PL203462B1 - Physiologically active granulocyte colony stimulating factor (GCSF) conjugates, compositions containing them and a method of producing a PEG-GCSF conjugate - Google Patents

Physiologically active granulocyte colony stimulating factor (GCSF) conjugates, compositions containing them and a method of producing a PEG-GCSF conjugate Download PDF

Info

Publication number
PL203462B1
PL203462B1 PL363117A PL36311700A PL203462B1 PL 203462 B1 PL203462 B1 PL 203462B1 PL 363117 A PL363117 A PL 363117A PL 36311700 A PL36311700 A PL 36311700A PL 203462 B1 PL203462 B1 PL 203462B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
conjugate
gcsf
conjugates
peg
mutein
Prior art date
Application number
PL363117A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL363117A1 (en
Inventor
Sebastian Bailon Pascal
Original Assignee
Amgen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen filed Critical Amgen
Publication of PL363117A1 publication Critical patent/PL363117A1/en
Publication of PL203462B1 publication Critical patent/PL203462B1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku s a fizjologicznie aktywne koniugaty czynnika stymuluj acego tworzenie kolonii granulocytów (GCSF), zawieraj ace je kompozycje i sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF. Czynnik stymuluj acy tworzenie kolonii granulocytów (GCSF) jest farmaceutycznie aktywnym bia lkiem reguluj acym proliferacj e, ró znicowanie i funkcjonaln a aktywacj e granulocytów oboj etnoch lon- nych (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan i wsp. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, i wsp. Blood 81(11): 3158-3163 (1993); Roberts i wsp., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben i wsp. Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF mo ze pobudza c komórki macierzyste i prekursorowe szpiku kostnego i jest stosowany w leczeniu pacjentów, u których w wyniku chemoterapii zmniejszy la si e liczba granulocytów lub jako wst ep do przeszczepu szpiku kostnego. W patencie U.S. Nr 5,214,132 ujawniono mutein e ludzkiego GCSF ró zni ac a si e od naturalnego hGCSF w pozycjach 1, 3, 4, 5 i 17, w której zamiast aminokwasów naturalnych dla GCSF wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser (Patrz równie z, doniesienie Kuga i wsp., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe i wsp. (Blood 75(9): 1788-1793 (1 maja 1990)) o pochod- nej rhGCSF, w której aminokwasy s a zast apione w pi eciu miejscach N-ko ncowego regionu rhGCSF, wykazuj acej wy zsz a aktywno sc specyficzn a ni z nienaruszony rhGCSF, w dwóch oznaczeniach na mysich i/lub ludzkich progenitorowych komórkach szpiku kostnego. W patencie U.S. Nr 5,218,092 ujawniono mutein e ludzkiego GCSF ró zni ac a si e od naturalnego hGCSF w pozycjach 1, 3, 4, 5, 17, 145 i 147, gdzie zamiast wyst epuj acych w naturalnym GCSF aminokwasów w muteinie wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn i Ser. Tre sc patentów U.S. Nr. 5,214,132 i 5,218,092 jest w laczona tu przez odniesienie. Dost epno sc biologiczna bia lek leczniczych, takich jak GCSF, jest cz esto ograniczona przez ich krótki pó lokres trwania w osoczu i wra zliwo sc na degradacj e przez proteazy, co zmniejsza ich maksy- malny potencja l kliniczny. Badania innych bia lek leczniczych pokaza ly, ze takie