PL216936B1 - Multilayer electrode and the application thereof - Google Patents

Abstract

A multilayer electrode has a substrate and layer including separated particles and carbon nanoparticles. The separated particles contain toluene diisocyanate, compound synthesized from tetramethoxysilane and N,N-dimethyl-N-tetradecyl-N-3-(trimethoxysilyl)ammonium chloride, and/or compound synthesized from tetramethoxysilane and N,N,N-trimethyl-N,N-3-(trimethoxysilyl)ammonium chloride.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest wielowarstwowa elektroda do oznaczania dopaminy obejmująca substrat elektrodowy oraz warstwy zawierające cząstki pierwszego rodzaju i nanocząstki węgla CNP osadzone na substracie elektrodowym. Bardziej szczegółowo, przedmiotem wynalazku jest elektroda wielowarstwowa, zbudowana z nanocząstek węgla oraz submikrocząstek polikrzemianowych układanych naprzemiennie. Elektroda taka znajduje zastosowanie jako czujnik dopaminy w obecności substancji przeszkadzających, takich jak kwas askorbinowy, kwas moczowy, acetaminofen, NADH, tryptofan oraz kwas cytrynowy. Wspomniane zastosowanie jest również przedmiotem obecnego wynalazku.The present invention relates to a multilayer electrode for the determination of dopamine comprising an electrode substrate and layers containing first type particles and CNP carbon nanoparticles deposited on the electrode substrate. More specifically, the subject of the invention is a multilayer electrode made of carbon nanoparticles and polysilicate submicroparticles arranged alternately. Such an electrode is used as a dopamine sensor in the presence of interfering substances such as ascorbic acid, uric acid, acetaminophen, NADH, tryptophan and citric acid. Said use is also an object of the present invention.

Przygotowanie elektrody warstwowej obejmuje wykorzystanie znanej od prawie pół wieku metody „warstwa po warstwie, stosowanej w elektrochemii do tworzenia nowych materiałów elektrodowych na gładkich przewodzących powierzchniach, takich jak złoto, węgiel szklisty czy ITO [Crepilho F., Z.V., Oliveira Jr.O., Nart F.„ Electrochemistry of Layer by Layer films: a review. International of Electrochemical Science, 2006. 1: p. 194-214]. Polega ona na naprzemiennym nakładaniu materiałów obdarzonych przeciwnymi ładunkami elektrycznymi, które w wyniku oddziaływań elektrostatycznych tworzą trwałe warstwy na powierzchni elektrody. Pionierem metody był ller [ller R.K., Multilayers of colloidal particles. J.Colloid.Interf.Sci., 1966. 21: p. 569], który w 1965 roku przedstawił pierwszy materiał wykonany z cząstek krzemionki i koloidalnego bemitu, do zastosowania w spektrofotometrii. W latach dziewięćdziesiątych metodę rozwinął Decher, proponując układ składający się z polikationu i polianionu, czyli warstw polielektrolitu o różnych ładunkach, nakładanych sukcesywnie jedna po drugiej, aż do uzyskania pożądanych właściwości materiału [Decher G., Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science, 1997. 277.]. Metoda ta pozwoliła na tworzenie bardzo cienkich filmów na powierzchni stałej.The preparation of a layered electrode involves the use of the layer-by-layer method known for almost half a century, used in electrochemistry to create new electrode materials on smooth conductive surfaces, such as gold, glassy carbon or ITO [Crepilho F., ZV, Oliveira Jr.O., Nart F. 'Electrochemistry of Layer by Layer films: a review. International of Electrochemical Science, 2006. 1: p. 194-214]. It consists in the alternate application of materials endowed with opposite electric charges, which, as a result of electrostatic interactions, create permanent layers on the electrode surface. The method was pioneered by ller [ller R.K., Multilayers of colloidal particles. J.Colloid.Interf.Sci., 1966. 21: p. 569], who in 1965 introduced the first material made of silica particles and colloidal bitumen for use in spectrophotometry. In the nineties, the method was developed by Decher, proposing a system consisting of polycation and polyanion, i.e. layers of polyelectrolyte with different charges, applied successively one after another until the desired material properties were obtained [Decher G., Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites. Science, 1997. 277.]. This method allowed the creation of very thin films on the solid surface.

W stanie techniki stosowane jest zasadniczo jedno podejście do metody layer by layer, mianowicie, do tworzenia warstw wykorzystywane są polielektrolity (anionowe lub kationowe) lub polikektrolity i nanocząstki różnych materiałów. Pomimo wieloletniej praktyki aplikacji tychże materiałów dopiero w ostatnim czasie zainteresowano się tworzeniem warstw wyłączenie z cząstek. Skonstruowano np. elektrodę bez wykorzystania polimeru, zawierającą dwa rodzaje różnoimiennie naładowanych nanocząstek węgla o powierzchni funkcjonalizowanej grupami fenylosulfonowymi (CNP) oraz submikrocząstek polikrzemianowych modyfikowanych cieczą jonową [Lesniewski, A., et al., Carbon ceramic nanoparticulate film electrode prepared from oppositely charged particles by layer-by-layer approach. Electrochemistry Communications. 12(1); p. 83-85]. W połowie 2010 roku opublikowano zgłoszenie wynalazku obejmujące elektrodę wykonaną techniką layer by layer z wielościennych nanorurek węglowych modyfikowanych grupą aminową i nanorurek z ujemnie naładowanymi grupami karboksylowymi [Shao-Horn Y., Woo L.S., Yabuuchi N., Hammond-Cunningham P.T., US 2010/0159366 A1, Layer-by-layer assemblies of carbon-based nanostructures and their applications in energy storage and generation devices. 2010], Nowe podejście do znanej od lat metody otworzyło drogę do projektowania materiałów o jeszcze ciekawszych właściwościach, łatwiejszych w przygotowaniu i tańszych.The prior art uses essentially one layer by layer approach, namely polyelectrolytes (anionic or cationic) or polycectrolytes and nanoparticles of various materials are used to form the layers. Despite many years of practice in the application of these materials, only recently has there been an interest in creating layers solely from particles. For example, an electrode was constructed without the use of a polymer, containing two types of differentially charged carbon nanoparticles with a surface functionalized with phenylsulfonic groups (CNP) and ionic liquid-modified polysilicate submicroparticles [Lesniewski, A., et al., Carbon ceramic nanoparticulate film electrode prepared from oppositely charged particles layer-by-layer approach. Electrochemistry Communications. 12 (1); p. 83-85]. In mid-2010, an application for the invention was published, including an electrode made using the layer by layer technique of polyhedral carbon nanotubes modified with an amino group and nanotubes with negatively charged carboxyl groups [Shao-Horn Y., Woo LS, Yabuuchi N., Hammond-Cunningham PT, US 2010 / 0159366 A1, Layer-by-layer assemblies of carbon-based nanostructures and their applications in energy storage and generation devices. 2010], A new approach to the method known for years has opened the way to designing materials with even more interesting properties, easier to prepare and cheaper.

