PL214785B1 - Sposób termofilnej beztlenowej fermentacji glicerolu - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy biotechnologii w zakresie technologii fermentacji oraz produkcji biopaliw. Wynalazek dotyczy technologii fermentacji glicerolu z użyciem termofilnych mikroorganizmów zdolnych do produkcji butanolu, wodoru oraz etanolu. W niniejszym wynalazku zostaje ujawniona metoda zastosowania mikroorganizmów z rodzaju Thermoanaerobacterium oraz fermentacji i separacji produktów.

Alternatywą dla paliw kopalnych są paliwa oparte o technologie obniżające emisję CO₂ i wykorzystujące rozwiązania ze świata biologii prowadzące do tworzenia tzw. biopaliw. Obecnie rozpoznano następujące typy biopaliw: bio-diesel, bio-etanol, bio-butanol i bio-metan. Ze względu na rosnące zainteresowanie biopaliwami i bioenergii światowa produkcja bio-paliw ciągle rośnie. Aktualnie największym zainteresowaniem cieszą się: bio-etanol, bio-diesel i bio-gaz oraz bio-metan, które produkowane są w skali przemysłowej.

Do produkcji tzw. bioalkoholi wykorzystuje się najczęściej procesy fermentacji, w których jako substratów używa się cukrów w postaci mono- lub polisacharydów uzyskiwanych z biomasy. Dziś istnieją przede wszystkim dwie generacje bio-paliw w zależności od użytej technologii, a mianowicie: technologii I generacji i technologii Il generacji.

Technologia I generacji bio-paliw oparta jest na produkcji bio-alkoholi głównie z cukrów prostych, takich jak: monocukry np. glukoza czy dwucukry, takie jak sacharoza (czyli dimer glukozy i fruktozy) oraz skrobi, łatwo hydrolizowanego polisacharydu złożonego z jednostek glukozy. Źródłami tych cukrów są uprawy roślin, takich jak buraki cukrowe, trzcina cukrowa, zboża (np. pszenica, jęczmień, żyta, itd.) oraz kukurydza. Technologie produkcji alkoholi I generacji są dobrze poznane i opierają się o wykorzystanie mikroorganizmów fermentacji alkoholowej. Jednakże, ze względu na wysokie ceny surowców oraz możliwości wykorzystania ich jako produktów spożywczych, zastosowanie ich do pr odukcji bio-paliw staje się obecnie dyskusyjne.

Technologia Il generacji bio-paliw opiera się na produkcji alkoholi z materiałów lignocelulozowych, takich jak słoma, drewno i pozostałości rolnych, które często są traktowane jako odpady. W związku z tym, tego rodzaju materiały są tanie i łatwo dostępne. Jednakże procesy technologiczne z ich wykorzystaniem są bardziej skomplikowane w stosunku do technologii używanych w produkcji bio-paliw I generacji. Dzieje się tak głównie ze względu na obecność ligniny, która wiąże ze sobą pe ktyny, białka i dwa polisacharydy, celulozę i hemicelulozę. Zastosowanie obróbki wstępnej pozwala na rozbicie struktury ligniny, co ułatwia dostęp dla czynników uwalniających cukry z hemicelulozy i celulozy, i co w efekcie pozwala na ich konwersję w procesie fermentacji do bio-alkoholi. Zwykle, cukry uwalniane są przez zastosowanie enzymów hydrolizujących celulozę i hemicelulozę z których uzyskuje się glukozę oraz frakcję pentoz (cukrów 5 węglowych), takich jak ksyloza, arabinoza, galaktoza, mannoza czy ramnoza. W wyniku hydrolizy największą frakcję stanowi jednak glukoza, która jest łatwo fermentowana do alkoholu, oraz ksyloza, której fermentacja nastręcza nadal wiele problemów.

Bio-diesel należy do odnawialnych bio-paliw wytwarzanych z np. olejów roślinnych i tłuszczów zwierzęcych. Proces produkcyjny bio-diesla na dużą skalę polega na reakcji transestryfikacji tłuszczów - rozgałęzionych trójglicerydów do estrów metylowych lub etylowych kwasów tłuszczowych. W proc esie tym trójglicerydy są przekształcone w obecności katalizatora silnie alkalicznego oraz najczęściej alkoholu metylowego do mieszanin estrów metylowych i do gliceryny. Głównym produktem reakcji są estry metylowe, które są łatwo oddzielone od frakcji glicerolu. Estry te po oczyszczeniu są stosowane jako bio-paliwa lub jako dodatek do paliw uzyskiwanych tradycyjnymi metodami.

Glicerol stanowi główny produkt uboczny w technologii produkcji bio-diesla.

Jest on uzyskiwany w postaci tzw. gliceryny surowej, która występuje w postaci gęstej alkalic znej emulsji wodnej zawierającej 50 do 60% glicerolu, mydła, metanolu oraz katalizatora. Ze względu na zawartość metanolu, produkt ten jest uznawany za niebezpieczny, trudny do zbycia i posiada bardzo niską wartość rynkową. Dlatego strumień frakcji gliceryny surowej poddaje się kolejnym procesom mającym na celu usunięcie reszty kwasów tłuszczowych i ich soli - mydeł i zawrócenie ich do procesu transestryfikacji oraz separacji próżniowej metanolu. Po tym procesie uzdatniania glicerolu uzyskuje się glicerynę techniczną zawierającą około 85% czystego glicerolu. Glicerol ten może być poddawany rektyfikacji w rafineriach, gdzie uzyskuje sie glicerynę o czystości 99,7% stosowaną w przemyśle kosmetycznym czy farmaceutycznym.

PL 214 785 B1

Obok tej tradycyjnej technologii produkcji bio-diesla, proces produkcji bio-diesla na drodze heterogenicznej katalizy jest obecnie prowadzony na dużą skalę produkcyjną. Uzyskiwana w tej skali gliceryna zawiera od 95 do 98% glicerolu, co zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia bio-diesla metanolem.

W produkcji bio-diesla, część glicerolowa może stanowić około 10% objętości mieszaniny reakcyjnej i zwykle jest dalej przetwarzana do pochodnych glicerolu wykorzystywanych w żywności, przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym, przy produkcji tekstyliów, wosków, kauczuku syntetycznego i itp. Glicerol jako produkt uboczny z produkcji bio-diesla był uznawany za atut tej technologii, ale ze względu na rosnącą ilość produkcji samego bio-diesla jego wartość ciągle maleje i powoli staje się kłopotliwym do zbycia produktem, co w efekcie spowodowało, że sama produkcja bio-diesla stała się mało konkurencyjna w stosunku do produkowanego z surowców kopalnych oleju napędowego. Obecnie rynek tradycyjnych technologii przetwarzania gliceryny wydaje się nasycony i producenci bio-diesla stoją w obliczu problemu unieszkodliwiania rosnącej ilości składowanych odpadów gliceryny. Zatem wraz z rosnącą globalną produkcją paliwa, problem z zagospodarowaniem odpadowej gliceryny będzie się nasilał.

