi enia DNA pacjentów cierpiących na alergie wywołane alergenami grupy 4 Poaceae i/lub do zapobiegania takim alergiom.

Inna grupa kompozycji farmaceutycznych według wynalazku zawiera, zamiast DNA, co najmniej jeden z dotychczas opisanych polipeptydów nadających się do diagnozy i/lub terapii rzeczonych alergii.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku zawiera jako aktywne składniki polipeptyd według wynalazku lub wektor ekspresyjny i/lub lub ich odpowiednią farmaceutycznie użyteczną pochodną, w tym ich mieszaniny w dowolnym stosunku.

Składniki aktywne według wynalazku mogą być dostarczane do właściwej postaci dozowania razem z nośnikiem lub substancją pomocniczą o konsystencji stałej, płynnej i/lub półpłynnej i opcjonalnie w połączeniu z jednym lub kilkoma środkami czynnymi.

Jako substancje pomocnicze szczególnie nadają się do użycia immunostymulujące odcinki DNA lub oligonukleotydy bogate w motywy CpG. Kompozycje te mogą znaleźć zastosowanie jako terapeutyki i preparaty diagnostyczne w medycynie i weterynarii. Rolę nośników mogą spełniać organiczne lub nieorganiczne substancje, które nadają się do stosowania pozajelitowego i które nie wpływają negatywnie na działanie składników aktywnych będących przedmiotem wynalazku. Do podawania pozajelitowego szczególnie właściwe są roztwory, najbardziej korzystne są roztwory oleiste lub wodne, korzystne są także zawiesiny, emulsje i implantaty.

Składnik aktywny według wynalazku może także być liofilizowany, a otrzymany liofilizat wykorzystany np. do produkcji preparatów do iniekcji. Wymieniona kompozycja może być sterylizowana i/lub zawierać substancje pomocnicze takie jak substancje poślizgowe, konserwujące, stabilizujące i/lub substancje zwilżające, emulgatory, sole zmieniające ciśnienie osmotyczne, substancje buforowe i/lub wiele innych składników aktywnych. Ponadto, poprzez odpowiednią formulację składników aktywnych według wynalazku można otrzymać preparaty o powolnym uwalnianiu.

Wynalazek służy zatem także polepszeniu diagnostyki in vitro w ramach identyfikacji składnikowo-specyficznego spektrum wrażliwości na składniki wywołujące alergie.

PL 219 272 B1

Wynalazek służy również do otrzymywania znacząco ulepszonych preparatów do specyficznej immunoterapii alergii wywołanych przez pyłki traw.

T a b e l a 1

Sekwencja aminokwasów peptydów Phi p 4

Preparat	Seria peptydu	SEQ ID NO	Aminokwasy
1	6	11	16	21	26	31
Cały Phi p 4	P1-a	35	YFPP'P'	AAKED	FLGXL	VKEIP	PRLLY	AKSSP	AYP
P1-b	36	YFPP'P'	AAKED	FLGXL	VKE-P	PRLLY	AKSSP
P1-C	37	YFPXX	AAKED	FLGXL
P1-d	38	YFPXX	AKKED	FLGXL
P1-e	39	YFPXX	AAKDD	FLGXL
P1-f	40	YFPXX	LANED	F
Fragment Glu-C	P2	41	SATPF	XHRKG	VLFNI	QYV
P3	42	GLXYR	XLXPE
Fragment Lys-C	P4	43	KXMGD	DHFXA	VR
P5	44	APEGA	VDI I
Fragment CNBr	P6	45	MEPYV	SINPV	QAYAN	Y

T a b e l a 2

Zdegenerowane oraz specyficzne sensowne (forward) i antysensowne (reverse) startery skonstruowane na bazie sekwencji peptydowych i sekwencji DNA Phi p 4

Starter nr	Peptyd/DNA	Sensowny/An- tysensowny	SEQ ID NO	Sekwencja nukleotydowa
29	Phi p 4-P1	S	46	YTN TAY GCN AAR WSN WSN CCN GCN TAY CC
30	Phi p 4-P2	S	47	CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTY AAY ATM C
37	Phi p 4-P6	As	48	TAR TTN OCR TAN GCY TGN ACN GGR TT
82	Phi p 4-DNANYW	S	49	ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAG CC
85	Phi p 4-DNAGLV	As	50	TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACA CCA AAC C
86	Phi p 4-DNAQRL	As	51	CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTC TGG
88	Phi p 4-DNAPSV	S	52	CTC AGT CCT GGG GCA GAC CAT CC

Sekwencje nukleotydów starterów 82, 85, 86 oraz 88 przedstawiono zwyczajowym kodem 4-literowym. W przypadku starterów 29, 30 oraz 37 zastosowano kod DNA lUPAC-IUB; w tym przypadku litera „N” oznacza inozynę.

