PL208422B1 - New strain Lactobacillus rhamnosus - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus.The subject of the invention is a new strain of Lactobacillus rhamnosus.

W europejskim opisie patentowym EP 199535 opisano szczep Lactobacillus rhamnosus nazwany GG zdeponowany w ATCC pod numerem 53103. Szczep Lactobacillus rhamnosus GG przeznaczony jest do stosowania u ludzi i zwierząt w celu leczenia lub profilaktyki przewodu pokarmowego. Znany jest z amerykańskiego opisu patentowego nr US 2005074440 nowy szczep Lactobacillus rhamnosus CCRC 910145 (PTA-2406). Szczep ten użyty jest do kompozycji z probiotycznymi szczepami wybranymi z grupy. Z polskiego zgłoszenia patentowego nr 338775 znana jest biologicznie czysta kultura Lactobacillus rhamnosus HN001 nr depozytu AGAL NM97/09514 i Lactobacillus rhamnosus HN067 nr depozytu AGAL NM97/01925. Wymienione bakterie kwasu mlekowego mają korzystny wpływ na odporność organizmów.EP 199535 describes a Lactobacillus rhamnosus strain named GG deposited with the ATCC under the number 53103. The Lactobacillus rhamnosus GG strain is intended for use in humans and animals for the treatment or prophylaxis of the gastrointestinal tract. A new strain of Lactobacillus rhamnosus CCRC 910145 (PTA-2406) is known from US patent description US 2005074440. This strain is used in the composition with probiotic strains selected from the group. From the Polish patent application No. 338775 there is known a biologically pure culture of Lactobacillus rhamnosus HN001 deposit number AGAL NM97 / 09514 and Lactobacillus rhamnosus HN067 deposit number AGAL NM97 / 01925. The listed lactic acid bacteria have a beneficial effect on the immunity of organisms.

Celem wynalazku jest wyselekcjonowanie bakterii z rodzaju Lactobacillus o silnych właściwościach probiotycznych. Szczep powinien posiadać bardzo dobre właściwości probiotyczne, który będzie miał silniejsze oddziaływanie na przewód pokarmowy niż szczepy stosowane obecnie.The aim of the invention is to select bacteria of the Lactobacillus genus with strong probiotic properties. The strain should have very good probiotic properties, which will have a stronger effect on the gastrointestinal tract than the strains currently used.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A PCM B/00011.The essence of the invention is a new strain of Lactobacillus rhamnosus KL53A PCM B / 00011.

1. Identyfikacja szczepów.1. Identification of strains.

Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A pochodzi z przewodu pokarmowego zdrowych noworodków karmionych mlekiem matki. Szczep został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, 53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12. Depozyty złożono w dniu 16.06 2005 r. Depozytowi nadano numer: Lactobacillus rhamnosus KL53A - numer depozytu - B/00011.The new Lactobacillus rhamnosus KL53A strain comes from the gastrointestinal tract of healthy newborns fed with mother's milk. The strain was deposited in accordance with the Budapest Treaty at the Polish Collection of Microorganisms (PCM) at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences, 53-114 Wrocław, ul. Rudolf Weigl 12. Deposits were made on June 16, 2005. The deposit was given the number: Lactobacillus rhamnosus KL53A - deposit number - B / 00011.

2. Oznaczanie przynależności gatunkowej szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A.2. Determination of species affiliation of the Lactobacillus rhamnosus KL53A strain.

Szczep poddany był szczegółowym badaniom potwierdzającym jego właściwości probiotyczne. W tym celu okreś lono jego przynale ż ność gatunkową metodami fenotypowymi (zestaw API 50CHL i API 20A) i genotypowymi (metoda PCR), ponadto wykonano sekwencjonowanie podjednostki 16 S rRNA.The strain was subjected to detailed tests confirming its probiotic properties. For this purpose, its species identity was determined by phenotypic (API 50CHL and API 20A kit) and genotypic (PCR method) methods, and the 16 S rRNA subunit was sequenced.

Wykazano metodami fenotypowymi i genotypowymi, że szczep należy do następującego gatunku: KL53A - Lactobacillus rhamnosus.It was demonstrated by phenotypic and genotypic methods that the strain belongs to the following species: KL53A - Lactobacillus rhamnosus.

