PL205228B1 - Diagnostic set for the examination of animal serum for presence of RHD antibodies and diagnostic set for detection of the RHD virus - Google Patents

Abstract

The subjects of the present invention are a diagnostic kit for the examination of animal sera for the presence of anti-RHD antibodies and a diagnostic kit for detecting the RHDD virus. The subjects of the present invention facilitate the application in ELISA tests of specific (monospecific) anti-sera obtained as a result of the immunization of laboratory animals with purified, recombinant RHD virus antigens (VLP RHDV). This yields high specificity, sensitivity and repeatability of the results obtained. The application of a control system composed of a positive antigen, a negative virus control as well as control sera in the test makes it possible to quickly and accurately determine studied samples as positive or negative.

Description

Przedmiotami wynalazku są zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD. Przedmioty wynalazku umożliwiają użycie w teście ELISA swoistych, monospecyficznych surowic odpornościowych uzyskanych w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV), gwarantując wysoką czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników. Wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z antygenu dodatniego i kontroli ujemnej wirusa, a także próbki surowic kontrolnych pozwala szybko i precyzyjnie określić badane próbki jako dodatnie bądź ujemne.The invention relates to a serological diagnostic kit for testing the sera of animals for the presence of RHD antibodies and a diagnostic kit for the detection of the RHD virus. Objects of the invention allow the use of specific, monospecific antisera obtained as a result of immunization of laboratory animals with purified recombinant antigen of the RHD virus (VLP RHDV) in the ELISA test, guaranteeing high sensitivity, specificity and reproducibility of the obtained results. The use of a control system consisting of a positive antigen and a negative virus control, as well as a sample of control sera, allows you to quickly and accurately determine the tested samples as positive or negative.

Krwotoczna choroba królików (ang. Rabbit haemorrhagic disease RHD) określana powszechnie w Polsce jako pomór królików [Górski 1988] jest chorobą wirusową przebiegają c ą w postaci ostrej lub nadostrej, z wysokim odsetkiem śmiertelności, dochodzącym w niektórych ogniskach do 100%. Okres inkubacji choroby wynosi od 24 do 72 godzin. W obrazie sekcyjnym królików padłych dominuje silny obrzęk płuc z wyraźnymi cechami zapalenia krwotocznego. Stwierdza się obrzęk i zwyrodnienie wątroby, a także powiększenie śledziony oraz rozpulchnienie i przekrwienie nerek. Badaniem histopatologicznym stwierdza się liczne wynaczynienia w płucach, przekrwienie i obrzęk węzłów chłonnych, destrukcję i zanik jąder hepatocytów, zanik miazgi białej śledziony, zwyrodnienie i przekrwienie nerek.Rabbit haemorrhagic disease (RHD), commonly referred to in Poland as rabbit fever [Górski 1988], is a viral disease that is acute or hyperacute, with a high mortality rate reaching 100% in some outbreaks. The incubation period of the disease ranges from 24 to 72 hours. The autopsy image of fallen rabbits is dominated by severe pulmonary edema with distinct features of haemorrhagic inflammation. There is swelling and degeneration of the liver, as well as enlargement of the spleen, and loosening and congestion of the kidneys. Histopathological examination reveals numerous extravasations in the lungs, congestion and swelling of the lymph nodes, destruction and atrophy of the nuclei of hepatocytes, atrophy of the white pulp of the spleen, degeneration and congestion of the kidneys.

Chorobę po raz pierwszy opisano w Chinach w 1984 roku, a niedługo później ogniska RHD odnotowano w Europie, Azji, Ameryce, Afryce. W Polsce pierwsze przypadki RHD stwierdzono w 1988 r. i wyizolowano szczepy wirusa oznaczone jako SGM i KGM [Górski 1988].The disease was first described in China in 1984, and shortly thereafter RHD outbreaks were reported in Europe, Asia, America and Africa. In Poland, the first cases of RHD were found in 1988 and strains of the virus designated as SGM and KGM were isolated [Górski 1988].

Na podstawie cech morfologicznych i właściwości fizyko-chemicznych (wielkość wirionów o średnicy 28-32 nm, gęstość w gradiencie chlorku cezu 1,31-1,36 g/cm³, oporność na działanie rozpuszczalników organicznych) wirus RHD został sklasyfikowany w rodzinie Caliciviridae. Wirus posiada zdolności aglutynowania krwinek czerwonych człowieka [Górski 1988, Liu 1984, Ohlinger 1990, Parra 1990].On the basis of morphological features and physico-chemical properties (virion size 28-32 nm diameter, cesium chloride gradient density 1.31-1.36 g / cm ³ , resistance to organic solvents), the RHD virus was classified in the Caliciviridae family. The virus has the ability to agglutinate human red blood cells [Górski 1988, Liu 1984, Ohlinger 1990, Parra 1990].

Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest powszechnie znaną i użyteczną metodą diagnostyczną wykorzystywaną z powodzeniem do oznaczania różnych składników obecnych w płynach ustrojowych takich jak surowica lub mocz, czy też w supernatancie z hodowli tkankowych lub homogenatów.The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a well-known and useful diagnostic method successfully used to determine various components present in body fluids such as serum or urine, or in tissue culture supernatants or homogenates.

W praktyce weterynaryjnej znajduje zastosowanie w diagnostyce wielu chorób zakaźnych np. pryszczycy, chorobie Aujeskiego. Test ELISA jest metodą czułą i specyficzną a przy tym szybką i prostą w wykonaniu.In veterinary practice, it is used in the diagnosis of many infectious diseases, e.g. foot-and-mouth disease, Aujeski's disease. The ELISA test is a sensitive and specific method, and at the same time quick and easy to perform.

W rutynowej diagnostyce krwotocznej choroby królików (ang. Rabbit haemorrhagic disease - RHD) do wykrywania wirusa wykorzystuje się odczyn hemaglutynacji (HA), a do wykrywania obecności swoistych przeciwciał w surowicy królików odczyn zahamowania hemaglutynacji (HI). W obu tych metodach wykorzystano zdolność wirusa RHD do aglutynacji erytrocytów człowieka grupy 0. Równocześnie istotne jest, że ograniczeniem odczynu hemaglutynacji (HA), jest brak możliwości wykrywania szczepów wirusa pozbawionych właściwości hemaglutynacyjnych [Chasey 1995, Anon 2004] a z powodu niskiej czułości i potrzeby ciągłego posiadania świeżych erytrocytów jest on pomocny w ograniczonym zakresie. Od wielu lat w diagnostyce RHD obok metod HA i HI, w wyspecjalizowanych ośrodkach badawczych, wykorzystuje się techniki mikroskopii elektronowej, a także metody western blotting, immunofluorescencję (IF) i techniki immunohistochemiczne. Rozpoznawanie RHD z wykorzystaniem wymienionych metod dostarcza wiarygodnych wyników, ale jest jednocześnie bardzo kosztowne i znajduje główne zastosowanie w przypadku prowadzenia badań naukowych. Znacznie powszechniej i na nieco wię kszą skalę w diagnostyce RHD wykorzystywany jest test immunoenzymatyczny ELISA, stosowany w wielu modyfikacjach, ze względu na czułość, swoistość reakcji i prostotę wykonania.Routine diagnosis of Rabbit haemorrhagic disease (RHD) uses the haemagglutination (HA) test to detect the virus, and the haemagglutination inhibition (HI) test is used to detect the presence of specific antibodies in the serum of rabbits. Both of these methods used the ability of the RHD virus to agglutinate human group 0 erythrocytes. At the same time, it is important that the limitation of the haemagglutination reaction (HA) is the inability to detect virus strains lacking haemagglutination properties [Chasey 1995, Anon 2004] due to low sensitivity and the need for continuous having fresh erythrocytes is of limited help. For many years, in the diagnostics of RHD, in addition to the HA and HI methods, in specialized research centers, electron microscopy techniques, as well as western blotting, immunofluorescence (IF) and immunohistochemical techniques have been used. Recognition of RHD with the use of the above-mentioned methods provides reliable results, but is also very expensive and is mainly used in the case of scientific research. The enzyme immunoassay ELISA is used much more commonly and on a slightly larger scale in the diagnosis of RHD, which is used in many modifications due to the sensitivity, specificity of the reaction and simplicity of execution.

W większości przypadków opisane i używane metody ELISA opracowano w laboratoriach badawczych zajmujących się problematyką krwotocznej choroby królików. Od kilku lat, na niewielką skalę, oferowane są także komercyjnie zestawy testów ELISA do diagnostyki serologicznej i wirusologicznej wytwarzane przez włoski Instytut naukowy w Brescii (Istituto Zooprofilattico Sperimentale - IZS), który jest ośrodkiem referencyjnym OIE do spraw diagnostyki RHD. W zestawach IZS wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne przeciw różnym epitopom wirusa RHD oraz odpornościowe surowice poliklonalne królików i natywny antygen RHDV izolowany z tkanek zakażonych królików.In most cases, the described and used ELISA methods were developed in research laboratories dealing with rabbit haemorrhagic disease. For several years, on a small scale, also commercially available ELISA kits for serological and virological diagnostics are produced by the Italian Scientific Institute in Brescia (Istituto Zooprofilattico Sperimentale - IZS), which is the OIE reference center for RHD diagnostics. IZS kits use monoclonal antibodies against various epitopes of the RHD virus, as well as rabbit polyclonal immune sera and native RHDV antigen isolated from tissues of infected rabbits.

