PL215011B1 - Sposób otrzymywania monodyspresyjnych mikrozeli pektynowych z wykorzystaniem ukladu mikroprzeplywowego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych z wykorzystaniem układu mikroprzepływowego. Bardziej szczegółowo, sposób według wynalazku umożliwia formulację mikrożeli pektynowych o kontrolowanej strukturze z zastosowaniem technik mikroprzepływowych do enkapsulacji nanocząstek.

Techniki mikroprzepływowe są uniwersalnym narzędziem badawczym wykorzystywanym w nauce, w szczególności w biologii, chemii, medycynie oraz farmacji. Pozwalają na operacje na bardzo małych objętościach płynów (rzędu nawet pikolitrów), jak również na wytwarzanie monodyspersyjnych mikrocząstek oraz mikrokapsuł o kontrolowanym rozmiarze i morfologii.

Mikrokapsuły to cząstki o średnicy od 1 do 1000 μm. Są nośnikiem mikroskopijnych ilości substancji, np. barwników czy preparatów biologicznie czynnych. Składają się z jądra i cienkiej otoczki. Ich główne zastosowanie to kontrolowane uwalnianie substancji leczniczych w określonym miejscu i czasie. Najważniejszą właściwością mikrokapsułek jest ich niewielki wymiar umożliwiający zbudowanie ogromnej powierzchni, na której zachodzi uwalnianie substancji enkapsulowanej.

Mikrokapsuły stosowane są w wielu gałęziach przemysłu [Thies, C. in Encyclopedia of Polymer Science and Technology (ed H. F. Mark) (John Wiley & Sons, Inc., 2005)]: farmaceutycznym, spożywczym, kosmetycznym, papierniczym, perfumeryjnym i innych. Różne preparaty kapsułkuje się, aby:

i) polepszyć ich stabilność i trwałość; ii) poprawić ich rozpuszczalność w wodzie; iii) zwiększyć biodostępność; iv) zamaskować smak i/lub zapach; v) zmniejszyć ich lotność; vi) móc je uwalniać w określonym miejscu i czasie; vii) przedłużyć proces ich uwalniania.

W przemyśle spożywczym kapsułkowanie ma przede wszystkim na celu: maskowanie smaku i zapachu, zmniejszenie higroskopijności, ochronę przed utlenianiem i oddzielenie od siebie składników produktu, aby te nie reagowały ze sobą. Kluczowym jest, aby kapsułki były wykonane z substancji nietoksycznej, najkorzystniej spożywczej. Z kolei przemysł rolniczy, tzw. agrochemia, kapsułkuje np. środki ochrony roślin czy feromony. Ogranicza się w ten sposób lotność użytych mieszanin, toksyczność dla środowiska, a także użytą ich ilość. Natomiast w przemyśle kosmetycznym kapsułki stosowane są w produkcji kremów, pudrów, środków higieny oraz dezodorantów (szczególnie przeciwpotowych). Mikrokapsuły są szeroko stosowane także w biochemii, medycynie i farmacji. Zamykane są w nich mikroorganizmy (np. drożdże, aby przyspieszyć procesy fermentacyjne [Bonin, S. Agro Przemysł 6, 20-23 (2008)]), komórki (np. w celach transplantacyjnych [Schmidt, J. J., Rowley, J. & Kong, H. J. Journal of Biomedical Materials Research Part A 87A, 1113-1122 (2008)], aby zahamować odpowiedź immunologiczną organizmu biorcy), substancje aktywne (np. badania nad enkapsulacją leków [Xu, Q., Hahsimoto, M., Dang, T. T., Hoare, T., Kohane, D. S., Whitesides, G. M., Langer, R., Anderson, D. G. Small 5, 1575-1581 (2009); Yu, C.-Y., Cao, H., Zhang, X.-C., Zhou, F.-Z., Cheng,

S.-X., Zhang, X.-Z., and Zhuo, R.-X. Langmuir 25, 11720-11726 (2009)], enzymów [Um, E., Lee,

D.-S., Pyo, H.-B. & Park, J.-K. Microfluidics and Nanofluidics 5, 541-549 (2008)], hemoglobiny [Schmidt, J. J., Rowley, J. & Kong, H. J. Journal of Biomedical Materials Research Part A 87A, 1113-1122 (2008)] czy innych białek krwi [Liu, Z., Jiao, Y., Wang, Y., Zhou, C. & Zhang, Z. Advanced Drug Delivery Reviews 60, 1650-1662 (2008)]). Natomiast mikrokapsuły z gazowym jądrem stosowane są w technice ultrasonograficznego obrazowania medycznego, jako kontrast [Sirsi, S. R., Borden, M. A. Bubble Science, Engineering & Technology 1, 3-17 (2009)].

W większości gałęzi przemysłu kontrola wielkości produkowanych i stosowanych mikrokapsuł nie jest sprawą kluczową. Jednak w przypadku medycyny i farmacji jest to czynnik newralgiczny wielkość mikrokapsułek determinuje ich ładowność oraz czas uwalniania leku [Xu, Q., Hahsimoto, M., Dang, T. T., Hoare, T., Kohane, D. S., Whitesides, G. M., Langer, R., Anderson, D. G. Smali 5, 1575-1581 (2009)].

Mikrokapsuły z ładunkiem leku najczęściej są elementami systemów ich kontrolowanego uwalniania. Umożliwiają uwolnienie farmaceutyku w wybranym punkcie, np. przewodu pokarmowego, oraz kontrolę nad czasem jego uwalniania. Jednocześnie zmniejszają ogólnoustrojową toksyczność leku, pozwalając zminimalizować skuteczną dawkę i zastosować ją w odpowiednim miejscu. Przykładem jest popularny lek - aspiryna. Kapsułkuje się ją aby przedłużyć czas uwalniania w przewodzie pokarmowym (do całej nocy), a także aby chronić ścianki żołądka przed podrażnieniami. Również preparaty chlorku potasu (KCI) są kapsułkowane, aby uniknąć zbyt wysokiego lokalnego stężenia, co mogłoby podrażnić śluzówkę żołądka i wywołać krwawienie.

PL 215 011 B1

Biopolimery, jakimi są hydrokoloidy, ze względu na wyjątkowe właściwości (m.in. zagęszczające, stabilizujące czy żelujące) znalazły szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach przemysłu (np. spożywczym czy kosmetycznym) oraz w medycynie. Na szczególną uwagę zasługują żele kwasów uronowych (m.in. alginianowe i pektynowe), których bardzo łagodny sposób żelowania (oddziaływania jonowe) umożliwia łatwe otrzymanie układów do pułapkowania „wrażliwych indywiduów chemicznych czy żywych organizmów (mikrokapsułkowanie). Jednym z najczęściej wykorzystywanych do tworzenia mikrokapsuł biopolimerów z grupy kwasów uronowych są alginiany. Literatura opisuje wiele różnych metod tworzenia mikrożeli alginianowych z użyciem układów mikroprzepływowych o różnej geometrii, zarówno w przepływach Iaminarnych jak i wielofazowych. Ogólnie proces formowania mikrożeli jest zawsze dwuetapowy. Pierwszym krokiem jest nadanie pożądanego kształtu (wytworzenie emulsji lub włókien) roztworowi polimeru. Następnie zachodzi żelowanie, czy to na drodze chemicznej czy fizycznej, w lub poza układem użytym do formowania polimeru. „Standardowe, kuliste żelki alginianowe otrzymuje się rozpraszając wodny roztwór alginianu sodu w fazie ciągłej, a następnie inicjując proces żelowania. Fazą ciągłą jest najczęściej olej spożywczy [Tan, W.-H. & Takeuchi, S. Advanced Materials 19, 2696-2701 (2007); Workman, V. L., Dunnett, S. B., Kille, P. & Palmer, D. D. Biomicrofluidics 1, 014105-014109 (2007); Liu, K., Ding, H.-J., Liu, J., Chen, Y. & Zhao, Χ.-Ζ. Langmuir 22, 9453-9457 (2006)] (ze względu na nietoksyczność), heksadekan [Choi, C.-H., Jung, J.-H., Rhee, Y. W., Kim, D.-P., Shim, S.-E. and Lee, C.-S. Biomedical Microdevices 9, 855-862 (2007)] (łatwo dostępny alkan, który ma właściwości stabilizujące emulsje [Blythe, P. J., Morrison, B. R., Mathauer, K. A., Sudol, E. D. & El-Aasser, M. S. Langmuir 16, 898-904 (1999)]) lub undekanol [Zhang, H., Tumarkin, E., Peerani, R., Nie, Z.H., Sullan, R.M.A., Walker, G.C., Kumacheva, E., Journal of the American Chemical Society 128, 12205-12210 (2006)] (ponieważ lepiej niż inne oleje rozpuszcza sole metali). W celu uniknięcia koalescencji, często do fazy ciągłej dodaje się surfaktantu (np. półtorastearynian poliglicerolu [Lin, Y.-H., Chen, C.- T., Huang, L. & Lee, G.-B. Biomedical Microdevices 9, 833-843 (2007)], Span85 [Chuah, A. M., Kuroiwa, T., Kobayashi, I., Zhang, X. & Nakajima, M. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 351, 9-17 (2009)], Span80 [Um, E., Lee, D.-S., Pyo, H.-B. & Park, J.-K. Microfluidics and Nanofluidics 5, 541-549 (2008)], lecytyna [Tan, W.-H. & Takeuchi, S. Advanced Materials 19, 2696-2701 (2007)]). Również formy inne niż kuliste [Liu, K., Ding, H.-J., Liu, J., Chen, Y. & Zhao, X.-Z. Langmuir 22, 9453-9457 (2006)], np. dyski, pałeczki czy włókna, są możliwe do uzyskania w układach mikroprzepływowych.