trudno sci mo zna prze- zwyciezy c przez sprz eganie bia lek z polimerami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG), zazwyczaj przy pomocy cz asteczki lacznikowej (linkera) kowalencyjnie po laczonej zarówno z bia lkiem jak i z PEG. Pokazano, ze takie, b ed ace koniugatami z PEG, biocz asteczki maj a w la sciwo sci klinicznie u zy- teczne (Inada i wsp., J. Bioact. and Compatible Polymers, 5:343 (1990); Delgado i wsp., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992); i Katre, Advanced Drug Delivery Sys- tems, 10:91 (1993)). W la sciwo sciami tymi s a, mi edzy innymi, lepsza stabilno sc fizyczna i termiczna, ochrona przed degradacj a enzymatyczn a, zwi ekszona rozpuszczalno sc i wyd lu zony pó lokres trwania in vivo, zmniejszony klirens, zmniejszona immunogenno sc, antygenowo sc i zmniejszona toksyczno sc. Koniugaty PEG-GCSF o odmiennej strukturze ni z koniugaty wed lug wynalazku, zosta ly ujaw- nione w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 335 423; w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 401 384; R.W. Niven i wsp., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); i Satake-Ishikawa i wsp., Celi Structure and Function, 17: 157-160 (1992)). Wynalazek dotyczy nowej klasy pochodnych GCSF z glikolem polietylenowym dalej okre slanym jako PEG. Jak pokazano ni zej, koniugat wed lug wynalazku posiada linker amidowy. Fizjologicznie aktywny koniugat wed lug wynalazku przedstawiony jest wzorem I w którym G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; R oznacza ni zszy alkil; n jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550, a m jest liczb a ca lkowit a od 1 do 5. Korzystnie R oznacza metyl, n wynosi od 450 do 490, a m wynosi od 1 do 4, bardziej korzystnie m wynosi 2. Korzystnie czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. Korzystnie n w koniugacie wynosi od 450 do 490, a m przyjmuje warto sc od 1 do 4, korzystniej m wynosi 2.PL 203 462 B1 3 Koniugat wed lug wynalazku ma d lu zszy pó lokres kr azenia w ustroju i wi eksz a, in vivo, aktyw- nosc granulopoetyczn a, ni z odpowiadaj acy mu nieskoniugowany czynnik pobudzaj acy tworzenie ko- lonii granulocytów. Korzystny koniugat wed lug wynalazku przedstawiony jest wzorem I w którym R oznacza grup e metylow a; n ma warto sc od 450 do 490; m stanowi 2, a G oznacza Mutein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego. Wynalazek dotyczy równie z kompozycji zawieraj acej fizjologicznie aktywne koniugaty o wzorze I w której w ka zdym koniugacie G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugatach wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; R w ka zdym z koniugatów niezale znie oznacza ni zszy alkil; n w ka zdym z koniuga- tów niezale znie jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550; m w ka zdym z koniugatów niezale znie jest liczb a ca lkowit a od 1 do 4 przy czym zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest 1, wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest 2, wynosi od pi ecdziesi eciu do szescdziesi eciu sze sciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a procentowa zawarto sc koniu- gatów, dla których m jest równe 4, wynosi do pi eciu procent. Korzystnie R oznacza grup e metylow a, a n i R s a takie same w ka zdym koniugacie. Korzystnie n w koniugacie