PL219151B1

PL219151B1 - Kompozycja szczepów zawierająca: Stenotrophomonas sp. szczep 2L, Stenotrophomonas sp. szczep 5L, Stenotrophomonas sp. szczep 6L, Stenotrophomonas sp. szczep 3N, Achromobacter sp. szczep 4P, Arthrobacter sp. szczep 1N, Brevundimonas sp. szczep 2N, Brevundimonas sp. szczep 5N, Brevuedimonas sp. szczep 6N, Pseudomonas sp. szczep 3G, Pseudomonas sp. szczep 4G, zdeponowana pod numerem - numer depozytu KKP 2041p., szczepionka bioremediacyjna zawierająca kompozycję szczepów, zastosowanie szczepionki bioremediacyjnej do usuwania z gleby zanieczyszczeń i sposób oczyszczania gleby

Info

Publication number: PL219151B1
Application number: PL399388A
Authority: PL
Inventors: Magdalena Popowska; Hanka Boszczyk-Maleszak; Iga Komorowska
Original assignee: Univ Warszawski
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2015-03-31
Also published as: RU2014143121A; EP2788512B1; SI2788512T1; CN104583389A; EP2788512A1; WO2013179116A1; PL399388A1; UA110449C2; US9012200B2; US20140141494A1; RU2601155C2; CN104583389B

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem rozwiązania jest kompozycja składająca się z 11 szczepów Stenotrophomonas sp. szczep 2L, Stenotrophomonas sp. szczep 5L, Stenotrophomonas sp. szczep 6L, Stenotrophomonas sp. szczep 3N, Achromobacter sp. szczep 4P, Arthrobacter sp. szczep 1N, Brevundimonas sp. szczep 2N, Brevundimonas sp. szczep 5N, Brevundimonas sp. szczep 6N, Pseudomonas sp. szczep 3G, Pseudomonas sp. szczep 4G, zdeponowana pod numerem - numer depozytu KKP 2041p., szczepionka bioremediacyjna zawierająca kompozycję tych szczepów bakterii, jej zastosowanie do usuwania z gleby zanieczyszczeń, a także sposób oczyszczania gleby.

Nieustanny rozwój przemysłu związany jest z pojawieniem się w środowisku związków chemicznych, które w naturalnych warunkach w nim nie występują. Ważny typ zanieczyszczenia antropogenicznego stanowią obecnie m.in. związki nitrowe, z których na szczególną uwagę zasługują m.in. nitrobenzen, 2- i 4-nitrotoluen, 3-nitrotoluen, 4-nitrofenol, 3-nitrofenol czy p-nitroanilina. Są one stosowane w produkcji materiałów wybuchowych, do wyrobu pestycydów, herbicydów. Jako substraty do syntezy barwników, tworzyw sztucznych, farb, a także w przemyśle farmaceutycznym. Ocenia się, że co roku produkowane Jest na świecie około 10⁸ ton organicznych związków nitrowych, a samego nitrobenzenu uwalniane jest do środowiska przeszło 8,5 ton. Powszechne zastosowanie tych związków, już od prawie 80 lat, w wielu gałęziach przemysłu, a także wyprodukowanie w pierwszej połowie minionego wieku olbrzymich ilości materiałów militarnych i amunicji w związku z toczącymi się dwiema wojnami światowymi, przyczyniło się do poważnego skażenia środowiska nitrozwiązkami. Wspomniane typy związków oraz ich metabolity są wysoce toksyczne i niebezpieczne dla człowieka - niektóre są silnymi truciznami, często o silnych właściwościach mutagennych i kancerogennych. Większość związków nitro aromatycznych cechuje stabilność i trwałość w układach biologicznych oraz ich znaczna odporność na degradację (Kulkarni i Chaudhari, 2007).

Dodatkowy niepokój budzi fakt, że skażenie związkami nitrowymi gruntu, stanowi również bezpośrednie zagrożenie dla wód podziemnych, a w konsekwencji może powodować przenikanie tych zanieczyszczeń do wód płynących. Problem skażenia gruntu i wód podziemnych związkami organicznymi pochodzącymi z różnych gałęzi przemysłu dotyczy nie tylko Polski i pozostałych krajów Unii Europejskiej, ale praktycznie wszystkich uprzemysłowionych krajów świata. Zarówno w Polsce, jak i na świecie problem zanieczyszczenia środowiska tymi związkami dotyczy głównie terenów położonych w pobliżu zakładów chemicznych, gdzie były one wykorzystywane, jako substraty w syntezie organicznej, a także terenów baz wojskowych, gdzie były przechowywane i magazynowane.

Znanych jest kilka konwencjonalnych, fizykochemicznych metod neutralizacji związków nitrowych, m.in. utlenianie oraz fotoutlenianie, hydroliza, parowanie, spalanie, adsorpcja itd. (Kanekar i wsp., 2003). Takie metody mają jednak liczne wady i ograniczenia - spalanie nie jest ekonomicznie opłacalne i nie ekologiczne. Dodatkowo towarzyszy mu uwalnianie do środowiska znacznych ilości toksycznych oparów. Podczas takich zabiegów jak filtracja, ekstrakcja czy adsorpcja na żywicy, niepożądane związki są jedynie odseparowywane, nie prowadzi to jednak do ich zniszczenia. Procesy utleniania zaś generują powstawanie toksycznych pochodnych i wiążą się z dużymi kosztami (Kulkarni i Chaudhari, 2007).

Opracowano kilka strategii remediacji gruntów - metody fizyczne, chemiczne i biologiczne. Jednak za najtańsze i najbardziej skuteczne, a co za tym idzie bezpieczne uważane są technologie bioremediacji wykorzystujące potencjał metaboliczny mikroorganizmów.

Bioremediacja jest procesem naprawczym, w którym wykorzystuje się mikroorganizmy, takie jak bakterie, drożdże oraz grzyby strzępkowe w celu rozłożenia niebezpiecznych substancji w mniej toksyczne lub nietoksyczne związki.

Dla potrzeb procesów bioremediacji, drobnoustroje izoluje się spośród mikroflory naturalnej występującej w zanieczyszczonym środowisku (reinokulacja) lub uzyskuje się metodami inżynierii genetycznej. W praktyce w procesie biodegradacji zaangażowane są wyspecjalizowane zestawy (konsorcja mikroorganizmów) wykazujące szczególne uzdolnienia do degradacji określonych grup węglowodorów.

Konsorcje takie oprócz wysokiej aktywności detoksykacyjnej muszą szybko adaptować się w skażonym środowisku, współpracować z rodzimą mikroflorą oraz nie gromadzić toksycznych produktów pośrednich rozkładu.

Można wyróżnić dwa rodzaje preparatów mikrobiologicznych: preparaty zawierające szczepy pochodzenia zewnętrznego oraz autoszczepionki, zawierające wydajne szczepy rodzime, wyizolowane różnymi metodami z oczyszczonej gleby.