Dopamina (4-(2-aminoetylo)benzeno-1,2-d) jest bardzo ważnym neuroprzekaźnikiem. Jej niedobór może prowadzić do powstania wielu poważnych chorób jak choroba Parkinsona czy schizofrenia. Dlatego też ważne jest szybkie i proste oznaczenie stężenia dopaminy w próbkach moczu czy krwi. W tym celu stosuje się różne metody (HPLC, MS, NMR), a także metody elektrochemiczne, które są tanie i bardzo szybkie. Aby móc elektrochemicznie oznaczyć dopaminę, niezbędne jest przygotowanie podłoża czułego na jej obecność, a biernego dla substancji występujących wraz z nią w badanej próbce i często zakłócających prawidłową jej detekcję. Jest to przede wszystkim kwas askorbinowy (witamina C) moczowy, NADH (zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy), acetaminofen (Paracetamol), który jest chętnie i nadmiernie przyjmowany przez ludzi jako środek łagodzący ból. Są to substancje aktywne elektrochemicznie i charakteryzujące się potencjałem utleniania zbliżonym do potencjału utleniania dopaminy, co stanowi ogromny problem w jej oznaczaniu elektrochemicznym. Literatura opisuje przede wszystkim wpływ kwasu askorbinowego, którego stężenie we krwi jest znacznie większe od stężenia dopaminy. Wynosi ono u zdrowego człowieka od 0,01 μΜ do 1 μΜ, natomiast stężenie kwasu askorbinowego mieści się w zakresie 0,1-0,6 mM [Shah R., Parajuli R.R., Balogun Y., Ma Y., He H.„ Sensors 2008. 8: p. 8423-8452]. W celu wyeliminowania substancji przeszkadzających, w obecnym stanie techniki stosuje się membrany kationowymienne, np. Nafion, które uniemożliwiają przepływ anionu kwasu askorbinowego w pH 7 do podłoża elektrodowego. Zastosowanie Nafionu zostało przedstawione m.in. przez Tian w zgłoszeniu wynalazku opublikowanymDopamine (4- (2-aminoethyl) benzene-1,2-d) is a very important neurotransmitter. Its deficiency can lead to many serious diseases such as Parkinson's disease or schizophrenia. Therefore, it is important to quickly and easily measure dopamine levels in urine or blood samples. For this purpose, various methods (HPLC, MS, NMR) are used, as well as electrochemical methods that are cheap and very fast. In order to be able to determine dopamine electrochemically, it is necessary to prepare a substrate that is sensitive to its presence and passive to substances present with it in the tested sample and often interfering with its proper detection. It is primarily ascorbic acid (vitamin C), uric acid, NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide), acetaminophen (Paracetamol), which is readily and excessively consumed by humans as a pain reliever. These are electrochemically active substances with an oxidation potential similar to that of dopamine, which is a huge problem in its electrochemical determination. The literature mainly describes the influence of ascorbic acid, the concentration of which in the blood is much higher than that of dopamine. In a healthy person, it ranges from 0.01 μΜ to 1 μ, while the concentration of ascorbic acid is in the range of 0.1-0.6 mM [Shah R., Parajuli RR, Balogun Y., Ma Y., He H. " Sensors 2008. 8: p. 8423-8452]. In order to eliminate interfering substances, the prior art uses cation exchange membranes, e.g., Nafion, which prevent the flow of the ascorbic acid anion at pH 7 into the electrode support. The use of Nafion has been presented, among others, by Tian in his patent application published