Metody tworzenia żeli z zastosowaniem układów mikroprzepływowych można podzielić ze względu na miejsce żelowania, a także na sposób dostarczania czynnika sieciującego. Wyróżniamy:

i) żelowanie poza mikroukładem, ii) żelowanie wewnątrz mikroukładu, które dodatkowo można podzielić na:

- zewnętrzne - gdy czynnik sieciujący obecny jest w fazie ciągłej,

- wewnętrzne - gdy nieaktywny czynnik sieciujący obecny jest w fazie rozpraszanej,

- metody z równoległym doprowadzeniem czynnika sieciującego, tzn. takie, gdzie czynnik sieciujący doprowadzany jest dodatkowym strumieniem lub kroplą do fazy rozpraszanej, iii) systemy kombinowane, czyli takie, w których wykorzystuje się zarówno żelowanie w mikroukładzie jak i poza nim.

Wszystkie te metody zostały pokrótce scharakteryzowane poniżej.

Najprostszym sposobem formulacji mikrożeli jest sieciowanie w kąpieli żelującej poza mikroukładem (Tabela 1). W ten sposób unika się zapchania kanałów szybkożelującymi substancjami, jednak wadą takiego rozwiązania są częste deformacje uzyskiwanych cząstek. Alternatywą może być żelowanie wewnątrz mikroukładów. O żelowaniu zewnętrznym wewnątrz mikroukładów mówimy, gdy czynnik sieciujący w formie aktywnej zawarty jest w fazie ciągłej i dociera do kropli sieciowanego polimeru na drodze dyfuzji (Tabela 2). Zaletą tej metody jest eliminacja problemu zatykania się kanałów. Ponadto, sterując czasem żelowania, można łatwo uzyskać kapsuły z ciekłym jądrem czy lite żele. Częstą wadą jest niejednorodność uzyskiwanych struktur żelu, spowodowana tym, że proces żelowania uzależniony jest od dyfuzji czynnika sieciującego przez już utworzoną sieć żelu. Żele o znacznie bardziej jednorodnej strukturze uzyskuje się stosując sieciowanie wewnętrzne w mikroukładzie (Tabela 2). W tej metodzie czynnik sieciujący w formie nieaktywnej zawarty jest w fazie rozpraszanej. Jego aktywacja następuje pod wpływem zmian środowiska, np. zmiany pH. Dużą wadą tego rozwiązania jest bardzo częste zatykanie się dyszy tworzącej krople w wyniku szybkiego sieciowania polisacharydu. Podobne problemy występują w przypadku, gdy wprowadzamy czynnik sieciujący dodatkowym strumieniem. Natomiast gdy stosuje się żelowanie indukowane koalescencją, trudności może sprawiać

PL 215 011 B1 zaprojektowanie odpowiedniej geometrii mikroukładu (Tabela 2). W zależności od potrzeb można również wykorzystać kombinacje w/w metod (metody kombinowane; Tabela 3). Najczęściej łączy się żelowanie w mikroukładzie z żelowaniem poza mikroukładem.

T a b e l a 1. Zestawienie literaturowe dotyczące produkcji mikrożeli alginianowych w układach mikroprzepływowych z zastosowaniem żelowania poza mikroukładem. (1 - Capretto, L., Mazzitelli, S., Luca, G. & Nastruzzi, C. Acta Biomaterialia 6, 429-435, (2010); 2 - Su, J., Zheng, Y., Wu, H. Lab on a chip 9, 996-1001, (2009); 3 - Chuah, A. M., Kuroiwa, T., Kobayashi, I., Zhang, X. & Nakajima, M. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 351, 9-17, (2009); 4 - Huang, K.- S., Liu, Μ. -Κ., Wu, C.-H., Yen, Y.-T. and Lin, Y.-C. Journal of Micromechanics and Microengineering 17,1428 (2007); 5 - Huang, Κ.-S., Lai, T-H., Lin, Y-C. Lab on a chip 6, 954-957, (2006); 6 - Capretto, L., Mazzitelli, S., Balestra, C., Tosi, A., Nastruzzi, C. Lab on a chip 8, 617-621, (2008). 7 - Sugiura, S., Oda, T., Aoyagi, Y., Satake, M., Ohkohchi, N., Nakajima, M. Lab on a chip 8, 1255-1257, (2008); 8 - Dohnal, J. & Stepanek, F. Powder Technology 200, 254-259, (2010); 9 - Rondeau, E. & CooperWhite, J. J. Langmuir 24, 6937-6945, (2008).)

Faza ciągła	Faza rozpraszana	Kąpiel sieciująca	Literatura
olej słonecznikowy	alginian sodu + agaroza	BaCI2	1
alginian sodu	brak	CaCI2	2
izooctan + Span85	alginian sodu	CaCI2	3
olej słonecznikowy	alginian sodu	CaCI2	4
olej	alginian sodu	CaCI2	5
olej słonecznikowy	alginian sodu	BaCI2	6
alginian sodu	brak	CaCI2	7
powietrze (metoda piezoelektryczna)	alginian sodu	CaCI2 (z modyfikacjami lepkości)	8
dimetylowęglan	alginian sodu	CaCI2	9

T a b e l a 2. Zestawienie literaturowe dotyczące produkcji mikrożeli alginianowych w układach mikroprzepływowych z zastosowaniem żelowania wewnątrz mikroukładu (1 - Zhang, H., Tumarkin,

E. , Sullan, R. M. A., Walker, G. C. & Kumacheva, E. Macromolecular Rapid Communications 28, 527-538 (2007); 2 - Zhang, H., Tumarkin, E., Peerani, R., Nie, Z.H., Sullan, R.M.A., Walker, G.C., Kumacheva, E., Journal of the American Chemical Society 128, 12205-12210 (2006); 3 - Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L. & Renaud, P. Lab on a chip 5, 553-559 (2005); 4 - Johann, R. M. & Renaud, P. Biointerphases 2, 73-79 (2007); 5 - Kim, C., Lee, K. S., Kim, Y. E., Lee, K.-J., Lee, S. H., Kim, T. S. and Kang, J. Y. Lab on a chip 9, 1294-1297, (2009); 6 - Ren, P.-W., Ju, X.-J., Xie, R. & Chu, L.-Y. Journal of Colloid and Interface Science 343, 392-395 (2010); 7 - Tan, W.-H. & Takeuchi, S. Advanced Materials 19, 2696-2701 (2007); 8 - Yuya, M., Wei-heong, T., Yukiko, T. & Shoji, T. Lab on a chip 9, 2217-2223 (2009); 9 - Workman, V. L., Dunnett, S. B., Kille, P. & Palmer, D. D. Biomicrofluidics 1, 014105-014109 (2007); 10 - Capretto, L., Mazzitelli, S., Balestra, C., Tosi, A., Nastruzzi, C. Lab on a chip 8, 617-621 (2008); 11 - Amici, E., Tetradis-Meris, G., de Torres, C. P. & Jousse,

F. Food Hydrocolloids 22, 97-104 (2008); 12 - Um, E., Lee, D.-S., Pyo, H.-B. & Park, J.-K. Microfluidics and Nanofluidics 5, 541-549 (2008); 13 - Liu, K., Ding, H.-J., Liu, J., Chen, Y. & Zhao, X.- Z. Langmuir 22, 9453-9457 (2006); 14 - Choi, C.-H., Jung, J.-H., Rhee, Y. W., Kim, D.-P., Shim, S.-E. and Lee, C.-S. Biomedical Microdevices 9, 855-862 (2007); 15 - Zhao, L. B., Pan, L., Zhang, K., Guo, S. S., Liu, W., Wang, Y., Chen, Y., Zhao, X. Z., Chan, H. L. W. Lab on a chip 9, 2981-2986 (2009).)