PL 219 151 B1

Z opisu patentowego PL 180 141 znany jest sposób mikrobiologicznej remediacji gruntów naftowych, w którym wykorzystuje się rodzime mikroorganizmy wyizolowane z gruntu przeznaczonego do oczyszczania. Wyizolowane szczepy bakteryjne hoduje się na płynnym podłożu mineralnym w warunkach tlenowych z udziałem węglowodorów ropopochodnych i drogą identyfikacji wybiera się bakterie o największej aktywności w rozkładzie tych zanieczyszczeń. Wyselekcjonowane w ilości od 5 do 10 bakterie różnych gatunków namnaża się w temperaturze 26°C przez 48 do 72 godzin. Namnożoną hodowlę wprowadza się do skażonego gruntu, poprzez zraszanie gruntu wodną zawiesiną bakterii ₅ w ilości powyżej 10⁵ komórek na 1 g suchej masy gruntu.

Z opisu patentowego numer PL 189 586 znany jest sposób wytwarzania autoszczepionki przyspieszającej oczyszczanie gleby i ścieków z zanieczyszczeń ropopochodnych, polegający na izolowaniu bakterii z gleby lub ścieków z zastosowaniem rozcieńczeń i selektywnej hodowli wzbogaconej w wyjałowioną ropę naftową lub naftalen, jako jedyne źródło węgla.

Długotrwała obecność aromatycznych związków nitrowych, w szczególności nitroaniliny, nitrobenzenu i nitrofenolu w glebie powoduje, że na skażonym terenie zachodzi proces naturalnej adaptacji i selekcji mikroorganizmów, który wpływa na jakość, jak również skład gatunkowy autochtonicznych (rodzimych dla danego ekosystemu) zespołów mikroorganizmów. Skuteczna bioremediacja wymaga, obok dokładnego poznania mikroorganizmów odpowiedzialnych za degradację danych aromatycznych związków nitrowych, również zrozumienia szlaków rozkładu tych związków i to zarówno na poziomie fizjologicznym, biochemicznym, jak i molekularnym, a także przeprowadzenie badań nad optymalizacją warunków koniecznych do sprawnego przebiegu procesów bioremediacji. Takie badania zostały przeprowadzone przez Twórców przedmiotowego rozwiązania.

W glebie z terenów wojskowych (m.in. poligony wojskowe) i obszarów uprzemysłowionych bardzo często notowane są wysokie koncentracje nie tylko różnorodnych ksenobiotyków organicznych ale również metali ciężkich m.in. arsenu, kadmu, chromu, miedzi, ołowiu, rtęci, niklu, cynku i innych (Bahig i Altalhi, 2009). Metale ciężkie uznawane są za silne inhibitory procesów biodegradacji ksenobiotyków organicznych (Silva i wsp., 2007). Uznaje się, że obecność metali ciężkich w ściekach przemysłowych stanowi jedno z głównych ograniczeń stosowania biologicznych metod remediacji (Kulkarni i Chaudhari, 2007). Wieloletnia obecność tych zanieczyszczeń w środowisku sprawiła jednak, że bakterie wykształciły mechanizmy detoksykacji tych związków. Ponadto, sugeruje się, że tolerancja mikroorganizmów na metale ciężkie może mieć wpływ na utrzymanie i rozprzestrzenianie wśród bakterii genów oporności na antybiotyki na skutek zwiększenia presji selekcyjnej środowiska (Spain, 2003). Istnieją również dowody na związek między opornością bakterii na wiele istotnych klinicznie klas leków przeciwbakteryjnych, metale ciężkie i czwartorzędowe związki amoniowe, używane jako środki dezynfekujące. Niejednokrotnie, związane jest to z lokalizacją genów, które warunkują taką oporność, blisko siebie na tym samym plazmidzie bakteryjnym, co sugeruje możliwość wspólnego przenoszenia całych zespołów genów drogą transferu horyzontalnego (Schluter i wsp., 2007).

Istnieją liczne prace dotyczące procesu bioremediacji różnych ksenobiotyków zanieczyszczających glebę np.: ropa naftowa i jej pochodne, nie ma jednak w dotychczasowym stanie techniki prac dotyczących zastosowania bioremediacji terenów skażonych in situ aromatycznymi związkami nitrowymi. W literaturze fachowej dotyczącej biodegradacji cyklicznych nitrozwiązków problem ten jest rozważany i analizowany tylko na etapie prac laboratoryjnych. Zastosowanie skutecznej metody biodegradacji nitrozwiązków, a zwłaszcza nitroaniliny wydaje się optymalne z wielu względów, przede wszystkim są to procesy naturalnie zachodzące w środowisku, ale również co ma ogromne znaczenie, są bardzo efektywne i wiążą się one z mniejszymi kosztami, niż metody tradycyjne np.: fizyko-chemiczne.

Z polskiego zgłoszenia patentowego P 380 007 znany jest sposób bioremediacji gruntu i prewencji rozprzestrzeniania się skażeń substancjami organicznymi, polegający na tym, że do gruntu wprowadza się drożdże z gatunku Yarrowia iipolytica w postaci unieruchomionej. Drożdże wprowadza się bezpośrednio na tereny skażone lub wokół nich, metodą in situ w postaci szczepionki na nośniku organicznym, którym jest alginian sodu, agar, żelatyna, kolagen albo pióra ptaków. Szczepionka, w postaci płynnej albo suchej, może być wprowadzana w postaci granulek albo biofilmu, albo biożelu, a drożdże stanowią od 5 do 50% masy szczepionki, przy czym może ona stanowić od 10 do 100% materiału wprowadzanego do gruntu. Szczepionkę wprowadza się na głębokość od 0,1 do 2 m w otwory o średnicy od 0,1 do 1,0 m albo w rowki o szerokości od 0,1 do 1,0 m, przy czym ich rozmieszczenie może być liniowe albo poprzecznie nakładające się albo koncentryczne albo okalające dany teren albo usytuowane na jego najniżej położonym miejscu, zgodnie z kierunkiem spływu wód

PL 219 151 B1 gruntowych, a w przypadku ochrony akwenów, w pobliżu linii brzegowej poza zasięgiem fali. Wynalazek może znaleźć zastosowanie na terenach skażonych, w szczególności związkami ropopochodnymi, odpadami z przemysłu tłuszczowego, olejami roślinnymi i mineralnymi.

Przedmiotowe rozwiązanie stanowi naturalną metodę usuwania ze środowiska niebezpiecznych zanieczyszczeń nie wprowadzając do środowiska żadnych syntetycznych produktów. Bioremediacja in situ oparta jest na naturalnych zachodzących w środowisku procesach, co wiąże się ze znacznie mniejszymi kosztami niż tradycyjne metody fizyko-chemiczne. Opracowany i zdeponowany skład kompozycji/szczepionki daje możliwość szybkiego namnożenia odpowiedniej ilości preparatu i przeprowadzenie bioremediacji środowiska w krótkim czasie.