PL 216 936 B1 w 2009 roku [Tian D., Song W., Chen Y., Cui R., Method for preparing polymer modified electrode for selectively measuring dopamine, 2009, CN101576525 A]. Opierając się na podobnym mechanizmie ochrony, powierzchnie można modyfikować jonami żelazocyjankowymi [Noroozifar M, Khorasani-Motlagh M., Taheri A., Talanta 2010. 80: p.1657-1664]. Innym sposobem, jest znalezienie podłoża elektrodowego, które będzie katalizowało te reakcje przy różnych potencjałach lub w ogóle nie będzie na nie czułe. Pozwala to na uproszczenie budowy czujnika i zmniejszenie jego rozmiarów i kosztów. W obecnym stanie techniki jako czujniki dopaminy stosuje się wiele różnych materiałów. Przede wszystkim są to elektrody z węgla szklistego (GC) modyfikowane nanorurkami węglowymi, nanocząstkami metali czy tlenkami metali [Zhang Y., Jin G., Wang Y., Sensors, 2003. 3: p. 443-450]. Jednoczesną detekcję dopaminy i acetaminofenu na elektrodzie GC modyfikowanej nanorurkami wielościennymi, na którą nie miała wpływu obecność NADH i kwasu askorbinowego, przedstawił np. Alothman [Alothman Z.A., B.N., Sensors and Actuators B, 2010. 146: p. 314- 320]. Do detekcji dopaminy, a także innych neuroprzekaźników w obecności kwasu askorbinowego, można wykorzystać elektrodę modyfikowaną polietylenooksotiofenem domieszkowanym sulfonowaną β-cyklodekstryną, która zastała zastrzeżona amerykańskim wnioskiem patentowym przez Harley i współpracowników.In 2009 [Tian D., Song W., Chen Y., Cui R., Method for preparing polymer modified electrode for selectively measuring dopamine, 2009, CN101576525 A]. Based on a similar protection mechanism, surfaces can be modified with ferrocyanide ions [Noroozifar M, Khorasani-Motlagh M., Taheri A., Talanta 2010. 80: p.1657-1664]. Another way is to find an electrode substrate that will catalyze these reactions at different potentials or be completely non-sensitive to them. This simplifies the design of the sensor and reduces its size and cost. A wide variety of materials are used as dopamine sensors in the state of the art. First of all, they are glassy carbon (GC) electrodes modified with carbon nanotubes, metal nanoparticles or metal oxides [Zhang Y., Jin G., Wang Y., Sensors, 2003. 3: p. 443-450]. The simultaneous detection of dopamine and acetaminophen on a GC electrode modified with polyhedral nanotubes, unaffected by the presence of NADH and ascorbic acid, was presented by e.g. Alothman [Alothman Z.A., B.N., Sensors and Actuators B, 2010. 146: p. 314-320]. For the detection of dopamine, as well as other neurotransmitters in the presence of ascorbic acid, an electrode modified with polyethyleneoxothiophene doped with sulfonated β-cyclodextrin, which was registered in the US patent application by Harley et al., Can be used.

[Harley C., Colleran J., Alcock B., Breslin C. US 2010/0116655 A1, Chemical Messenger Sensor. 2010]. Inny materiał elektrodowy, złożony z nanocząstek palladu w połączeniu z włóknami węglowymi znalazł zastosowanie w jednoczesnym oznaczaniu dopaminy, kwasu askorbinowego i kwasu moczowego i został opatentowany w Chinach przez You. [You. T., Huang J., Palladium nanoporticles/carbon nanofibercompound preparation method and aplication therefor in electrocatalysis. 2010]. W literaturze pojawiły się także opisy elektrod wykonanych techniką layer by layer czułe na obecność dopaminy. Jest to np. elektroda ITO pokryta warstwami składającymi się z nanocząstek węgla CNP i polikationu PDDAC [Amiri, M., S. Shahrokhian, and F. Marken, Ultrathin carbon nanoparticle composite film electrodes: Distinguishing dopamine and ascorbate. Electroanalysis, 2007. 19(10): p. 1032-1038]. Zaskakująco, nie ma doniesień o oznaczaniu dopaminy na elektrodach layer by layer wykonanych wyłącznie z nanocząstek. Tymczasem, procedura przygotowania takich elektrod jest prostsza i tańsza.[Harley C., Colleran J., Alcock B., Breslin C. US 2010/0116655 A1, Chemical Messenger Sensor. 2010]. Another electrode material, composed of palladium nanoparticles in combination with carbon fibers, has found application in the simultaneous determination of dopamine, ascorbic acid and uric acid, and has been patented in China by You. [You. T., Huang J., Palladium nanoporticles / carbon nanofibercompound preparation method and aplication therefor in electrocatalysis. 2010]. Descriptions of electrodes made with the layer by layer technique, sensitive to the presence of dopamine, also appeared in the literature. It is, for example, an ITO electrode covered with layers consisting of CNP carbon nanoparticles and PDDAC polycation [Amiri, M., S. Shahrokhian, and F. Marken, Ultrathin carbon nanoparticle composite film electrodes: Distinguishing dopamine and ascorbate. Electroanalysis, 2007. 19 (10): p. 1032-1038]. Surprisingly, there are no reports of dopamine determination on layer by layer electrodes made entirely of nanoparticles. Meanwhile, the procedure for preparing such electrodes is simpler and cheaper.

Zgodnie z wynalazkiem, wielowarstwowa elektroda do oznaczania dopaminy obejmująca substrat elektrodowy oraz warstwy zawierające cząstki pierwszego rodzaju i nanocząstki węgla CNP o rozmiarach 9-18 nm osadzone warstwami na substracie elektrodowym, charakteryzuje się tym, że cząstki pierwszego rodzaju mają rozmiary 100-300 nm oraz zawierają cząstki wybrane z grupy obejmującej TDA, syntezowane z tetrametoksysilanu i chlorku N,N-dimetylo-N-tetradecylo-N-3-(trimetoksysililo)amoniowego, TMA, syntezowane z tetrametoksysilanu i chlorku N,N,N-trimetylo-N,N-3-(trimetoksysililo)amoniowego lub ich mieszaniny przy czym elektroda obejmuje od jednej do 24, a korzystnie 6 albo 12 warstw zawierających cząstki pierwszego rodzaju i nanocząstki węgla, osadzonych na substracie elektrodowym.According to the invention, the multilayer dopamine determination electrode comprising the electrode substrate and layers comprising first type particles and CNP carbon nanoparticles having a size of 9-18 nm deposited in layers on the electrode substrate, is characterized in that the particles of the first type are 100-300 nm in size and contain particles selected from the group consisting of TDA, synthesized from tetramethoxysilane and N, N-dimethyl-N-tetradecyl-N-3- (trimethoxysilyl) ammonium chloride, TMA, synthesized from tetramethoxysilane and N, N, N-trimethyl-N, N- chloride 3- (trimethoxysilyl) ammonium or mixtures thereof, the electrode comprising from one to 24, preferably 6 or 12 layers containing first type particles and carbon nanoparticles, deposited on the electrode substrate.