PL 215 011 B1

Metoda żelowania	Faza ciągła	Faza rozpraszana	Dodatkowy kanał	Literatura
zewnętrzne	undekanol+ (CH3COO)2Ca	alginian sodu		1
undekanol + Cal2	alginian sodu		2
CaCl2 (przepływ laminarny)	alginian sodu	EDTA - aby zatrzymać proces żelowania	3,4
kwas oleinowy + CaCl2	alginian sodu		5
dwie: CaCl2, olej (emulsja wielokrotna)	dwie: alginian sodu, olej		6
wewnętrzne	olej + CH3COOH	alginian sodu + CaCO3		1,7
olej kukurydziany + lecytyna	alginian sodu + CaCO3	GDL	8
olej kukurydziany + lecytyna + CH3COOH	alginian sodu + CaCO3	olej kukurydziany + CH3COOH	7
olej słonecznikowy	alginian sodu + CaCO3	olej słonecznikowy + CH3COOH	9
olej słonecznikowy + CH3COOH	alginian sodu + BaCO3		10
olej	alginian sodu + CaCO3	GDL	11
Φ c c	olej mineralny + Span80	alginian sodu	strumień CaCI2	12
olej sojowy	alginian sodu	krople CaCI2 (koalescencja)	13
heksadekan + Span80	alginian sodu	strumień CaCI2	14
olej	alginian sodu + cząstki magnetyczne	krople CaCI2 (koalescencja)	15

T a b e l a 3. Zestawienie literaturowe dotyczące produkcji mikrożeli alginianowych w układach mikroprzepływowych z zastosowaniem łączonych metod żelowania (1 - Capretto, L., Mazzitelli, S., Balestra, C., Tosi, A., Nastruzzi, C. Lab on a chip 8, 617-621 (2008); 2 -Rondeau, E. & Cooper-White, J. J. Langmuir 24, 6937-6945 (2008); 3 - Shin, S.-J., Park, J.-Y., Lee, J.-Y., Park, H., Park, Y.-D., Lee, K.- B., Whang, C.-M. and Lee, S.-H. Langmuir 23, 9104-9108 (2007).)

Faza ciągła	Faza rozpraszana	Kąpiel sieciująca	Literatura
olej słonecznikowy	alginian sodu + BaCI2	BaCI2	1
DMC	łączenie 2 strumieni: roztwór alginianu sodu i roztwór CaCI2	CaCI2	2
roztwór alginianu sodu otoczony koncentrycznie roztworem CaCI2	brak	CaCI2	3

Związki pektynowe, podobnie jak alginiany, należą do grupy hydrożeli poliuronianowych i są głównym składnikiem budulcowym ścian komórkowych roślin wysokich. Związki pektynowe są nietoksyczne i w pełni biodegradowalne, dlatego w diecie człowieka są obecne od zawsze. Wykazują szerokie spektrum aktywności fizjologicznej: obniżają poziom cholesterolu [Sriamornsak, P. Journal of Silpakorn University 21-22, 206-228 (2001)], spowalniają wchłanianie glukozy [Voragen, A., Coenen,

G.-J., Verhoef, R. & Schols, H. Structural Chemistry 20, 263-275 (2009)], pełnią funkcje regulacyjne

PL 215 011 B1 w jelicie cienkim (zmiana aktywności mikrobiotycznej i enzymatycznej, a także miejscowe zmiany morfologii ściany jelita, dzięki czemu poprawione jest wchłanianie substancji odżywczych) [Sriamornsak, P. Journal of Silpakorn University 21-22, 206-228 (2001)], ułatwiają wydalenie składników toksycznych wraz z moczem (np. dwuwartościowe metale ciężkie [Kohn, R. Carbohydrate Polymers 2, 273-275 (1982)]), działają antykancerogennie [Nangia-Makker, P., Hogan, V., Honjo, Y., Baccarini, S., Tait, L., Bresalier, R. and Raz, A. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1854-1862 (2002); Ovodov, Y. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 35, 269-284 (2009)]. Należy podkreślić, że normy światowe FAO/WHO nie nakładają ograniczeń na maksymalną dzienną dawkę spożycia pektyn. Pektyny wykazują wyjątkową trwałość w ludzkim układzie pokarmowym - są odporne na działanie proteaz i amylaz. Wspomniane enzymy są aktywne w górnych odcinkach przewodu pokarmowego [Yu, C.-Y., Cao, H., Zhang, X.-C., Zhou, F.-Z., Cheng, S.-X., Zhang, X.-Z., and Zhuo, R.-X. Langmuir 25, 11720-11726 (2009)]. Dopiero w jelicie grubym obecne są pektynazy, które rozkładają związki pektynowe. Z tego powodu pektyny są doskonałym nośnikiem leków dojelitowych (np. do leczenia raka okrężnicy [Liu, L., Fishman, M. L., Kost, J. & Hicks, K. B. Biomaterials 24, 3333-3343 (2003)]). Ponadto omawiane związki mają wiele zastosowań w przemyśle spożywczym (zagęszczacz zastępujący żelatynę w galaretkach dla wegan), kosmetycznym (zagęszczacz) oraz w rolnictwie (np. składnik pasz). Substancje pektynowe znajdują coraz to nowe zastosowania. Publikacja przeglądowa z roku 2006 [Liu, L., Fishman, M. & Hicks, K. Cellulose 14, 15-24 (2007)] opisuje szerokie zastosowanie pektyn i ich pochodnych do systemów kontrolowanego podawania leków (dookrężniczo, przez śluzówkę nosa, przez skórę). Z kolei modyfikowane pektyny testowane są jako materiał nośnikowy dla DNA w terapiach genowych [Katav, T., Liu, L. S., Traitel, T., Goldbart, R., Wolfson, M., Kost, J. Journal of Controlled Release 130, 183-191 (2008)]. Tworzone są również nowe systemy jonowo-przewodzące SPE (z ang. solid polymer electrolyte) [Andrade, J. R., Raphael, E. & Pawlicka, A. Electrochimica Acta 54, 6479-6483 (2009)] bazujące na pektynach. Z kolei pektyny sieciowane diwinylosulfonianem mają szansę stać się syntetycznymi kośćmi o lepszych właściwościach mechanicznych niż naturalne [Ichibouji, T., Miyazaki, T., Ishida, E., Sugino, A. & Ohtsuki, C. Materials Science and Engineering: C 29, 1765-1769 (2009)].

Budowa związków pektynowych oraz struktura ich żeli jest dobrze poznana i szeroko opisywana w literaturze. W zależności od gatunku rośliny, etapu jej wzrostu, a także wykorzystywanej tkanki oraz metody izolacji otrzymuje się związki pektynowe o różnej budowie. W przybliżeniu cząsteczka pektyny składa się z regionów gładkich i rozgałęzionych, a ich rozmieszczenie w cząsteczce jest losowe (a nie blokowe tak jak w przypadku alginianów). Regiony gładkie zbudowane są przede wszystkim z 1,4-połączonych reszt kwasu α-D-galakturonowego (Gal). Regiony rozgałęzione zazwyczaj zawierają wiele różnych cukrów, np. ramnozę, ksylozę, glukozę, arabinozę czy galaktozę. Właściwości żelu, który zostanie utworzony z konkretnego rodzaju pektyny, zależą od długości i rozmieszczenia regionów gładkich i rozgałęzionych, a także od długości całego pojedynczego łańcucha. Równie istotnym czynnikiem jest stopień estryfikacji (zmetylowania). Stopień zmetylowania (DM, ang. degree of methoxylation) jest określany jako ilość moli metanolu obecnego w 100 molach kwasu galakturonowego i wyrażany w procentach [Ovodov, Y. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 35, 269-284 (2009)]. Na podstawie tej liczby wprowadzono podział związków pektynowych na pektyny: i) wysokometylowane (ang. high-methoxylated pectins, HMP), w których więcej niż 50% monomerów ma zmetylowaną grupę karboksylową; ii) niskometylowane (ang. low-methoxylated pectins, LMP), w których zmetylowanych jest mniej niż 50% monomerów.