wynosi od 450 do 490. Korzystnie ka zdy z koniugatów czynnika pobudzaj acego tworzenie granulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. Korzystnie kompozycja zawiera koniugaty, w których we wzorze I R oznacza grup a metylow a; n w ka zdym koniugacie ma tak a sam a warto sc i jest liczb a ca lkowi- t a od 450 do 490; G oznacza Mutein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup amino- wych, które tworz a, w ka zdym koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; m w ka zdym koniugacie jest niezale znie liczb a ca lkowit a od 1 do 4; przy czym procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 1 wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; procento- wa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 2, wynosi od piecdziesi eciu do sze scdziesi eciu sze sciu procent; procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 4, wynosi do pi eciu procent. W zakres wynalazku wchodzi równie z sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF o d luzszym pó lokresie kr azenia w ustroju i wi ekszej in vivo aktywno sci granulopoetycznej ni z odpowiadaj acy mu nieskoniugowany GCSF obejmuj acy kowalencyjne wi azanie z reagenta o wzorzePL 203 462 B1 4 z GCSF z wytworzeniem koniugatu. Korzystnie GCSF jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. W porównaniu z niezmodyfikowanym GCSF (to jest, GCSF bez przy laczonego PEG), koniugat wykazuje wyd luzony pólokres kr azenia i czas odporno sci osocza, zmniejszony klirens i zwi ekszon a aktywnosc granulopoetyczn a in vivo. Ponadto, w porównaniu z koniugatami PEG-GCSF, koniugaty wed lug niniejszego wynalazku maj a lepsze w la sciwo sci granulopoetyczne. Inne koniugaty PEG-GCSF ujawniono w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 335 423; w publikacji patentu europejskiego Nr EP 0 401 384 i w Niven, i wsp., Ibid. Jednak koniugaty wed lug tego wynalazku maj a inn a struktur e ni z te koniugaty i lepsze w la sciwo sci, w szczególno sci ujawniaj a d lugo utrzymuj ac a si e, obserwowan a in vivo przy niskich dawkach wysok a aktywnosc granulopoetyczn a. Korzystnie, GCSF stosowany w koniugatach wed lug wynalazku jest mutein a GCSF, która ma w la sciwo sci równowa zne lub lepsze ni z naturalna GCSF i ma takie same zastosowania jak GCSF. Muteina ma tak a sam a sekwencj e aminokwasow a jak GCSF, z wyj atkiem miejsc 1, 3, 4, 5 i 17, w których zamiast aminokwasów wyst epuj acych w naturalnym GCSF w muteinie wyst epuj a odpo- wiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser (mutein a GCSF) (Patrz Fig. 1). Muteina taka jest ujawniona w patencie U.S. Nr. 5,214,132. Koniugaty wed lug niniejszego wynalazku maj a takie samo zastosowanie jak GCSF. W szcze- gólno sci, koniugaty wed lug niniejszego wynalazku s a u zyteczne w leczeniu pacjentów, u których licz- ba granulocytów uleg la zmniejszeniu w wyniku chemioterapii lub jako wst ep do przeszczepu szpiku kostnego, w taki sam sposób jak w przypadku stosowania GCSF. Jednak ze koniugaty wed lug niniej- szego wynalazku maj a udoskonalone w la sciwo sci, w tym doskonala stabilnosc, zwi ekszon a rozpusz- czalno sc, poprawiony pó lokres kr azenia i czasy odporno sci osocza. Opis Figur Fig. 1: Pierwszorz edowa struktura Muteiny GCSF Mutein a GCSF ró zni si e od ludzkiego GCSF typu dzikiego w pozycjach 1, 3, 4, 5 i 17, w których zamiast wyst epuj acych w naturalnym GCSF aminokwasów, w muteinie wyst epuj a odpowiednio Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser. Fig. 2: Reagenty do pegylacji Fig. 3: Oddzielanie muteiny GCSF zmodyfikowanej PEG 20 kDa i niezmodyfikowanej. Typowy profil wyp lukiwania dla mieszaniny reakcyjnej z PEG. Kolumna: 1-2 ml Fractogel® EMD SO 3 650S Bufor do równowa zenia kolumny: 10 mM octan amonu, pH 4,5 Bufory do wyp lukiwania z kolumny: 1. 