Aktualnie gliceryna techniczna straciła tak wiele ze swojej wartości i w ciągu ostatnich lat jej cena doszła do punktu, w którym jest traktowana jako odpad przez wielu producentów bio-diesla. Jednocześnie brak jest efektywnych i rzetelnych metod zarządzania odpadami glicerolu. Rozwiązaniem stosowanym dotychczas jest usuwanie gliceryny przez spalanie. Jednakże, tworzenie akroleiny w wyniku termicznego rozkładu glicerolu oraz obecność soli w glicerolu prowadzi do powstania niezwykle agresywnych oraz kancerogennych substancji chemicznych. W efekcie problemy środowisk owe wynikające z tej metody zagospodarowania gliceryny pozwalają stwierdzić, że jest ona produktem odpadowym o niewielkiej wartości rynkowej.

Jedną z najkorzystniejszych metod zagospodarowania glicerolu jest metoda biologiczna, gdzie w wyniku beztlenowej fermentacji metanowej gliceryna jest przetwarzana do biogazu (bio-metanu). Produkcja bio-metanu jest znaną technologią wdrażaną na całym świecie do obróbki odpadów organicznych, takich jak osady ściekowe, odpady z gospodarstw domowych, obornika i odpadów przem ysłowych. Proces ten jest zwykle prowadzony w warunkach mezofilnych w 33-37°C, lub termofilnych w zakresie 50-55°C. Bio-metan może być produkowany z substancji organicznych w procesie fermentacji przeprowadzonej przez złożone kultury drobnoustrojów składający się z wielu niemetanowych i metanowych mikroorganizmów takich jak bakterie i archeony. W efekcie procesów metabolicznych tych kultur następuje konwersja materii organicznej w metan. Proces ten jest złożoną kaskadą reakcji, w których biorą udział kolejne rodzaje drobnoustrojów. Jest on inicjowany przez bakterie fermentacji hydrolitycznej, które przeprowadzają konwersję związków organicznych, takich jak węglowodany, białka i lipidy w octany, propioniany, maślany, iso-maślany, walerianiany izo-walerianiany, alkohole, mleczany, wodór i dwutlenek węgla. Związki te są głównymi półproduktami w procesie metanogenezy i stanowią substraty dla mikroorganizmów metanowych. Jeżeli działalność złożonej społeczności drobnoustrojów jest w równowadze, to nie występuje gromadzenie się lotnych kwasów tłuszczowych i w efekcie proces wykazuje maksymalną wydajność. Jednak w pewnych warunkach takich jak przeciążenia w ilości substratów lub częściowe zahamowanie dopływu biomasy może doprowadzić do poważnego obniżenia produkcji biogazu i nagromadzenia się lotnych kwasów tłuszczowych. Zatem ilość stosowanej w procesie produkcji biogazu gliceryny jest dość ograniczona ze względu na wysoką zawartość tzw. lotnych związków organicznych.

Zastosowanie gliceryny w procesach produkcji biogazu wiąże się z selekcją określonych drobnoustrojów wykorzystujących ten substrat. Ważna jest zatem adaptacja drobnoustrojów do procesu metanogenezy na bazie glicerolu. Tylko wtedy glicerol dodawany do fermentacji nie będzie zaburzał procesu produkcji biogazu. Aktualnie nie stosuje się glicerolu w termofilnych procesach fermentacji metanowej. Istnieje jedynie jedno ostatnio opublikowane doniesienie na ten temat [Holm-Nielsen JB, Lomborg CJ, Oleskowicz-Popiel P, Esbensen KH (2007) On-line near infrared monitoring of glycerol-boosted anaerobic digestion processes: Evaluation of process analytical technologies. Biotechnol Bioengineering 99(2):302-313)]. Z publikacji tej wynika, że stosowany udział frakcji glicerolu nie może przekroczyć poziomu 5-7 g/l biomasy. Przekroczenie tej bariery prowadzi do zaburzenia równowagi mikrobiologicznej i w efekcie do akumulacji glicerolu, lotnych kwasów tłuszczowych oraz spadku produkcji metanu. Publikacja ta ukazuje wyraźnie niewystarczający potencjał natury złożonych społeczności bakterii beztlenowych do konwersji glicerolu w metan.

Glicerol jest kłopotliwym produktem ubocznym produkcji bio-diesela. Dlatego istnieje pilna potrzeba wprowadzenia technologii i metod związanych z procesami przetwarzania gliceryny do produk4

PL 214 785 B1 tów szeroko stosowanych w przemyśle np. paliwowym. Takie technologie i metody mogą rozwiązać lub zniwelować problem usuwania odpadów gliceryny, a także wprowadzają one możliwość powstania nowych, atrakcyjnych, wysokiej jakości produktów na rynek, co może przyczynić się do poprawy stanu całej gospodarki, np. produkcji bio-diesla. Według stanu wiedzy autorów wynalazku nie istnieje aktualnie przemysłowa metoda utylizacji glicerolu.

Z pośród bogactwa kultur bakteryjnych, zdolność do fermentacji w warunkach anaerobowych lub mikroanaerobowych jest szczególną cechą fizjologiczną jedynie kilku bakterii. Najintensywniej badanymi bakteriami fermentacji gliceryny są szczepy bakterii z grupy pałeczek jelitowych z rodzajów Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter oraz inne takie jak: Lactobacillus i Clostridium butyricum, Clostridium perfringens i Clostridium pasteurianum [Biebl H (2001) Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum -batch and continuous culture studies. J Industrial Microbiol & Biotechnol 27:18-26], Zgodnie z aktualną wiedzą na temat szlaków metabolicznych enterobakterii i Clostridiów, glicerol jest przetwarzany dwoma szlakami metabolicznymi tj. utleniania glicerolu, a drugi odpowiedzialnym za zachowanie bilansu oksydacyjno-redukcyjnego (redox) w komórce mikroorganizmu. Typowe produkty pierwszego szlaku to biomasa i octan. Natomiast produkty drugiego szlaku - szlaku redox to etanol, butanol i mleczan. Uważa się, że ponieważ glicerol jest bardziej zredukowany od biomasy, to jego zredukowany potencjał jest przeniesiony tylko przez część tworzonych związków jak etanol, butanol lub mleczan. Dlatego podlega on dodatkowo przemianie do 1,3-propanodiolu, gdzie następuje zrównoważenie ilości NAD+ do NADH. Tworzenie 1,3-propanodiolu jest bardzo często obserwowaną cechą fizjologiczną fermentacji glicerolu przez bakterie. Istnieją jednak pewne wyjątki. Jednym z nich są dwa szczepy bakterii Clostridium wykorzystane do produkcji etanolu jako głównego i jedynego produktu mezofilnej fermentacji gliceryny [Jarvis GN, Strompl C, Moore ERB, Thiele JH (1999) Isolation and characterisation of two glycerol-fermenting clostridial strains from a pilot scale anaerobic digester treating high lipid-content slaughterhouse waste. J Appl Microbiol 86 (3):412-420].

Clostridium perfringens i acetobutylicum to dwie z nielicznych bakterii mezofilnej fermentacji anaerobowej zdolne do wytwarzania w warunkach mezofilnej, ale nie termofilnej fermentacji znacznych ilości butanolu z glicerolu oraz mieszaniny gliceryny i glukozy. Dodatkowymi produktami rozkładu glicerolu jest etanol oraz kwasy organiczne, takie jak octan, mleczan i maślan. C. partorianum produkuje dodatkowo 1,3-propanediol [Biebl H (2001) Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum -batch and continuous culture studies. J Industrial Microbiol & Biotechnol 27:18-26; Andrade JC, Vasconcelos I (2003) Continuous cultures of Clostridium acetobutylicum: culture stability and low-grade glycerol utilization. Biotechnology Letters 25: 121-125].