Wyróżnić można również pektyny niskometylowane amidowane (ang. low-methoxylated amidated pectins, LMA), które powstają podczas chemicznego przeprowadzania HMP w LMP w środowisku alkalicznym, w reakcji z amoniakiem. Wymienione rodzaje pektyn różnią się między sobą nie tylko budową, ale również sposobem żelowania (odmienne warunki niezbędne do powstania żelu). Warto nadmienić, że do żelowania pektyn wymagane jest kwaśne środowisko pH, w przeciwieństwie do związków alginianowych, które w tych warunkach są niestabilne. Żele z HMP powstają przy pH bliskim 3,0, w obecności ok. 65% cukru (najczęściej sacharozy). Wymagane stężenie pektyny to 0,3 - 2%. Siatka żelu powstaje w wyniku tworzenia się wiązań wodorowych pomiędzy grupami karboksylowymi jednego łańcucha pektynowego a grupami hydroksylowymi łańcucha sąsiedniego. Dodatek cukru dodatkowo stabilizuje strukturę żelu, biorąc udział w tworzeniu wiązań wodorowych. Z kolei wysokie stężenie jonów wodorowych zapobiega dysocjacji grup karboksylowych. Natomiast struktury żeli LMP i LMA budowane są w obecności dwuwartościowych jonów metali, najczęściej Ca²⁺, o stężeniu 0,01 - 0,1%. Proces nie wymaga obecności innych cukrów i zachodzi w zakresie pH od 2,0 do 6,0. Opisywany jest głównie przez model „egg-box [Voragen, A., Coenen, G.-J., Verhoef, R. & Schols,

PL 215 011 B1

H. Structural Chemistry 20, 263-275 (2009); Sriamornsak, P. Silpakorn University International Journal 3,

206-228 (2003)], aczkolwiek dla pektyn amidowanych należy wziąć również pod uwagę wkład oddziaływań między grupami -NH2, które znacząco zmieniają one właściwości otrzymanego żelu (np. ilość jonów potrzebnych do stworzenia siatki żelu z roztworu pektyn amidowanych jest mniejsza niż w przypadku pektyn niskometylowanych nieamidowanych [Tho, I., Sande, S. A. & Kleinebudde, P. Chem. Eng. Sci. 60, 3899-3907 (2005)]).

Pomimo wielu zastosowań związków pektynowych (vide supra), w literaturze nie ma wielu doniesień o preparowaniu pektynowych mikrocząstek. Jednym z nielicznych artykułów na temat otrzymywania mikrosfer czy mikrocząstek pektynowych jest praca Reisa et al. [Reis, A. V., Guilherme, M. R., Paulino, A. T., Muniz, E. C., Mattoso, L. H. C. and Tambourgi, E. B. Langmuir 25, 2473-2478 (2009)]. Autorzy otrzymywali puste w środku mikro- i nanokapsułki dzięki zastosowaniu dwustopniowej reakcji. Pierwszym etapem była modyfikacja pektyny metakrylanem glicylu (GMA). Modyfikacja ta miała na celu wprowadzenie do łańcucha pektyn dodatkowych grup, które mogłyby brać udział w tworzeniu dodatkowych wiązań międzycząsteczkowych. W rezultacie utworzono bardziej stabilną strukturę, bez istotnych zmian właściwości żelu. W drugim etapie uzyskany roztwór mechanicznie emulsyfikowano (6000-12000 obrotów na minutę) w systemie woda / alkohol benzylowy w obecności gazowego azotu (zapewniał powstanie kapsuł z gazowym jądrem) oraz katalizatora, którym był TEMED (Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametyloetylodiamina). Po suszeniu natryskowym otrzymywano gotowy produkt. Wyprodukowane kapsułki miały średnice w zakresie od 0,16 do 24 μm i charakteryzowały się polidyspersyjnością. Należy podkreślić, że w sposób niekontrolowany powstawały również emulsje wielokrotne.

Z kolei „klasyczne żelowanie (sieciowanie z udziałem kationów dwuwartościowych) mikrocząstek pektynowych zostało opisane w pracy Opanasopit et al. [Opanasopit, P., Apirakaramwong, A., Ngawhirunpat, T., Rojanarata, T. & Ruktanonchai, U. AAPS PharmSciTech 9, 67-74 (2008)], gdzie pektynowe mikro- i nanoziarna zostały wykorzystane jako nośnik DNA (potencjalne zastosowanie do terapii genowych). Zbadano wpływ kilku czynników na tworzenie się mikrocząstek: rodzaj kationu sieciującego, jego stężenie, stosunek wagowy (w stosunku do użytej pektyny), a także stężenie i pH roztworu pektyny. Oceniano również m.in. rozmiar i kształt utworzonych mikrocząstek oraz ich ładowność kwasem deoksyrybonukleinowym. W celu otrzymania mikroziaren roztwór pektyny LMA był nakraplany do roztworu jonów: Ca²⁺, Mg²⁺ lub Mn²⁺. Badanie ładowności dowiodło, że w cząstkach sieciowanych jonami wapnia można zamknąć największą ilość DNA. Ponadto na podstawie obserwacji przeżywalności komórek ludzkich (Huh7, ludzkie komórki nowotworowe raka wątroby) nie stwierdzono znaczącej cytotoksyczności otrzymanych mikrocząstek pektynowych. Przeprowadzone eksperymenty potwierdzają, że mikroziarna pektynowe mogą być z powodzeniem stosowane jako nośnik w terapiach genowych.

Z kolei Yu et al. [Yu, C.-Y., Cao, H., Zhang, X.-C., Zhou, F.-Z., Cheng, S.-X., Zhang, X.-Z., i Zhuo, R.-X. Langmuir 25, 11720-11726 (2009)] tworzyli nanokapsuły pektynowe z jądrem wypełnionym farmaceutykiem, 5-fluorouracylem. Zaproponowana procedura pozwalała na wyprodukowanie ziaren i kapsuł w rozmiarach z przedziału od 400 do 2600 nm. Ładowność 5-fluorouracylem dla wszystkich badanych próbek była wyższa niż 12% (nawet do 18% masy mikrocząstki). Metoda ta ma pewne wady: przygotowanie próbek trwa ponad 50 h i wymaga ciągłego mieszania oraz ścisłej kontroli temperatury czy lepkości stosowanych roztworów. Wyeliminowanie wspomnianego problemu kontroli dyspersji (wymóg monodyspersyjności cząstek), jak również zapewnienie precyzyjnej kontroli warunków reakcji może zostać osiągnięte poprzez zastosowanie technik mikroprzepływowych. Jednakże w literaturze jest niewiele doniesień nt. tworzenia emulsji czy mikrocząstek pektynowych, w przeciwieństwie do mikrocząstek alginianowych, w mikrokanałach. Kawakatsu et al. w swoich pracach [Kawakatsu, T., Tragardh, G. & Tragardh, C. Journal of Food Engineering 50, 247-254 (2001); Kawakatsu, T., Tragardh, G. & Tragardh, C. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 189, 257-264 (2001)] opisali tworzenie prostych emulsji olej-w-pektynie oraz emulsji wielokrotnych typu W/O/W oraz S/O/W (żel pektynowy-w-oleju-w-wodzie). Do tego celu wykorzystano układ o geometrii mikrotarasowej (MT). Zaproponowana technika mikrotarasowa umożliwa formułowanie monodyspersyjnych cząstek, jednak nie daje pełnej kontroli nad prowadzonym procesem emulsyfikacji (trudno sterować rozmiarami czy morfologią uzyskiwanych mikrożeli).

Wynalazek dotyczy metody formulacji monodyspersyjnych mikrocząstek pektynowych, do potencjalnych zastosowań w przemyśle: spożywczym i farmaceutycznym, przy użyciu układów mikroprzepływowych.

PL 215 011 B1

Zgodnie z wynalazkiem, sposób otrzymywania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych z wykorzystaniem układu mikroprzepływowego, obejmujący etapy: i) wytworzenia emulsji oraz ii) żelowania w wyniku dyfuzji do fazy rozpraszanej jonów sieciujących zawartych w fazie ciągłej, charakteryzuje się tym, że faza ciągła zawiera olej jadalny, zwłaszcza olej rzepakowy, sól wapnia oraz nietoksyczny, mieszalny z rozpuszczalnikami polarnymi i niepolarnymi kwas octowy, a fazę rozpraszaną stanowi wodny roztwór pektyny opcjonalnie zawierający nanocząstki.

Korzystnie, jako olej rzepakowy, stosuje się olej rzepakowy z pierwszego tłoczenia.

Korzystnie, solą wapnia jest chlorek wapnia lub węglan wapnia.

Najkorzystniej solą wapnia jest węglan wapnia.

Korzystnie, kwasem octowym jest kwas octowy lodowaty.

Korzystnie, stężenie kwasu w fazie ciągłej wynosi co najmniej 1,0% wagowych, korzystniej 10,0% wagowych.

Korzystnie, stężenie soli w fazie ciągłej wynosi od 0,05% wagowych do 2,0% wagowych, korzystniej 0,4% wagowych.

Korzystnie, pektynami są niskoestryfikowane amidowane pektyny.

Korzystnie, pektyna ma małą, średnią lub dużą wrażliwość na jony wapnia, korzystniej średnią wrażliwość na jony wapnia.

Korzystnie, stężenie roztworu pektyny wynosi od 0,25% wagowych do 1,0% wagowych, najkorzystniej 0,5% wagowych.

Korzystnie, sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etap wymiany fazy ciągłej zawierającej olej.

Korzystnie, do fazy rozpraszanej enkapsuluje się nanocząstki o różnej chemii powierzchni, korzystnie o ujemnie naładowanej powierzchni, korzystniej pokryte SHC10H20COO^-.

Korzystnie, w etapie wytworzenia emulsji zachodzi przepływ fazy ciągłej i fazy rozpraszanej.