Szczepy bakterii wchodzące w skład szczepionki bioremediacyjnej stanowiącej przedmiot niniejszego zgłoszenia potrafią degradować/metabolizować aromatyczne związki nitrowe oraz ogólnie związki aromatyczne m.in. fenole, aminofenole, nitrofenole, jak również wielopierścieniowe związki aromatyczne, które mogą stanowić dla tych mikroorganizmów jedyne źródło węgla i energii. Co więcej, szczepy zdolne są do wzrostu w obecności wysokich stężeń metali ciężkich (a w przypadku gleb zanieczyszczonych nitrowymi związkami organicznymi lub ropopochodnymi, metale ciężkie również występują), jednocześnie są zdolne do wzrostu w obecności wysokich stężeń antybiotyków (w przypadku bioremediacji terenów przy firmach farmaceutycznych lub terenów dodatkowo zanieczyszczonych antybiotykami lub ich metabolitami jest to bardzo istotne) z grup: makrolidy (erytromycyna), aminoglikozydy (streptomycyna), fluorochinolony (ciprofloksacyna), tetracykliny (tetracyklina), beta-laktamy (penicylina), glikopeptydy (wankomycyna).

Celem przedmiotowego rozwiązania jest wydajny sposób usuwania toksycznych aromatycznych związków nitrowych za pomocą szczepionki mikrobiologicznej do bioremediacji gleby skażonej nitrozwiązkami aromatycznymi.

Przedmiotem rozwiązania jest kompozycja szczepów zawierająca: Stenotrophomonas sp. szczep 2L, Stenotrophomonas sp. szczep 5L, Stenotrophomonas sp. szczep 6L, Stenotrophomonas sp. szczep 3N, Achromobacter sp. szczep 4P, Arthrobacter sp., szczep 1N, Brevundimonas sp. szczep 2N, Brevundimonas sp. szczep 5N, Brevundimonas sp. szczep 6N, Pseudomonas sp. szczep 3G, Pseudomonas sp. szczep 4G, zdeponowana pod numerem - numer depozytu KKP 2041 p. (Instytut Biotechnologii I Przemysłu Rolno-Spożywczego).

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na antybiotyki z następujących grup: aminoglikozydy, fluorochinolony, glikopeptydy, makrolidy, penicyliny, sulfonamidy, tetracykliny.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na ciprofloksacynę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na erytromycynę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na gentamycynę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na penicylinę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na streptomycynę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na sulfometoksazol.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na tetracyklinę.

Korzystnie, gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na wankomycynę.

Korzystnie gdy co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystniej wszystkie szczepy wykazują oporność na metale ciężkie, takie jak; As (III), Cu (II), Cr (VI), Zn (II) oraz Ni (II).

Kolejnym przedmiotem rozwiązania według wynalazku jest szczepionka bioremediacyjna zawierająca kompozycję szczepów wyżej opisaną.

Korzystnie szczepionka zawiera 10⁸ komórek bakterii w ml podłoża.

Korzystnie poza kompozycją 11 szczepów szczepionka zawiera podłoże płynne mineralne uzupełnione nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.

PL 219 151 B1

Korzystnie poza kompozycją 11 szczepów szczepionka zawiera podłoże stałe mineralne uzupełnione nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.

Korzystnie, gdy nitrozwiązek w podłożu stanowi nitrobenzen, p-nitroanilina, 2-nitrotoluen, 4-nitrotoluen, dinitrotouleny, trinitrotouleny, mononitrofenole, polinitrofenole.

Korzystnie, gdy źródłem węgla w podłożu jest, co najmniej jeden nitrozwiązek opisany powyżej.

Korzystnie, gdy nitrozwiązek dodawany jest w ilości 50-200 mg/l podłoża hodowlanego, w zależności od stopnia zanieczyszczenia gleby.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepionki bioremediacyjnej do usuwania z gleby zanieczyszczeń w postaci aromatycznych związków nitrowych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania gleby z zanieczyszczeń przy użyciu szczepionki, polegający na tym, iż izoluje się mikroorganizmy glebowe z zanieczyszczonej gleby i prowadzi się ich hodowlę, po czym dokonuje się selekcji/identyfikacji mikroorganizmów, następnie wyselekcjonowane mikroorganizmy glebowe namnaża się, po czym namnożoną hodowlę wprowadza się do skażonego gruntu, glebę zaś natlenia się mechanicznie i utrzymuje się odpowiedni stopień jej wilgotności, charakteryzujący się tym, że usuwa się aromatyczne związki nitrowe z zanieczyszczonej gleby a mikroorganizmy glebowe stanowią kompozycję szczepów opisaną powyżej.

Korzystnie sposób odbywa się in situ.

Korzystnie sposób odbywa się ex situ.

Korzystnie, gdy hodowle prowadzi się na podłożu płynnym mineralnym uzupełnionym nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.

Korzystnie, gdy hodowle prowadzi się na podłożu stałym mineralnym uzupełnionym nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.

Korzystnie hodowlę prowadzi się w temperaturze w zakresie 20-25°C.

Korzystnie, gdy zanieczyszczoną glebę zrasza się zawiesiną bakterii (szczepionką bioremediacyjną) w stosunku objętościowym szczepionka do gleby w przedziale od 1:10 do 3:10.

Użycie kompozycji będącej przedmiotem rozwiązania jest naturalną metodą która nie wprowadza żadnych syntetycznych produktów do środowiska. Fakt, iż przedmiot zgłoszenia składa się z organizmów autochtonicznych skraca czas potrzebny na biodegradację, co więcej metoda opiera się na procesach naturalnie zachodzących w środowisku, które są efektywne i bardziej ekonomiczne niż przykładowo metody fizyko-chemiczne.

Mikroorganizmy zostały wyizolowane z gleby zanieczyszczonej nitrozwiązkami (były poligon wojskowy na Pomorzu).

Dla potrzeb rozwiązania, szczepy zostały oznaczone następująco:

T a b e l a 1 Oznaczenie szczepów

2L	Stenotrophomonas sp.
5L	Stenotrophomonas sp.
6L	Stenotrophomonas sp.
4P	Achromobacter sp.
3G	Pseudomonas sp.
4G	Pseudomonas sp.
1N	Arthrobacter sp.
2N	Brevundimonas sp.
3N	Stenotrophomonas sp.
5N	Brevundimonas sp.
6N	Brevundimonas sp.

PL 219 151 B1

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładach wykonania.