0,15 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny 2. 0,5 M NaCl w buforze dla równowa zenia kolumny. Fig. 4: Aktywno sc PEG-muteina GCSF 5 dnia po jednorazowym wstrzykni eciu Samicom myszy C57BL/6J wstrzykni eto podskórnie 25,2 µg koniugatu pegylowanej muteiny GCSF; w pi atym dniu po podaniu zbierano próbki krwi zylnej z zatoki pozaoczodo lowej. Przeprowa- dzono analizy hematologiczne metod a Coulter'a i ró znicow a analiz e leukocytów; oznaczony poziom neutrofili standaryzowano w ka zdym do swiadczeniu wzgl edem kontroli b ed acej no snikiem. Wyniki s a warto sciami srednimi ± S.E. uzyskanymi dla grupy licz acej cztery myszy. Fig. 5: Wzrost liczby PMN w funkcji masy PEG (kDa) w koniugatach muteiny GCSF PEG z lacznikiem amidowym i z mocznikowym. Dla koniugatów wytworzonych z reagentem SPA PMN=0,277MW+3,95. Dla koniugatów wytworzonych z mocznikiem PMN=0,152 MW+2,74. Fig. 6: Aktywno sc PEG-muteina GCSF 7 dnia po jednorazowym wstrzykni eciu Samicom myszy C57BL/6J wstrzykni eto podskórnie 25,2 µg pegylowanego koniugatu muteiny GCSF; w siódmym dniu po podaniu zbierano próbki krwi zylnej z zatoki pozaoczodo lowej. PrzeprowadzonoPL 203 462 B1 5 analizy hematologiczne metod a Coulter'a i ró znicow a analiz e leukocytów; oznaczony poziom neutrofili standaryzowano w ka zdym do swiadczeniu wzgl edem kontroli b ed acej no snikiem. Wyniki s a warto- sciami srednimi ± S.E. uzyskanymi dla grupy licz acej cztery myszy. Fig. 7: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC (komórki macierzyste krwi obwodowej) Fig. 8: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 9: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 10: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC Fig. 11: Oznaczenie pobudzenia mysich kolonii PBSC We wzorze I koniugatu wed lug wynalazku warto sci n i m s a dobrane tak, ze uzyskany koniugat o wzorze I ma aktywno sc fizjologiczn a porównywaln a z niezmodyfikowanym GCSF, która to aktyw- nosc mo ze by c taka sama, wi eksza ni z lub mo ze stanowi c cz esc aktywno sci odpowiedniego niezmo- dyfikowanego GCSF. n przedstawia liczb e reszt tlenku etylenu w jednostce PEG. Pojedyncza podjed- nostka PEG b ed aca OCH 2 CH 2 ma ciezar cz asteczkowy oko lo 44 daltonów, m przedstawia liczb e jed- nostek PEG do laczonych do cz asteczki GCSF. Koniugat wed lug wynalazku mo ze zawiera c jedn a, dwie, trzy, cztery lub pi ec jednostek PEG na cz asteczk e GCSF. Tak wi ec ciezar cz asteczkowy koniu- gatu (po wy laczeniu ciezaru cz asteczkowego GCSF) zale zy od warto sci n i m. n moze przyjmowa c warto sc od 420 do 550, co daje koniugat w którym ka zda jednostka PEG ma sredni ciezar cz asteczkowy od oko lo 18 kilodaltonów do oko lo 25 kilodaltonów na jednostk e PEG. Korzystnie, n przyjmuje warto sc 450 do 490, co daje koniugat, w którym ka zda jednostka