Zgodnie z wynalazkiem, korzystnie do formulacji mikrocząstek wykorzystuje się niskoestryfikowane amidowane pektyny, naturalne polisacharydy, które w obecności kationów metali tworzą sztywne żele. Szybkość żelowania, struktura oraz właściwości żeli uwarunkowane są rodzajem czy stężeniem: pektyny czy soli metalu wielowartościowego.

Sposób według wynalazku, w jednym z preferowanych przykładów realizacji, dodatkowo obejmuje etap wymiany wspomnianej fazy ciągłej zawierającej olej, to jest wymianę oleju zawierającego kwas oraz sól metalu na olej czysty. Wymiana oleju pozwala na precyzyjną kontrolę czasu dyfuzji czynników sieciujących z fazy organicznej do kropli zawierających roztwór polisacharydu. Dzięki temu uzyskuje się lepszą kontrolę rozmiarów otrzymywanych kropli, wysoką jednorodność i powtarzalność stopnia usieciowania żelków.

Korzystnie, we wspomnianym etapie wytworzenia emulsji zachodzi przepływ fazy ciągłej (olej z czynnikami sieciującymi) i fazy rozpraszanej (roztwór pektyny), które w jednym z przykładów realizacji wynalazku wynoszą od 3 mL/h do 50 mL/h dla fazy ciągłej, korzystniej 6 mL/h i od 1 mL/h do 5 mL/h dla fazy rozpraszanej, korzystniej 1 mL/h.

Sposób według wynalazku charakteryzuje się prostotą, dużą powtarzalnością oraz możliwością wytwarzania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych o zadanym rozmiarze czy morfologii. Konstrukcja opracowanego systemu formulacji jest prosta, bazuje na taniej aparaturze czy materiałach oraz łatwo dostępnych i nietoksycznych substratach. System ten umożliwia pełną kontrolę nad rozmiarami uzyskiwanych mikrocząstek pektynowych i może być wygodnym narzędziem do ich produkcji w przemyśle (w szczególności, przemysł farmaceutyczny - systemy kontrolowanego uwalniania leków). Obecny stan techniki pozwala na otrzymywanie mikrożeli pektynowych. Jednakże znane sposoby formulacji nie gwarantują monodyspersji otrzymywanych cząstek bądź nie dają pełnej kontroli nad prowadzonym procesem emulsyfikacji (trudno sterować rozmiarami czy morfologią uzyskiwanych mikrożeli).

Korzystne przykłady wykonania wynalazku.

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków oraz tabel, na których:

fig. 1 prezentuje mikrofotografię przedstawiającą wytwarzanie kropel wodnego roztworu pektyny o stężeniu 0,5% w/w w oleju rzepakowym w układzie mikroprzepływowym typu flow-focusing.

PL 215 011 B1

Objętościowe prędkości przepływów wyrażone w mL/h (Qc dla fazy ciągłej, Qd dla fazy rozpraszanej) podano na rysunku. Wszystkie kanały w układzie miały jednakowy przekrój poprzeczny o wymiarach 400 x 400 μm. Na wykresie pokazano zależność wielkości kropel (długość, L, znormalizowano względem szerokości kanału, W) w funkcji stosunku Qc/Qd;

fig. 2 przedstawia schemat systemu do otrzymywania monodyspersyjnych żelowych mikrocząstek pektynowych. Działanie systemu opierało się na: i) formułowaniu monodyspersyjnych kropel z roztworu pektyny, ii) dyfuzji czynników sieciujących z fazy ciągłej do rozpraszanej, iii) odbieraniu uformowanych mikrocząstek i wtórnej żelifikacji;

fig. 3 a-c - przedstawia mikrofotografie ilustrujące przechodzenie pektynowych mikrocząstek z fazy ciągłej do gliceryny. Okręgi o wyraźnie zaznaczonych krawędziach odpowiadają mikrocząstkom w fazie ciągłej, natomiast słabo zarysowane kształty odpowiadają cząstkom, które przeszły do gliceryny, d - pokazuje mikrofotografię sieci żelu pektynowego wykonana z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego. Eksperymenty przeprowadzono wykorzystując system mikroprzepływowy przedstawiony na Fig. 2 z użyciem 0,5% (w/w) roztworu pektyny (Qd = 1 mL/h) oraz oleju rzepakowego z dodatkiem 0,4% CaCO3 i 4% CH3COOH (w/w) (Qc = 6 mL/h);

fig. 4 schematycznie ilustruje zmodyfikowany system (dodatkowy moduł) do badania wpływu poszczególnych składników mieszaniny reakcyjnej na struktury otrzymywanych mikrożeli pektynowych. Działanie systemu opierało się na: i) formułowaniu monodyspersyjnych kropli z roztworu pektyny, ii) dyfuzji czynników sieciujących z fazy ciągłej do rozpraszanej, iii) ekstrakcji in situ do fazy ciągłej niezawierającej czynników sieciujących oraz iv) odbieraniu uformowanych mikrocząstek i wtórnej żelifikacji;

fig. 5 prezentuje fotografie (a) żelu pektynowego oraz (b-d) żeli z enkapsulowanymi nanocząstkami: (b) Ag/SHC11H22N⁺(CH3)3, (c) Au/SHC11H22SO3^-, (d) Au/SHC10H20COO^-. Rezultat badań jakościowych;

fig. 6 ilustruje efekt czasu sieciowania. Wykres przedstawia czasowe profile rozpadu mikrożeli pektynowych sieciowanych w różnym czasie (1/2, 1, 3, 15, 24 h) i uwalniania z nich nanocząstek złota w roztworze EDTA pC 3. Mikrocząstki żelowe produkowane były z użyciem roztworu pektyny o stężeniu 0,5% i oleju rzepakowego z dodatkiem węglanu wapnia (0,4%) oraz kwasu octowego (4%). Szczegółowy opis eksperymentu podano w tekście;

fig. 7 przedstawia wartości absorbancji w funkcji czasu mierzone w zawiesinie mikrożeli pektynowych w pięciu różnych stężeniach EDTA (pC 5; 4; 3,3; 3 i 2) oraz w wodzie (ślepa próba). Mikrożele otrzymano z użyciem 0,5% roztworu pektyny i oleju rzepakowego z dodatkiem węglanu wapnia (0,4%) oraz kwasu octowego (4%). Szczegółowy opis eksperymentu podano w tekście;

fig. 8 przedstawia przekształcone dane z Fig. 7. Wyniki znormalizowano względem wartości absorbancji (Amax) przy PCEDTA 2 dla t = 7 h;

fig. 9 ilustruje czasowe profile uwalniania AuNPs z mikrożeli. Fazę rozpraszaną stanowiła mieszanina 0,5% roztworu pektyny z roztworem AuNPs w stosunku objętościowym 2:1 (P). Fazę ciągłą stanowił olej rzepakowy z dodatkiem węglanu wapnia (Ca) i kwasu octowego (H). Ilości Ca i H podano w tabeli w procentach wagowych. Szczegółową procedurę eksperymentalną podano w tekście. Punkty na wykresach odzwierciedlają średnie wartości absorbancji obliczone dla dwóch pomiarów;

fig. 10 ilustruje czasowe profile uwalniania AuNPs z mikrożeli. Fazę rozpraszaną stanowiła mieszanina 1% roztworu pektyny z roztworem AuNPs w stosunku objętościowym 2:1 (P). Fazę ciągłą stanowił olej rzepakowy z dodatkiem węglanu wapnia (Ca) i kwasu octowego (H). Ilości Ca i H podano w tabeli w procentach wagowych. Szczegółową procedurę eksperymentalną podano w tekście. Punkty na wykresach odzwierciedlają średnie wartości absorbancji obliczone dla dwóch pomiarów;

tabela 4 prezentuje wyniki badań rozpuszczalności soli wapnia w lodowatym kwasie octowym oraz mieszalności otrzymanych roztworów (sól-kwas) z olejem rzepakowym. Wyjaśnienie symboli: (++) - dobra, (+) - słaba, (-) - nierozpuszczalny lub niemieszalny; tabela 5 przedstawia dobór rodzaju nanocząstek do enkapsulacji w żelach pektynowych. W eksperymencie wykorzystano roztwory nanocząstek o stężeniu 1,5 mg/mL, 0,5% wodny roztwór pektyny oraz 0,5% roztwór CaCI2. Fotografie otrzymanych żeli zaprezentowano na Fig. 5;

P r z y k ł a d 1

Do wytwarzania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych stosuje się prosty układ mikroprzepływowy typu flow-focusing o wymiarach mikrokanałów równych 400 x 400 gm wykonywany wg procedury opisanej w [Ogończyk, D., Węgrzyn, J., Jankowski, P., Dąbrowski, B. & Garstecki, P. Lab on