Pr zyk ła d 1

Określenie wzajemnego antagonistycznego wpływu szczepów, stanowiących kompozycję

Aby określić czy poszczególne szczepy nie wywierają na siebie wpływu o charakterze antagonistycznym (hamowanie wzrostu jednych szczepów przez drugie na skutek wydzielania do środowiska bakteriocyn), za pomocą jałowej ezy bakterie posiano rysą na szalki Petriego z podłożem M9 (Na2HPO4 x H2O - 0,134 g; KH2PO4 - 0,03g; NaCI - 0,5 g: MgSO4 x 7H2O - 2,47 g; CaCl2 - 111 mg, H2O destylowana do objętości 1000 ml) uzupełnionym 2-nitrofenolem w stężeniu 200 mg/l (wariant I) bądź z agarem odżywczym (wariant II). Wykonywano posiew określonych szczepów bakterii w odległości około 2 mm od siebie w ustalonych konfiguracjach. Stworzone układy miały na celu sprawdzenie czy każdy ze szczepów jest w stanie rosnąć w bezpośrednim sąsiedztwie pozostałych szczepów. Po 24 h inkubacji w temperaturze 30°C wykonano odczyt. Każdy z przebadanych szczepów był w stanie rosnąć w bezpośrednim sąsiedztwie pozostałych. Na tej podstawie można wnioskować, że pomiędzy badanymi mikroorganizmami nie zachodzi oddziaływanie o charakterze antagonistycznym tzn. żaden z badanych szczepów nie zmienia środowiska w taki sposób by hamować wzrost innych np. poprzez wytwarzanie bakteriocyn. Takie same wyniki uzyskano w obydwu wariantach doświadczenia, co świadczy o tym, że w obecności zastosowanego ksenobiotyku badane szczepy również nie produkują substancji biologicznie czynnych, które prowadziłyby do bakteriostazy.

Przykład 2

Określenie wrażliwości szczepów, stanowiących kompozycję na antybiotyki

T a b e l a 2

Stosowane krążki antybiotykowe

Antybiotyk	Stężenie [pg/ml]
Ciprofloksacyna (CIP)	5
Erytromycyna (E)	15
Gentamycyna (CN)	30
Penicylina G (P)	10
Streptomycyna (S)	25
Sulfometoksażol (RL)	25
Tetracyklina (TE)	30
Wankomycyna (VA)	30

Do określenia wrażliwości bakterii na wybrane antybiotyki wykorzystywano metodę dyfuzyjnokrążkową (ang. Disc diffusion) z zastosowaniem krążków nasączonych antybiotykiem o ściśle określonym stężeniu (BioMerioux) (Tabela 2) oraz badanie określające minimalne stężenie hamujące wzrost bakterii (ang. MIC, Minimal Inhibitory Concentration) z użyciem E-testów (Oxoid) (Tabela 3).

T a b e l a 3

E-testy wykorzystywane w badaniach

E-test (antybiotyk)	Zakres E-testu [pg/ml]
1	2
Ciprofloksacyna (Cl)	32-0,002
Erytromycyna (EM)	256-0,016
Gentamycyna (GM)	256-0,016
Norfioksacyna (NX)	256-0,016
Penicylina G (PG)	32-0,002
Streptomycyna (SM)	1024-0,064
Sulfometoksazol (SX)	1024-0,064
Tetracyklina (TC)	256-0,016

PL 219 151 B1 cd. Tabeli 3

1	2
Ceftriakson (TX)	256-0,016
Wankomycyna (VA)	256-0,016

Celem przeprowadzonego doświadczenia było ustalenie, w Jakim stopniu wyizolowane szczepy bakterii są wrażliwe na wybrane antybiotyki. Antybiotyki tak dobrano, aby należały one do różnych grup, odpowiednio: aminolikozydy (gentamycyna, streptomycyna); fluorohinolony II generacji (ciprofloksacyna); glikopeptydy (wankomycyna); makrolidy (erytromycyna); penicyliny (penicylina); sulfonamidy (sulfometoksazol); tetracykliny (tetracyklina).

Sporządzano inokulum 0,5 McFarlanda z hodowli poszczególnych szczepów z wykorzystaniem densytometru (EMO). Następnie przy pomocy jałowych wymazówek rozprowadzano zawiesinę komórek bakteryjnych na szalkach z gotowym podłożem MHA (Oxoid), po 15 min umieszczano na nich krążki nasączone antybiotykami o określonym stężeniu.

Szalki inkubowano w temperaturze 25-30°C, po 24 i 48 godz. wykonywano odczyt. Miarą wrażliwości badanego szczepu na dany antybiotyk była wielkość strefy zahamowania wzrostu jaka pojawiła się wokół krążka nasączonego antybiotykiem. Odczytane wyniki (wielkość stref mierzona w mm) porównywano z danymi zawartymi w normach EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) z 2010 roku (Tabela 4).

T a b e l a 4

Wartości graniczne stref zahamowania wzrostu wg norm EUCAST, 2010

Pełna nazwa antybiotyku	Skrót	Zawartość antybiotyku w krążku [pg]	Wartość graniczna strefy zahamowania wzrostu (mm)
S*>=	R*<
Iprofloksacyna	CIP	5	25	22
Erytromycyna	E	15	21	18
Gentamycyna	CN	30	15	15
Penicylina	P	10	19	19
Streptomycyna	S	25	17	14
Sulfometoksazol	RL	25	16	13
Tetracyklina	TE	30	18	15
Wankomycyna	VA	30	12	12

* S - oznacza szczep wrażliwy; R - oporny

T a b e l a 5

Wrażliwość badanych szczepów bakterii na wybrane antybiotyki określoną metodą dyfuzyjno-krążkową

Nr	Oznaczenie szczepu	Wielkość strefy zahamowania wzrostu [mm], 24 h (48 h)
RL	S	CN	CIP	TE	P	E	VA
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
1	4P	0	0	22(21)	0	19(0)	0	0	0
2	3G	0	10	22(20)	0	17(0)	0	0	0
3	4G	0	0	0	0	19(0)	0	0	0
4	2L	0	16(10)	24(19)	0	17(0)	0	0	0
5	5L	0	8	22	10(0)	19(0)	0	0	0

PL 219 151 B1 cd. Tabeli 5

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
6	6L	0	0	0	0	17(0)	0	0	0
7	1N	0	12(10)	23(18)	0	17(0)	0	0	0
8	2N	0	0	24(21)	0	18(0)	0	0	0
9	3N	0	0	25(0)	0	19(0)	0	0	0
10	5N	0	0	24	0	18(0)	0	0	0
11	6N	0	0	23(20)	0	17(0)	0	0	0

W kolejnym etapie badań ustalano wartości MIC danego antybiotyku dla badanych szczepów, czyli najmniejsze stężenie leku, wyrażone w mg/l, określone w warunkach in vitro, hamujące wzrost bakterii przy określonej gęstości inokulum i w określonym czasie (Hryniewicz i wsp., 2001). Badania te umożliwiają dokładniejsze określenie stopnia wrażliwości bakterii na stosowane antybiotyki.