Do wykrywania i ilościowej oceny przeciwciał neutralizujących opracowano test współzawodnictwa (ang. competition ELISA). W proponowanej metodzie płytkę o właściwościach sorbcyjnych opłaszcza się swoistą króliczą surowicą odpornościową. Na płytkę nanosi się mieszaninę badanejA competition ELISA was developed for the detection and quantification of neutralizing antibodies. In the proposed method, the plate with sorption properties is coated with a specific rabbit antiserum. The test mixture is placed on the plate

PL 205 228 B1 surowicy i stałej dawki antygenu wirusa pomoru królików. W następnym etapie stosuje się przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciw wirusowi RHD, związane z enzymem peroksydazą chrzanową. Obecność przeciwciał w badanej surowicy wykrywa się spektrofotometryczne na podstawie reakcji barwnej po dodaniu substratu. Ocenę wyników dokonuje się poprzez porównanie wartości absorpcji (OD492) badanych prób, z rezultatami próbek kontrolnych, dodatniej i ujemnej.And a constant dose of rabbit fever virus antigen. In the next step, monoclonal antibodies raised against the RHD virus, bound to the enzyme horseradish peroxidase, are used. The presence of antibodies in the test serum is detected spectrophotometrically on the basis of the color reaction after adding the substrate. Evaluation of the results is made by comparing the absorption value (OD492) of the tested samples with the results of the positive and negative control samples.

Zestaw do diagnostyki wirusologicznej (test pośredni ELISA - (ang. indirect sandwich ELISA) zawiera m. in. mieszaninę kilku przeciwciał monoklonalnych pozwalających wykrywać obecność wirusa RHD w narządach wewnętrznych zakażonych królików jak również rozpoznawać zakażenie zajęcy wirusem EBHSV. Na płytkę opłaszczoną swoistą króliczą surowicą odpornościową anty-RHDV, nanosi się badany antygen, który następnie wykrywa się stosując koniugat, czyli swoiste przeciwciała monoklonalne związane z enzymem-peroksydazą chrzanową. Wizualnym odzwierciedleniem obecności antygenu wirusa RHD - wyniku dodatniego jest reakcja barwna z substratem. Intensywność reakcji barwnej odczytuje się spektrofotometrycznie i analizuje w odniesieniu do prób kontrolnych, ujemnej i dodatniej. Wyniki interpretuje się ilościowo.The virological diagnostics kit (indirect sandwich ELISA) contains, among others, a mixture of several monoclonal antibodies that allow to detect the presence of the RHD virus in the internal organs of infected rabbits as well as to identify hare infection with EBHSV. anti-RHDV, the test antigen is applied, which is then detected using a conjugate, i.e. specific monoclonal antibodies bound to the enzyme-horseradish peroxidase. A visual reflection of the presence of the RHD virus antigen - a positive result is a color reaction with the substrate. The intensity of the color reaction is read spectrophotometrically and analyzed for negative and positive controls Results are interpreted quantitatively.

W piś miennictwie dotyczą cym RHD wymienia się takż e wykorzystanie metody ELISA typu „direct, w której do wykrywania przeciwciał płytki o właściwościach sorbcyjnych opłaszcza się bezpośrednio oczyszczonym wirusem RHD a następnie wykorzystuje do wykrywania przeciwciał (Rodak 1990).The literature on RHD also mentions the use of the direct ELISA method, in which plates with sorption properties are coated directly with purified RHD virus to detect antibodies and then used to detect antibodies (Rodak 1990).

W ostatnim czasie dostę pny jest w ofercie handlowej test ELISA firmy Kalon, do wykrywania przeciwciał RUD, w którym do opłaszczenia płytek użyto rekombinowanego białka RHDV uzyskanego w systemie bakulowirusa. Zestaw zawiera opł aszczone pł ytki sorbcyjne oraz surowice odniesienia dodatnią i ujemną.Recently, the Kalon ELISA test for the detection of RUD antibodies, in which the recombinant RHDV protein obtained in the baculovirus system was used for coating the plates, is available on the commercial offer. The kit includes coated sorbent plates and positive and negative reference sera.

Wirus RHD posiada dodatnio spolaryzowaną (ss RNA+), pojedynczą nić RNA zawartą w dwudziestościennym, bezotoczkowym kapsydzie. Genom wirusa (7,5 kb) został po raz pierwszy sklonowany przez Meyersa i wsp. [Meyers 1991a, 1991b], a następnie jego pełną sekwencję opublikował Rasschaert i wsp. wykazując 98% homologię sekwencji aminokwasowej [Rasschaert 1994]. Sekwencje fragmentu genomu kodującego białko kapsydu przedstawili m. in. Boga i wsp. [Boga 1994] dla szczepu wyizolowanego w Hiszpanii, Milton i wsp. dla szczepów wyizolowanych w Czechach i Austrii, a także Guittre i wsp., którzy wykazali identyczność sekwencji nukleotydów szczepów francuskich od do 98%.The RHD virus has a positively polarized (ss RNA +) single strand RNA contained in an icosahedral, non-enveloped capsid. The viral genome (7.5 kb) was first cloned by Meyers et al. [Meyers 1991a, 1991b] and its complete sequence was subsequently published by Rasschaert et al. Showing 98% amino acid homology [Rasschaert 1994]. The sequences of the genome fragment coding for the capsid protein are presented, among others, by Boga et al. [Boga 1994] for a strain isolated in Spain, Milton et al. For strains isolated in the Czech Republic and Austria, and also Guittre et al., Who showed nucleotide sequence identity of French strains from up to 98%.

Na podstawie badań molekularnych ustalono, że genom wirusa RHD wykazuje znaczną homologię z innymi kaliciwirusami (Feline calicivirus -FCV, San Miguel sealion virus - SMSV, Vesicular exanthema virus of swine - VESV), jednakże jest inaczej zorganizowany, gdyż wyróżnia się w nim tylko dwie ramki odczytu (ORF), a nie trzy jak u wymienionych. Główna ramka odczytu (ORF1) wirusa RHD o 2344 kodonach obejmuje prawie cały genom, od nukleotydu 10 do 7042 i koduje poliproteinę o wielkości 257 kDa, którą można rozdzielić na białka niestrukturalne (nt 1000 - 5000) i białko kapsydu VP60 (5305 - 7044). Sekwencja kodująca białko strukturalne znajduje się przy końcu 3' ORF1. Obok ORF1 występuje, mniejsza ramka odczytu - ORF2 (7025-7378) zawierająca 353 nukleotydy, która koduje białko VP12 o niesprecyzowanej dotychczas funkcji. Wyizolowano także subgenomowy RNA o wielkości 2.2 kb, który przypuszczalnie spełnia rolę w procesie replikacji [Meyers 1991a, 1991b].On the basis of molecular studies, it has been established that the RHD virus genome shows significant homology with other caliciviruses (Feline calicivirus-FCV, San Miguel sealion virus - SMSV, Vesicular exanthema virus of swine - VESV), however, it is organized differently, as only two are distinguished in it. reading frames (ORF), not three as mentioned. The main reading frame (ORF1) of the RHD virus with 2344 codons covers almost the entire genome, from nucleotide 10 to 7042, and encodes a 257 kDa polyprotein that can be separated into non-structural proteins (nt 1000-5000) and capsid protein VP60 (5305-7044) . The coding sequence for the structural protein is located at the 3 'end of the ORF1. In addition to ORF1, there is a smaller reading frame - ORF2 (7025-7378) containing 353 nucleotides, which codes for the VP12 protein with hitherto unspecified function. A subgenomic RNA of 2.2 kb has also been isolated which presumably plays a role in the replication process [Meyers 1991a, 1991b].

Produkty ekspresji wirusowego cDNA RHDV uzyskane in vitro w systemach lizatów retykulocytów królika (RRL) i E. coli użyto do badania mechanizmu powstawania i rozpadu obszernej poliproteiny (257 kDa) kodowanej przez główną ramkę odczytu ORF 1. W wyniku rozpadu poliproteiny uzyskano kilka białek wirusowych RHDV, w tym proteinę o masie 60 kDa rozpoznawaną przez surowicę odpornościową anty-RHDV [Alonso 1996].RHDV viral cDNA expression products obtained in vitro in rabbit reticulocyte (RRL) and E. coli lysate systems were used to study the mechanism of formation and degradation of the bulky polyprotein (257 kDa) encoded by the main ORF 1 reading frame. Several RHDV viral proteins were obtained as a result of the degradation of the polyprotein. , including the 60 kDa protein recognized by the anti-RHDV antiserum [Alonso 1996].

Ekspresję białka kapsydu (VP60) wirusa RHD uzyskano w wirusie vaccinii (krowianki). Rekombinowany wirus RecV-VP60 namnożono poprzez zakażenie komórek RK13. Jak wykazano w pośredniej reakcji immunofluorescencji (IF) i immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-RHDV uzyskany produkt białkowy o masie 60 kDa - posiadał właściwości antygenowe. Po podaniu królikom, w iniekcji śródskórnej i doustnie, białko indukowało powstanie swoistych przeciwciał o wysokim mianie i chroniło w próbie zakażenia zjadliwym wirusem RHD wykonanej 15 dnia po zakażeniu [Bertagnoli 1996].RHD virus capsid protein (VP60) expression was achieved in vaccinia virus (vaccinia). Recombinant RecV-VP60 virus was propagated by infecting RK13 cells. As demonstrated by the indirect immunofluorescence (IF) reaction and immunoprecipitation with anti-RHDV antibodies, the obtained protein product with a mass of 60 kDa had antigenic properties. When administered to rabbits, by intradermal injection and orally, the protein induced high-titer specific antibodies and protected in an infection trial with virulent RHD virus made on day 15 after infection [Bertagnoli 1996].

Laurent et al. zastosowali system bakulowirusa w celu ekspresji genu VP60 wirusa RHD. Stwierdzono wydzielanie się do pożywki z hodowli komórek owadzich S9 białka rekombinowanego, które formowało się w struktury pseudowirusowe VLP, strukturalnie i immunologicznie nie do odróżnienia od natywnych wirionów wirusa RHD [Laurent 1994].Laurent et al. used the baculovirus system to express the RHD virus VP60 gene. It was found secretion into the medium of the S9 insect cell culture of a recombinant protein that formed into pseudoviral VLP structures that were structurally and immunologically indistinguishable from native RHD virions [Laurent 1994].