Stosowanie szczepów z rodzaju Clostridium w procesach fermentacji, w tym fermentacji przemysłowej posiada ograniczenia. Niektóre z gatunków Clostridium to potencjalne czynniki chorobotwórcze sklasyfikowane do 2 grupy ryzyka. Prowadzenie fermentacji w skali przemysłowej, gdzie ilości powstającej biomasy komórek bakterii często sięgają ilości ton na dobę wiąże się z dużym zagrożeniem uwolnienia do środowiska. Zatem wskazane jest stosowanie w procesach fermentacji przem ysłowej mikroorganizmów do grupy niskiego ryzyka tj. grupy 1 do jakiej należą anaerobowe mikroorganizmy termofilne.

Liczba termofilnych drobnoustrojów posiadających zdolność fermentacji glicerolu jako jedynego źródła węgla jest ograniczona. Do takich organizmów należą dwa drobnoustroje termofilne, które posiadają zdolność produkcji 1,3-propandiolu oraz wodoru. Jest to szczep Caloramator AT1 [Wittlich P, Themann A, Vorlop K-D (2001) Conversion of glycerol into 1,3-propanodiol by a newly isolated thermophilic strain. Biotechnology Letters 23: 463-466] i nowy szczep Caloramator viterbensis [Seyfried M, Lyon D, Rainey FA, Wiegel J (2002) Caloramator viterbensis sp. nov., a novel thermophilic, glycerol-fermenting bacterium isolated from a hot spring in Italy. Int J Syst Evol Microbiol 52: 1177-1184], Szczepy te zostały wyizolowane z gorących źródeł we Włoszech. Bakterie te posiadają zdolność fermentacji glicerolu, gdzie oprócz 1,3-propanodiolu powstawały również takie związki jak: maślan, etanol (szczep Caloramator ATI) oraz octan i wodór (szczep Caloramator viterbensis). Przykład dwóch szczepów termofilnych zdolnych do produkcji butanolu na bazie glukozy i skrobii został opisany przez Freier-Schroder [Freier-Schroder D, Wiegel J, Gottschalk G (1989). Butanol production by Clostridium thermosaccharolyticum at neutral pH. Biotechnology Letters 11 (11): 831-836]. Opisane szczepy należą do gatunku Clostridium thermosaccharolyticum. Są one zdolne do produkcji do 40 mM butanolu w wyniku fermentacji glukozy lub skrobi. Jednak nie są one zdolne do fermentacji glicerolu i produkcji butanolu. Ponadto produkcji butanolu z cukrów zawsze towarzyszy znaczna produkcja

PL 214 785 B1 pozostałych metabolitów, w tym znaczne ilości maślanu w ilości 0,11-1,8 moli na mol butanolu w zależności od szczepu i warunków hodowli.

Aktualnie nie istnieje wielkoprzemysłowa skala produkcji bio-butanolu.

Chociaż w ubiegłym stuleciu istniały procesy mezofilnej fermentacji mieszanej, gdzie w procesie fermentacji cukrów powstawała mieszanina rozpuszczalników, których najmniejszym składnikiem był butanol. Proces fermentacji określanej mianem ABE (aceton, butanol, etanol) był procesem biologic znym wytwarzania butanolu do połowy ubiegłego stulecia [Jones DT, Woods DR (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiol Reviews 50(4):484-524]. Jednak ze względu na koszty surowców, którymi były cukry oraz spadające ceny ropy naftowej w tamtym okresie, zaniechano rozwij ania tej technologii. W procesach tych wykorzystywano szczepy mezofilnych gatunków Clostridium perfrigens, C. acetobutylicum oraz C. beijerinckii. Drobnoustroje te wydajnie fermentowały hydrolizaty biomasy roślinnej zawierające cukry tj. melasę, kukurydzę, ryż, jednakże nie były w stanie prowadzić procesu fermentacyjnego na glicerolu jako jedynym źródle węgla [Zverlov VV, Berezina O, Velikodvorskaya GA, Schwarz WH (2006) Bacterial acetone and butanol production by industrial fermentation in the Soviet Union: use of hydrolyzed agricultural waste for biorefinery. Appl Microbiol Biotechnol 71: 587-597].

Tradycyjną metodą usuwania butanolu z wodnych roztworów fermentacyjnych jest destylacja. Jednak z powodu wyższej temperatury parowania butanolu względem wody większość zapotrzebowania na energię związana jest z odparowaniem wody i jest funkcją stężenia butanolu w mieszaninie poddawanej separacji. [Matsumura M, Kataoka H, lbaraki, Sueki M , Araki K, Yokohama,1988, Energy saving effect of pervaporation using oleyl alcohol liquid membrane in butanol purification, Bioprocess Engineering 3, 93-100]. Wydajność destylacji związana jest z zastosowaną integracją energetyczną całego procesu fermentacji i separacji jako że zapotrzebowanie na energię stanowi największy udział kosztów operacyjnych.

Do ważnych i szeroko badanych technik w kontekście separacji butanolu w procesach fermentacyjnych należy perwaporacja. Technika jest złożeniem selektywnej filtracji membranowej i odparowania rozpuszczalników z mieszaniny fermentacyjnej [Wijmans, JG, Baker RW, 1993, A simple predictive treatment of Permeation Process by Pervaporation, J. Membr. Sci.79,101.; Groot, WJ, van der Lans RGJM, Luyben KChAM, 1992, Technologies for butanol recovery integrated with fermentations, Process Biochem. 27,61]. Zasada działania polega na dyfuzji związków lotnych poprzez membrany i równoczesnym utrzymywaniu w mieszaninie związków odżywczych, makromolekuł oraz całych komórek. Przy czym selektywność odzyskiwania produktów i szybkość przenikania przez membranę zależą od właściwości stosowanych membran, ich grubości, powierzchni, składu fazy ciekłej i gazowej oraz temperatury i ciśnienia w trakcie procesu. Separacja butanolu w procesie perwaporacji była stosowana zarówno w fermentacji stacjonarnej [Qureshi N, Blaschek HP, 1999, Production of acetone butanol ethanol (ABE) by a hyper-producing strain of Clostridium beijgerinckii BA101 and recovery by pervaporation., Biotechnol. Prog., 15, 594; Groot WJ, an der Oever CE, Kossen NWF, 1984, Pervaporation for simultaneous product recovery in the butanol/isopropanol batch fermentation., Biotechnol. Lett., 6, 709], jak i fermentacji z dokarmianiem [Qureshi N, Blaschek HP, 2000, Butanol production using hyper-producing mutant strain of Clostridium beijgerinckii BA101 and recovery by pervaporation., Appl. Biochem. Biotechnol., 84, 225].