Korzystnie, substrat elektrodowy wybrany jest z grupy obejmującej: tlenek indu domieszkowany tlenkiem cyny, ITO, tlenek cyny domieszkowany fluorem, FTO, węgiel szklisty, GC i złoto, Au.Preferably, the electrode substrate is selected from the group consisting of: indium oxide doped with tin oxide, ITO, fluorine doped tin oxide, FTO, glassy carbon, GC and gold, Au.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie takiej wielowarstwowej elektrody do selektywnego oznaczania dopaminy.The invention also includes the use of such a multi-layer electrode for the selective determination of dopamine.

Szczegółowy opis wynalazkuDetailed Description of the Invention

Obecny wynalazek zostanie bardziej szczegółowo przedstawiony w przykładach wykonania z odniesieniem do załączonego rysunku, na którym:The present invention will be illustrated in more detail in embodiments with reference to the accompanying drawing, in which:

Fig. 1 Przedstawia fragment struktury cząstek polikrzemianowych: (A) TDA, (B) TMA.Fig. 1 shows a fragment of the structure of the silicate particles: (A) TDA, (B) TMA.

Fig. 2 Przedstawia przygotowanie elektrody warstwowej według metody layer by layer.Fig. 2 shows the preparation of a layered electrode according to the layer by layer method.

Fig. 3 Zdjęcia SEM: (A) cząstki TDA, (B) cząstki TDA pokryte CNP; elektroda TDA/CNP z (C) 1 warstwą, (D) 6 warstwami, (E) 12 warstwami, (F) 24 warstwami materiału.Fig. 3 SEM pictures: (A) TDA particles, (B) CNP coated TDA particles; TDA / CNP electrode with (C) 1 layer, (D) 6 layers, (E) 12 layers, (F) 24 layers of material.

Fig. 4 Woltamogram cykliczny dla elektrody TDA/CNP z (i) 1 warstwą, (ii) 6 warstwami, (iii) warstwami, (iv) 24 warstwami, zanurzonej w (A) 0.1 M H2SO4, (B) 25 nmol t-BuFc na -1 elektrodzie, 0.1 M NaCIO4. Szybkość skanowania 10 mV s^-1.Fig. 4 Cyclic voltamogram for a TDA / CNP electrode with (i) 1 layer, (ii) 6 layers, (iii) layers, (iv) 24 layers, immersed in (A) 0.1 M H2SO4, (B) 25 nmol t- BuFc on -1 electrode, 0.1 M NaCIO4. Scanning rate 10 mV s ^-1 .

Fig. 5 Woltamogram cykliczny zarejestrowany na (i) czystej elektrodzie ITO, (ii) z 6 warstwamiFig. 5 Cyclic voltamogram recorded on (i) clean ITO electrode, (ii) with 6 layers

TDA/CNP, (iii) z 6 warstwami TMA/CNP, w 0.1 mM K3Fe(CN)6, 0.1 M NaCIO4, z szyb-1 kością skanowania 10 mV s^-1 TDA / CNP, (iii) with 6 layers of TMA / CNP, in 0.1 mM K3Fe (CN) 6, 0.1 M NaCIO4, with a scan rate of 10 mV s ^-1

Fig. 6 Woltamogram cykliczny dla (i) czystej elektrody ITO, (ii) z 6 warstwami TDA/CNP zanurzonej w elektrolicie zawierającym (A) 2 mM AA, 2 mM DA, 1 mM UA, (B) 1 mM AA, mM DA, 0.1 mM AC w 0.1 M buforze fosforanowym pH 5. Szybkość skanowania 20 mV s^-1 Fig. 6 Cyclic voltamogram for (i) pure ITO electrode, (ii) with 6 layers of TDA / CNP immersed in an electrolyte containing (A) 2 mM AA, 2 mM DA, 1 mM UA, (B) 1 mM AA, mM DA , 0.1 mM AC in 0.1 M phosphate buffer pH 5. Scanning rate 20 mV s ^-1

PL 216 936 B1PL 216 936 B1

Fig. 7 DPV woltamogram wykonany dla elektrody ITO pokrytej 6 warstwami TDA/CNP zanurzonej do buforu fosforanowego pH 5 zawierającego: (A) 1 mM AA, 1 mM UA i 0.4 - 350 μΜ DA, (B) 1 mM AA, 0.1 mM AC i 0.3 - 23.5 μΜ DA. Szybkość skanowania 20 mV s^-1.Fig. 7 DPV voltamogram made for an ITO electrode covered with 6 layers of TDA / CNP immersed in pH 5 phosphate buffer containing: (A) 1 mM AA, 1 mM UA and 0.4 - 350 μΜ DA, (B) 1 mM AA, 0.1 mM AC and 0.3 - 23.5 μΜ DA. Scanning rate 20 mV s ^-1 .

Fig. 8 CV otrzymany dla elektrody ITO pokrytej sześcioma warstwami TMA/CNP (1) lubFig. 8 CV obtained with an ITO electrode covered with six layers of TMA / CNP (1) or

TDA/CNP (2), zanurzona w 0.1 M buforze fosforanowym o różnym pH oraz zawierającym (A) 1 mM AA, 1 mM DA i 1 mM UA, (B) 1 mM AA, 1 mM Da, 0.1 mM AC. Szybkość -1 skanowania 20 mV s^-1.TDA / CNP (2), immersed in 0.1 M phosphate buffer of various pH and containing (A) 1 mM AA, 1 mM DA and 1 mM UA, (B) 1 mM AA, 1 mM Da, 0.1 mM AC. Scanning speed -1 20 mV s ^-1 .