Laurent et al. uzyskali ekspresję genu VP60 wirusa syndromu krwotocznej choroby zajęcy EBHSV, należącego do Caliciviridae. Wirus EBHSV jest bardzo blisko spokrewniony z wirusem RHD.Laurent et al. expressed the VP60 gene of the EBHSV hare hemorrhagic disease virus, belonging to Caliciviridae. The EBHSV virus is very closely related to the RHD virus.

PL 205 228 B1PL 205 228 B1

Ma podobną morfologię (wielkość i wygląd w mikroskopie elektronowym). Badania ochrony krzyżowej wykazały, że króliki szczepione rekombinowanym białkiem EBHSV (rEBHSV) nie są odporne na zakażenie zjadliwym wirusem RHD [Laurent 1997].It has a similar morphology (size and appearance under an electron microscope). Cross-protection studies have shown that rabbits vaccinated with recombinant EBHSV protein (rEBHSV) are not immune to infection with the virulent RHD virus [Laurent 1997].

Gen kodujący strukturalne białko kapsydu RHDV poddano ekspresji w systemie E. coli lub w systemie polimerazy T7 RNA. W systemie E. coli uzyskano białko fuzyjne, które tylko częściowo wykazywało podobieństwo antygenowe do natywnego białka VP60 i po immunizacji nie uzyskiwano ochrony w próbie zakażenia zjadliwym wirusem.The gene encoding the RHDV structural capsid protein was expressed in an E. coli system or a T7 RNA polymerase system. In the E. coli system, a fusion protein was obtained that showed only partially antigenic similarity to the native VP60 protein, and no protection was obtained after immunization in an attempt to infect with virulent virus.

Natomiast w systemie T7 RNA uzyskano białko rekombinowane, które po dwukrotnej immunizacji królików (1-ego i 7-ego dnia) stymulowało powstawanie swoistych przeciwciał i ochronę po wykonaniu zakażenia śmiertelną dawką oczyszczonego wirusa RHD w 7 dniu po podaniu drugiej dawki immunizacyjnej [Boga 1994].On the other hand, in the T7 RNA system, a recombinant protein was obtained, which after immunization of rabbits twice (on the 1st and 7th day) stimulated the formation of specific antibodies and protection after the infection with a lethal dose of purified RHD virus on the 7th day after the second immunization dose [Boga 1994] .

W systemie drożdży Saccharomyces cerevisiae uzyskano białko rekombinowane, które chroniło w próbie zakaż enia zjadliwym wirusem RHDV. Biał ko posiadał o wł aś ciwości antygenowe charakterystyczne dla RHDV. W mikroskopie elektronowym wykazano obecność struktur wirusopodobnych VLP wykazujących zbliżoną wielkość (średnicę).A recombinant protein was obtained in the Saccharomyces cerevisiae yeast system, which protected against infection with the virulent RHDV virus. The protein had antigenic properties characteristic of RHDV. Electron microscopy revealed the presence of VLP virus-like structures of similar size (diameter).

W celu oceny immunogennoś ci rekombinowanego białka 4 króliki immunizowano podskórnie próbkami białka całkowitego stanowiącego osad uzyskany metodą ultrawirowania o stężeniu 400 μg (natomiast względna ilość białka rekombinowanego w próbce na podstawie analizy SDS-PAGE wynosiła ok. 10%). Zakażenie zjadliwym wirusem 100 LD50 wykonano 14 dni po immunizacji pojedynczą dawką [Boga 1997].In order to assess the immunogenicity of the recombinant protein, 4 rabbits were immunized subcutaneously with samples of total protein constituting the precipitate obtained by ultracentrifugation at a concentration of 400 μg (while the relative amount of recombinant protein in the sample was approx. 10% based on SDS-PAGE analysis). Infection with the virulent virus 100 LD50 was performed 14 days after single dose immunization [Boga 1997].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w systemie ekspresji bakulowirusa w komórkach owadzich. Króliki immunizowano dwukrotnie domięśniowo oczyszczonymi cząstkami pseudowirusowymi VLP w dawce 30 μg, natomiast myszy białe immunizowano dootrzewnowo podając 10 μg białka rekombinowanego. Antygen podawano łącznie z adiuwantem Titer Max. Dawkę przypominającą podawano po 14 dniach. Cztery szczepione króliki zakażono doświadczalne zjadliwym wirusem o mianie 1000 LD50. Króliki szczepione przeżyły zakażenie, natomiast 2 króliki kontrolne padły [Nagesha 1995].The RHD virus capsid protein was obtained in a baculovirus expression system in insect cells. Rabbits were immunized twice with the purified pseudoviral VLPs at a dose of 30 µg intramuscularly, while white mice were immunized intraperitoneally with 10 µg of recombinant protein. The antigen was administered in conjunction with the Titer Max adjuvant. A booster dose was given after 14 days. Four vaccinated rabbits were infected with the experimental virulent virus with a titer of 1000 LD50. Vaccinated rabbits survived the infection, while 2 control rabbits died [Nagesha 1995].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w systemie ekspresji bakulowirusa w komórkach owadzich dwiema drogami: 1) na podstawie informacji genetycznej zapisanej na matrycy mRNA analogicznej do podgenomowego RNA wirusa RHD oraz 2) jako fragment większej poliproteiny białkowej obejmującej białka niestrukturalne (proteazę 3C i polimerazę RNA) i strukturalne białko kapsydu, wytworzonej na podstawie informacji genetycznej genomowego RNA. W obu sposobach ekspresji uzyskano cząstki pseudowirusowe VLPs, podobne antygenowo i morfologicznie do oczyszczonych wirionów natywnej postaci wirusa.The RHD virus capsid protein was obtained in the baculovirus expression system in insect cells in two ways: 1) on the basis of genetic information stored on an mRNA template analogous to the RHD virus subgenomic RNA, and 2) as a fragment of a larger protein polyprotein including non-structural proteins (3C protease and RNA polymerase) and structural protein of the capsid, generated on the basis of the genetic information of the genomic RNA. Both expression methods produced pseudoviral VLPs antigenically and morphologically similar to the purified virions of the native form of the virus.

Sześć królików wolnych od swoistych przeciwciał poddano jednokrotnej immunizacji rekombinowanym białkiem VLPs w dawkach zawierających 10 i 100 μg białka z dodatkiem adiuwanta (żelu wodorotlenku glinu). Po 2 tygodniach pobrano surowice i wykonano zakażenie zjadliwym wirusem w dawce 10³LD50. Króliki wykazywały obecność swoistych przeciwciał o mianie od 1/60 do 1/400. Króliki immunizowane przeżyły nie wykazując żadnych objawów choroby, natomiast dwa zwierzęta kontrolne padły do 52 godziny po zakażeniu [Sibilia 1995].Six specific antibody-free rabbits were immunized once with recombinant VLPs protein at doses containing 10 and 100 µg of protein with adjuvant (aluminum hydroxide gel). After 2 weeks, sera were collected and infection virulent virus was performed at 10 ³ LD 50. The rabbits showed specific antibodies ranging from 1/60 to 1/400. The immunized rabbits survived without showing any signs of disease, while two control animals died by 52 hours post-infection [Sibilia 1995].

W opisie patentowym PL183976 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików (VHD). Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi pomoru królików, antygen wirusa VHD konserwowany glicerolem, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - OPD z dodatkiem H2O2 oraz układ referencyjny składający się z surowicy króliczej ujemnej, wysokododatniej i niskododatniej - progowej w kierunku krwotocznej choroby królików - VHD.The patent description PL183976 (published 1998-12-07) describes the use of an ELISA test to test rabbit sera for rabbit haemorrhagic disease (VHD). The method is based on the fact that the ELISA test uses microplates coated with the specific antiserum of the chicken against the rabbit fever virus, the antigen of the VHD virus preserved with glycerol, the specific antiserum of the guinea pig against the VHD virus, the antiglobulin conjugate, the enzyme substrate - OPD with the addition of H2O2 and the reference system consisting of rabbit negative, highly positive and low positive serum - threshold for rabbit haemorrhagic disease - VHD.

W opisie patentowym PL183983 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików. Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi VHD, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - OPD z dodatkiem H2O2 oraz układ kontrolny składający się z antygenu referencyjnego dodatniego o właściwościach hemaglutynujących oraz pozbawionego tych właściwości i antygenu referencyjnego ujemnego.The patent description PL183983 (published 1998-12-07) describes the use of the ELISA test for the diagnosis of rabbit haemorrhagic disease virus. The method consists in the fact that the ELISA test uses microplates coated with a specific antiserum of a hen against VHD virus, a specific guinea pig antiserum against VHD virus, an antiglobulin conjugate, an enzyme substrate - OPD with the addition of H2O2 and a control system consisting of a positive reference antigen with hemagglutinating properties, and without and with a negative reference antigen.

W opisie patentowym PL160369 (opublikowanym 1991-03-11) opisano sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pomorowi królików.The patent description PL160369 (published 1991-03-11) describes a method of producing a vaccine against rabbit plague.