Do opracowania wydajnej i selektywnej perwaporacji stosowano szeroką gamę materiałów do produkcji membran, włączając silikon, PDMS (polidimetylosiloksan), PP (polipropylen), membrany ciekłe oparte na PP wypełnione alkoholem oleinowym, PTFE (politetrafluoroetylen), poliuretan, zeolit ZSM-5 oraz silikonowe membrany z silikalitem. [Qureshi N, 1997, recovery of alcohol fuels using selective membranes by prvaporation., PhD Dissertation, Univeristy of Nebraska, Lincoln]. Membrany silikonowe są jak dotąd uznawane za najlepsze z dostępnych w procesie usuwania butanolu z mieszanin fermentacyjnych za pośrednictwem perwaporacji. [Duerre P.,2005, Handbook of Clostridia, CRC Press].

Metoda odpędzania gazem (ang. Gas stripping) jest powszechnie uznana jako najważniejsza przemysłowo metoda separacji butanolu w zintegrowanych układach z procesem fermentacji [Maddox IS, 1988, The acetone-butnol-ethanol fermentation: recent progress in technology. Biotechnol. Genetic Eng. Reviews 7, 189; Groot, WJ, van der Lans RGJM, Luyben KChAM, 1992, Technologies for butanol recovery integrated with fermentations, Process Biochem. 27,61], Odpędzanie gazem pozwala na selektywne usuwanie lotnych produktów fermentacji bez pośrednictwa błon filtracyjnych wyk orzystując różnice stężeń produktu pomiędzy fazami ciekłą i gazową. Obieg fazy gazowej w układzie

PL 214 785 B1 jest wymuszany, zaś produkt jest odzyskiwany z fazy gazowej poprzez kondensację w chłodnicy. Po odebraniu produktu gaz jest zawracany do mieszania z roztworem fermentacyjnym w celu kontynuacji procesu odpędzania. W trakcie odpędzania gazem utrzymywanie warunków bezwzględnie beztlenowych jest łatwe przy użyciu gazów wolnych od tlenu (azot, dwutlenek węgla, wodór). Metoda odpędzania gazem została pierwszy raz opisana w izolacji butanolu w procesie fermentacji prowadzonego szczepem C. Acetobutylicum [Ennis BM, Marshall CT, Maddox IS, Patterson AHJ, 1986, Continuous product recovery by in situ gas stripping/condensation during solvent production from whey permeate using Clostridium acetobutylicum. Biotechnol. Lett. 8, 725]. Odpędzanie gazem posiada wiele wyraźnych zalet w porównaniu z innymi metodami separacji jest metodą prostą i niedrogą pod względem kosztów operacyjnych. Na proces odpędzania nie ma znaczącego wpływu przyrastająca biomasa w fermentorze i związane z tym problemy zanieczyszczania i blokowania membran filtracyjnych towarzyszące perwaporacji czy adsorbcji. [Ezeji TC, Qureshi N, Blaschek HP, 2003, Production of butanol by Clostridium beijgerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping., World J. Microbiol. Biotechnol., 19, 595]. Jednoczesne odpędzanie gazem w procesie fermentacyjnym we wszystkich opisywanych warunkach polepsza wydajność fermentacji zarówno pod względem przyswajania składników odżywczych przez producenta jak również pod względem poziomu produkcji butanolu [Outshoorn A, 2009, Assessment of options for selective 1-butanol recovery form aqueous solution., Ind. Eng. Chem. Res. 48, 15, 7325]. Zintegrowane odpędzanie butanolu jest dedykowanym sposobem na optymalizację nowych procesów fermentacyjnych dzięki obniżaniu toksyczności i ciągłym przywracaniu równowagi w kierunku syntezy produktu.

W warunkach fermentacji przemysłowej istnieje potrzeba stosowania drobnoustrojów niskiego ryzyka, których przypadkowe uwolnienie do środowiska nie spowoduje poważnych konsekwencji zdrowotnych dla ludzi i środowiska. Dotyczy to również fermentacji przemysłowej służącej do produkcji bio-paliw.

Istnieje również potrzeba zastosowania mikroorganizmów termofilnych w procesach produkcji bio-paliw takich jak butanol ze względu na ułatwione metody bezpośrednej (w trakcie fermentacji) separacji przez odparowywanie oraz odporności na zakażenia przez mezofilną mikroflorę środowiskową.

Istnieje również potrzeba opracowania i wdrożenia technologii fermentacji z użyciem mikroorganizmów zdolnych do produkcji różnych typów bio-paliw na bazie odpadowej gliceryny w zależności od potrzeb rynkowych, np. butanolu, etanolu, kwasu mlekowego czy wodoru z glicerolu, który stanowi produkt uboczny i odpadowy w produkcji bio-diesla.

Dlatego celem wynalazku jest dostarczenie technologii fermentacji glicerolu z użyciem termofilnych szczepów mikroorganizmów oraz bezpośredniej separacji produktów fermentacji, która będzie mogła służyć produkcji bio-paliw takich jak etanol, butanol i wodór lub związków organicznych jak kwas mlekowy, jak i polepszy ekonomię procesu wytwarzania samego paliwa typu bio-diesel.

Wynalazek obejmuje sposób wytwarzania butanolu, wodoru, kwasu mlekowego i etanolu z glicerolu w termofilnej fermentacji z użyciem wyizolowanego z próbek środowiskowych szczepu bakterii Thermoanaerobacterium sp. oznaczonego jako N53.Sposób pozwala na zagospodarowanie gliceryny technicznej uzyskiwanej w procesie produkcji bio-diesla i produkcję wartościowych bio-paliw.

Krótki opis rysunków

Fig. 1. Sekwencja górnej nici DNA fragmentu genu 16S rDNA kodującego rybosomalne RNA małej podjednostki rybosomu szczepu Thermoanaerobacterium sp. N53

Fig. 2. Schemat technologiczny aparatury do przeprowadzania procesu fermentacji glicerolu w warunkach termofilnych z udziałem szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp.

Fig. 3. Przebieg stacjonarnej fermentacji gliceryny technicznej o zawartości 95% glicerolu z użyciem szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. w temperaturze 60°C w warunkach stałego nadciśnienia 1 bar i pH stabilizowanego na poziomie 6,5.