PEG ma sredni ci ezar cz asteczkowy oko lo 20 kilodaltonów, m mo ze przyj ac warto sc 1, 2, 3, 4 lub 5. Korzystnie m wynosi 1-4, a szczególnie korzystnie m wynosi 2. Zakres ciezarów cz asteczkowych koniugatów wed lug wynalazku wynosi od oko lo 18 kilodaltonów (n=420, m=1) do oko lo 125 kilodaltonów (n=550, m=5). Gdy n wynosi od 420 do 550, a m przyjmuje warto sc 1 do 4, to zakres ciezaru cz asteczkowego cz esci koniugatów wed lug wynalazku, b ed acej PEG, wynosi od oko lo 18 kilodaltonów (n=420, m=1) do okolo 97 kilodaltonów (n=550; m=4). Okre slenie „oko lo” przy liczbie oznaczaj acej ciezar cz astecz- kowy oznacza, ze mie sci si e on w rozs adnym zakresie od tej warto sci jak okre slona konwencjonalny- mi technikami analitycznymi. W korzystnym koniugacie n wynosi 450 do 490, a m wynosi 1-4, i w tym przypadku ciezar cz a- steczkowy cz esci PEG koniugatów wynosi od oko lo 20 kilodaltonów (n=450; m~1) do oko lo 86 kilodal- tonów (n=490; m=4). W innym korzystnym koniugacie n wynosi 420 do 550, a m wynosi 2, w którym to przypadku ci ezar cz asteczkowy cz esci PEG koniugatu jest w zakresie od oko lo 37 kilodaltonów (n=420) do oko lo 48 kilodaltonów (m=550). W szczególnie korzystnym koniugacie n wynosi 450 do 490, a m wynosi 2 i w tym przypadku ci ezar cz asteczkowy czesci PEG koniugatu mie sci si e w zakresie od oko lo 40 kilodaltonów (n=450) do oko lo 43 kilodaltonów (n=490). R mo ze oznacza c dowoln a ni zsz a grup e alkilow a, przez co rozumie si e grup e alkilow a zawiera- jac a od jednego do sze sciu atomów w egla, tak a jak grupa metylowa, etylowa, izopropylowa itp. W zakres tego znaczenia w laczone s a alkile o rozga lezionych la ncuchach. Korzystnym alkilem jest metyl. Przez GCSF rozumie si e bia lko naturalne lub zrekombinowane, korzystnie ludzkie, uzyskane z tradycyjnych zróde l, takich jak tkanki, synteza bia lka, hodowle komórkowe komórek naturalnych lub zrekombinowanych. Termin ten obejmuje dowolne bia lka o aktywno sci GCSF, takie jak muteiny lub inaczej zmodyfikowane bia lka. Otrzymywanie i izolowanie GCSF z naturalnych lub zrekombinowanych zróde l jest dobrze znane (patrz przykladowo patenty U.S. Nr. 4,810,643 i 5,532,341). Korzystny ko- niugat GCSF jest koniugatem z mutein a GCSF, jak opisana w patencie U.S. Nr. 5,214,132. Fizjologicznie aktywny koniugat o wzorze I ma aktywno sc GCSF, przez któr a rozumie si e jak a- kolwiek cz esc lub wielokrotno sc jakiejkolwiek znanej aktywno sci GCSF, okre slonej przez ró zne ozna- czenia znane w dziedzinie. W szczególno sci koniugat wed lug niniejszego wynalazku ma aktywnosc GCSF co pokazano przez zdolno sc do zwi ekszania liczby PMN. Jest to znana aktywno sc GCSF. Taka aktywnosc koniugatu mo ze by c oznaczona przy pomocy analiz dobrze znanych w dziedzinie, przyk la- dowo analiz opisanych poni zej (Patrz równie z: Asano i wsp., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773; Yamasaki i wsp., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; i Neben, i wsp., Blood (1993) 81:1960. Koniugaty o wzorze I s a wytwarzane przez kowalencyjne wi azanie GCSF z estrem sukcynimi- dylowym kwasu PEG-propionowego (SPA) b ed acym reagentem o wzorzePL 203 462 B1 6 Reagent o wzorze II mo ze by c uzyskany tradycyjnymi sposobami zgodnymi ze znanymi proce- durami (patrz patent U.S. Nr. 5,672,662). n