PL 205 228 B1PL 205 228 B1

W zgłoszeniu patentowym US2003186431 (opublikowanym 2003-10-02) opisano szczepionkę przeciwko krwotocznej chorobie królików oraz antygen. Strukturalny antygen VP60 wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) bądź jego fragment może być uzyskiwany w roślinach poprzez zastosowanie wektora wirusowego opartego na wirusie plum pox (PPV), zawierającego promotor, rekombinowaną sekwencję DNA zawierającą cDNA przyłączone do genomu wirusa PPV, pełną długość, oraz sekwencję DNA kodującą białko RHDV VP60 lub jego fragment wprowadzony pomiędzy sekwencje nukleotydowe kodujące białka Nib i CP wirusa PPV, oraz element klonujący. Otrzymany antygen jest zdolny do pobudzania reakcji obronnych przeciwko śmiertelnej krwotocznej chorobie królików (RHDV) i może być wykorzystywany jako rekombinowaną podjednostka szczepionki przeciwko pomorowi królików.Patent application US2003186431 (published 2003-10-02) describes a rabbit haemorrhagic disease vaccine and an antigen. The structural antigen of rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) or a fragment thereof can be obtained in plants by using a viral vector based on plum pox virus (PPV) containing a promoter, a recombinant DNA sequence containing cDNA joined to the PPV genome, full length, and sequence DNA encoding the RHDV VP60 protein or a fragment thereof inserted between the nucleotide sequences encoding the PPV Nib and CP proteins, and a cloning element. The resulting antigen is capable of stimulating defense responses against lethal rabbit haemorrhagic disease (RHDV) and can be used as a recombinant rabbit vaccine subunit.

W opisie patentowym W09639177 (opublikowanym 1996-12-12) opisano kompozycje rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus (wirusa krwotocznej choroby króliczej RHDV) i ich zastosowanie. Opisano atenuowane rekombinowane wirusy zawierające DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, a mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje zawierające te wirusy, ekspresję ich produktów oaz przeciwciała powstałe w wyniku działania wirusów oraz produkty genowe o licznych zastosowaniach zapobiegawczych, terapeutycznych i diagnostycznych. Wirusowe DNA może być wykorzystywane zarówno do sond jak i primerów.W09639177 (published 1996-12-12) describes recombinant poxvirus-calicivirus (RHDV rabbit haemorrhagic disease virus) compositions and their use. Attenuated recombinant viruses containing DNA encoding a calicivirus antigen such as the RHDV antigen, namely the capsid gene, as well as methods and compositions containing these viruses, the expression of their virus products and antibody products and gene products with numerous preventive, therapeutic and diagnostic applications are described. Viral DNA can be used for both probes and primers.

W opisie patentowym CN1134461 (opublikowanym 1996-10-30) opisano rekombinowane kapsydy i białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV), zestawy diagnostyczne oraz szczepionki zawierające wspomniane kapsydy oraz białka. Rekombinowane kapsydy i rekombinowane białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) były wytwarzane w rekombinowanym systemie ekspresji bakulowirusa replikowanym w hodowli komórkowej owadów. Uzyskane kapsydy i białka są pod względem właściwości immunogennych i antygenowych analogiczne względem natywnego białka VP60 RHDV i nadają się do wytwarzania szczepionek stosowanych przeciwko krwotocznej chorobie królików, a także do przygotowywania testów diagnostycznych umożliwiających wykrycie obecności przeciwciał rozpoznających RHDV oraz obecności RHDV w próbkach biologicznych pobranych od królików.Patent description CN1134461 (published 1996-10-30) describes recombinant capsids and proteins of Rabbit Haemorrhagic Disease Virus (RHDV), diagnostic kits and vaccines containing said capsids and proteins. Recombinant capsids and recombinant rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) proteins were produced in a recombinant baculovirus expression system replicated in insect cell culture. The obtained capsids and proteins are analogous in terms of immunogenic and antigenic properties to the native VP60 RHDV protein and are suitable for the production of vaccines used against rabbit haemorrhagic disease, as well as for the preparation of diagnostic tests to detect the presence of antibodies recognizing RHDV and the presence of RHDV in biological samples collected from rabbits .

W opisie patentowym EP0704529 (opublikowanym 1996-04-03) opisano szczepionkę przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików, wytwarzanie strukturalnego antygenu (VP60) wirusa RHD oraz jego zastosowanie jako szczepionki. Wytwarzanie antygenu oraz sposób szczepienia obejmuje następujące etapy: a) izolacja genu kodującego białko strukturalne (VP60) wirusa RHD; b) klonowanie wspomnianego genu w wektorze transferowym bakulowirusa pAcYM1; c) otrzymanie i izolacja rekombinowanego bakulowirusa AcVP60; d) zainfekowanie komórek owadzich Sf9 rekombinowanym bakulowirusem AcVP60; e) otrzymanie i izolacja białka VP60 wytwarzanego przez rekombinowany bakulowirus AcVP60; f) inokulacja królików przy zastosowaniu antygenu.EP0704529 (published 1996-04-03) describes a vaccine against rabbit haemorrhagic disease virus, the production of the structural antigen (VP60) of the RHD virus and its use as a vaccine. The production of the antigen and the method of vaccination comprises the following steps: a) isolation of the gene encoding the structural protein (VP60) of the RHD virus; b) cloning said gene in the pAcYM1 baculovirus transfer vector; c) production and isolation of the recombinant AcVP60 baculovirus; d) infecting Sf9 insect cells with the recombinant AcVP60 baculovirus; e) production and isolation of the VP60 protein produced by the recombinant AcVP60 baculovirus; f) inoculating rabbits using the antigen.

W opisie patentowym RU2007452 (opublikowanym 1994-02-15) przedstawiono szczep komórek hybrydowych mus musculus - wytwarzający monoklonalne przeciwciała wykorzystywane przy diagnozowaniu choroby krwotocznej królików.Patent description RU2007452 (published 1994-02-15) describes the mus musculus hybrid cell strain - producing monoclonal antibodies used in the diagnosis of rabbit haemorrhagic disease.

W opisach patentowych CS9005797 (opublikowanym 1992-03-18) oraz CS8906486 (opublikowanym 1992-03-18) opisano limfocyty wytwarzane w liniach hybrydowych komórek nowotworowych myszy lub myszowatych RHDV-02 oraz RHDV-01 (odpowiednio dla zgłoszeń CS9005797 i CS8906486) wytwarzające monoklinalne przeciwciała przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików.The patents CS9005797 (published 1992-03-18) and CS8906486 (published 1992-03-18) describe lymphocytes produced in the mouse or murine hybrid tumor cell lines RHDV-02 and RHDV-01 (for applications CS9005797 and CS8906486, respectively) producing monoclonal antibodies against rabbit haemorrhagic disease virus.

W opisie patentowym AU6247000 (opublikowanym 2000-12-14) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus oraz ich zastosowanie.Patent AU6247000 (published 2000-12-14) describes the recombinant poxvirus-calicivirus composition and use thereof.

Podobnie w opisie patentowym US5989561 (opublikowanym 1999-11-23) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus krwotocznej choroby królików i ich zastosowanie. W rozwią zaniu tym przedstawione został y atenuowane rekombinowane wirusy zawierają ce DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje dotyczące wirusa, produkty ich ekspresji oraz przeciwciała wyprodukowane przez ten wirus bądź produkty ekspresji. Rekombinowane wirusy mogą być rekombinowanymi wirusami NYVAC lub ALVAC. Rekombinowane wirusy oraz produkty genowe z nich uzyskane a także przeciwciała wytworzone przez wirusy oraz produkty genowe mogą mieć liczne zastosowania zarówno prewencyjnie, terapeutycznie jak i diagnostycznie. DNA z wirusów może być wykorzystywane do sond oraz do primerów.Similarly, US5989561 (published 1999-11-23) describes the recombinant poxvirus-calicivirus rabbit haemorrhagic disease virus composition and its use. In this solution, attenuated recombinant viruses containing DNA encoding a calicivirus antigen such as the RHDV antigen, namely the capsid gene, as well as methods and compositions relating to the virus, their expression products and antibodies produced by the virus or expression products are presented. The recombinant viruses may be NYVAC or ALVAC recombinant viruses. Recombinant viruses and gene products derived from them, as well as antibodies produced by viruses and gene products, can have numerous preventive, therapeutic and diagnostic applications. DNA from viruses can be used for probes and primers.

Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych dostarczeniu zestawów diagnostycznych wykorzystujących test ELISA do badania surowic królików oraz do wykrywania antygenu wirusa krwotocznej choroby królików (RHD) oraz stosowania odczynów hemaglutynacji i zahamowania hemaglu6Despite the studies described above devoted to the provision of diagnostic kits using an ELISA test for rabbit sera and for the detection of rabbit haemorrhagic disease virus (RHD) antigen, as well as for the use of hemagglutination and haemaglu inhibition tests6