3. Oznaczanie antagonistycznych właściwości szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A wobec typowych czynników patogennych przewodu pokarmowego za pomocą metody słupkowej.3. Determination of antagonistic properties of Lactobacillus rhamnosus KL53A strain against typical pathogenic factors of the gastrointestinal tract using the bar method.

Badanie antagonizmu przeprowadzono za pomocą metody słupkowej. Wybrano drobnoustroje wskaźnikowe (Tabela 1), które stanowią tlenowe i beztlenowe czynniki patogenne zakażeń ludzkiego przewodu pokarmowego, oraz stanowią element składowy lokalnej flory przewodu pokarmowego (wybrane gatunki Lactobacillus i Bifidobacterium).Antagonism testing was performed using the bar method. Indicator microorganisms were selected (Table 1), which are aerobic and anaerobic pathogens of human gastrointestinal tract infections and constitute a component of the local flora of the gastrointestinal tract (selected Lactobacillus and Bifidobacterium species).

T a b e l a 1: Antagonizm szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53 A względem szczepów wskaźnikowych.T a b e l a 1: Antagonism of the Lactobacillus rhamnosus KL 53 A strain against the indicator strains.

Szczepy wskaźnikowe Indicator strains Strefa zahamowania wzrostu / skala zahamowania wzrostu Growth inhibition zone / scale of growth inhibition Stapylococcus aureus ATTC 25923 Stapylococcus aureus ATTC 25923 18 mm / 2 18 mm / 2 Salmonella enteritidis Salmonella enteritidis 22 mm / 3 22 mm / 3 Shigella sonnei Shigella sonnei 30 mm / 4 30 mm / 4 Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus GG 14 mm / 1 14 mm / 1 Lactobacillus plantarum DSMZ 20174 Lactobacillus plantarum DSMZ 20174 10 mm / 1 10 mm / 1 Bifidobacterium longum DSMZ 20219 Bifidobacterium longum DSMZ 20219 20 mm / 2 20 mm / 2 Campylobacter jejuni ATCC 29428 Campylobacter jejuni ATCC 29428 35 mm / 4 35 mm / 4 Helicobacter pylori DSMZ 4867 Helicobacter pylori DSMZ 4867 30 mm / 4 30 mm / 4 Clostridium difficile Clostridium difficile 22 mm / 3 22 mm / 3

PL 208 422 B1PL 208 422 B1

Skala zahamowania wzrostu:Scale of growth inhibition:

- Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 12-16 mm 2 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 17-21 mm 3 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 22-26 mm 4 - Ś rednica strefy zahamowania wynosi: 27-35 mm- The diameter of the braking zone is: 12-16 mm 2 - The diameter of the braking zone is: 17-21 mm 3 - The diameter of the braking zone is: 22-26 mm 4 - The diameter of the braking zone is: 27-35 mm

Badany szczep wykazuje bardzo silne antagonistyczne właściwości wobec bakterii wskaźnikowych należących do rodzajów: Campylobacter, Helicobacter, Shigella, zaś silne antagonistyczne właściwości zaznaczają się wobec rodzajów: Clostridium i Salmonella. Średnie właściwości antagonistyczne zaznaczają się wobec bakterii Gram dodatnich tzn. Staphylococcus i Bifidobacterium. Ponadto wykazano brak hamujących aktywności badanego szczepu wobec innych bakterii z rodzaju Lactobacillus (skala zahamowania wzrostu równa 1), co ma istotne znaczenie przy ustalaniu wzajemnych relacji (brak konkurencji) z tymi gatunkami Lactobacillus, które drogą naturalną skolonizowały przewód pokarmowy człowieka.The tested strain shows very strong antagonistic properties against indicator bacteria belonging to the genera: Campylobacter, Helicobacter, Shigella, and strong antagonistic properties are visible against the genera: Clostridium and Salmonella. Moderate antagonistic properties are marked against Gram-positive bacteria, ie Staphylococcus and Bifidobacterium. In addition, the lack of inhibitory activity of the tested strain against other bacteria of the Lactobacillus genus (scale of growth inhibition equal to 1) was shown, which is important in establishing mutual relations (no competition) with those Lactobacillus species that naturally colonized the human gastrointestinal tract.