Szczegółowy opis wynalazku

Istota wynalazku polega na zastosowaniu w procesie termofilnej fermentacji gliceryny technicznej o zawartości glicerolu 85 do 99% użyciem szczepu wyizolowanej z próbek środowiskowych anaerobowej bakterii termofilnej z rodzaju Thermoanaerobacterium nazwanej dalej szczepem N53. Drobnoustrój ten został wyizolowany z próbek środowiskowych tj. aktywnych biologicznie osadów ze zbio rnika do produkcji biogazu na drodze selekcji temperaturowej w 55-60°C i w obecności glicerolu o stęPL 214 785 B1 żeniu 20 g/l jako jedynego źródła węgla. Proces selekcyjny wielokrotnie powtarzano w celu eliminacji towarzyszących kultur bakteryjnych. W końcowym etapie selekcji, aktywną kulturę drobnoustrojów wysiano na podłoże stałe w celu selekcji pojedynczych kolonii. Każdą z kolonii bakteryjnych przesiewano indywidualnie na podłoże płynne zawierające glicerol w stężeniu 20 g/l, hodowano i następnie przeniesiono ponownie na podłoże stałe w celu potwierdzenia homogenności kultury bakteryjnej. W trakcie kolejnych posiewów monitorowano z użyciem techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) rodzaj i stężenie powstających produktów oraz samego glicerolu. W wyniku przeprowadzonej selekcji wykryto w jednej z kultur komórkowych jako produkt fermentacji glicerolu butanol, kwas mlekowy oraz etanol. Dodatkowe analizy z użyciem techniki chromatografii gazowej (GC) pozwoliły na stwierdzenie obecności wodoru w przestrzeni nad mieszaniną hodowlaną w ilości od 10 do 60% w zależności od stopnia fermentacji glicerolu. W celu identyfikacji gatunkowej mikroorganizmu produkującego butanol, etanol oraz wodór przeprowadzono izolację genomowego DNA tego organizmu oznaczonego jako szczep N53 oraz przeprowadzono reakcję PCR w celu amplifikacji genu 16S rDNA. Uzyskany produkt PCR został zsekwencjonowany. Uzyskaną w ten sposób sekwencję genu 16S rDNA szczepu N53 przedstawia w postaci jednej górnej nici figura 1. Dzięki porównaniu uzysk anej sekwencji 16S rDNA szczepu N53, możliwe było porównanie sekwencji genu z użyciem programu internetowego BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) z innymi znanym genami 16S rDNA. W wyniku przeprowadzonych porównań określono największy stopień homologii 16S rDNA szczepu N53 i wynoszący 99% identyczności do anaerobowych bakterii termofilnych z rodzaju Thermoanaerobacterium tj. T. thermosaccharolyticum szczep W16 oraz T. thermosaccharolyticum szczep GD17. W celu porównania wydajności fermentacji glicerolu przez inne bakterie termofilne z gatunku Therm oanaerobacterium thermosaccharolyticum przeprowadzono próby fermentacji na podłożu zawierających glicerol w ilości 10 g/l dla szczepów T. thermosaccharolyticum DSM 571-, DSM 572, DSM 573, DSM 869, DSM 7416, ATCC 25773, ATCC 27384, ATCC 31907, ATCC 31908, ATCC 31909, ATCC 31925, ATCC 31960, ATCC 7956 pochodzących z publicznych kolekcji szczepów takich jak DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH oraz LGC Standards (dawniej American Type Culture Colection, USA). Wszystkie badane kultury bakterii pochodzących z publicznych kolekcji wykazywały ograniczony wzrost na podłożu zawierającym glicerol oraz ograniczoną produkcję butanolu, etanolu, kwasu mlekowego i wodoru nie przekraczającą odpowiednio ilości 2,1 g/l, 1,5 g/l, 0,6 g/l i 80 ml z 20 ml hodowli komórkowej.

Szczep N53 został wykorzystany następnie w sposobie fermentacji glicerolu do wodoru, butanolu, etanolu i mleczanu. W procesie tym glicerol jest mieszany z medium hodowlanym w stężeniu od 5 do 100 g/l, a następnie fermentowany w temperaturze od 50 do 65°C do butanolu, etanolu, mleczanu i wodoru. W procesie tym powstają również śladowe ilości kwasu octowego. Wyprodukowane alkohole są w sposób ciągły usuwane ze środowiska procesu fermentacji przez odpędzanie ich znad m e₃ dium hodowlanego przeponową pompą cyrkulacyjną o wydajności 1 m /h ze zbiornika fermentacyjnego i schładzane poza układem fermentacyjnym do temperatury od -20 do +10°C. W zależności od warunków procesu fermentacji takich jak temperatura, poziom stabilizowanego pH, stężenia glicerolu oraz kontroli ciśnienia w bioreaktorze możliwe jest racjonalne kierowanie wydajnościami poszczególnych produktów fermentacji. Prowadzenie procesu fermentacji przy stabilizacji pH na poziomie 6,5 oraz niskim ciśnieniu od 0,02 do 0,2 Bar prowadzi do powstawania jako produktów fermentacji głównie etanolu oraz wodoru. Również obniżenie temperatury procesu do 50°C prowadzi do uzyskiwania większej ilości etanolu oraz wodoru. Natomiast podniesienie temperatury procesu do 62°C, podniesienie ciśnienia powyżej 0,5 Bar i stabilizacja pH na poziomie 5,8 prowadzi do powstawania w procesie fermentacji glicerolu większej ilości butanolu i obniżonej produkcji wodoru oraz etanolu i kwasu mlekowego. Aby proces fermentacji przebiegał stabilnie i powstające produkty fermentacji, głównie alkohole, nie powodowały inhibicji wzrostu drobnoustrojów wprowadzono obieg ciągłego odpędzania par alkoholi, które są skraplane w zewnętrznym kondensorze schłodzonym od -20 do 10°C. Prowadzenie fermentacji w temperaturze powyżej 50°C pozwala na wydajną separacją alkoholi i w efekcie ich wydajną produkcję. Opracowany sposób fermentacji pozwala na wykorzystanie różnych rodzajów gliceryny uzyskiwanej w procesie produkcji bio-diesla uzyskiwanego z różnych rodzajów olejów roślinnych takich jak olej rzepakowy, słonecznikowy, palmowy, sojowy i inne.

Istota wynalazku zostanie wyjaśniona bliżej na podstawie figury 2, gdzie przedstawiono schemat technologiczny przykładowego urządzenia do prowadzenia procesu fermentacji glicerolu z udziałem termofilnego szczepu bakterii N53 z rodzaju Thermoanaerobacterium. Urządzenie do procesu składa się ze zbiornika ciśnieniowego (1) z płaszczem (2), mieszadłem mechanicznym (3) oraz beł8

PL 214 785 B1 kotką (4). Do zbiornika (1) podawane są roztwory glicerolu z zasobnika (5) za pomocą pompy (6), oraz roztwór zasady z zasobnika (7) podawanej za pomocą pompy (8). Umieszczona w zbiorniku (1) bełkota (4) jest zasilana azotem lub mieszaniną azotu i dwutlenku węgla w proporcjach objętościowych 80:20 z butli (9) zawierającej zawór redukcyjny (10). Zbiornik (1) jest połączony obiegiem zamkniętym z chłodzonym kondensatorem oparów (11) zaopatrzonym w zawór wylotowy (12). Obieg oparów jest wymuszany działaniem pompy (13). Dodatkowo w zbiorniku (1) umieszczony jest zawór (14) w celu wprowadzenia inokulum.