PL 215 011 B1 a chip 10, 1324-1327 (2010)] i modyfikowany wg procedury opisanej w [P. Jankowski, D. Ogończyk, A. Kosiński, W. Lisowski and P. Garstecki (submitted)]. Do produkcji stosuje się: 0,5% wodny roztwór pektyny (faza rozpraszana) oraz olej rzepakowy z dodatkiem węglanu wapnia i kwasu octowego w ilościach 0,4% oraz 4% wagowych w stosunku do oleju rzepakowego (faza ciągła). Fazę ciągłą przygotowuje się następująco: węglan wapnia rozpuszcza się w lodowatym kwasie octowym, następnie otrzymany roztwór miesza się z olejem rzepakowym i poddaje się sonifikacji przez 2 h. Ostatnim etapem przygotowania fazy ciągłej jest jej filtrowanie z wykorzystaniem prostego filtru strzykawkowego o średnicy porów 1,2 ąm. Przygotowane w/w sposobem roztwory umieszcza się w dwóch strzykawkach, które następnie łączy się z mikroukładem za pomocą węży polietylenowych. Strzykawki umieszcza się w pompach strzykawkowych. Mikroukład łączy się z odbieralnikiem za pomocą polietylenowego węża wyprowadzającego. Za pomocą pomp strzykawkowych wtłacza się obie fazy do mikroukładu z prędkościami: 1 mL/h i 6 mL/h, odpowiednio dla fazy rozpraszanej i ciągłej. Otrzymywane mikrożele odbiera się do odbieralnika zawierającego wodę.

P r z y k ł a d 2

Do wytwarzania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych stosuje się prosty układ mikroprzepływowy typu flow-focusing o wymiarach mikrokanałów równych 400 x 400 ąm wykonywany wg procedury opisanej w [Ogończyk, D., Węgrzyn, J., Jankowski, P., Dąbrowski, B. & Garstecki, P. Lab on a chip 10, 1324-1327 (2010)] i modyfikowany wg procedury opisanej w [P. Jankowski, D. Ogończyk, A. Kosiński, W. Lisowski and P. Garstecki (submitted)]. Do produkcji stosuje się: 0,5% wodny roztwór pektyny i 1,5 mg/mL wodny roztwór nanocząstek złota AU/SHC10H20COO^- w objętościowym stosunku 2:1 (faza rozpraszana) oraz olej rzepakowy z dodatkiem węglanu wapnia i kwasu octowego w ilościach 0,4% oraz 10% wagowych w stosunku do oleju rzepakowego (faza ciągła). Fazę ciągłą przygotowuje się następująco: węglan wapnia rozpuszcza się w lodowatym kwasie octowym, następnie otrzymany roztwór miesza się z olejem rzepakowym i poddaje się sonifikacji przez 2 h. Ostatnim etapem przygotowania fazy ciągłej jest jej filtrowanie z wykorzystaniem prostego filtru strzykawkowego o średnicy porów 1,2 μm. Przygotowane w/w sposobem roztwory umieszcza się w dwóch strzykawkach, które następnie łączy się z mikroukładem za pomocą węży polietylenowych. Strzykawki umieszcza się w pompach strzykawkowych. Mikroukład łączy się z odbieralnikiem za pomocą polietylenowego węża wyprowadzającego. Za pomocą pomp strzykawkowych wtłacza się obie fazy do mikroukładu z prędkościami: 1 mL/h i 9 mL/h, odpowiednio dla fazy rozpraszanej i ciągłej. Otrzymywane mikrożele odbiera się do odbieralnika zawierającego wodę.

Podsumowanie wyników otrzymanych w w/w przykładach realizacji

Sterowanie w układzie mikroprzepływowym wielkością monodyspersyjnych mikrocząstek pektynowych

Do wytwarzania kropel wodnego roztworu pektyny wykorzystano układ mikroprzepływowy typu flow-focusing o wymiarach mikrokanałów 400 x 400 μm (Fig. 1). Sterowanie objętościowymi prędkościami przepływów fazy ciągłej (olej rzepakowy) pozwala na uzyskanie monodyspersyjnych kropel wodnego roztworu pektyny o stężeniu 0,5% wagowych o długości w zakresie od połowy do czterech szerokości kanałów, czyli 200-1600 μm, co odpowiada objętościom z zakresu 15-150 pL. Jak zostało

-1/2 to pokazane na Fig. 1 wielkość otrzymywanych kropli skaluje się jak L/W ~ (Qd/Qc)^-1/2, co nie odpowiada skalowaniu dla płynów newtonowskich.

Optymalizacja składu faz: ciągłej i rozpraszanej w celu formulacji mikrożeli pektynowych

Celem wynalazku było opracowanie metody tworzenia biokompatybilnych mikrożeli pektynowych. W związku z tym jako bazę fazy ciągłej użyto jadalny olej, korzystniej rzepakowy. Składową fazy ciągłej były też niezbędne do żelowania pektyny czynniki sieciujące: jony wodorowe oraz kationy metali dwuwartościowych. Wybór kwasu octowego (E260) był podyktowany jego szerokimi zastosowaniami w przemyśle, jak również mieszalnością, zarówno z cieczami polarnymi jak i niepolarnymi, co umożliwia jego łatwą dyfuzję z fazy ciągłej do rozpraszanej. Wybór soli metalu był podyktowany niską toksycznością soli wapnia, a także ich bardzo dobrą rozpuszczalnością w kwasie octowym. Testowano sześć różnych soli wapnia (Tabela 4) pod kątem rozpuszczalności w kwasie octowym oraz mieszalności uzyskanego roztworu z olejem rzepakowym. Na podstawie otrzymanych wyników do otrzymywania mikrożeli pektynowych najkorzystniej jest stosować czynniki sieciujące: węglan wapnia rozpuszczony w lodowatym kwasie octowym.

PL 215 011 B1

Systemy do otrzymywania monodyspersyjnych mikrocząstek żelowych w układzie mikroprzepływowym

Do otrzymywania żelowych mikrocząstek pektynowych skonstruowano system mikroprzepływowy, którego schemat zaprezentowano na Fig. 2.

Idea prezentowanego systemu była następująca. W układzie mikroprzepływowym formułowano monodyspersyjne krople o żądanej wielkości (Fig. 1). Fazą rozpraszaną był roztwór pektyny o zadanym stężeniu, a fazę ciągłą stanowił olej rzepakowy z dodatkiem czynników sieciujących (sól wapnia i kwas octowy). Doświadczalnie sprawdzono, że dodatek tych czynników nie ma większego wpływu, w porównaniu z czystym olejem, na proces formowania kropel. Uformowane w mikroukładzie krople ulegały żelowaniu w wyniku kontaktu z fazą ciągłą; na skutek dyfuzji czynników sieciujących do fazy rozpraszanej. Omawiany proces żelowania ma charakter kinetyczny, co oznacza, że można go kontrolować czasem. Z kolei, czasem żelowania można sterować np. ustalając odpowiednią długość drogi żelowania czy zmieniając objętościowe prędkości przepływów. Eksperymentalnie dobrano długość drogi żelowania, która wynosiła 100 cm (odpływowy wąż polietylenowy o średnicy wewnętrznej 0,76 mm) przy zadanym przepływie całkowitym nie przekraczającym 10 mL/h. Uformowane mikrocząstki odbierano do rezerwuaru z wodą, gdzie następowało ich dalsze żelowanie. Proces ten następował na skutek: i) dyfuzji czynników sieciujących z fazy ciągłej do wody w odbieralniku, ii) wtórnej dyfuzji jonów zamkniętych już w mikrocząstce (żelowanie do wewnątrz uformowanej kapsuły). Należy zaznaczyć, że mikrocząstki gromadziły się na granicy faz olej-woda. W miarę postępu procesu, mikrożele przechodziły z fazy olejowej do wody i opadały grawitacyjnie na dno zbiornika. Wytworzone w systemie mikrożele oraz przykładową strukturę żelu otrzymanego w/w sposobem przedstawiono na Fig. 3.

W związku z tym, że dalsze eksperymenty polegały na badaniu wpływu poszczególnych składników mieszanin reakcyjnych na strukturę otrzymywanych mikrożeli, zaproponowany system (Fig. 2) zmodyfikowano. Wprowadzono dodatkowy moduł, który umożliwiał ekstrakcję in situ mikrocząstek pektynowych z fazy ciągłej, zawierającej czynniki sieciujące, do fazy ciągłej nie zawierającej żadnych dodatków (Fig. 4). Ta modyfikacja umożliwiła uzyskanie powtarzalności pomiarów oraz wyeliminowała wpływ dyfuzji czynników sieciujących z fazy ciągłej do wody w odbieralniku.