4. Oznaczanie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX.4. Determination of the adherence properties of Lactobacillus rhamnosus KL53A strain to the HT-29MTX human tissue line.

Oznaczenie właściwości adherencyjnych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A zostało przeprowadzone na ludzkiej linii komórek jelitowych HT-29MTX. Działanie metotrexatu (MTX) indukuje tkankę HT-29 do wydzielania zwiększonej ilości śluzu, dzięki czemu ten model tkankowy bardziej przypomina naturalne właściwości jelita grubego zdrowego człowieka. Hodowlę tkankową prowadzono metodą wielokrotnych pasaży przez okres 20 dni do uzyskania jednolitej warstwy (monolayer). Stosowano podłoże DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), wzbogacone dodatkiem 10% inaktywowanej, płodowej surowicy cielęcej. Ponadto, podłoże to zawierało 3 mM/ml L-glutaminy oraz antybiotyki: 100 μg/ml^-1 streptomycyny i 100 U/ml^-1 penicyliny. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności zawierającej 10% CO2, zmieniając podłoże odżywcze 2 razy w tygodniu. Zliofilizowany szczep Lactobacillus rhamnosus KL 53A zawieszano w 10 ml bulionu MRS i inkubowano przez pół godziny w cieplarce, w temperaturze 37°C, a następnie sprawdzono gęstość szczepu za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń. Do testu adherencji pobrano 500 μl szczepu o gęstości około 2x10⁹ i 500 μl płynu hodowlanego DMEM. Tak przygotowany szczep dodawano do dołków zawierających komórki Ht-29MTX. Komórki linii tkankowej wraz z badanym szczepem inkubowano w temperaturze 37°C, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 przez 30 minut. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie PBS w celu usunięcia nie przyczepionych bakterii, a następnie utrwalano 3,7% formaldehydem w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po utrwaleniu komórki ponownie przemywano PBS i barwiono fioletem krystalicznym przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Lactobacillus w 20 polach widzenia preparatu. Badanie adherencji szczepu do tkanki HT-29MTX było przeprowadzone dwukrotnie, a końcowy wynik zatem jest średnią powyższych badań.The determination of the adherence properties of the Lactobacillus rhamnosus KL 53A strain was performed on the human intestinal cell line HT-29MTX. The action of methotrexate (MTX) induces HT-29 tissue to secrete an increased amount of mucus, making this tissue model more similar to the natural properties of the healthy human colon. Tissue culture was carried out by the method of multiple passages for a period of 20 days until obtaining a uniform layer (monolayer). DMEM (Dulbecco Minimal Essential Medium) (Gibco), supplemented with 10% inactivated fetal calf serum was used. Moreover, the medium contained 3 mM / ml L-glutamine and antibiotics: 100 μg / ml ^-1 streptomycin and 100 U / ml ^-1 penicillin. Cultures were carried out at 37 ° C in an atmosphere with increased humidity containing 10% CO2, changing the nutrient medium twice a week. The lyophilized Lactobacillus rhamnosus KL 53A strain was suspended in 10 ml MRS broth and incubated for half an hour in an oven at 37 ° C, and then the strain density was checked by means of decimal dilutions. For the adherence test, 500 µl of the strain with a density of approximately 2x10 ⁹ and 500 µl of DMEM culture fluid were taken. The prepared strain was added to the wells containing Ht-29MTX cells. The cells of the tissue line with the test strain were incubated at 37 ° C in an atmosphere enriched with 10% CO2 for 30 minutes. After incubation, cells were washed twice with PBS to remove non-attached bacteria, and then fixed with 3.7% formaldehyde at room temperature for 1 hour. After fixation, cells were washed again with PBS and stained with crystal violet for 3 minutes. The preparation was examined microscopically at a magnification of 1000 x. Lactobacillus cells were counted in 20 fields of view of the preparation. The HT-29MTX tissue adherence test was performed twice, and the final result is therefore the average of the above studies.

T a b e l a 2. Wynik adherencja szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A do ludzkiej linii tkankowej HT-29MTX.T a b e l a 2. Result adherence of the Lactobacillus rhamnosus KL 53A strain to the HT-29MTX human tissue line.