Przygotowaną pożywkę umieszcza się w zbiorniku (1) w ilości maksymalnej 75% całkowitej objętości zbiornika. Następnie uruchamia się mieszadło (3) oraz otwiera się zawór redukcyjny (10) w celu wtłoczenia inertnych gazów z butli (9) i usunięcia obecnego w pożywce i instalacji tlenu tak aby jego stężenie nie przekraczało 1%. W trakcie procesu przedmuchiwania instalacji uruchomiona zostaje również pompa (13) oraz otwarty zawór (12) kondensora (11). Po zakończeniu procesu usuwania tlenu zamyka się kolejno zawór (12) kondensora (11) i zawór (10) na butli (9) oraz wyłącza się pompę (13). Pożywkę w szczelnie zamkniętym zbiorniku (1) podgrzewa się w celu sterylizacji z użyciem przegrzanej pary wodnej dostarczanej do płaszcza (2). Po zakończeniu procesu sterylizacji, pożywkę ochładza się do temperatury 50-65°C przez wprowadzenie zimnej wody do płaszcza (2) zbiornika (1). W trakcie procesu chłodzenia otwiera się ponownie zawór (10) na butli (9) oraz zawór (12) na kondensorze oparów (11), jak również włącza się pompę obiegową (13) w celu zabezpieczenia instalacji fermentacyjnej przed dostaniem się tlenu na skutek wytworzonego w podczas schładzania podciśnienia. Po schłodzeniu pożywki w zbiorniku (1) i doprowadzeniu do odpowiedniego pH za pośrednictwem gazu z butli otwarty zostaje zawór inokulacyjny (14) w celu wprowadzenia aktywnej termofilnej kultury bakteryjnej. Po wprowadzeniu zawiesiny komórek, zawór (14) zostaje zamknięty. Następnie zamykany jest zawór (12) kondensora (11) oraz zawór na butli (9). Zawór (12) na kondensorze (11) jest sterowany przez elektroniczny nastawny manometr mierzący ciśnienie w zbiorniku (1). W wyniku procesu fermentacji dochodzi do produkcji mieszaniny dwutlenku węgla i wodoru, która jest upuszczana za pośrednictwem zaworu (12) kondensora (11) w zależności od nastawionego ciśnienia w zbiorniku fermentacyjnym (1). W trakcie procesu fermentacji obniża się również pH pożywki w zbiorniku (1) na skutek produkowanych kwasów octowego i mlekowego co prowadzi do automatycznego uruchomienia pompy (8) w celu równoważenia zadanego pH przez dodatek roztworu alkali ze zasobnika (7). W miarę wyczerpywania się glicerolu w wyniku fermentacji w zbiorniku (1) wprowadzony zostaje świeży roztwór glicerolu z zasobnika (5) za pośrednictwem pompy (6). W trakcie procesu fermentacji w zbiorniku (1) chłodzenie kondensora (11) oraz pompa obiegowa (13) jest ciągle włączona. Gromadzące się w zbiorniku (1) opary alkoholi są przenoszone za pośrednictwem pompy (13) i skraplane w schłodzonym kondens orze (11). Produkowana mieszanina gazów dwutlenku węgla i wodoru jest uwalniana zaworem (12) kondensora (11). Proces fermentacji glicerolu może być prowadzony jako okresowy (ang. batch), okresowy z dokarmianiem (ang. fed-batch) lub też ciągły przez podawanie świeżej pożywki i odbieranie przefermentowanego medium wraz z masą komórkową. Obecność kondensora (11) pozwala na wydajne usuwanie toksycznych alkoholi z medium fermentacyjnego oraz prowadzenie procesu w sposób ciągły.

Opis wynalazku został przedstawiony w następujących przykładach

P r z y k ł a d 1. Izolacja szczepu Thermoanaerobacterium sp. N53

Pobrane ze środowiska próbki z aktywnych biologicznie osadów ze zbiornika do produkcji biogazu podzielono na 50 małych porcji o masie około 1 g i umieszczono w ampułkach 20 ml, a następnie zamknięto szczelnie korkiem i zakapslowano. Każdą z tak przygotowanych fiolek przedmuchano 5 min mieszaniną gazową azotu i dwutlenku węgla w stosunku objętościowym 80:20 (gaz Biogon C20). Następnie do każdej z fiolek wstrzyknięto z użyciem strzykawki z igłą po 10 ml uprzednio przygotowaną w anaerobowych warunkach pożywkę AA1 uzyskaną z kolejno mieszanych roztworów i wody na 1 litr: 916 ml wody destylowanej; 10 ml roztwór A1 (NH 4CI (100 g/l), NaCI (10 g/l), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l)); 2 ml roztwór B (K2HPO4 x 3H₂O (200 g/l)); 1 ml roztwór C (Rezazuryna (0,5 g/l)); 1 ml roztwór D (ZnCI₂ (50 mg/l), MnCI₂ x H₂O (38 mg/l), CoCI₂ x 2H₂O (50 mg/l), H₃BO₃ (50 mg/l), CuCI₂ x 2H₂O (50 mg/l), NiCI₂ x 6H₂O (92 mg/l), FeCI₂ x 2H₂O (2308 mg/l), (NH4^Mo7O₂4 x 4H₂O (50 mg/l), EDTA (500 mg/l)); cysteina (0,5 g); ekstrakt drożdżowy (5 g); 50 ml NaHCO₃ (56 g/l) oraz dodano 10 g gliceryny technicznej 95% pochodzącej z produkcji bio-diesla na bazie oleju rzepakowego. Tak przygotowaną pożywkę przedmuchano 15 min mieszaniną gazową Biogon C20, a następnie szczelnie zamknięto i autoklawowano. Próbki umieszczono w inkubatorze o temperaturze

PL 214 785 B1

55°C inkubowano przez 7 dni. Wzrost drobnoustrojów był obserwowany poprzez monitorowanie ciśnienia w próbkach z użyciem mikromanometru. Próbki wykazujące podwyższone ciśnienie przenoszono na świeżą pożywkę AA1 za pomocą strzykawki z igłą w ilości 1 ml na 10 ml pożywki umies zczonej w anaerobowej fiolce i dalej prowadzono hodowle. Proces ten powtarzano jeszcze 5-ciokrotnie. Wybrano 4 próbki wykazujące najlepszy wzrost na podłożu z glicerolem i przeprowadzono analizy HPLC. Analizę HPLC przeprowadzono z użyciem następujących parametrów: kolumna: Aminex HPX87H (Biorad), 300 mm x 7,8 mm: Temperatura kolumny: 60°C; Faza ruchoma: 0,005M H₂SO₄; Przepływ fazy ruchomej: 0,6 ml/min; Detekcja: RID, temp. 40°C oraz DAD 210 nm; użyte wzorce kwas mlekowy, glicerol, kwas octowy, kwas mlekowy, etanol, butanol; ilość próbki 20 μΙ. Hodowle, w których wykryto obecność butanolu, etanolu w ilościach przekraczających stężenie 1 g/l przeniesiono z użyciem posiewu redukcyjnego na płytki z podłożem AA1 zawierającym 10 g/l glicerolu zestalonym 2% agarem. Wszystkie czynności wykonywano w komorze do pracy anaerobowej wypełnionej mieszaniną gazową Biogon C20. Płytki inkubowano w warunkach anaerobowych w temperaturze 50°C przez okres 3 dni. Po tym czasie zaobserwowano wzrost kolonii. Każdą z kolonii pojedynczo przenoszono w warunkach anaerobowych do fiolek zawierających 10 ml podłoża AA1 z glicerolem od 5 do 10 g/l o pH podłoża od 4,5 do 8,0. Płynne hodowle (20 μΙ) analizowano ponownie z użyciem techniki HPLC na obecność butanolu oraz etanolu. Hodowla wykazująca największe wydajności produkcji butanolu tj. 0,5 g butanolu na 1 g skonsumowanego glicerolu została ponownie przesiana na płytkę z podłożem stałym w celu selekcji kolonii i zapewnienia homogenności kultury bakteryjnej. Pojedyncze kolonie przesiano ponownie na 10 ml podłoża płynnego AA1 z dodatkiem glicerolu o stężeniu 10 g/I. Uzyskano cztery hodowle, które analizowano ponownie techniką HPLC w celu potwierdzenia obecności butanolu i etanolu. 5 ml każdej z hodowli odwirowano 5000 obr/min przez 5 min i następnie wyizolowano genomowe DNA z użyciem zestawu do izolacji genomowego DNA Genomie Mini AX firmy A&A Biotechnology. Uzyskane DNA genomowe (100 ng) z każdej z 4 hodowli posłużyło do amplifikacji fragmentu genu 16S rDNA z użyciem 2xPCR MasterMix (A&A Biotechnology) oraz 10 pmoli każdego ze starterów BacFor o sekwencji 5'GAG TTT GAT CCT GGC TCA G 3' oraz BacRev o sekwencji 5' ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT 3'. Z każdej z próbek genomowego DNA uzyskano produkt reakcji PCR o długości około 1500 pz. Produkt analizowano z użyciem elektroforezy agarozowej w 1% żelu agarozowym i następnie oczyszczano z użyciem zestawu Gel-Out firmy A&A Biotechnology. Uzyskano 1 pg każdego z produktów i następnie sekwencjonowano zużyciem starterów BacFor i BacRev. Wszystkie analizowane sekwencje DNA były identyczne. Sekwencje fragmentu genu 16S rDNA przedstawiono na figurze 1. W celu identyfikacji drobnoustroju przeprowadzono porównanie uzyskanej sekwencji DNA z bazą danych sekwencji GenBank™ za pomocą programu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Analizowana sekwencja DNA wykazywała 99% zgodności ze znalezioną w bazie danych sekwencją DNA genu 16S rDNA organizmów Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum szczep W16 oraz Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum szczep GD17. Na podstawie powyższych analiz nazwano wyizolowaną kulturę bakteryjną mającą zdolność fermentacji glicerolu szczep N53 Thermoanaerobacterium sp.