Przedmiotem wynalazku jest elektroda wielowarstwowa zbudowana z przewodzących nanocząstek węglowych i nieprzewodzących submikrocząstek polikrzemianowych, mająca zastosowanie jako selektywny czujnik dopaminy. Konstrukcja elektrody opiera się na zastosowaniu metody layer by layer z użyciem wyłącznie małych cząstek różnego materiału, obdarzonych przeciwnym ładunkiem elektrycznym. Kolejne warstwy powstają dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym pomiędzy grupami funkcyjnymi cząstek obydwu rodzajów. Cząstki polikrzemianowe (100-300 nm) są znacznie większe od węglowych (9-18 nm), dlatego też są one pokrywane przez CNP, co sprzyja znacznemu rozwinięciu powierzchni w stosunku do wielkości elektrody. Materiał ten jest łatwy w przygotowaniu i trwały. Pozwala też na oznaczanie małych stężeń dopaminy w obecności substancji, który zwykle to uniemożliwiają, czyli kwasu askorbinowego, kwasu moczowego, acetaminofenu, NADH, kwasu cytrynowego i tryptofanu. Elektroda umożliwia też detekcję dopaminy w szerokim zakresie pH.The subject of the invention is a multilayer electrode made of conductive carbon nanoparticles and non-conductive polysilicate submicroparticles, applicable as a selective dopamine sensor. The design of the electrode is based on the layer by layer method, using only small particles of different material, with the opposite electric charge. Subsequent layers are formed due to electrostatic interactions between the functional groups of particles of both types. Polysilicate particles (100-300 nm) are much larger than carbon particles (9-18 nm), therefore they are covered by CNP, which favors a significant surface development in relation to the size of the electrode. This material is easy to prepare and durable. It also allows the determination of low concentrations of dopamine in the presence of substances that usually prevent this, i.e. ascorbic acid, uric acid, acetaminophen, NADH, citric acid and tryptophan. The electrode also enables the detection of dopamine over a wide pH range.

Przygotowano dwie odmiany elektrody, różniące się rodzajem cząstek polikrzemianowych. Cząstki te różniły się modyfikacją powierzchni, czyli grupami funkcyjnymi. Cząstki TDA posiadają długi łańcuch węglowy, który nadaje im właściwości hydrofobowe w przeciwieństwie do krótkiego łańcucha cząstek TMA, które są bardziej hydrofitowe (Fig. 1).Two types of electrode were prepared, differing in the type of polysilicate particles. These particles differed in surface modification, i.e. functional groups. TDA particles have a long carbon chain which makes them hydrophobic in contrast to the short chain TMA particles which are more hydrophilic (Fig. 1).

Odczynniki i stosowane materiałyReagents and materials used

AparaturaApparatus

Podstawowymi technikami wykorzystanymi do badania właściwości wynalazku były woltamperometria cykliczna (CV) i różnicowa woltamperometria pulsowa (DPV). Wymagały one użycia standardowego trójelektrodowego naczynia. Elektrodę pracującą stanowił badany wynalazek, elektrodą odniesienia była elektroda chlorosrebrowa (Ag/AgCI/KCI(sat.)), natomiast pomocniczą elektrodą byt drut platynowy (d = 0.5 mm). Do zobrazowania powierzchni elektrod użyto skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).The primary techniques used to test the properties of the invention were cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV). They required the use of a standard three-electrode vessel. The working electrode was the tested invention, the reference electrode was silver chloride electrode (Ag / AgCI / KCI (sat.)), And the auxiliary electrode was a platinum wire (d = 0.5 mm). A scanning electron microscope (SEM) was used to visualize the electrode surfaces.

OdczynnikiReagents

Prekursory procesu zol-żel: tetrametoksysilan, chlorek N,N-dimetylo-N-tetradecylo-N-3-(trimetoksysililo)amoniowy, chlorek N,N,N-trimetylo-N-N-3(trimetoksysililo)amoniowy zakupione w ABCR. Sole fosforanowe do przygotowania roztworów buforowych, surfaktant CTAB. Dopamina, kwas moczowy, kwas askorbinowy, acetaminofen, NADH, kwas cytrynowy, tryptofan. Nanocząstki węgla, (Emperor 2000, Cabot Corp.).Sol-gel process precursors: tetramethoxysilane, N, N-dimethyl-N-tetradecyl-N-3- (trimethoxysilyl) ammonium chloride, N, N, N-trimethyl-N-3 (trimethoxysilyl) ammonium chloride purchased from ABCR. Phosphate salts for the preparation of buffer solutions, CTAB surfactant. Dopamine, uric acid, ascorbic acid, acetaminophen, NADH, citric acid, tryptophan. Carbon nanoparticles, (Emperor 2000, Cabot Corp.).

Elektroda według wynalazku może być stosowana do selektywnego oznaczania dopaminy.The electrode according to the invention can be used for the selective determination of dopamine.

Na początku przygotowano substraty niezbędne do budowy elektrody. Przede wszystkim zsyntetyzowano cząstki polikrzemianowe za pomocą zmodyfikowanej metody Stobera opartej na procesie zol-żel. Cząstki te mają rozmiar ok. 100-300 nm i w większości eliptyczny, niejednorodny kształt. Jest to materiał nieprzewodzący, który pomaga rozwinąć powierzchnię elektrody. Do syntezy użyto dwóch prekursorów: podstawowego tetrametoksysilanu oraz domieszki prekursora który pozwolił na modyfikację powierzchni cząstki dodatnio naładowanymi grupami tetraalkiloamoniowymi, stosując chlorek N,N-dimetylo-N-tetradecylo-N-3-(trimetoksykrzemian)amoniowy otrzymano cząstki TDA, natomiast przy zastosowaniu domieszki chlorek N,N,N-trimetylo-N-N-3-(trimetoksykrzemian)amoniowy, cząstki TMA. Następnie przygotowano zawiesiny tych cząstek w metanolu (5 mg/ml) oraz nanocząstek węgla CNP w acetonitrylu (5 mg/ml).First, the substrates necessary for the construction of the electrode were prepared. First of all, polysilicate particles were synthesized using a modified Stober method based on the sol-gel process. These particles are about 100-300 nm in size and mostly elliptical, non-uniform in shape. It is a non-conductive material that helps to expand the electrode surface. Two precursors were used for the synthesis: the basic tetramethoxysilane and the admixture of the precursor, which allowed for the modification of the particle surface with positively charged tetraalkylammonium groups, using N, N-dimethyl-N-tetradecyl-N-3- (trimethoxysilicate) ammonium particles, while using the admixture of TDA N, N, N-trimethyl-NN-3- (trimethoxysilicate) ammonium chloride, TMA particles. Subsequently, these particles were suspended in methanol (5 mg / ml) and CNP carbon nanoparticles in acetonitrile (5 mg / ml).