PL 205 228 B1 tynacji, ze względu na stosunkowo niską czułość, pracochłonność a także konieczność posiadania świeżych erytrocytów, testy te w ograniczonym zakresie spełniają kryteria diagnostyczne. Ponieważ niedogodności związane są z produkcją reagentów, występowaniem reakcji nieswoistych wynikających ze sposobu pozyskiwania wirusa z tkanek zakażonych królików, czy też uzyskaniem i standaryzacją przeciwciał monoklonalnych, istnieje cią gła potrzeba uzyskania skutecznego rozwiązania umożliwiającego uzyskanie zestawów wykorzystujących oczyszczone, stabilne antygenowo preparaty natywnego wirusa.Due to the relatively low sensitivity, labor consumption and the need to have fresh erythrocytes, these tests meet the diagnostic criteria to a limited extent. Since the inconvenience is related to the production of reagents, the occurrence of non-specific reactions resulting from the method of obtaining the virus from infected rabbit tissues, or the obtaining and standardization of monoclonal antibodies, there is a continuing need for an effective solution to obtain kits using purified, antigen-stable preparations of native virus.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do opracowania zestawów diagnostycznych do badania surowic królików oraz innych gatunków zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz do wykrywania antygenu wirusa RHD u zwierząt. Zestawy te obejmują opracowane oczyszczone, stabilne antygenowo preparaty rekombinowanego białka VP60 w postaci cząstek pseudowirusowych VLP, umożliwiając użycie w teście ELISA swoistych, monospecyficznych surowic odpornościowych uzyskanych w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV), zaś wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z antygenu dodatniego i kontroli ujemnej wirusa umożliwia szybkie i precyzyjne określenie badanych próbek jako dodatnich bą dź ujemnych, gwarantując wysoką czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników.The object of the present invention is to provide a means that could be used to develop diagnostic kits for testing the sera of rabbits and other animal species for the presence of RHD antibodies and for the detection of the RHD virus antigen in animals. These kits include the developed, purified, antigen-stable preparations of recombinant VP60 protein in the form of pseudoviral VLP particles, enabling the use of specific, monospecific antisera obtained by immunizing laboratory animals with purified recombinant RHD virus antigen (VLP RHDV) in the ELISA test, and use in the control system test composed of a positive antigen and a negative virus control, it enables quick and precise determination of tested samples as positive or negative, ensuring high sensitivity, specificity and repeatability of the obtained results.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z opracowaniem i dostarczeniem zestawów diagnostycznych wykorzystujących test ELISA do badania surowic królików oraz innych gatunków zwierząt na obecność przeciwciał RHD a takż e do wykrywania wirusa RHD, których skł adniki czynne - swoiste, monospecyficzne surowice odpornościowe uzyskane zostały w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV) zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.Realization of such a defined goal and solving the problems described in the state of the art related to the development and delivery of diagnostic kits using the ELISA test to test the sera of rabbits and other animal species for the presence of RHD antibodies, as well as to detect the RHD virus, the active ingredients of which - specific, monospecific sera immune responses obtained by immunizing laboratory animals with purified recombinant RHD virus antigen (RHDV VLP) have been achieved in the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oparty na teście ELISA, charakteryzujący się tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje surowicę opłaszczającą-króliczą monospecyficzną surowicę odpornościową antyVLP RHDV, swoisty antygen - VLP RHDV, surowicę wykrywającą - monospecyficzną surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy znakowany enzymem, substrat enzymatyczny oraz surowice królicze kontrolne, ujemną i wysokododatnią oraz niskododatnią - progową zawierające swoiste przeciwciała przeciw wirusowi RHD.The subject of the invention is a serological diagnostic kit for testing animal sera for the presence of RHD antibodies based on an ELISA test, characterized in that the diagnostic kit includes the coat serum-rabbit monospecific antiserum RHDV anti-VLP, specific antigen - VLP RHDV, detection serum - monospecific antiserum mumps marine anti-VLP RHDV VP60, enzyme-labeled antiglobulin conjugate, enzyme substrate and negative, high-positive and low-positive rabbit control rabbit sera containing specific antibodies to the RHD virus.

Korzystnie, gdy składniki czynne zestawu (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.Preferably, the active components of the kit (immune sera) have been obtained by immunizing laboratory animals with the recombinant structural protein VP60 of the RHD virus, purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient.

Korzystnie gdy do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną, monospecyficzną, surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego o masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynujacego szczepu SGM wirusa RHD.Preferably, a polyvalent monospecific rabbit antiserum (primary antibodies) immunized with a fraction of pseudoviral RHD virus particles - a recombinant structural protein of 60 kDa (VLP RHDV VP60) obtained in a baculovirus system by expression of the complete gene is used to coat the plate with sorption properties. vp60 (1800 bp) of the hemagglutinating SGM strain of the RHD virus.

Korzystnie, gdy antygen używany w fazie płynnej testu w stanowi pożywka komórek owadzich linii Spodoptera frugiperda transfekowanych rekombinowanym bakulowirusem (SGM 1800 BacV) przy m.o.i 2,0 - zebrana 4 dnia po zakażeniu hodowli komórek, konserwowana glicerolem.Preferably, the antigen used in the liquid phase of the test is medium of Spodoptera frugiperda insect cells transfected with recombinant baculovirus (SGM 1800 BacV) at m. O. And 2.0 - harvested on day 4 after infection of the cell culture, conserved with glycerol.

Korzystnie, gdy cząstki pseudowirusowe VLP są w postaci pożywki z hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko strukturalne kapsydu wirusa RHD (VLP RHDV VP60)Preferably, the pseudoviral VLPs are in the form of an insect cell culture medium containing the recombinant RHD virus capsid structural protein (VLP RHDV VP60).

Korzystnie, gdy koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.Preferably, the antiglobulin conjugate is serum containing guinea pig anti-IgG antibodies bound to the enzyme horseradish peroxidase, and the substrate is a chemical compound - o-phenylenediamine dihydrochloride-OPD activated with hydrogen peroxide - H2O2.

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną ujemną w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem krwotocznej choroby królików. Korzystnie, gdy surowicę referencyjną wysokododatnią w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD, stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji królików inaktywowanym, natywnym wirusem RHD, poddanych zakażeniu zjadliwym wirusem.Preferably, the rabbit haemorrhagic disease negative reference serum - RHD is obtained by mixing aliquots of sera derived from clinically healthy, unvaccinated rabbits that have never been in contact with rabbit haemorrhagic disease virus. Preferably, the reference serum highly positive for rabbit haemorrhagic disease - RHD is rabbit serum obtained after immunizing rabbits with inactivated, native RHD virus infected with the virulent virus.

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną wysokododatnią cechuje miano w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) nie mniejsze niż 1280.Preferably, the highly positive reference serum has a hemagglutination inhibition (HI) titer of not less than 1280.

PL 205 228 B1PL 205 228 B1

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną niskododatnią - progową stanowi surowica królików immunizowanych szczepionką przeciwko pomorowi królików, zebrana między 10-14 dniem po szczepieniu o mianie HI 1/40 - 1/80.Preferably, the low positive-threshold reference serum is the serum of rabbits immunized with a vaccine against rabbit plague, collected between days 10-14 after vaccination at an HI titer of 1/40 - 1/80.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD oparty na teście ELISA, charakteryzujący się tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje odpornościową surowicę króliczą anty-VLP RHDV VP60, surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz kontrolne próby antygenu wirusa RHD dodatnią i ujemną.Another subject of the invention is a diagnostic kit for the detection of RHD virus based on an ELISA test, characterized in that the diagnostic kit comprises rabbit anti-VLP RHDV VP60 antiserum, anti-VLP RHDV VP60 guinea pig antiserum, antiglobulin conjugate, enzyme substrate and control samples RHD virus antigen positive and negative.

Korzystnie, gdy składniki czynne (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy. Korzystnie, gdy antygen wirusa RUD zawarty w badanej próbce, wiąże się do surowicy opłaszczającej - odpornościowej surowicy króliczej anty-VLP RHDV VP60) i jest dostępny dla immunoglobulin (IgG) anty-VLP RHDV VP60 obecnych w surowicy świnki morskiej.Preferably, the active ingredients (antisera) have been obtained by immunizing laboratory animals with the recombinant structural protein VP60 of the RHD virus, purified by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Preferably, the RUD virus antigen contained in the test sample binds to the coat serum - rabbit anti-VLP RHDV VP60 immune serum) and is available to the anti-VLP RHDV VP60 immunoglobulin (IgG) present in guinea pig serum.

Korzystnie, gdy testowane próbki, których wartość OD492 jest co najmniej dwukrotnie wyższa od wartości absorbcji (OD) dla kontroli ujemnej są dodatnie. Korzystnie, gdy poliwalentne, monospecyficzne surowice odpornościowe królika i świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia zwierząt, po przeprowadzeniu dwóch kolejnych szczepień drogą iniekcji podskórnej, w odstępie 21-28 dni.Preferably, the test samples whose OD492 value is at least twice the absorbance (OD) value of the negative control are positive. Preferably, the polyvalent, monospecific antisera of rabbit and guinea pig have been obtained by active immunization of the animals after two successive vaccinations by subcutaneous injection, 21-28 days apart.

Korzystnie gdy do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną, monospecyficzną, surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.Preferably, a polyvalent, monospecific, rabbit antiserum (primary antibodies) immunized with the pseudoviral particle fraction of the RHD virus - a recombinant structural protein of 60 kDa (RHDV VP60 VLP) obtained in the baculovirus system by expression of the complete vp60 gene ( 1800 bp) of the hemagglutinating SGM strain of the RHD virus.

Korzystnie gdy surowicę wykrywającą (drugie przeciwciała) stanowi poliwalentna, monospecyficzna, surowica odpornościowa świnki morskiej immunizowanej frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD (VLP RHDV VP60), uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.Preferably the detection serum (second antibodies) is a polyvalent monospecific guinea pig antiserum immunized with a fraction of pseudoviral RHD virus (VLP RHDV VP60) obtained in a baculovirus system by expressing the complete vp60 gene (1800 bp) of the hemagglutinating SGM strain of the RHD virus.

Korzystnie, gdy koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową, zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride - OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.Preferably, the antiglobulin conjugate is serum containing guinea pig anti-IgG antibodies bound to the enzyme horseradish peroxidase, and the substrate is a chemical compound - o-phenylenediamine dihydrochloride - OPD activated with hydrogen peroxide - H2O2.

Korzystnie, gdy próby kontrolne antygenu RHDV - dodatnią i ujemną stanowią oczyszczone homogenaty tkankowe.Preferably, the RHDV antigen positive and negative controls are purified tissue homogenates.

Korzystnie, gdy dodatni antygen wirusa (+)RHDV stanowi 20% zawiesina wątroby królika zakażonego zakaźnym szczepem wirusa krwotocznej choroby królików o właściwościach hemaglutynujących, inaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1. Korzystnie, gdy ujemny antygen wirusa (-) RHDV stanowi 20% zawiesina uzyskana z wątroby zdrowych królików, oczyszczona chloroformem i zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.Preferably, the positive antigen of the (+) RHDV virus is a 20% suspension of rabbit liver infected with an infectious strain of rabbit hemorrhagic disease virus with haemagglutinating properties, inactivated and purified by centrifugation, chloroforming and preserved with glycerol in a ratio of 1: 1. Preferably, the negative (-) RHDV virus antigen is a 20% suspension obtained from the liver of healthy rabbits, purified with chloroform and preserved with glycerol in a 1: 1 ratio.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.Exemplary embodiments of the above-defined invention are presented below.