Badanie Research Stopień adherencji The degree of adherence Badanie I Study I. +++ +++ Badanie II Study II +++ +++

Legenda dotycząca określenia stopnia adherencji do tkanki HT-29-MTX wg standardu wewnętrznego.Legend for determining the degree of adherence to HT-29-MTX tissue according to the internal standard.

Stopień adherencji The degree of adherence Liczba komórek bakteryjnych The number of bacterial cells +++ +++ Powyżej 80 Over 80 ++ ++ Zakres 60-80 Range 60-80 + + Zakres 40-60 Range 40-60 - - Poniżej 40 Below 40

• Liczbę komórek bakteryjnych podaje się jako średnią z 20 pól widzenia w preparacie.• The number of bacterial cells is reported as the average of the 20 fields of view in the slide.

• HT29-MTX do badań stosuje się w postaci hodowli jednowarstwowej.• HT29-MTX for research is used in the form of a single layer culture.

Ś rednia z 20 pól widzenia z dwóch badań wynosiła powyżej 80 komórek bakteryjnych (+++).The mean of the 20 fields of view from the two studies was greater than 80 bacterial cells (+++).

PL 208 422 B1PL 208 422 B1

Zliofilizowany szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A wykazuje duży stopień adherencji do ludzkiej linii komórkowej nabłonka jelitowego HT-29MTX. Tłumaczyć to można faktem, iż zostały one wyizolowane z normalnej mikroflory ustroju ludzkiego.The lyophilized Lactobacillus rhamnosus strain KL53A shows a high degree of adherence to the human intestinal epithelial cell line HT-29MTX. This can be explained by the fact that they were isolated from the normal microflora of the human body.

5. Oznaczanie oporności na antybiotyki szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A za pomocą metody dyfuzyjno krążkowej.5. Determination of resistance to antibiotics of the Lactobacillus rhamnosus KL53A strain using the disk diffusion method.

Szczep Lactobacillus rhamnosus oraz jego wzorce posiewano metodą redukcyjną na płytki ze stałym podłożem MRS, a następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godz. Uzyskane w ten sposób pojedyncze kolonie zawieszano w 1 ml płynnego podłoża MRS i inkubowano w tych samych warunkach przez 24 godz. Następnie przy wykorzystaniu soli fizjologicznej doprowadzano gęstość hodowli do 0,5 według skali McFarland'a dla szczepów Lactobacillus. Tak przygotowane zawiesiny bakteryjne rozprowadzano przy użyciu jałowego wacika po całej powierzchni uprzednio przygotowanych płytek ze stałym podłożem MRS w objętości 20 ml. Na płytki nakładano krążki nasycone antybiotykami, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godz.The Lactobacillus rhamnosus strain and its standards were inoculated by reduction method on plates with solid MRS medium, and then incubated under standard anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours. Single colonies obtained in this way were suspended in 1 ml of liquid MRS medium and incubated under the same conditions for 24 hours. The culture density was then adjusted to 0.5 on the McFarland scale for the Lactobacillus strains using saline. The bacterial suspensions prepared in this way were spread with a sterile swab over the entire surface of the previously prepared plates with the solid MRS medium in a volume of 20 ml. The plates were discs impregnated with antibiotics and then incubated anaerobically at 37 ° C for 24 hours.

T a b e l a 3: Wrażliwość badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na antybiotyki oznaczone metodą krążkową wobec szczepów kontrolnychT a b e l a 3: Susceptibility of the tested Lactobacillus rhamnosus KL53A strain to antibiotics determined by the disc method against control strains

Antybiotyk Stężenie Antibiotic Concentration Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus KL53A Lactobacillus rhamnosus KL53A Penicylina 10:L Penicillin 10: L. 38 38 36 36 Ciprofloksacyna 5:L Ciprofloxacin 5: L. 25 25 22 22 Cefaklor 30:L Cefaclor 30: L. 20 twenty 18 18 Doksacyklina 30:L Doxacycline 30: L. 40 40 40 40 Oksycyklina 1:L Oxycycline 1: L. 12 12 11 11 Kotrymoksazol 25:L Cotrimoxazole 25: L. 6 6 6 6 Erytromycyna 15:L Erythromycin 15: L. 40 40 40 40 Ampicylina 10:L Ampicillin 10: L. 21 21 25 25 Klindamycyna 2:L Clindamycin 2: L. 30 thirty 30 thirty Gentamycyna 10:L Gentamicin 10: L. 14 14 14 14 Wankomycyna 30:L Vancomycin 30: L. 6 6 6 6 Metronidazol 5:L Metronidazole 5: L. 6 6 6 6