PL 219 272 B1

T a b e l a 3

Wykryte polimorfizmy pojedynczych nukleotydów

Pozycja w sekwencji	Nukleotyd według SEC ID NO 1	Wykryte SNP
1	2	3
85	T	A
130	C	A
159	G	A
160	A	C
169	G	A
185	C	T
186	C	A
222	G	C
226	G	A
227	G	C
228	T	C
237	C	T
273	C	T
285	C	T
286	C	T
298	G	A
299	A	C
303	C	T
309	C	G
318	T	C
320	G	A
333	C	G
348	G	C
369	C	G
409	C	T
411	C	T
420	T	C
421	A	C
423	A	C
424	G	A
425	T	C
456	C	G
462	C	A
522	G	C
525	C	G
567	G	A

PL 219 272 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
618	C	T
655	A	C
657	G	A
662	G	A
680	C	T
684	G	C
690	C	A
691	G	A
693	G	A
703	C	T, A
710	A	C
711	G	A
713	C	T
743	G	A
750	G	A
768	C	T
773	A	C
790	G	A
798	G	C
801	G	A
804	C	G
809	C	A
834	G	C
844	C	A
859	A	T
865	A	G
879	G	C
895	G	C
900	G	C, A
918	G	A
961	A	G
962	A	C
964	A	C
987	G	C
994	A	T
1020	G	A
1023	G	C

PL 219 272 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
1036	G	C
1040	C	T
1041	G	C
1047	C	A
1051	A	G
1052	G	A, C
1053	G	A, C, T
1056	G	C
1073	G	A
1084	C	G
1086	G	C
1090	C	T
1098	G	C
1151	G	C
1152	G	C
1155	G	C
1161	G	C
1185	C	G
1229	G	C
1233	G	C
1239	A	C
1240	T	C
1242	G	C
1257	G	C
1266	C	T
1269	C	T
1278	A	C, G
1305	C	G
1308	C	T
1311	C	A
1335	G	C
1350	G	C
1357	T	A
1359	A	G
1370	G	C
1377	T	C
1378	T	A
1379	T	A

PL 219 272 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
1383	G	C
1398	C	T
1411	T	C
1414	C	G
1425	C	A
1428	C	T
1443	G	C
1449	C	T
1464	G	A
1485	G	A
1498	A	C

T a b e l a 4

Zamiany aminokwasów w konsekwencji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów

Pozycja w sekwencji	Aminokwasy według SEQ ID NO 2	Wykryte zamiany
1	2	3
6	A	L
7	A	K
8	K	N
9	E	D
29	S	T
54	I	L
57	V	I
62	A	V
76	G	T, N, S
100	E	T
107	S	N
137	H	Y
141	T	P
142	V	A, T
189	T	K
219	K	Q
221	R	K
227	P	L
231	V	I
235	P	T, S
237	K	T
238	A	V
248	R	K

PL 219 272 B1 cd. tabeli 4

1	2	3
258	D	A
264	V	I
270	T	K
282	Q	K
287	M	L
289	S	G
299	A	P
321	N	A
322	I	L
332	T	S
346	E	Q
347	P	L
351	R	E, T
357	F	L
358	S	N
362	L	V
364	P	S
384	W	S
410	G	A
419	E	D
456	F	Y
457	S	A, N
460	L	K
468	K	M
472	Q	E
498	K	Q

T a b e l a 5

Pozycje aminokwasów różniących się w poszczególnych klonach Phi p 4 w porównaniu z sekwencją SEQ ID NO 2

Przykład	Pozycje różniące się*
1	2
Klon 1	L54, 157, V62, S76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, 0219, K221, L227, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472
Klon 2	L54, 157, V62, T76, T100, N107, Y137, P141, T142, K189, 0219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, 0346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472
Klon 3	P141, K282, L287, P299, L347, E351
Klon 4	G289, A410, D419, Y456, A 457, K460, E472
Klon 5	L347, E351, S384, A410, D419, Y456, A457, K460, E472

PL 219 272 B1 cd. tabeli 5

1	2
Klon 6	N107, Y137, P141, T142, K189, Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384, A410, D419, Y456, A457, K460
Klon 7	K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, L357, N358, V362, S384
Klon 8	Q219, K221, 1231, S235, T237, V238, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, E351
Klon 9	M231, T246, A251, C263, G289, L307, L309, E334
Klon 10	Q219, K221, 1231, S235, T237, M238, V242, V246, K248, A258, 1264, K270, K282, L287, P299, A321, L322, S332, Q346, P347, T351, N358, V362, S384, wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408, N452, Y456, A457, K460, E472
Klon 11	Wstawienie GA pomiędzy pozycję 407 a 408

^* [Aminokwas według SEQ ID NO 2/pozycje w sekwencji/różniący się aminokwas]