P r z y k ł a d I. Oceniano dynamikę powstawania swoistych przeciwciał (serokonwersję) w surowicach zwierząt laboratoryjnych - królików i świnek morskich immunizowanych dwukrotnie oczyszczonym, rekombinowanym białkiem SGM1800 VP60 w koncentracji ok. 100 μg/ml, z dodatkiem adiuwanta Freunda w formie pełnej (CFA) i niepełnej (ICFA).Example I. The dynamics of the development of specific antibodies (seroconversion) in the sera of laboratory animals - rabbits and guinea pigs immunized twice with purified, recombinant SGM1800 VP60 protein at a concentration of approx. 100 μg / ml, with the addition of Freund's adjuvant in full form (CFA) was assessed and incomplete (ICFA).

Zwierzęta szczepiono śródskórnie i podskórnie, w odstępie 21 dni (świnki morskie) lub 28 dni (króliki). Preparat rekombinowanego białka SGM1800 VP60 - cząstki pseudowirusowe VLP obecne w pożywce hodowli komórek owadzich Sf9 oczyszczono metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy (60-10%) przy 82000xg, w temp. 4°C przez 1,3 h.The animals were vaccinated intradermally and subcutaneously at an interval of 21 days (guinea pigs) or 28 days (rabbits). SGM1800 VP60 recombinant protein preparation - VLP pseudoviral particles present in the Sf9 insect cell culture medium were purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient (60-10%) at 82,000 xg, at 4 ° C for 1.3 h.

Do immunizacji użyto wybranych frakcji gradientu zawierających cząstki pseudowirusowe VLP o największej aktywności antygenowej, oznaczonej metodami western blotting, ELISA i w odczynie hemaglutynacji.Selected gradient fractions containing pseudoviral VLP particles with the highest antigenic activity, determined by western blotting, ELISA and hemagglutination methods, were used for immunization.

Czterem królikom przy pierwszym szczepieniu podano po 1 ml zawiesiny zawierającej 0,5 ml białka rekombinowanego i 0,5 ml CFA, natomiast przy drugiej immunizacji podano 0,6 ml zawiesiny złożonej po równych częściach z białka rekombinowanego SGM1800VP60 i ICFA. Piąty królik - nieszczepiony stanowił kontrolę.Four rabbits were given 1 ml of the suspension containing 0.5 ml of recombinant protein and 0.5 ml of CFA for the first immunization, while for the second immunization 0.6 ml of the suspension composed of equal parts of the recombinant protein SGM1800VP60 and ICFA were administered. The fifth rabbit - unvaccinated was the control.

PL 205 228 B1PL 205 228 B1

Trzy świnki morskie immunizowano dwukrotnie podając kompozycję złożoną po równych częściach z pożywki hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko VP60 i z adiuwanta CFA lub ICFA. Każdej śwince morskiej podawano po 0,5 ml mieszaniny.Three guinea pigs were immunized twice with a composition composed of aliquots of insect cell culture medium containing the recombinant VP60 protein and either CFA or ICFA adjuvant. Each guinea pig was given 0.5 ml of the mixture.

Od immunizowanych zwierząt pobierano krew przed szczepieniem, po 14, 21 (lub 28) dniach po pierwszej immunizacji oraz 14 dnia po podaniu przypominającej dawki rekombinowanego antygenu.Blood was drawn from immunized animals prior to vaccination, 14, 21 (or 28) days after the first immunization, and 14 days after a booster dose of the recombinant antigen.

Na podstawie serologicznych badań w kierunku przeciwciał dla wirusa RHD wykonanych w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) i testem ELISA u immunizowanych zwierząt stwierdzono bardzo wysokie koncentracje swoistych przeciwciał po okresie obserwacji. Zgodnie z przewidywaniem dynamiczny wzrost miana przeciwciał nastąpił po podaniu przypominającej dawki antygenu. Od zwierząt zebrano poliklonalne, monospecyficzne surowice odpornościowe o mianach d 1/5120 do 1/40960, które użyto do opracowania i standaryzacji testu ELISA do diagnostyki wirusologicznej i serologicznej RHD.On the basis of serological tests for antibodies to the RHD virus performed in the inhibition of haemagglutination (HI) and ELISA test, very high concentrations of specific antibodies were found in the immunized animals after the observation period. As expected, the dynamic increase in the antibody titer occurred after the administration of a booster dose of the antigen. Polyclonal monospecific antisera with titers d 1/5120 to 1/40960 were collected from the animals and used for the development and standardization of the ELISA assay for virological and serological diagnosis of RHD.

Schemat nr 1Scheme no 1

ELISA test serologiczny - rozmieszczenie próbek badanych i kontrolnych (badanie punktowe*)ELISA serological test - distribution of test and control samples (spot test *)

1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 A AND 1 1 1 1 9 9 9 9 17 17 17 17 25 25 25 25 33 33 33 33 Ks (-) Ks (-) Ks (-) Ks (-) B B 2 2 2 2 10 10 10 10 18 18 18 18 26 26 26 26 34 34 34 34 Ks (+) Ks (+) Ks (+) Ks (+) C C. 3 3 3 3 11 11 11 11 19 19 19 19 27 27 27 27 35 35 35 35 Ks prog Ks prog Ks prog Ks prog D D 4 4 4 4 12 12 12 12 20 twenty 20 twenty 28 28 28 28 36 36 36 36 Ks prog Ks prog Ks prog Ks prog E E. 5 5 5 5 13 13 13 13 21 21 21 21 29 29 29 29 37 37 37 37 Ka Ka Ka Ka F F. 6 6 6 6 14 14 14 14 22 22 22 22 30 thirty 30 thirty 38 38 38 38 Ka Ka Ka Ka G G. 7 7 7 7 15 15 15 15 23 23 23 23 31 31 31 31 39 39 39 39 Ka Ka Ka Ka H H. 8 8 8 8 16 16 16 16 24 24 24 24 32 32 32 32 40 40 40 40 Ka Ka Ka Ka

Objaśnienia:Explanations:

Ks (-) - kontrola surowicy ujemnejKs (-) - negative serum control

Ks (+) - kontrola surowicy dodatniejKs (+) - positive serum control

Ks prog. - kontrola surowicy niskododatniej (progowej)Rev. - low-positive (threshold) serum control

Ka - kontrola antygenu * identyczny wzór rozmieszczenia próbek kontrolnych (surowic i antygenu) stosuje się podczas mianowania surowic.Ka - antigen control * identical pattern of the distribution of the control samples (sera and antigen) is used during the titration of the sera.

P r z y k ł a d II. Badanie punktowe lub mianowanie surowicyP r z x l a d II. Spot test or serum titration

Do wykonania testu ELISA w celu badania surowic króliczych wykorzystano w zestawie płaskodenne mikropłytki ELISA o dużych właściwościach sorbcyjnych IgG (maxisorb, Nunc) oraz płytki okrągłodenne. Płytki ELISA opłaszcza się monospecyficzną króliczą surowicą odpornościową anty-VLP RHDV w optymalnym rozcieńczeniu 1/4000 w buforze węglanowym o pH 9.6 i inkubuje przez 18-24 godz. W temp. 4-8°C. Równolegle, na płytki okrągłodenne (w kolumnach 1-10) nanosi się surowice badane oraz kontrolne (kolumny 11 i 12) w rozcieńczeniu 1/10 lub w kolejnych rozcieńczeniach w postępieTo perform the ELISA test for the examination of rabbit sera, flat-bottom ELISA microplates with high sorption properties of IgG (maxisorb, Nunc) and round-bottom plates were used in the set. The ELISA plates are coated with monospecific rabbit anti-VLP RHDV antiserum at an optimal dilution of 1/4000 in carbonate buffer at pH 9.6 and incubated for 18-24 hours. At 4-8 ° C. In parallel, the test and control sera (columns 11 and 12) are applied to the round-bottom plates (columns 11 and 12) at a dilution of 1/10 or in successive dilutions in progress.

2-krotnym, tj. 1/10, 1/20, 1/40 itd. w buforze PBS + 0.05% Tween 20 (PBST), po czym do wszystkich zagłębień nanosi się po 50 μΐ rekombinowanego antygenu (VLP RHDV) w rozcieńczeniu 1/1500. Każdą surowicę w badaniu punktowym nakłada się dwukrotnie (schemat rozmieszczenia surowic badanych, kontrolnych i kontroli antygenu w badaniu punktowym i podczas mianowania - schemat nr 1). Płytki inkubuje się przez 18-24 godz. w temperaturze 4-8°C. Następnego dnia płytki ELISA przemywa się 5 razy buforem PBST i do odpowiednich studzienek przenosi po 50 μl mieszaniny antygen/surowica z płytki okrągłodennej. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C, płytkę przemywa się j/w i do każdej studzienki na krapla się po 50 μl monospecyficznej surowicy, odpornościowej świnki morskiej anty-VLP RHDV rozcieńczonej w stosunku 1/8000 w buforze PBST zawierającym 1-2% albuminy bydlęcej lub surowicy cielęcej (PBST-BSA). Płytkę inkubuje się 1 godzinę w temp. 37°C i po przemyciu j/w nakrapla koniugat - swoiste IgG królicze anty IgG świnki morskiej znakowane enzymem peroksydazą chrzanową (HRP) w ilości 50 μl/studzienkę, w rozcieńczeniu 1/1000 w buforze PBST +BSA. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C i po przemyciu j/w dodaje się substrat OPD (50 μl/studzienkę)2 times, i.e. 1/10, 1/20, 1/40, etc. in PBS + 0.05% Tween 20 (PBST), then 50 μΐ of recombinant antigen (VLP RHDV) in a dilution of 1 / 1500. Each prick test serum is applied in duplicate (spot, control and antigen control sera distribution scheme in the prick and titration test - scheme no. 1). Plates are incubated for 18-24 hours. at 4-8 ° C. The next day, the ELISA plates are washed 5 times with PBST buffer and 50 µl of the round bottom antigen / serum mixture is transferred to the appropriate wells. After 1 hour incubation at 37 ° C, the plate is washed as above and 50 μl of monospecific serum, anti-VLP RHDV immune guinea pig, diluted 1/8000 in PBST buffer containing 1-2%, is dripped into each well. bovine albumin or calf serum (PBST-BSA). The plate is incubated for 1 hour at 37 ° C and, after washing as above, the conjugate - specific rabbit IgG anti IgG guinea pig, labeled with the enzyme horseradish peroxidase (HRP) in the amount of 50 μl / well, diluted 1/1000 in PBST + buffer BSA. After 1 hour incubation at 37 ° C and after washing with the above mentioned, the OPD substrate is added (50 μl / well)