jest takie samo jak powy zej we wzorze I, i jest tak wybra- ne, by dawa lo koniugat o zadanym ciezarze cz asteczkowym. Korzystne s a takie reagenty, w których n wynosi od 450 do 490 (MW=20 kDa). Inne ci ezary cz asteczkowe mo zna uzyska c przez zmian e n w materiale wyj sciowym PEG-alkohol dla reagenta o wzorze II. Reagent SPA o wzorze II i ciezarach cz asteczkowych 5, 10, 15 i 20 kDa mo zna uzyska c z Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama). Reagent o wzorze II mo ze by c skoniugowany z GCSF sposobami konwencjonalnymi. Wi azanie zachodzi przez wi azanie amidowe. Konkretnie, reagent o wzorze II zasadniczo reaguje z jedn a lub wi eksz a liczb a pierwszorz edowych grup aminowych (przyk ladowo N-koniec i lancuchy boczne lizyny) z GCSF tworz ac wi azanie amidowe pomi edzy GCSF i polimerowym szkieletem PEG. Przedstawiona we wzorze I grupa NH pochodzi od tej pierwszorz edowej grupy (grup) aminowej (aminowych) GCSF, która reaguje z reagentem o wzorze II tworz ac wi azanie amidowe. W mniejszym stopniu reagent o wzorze II mo ze tak ze reagowa c z grup a hydroksylow a seryny w pozycji 66 GCSF tworz ac wi azanie estrowe mi edzy GCSF i polimerowym szkieletem PEG. Warunki reakcji s a typowe i znane specjali- stom, a szczegó lowo s a podane poni zej. Przy laczenie reagentów do GCSF mo zna przeprowadzi c tradycyjnymi sposobami. Mo zna za- stosowa c PEG o dowolnym wybranym wed lug tego wynalazku ci ezarze cz asteczkowym (n). Przyk la- dowo, reakcj e mo zna przeprowadzi c w roztworze o pH od 5 do 10 w temperaturze od 4°C do tempera- tury pokojowej, przez 30 minut do 20 godzin, wykorzystuj ac stosunek molowy reagentu do bia lka od 4:1 do 30:1. Warunki reakcji mo zna tak wybra c, aby skierowa c reakcj e na wytwarzanie g lównie zadanego poziomu podstawie n. Ogólnie, niska temperatura, niskie pH (np. pH 5) i krótki czas reakcji prowadz a do zmniejszenia liczby przy laczonych cz asteczek PEG (mniejsze m). Wysoka temperatura, pH oboj et- ne do wysokiego (np. pH = 7) i d lu zszy czas reakcji zwi ekszaj a liczb e przy laczonych cz asteczek PEG (wi eksza m). Przyk ladowo, w przypadku reagenta o wzorze II i ci ezarze cz asteczkowym 5 kDa, w pH 7,3 i przy stosunku molowym reagenta do bia lka 30:1, w temperaturze 4°C i w czasie reakcji 30 minut powstaj a g lównie koniugaty mono-PEG; w temperaturze 4°C i w czasie reakcji 4 godziny powstaj a g lównie koniugaty di-PEG, a w temperaturze pokojowej i w czasie reakcji 4 godziny powstaj a g lównie koniugaty tri-PEG. Reakcj e ko nczy si e przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i zamro zenie w -20°C. Na ogó l, korzystne s a pH od 7 do 7,5 i stosunek molowy reagenta do bia lka 4:1 do 6:1. Do rozdzielenia koniugatów z wykorzystaniem ró znicy ladunków u zyte mog a by c sposoby oczyszczania, takie jak chromatografia kationowymienna, która skutecznie rozdziela koniugaty z uwa- gi na ich ró zne ciezary cz asteczkowe. Przyk ladowo, kolumna do wymiany kationowej mo ze by c za la- dowana, a nast epnie p lukana ~20 mM octanem sodu, pH ~4, i nast epnie wymywana liniowym gra- dientem (0 M do 0,5 M) NaCl buforowanym przy pH od 3 do 5,5, korzystnie przy pH ~4,5. Zawarto sc frakcji uzyskanych przez chromatografi e kationowymienn a mo ze by c okre slona przez wyznaczenie ciezaru cz asteczkowego, tradycyjnymi