Na szalki z gotowym podłożem MHA (Oxoid) i równomiernie rozprowadzoną zawiesiną bakteryjną nanoszono plastikowe paski testowe (E-testy) nasączone antybiotykiem ze stopniowo zmieniającym się stężeniem (gradient). Szalki inkubowano 24h w temperaturze 25-30°C, po tym czasie odczytywano wynik badania.

Miejsce przecięcia eliptycznej strefy zahamowania wzrostu, jaka pojawiła się wokół paska testowego, ze znacznikiem wartości na skali gradientowej paska wyznaczało najmniejsze stężenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustroju (MIC). Analogicznie jak w przypadku metody dyfuzyjnokrążkowej, uzyskane wyniki porównywano z wytycznymi zawartymi w stosownych normach. Otrzymane rezultaty przedstawiono w Tabeli 6.

T a b e l a 6

Wartości MIC danego antybiotyku dla badanych szczepów określone za pomocą E-testów

Nr	Oznaczenie szczepu	Wartość graniczna MIC ^g/ml] dla danego antybiotyku
SX	SM	GM	Cl	TC	PG	E M	VA	NX	TX
1	4P	12	96	4	>32	12	>32	256	-	256	16
2	3G	>1024	>1024	>256	>32	6	>32	>256	-	192	>256
3	4G	>1024	>1024	>256	>32	6	>32	>256	-	>256	>256
4	2L	6	64	4	>32	6	>32	>256	-	128	>256
5	5L	8	64	8	4	8	>32	>256	-	32	>256
6	6L	12	>1024	25 6	>32	6	>32	>256	-	128	>256
7	1N	12	48	8	>32	6	>32	256	>256	96	>256
8	2N	12	384	8	>32	6	>32	128	-	256	>256
9	3N	12	384	8	>32	6	>32	>256	-	128	>256
10	5N	>1024	64	4	>32	6	>32	256	-	128	>256
11	6N	>1024	>1024	8	>32	6	>32	256	-	96	>256

PL 219 151 B1

Ta b e l a 7

Zakresy E-testów oraz wartości graniczne MIC wg wytycznych EUCAST, 2010

Pełna nazwa antybiotyku	Skrót	Zakres E-testu ^g/ml]	Wartość graniczna MIC [pg/ml]
S*>=	R*<
Ciprofloksacyna	Cl	32-0,002	0,5	1
Erytromycyna	EM	256-0,016	1	2
Gentamycyna	GM	256-0,016	2	4
Norfioksacyna	NX	256-0,016	0,5	1
Penicylina G	PG	32-0,002	-	8
Streptomycyna	SM	1024-0,064	4	4
Sulfometoksazol	SX	1024-0,064	2	4
Tetracyklina	TC	256-0,016	1	2
Ceftriakson	TX	256-0,016	1	2
Wankomycyna	VA	256-0,016	2	2

* S - oznacza szczep wrażliwy; R - oporny

Wartości MIC określone w tym badaniu korelują z wynikami uzyskanymi metodą dyfuzyjno-krążkową. Szczepy, dla których stwierdzono większe, w porównaniu z pozostałymi szczepami, strefy zahamowania wzrostu wokół krążka nasączonego konkretnym antybiotykiem charakteryzowała mniejsza wartość MIC czyli niższe stężenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustroju i tym samym większa wrażliwość szczepu na dany lek.

Porównując wartości MIC z rezultatami uzyskanymi w metodzie dyfuzyjno-krążkowej stwierdzono dużą ich zgodność. W odniesieniu do szczepów bakterii, dla których wykazano wysokie wartości MIC nie obserwowano lub obserwowano bardzo niewielką strefę zahamowania wzrostu wokół krążka antybiotykowego. Wynik taki świadczy o tym, że badany szczep jest oporny na dany antybiotyk. Uzyskane wartości MIC porównano z danymi granicznymi MIC (Tabela 7) zawartymi w wytycznych EUCAST (2010). Na tej podstawie można stwierdzić, że wszystkie z 11 badanych szczepów są oporne na zastosowane w badaniu antybiotyki.

Przykład 3

Określenie wrażliwości szczepów, stanowiących kompozycję na metale ciężkie

T a b e l a 8

Sole metali ciężkich rozpuszczalne w wodzie

Sól metalu	Wzór	Masa molowa [g/mol]
Arsenian sodu	NaAsO2	129,90
Chlorek niklu	NiCl2x6H2O	237,70
Dichromian potasu		294,20
Siarczan cynku	ZnSO4x7H2O	287,50
Siarczan kadmu	CdSO4x8H2O	769,54
Siarczan miedzi	CUSO4	159,60

W celu otrzymania stężonego roztworu wyjściowego metalu (Tabela 8): o 100 mM wodny roztwór soli; As(lll),Cd(ll), Cr(VI), Ni(ll), Zn(ll), o 1 M wodny roztwór soli: Cu(ll), odpowiednią naważkę soli metalu rozpuszczano w wodzie destylowanej, po czym filtrowano przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 μm. Tak przygotowane roztwory przechowywano w temperaturze 4°C. W badaniach wykorzystywano stężenia metali ciężkich w zakresie 0,2-30 mM. W tym celu, bezpośrednio przed zastosowaniem, podłoże płynne (bulion odżywczy) uzupełniano

PL 219 151 B1 odpowiednią objętością stężonego roztworu wyjściowego do uzyskania końcowego stężenia podanego w Tabeli 9 dla poszczególnych metali.

T a b e l a 9

Zakres stężeń roztworów soli metali w bulionie odżywczym (BO)

As, Cu, Cr, Ni, Zn

2 mM

4 mM

8 mM

6 mM

8 mM

10 mM

12 mM

14 mM

16 mM

18 mM

20 mM

30 mM

Cd

0,2 mM

0,4 mM

0,8 mM

0,6 mM

0,8 mM

1,0 mM

1,2 mM

1,4 mM

1,6 mM

1,8 mM

2,0 mM

3,0 mM

Wrażliwość wyizolowanych szczepów na metale ciężkie badano poprzez wyznaczenie wartości MIC. W tym celu wykorzystywano 96-dołkowe płytki filtracyjne (ROTH). Do każdego z dołków pipetowano po 150 μΐ roztworu soli metalu w BO, tak aby stworzyć szereg o wzrastającym stężeniu każdego metalu (gradient), po czym zaszczepiano je 150 μl inokulum uzyskanym z hodowli poszczególnych szczepów o gęstości 0,5 McFarlanda. W każdym z 8 rzędów (12 dołków) znajdowało się inne stężenie danego metalu zgodnie z Tabelą 9, przy czym ostatni rząd mikroprobówek stanowił kontrolę negatywną (samo podłoże BO z solą fizjologiczną bądź BO ze stokiem metalu bez inokulum).