T a b e l a 6

Skład aminokwasowy Phi p 4

Aminokwasy	Liczba	% masowy
Z ładunkiem	138/138/138	33,89/33,86/33,93
Kwasowe	45/46/43	9,82/10,05/9,38
Zasadowe	54/53/55	13,67/13,39/13,78
Polarne	120/119/124	24,88/24,71/25,89
Hydrofobowe	180/180/180	35,64/35,66/35,43
A Ala	40/40/41	5,10/5,10/5,24
C Cys	5/5/5	0,92/0,93/0,93
D Asp	24/24/24	4,95/4,96/4,97
EGIu	21/22/19	4,86/5,10/4,41
F Phe	24/24/22	6,33/6,34/5,82
GGIy	42/42/40	4,30/4,30/4,10
H His	10/10/9	2,46/2,46/2,22
I Ile	29/29/30	5,88/5,89/6,10
K Lys	29/29/33	6,67/6,67/7,60
L Leu	33/33/35	6,70/6,70/7,12
M Met	11/11/10	2,59/2,59/2,36
N Asn	22/22/23	4,50/4,50/4,72
P Pro*	38/39/39	6,62/6,80/6,81
Q GIn	15/15/15	3,45/3,45/3,46
R Arg	25/24/22	7,00/6,73/6,18
S Ser	32/32/33	5,00/5,00/5,17
T Thr	22/21/22	3,99/3,81/4,00
V Wal	41/41/40	7,29/7,29/7,13
W Trp	13/13/12	4,34/4,34/4,02
Y Tyr	24/24/26	7,02/7,03/7,63

* w tym hydroksyprolina

PL 219 272 B1

Wartości zostały podane dla trzech dominujących sekwencji w kolejności SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4/SEQ ID NO 6.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej cechującej się względem sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 homologią sekwencji wynoszącą co najmniej 91,8%.
2. 2. Cząsteczka DNA o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 1 z co najmniej jedną pojedynczą zmianą nukleotydową wybraną z grupy obejmującej: T85A, C130A, G159A, A160C, G169A, C185T, C186A, G222C, G226A, G227C, T228C, C237T, C273T, C285T, C286T, G298A, A299C, C303T,

   C309G, T318C, G320A, C333G, G348C, C369G, C409T, C411T, T420C, A421C, A423C, G424A,

   T425C, C456G, C462A, G522C, C525G, G567A, C618T, A655C, G657A, G662A, C680T, G684C,

   C690A, G691A, G693A, C703T, C703A, A710C, G711A, C713T, G743A, G750A, C768T, A773C,

   G790A, G798C, G801A, C804G, C809A, G834C, C844A, A859T, A865G, G879C, G895C, G900C,

   G900A, G918A, A961G, A962C, A964C, G987C, A994T, G1020A, G1023C, G1036C, C1040T, G1041C, C1047A, A1051G, G1052A, G1052C, G1053A, G1053C, G1053T, G1056C, T1069C,

   G1073A, C1084G, G1086C, C1090T, G1098C, G1151C, G1152C, G1155C. G1161C, C1185G,

   G1229C, G1133C, A1239C, T1240C, G1242C, G1257C, C1266T, C1269T, A1278C, A1278G,

   C1305G, C1308T, C1311 A, G1335C, G1350C, T1357A, A1359G, G1370C, T1377C, T1378A,

   T1379A, G1383C, C1398T, T1411C, C1414G, C1425A, C1428T, G1443C, C1449T, G1464A, G1485A i A1498C.
3. 3. Cząsteczka DNA kodująca polipeptyd, znamienna tym, że rzeczony polipeptyd jest wybrany z grupy obejmującej:

   - polipeptyd mający sekwencję SEQ ID NO: 2 z jedną lub większą liczbą zmian aminokwasowych wybranych z grupy obejmującej: A6L, A7K, K8N, E9D, S29T, I54L, V57I, A62V, G76T, G76N, G76S, E100T, S107N, H137Y, T141P, V142A, V142T, T189K, K219Q, R221K, P227L, V231I, P235T, ME262A P235S, K237T, A238V, R248K, D258A, V264I, T270K, Q282K, M287L, S289G, A299P, N321A, I322L, T332S, E346Q, P347L, R351E, R351T, F357L, S358N, L362V, P364S, W384S, G410A, E419D, F456Y, S457A, S457N, L460K, K468M, Q472E i K498Q.
4. 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, kodująca immunomodulatorowy fragment Phi p 4 reaktywny z limfocytami T wybrana spośród:

   - fragmentu 1-200, z aminokwasami 1-200 Phi p 4 oraz

   - fragmentu 185-500, z aminokwasami 185-500 Phi p 4.
5. 5. Cząsteczka DNA odpowiadająca sekwencji nukleotydowej zdefiniowanej w zastrz. od 1 do 3, kodująca immunomodulatorowy fragment reaktywny z limfocytami T, znamienna tym, że rzeczona mutacja obejmuje zastąpienie co najmniej jednej cysteiny odpowiedniego polipeptydu przez inny aminokwas.
6. 6. Rekombinowany wektor ekspresyjny DNA lub system klonowania zawierający cząsteczkę DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4, funkcjonalnie połączony z ekspresyjną sekwencją kontrolną.
7. 7. Sposób otrzymywania polipeptydu kodowanego sekwencją DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4 poprzez hodowanie organizmu żywiciela transformowanego cząsteczką DNA zdefiniowaną w zastrz. od 1 do 4 lub wektorem ekspresyjnym zdefiniowanym w zastrz. 6 i izolowanie polipeptydu z kultury hodowlanej.