PL 205 228 B1 aktywowany H2O2, w buforze cytrynianowym o pH 5.0 w celu wywołania reakcji barwnej. Po 10-15 minutach reakcję barwną hamuje się nanosząc po 50 μΐ 1M roztworu H₂SO₄.Activated H 2 O 2 in citrate buffer pH 5.0 to induce a color reaction. After 10-15 minutes, the color reaction is stopped by applying 50 μΐ of 1M H ₂ SO _{4 solution each} .

Wyniki odczytuje się spektrofotometrycznie przy użyciu czytnika do mikro płytek przy długości fali 492 nm. Surowice, których wartość ekstynkcji w badaniu punktowym jest niższa niż 50% średniej wartości OD492 dla kontroli antygenu należy traktować jako dodatnie. Miano przeciwciał wyraża końcowe rozcieńczenie surowicy, przy którym wartość ekstynkcji stanowi 50% OD492 dla kontroli antygenu. Surowice referencyjne (ujemne, dodatnia i progowa) stanowią kontrolę prawidłowości wykonania badania.The results are read spectrophotometrically in a microplate reader at 492 nm. Sera whose extinction value on the spot test is less than 50% of the mean OD492 value for the antigen control should be considered positive. The antibody titer expresses the final dilution of the serum where the extinction value is 50% of the OD492 for the antigen control. Reference sera (negative, positive and threshold) are a control of the correctness of the test.

LITERATURALITERATURE

Alonso J.M., Casais R., Boga J.A., Parra Fr. Processing of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Polyprotein. 1996. J. Virol. 70, 1261-1265.Alonso J.M., Casais R., Boga J.A., Parra Fr. Processing of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Polyprotein. 1996. J. Virol. 70, 1261-1265.

Anon. (2004) Manual of diagnostic tests and vaccine for terrestrial animals. OIE, fifth edition, chapter 2.8.3.Anon. (2004) Manual of diagnostic tests and vaccine for terrestrial animals. OIE, fifth edition, chapter 2.8.3.

Bertagnoli S., Gelfi J., Petit F., Vautherot J.F., Rasschaert D., Laurent S., Gall Le G., Boilletot E., Chantal J., Boucraut-Baralon C. Protection of rabbits against viral haemorrhagic disease with a vaccinia-RHDV recombinant virus. Vacine, 1996 14, 506-510.Bertagnoli S., Gelfi J., Petit F., Vautherot JF, Rasschaert D., Laurent S., Gall Le G., Boilletot E., Chantal J., Boucraut-Baralon C. Protection of rabbits against viral haemorrhagic disease with a vaccinia-RHDV recombinant virus. Vacine, 1996 14, 506-510.

Boga J.A., Casais R., Marin M.S., Martin Alonso J.M., Carmenes R.S., Prieto., Parra F.: Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the capsid protein gene from rabbit haemorrhagic disease virus (Spanish isolate AST/89). J. Gen. Virol. 1994, 75, 2409-2413Boga JA, Casais R., Marin MS, Martin Alonso JM, Carmenes RS, Prieto., Parra F .: Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the capsid protein gene from rabbit haemorrhagic disease virus (Spanish isolate AST / 89) . J. Gen. Virol. 1994, 75, 2409-2413

Boga J.A., Martin Alonso J.M., Casais R., Parra F.: A single dose immunization with rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2315-2318,Boga J.A., Martin Alonso J.M., Casais R., Parra F .: A single dose immunization with rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2315-2318,

Castanon S., Marin M.S., Martin-Alonso J.M., Boga J.A., Casais R., Humara J.M., Ordas R.J., Parra F. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 1999, 73, 4452-4455.Castanon S., Marin M.S., Martin-Alonso J.M., Boga J.A., Casais R., Humara J.M., Ordas R.J., Parra F. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 1999, 73, 4452-4455.

Chasey D., Lucas M.H., Westcott D.G., Sharp G., Kitching A., Hughes S.K.: Development of a diagnostic approach to the identification of rabbit haemorrhagic disease. Vet. Rec. 1995, 137, 158-160,Chasey D., Lucas M.H., Westcott D.G., Sharp G., Kitching A., Hughes S.K .: Development of a diagnostic approach to the identification of rabbit haemorrhagic disease. Vet. Rec. 1995, 137, 158-160,

Chomczyhski P., Sacchi N.(1978). Single-step method of RNA isolation by amid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Bioch., 162, 156-159,Chomczyhski P., Sacchi N. (1978). Single-step method of RNA isolation by amid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Bioch., 162, 156-159.

Fitzner A., Kęsy A., Niedbalski W., Paprocka G. 1999, Medycyna Wet. 55, 120-122. Zastosowanie reakcji RT-PCR do identyfikacji szczepów wirusa krwotocznej choroby królików (RHD) wyosobnionych w Polsce.Fitzner A., Kęsy A., Niedbalski W., Paprocka G. 1999, Medycyna Wet. 55, 120-122. Application of RT-PCR to identify rabbit haemorrhagic disease virus (RHD) strains isolated in Poland.

Górski J., Mizak B., Mizak Z., Komorowski A.: Obraz kliniczny oraz zmiany anatomopatologiczne w przebiegu pomoru królików (wirusowej krwiotocznej bronchopneumonii królików). Życie wet. 1988, 63, 266-269.Górski J., Mizak B., Mizak Z., Komorowski A .: Clinical picture and anatomopathological changes in the course of rabbit fever (viral haemorrhagic bronchopneumonia of rabbits). Life vet. 1988, 63, 266-269.

Jiang X., Graham D. Y., Wang M., Estes M. K.: Expression, self assembly and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. J. Virol. 1992, 66, 6527-6532,Jiang X., Graham D. Y., Wang M., Estes M. K .: Expression, self assembly and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. J. Virol. 1992, 66, 6527-6532,

Laurent S., Vautherot J-F., Madelaine M-F., Le Gall G., Rasschaert D.: Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protecion. J. Virol. 1994, 68, 6794-6798.Laurent S., Vautherot J-F., Madelaine M-F., Le Gall G., Rasschaert D .: Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protecion. J. Virol. 1994, 68, 6794-6798.

Laurent S. Vautherot J-F., Gall le G., Madelaine M-F., Rasschaert D.: Structural, antigenic and immunogenic relationships between European brown hare syndrome virus and rabbit haemorrhagic disease virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2803-2811,Laurent S. Vautherot J-F., Gall le G., Madelaine M-F., Rasschaert D .: Structural, antigenic and immunogenic relationships between European brown hare syndrome virus and rabbit haemorrhagic disease virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2803-2811,

Liu S.J., Xue H.P., Pu B.Q., Quian N.H.: A new viral disease in rabbits. Anim. Husb. Vet. Med. 1984, 16, 253-255)Liu S.J., Xue H.P., Pu B.Q., Quian N.H .: A new viral disease in rabbits. Anim. Husb. Vet. Med. 1984, 16, 253-255)

Meyers G.C., Wirblich H., Thiel H-J.: Rabbit hemorrhagic disease virus molecular-cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome. Virology 1991, 184, 664-676,Meyers G.C., Wirblich H., Thiel H-J .: Rabbit hemorrhagic disease virus molecular-cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome. Virology 1991, 184, 664-676,

Meyers G., Wirblich CH., Thiel H-J.: Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles. Virology 1991,184, 677-686.Meyers G., Wirblich CH., Thiel H-J .: Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles. Virology 1991, 184, 677-686.

Nagesha H. S., Wang L.F., Hyatt A. D., Morrissy C. J., Lenghaus C., Westbury H. A.: Self assembly, antigenicity, and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus (Czechoslovakian strain V-351) capsid protein expressed in baculovirus. Arch. Virol. 1995, 140, 1095-1108,Nagesha H. S., Wang L.F., Hyatt A. D., Morrissy C. J., Lenghaus C., Westbury H. A .: Self assembly, antigenicity, and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus (Czechoslovakian strain V-351) capsid protein expressed in baculovirus. Arch. Virol. 1995, 140, 1095-1108,

Ohlinger V. F., Haas B., Meyers G., Weiland F., Thiel H-J.: Identification of the virus causing rabbit hemorrhagic disease. J. Virol. 1990, 64, 3331-3336,Ohlinger V. F., Haas B., Meyers G., Weiland F., Thiel H-J .: Identification of the virus causing rabbit hemorrhagic disease. J. Virol. 1990, 64, 3331-3336,

PL 205 228 B1PL 205 228 B1

Parra F., Prieto M.: Purification and characterization of a calicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits. J. Virol. 1990, 64, 4013-4015.Parra F., Prieto M .: Purification and characterization of a calicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits. J. Virol. 1990, 64, 4013-4015.