Oporność szczepów bakterii probiotycznych na leki przeciwbakteryjne jest przedmiotem szczegółowych badań ze względów bezpieczeństwa przyszłych preparatów leczniczych. Chodzi tu głównie o mo ż liwość przeniesienia genów opornoś ci na antybiotyki z podanych w preparacie, ż ywych bakterii na inne składniki flory chorego i rozpowszechnienie genów oporności wśród składników normalnej flory, co może spowodować uniemożliwienie leczenia ewentualnych zakażeń tego chorego lub jego kontaktów. Bakterie z rodzaju Lactobacillus wykazują oporność gatunkową, tzn. oporność, która na stałe związana jest z danym gatunkiem (np. bakterie Lactobacillus acidophilus są zawsze wrażliwe na wankomycynę, zaś np. Lactobacillus rhamnosus są na ten lek zawsze oporne). Oporność na dany antybiotyk pojawiająca się w jednym lub kilku szczepach danego gatunku odbiegająca od generalnej wrażliwości całego gatunku, lub znajdowana w szczepach wyizolowanych od chorego w trakcie leczenia antybiotykiem może oznaczać jednostkowe nabycie cechy oporności na drodze mutacji lub wymiany materiału genetycznego zlokalizowanego na plazmidzie, jest to już oporność plazmidowa (nabyta). Zjawisko nabywania oporności przez bakterie z rodzaju Lactobacillus nie jest korzystne, istnieje bowiem zagrożenie jej przekazywania enterokokom (również drogą plazmidową), które wraz ze szczepami Lactobacillus są naturalnym symbiontem przewodu pokarmowego.The resistance of probiotic bacteria strains to antibacterial drugs is the subject of detailed studies for the safety of future medicinal preparations. It is mainly about the possibility of transferring the antibiotic resistance genes from the live bacteria specified in the preparation to other components of the patient's flora and the dissemination of resistance genes among the components of the normal flora, which may prevent the treatment of possible infections of the patient or his contacts. Lactobacillus bacteria show resistance to species, i.e. resistance that is permanently associated with a given species (e.g. Lactobacillus acidophilus bacteria are always sensitive to vancomycin, and e.g. Lactobacillus rhamnosus are always resistant to this drug). Resistance to a given antibiotic, occurring in one or more strains of a given species, deviating from the general susceptibility of the whole species, or found in strains isolated from the patient during antibiotic treatment, may mean individual acquisition of a resistance trait by mutation or replacement of genetic material located on the plasmid, this is already plasmid resistance (acquired). The phenomenon of acquiring resistance by bacteria of the genus Lactobacillus is not favorable, because there is a risk of its transmission to enterococci (also via plasmid), which, together with Lactobacillus strains, are a natural symbiote of the gastrointestinal tract.

Izolacja DNA chromosomalnego metodą kolumienkowąIsolation of chromosomal DNA by column method

Na zdjęciu (a) widoczny prążek odpowiadający DNA chromosomalnemu (na wysokości prążkaThe photo (a) shows the band corresponding to chromosomal DNA (at the height of the band

23130pz markera wielkości λ/Hind III). Nie widać żadnych prążków poniżej ani powyżej DNA chromoPL 208 422 B1 somalnego, które mogłyby świadczyć o obecności DNA plazmidowego. Kontrolą pozytywną jest szczep Lactobacillus rhamnosus u którego poniżej DNA chromosomalnego (prążek na wysokości 23130pz) widoczne są dodatkowe prążki świadczące o obecności DNA plazmidowego - zdjęcie (b).23130bp of the λ / Hind III size marker). There are no bands below or above the chromosomal DNA that could be indicative of the presence of plasmid DNA. The positive control is the Lactobacillus rhamnosus strain in which additional bands are visible below the chromosomal DNA (band at the level of 23130 bp) indicating the presence of plasmid DNA - photo (b).