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Przygotowanie elektrody rozpoczyna się od dokładanego oczyszczenia substratu elektrodowego, którym jest ITO. Polega to na myciu ITO w etanolu i wodzie dejonizowanej za pomocą ultradźwięków, a następnie usunięciu organicznych zanieczyszczeń przez wygrzanie w piecu w temperaturze 500°C przez 30 min. Na tak przygotowane podłoże nakładano kolejno warstwy cząstek. Najpierw ITO zanurza się do zawiesiny cząstek polikrzemianowych (TDA lub TMA) na 5 sekund, po czym wyjmuje się i pozostawia do odparowania rozpuszczalnika w pozycji poziomej. Następnie, elektroda jest płukana w czystym metanolu, w celu usunięcia nadmiaru słabo związanych cząstek i pozostawiana do wyPL 216 936 B1 schnięcia. Kolejny krok polega na zanurzeniu w zawiesinie cząstek węgla (CNP) także na 5 sekund, powolnym ruchem jest wyjmowana, suszona i płukana w acetonitrylu, ponownie suszona. W ten sposób powstaje jedna warstwa nowego podłoża, która składa się z dwóch rodzajów cząstek (Fig. 2).Electrode preparation begins with a thorough cleaning of the electrode substrate, ITO. It consists in washing ITO in ethanol and deionized water with the use of ultrasound, and then removing the organic impurities by heating in an oven at 500 ° C for 30 minutes. Layers of particles were successively applied to the thus prepared substrate. First, ITO is immersed in a suspension of silicate particles (TDA or TMA) for 5 seconds, then removed and the solvent is allowed to evaporate horizontally. Then, the electrode is rinsed with pure methanol to remove excess weakly bound particles and allowed to dry. The next step is to immerse the carbon particles (CNP) in the suspension for 5 seconds, slowly remove it, dry it and rinse with acetonitrile, then dry it again. In this way, one layer of new substrate is formed, which consists of two types of particles (Fig. 2).

Przygotowano elektrody pokryte jedną, sześcioma, dwunastoma i dwudziestoma czteroma warstwami polikrzemianowo-węglowymi. Dalsze zwiększanie liczby warstw prowadziło do zmniejszenia stabilności mechanicznej materiału. Jako optymalną elektrodę pod względem właściwości elektrochemicznych i aplikacyjnych wybrano elektrodę sześciowarstwową. Elektroda zanurzana była do elektrolitu zawierającego dopaminę oraz substancje przeszkadzające; kwas askorbinowy oraz kwas moczowy lub kwas askorbinowy i acetaminofen. Za pomocą metody DPV wyznaczona została granica wykrywalności oraz względne odchylenie standardowe. Porównanie elektrod składających się cząstek TDA i TMA nie wykazało znaczących różnic poza zdolnością akumulacji anionów żelazocyjankowych oraz w oznaczaniu dopaminy w neutralnym środowisku.The electrodes covered with one, six, twelve and twenty-four polysilicate-carbon layers were prepared. A further increase in the number of layers led to a reduction in the mechanical stability of the material. A six-layer electrode was selected as the optimal electrode in terms of electrochemical and application properties. The electrode was immersed in an electrolyte containing dopamine and interfering substances; ascorbic acid and uric acid, or ascorbic acid and acetaminophen. Using the DPV method, the detection limit and the relative standard deviation were determined. The comparison of the electrodes consisting of TDA and TMA particles did not show any significant differences, apart from the capacity of the accumulation of ferrocyanide anions and in the determination of dopamine in a neutral environment.

Zsyntetyzowane cząstki polikrzemianowe oglądane były za pomocą mikroskopu SEM (Fig. 3). Na zdjęciu przedstawiono cząstki TDA, które kształtem i wielkością są bardzo zbliżone do TMA. Cząstki te mają eliptyczny kształt, a ich dłuższa średnica wynosi 100-300 nm. Zdjęcie obok przedstawia te same cząstki ale pokryte warstwą węgla CNP. Widać zasadniczą różnicę, wcześniej gładkie cząstki polikrzemianowe, teraz oblepione są kilkudziesięciu-nanometrowymi agregatami CNP (Fig. 3 A,B). Powierzchnię wynalazku z różnymi liczbami warstw przedstawiają zdjęcia SEM (Fig. 3 C,D,E,F). Jak się okazało, nanocząstki nie pokrywają jednorodnie powierzchni ITO, organizują się w swoiste wyspy, które rosną wraz z ilością nanoszonego materiału, dla 12 i 24 warstw obserwujemy całkowite pokrycie ITO cząstkami (Fig. 3E,F).The synthesized silicate particles were viewed with a SEM microscope (Fig. 3). The photo shows TDA particles, which in shape and size are very similar to TMA. These particles are elliptical in shape and their longer diameter is 100-300 nm. The photo opposite shows the same particles but covered with a CNP carbon layer. You can see the fundamental difference, previously smooth polysilicate particles are now caked with CNP aggregates of several dozen nanometers (Fig. 3 A, B). The surface of the invention with different numbers of layers is shown in SEM pictures (Fig. 3 C, D, E, F). As it turned out, the nanoparticles do not uniformly cover the ITO surface, they organize into specific islands that grow with the amount of material applied. For the 12 and 24 layers, we observe complete coverage of ITO with particles (Fig. 3E, F).