P r z y k ł a d 2. Badanie wydajności fermentacji glicerolu przez szczep Thermoanaerobacterium sp. N53.

Badanie wydajności i stabilności produkcji mleczanu, octanu, etanolu, butanolu oraz wodoru w hodowli stacjonarnej wyizolowanego szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. przeprowadzono na niezależnych próbek hodowli oznaczonych AA3 oraz AA5. Hodowle prowadzono w warunkach anaerobowych w temperaturze 60°C z użyciem podłoża AA1 zawierającego 10 g/l glicerolu, w którym zmieniano w trakcie przygotowania roztwór A1 (NH₄CI (100 g/l), NaCI (10 g/l), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5g/l)) na roztwory kolejno: A2: NH4CI (10 g/I), NaCI (1 g/l), MgCI₂ x H₂O(10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l); A3: NH 4CI (100 g/l), NaCI (1 g/l), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l); A4: NH4CI (100 g/l), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l); A5: NH 4CI (10 g/I), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l); A6: NaCI (10 g/l), MgCl₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5 g/l); A7: NaCI (1 g/l), MgCI₂ x H₂O (10 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (5g/l). Po 48 h inkubacji, próbki hodowli analizowano z użyciem techniki HPLC jak opisano w przykładzie 1. Analizę wodoru w przestrzeni nad pożywką przeprowadzono w oparciu o chromatografię gazową na kolumnie: Molecular Sieve, średnica ziaren 100/120, 1,5m x 1,4”Cu (Mikrolab); temperatura kolumny: 50°C, gaz nośny: N2; przepływ gazu nośnego: 50 ml/min; detekcja: TCD. Określono zawartość procentową wodoru, która wynosiła od 10 do 60% oraz zmierzono i wyliczono jego objętość. Wyniki analiz zostały przedstawione w formie tabeli 1. W toku tych prac ustalono, że czynnikiem limitującym wzrost komórek jest wysokie stężenie NH₄CI.

PL 214 785 B1

W toku doświadczeń przeprowadzono próby na hodowlach komórek szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. zawierających 0, 1,5, 10, 20 i 30 g/l NH₄CI. Aktywność wzrostu komórek badano mikromanometrem. Jak wykazały przeprowadzone badania hodowle komórek bakteryjnych wykazały wzrost dla stężeń 0, 1,5, 10, 20 g/l NH4CI.

T a b e l a 1. Wyniki analizy HPLC oraz GC produktów fermentacji 10 g/l glicerolu w hodowlach stacjonarnych szczepu N53 Thermoanaerobacter sp.

Nr próbki/ podłoże	mleczan (g/l)	octan (g/l)	etanol (g/l)	butanol (g/l)	wodór (ml)
AA3/A1	0,73	0,39	3,55	3,92	170
AA3/A2	1,02	0,65	0,81	4,73	568
AA3/A3	1,03	0,69	1,41	4,64	557
AA3/A4	1,04	0,37	3,07	4,14	497
AA3/A5	0,72	0,49	3,22	4,28	514
AA3/A6	1,17	0,45	1,79	4,51	541
AA3/A7	1,21	0,69	0,99	4,73	568
AA5/A1	1,34	0,92	3,37	4,96	586
AA5/A2	1,25	0,86	1,75	4,74	546
AA5/A3	1,34	0,92	5,02	5,05	610
AA5/A4	1,16	0,75	2,92	3,97	147
AA5/A5	1,35	0,68	0,88	4,79	560
AA5/A6	1,39	0,77	1,64	4,87	586
AA5/A7	1,42	0,75	0,72	4,72	566

P r z y k ł a d 3. Proces fermentacji glicerolu w hodowli stacjonarnej z użyciem fermentora o pojemności 35 litrów przy stałym nadciśnieniu 0,02 do 3 bar.

W celu zbadania procesu fermentacji w warunkach kontrolowanego wzrostu przygotowano 1 litr hodowli szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. Hodowlę prowadzono w 500 ml butelkach wypełnionych 200 ml pożywki AA1 zawierającej 20 g/l gliceryny technicznej o zawartości glicerolu (95%). Hodowlę prowadzono 24 h w warunkach anaerobowych w temperaturze 60°C. Następnie napełniono zbiornik (1) o pojemności całkowitej 35 litrów 10 litrami podłoża AA1 zawierającego 30 g/l gliceryny technicznej o zawartości glicerolu 95%. Tak przygotowane podłoże przedmuchano mieszaniną gazową Biogon C20 w celu usunięcia tlenu. Stwierdzono, że zawartość rozpuszczonego w pożywce tlenu musi być niższa niż 1%. Wyższe stężenia tlenu poważnie inhibują rozwój szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. Pożywkę sterylizowano mieszając w temperaturze 120°C przez 20 min, a następnie schłodzono do 60°C. Tak przygotowane jałowe podłoże zaszczepiono 1 litrem uprzednio przygotowanej 24 godzinnej hodowli szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. przez zawór do wprowadzania inokulum (14). Hodowlę prowadzono utrzymując stałe nadciśnienie o wartości 1 bar, mieszanie 80 obr/min oraz stałą wartość pH 6,5 dzięki systemowi podawania 2 M NaOH z zasobnika (7) z użyciem pompy (8). Wynik przebiegu procesu fermentacji został przedstawiony w postaci figury 3. Skład mieszaniny fermentacyjnej analizowano z użyciem techniki HPLC, jak opisano w przykładzie 1. Na podstawie analizy GC, jak w przykładzie 2, określono zawartość wodoru na 45%, a objętość wodoru wyprodukowanego w czasie fermentacji wynosiła 115 litrów. Zaobserwowano znaczące obniżenie wydajności produkcji gazu i wzrostu komórek z chwilą osiągnięcia w fermentorze stężenia butanolu

7,6 g/l, etanolu 5,2 g/l, mleczanu 2,9 g/l po 100 godzinach fermentacji. Wyniki analiz powstających produktów w trakcie fermentacji przedstawiono na figurze 3.