Izolacja DNA plazmidowego wg metody O'SullivanIsolation of plasmid DNA according to the O'Sullivan method

Metoda używana do rodzaju Latobacillus i Lactococcus. Na zdjęciu (c) widać niewielkie ilościThe method is used for the genus Latobacillus and Lactococcus. In photo (c) you can see small amounts

DNA chromosomalnego (na wysokości prążka 23130pz markera wielkości λ/Hind III), które pozostało w trakcie izolacji DNA plazmidowego, nie widać prążków odpowiadających wielkością DNA plazmidowemu.The chromosomal DNA (at the 23130bp band of the λ / Hind III size marker) which remained during the isolation of plasmid DNA, no bands corresponding to the size of plasmid DNA are visible.

zdjęcie cphoto c

KL53A PL02 PL03 MKL53A PL02 PL03 M

23130pz23130bp

9416pz9416pz

6557pz6557pz

Lekooporność badanych szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A reprezentuje wzór oporności typowy dla danego gatunku. Ponadto w wyniku zastosowania dwóch metod wykazano brak obecności dodatkowego prążka DNA (poniżej wysokości 23130pz) co może świadczyć o braku obecności DNA plazmidowego.The drug resistance of the tested Lactobacillus rhamnosus KL53A strains represents a pattern of resistance that is typical for a given species. Moreover, as a result of the application of two methods, no additional DNA band was present (below the height of 23130 bp), which may indicate the absence of plasmid DNA.

6. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na niskie pH.6. Determination of Lactobacillus rhamnosus KL53A resistance to low pH.

Badany szczep Lactobacillus rhamnosus namnożono w płynnym podłożu MRS. Hodowlę prowadzono w warunkach beztlenowych w 37°C przez 24 godziny, a po upływie tego czasu, za pomocą dziesiątkowych rozcieńczeń, określono uzyskaną gęstość poszczególnych bakterii. Następnie przyThe tested Lactobacillus rhamnosus strain was grown in the liquid MRS medium. The cultivation was carried out in anaerobic conditions at 37 ° C for 24 hours, after which time the obtained density of individual bacteria was determined by means of decimal dilutions. Then at

PL 208 422 B1 pomocy 1N HCl obniżano pH medium hodowlanego do wartości 1,2 równej wartości pH soku żołądkowego. Hodowle dalej inkubowano przez 20 minut w warunkach beztlenowych w 37°C, a następnie ponownie ją wysiewano w celu określenia stopnia redukcji badanych populacji bakterii pod wpływem niskiego pH.With the aid of 1N HCl, the pH of the culture medium was lowered to a value of 1.2, equal to the pH of the gastric juice. The cultures were further incubated for 20 minutes under anaerobic conditions at 37 ° C and then reseeded to determine the degree of reduction of the tested bacterial populations under the influence of low pH.

T a b e l a 4: Oporność szczepów Lactobacillus na niskie pH.T a b e l a 4: Lactobacillus strain resistance to low pH.

Gęstość bakterii podana w j.t.k./1 ml Bacterial density given in cf./1 ml Szczep Strain Czas wyjściowy Output time 20 min. Inkubacji w pH 1.2 20 min. Incubation at pH 1.2 L. rhamnosus GG L. rhamnosus GG 1 x 10⁸ 1 x 10 ⁸ 1 x 10⁷ 1 x 10 ⁷ L. rhamnosus KL53A L. rhamnosus KL53A 6 x 10⁸ 6 x 10 ⁸ 2,5 x 10⁶ 2.5 x 10 ⁶

7. Oznaczanie oporności szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A na sole żółci.7. Determination of the resistance of the Lactobacillus rhamnosus KL53A strain to bile salts.