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Rozwinięcie powierzchni wraz z kolejnymi warstwami potwierdzono także na drodze badań elektrochemicznych. Zmierzono m.in, prąd pojemnościowy w elektrolicie bez substancji aktywnej elektrochemicznie dla każdej z elektrod. Okazało się, że prąd ten prawie liniowo zależy od liczby nakładanych warstw (Fig. 4A). Kolejny eksperyment polegał na utlenianiu 25 nmoli ciekłego tert-butyloferrocenu (Fig. 4B). Tutaj również obserwowano ścisłą zależność od ilości warstw, co świadczy o tym, iż wraz ze wzrostem ilości osadzonego materiału zwiększała się granica trzech faz na której zachodzi utlenianie depozytu.The development of the surface with subsequent layers was also confirmed by electrochemical tests. Among other things, the capacitive current in the electrolyte without electrochemically active substance was measured for each of the electrodes. It turned out that this current depends almost linearly on the number of layers applied (Fig. 4A). Another experiment was to oxidize 25 nmol of liquid tert-butylferrocene (Fig. 4B). Here, too, a close dependence on the number of layers was observed, which proves that with the increase in the amount of deposited material, the three-phase boundary at which the deposit oxidation takes place increased.

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Kolejnym krokiem było sprawdzenie podstawowych właściwości elektrochemicznych wynalazku, czyli zdolności do akumulacji kationów, bądź anionów na zasadzie wymiany przeciwjonu grup funkcyjnych którymi modyfikowane były cząstki. Okazało się, że zarówno elektrody TDA/CNP jak i TMA/CNP dość dobrze akumulują kation Ru(NH3)6³⁺ co zaznacza się przez wzrost prądu utleniania-redukcji heksaminorutenu, ale tylko na powierzchni elektrody TMA/CNP akumuluje się anion Fe(CN)6³⁺. Związane jest to z hydrofobowym charakterem cząstek TDA i hydrofilowością wymienianego anionu.The next step was to check the basic electrochemical properties of the invention, i.e. the ability to accumulate cations or anions by exchanging the counterion of functional groups with which the particles were modified. It turned out that both the TDA / CNP and TMA / CNP electrodes accumulate the Ru (NH3) 6 ³⁺ cation quite well, which is marked by an increase in the oxidation-reduction current of hexaminorutene, but only on the surface of the TMA / CNP electrode the Fe anion (CN ) 6 ³⁺ . This is due to the hydrophobic nature of the TDA particles and the hydrophilicity of the anion exchanged.

P r z y k ł a d 4P r z k ł a d 4

Aplikacja elektrodyElectrode application

Właściwości aplikacyjne elektrody przedstawiono na przykładzie elektrody z sześcioma warstwami materiału. W przypadku elektrody z jedną warstwą nie otrzymano zadawalających wyników, a pomiędzy sześcioma i większą liczbą warstw nie obserwowano znaczącej różnicy w sygnale elektrochemicznym. Elektrodę zanurzono w roztworze zawierającym dopaminę, kwas askorbinowy (AA), kwas moczowy (UA) (Fig. 6A) lub acetaminofen (AC) (Fig. 6B). Otrzymano trzy bardzo dobrze rozseparowane piki. Potencjał piku, nieodwracalnego chemicznie utleniania AA wynosi ok. 207 mV, natomiast dla utleniania DA 424 mV, dla utleniania UA 515 mV, a dla AC 558 mV. Znaczna separacja pików w czasie jednoczesnego utleniania kilku substratów, ponad 100 mV, jednoznacznie otwiera drogę do aplikacji elektrody jako czujnika.The application properties of the electrode are shown on the example of an electrode with six layers of material. With a single layer electrode, satisfactory results were not obtained, and no significant difference in the electrochemical signal was observed between the six and more layers. The electrode was immersed in a solution containing dopamine, ascorbic acid (AA), uric acid (UA) (Fig. 6A) or acetaminophen (AC) (Fig. 6B). Three very well separated peaks were obtained. The peak potential for chemically irreversible oxidation of AA is approx. 207 mV, while for DA oxidation 424 mV, for UA oxidation 515 mV, and for AC 558 mV. Significant separation of peaks during the simultaneous oxidation of several substrates, over 100 mV, clearly opens the way to the application of the electrode as a sensor.

P r z y k ł a d 4.1P r z k ł a d 4.1

Za pomocą techniki DPV, oznaczano stężenie dopaminy w obecności substancji przeszkadzających. Fig. 7A przedstawia woltamogram roztworu UA i AA. Zakres stężenia w jakim prowadzono oznaczenie to 0.4 do 350 μΜ przy zachowaniu na stałym poziomie stężenia AA i UA. Liniowy zakres zarejestrowano w przedziale 0.4 - 6 μΜ, z równaniem prostej Ipa (μΑ) = 2.03 CDA (μΑ) - 0.24 i współczynnikiem korelacji równym 0.996. Na Fig. 7B przedstawiono oznaczenie dopaminy wykonane w obecności AA i AC, w zakresie stężeń dopaminy 0.3 - 23 μΜ. Liniowy zakres krzywej kalibracyjnej wynosił od 0.3 do 18 μΜ, z równaniem prostej wynoszącym Ipo (μΑ) = 2.508 CDA (μΑ) + 0.5084 i współczynnikiem korelacji 0.993. Tę samą technikę użyto do wyznaczenia granicy wykrywalnościBy means of the DPV technique, the dopamine concentration was determined in the presence of interfering substances. Fig. 7A shows the voltamogram of the UA and AA solution. The concentration range in which the determination was carried out was 0.4 to 350 μΜ, while the AA and UA concentrations were kept constant. The linear range was recorded in the range 0.4 - 6 μΜ, with the straight line equation Ipa (μΑ) = 2.03 CDA (μΑ) - 0.24 and the correlation coefficient equal to 0.996. Fig. 7B shows the dopamine assay performed in the presence of AA and AC over the dopamine concentration range of 0.3 - 23 µΜ. The linear range of the calibration curve was 0.3 to 18 μΜ, with the straight line equation Ipo (μΑ) = 2.508 CDA (μΑ) + 0.5084 and the correlation coefficient of 0.993. The same technique was used to determine the limit of detection