Płytki nakrywano plastikowym wieczkiem i dodatkowo zawijano w folię celofanową w celu zabezpieczenia ich przed parowaniem. Całość inkubowano w wytrząsarce (80 obr./min) w temperaturze 30°C. Po 24 i 48 godz. inkubacji mierzono gęstość optyczną hodowli (OD600) w każdym z 96 dołków. Do pomiarów wykorzystywano spektrofotometr „Sunrise (TECAN).

Wyznaczono wartości minimalnego stężenia metalu hamującego wzrost bakterii (MIC).

Za wartość MIC przyjęto najniższe stężenie, przy którym nie obserwowano wzrostu bakterii. Wyniki przedstawiono w Tabeli 10.

T a b e l a 10

Wartości MIC metali ciężkich dla badanych szczepów

Nr	Oznaczenie szczepu	Wartość graniczna MIC [mM/L], 24 h (48 h)
As(III)	Cu(ll)	Cr(VI)	Ni(ll)	Zn(ll)	Cd(ll)
1	4P	5(6)	3	1(2)	1	3(5)	0,1(0,2)
2	3G	5	3	1(2)	1(2)	4	0,1

T a b e l a 11

Wartości MIC określone dla szczepu wzorcowego Escherichia coli, wg Spain, 2003

Roz- twory soli metali w (BO):	As(III), Cr(VI), Ni(ll), Zn(ll), Cu(ll): 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM	Metal ciężki	MIC [mM/L]
As(lll)	0,5
Cu (II)	1
Cd(ll): 0,1 mM; 0,2mM; 0,3 mM; 0,4 mM; 0,5 mM, 0,7 mM; 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,5 mM	Ni (II)	1
Zn (II)	1
Cd (II)	0,5
Cr (VI)	0,2

Uzyskane wyniki obrazują duże zróżnicowanie między wartościami MIC poszczególnych metali. Niestety, w przypadku kadmu, nie udało się ustalić MIC. Żaden z badanych szczepów nie był zdolny do wzrostu nawet przy najniższej koncentracji soli kadmu w podłożu hodowlanym. Pomimo zastosowania roztworów tego pierwiastka o stężeniu rząd wielkości mniejszym niż pozostałych metali. Na tej podstawie można wnioskować, że toksyczność kadmu jest znacznie wyższa niż pozostałych metali ciężkich wykorzystanych w doświadczeniu. W Tabeli 10, jako wartość MIC wpisano najniższe, stosowane stężenie soli kadmu.

PL 219 151 B1

Otrzymane wyniki wskazują że badane szczepy bakterii są oporne na As(lll), Cu(ll), Cr(VI) i Zn(ll), średnio wrażliwe na Ni(ll) oraz wrażliwe na Cd(ll). Należy podkreślić, że w przypadku arsenu oraz chromu zastosowano formę metalu uznawaną za najbardziej toksyczną dla organizmów żywych (As III i Cr VI) i mimo to odnotowano wysokie wartości MIC dla badanych szczepów w porównaniu z danymi literaturowymi dla szczepu wzorcowego (Tabela 11) (Spain, 2003).

P r z yk ł a d 4

Sposób bioremediacji gleby skażonej nitrozwiązkami aromatycznymi

Hodowle czystych kultur bakteryjnych w podłożu płynnym uzupełnionym nitrozwiązkiem arom atycznym

Doświadczenie miało na celu określenie, jaka Jest wydajność wzrostu poszczególnych szczepów bakteryjnych w podłożu płynnym (M9) uzupełnionym nitrozwiązkiem aromatycznym (2-nitrofenol), stanowiącym jedyne źródło węgla dla mikroorganizmów. Wyjściowe stężenie nitrozwiązku w pożywce hodowlanej ustalono na poziomie 100 mg/L. Wszystkie z badanych szczepów wykazywały bardzo dobry wzrost na podłożu stałym (M9) uzupełnionym takim samym związkiem, również w stężeniu dwukrotnie wyższym (200 mg/L), niż zastosowane w hodowlach płynnych.

Niewielką objętość podłoża (około 20 ml) zaszczepiono materiałem mikrobiologicznym (czyste kultury bakteryjne). Szczepy bakterii izolowane ze środowiska w warunkach laboratoryjnych rosną zazwyczaj znacznie wolniej (wydłużona lag-faza) ze względu na nieznane wymagania pokarmowe oraz wydłużony czas adaptacji. Hodowle monokultur bakteryjnych prowadzono przez okres 7 dni w temperaturze pokojowej wytrząsając je na wytrząsarce platformowej. W trakcie trwania eksperymentu w odstępach jednodniowych wykonywano pomiar gęstości optycznej każdej z hodowli (OD600). Wyniki przedstawiono w Tabeli 12.

Po zakończeniu eksperymentu obliczono procentową zmianę gęstości optycznej każdej z hodowli w odniesieniu do wartości wyjściowej (Tabela 12), przy czym pominięto ostatni wynik (7 dzień, spadek OD600), gdzie najprawdopodobniej doszło do wyczerpania substancji odżywczych w pożywce, bądź też nagromadzenia toksycznych metabolitów wtórnych hamujących dalszy wzrost drobnoustrojów.

T a b e l a 12

Wzrost poszczególnych szczepów bakterii w podłożu płynnym z nitrozwiązkiem aromatycznym

Nr	Oznaczenie szczepu	Czas [dni]	Zmiana OD600 [%]
I(To)	2	3	4	5	6
OD600
1	4P	0,215	0,217	0,276	0,286	0,295	0,331	54,0
2	3G	0,139	0,108	0,174	0,158	0,177	0,178	28,1
3	4G	0,124	0,132	0,173	0,177	0,184	0,197	58,9
4	2L	0,205	0,135	0,150	0,157	0,179	0,226	10,2
5	5L	0,190	0,181	0,215	0,240	0,243	0,245	28,9
6	6L	0,250	0,181	0,262	0,204	0,234	0,258	X
7	1N	0,162	0,179	0,184	0,188	0,190	0,194	19,8
8	2N	0,176	0,171	0,225	0,225	0,230	0,219	24,4
9	3N	0,170	0,143	0,219	0,185	0,191	0,196	15,3
10	5N	0,220	0,203	0,220	0,212	0,230	0,240	9,1
11	6N	0,130	0,151	0,175	0,178	0,180	0,182	40,0

Analizując otrzymane wyniki, odnotowano istotne różnice w tempie wzrostu między poszczególnymi szczepami bakterii. Szczepy 4G, 4P oraz 6N cechował największy procentowy wzrost wartości OD, co pozwala wnioskować o najlepszym ich przystosowaniu do zastosowanych w eksperymencie warunków.