W celu oznaczenia oporności badanego szczepu Lactobacillus rhamnosus na sole żółci posłużono się metodą Dashkevicz'a i Feighner'a. Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej [POCH] w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci [OXGAL firmyIn order to determine the resistance of the tested Lactobacillus rhamnosus strain to bile salts, the method of Dashkevicz and Feighner was used. This method consisted in adding to the MRS agar the indicator dye - bromocresol purple [POCH] in the amount of 0.17 g / l and bile salt [OXGAL from

Difco], w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoża MRS posiewano metodą redukcyjną 100 μΐ hodowli badane szczepy Lactobacillus, które następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie szczepów opornych na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte.Difco], in five successive concentrations: 1 g / l, 2 g / l, 5 g / l, 10 g / l, 20 g / l. The tested Lactobacillus strains were inoculated on the solid MRS media prepared in this way by the reduction method and then incubated in standard anaerobic conditions for 48 hours. After the incubation was completed, the colonies of strains resistant to a given concentration of bile salt turned light yellow and the growth medium changed its color from purple to yellow.

T a b e l a 5: Oporność szczepów Lactobacillus na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5, 10, 20 g/l.T a b e l a 5: Resistance of Lactobacillus strains to bile salts in concentrations: 1, 2, 5, 10, 20 g / l.

Sole żółci stężenie Bile salts concentration Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus KL53A Lactobacillus rhamnosus KL53A 1 g/l 1 g / l +++ +++ +++ +++ 2 g/l 2 g / l +++ +++ +++ +++ 5 g/l 5 g / l +++ +++ +++ +++ 10 g/l 10 g / l +++ +++ +++ +++ 20 g/l 20 g / l +++ +++ +++ +++

Przebadane szczepy Lactobacillus wykazały dużą oporność zarówno na niskie pH (równe wartości pH występujące w soku żołądkowym) jak i na sole żółci, co może świadczyć o i ich doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panującym w ludzkim przewodzie pokarmowym.The tested Lactobacillus strains showed high resistance to both low pH (equal to the pH found in gastric juice) and to bile salts, which may indicate their perfect adaptation to the unfavorable conditions in the human digestive tract.

8. Badanie antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A na wzrost Candida albicans.8. Study of the antagonistic effect of Lactobacillus rhamnosus KL53A on the growth of Candida albicans.

Do badania antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A na wzrost Candida albicans wybrano 4 grzyby z których 3 pochodziły z przewodu pokarmowego, zaś jeden był szczepem kolekcyjnym (Candida albicans ATCC 10231). Ponadto jako kontrolę antygrzybiczego działania bakterii kwasu mlekowego na grzyby zastosowano również szczep Lactobacillus rhamnosus GG. Do badania posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry. Metoda polegała na zastosowaniu podłóż dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże MRS agar (Oxoid) na którym posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badane szczepy probiotyczne z rodzaju Lactobacillus. Po wymazaniu płytki inkubowano przez 48 godzin w warunkach beztlenowych, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone, płynne podłoże MYPG agar w kierunku wzrostu grzybów wskaźnikowych. Po zastygnięciu na podłoże wysiewano grzyby z rodzaju Candida o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następnie płytki były wkładane na 4 godziny do lodówki na 4°C, a następnie dalszą inkubacje prowadzono już w warunkach tlenowych w 37°C przez 24 godziny. Uzyskane wyniki oceniono według następującej legendy:For the study of the antagonistic effect of Lactobacillus rhamnosus KL53A on the growth of Candida albicans, 4 fungi were selected, 3 of which originated from the gastrointestinal tract, and one was a collection strain (Candida albicans ATCC 10231). In addition, the Lactobacillus rhamnosus GG strain was also used to control the antifungal activity of lactic acid bacteria on fungi. The modified semi-quantitative method according to Fitzsimmons and Berry was used for the study. The method was based on the use of two-layer substrates. The first layer was MRS agar (Oxoid) on which the tested probiotic strains of the Lactobacillus genus were seeded in the form of a 2 cm wide strip. After wiping, the plates were incubated for 48 hours under anaerobic conditions, after which time a second, slightly cooled, liquid MYPG agar medium was poured on top for growth of the indicator fungi. After setting, the fungi of the genus Candida with a density of 0.5 MacFarland were sown on the substrate. The plates were then placed in a refrigerator at 4 ° C for 4 hours, and then further incubation was already carried out under aerobic conditions at 37 ° C for 24 hours. The obtained results were assessed according to the following legend:

- Brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec Candida albicans nie zaobserwowano żadnej strefy zahamowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotycznym.- No Lactobacillus antagonist activity against Candida albicans, no zone of Candida growth inhibition was observed along the strip with the probiotic strain erased.

+ Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się lekkie przyhamowanie wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym.+ Partial antagonist activity of Lactobacillus against Candida albicans, slight inhibition of Candida growth is observed only over the strip with the erased probiotic strain.

PL 208 422 B1 ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się wyraźne przyhamowanie wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części.A clear antagonistic effect of Lactobacillus against Candida albicans is a marked inhibition of Candida growth over the probiotic strain erased strip, sometimes more clearly in its upper and lower parts.

+++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec Candida albicans obserwuje się wyraźne przyhamowanie wzrostu Candida nad paskiem i poza jego powierzchnią wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego. Badanie antagonistycznego działania Lactobacillus rhamnosus KL53A za pomocą metody półilościowej w warunkach in vitro wykazało, iż tylko badany szczep z rodzaju Lactobacillus wykazuje działanie wobec 4 wybranych szczepów grzybów Candida albicans.+++ Very strong antagonistic effect of Lactobacillus against Candida albicans, a marked inhibition of Candida growth is observed above the strip and beyond its surface along the entire inoculation line of the probiotic strain. The study of the antagonistic activity of Lactobacillus rhamnosus KL53A using the semi-quantitative method in in vitro conditions showed that only the tested Lactobacillus strain showed activity against 4 selected strains of Candida albicans.

T a b e l a 6. Antagonistyczne działanie Lactobacillus rhamnosus KL53A na wybrane szczepy Candida albicans.T a b e l a 6. Antagonistic effect of Lactobacillus rhamnosus KL53A on selected strains of Candida albicans.

Badany szczep Test strain Lactobacillus rhamnosus KL53A Lactobacillus rhamnosus KL53A Kontrola Lactobacillus rhamnosus GG Lactobacillus rhamnosus GG control Candida albicans 1 Candida albicans 1 +++ +++ +++ +++ Candida albicans 2 Candida albicans 2 ++ ++ +++ +++ Candida albicans 3 Candida albicans 3 +++ +++ +++ +++ C. albicans wzorzec ATCC 10231 C. albicans pattern ATCC 10231 +++ +++ +++ +++

Wybrany drogą selekcji szczep bakterii należący do rodzaju Lactobacillus spełnił wszystkie wymagania stawiane szczepom probiotycznym. Wyboru dokonano w spośród szczepów, które w naturalny sposób kolonizują przewód pokarmowy i egzystują obok siebie. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A jest użyteczny w profilaktyce i leczeniu stanów będących wynikiem braku właściwej flory bakteryjnej przewodu pokarmowego. Przeprowadzone badania laboratoryjne wykazały, że wybrany szczep bakterii Lactobacillus rhamnosus spełnia wszystkie kryteria funkcjonalności i bezpieczeństwa wymagane od probiotyków doustnych i może być stosowany jako dodatek żywnościowe do uzupełniania składu fizjologicznej flory przewodu pokarmowego dzieci i dorosłych we wszystkich stanach wskazujących na zaburzenia tego składu z różnych przyczyn, np. związanych z leczeniem antybiotykami, biegunką na różnym tle, niedoborami witamin i innych składników pokarmowych.The bacterial strain belonging to the Lactobacillus genus selected by selection met all the requirements for probiotic strains. The selection was made from among the strains that naturally colonize the digestive tract and exist side by side. Due to this and specific individual features, the Lactobacillus rhamnosus KL53A strain is useful in the prevention and treatment of conditions resulting from the lack of proper bacterial flora of the digestive tract. Laboratory tests have shown that the selected strain of Lactobacillus rhamnosus meets all the functionality and safety criteria required for oral probiotics and can be used as a food supplement to supplement the physiological composition of the gastrointestinal flora of children and adults in all conditions indicating disorders of this composition for various reasons for example, related to treatment with antibiotics, various background diarrhea, vitamin and other nutrient deficiencies.

Claims (1)

Zastrzeżenie patentowePatent claim Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A nr depozytu PCM B/00011.A new strain of Lactobacillus rhamnosus KL53A deposit no. PCM B / 00011.