PL 216 936 B1 która wynosiła 0.135 μΜ (S/N = 3) dla pomiaru w obecności AA, UA oraz 0.103 μΜ (S/N = 3) dla próbki zawierającej AA, AC. Następnie policzono także względne odchylenie standardowe (R.S.D.%, n=6) 1.64% dla przypadku pierwszego i 3.04% dla drugiego.PL 216 936 B1 which was 0.135 µΜ (S / N = 3) for the measurement in the presence of AA, UA and 0.103 µΜ (S / N = 3) for the sample containing AA, AC. Then the relative standard deviation (R.S.D.%, n = 6) of 1.64% for the first case and 3.04% for the second was also calculated.

P r z y k ł a d 4.2P r z k ł a d 4.2

W opisanym wynalazku ważne jest także pH środowiska oznaczania dopaminy, ze względu na późniejszą pracę sensora w płynach ustrojowych, które mogą mieć pH zarówno kwaśne, np. moczu, jak i obojętne np. krwi. Dlatego, pracę wynalazku sprawdzano także w elektrolicie o różnym pH. Na woltamogramach Fig. 5 przedstawione jest utlenianie dopaminy w obecności różnych substancji przeszkadzających na elektrodzie złożonej z CNP oraz z TDA w porównaniu do elektrody zawierającej TMA. Okazało się, iż elektroda z cząstkami TMA, ze względu na zdolność akumulacji anionów lepiej pracuje w środowisku neutralnym czy zasadowym.In the described invention, the pH of the dopamine determination medium is also important, due to the subsequent operation of the sensor in body fluids, which may be acidic, e.g. in urine, and neutral in e.g. blood. Therefore, the operation of the invention was also tested in an electrolyte of different pH. The voltammograms of Fig. 5 show the oxidation of dopamine in the presence of various interfering substances at the CNP electrode and the TDA electrode compared to the TMA containing electrode. It turned out that the electrode with TMA particles, due to the ability to accumulate anions, works better in a neutral or alkaline environment.

P r z y k ł a d 4.3E xample 4.3

Sprawdzono także czy inne substancje, występujące naturalnie obok dopaminy mogą wpływać na pracę opisywanego wynalazku. Okazało się, iż NADH, nie wykazuje aktywności w badanym zakresie potencjałów, podobnie jest w przypadku kwasu cytrynowego. Natomiast, tryptofan, aminokwas kodowany, wchodzący w skład białek i ciałek krwi, utlenia się na przygotowanym podłożu, jednak nie przeszkadza w oznaczeniu, gdyż pik utleniania tej substancji pojawia się przy potencjale równym 780 mV.It was also checked whether other substances occurring naturally in addition to dopamine could affect the operation of the described invention. It turned out that NADH showed no activity in the investigated range of potentials, similarly in the case of citric acid. On the other hand, tryptophan, an encoded amino acid, which is a component of proteins and blood cells, is oxidized on the prepared medium, but it does not interfere with the determination, because the oxidation peak of this substance appears at a potential of 780 mV.

Claims (3)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1. Wielowarstwowa elektroda do oznaczania dopaminy obejmująca substrat elektrodowy oraz warstwy zawierające cząstki pierwszego rodzaju i nanocząstki węgla CNP o rozmiarach 9-18 nm osadzone warstwami na substracie elektrodowym, znamienna tym, że cząstki pierwszego rodzaju mają rozmiary 100-300 nm oraz zawierają cząstki wybrane z grupy obejmującej TDA, syntezowane z tetrametoksysilanu i chlorku N,N-dimetylo-N-tetradecylo-N-3-(trimetoksysililo)amoniowego, TMA, syntezowane z tetrametoksysilanu i chlorku N,N,N-trimetylo-N,N-3-(trimetoksysililo)amoniowego lub ich mieszaniny przy czym elektroda obejmuje od jednej do 24, a korzystnie 5 albo 12 warstw zawierających cząstki pierwszego rodzaju i nanocząstki węgla, osadzonych na substracie elektrodowym.CLAIMS 1. A multilayer electrode for the determination of dopamine comprising an electrode substrate and layers comprising first type particles and 9-18 nm CNP carbon nanoparticles deposited in layers on the electrode substrate, characterized in that the first type particles are 100-300 nm in size and contain particles selected from the group consisting of TDA, synthesized from tetramethoxysilane and N, N-dimethyl-N-tetradecyl-N-3- (trimethoxysilyl) ammonium chloride, TMA, synthesized from tetramethoxysilane and N, N, N-trimethyl-N, N-3- chloride ( trimethoxysilyl) ammonium or mixtures thereof, the electrode comprising from one to 24, preferably 5 or 12 layers containing first type particles and carbon nanoparticles, deposited on the electrode substrate. 2. Elektroda według zastrz. 1, znamienna tym, że substrat elektrodowy wybrany jest z grupy obejmującej: tlenek indu domieszkowany tlenkiem cyny, ITO, tlenek cyny domieszkowany fluorem, FTO, węgiel szklisty, GC i złoto, Au.2. The electrode according to claim The method of claim 1, wherein the electrode substrate is selected from the group consisting of: indium oxide doped with tin oxide, ITO, fluorine doped tin oxide, FTO, glassy carbon, GC and gold, Au. 3. Zastosowanie wielowarstwowej elektrody według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń do selektywnego oznaczania dopaminy.3. Use of a multi-layer electrode according to any one of the preceding claims for the selective determination of dopamine.