PL 219 151 B1

Hodowle mieszane kultur bakteryjnych w podłożu płynnym uzupełnionym nitrozwiązkiem aromatycznym

Liczne dane literaturowe podają że efektywna degradacja nitrozwiązków aromatycznych w tym mononitrofenoli wymaga synergicznego udziału konsorcjów bakterii (Nielsen i wsp., 2006). W związku z powyższym postanowiono założyć hodowle mieszane, w skład których wchodziły wyizolowane szczepy bakterii. W oparciu o te szczepy założono hodowlę mieszaną. Próby inkubowano przez okres 2 tygodni. Analogicznie jak w poprzednim doświadczeniu wykonywano pomiar gęstości optycznej każdej z hodowli (OD600) 24 h. Otrzymane wyniki przedstawiono na figurze, która przedstawia wzrost mieszanej kultury bakteryjnej (11 szczepów) w podłożu płynnym (M9) uzupełnionym nitrozwiązkiem aromatycznym.

Określenie efektywności bioremediacji w mikrokosmosach Przygotowanie gleby

Glebę wykorzystywaną w badaniach pobrano z głębokości około 20 cm z obszaru nie skażonego pierwotnie nitrozwiązkami aromatycznymi, położonego w znacznej odległości od dróg i zakładów produkcyjnych (przydomowy ogród).

Przed założeniem mikrokosmosów glebę trzykrotnie jałowiono w autoklawie (0,7 atm., 30 min) w celu zredukowania liczebności autochtonicznej mikroflory, co kontrolowano wysiewając odpowiednie rozcieńczenia ekstraktu glebowego przed i po zakończeniu procesu jałowienia.

Tak przygotowaną glebę kontaminowano nitrozwiązkiem aromatycznym, 2-nitrofenolem w stężeniu 200 mg/kg gleby. Naważki (0,5 kg) gleby umieszczono w owalnych plastikowych pojemnikach przykrytych wieczkiem z wykonanymi niewielkimi otworami (zapewnienie warunków tlenowych).

Przygotowanie inokulum

Inokulaty bakteryjne sporządzono w oparciu o szczepy bakterii stanowiące przedmiot zgłoszenia wyizolowane ze środowisk skażonych nitrozwiązkami aromatycznymi. Biomasę komórek bakteryjnych zbierano z szalek Petriego uprzednio nanosząc na nie 2 ml RF i zmywając murawę przy pomocy głaszczki. Zawiesinę komórek przenoszono ilościowo do jałowej kolby. Mierzono gęstości optycznej zawiesin (OD600). Wartość OD600 każdej z nich doprowadzano do zbliżonej wartości około 0,6.

Zaszczepienie gleby

Glebę skażoną nitrozwiązkiem (2-nitrofenol w stężeniu 1500 μ-g/l) zaszczepiono inokulum bakteryjnym. Stosunek objętościowy inokulum do podłoża wynosił 1:10, co stanowiło 10⁸ komórek na 1 g suchej masy gruntu. Mikrokosmosy inkubowano w zaciemnionym pomieszczeniu w temperaturze pokojowej około 20°C. Co pewien czas zaszczepioną glebę mieszano w celu zapewnienia prawidłowych warunków tlenowych. W trakcie 30 dniowej inkubacji wilgotność podłoża utrzymywano na poziomie około 50% WHC (ang. water holding capacity). Ubytek wody uzupełniano odpowiednią objętością jałowej wody destylowanej.

Określenie efektywności bioremediacji

Efektywność procesu bioremediacji gleby skażonej nitrozwiązkiem aromatycznym (2-nitrofenol) (ocena redukcji nitrofenolu w badanym gruncie) zbadano przeprowadzając pomiar stężenia nitrozwiązku metodą chromatografii gazowej z detektorem płomieniowo jonizacyjnym GC-FID. Wykonanie oznaczenia zlecono Laboratorium Ochrony Środowiska „WESSLING” (http://pl.wessling-group.com/pl/uslugi/) oraz określenie liczebności bakterii.

W wyniku przeprowadzonego eksperymentu zaobserwowano znaczny spadek zawartości 2-nitrofenolu w glebie (w mikrokosmosach) na skutek biologicznego rozkładu zanieczyszczeń.

Próba kontrolna (gleba niezaszczepiona) zawierała 2-nitrofenol w stężeniu 1500 μ-g/l, poddanie jej procesom biodegradacji z wykorzystaniem szczepionki bioremediacyjnej doprowadziło do blisko

3-krotnego spadku zawartości zastosowanego nitroarenu. Ponadto, w badanym układzie eksperymen₅ talnym (poza układem kontrolnym) odnotowano wzrost liczebności bakterii z 10⁵ kom./ml (1 dzień) do około 10⁸ kom./ml (30 dzień).

Uzyskane wyniki wskazują na wysoką efektywność zastosowanej metody, rezultaty bioremediacji w skali laboratoryjnej okazały się być zadawalające.

Podstawowym celem niniejszego rozwiązania było opracowanie, na podstawie uzyskanej kolekcji szczepów, szczepionki mikrobiologicznej do bioremediacji gruntów skażonych nitrozwiązkami oraz sprawdzenie efektywności procesu biodegradacji w mikrokosmosach.

W oparciu o autochtoniczną mikroflorę terenów skażonych nitrozwiązkami aromatycznymi opracowano skład szczepionki bioremediacyjnej gruntów skażonych tymi ksenobiotykami oraz sprawdzono

PL 219 151 B1 ich efektywność w mikrokosmosach. Etap ten poprzedzono badaniami, które doprowadziły do wytypowania najbardziej wydajnych monokultur oraz zespołów bakterii (wykazujących najlepszy wzrost na podłożu płynnym z nitrozwiązkiem aromatycznym jako jedynym źródłem węgla).

Kontrola procesu bioremediacji skażonej gleby polegała na wykonaniu analiz fizykochemicznych oraz mikrobiologicznych. Otrzymano zadawalające efekty bioremediacji w mikrokosmosach. Po zastosowaniu inokulatów bakteryjnych (zespół 11 szczepów), po okresie inkubacji wynoszącym 30 dni, nastąpiła trzykrotna redukcja zanieczyszczenia, w odniesieniu do próby kontrolnej (nieinokulowanej). Ponadto, określenie liczebności mikroorganizmów na początku procesu bioremediacji, jak i po jego zakończeniu wykazało, że zastosowane mikroorganizmy charakteryzują się dobrą zdolnością namnażania nawet w niesprzyjających warunkach (obecność nitroarenu w podłożu).