P r z y k ł a d 4. Proces fermentacji glicerolu w hodowli stacjonarnej z dokarmianiem z użyciem fermentora o pojemności 35 litrów przy nadciśnieniu 0,2 bar.

Pożywkę w zbiorniku (1) przygotowano, zaszczepiono jak w przykładzie 3. Hodowlę prowadzono utrzymując stałe nadciśnienie o wartości 0,2 bar, mieszanie 80 obr/min, oraz stałą wartość pH 6,5

PL 214 785 B1 dzięki systemowi podawania 2 M NaOH z zasobnika (7) za pomocą pompy (8). Dodatkowo w czasie procesu fermentacji z zasobnika (5) podawano roztwór glicerolu o stężeniu 100 g/l w jałowej pożywce AA1 za pomocą pompy (6). W czasie 98 godzin fermentacji uzyskano 158 litrów wodoru, a stężenie poszczególnych produktów fermentacji glicerolu wynosiło odpowiednio: 8,2 g/l butanolu, 6,7 g/l etanolu, 3,2 g/l mleczanu.

P r z y k ł a d 5. Badanie inhibicji wzrostu hodowli komórkowej szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. w obecności wysokich stężeń butanolu i etanolu.

Tak jak w przykładzie 1, przygotowano pożywkę AA1 zawierającą 10 g/l glicerolu oraz odpowiednio 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 20 g/l butanolu w każdej z fiolek oraz pożywkę AA1 zawierającą 10 g/l glicerolu i odpowiednio 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30 i 40 g/l etanolu. Pożywki zaszczepiono 5% objętością świeżej hodowli szczepu N53 Thermoanaerobacterium sp. Po 24, 48 i 96 godzinach dokonano pomiaru ciśnienia z użyciem mikromanometru we fiolkach w celu detekcji aktywności hodowli komórek. Produkcję gazu zaobserwowano we fiolkach zawierających 1,2, 3, 4 , 6, 8, 10, 14 g/l butanolu oraz 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 30 g/l etanolu.

P r z y k ł a d 6. Proces fermentacji glicerolu w hodowli ciągłej z użyciem fermentora o pojemności 35 litrów wraz odpędzaniem fazy alkoholowej.

Przygotowano 15 litrów pożywki w zbiorniku (1) i zaszczepiono tak jak w przykładzie 3. Hodowlę prowadzono utrzymując stałe nadciśnienie o wartości 0,5 bar, mieszanie 80 obr/min oraz stałą wartość pH 5,8 dzięki systemowi podawania 0,5 M NaOH ze zasobnika (7) za pomocą pompy (8). Dodatkowo w czasie procesu fermentacji z zasobnika (5) podawano roztwór glicerolu o stężeniu 100 g/l w jałowej pożywce AA1 za pomocą pompy (6). Do zbiornika podłączono chłodzony do temperatury 0-4°C kon₃ denser (11) wraz z pompą (13) o wydajności 1 m /h wymuszającą obieg par znad pożywki przez kondenser (11). Ciśnienie w zbiorniku fermentora regulowano za pomocą zaworu redukcyjnego (12). W trakcie procesu uzupełniano hodowlę w zbiorniku (1) świeżą pożywką z zasobnika (5) jak i odbierano taką samą ilość pożywki przefermentowanej ze zbiornika (1). W wyniku procesu 98 godzinnej fermentacji stwierdzono ciągły wzrost drobnoustrojów i produkcję wodoru w całkowitej ilości 185 litrów oraz stały utrzymujący się poziom stężenia butanolu od do 4,5 g/l, etanolu od 2,5 do 3,2 g/l oraz wzrastający poziom stężenia mleczanu i osiągający stężenia 5,2 g/l w zbiorniku (1) w podłożu hodowlanym. W zbiorniku kondensora (11) zgromadziło się w tym czasie 500 ml kondensatu zawierającego

32,4 g/l butanolu oraz 12,5 g/l etanolu.

Claims (11)

1. Sposób termofilnej anaerobowej fermentacji glicerolu, znamienny tym, że: hodowla komórek bakterii termofilnych z gatunku Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum szczepów N53, DSM 571, DSM 572, DSM 573, DSM 869, DSM 7416, ATCC 25773, ATCC 27384, ATCC 31907, ATCC 31908, ATCC 31909, ATCC 31925, ATCC 31960, ATCC 7956 w warunkach anaerobowych w temperaturze od 50 do 65°C przekształca zredukowaną pożywkę zawierającą glicerol o stężeniu od 5 do 100 g/l w butanol, etanol i wodór.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że glicerol jest przekształcany w kwas mlekowy i kwas octowy.

3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że proces fermentacji jest prowadzony przy nadciśnieniu w komorze fermentacyjnej od 0,02 do 3 bar.

4. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że proces fermentacji jest prowadzony przy pH utrzymywanym w zakresie 4,5 do 8,0.

5. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stężenie butanolu w hodowli komórek jest mniejsze niż 14 g/l.

6. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stężenie etanolu w hodowli komórek jest mniejsze niż 30 g/l.

7. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że wytwarzany wodór stanowi od 10 do 60% objętości wytwarzanej mieszaniny gazów.

8. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stężenie NH₄CI nie przekracza stężenia 20 g/l w pożywce.

9. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stężenie rozpuszczonego tlenu w pożywce jest mniejsze niż 1 %.

PL 214 785 B1

10. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że w skład pożywki do fermentacji glicerolu wchodzą związki o stężeniach: MgCI₂ x H₂O (0,1 g/l), CaCI₂ x 2H₂O (0,05 g/l); K₂HPO₄ x 3H₂O (0,4 g/l); ZnCI₂ (0,02 mg/l), MnCI₂ x H₂O (0,038 mg/l), CoCI₂ x 2H₂O (0,02 mg/l), H3BO3 (0,02 mg/l), CuCI₂ x 2H₂O (0,02 mg/l), NiCI₂ x 6H₂O (0,092 mg/l), FeCI₂ x 2H₂O (2,308 mg/l), (N^^MoyO^ x 4H₂O (0,05mg/l), EDTA (0,5 mg/l)); NaHCO3 (2,6 g/l).

11. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że produkowane alkohole butanol i etanol są odpędzane z aktywnej hodowli komórek i skraplane w zewnętrznym zbiorniku, gdzie są schładzane do temperatury od -20 do 10°C.