Enkapsulacja nanocząstek w mikrocząstkach żelu pektynowego

Potencjalnym zastosowaniem mikrożeli pektynowych są m.in. systemy kontrolowanego uwalniania cząstek substancji aktywnych. Jako modelowe substancje wykorzystano nanocząstki, które enkapsulowano w matrycy pektynowej. Jednocześnie, badanie procesów uwalniania nanocząstek z mikrożeli posłużyło do scharakteryzowania, otrzymywanych w różnych warunkach, mikrostruktur żelowych. Nanocząstki charakteryzują się bardzo małymi rozmiarami czy intensywnymi barwami, a procesy ich uwalniania mogą być monitorowane bez użycia skomplikowanej aparatury, np. wykorzystując techniki spektrofotometryczne.

Dobór odpowiedniego rodzaju nanocząstek do enkapsulacji

Kolejny etap badań polegał na enkapsulacji w matrycy pektynowej nanocząstek złota i srebra o różnej chemii powierzchni (Tabela 5).

Związki pektynowe są polianionami, dlatego rodzaj enkapsulowanych nanocząstek (ich chemia powierzchni) ma wpływ na sposób ich żelowania czy stabilność otrzymywanych struktur żelowych. Enkapsulacja NPs o ładunku dodatnim na powierzchni w matrycy pektynowej nie przyniosła spodziewanych rezultatów. Proces żelowania był wyjątkowo wolny, w wyniku czego otrzymywane żele „rozmywały się i ulegały niebywale dużym deformacjom (Fig. 5b). Prawdopodobnie dodatni ładunek zgromadzony na powierzchni NPs w dużym stopniu utrudniał (spowalniał) dyfuzję jonów i sieciowanie żelu (oddziaływania elektrostatyczne). Znacznie lepsze wyniki uzyskano stosując NPs z ujemnie naładowanymi powierzchniami. Jednakże rodzaj płaszcza okazał się być kluczowym elementem. W przypadku zastosowania nanocząstek złota pokrytych SHC11H22SO3^- otrzymano żele o nieco gorszej charakterystyce (Tabela 5). Proces żelowania był wydłużony, co powodowało, że otrzymywane żele były zniekształcone. Przypuszczalnie, szybkość żelowania jest determinowana reakcją uboczną - wychwytywaniem i przyłączaniem jonów wapnia przez płaszcz SHC11H22SO3^-. Sprawdzono, iż w wyniku reakcji SHC10H22SO3^- z jonami wapnia strąca się osad. Najlepsze rezultaty uzyskano dla NPs pokrytych SHC10H20COO^-, dlatego ten rodzaj nanocząstek stosowano do badania struktur żelowych otrzymywanych w różnych warunkach. Należy zauważyć, iż ładunek płaszcza nanocząstek Au/SHC10H20COO może ulegać zmianie pod wpływem pH (protonowanie grup karboksylowych w środowisku kwaśnym), co może być znaczące przy formulacji mikrożeli z użyciem opracowanych systemów.

PL 215 011 B1

Badanie wpływu różnych czynników na strukturę mikrożeli pektynowych

Na morfologię żeli pektynowych mają wpływ m.in. takie czynniki jak: rodzaj i stężenie jonu metalu czy pektyny, pH środowiska, temperatura czy czas żelowania.

Kolejny etap badań polegał na sprawdzaniu efektów różnych czynników na strukturę mikrożeli pektynowych otrzymywanych w opracowanym systemie mikroprzepływowym (Fig. 4). W eksperymentach wykorzystano niskometylowaną amidowaną pektynę, o średniej wrażliwości na jony wapnia, której proces żelowania nie jest zależny od temperatury. Testowano czas żelowania oraz różną zawartość komponentów mieszanin reakcyjnych: ilość soli wapnia i stężenia jonów H⁺ czy pektyny. Należy nadmienić, iż uwalnianie substancji z matryc pektynowych do czystej wody jest procesem długotrwałym (czas rzędu dni czy tygodni). Dlatego, w celu jego przyspieszenia, badania prowadzono z użyciem soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). EDTA skutecznie kompleksuje jony wapnia, destabilizując strukturę żelu i uwalniając enkapsulowane nanocząstki w stosunkowo krótkim czasie, co niezwykle ułatwia prowadzenie eksperymentów.

Efekt czasu żelowania

Kolejne eksperymenty dotyczyły sprawdzenia wpływu czasu sieciowania mikrożeli pektynowych. Wpływ czasu żelowania sprawdzano wykorzystując mikrożele z enkaspulowanymi nanocząstkami złota Au/SHC10H20COO^-, które wyprodukowano używając 0,5% roztwór wodny pektyny i roztwór wodny nanocząstek o stężeniu 1,5 mg/mL w stosunku objętościowym 2:1 (jako faza rozpraszana) oraz z oleju rzepakowego z dodatkiem 0,4% węglanu wapnia i 4% kwasu octowego (jako faza ciągła). Objętościowe szybkości przepływów wynosiły 1 i 9 ml/h, odpowiednio dla fazy rozpraszanej i ciągłej, a objętość tak wytwarzanych kropel wynosiła 30 pL. Porcja analizowanych mikrocząstek (pojedyncza próbka) produkowana była przez 15 minut i odbierana do 1,5 mL wody. W rezultacie objętość pojedynczej badanej próbki wynosiła blisko 1,75 mL (analizowano tylko fazę wodną, natomiast faza olejowa była usuwana). Po zadanym czasie żelowania (0,5 h, 1 h, 3 h, 15 h lub 24 h) do próbki dodawano 10 mL roztworu EDTA o pC 3. Do monitorowania procesu uwalniania wykorzystano spektrofotometr i kuwetę o szerokości 3 cm (droga optyczna). Pomiary absorpcji miały charakter ciągły, interwał czasowy wynosił 5 minut, a całkowity czas pomiaru był równy 60 minut. W czasie pomiarów próbka była mieszana.

Należy podkreślić, że proces żelowania ma charakter kinetyczny, czyli jest uwarunkowany czasem kontaktu kropel roztworu pektyny z czynnikami sieciującymi oraz czasem wtórnej dyfuzji jonów zamkniętych w mikrocząstkach (żelowanie do wewnątrz uformowanych kapsuł). Wpływ czasu na proces sieciowania mikrożeli pektynowych został przedstawiony na Fig. 6.

Interpretując uzyskane rezultaty można stwierdzić, iż czas żelowania jest bardzo istotnym czynnikiem. Otrzymane wyniki jednoznacznie pokazują, że sieciowanie zachodzi dwuetapowo. Należy zauważyć, że całkowity proces sieciowania był długi (godziny), pomimo że kontakt kropli polimeru z czynnikami sieciującymi był stosunkowo krótki (minuty). Czas potrzebny na całkowite usieciowanie dla mikrożeli o objętości 30 pL wynosił blisko 10 h. Wniosek ten wysnuto na podstawie małych różnic sygnałów w czasowych profilach uwalniania dla 3 h, 15 h oraz 24 h (Fig. 6). Do dalszych eksperymentów wybrano czas żelowania równy 12 h.

Wpływ stężenia EDTA

Szybkość uwalniania NPs z matryc pektynowych zależy nie tylko od czasu sieciowania, lecz również uwarunkowana jest stężeniem soli kwasu etylenodiaminotetraoctowego.

Efekt EDTA sprawdzano wykorzystując mikrożele z enkaspulowanymi nanocząstkami złota Au/SHC10H20COO^-, które wyprodukowano używając 0,5% roztwór wodny pektyny i roztwór wodny nanocząstek o stężeniu 1,5 mg/mL w stosunku objętościowym 2:1 (jako faza rozpraszana) oraz z oleju rzepakowego z dodatkiem 0,4% węglanu wapnia i 4% kwasu octowego (jako faza ciągła). Objętościowe szybkości przepływów wynosiły 1 i 9 ml/h odpowiednio dla fazy rozpraszanej i ciągłej, a objętość tak wytwarzanych kropel wynosiła 30 pL. Porcja analizowanych mikrocząstek (pojedyncza próbka) produkowana była przez 10 minut i odbierana do 1,0 mL wody. W rezultacie objętość pojedynczej badanej próbki wynosiła blisko 1,17 mL (analizowano tylko fazę wodną, natomiast faza olejowa była usuwana). Czas żelowania pojedynczej próbki wynosił 12 h. Następnie do próbki dodawano 6,6 mL roztworu EDTA o zadanym stężeniu (zakres pC od 5 do 2). Do monitorowania procesu uwalniania wykorzystano spektrofotometr i kuwetę o szerokości 1 cm (droga optyczna). Pomiarów dokonywano po czasie: 1 h, 3 h, 1 h od dodania EDTA. W trakcie procesu uwalniania próbka była mieszana.

PL 215 011 B1

Wyniki przeprowadzonych eksperymentów z udziałem roztworów EDTA o różnym stężeniu (pC w zakresie od 5 do 2) i mikrożeli pektynowych z zaenkapsulowanymi nanocząstkami złota (tżelowania = 12 h) przedstawiono na Fig. 7 i Fig. 8.