Dodatkowo wykazano zdolność do wzrostu 11 szczepów bakterii wchodzących w składa szczepionki bioremediacyjnej, w obecności wysokich stężeń metali ciężkich oraz antybiotyków, na podstawie istniejących norm uznano te szczepy za oporne. Biorąc pod uwagę fakt, że w glebach skażonych bardzo często notowane są wysokie stężenia nie tylko różnorodnych ksenobiotyków organicznych, ale również metali ciężkich (Bahig i Altalhi, 2009), które uznawane są za silne inhibitory procesów biodegradacji ksenobiotyków organicznych (Silva i wsp., 2007) oraz antybiotyków czy ich metabolitów jest to rozwiązanie bardzo cenne i ważne dla efektywności procesu bioremediacji gleby.

Bibliografia

1. Bahig E.D., Altalhi A.D. 2009. Degradative plasmid and heavy metal resistance plasmid naturally coexist in phenol and cyanide assimilating bacteria. Am. J. Biochem. Biotech. 5(2): 84-93.

2. EUCAST. 2011. Clinical Breakpoint Table v. 1.3 2011-01-05.

http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/EU CAST_breakpoints_v1.3_pdf.pdf.

3. Kanekar P., Doudpure P., Sarnaik S. 2003. Biodegradation of nitroexplosives. Indian J. Exper. Biol. 41: 991-1001

4. Kulkami M., Chaudhari A. 2007. Microbial remediation of nitro-aromatic compounds: An overview. J. Environ. Manag. 85: 496-512.

5. Nielsen D.R., McLellan P.J., Dauguls A.J. 2006. Direct estimation of the oxygen requirements of Achromobacter xyloxidans tor aerobic degradation of monoaromatic hydrocarbons (BTEX) in a bioscrubber. Biotechnol. Lett. 28: 1293-1298.

6. Schluter A., Szczepanowski R., Puhler A., Top E.M. 2007. Genomics of lncP-1 antibiotic resistance plasmids isolated from wastewater treatment plants provides evidence for a widely accessible drug resistance gene pool. FEMS Microbiol. Rev. 31: 449-477.

7. Silva A.D.A., Pereira P.M., Filho S.G., Hofer E. 2007. Utilization of phenol in the presence of heavy metals by metal-tolerant non-fermentative gram-negative bacteria isolated from wastewater. Microbiol. 49: 68-73.

8. Spain A. 2003. Implications of microbial heavy metal tolerance in the environment. Rev. Undergrad. Res. 2: 1-6.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja szczepów zawierająca Stenotrophomonas sp. szczep 2L, Stenotrophomonas sp. szczep 5L, Stenotrophomonas sp. szczep 6L, Stenotrophomonas sp. szczep 3N, Achromobacter sp. szczep 4P, Arthrobacter sp. szczep 1N, Brevundimonas sp. szczep 2N, Brevundimonas sp. szczep 5N, Brevundimonas sp. szczep 6N, Pseudomonas sp. szczep 3G, Pseudomonas sp. szczep 4G, zdeponowana pod numerem - numer depozytu KKP 2041p. (Instytut Biotechnologii i Przemysłu Rolno-Spożywczego).
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na antybiotyki z następujących grup: aminoglikozydy, fluorochinolony, glikopeptydy, makrolidy, penicyliny, sulfonamidy, tetracykliny.
3. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na ciprofloksacynę.
4. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na erytromycynę.
5. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na gentamycynę.
6. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na penicylinę.
7. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na streptomycynę.
8. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na sulfometoksazol.
9. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na tetracyklinę.
10. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na wankomycynę.
11. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że co najmniej jeden szczep będący składnikiem kompozycji, a korzystnie wszystkie szczepy wykazują oporność na metale ciężkie, takie jak: As(III), Cu(II), Cr(VI), Zn(II) oraz Ni(II).
12. Szczepionka bioremediacyjna, zawierająca kompozycję szczepów określoną w zastrzeżeniu 1.
13. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że poza kompozycją 11 szczepów zawiera podłoże płynne mineralne uzupełnione nitrozwiązkiem jako jedynym źródłem węgla.
14. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że poza kompozycją 11 szczepów zawiera podłoże stałe mineralne uzupełnione nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.

₅
15. Szczepionka według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera 10⁵ komórek bakterii w ml podłoża.
16. Szczepionka według zastrz. 13 albo 14, znamienna tym, że nitrozwiązek w podłożu stanowi nitrobenzen, p-nitroanilina, 2-nitrotoluen, 4-nitrotoluen, dinitrotouleny, trinitrotouleny, mononitrofenole, polinitrofenole.
17. Szczepionka według zastrz.13 albo 14, znamienna tym, że źródłem węgla w podłożu jest co najmniej jeden nitrozwiązek określony w zastrzeżeniu 16.
18. Szczepionka według zastrz. 17, znamienna tym, że nitrozwiązek dodawany jest w ilości 50-200 mg/l podłoża hodowlanego, w zależności od stopnia zanieczyszczenia gleby.
19. Zastosowanie szczepionki bioremediacyjnej, według zastrz. 12 do usuwania z gleby zanieczyszczeń w postaci aromatycznych związków nitrowych.
20. Sposób oczyszczania gleby z zanieczyszczeń przy użyciu szczepionki, znamienny tym, iż izoluje się mikroorganizmy glebowe z zanieczyszczonej gleby i prowadzi się ich hodowlę, po czym dokonuje się selekcji/identyfikacji mikroorganizmów, następnie wyselekcjonowane mikroorganizmy glebowe namnaża się, po czym namnożoną hodowlę wprowadza się do skażonego gruntu, glebę zaś natlenia się mechanicznie i utrzymuje się odpowiedni stopień jej wilgotności, znamienny tym, że usuwa się aromatyczne związki nitrowe z zanieczyszczonej gleby a mikroorganizmy glebowe stanowią kompozycję szczepów określoną w zastrzeżeniu 1.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że odbywa się in situ.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że odbywa się ex situ.

PL 219 151 B1
23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że hodowle prowadzi się na podłożu płynnym mineralnym uzupełnionym nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.
24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że hodowle prowadzi się na podłożu stałym mineralnym uzupełnionym nitrozwiązkiem, jako jedynym źródłem węgla.
25. Sposób według zastrz. 23 albo 24, znamienny tym, że nitrozwiązek w podłożu stanowi nitrobenzen, p-nitroanilina, 2-nitrotoluen, 4-nitrotoluen, dinitrotolueny, trinitrotolueny, mononitrofenole, polinitrofenole.
26. Sposób według zastrz. 23 albo 24, znamienny tym, że źródłem węgla w podłożu jest co najmniej jeden nitrozwiązek określony zastrzeżeniem 25.
27. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że nitrozwiązek dodawany jest w ilości 50-200 mg/L podłoża hodowlanego, w zależności od stopnia zanieczyszczenia gleby.
28. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w temperaturze w zakresie 20-25°C.
29. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że zanieczyszczoną glebę zrasza się zawiesiną bakterii (szczepionką bioremediacyjną) w stosunku objętościowym szczepionka do gleby w przedziale od 1:10 do 3:10.