Rasschaert D., Huguet S., Madelaine M-F., Vautherot J-F.: Sequence and genomic organization of a rabbit hemorrhagic disease virus isolated from a wild rabbit. Virus Genes. 1994, 9:2, 121-132.Rasschaert D., Huguet S., Madelaine M-F., Vautherot J-F .: Sequence and genomic organization of a rabbit hemorrhagic disease virus isolated from a wild rabbit. Virus Genes. 1994, 9: 2, 121-132.

Sibilia M., Boniotti M. B., Angoscini P., Capucci L., Rossi C.: Two independent pathways of expression lead to self-assembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein. J. Virol. 1995, 69, 5812-5815.Sibilia M., Boniotti M. B., Angoscini P., Capucci L., Rossi C .: Two independent pathways of expression lead to self-assembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein. J. Virol. 1995, 69, 5812-5815.

Claims (21)

1. Zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oparty na teście ELISA, znamienny tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje surowicę opłaszczającą - króliczą monospecyficzną surowicę odpornościową anty-VLP RHDV, swoisty antygen - VLP RHDV, surowicę wykrywającą - monospecyficzną surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy znakowany enzymem, substrat enzymatyczny oraz surowice królicze kontrolne, ujemną i wysokododatnią oraz niskododatnią - progową zawierające swoiste przeciwciała przeciw wirusowi RHD.1. A serological diagnostic kit for testing animal sera for the presence of RHD antibodies based on an ELISA test, characterized in that the diagnostic kit includes a coat serum - rabbit monospecific anti-VLP RHDV antiserum, specific antigen - RHDV VLP, detection serum - monospecific mumps antiserum marine anti-VLP RHDV VP60, enzyme-labeled antiglobulin conjugate, enzyme substrate and negative, high-positive and low-positive rabbit control rabbit sera containing specific antibodies to the RHD virus. 2. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że składniki czynne zestawu (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.2. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the active components of the kit (immune sera) were obtained by immunizing laboratory animals with the recombinant structural protein VP60 of the RHD virus, purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient. 3. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną monospecyficzną surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego o masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.3. The diagnostic kit according to claim 1, A method according to claim 1, characterized in that a polyvalent monospecific rabbit antiserum (primary antibodies) immunized with a fraction of pseudoviral RHD virus particles - a recombinant structural protein of 60 kDa (VLP RHDV VP60) obtained in a baculovirus system as a result of expression is used for the coating of the plate with sorbent properties. the full vp60 gene (1800 bp) of the hemagglutinating SGM strain of the RHD virus. 4. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen używany w fazie płynnej testu w stanowi pożywka komórek owadzich linii Spodoptera frugiperda transfekowanych rekombinowanym bakulowirusem (SGM1800 BacV) przy m.o.i 2,0 - zebrana 4 dnia po zakażeniu hodowli komórek, konserwowana glicerolem.4. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the antigen used in the liquid phase of the assay is medium for Spodoptera frugiperda insect cells transfected with recombinant baculovirus (SGM1800 BacV) at m.o.i 2.0 - harvested on day 4 after infection of the cell culture, conserved with glycerol. 5. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1 albo 3, albo 4, znamienny tym, że cząstki pseudowirusowe VLP są w postaci pożywki z hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko strukturalne kapsydu wirusa RHD (VLP PvHDV VP60)5. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, 3 or 4, characterized in that the pseudoviral VLPs are in the form of an insect cell culture medium containing the recombinant RHD virus capsid structural protein (VLP PvHDV VP60) 6. Zestaw diagnostyczny wed ł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.6. A diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the antiglobulin conjugate is serum containing guinea pig anti-IgG antibodies bound to the enzyme horseradish peroxidase, and the substrate is a chemical compound - o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD activated with hydrogen peroxide - H2O2. 7. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną ujemną w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem krwotocznej choroby królików.7. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, wherein the rabbit haemorrhagic disease negative reference serum - RHD is obtained by mixing aliquots of sera derived from clinically healthy, unvaccinated rabbits that have never been in contact with rabbit haemorrhagic disease virus. 8. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e surowicę referencyjną wysokododatnią w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD, stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji królików inaktywowanym, natywnym wirusem RHD, poddanych zakażeniu zjadliwym wirusem.8. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, characterized in that the reference serum highly positive for rabbit haemorrhagic disease - RHD is rabbit serum obtained after immunization of rabbits with inactivated, native RHD virus infected with the virulent virus. 9. Zestaw diagnostyczny wedł ug zastrz. 1 albo 8, znamienny tym, ż e surowicę referencyjną wysokododatnią cechuje miano w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) nie mniejsze niż 1280.9. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1 or 8, characterized in that the highly positive reference serum has a hemagglutination inhibition (HI) titer of not less than 1280. 10. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną niskododatnią - progową stanowi surowica królików immunizowanych szczepionką przeciwko pomorowi królików, zebrana między 10-14 dniem po szczepieniu o mianie HI 1/40 - 1/80.10. The diagnostic kit according to claim 1, The method of claim 1, wherein the low positive - threshold reference serum is serum of rabbits immunized with the rabbit vaccine, collected between days 10-14 after vaccination with an HI titer of 1/40 - 1/80. 11. Zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD oparty na teście ELISA, znamienny tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje odpornościową surowicę króliczą anty-VLP RHDV VP60, surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz kontrolne próby antygenu wirusa RHD - dodatnią i ujemną.11. Diagnostic kit for the detection of RHD virus based on the ELISA test, characterized in that the diagnostic kit comprises rabbit anti-VLP RHDV VP60 immune serum, guinea pig anti-VLP RHDV VP60 antiserum, antiglobulin conjugate, enzyme substrate and RHD virus antigen controls - positive and negative. PL 205 228 B1PL 205 228 B1 12. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że składniki czynne (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.The kit according to claim 11, characterized in that the active ingredients (antisera) have been obtained by immunizing laboratory animals with RHD recombinant structural protein VP60, purified by ultracentrifugation in a sucrose density gradient. 13. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że antygen wirusa RHD zawarty w badanej próbce, wiąże się do surowicy opłaszczającej -odpornościowej surowicy króliczej anty-VLP RHDV VP60) i jest dostępny dla immunoglobulin (IgG) anty-VLP RHDV VP60 obecnych w surowicy świnki morskiej.13. The kit according to p. The method of claim 11, wherein the RHD virus antigen contained in the test sample binds to the coat serum (RHDV VP60 rabbit immune serum) and is available for anti-VLP RHDV VP60 immunoglobulin (IgG) present in guinea pig serum. 14. Zestaw według zastrz. 11 albo 13, znamienny tym, że testowane próbki, których wartość OD492 jest co najmniej dwukrotnie wyższa od wartości absorbcji (OD) dla kontroli ujemnej są dodatnie.14. The kit according to p. The process according to claim 11 or 13, characterized in that the test samples having an OD492 value at least twice the absorbance (OD) value of the negative control are positive. 15. Zestaw według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że poliwalentne, monospecyficzne surowice odpornościowe królika i świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia zwierząt, po przeprowadzeniu dwóch kolejnych szczepień drogą iniekcji podskórnej, w odstępie 21-28 dni.15. The kit according to p. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the polyvalent, monospecific antisera of rabbit and guinea pig are obtained as a result of active immunization of the animals after two consecutive vaccinations by subcutaneous injection with an interval of 21-28 days. 16. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną monospecyficzną surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.16. The kit according to p. A method according to claim 11, characterized in that a polyvalent monospecific rabbit antiserum (primary antibodies) immunized with a fraction of pseudoviral RHD virus particles - a recombinant structural protein of 60 kDa (VLP RHDV VP60) obtained in a baculovirus system by expression of full the vp60 gene (1800 bp) of the hemagglutinating SGM strain of the RHD virus. 17. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że surowicę wykrywającą (drugie przeciwciała) stanowi poliwalentną, monospecyficzną, surowica odpornościowa świnki morskiej immunizowanej frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD (VLP RHDV VP60), uzyskanych w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.17. The kit according to claim 11, characterized in that the detection serum (second antibodies) is a polyvalent, monospecific, guinea pig antiserum immunized with a fraction of pseudoviral RHD virus particles (VLP RHDV VP60) obtained in a baculovirus system by expressing the complete vp60 gene (1800 pz) haemagglutinating SGM strain of RHD virus. 18. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.18. The kit according to claim 11, characterized in that the antiglobulin conjugate is serum containing guinea pig anti-IgG antibodies bound to the enzyme horseradish peroxidase and the substrate is a chemical compound - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride OPD activated with hydrogen peroxide - H2O2. 19. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że próby kontrolne antygenu RHDV - dodatnią i ujemną stanowią oczyszczone homogenaty tkankowe.19. The kit according to claim 11, characterized in that the RHDV antigen positive and negative controls are purified tissue homogenates. 20. Zestaw według zastrzeżenia 11 albo 20, znamienny tym, że dodatni antygen wirusa (+)RHDV stanowi 20% zawiesina wątroby królika zakażonego zakaźnym szczepem wirusa krwotocznej choroby królików o właściwościach hemaglutynujących, inaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.Kit according to claim 11 or 20, characterized in that the positive antigen of the (+) RHDV virus is a 20% suspension of rabbit liver infected with an infectious strain of rabbit haemorrhagic disease virus with haemagglutinating properties, inactivated and purified by centrifugation, chloroforming and preserved with glycerol in a proportion of 1 : 1. 21. Zestaw według zastrzeżenia 11 albo 20, znamienny tym, że ujemny antygen wirusa (-) RHDV stanowi 20% zawiesina uzyskana z wątroby zdrowych królików, oczyszczona chloroformem i zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.21. Kit according to claim 11 or 20, characterized in that the (-) RHDV negative antigen is a 20% suspension obtained from the liver of healthy rabbits, purified with chloroform and preserved with glycerol in a 1: 1 ratio.