Uzyskane wyniki potwierdziły, iż sterując stężeniem EDTA można łatwo kontrolować szybkość uwalniania nanocząstek z mikrożeli pektynowych. Dla przykładu, stosując roztwór EDTA pC 2 całkowite uwolnienie NPs następuje w ciągu około 10 min (Fig. 7). Z kolei zastosowanie roztworów EDTA o mniejszych stężeniach (pC < 2) powoduje wolniejszą degradację mikrożeli i uwolnienie mniejszej ilości NPs.

Do dalszych badań nad wpływem składu faz wybrano roztwór EDTA o stężeniu 1,41 mM (pC 2,85). Ta ilość czynnika chelatującego umożliwi obserwację różnic w szybkości degradacji mikrożeli o różnej strukturze w zadanym eksperymentalnym czasie 45 minut (testowanie wpływu różnych czynników).

Wpływ składu faz: ciągłej i rozpraszanej

Do badań wpływu składu faz: ciągłej i rozpraszanej na uzyskiwane struktury mikrożeli potrzebna była odpowiednia procedura, która zapewniałaby miarodajne i powtarzalne wyniki. Dlatego tak istotne było uprzednie ustalenie optymalnego czasu żelowania i stężenia EDTA.

Wpływ składu faz sprawdzano wykorzystując mikrożele z enkaspulowanymi nanocząstkami złota Au/SHC10H20COO^-, które wyprodukowano używając 0,5% lub 1% roztwór wodny pektyny i roztwór wodny nanocząstek o stężeniu 1,5 mg/mL w stosunku objętościowym 2:1 (jako faza rozpraszana) oraz z oleju rzepakowego z dodatkiem 0,05% lub 0,4% lub 2% węglanu wapnia i 1% lub 4% lub 10% kwasu octowego (jako faza ciągła). Do produkcji mikrożeli zastosowano zmodyfikowany system mikroprzepływowy, który zapewniał powtarzalne warunki formulacji (schemat systemu przedstawiono na Fig. 4). Objętościowe szybkości przepływów wynosiły 1 i 9 mL/h odpowiednio dla fazy rozpraszanej i ciągłej, a objętość tak wytwarzanych kropel wynosiła 30 pL. Porcja analizowanych mikrocząstek (pojedyncza próbka) produkowana była przez 15 minut i odbierana do 1,5 mL wody. W rezultacie objętość pojedynczej badanej próbki wynosiła blisko 1,75 mL (analizowano tylko fazę wodną, natomiast faza olejowa była usuwana). Czas żelowania pojedynczej próbki wynosił 12 h. Następnie do próbki dodawano 10 mL roztworu EDTA o pC 2,85. Do monitorowania procesu uwalniania wykorzystano spektrofotometr i kuwetę o szerokości 3 cm (droga optyczna). Pomiary absorpcji miały charakter ciągły, interwał czasowy wynosił 3 minuty, a całkowity czas pomiaru był równy 45 minut. W czasie pomiarów próbka była mieszana. W tym celu wykorzystano specjalnie skonstruowany układ mieszający, który był sterowany regulatorem napięcia.

Badania wpływu składu faz polegały na testowaniu: i) stężenia użytej pektyny (0,5% i 1%), ii) stężenia kwasu octowego w oleju rzepakowym (1%, 4%, 10%) oraz iii) ilości węglanu wapnia dodanej do fazy ciągłej (0,05%, 0,4%, 2%). Wyniki przeprowadzonych eksperymentów przedstawiono na fig. 9 i 10.

Analizując otrzymane wyniki, można stwierdzić, iż sterując stężeniem pektyny, jonów wodorowych czy ilością soli wapnia, można kontrolować strukturę uzyskiwanych mikrożeli. Najważniejsza obserwacja jakościowa, wynikająca z przeprowadzonych eksperymentów, dotyczyła kluczowej roli kwasu octowego przy formułowaniu stabilnych mikrożeli pektynowych. Wszystkie mikrożele wyprodukowane z użyciem kwasu octowego o niskim stężeniu (1%) oraz 0,5% roztworu pektyny były wyjątkowo niestabilne. Większość AuNPs została uwolniona jeszcze przed dodaniem EDTA. Z kolei, mikrocząstki wyprodukowane z użyciem 1% CH3COOH i 1% roztworu pektyny charakteryzowały się nieco większą stabilnością. W tym przypadku, AuNPs zostały uwolnione w ciągu około 15 minut po dodaniu EDTA. Co ciekawe, dla analizowanych mikrożeli (produkowane z wykorzystaniem 1% kwasu) nie zaobserwowano zależności szybkości uwalniania od ilości zastosowanego węglanu wapnia. Warto również zauważyć, że mikrocząstki te miały tendencję do łączenia się i tworzenia dużych aglomeratów. Z kolei, mikrożele wyprodukowane z wykorzystaniem kwasu octowego o największym testowanym stężeniu (10%) nie ulegały agregacji i pozostawały stabilne nawet po dodaniu czynnika kompleksującego wapń. Jedynie w przypadku mikroziaren wyprodukowanych z użyciem najmniejszej ilości węglanu wapnia (0,05%) zaobserwowano pewną destabilizację mikrocząstek (około 25% nanocząstek zostało uwolnionych). Najbardziej interesujące rezultaty otrzymano dla średniego stężenia użytego kwasu (4%). Mikrożele formułowane z użyciem 0,5% roztworu pektyny wykazywały podobne profile destabilizacji, uwalniając wszystkie nanocząstki w czasie ok 20 minut po dodaniu EDTA. Co ciekawe, mikrocząstki wyprodukowane z 1% roztworu pektyny degradowały wolniej, a tempo uwalniania było większe dla cząstek spreparowanych z użyciem większej ilości wapnia.

PL 215 011 B1

T a b e l a 4

Sól wapnia	Rozpuszczalność w CH3COOH	Mieszalność z olejem rzepakowym	Obserwacje finalnych mieszanin
chlorek	++	+	zmętnienie oleju
mleczan	++	-	rozwarstwienie i wypadanie osadu
octan	++	-	zmętnienie oleju i wypadanie osadu
węglan	+	++	dobra mieszalność
szczawian	+	-	rozwarstwienie i wypadanie osadu
cytrynian	-	-	niemieszalny

T a b e l a 5

Zastosowane NPs	Ładunek NPs	Żelowanie - uwagi
Ag/SHCnH22N+(CH3)3	(+)	wyjątkowo wolne; finalnie uzyskano żel w kształcie „chmurki
Au/SHC11H22SO3-	(-)	wolne; otrzymano kapsułki (żele z ciekłym jądrem)
AU/SHC10H20COO·	(-)	szybkie; otrzymano jednolite żele (całkowicie zżelowane)

Zastrzeżenia patentowe

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania monodyspersyjnych mikrożeli pektynowych z wykorzystaniem układu mikroprzepływowego, obejmujący etapy: i) wytworzenia emulsji oraz ii) żelowania w wyniku dyfuzji do fazy rozpraszanej jonów sieciujących zawartych w fazie ciągłej, znamienny tym, że faza ciągła zawiera olej jadalny, zwłaszcza olej rzepakowy, sól wapnia oraz nietoksyczny, mieszalny z rozpuszczalnikami polarnymi i niepolarnymi kwas octowy, a fazę rozpraszaną stanowi wodny roztwór pektyny opcjonalnie zawierający nanocząstki.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako olej rzepakowy stosuje się olej rzepakowy z pierwszego tłoczenia.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że solą wapnia jest chlorek wapnia lub węglan wapnia.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że solą jest węglan wapnia.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 - 4, znamienny tym, że kwasem octowym jest kwas octowy lodowaty.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 - 5, znamienny tym, że stężenie kwasu w fazie ciągłej wynosi co najmniej 1,0% wagowych, korzystniej 10,0% wagowych.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 - 6, znamienny tym, że stężenie soli w fazie ciągłej wynosi od 0,05% wagowych do 2,0% wagowych, korzystnie 0,4% wagowych.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 - 7, znamienny tym, że pektynami są niskoestryfikowane amidowane pektyny.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że pektyna ma małą, średnią lub dużą wrażliwość na jony wapnia, korzystnie średnią wrażliwość na jony wapnia.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stężenie roztworu pektyny wynosi od 0,25% wagowych do 1,0% wagowych, korzystnie 0,5% wagowych.
11. 11. Sposób według zastrz. 1 - 10, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap wymiany fazy ciągłej zawierającej olej.
12. 12. Sposób według zastrz. 1 - 11, znamienny tym, że do fazy rozpraszanej enkapsuluje się nanocząstki o różnej chemii powierzchni, korzystnie o ujemnie naładowanej powierzchni, korzystniej pokryte SHC10H20COO^-.
13. 13. Sposób według zastrz. 1 - 12, znamienny tym, że w etapie wytworzenia emulsji zachodzi przepływ fazy ciągłej i fazy rozpraszanej.