metodami, przyk ladowo przez spektroskopi e SDS-PAGE lub innymi sposobami rozdzia lu cz asteczek z uwagi na ich ci ezar cz asteczkowy. Nast epnie frakcj e identy- fikuje si e jako zawieraj ac a koniugat o wzorze I o zadanej liczbie (m) przy laczonych cz asteczek PEG, oczyszcza si e ze niezmodyfikowanej postaci GCSF i koniugatów z inn a liczb a przy laczonych cz aste- czek PEG. Równie z czesci a tego wynalazku jest kompozycja koniugatów, która zawiera koniugaty o ró z- nych warto sciach m w konkretnych stosunkach. Kompozycj e tak a wytwarza si e przez reakcj e reagen- ta pegyluj acego z GCSF w stosunku molowym od 4 do 6:1 (nadmiar reagenta). Reakcja przebiega w 4°C do 8°C przez 20 godzin, przy pH zbli zonym do 7,5. Przy ko ncu reakcji dodaje si e kwas octowy. Nast epnie koniugat jest oczyszczany z pozosta lo sci niezmodyfikowanego bia lka, nadmiaru reagenta pegyluj acego i innych zanieczyszcze n i sk ladników buforu obecnego podczas reakcji. Poza pegylowanymPL 203 462 B1 7 bia lkiem, jako produkty uboczne reakcji wytwarzane s a N-hydroksysukcynimid i kwas polietylenoglikolo- karboksylowy. Nast epuj ace Przyk lady ilustruj a opisany wynalazek i nie ograniczaj a go w zaden sposób. W Przyk ladach tych by la stosowana Muteina GCSF. Równie z inne rodzaje GCSF mog a by c koniugo- wane z PEG sposobami podanymi tu przyk ladowo. P r z y k l a d 1 Reagenty do pegylacji 1. Lacznik amidowy GABA (P-6GA-1, P-12Ga-1) Amidowy lacznik GABA zawiera 2 nici PEG o ciezarze cz asteczkowym 6 lub 12 kDa. Struktury przedstawiono na Fig. 2-A. 2. Lacznik amidowy (P-5am-1, P-10am-1) Wytworzono laczniki o ci ezarze cz asteczkowym 5 i 10 kDa. Struktur e przedstawiono na Fig. 2-B. 3. Lacznik amidowy Reagentem tym by l dost epny w handlu kwas sukcynimidylopropionowy (SPA), wytworzony z cz asteczek PEG o ci ezarze cz asteczkowym 5, 10, 15 i 20 kDa, a jego ogóln a struktur e przedstawio- no na Fig. 2-C. 4. Lacznik mocznikowy Reagent ten zosta l wytworzony z cz asteczek PEG o ciezarze cz asteczkowym 5, 10 i 25 kDa, a jego typow a struktur e przedstawiono na Fig. 2-D. 5. Lacznik uretanowy Wytworzono laczniki uretanowe o ci ezarze 10 i 20 kDa, a ich struktur e przedstawiono na Fig. 2-E. 6. Lacznik uretanowy Jak pokazuje przedstawiona na Fig. 2-G struktura dost epnego w handlu reagenta PEG o ci eza- rze cz asteczkowym 36 kDa, jeden koniec odczynnika PEG jest zablokowany grup a t-butylow a. Re- agent ten mia l najwy zszy ci ezar cz asteczkowy spo sród PEG u zytych w tym przyk ladzie. 7. Lacznik tiouretanowy Struktur e tego reagenta do pegylacji mo zna zobaczy c na Fig. 2-F. Ci ezar cz asteczkowy PEG u zytego w tym reagencie wynosi l 20 kDa. Nast epuj ace reagenty by ly dostarczone przez Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokio, Japonia: 1) muteina G-CSF oznaczona jako Muteina GCSF, Muteina GCSF skoniugowana z rozga lezionym gliko- lem metoksypolietylenowym (m-PEG) zawieraj acym 2 lancuchy m-PEG albo o ciezarze cz asteczko- wym 6 albo 12 kDa (PEG-GABA-NHS, patrz Fig. 2A). Mutein a GCSF skoniugowana z reagentem m-PEG b ed acym liniowym estrem/amidem o ci ezarze cz asteczkowym 5 i 10 kDa (patrz Fig. 2B). Re- agenty m-PEG-kwas sukcynimidylopropionowy (NHS PEG-SPA) o ci ezarze cz asteczkowym 5, 10, 15 i 20 kDa nabyto z Shearwater Polymers, (Huntsville, Alabama, patrz Fig. 2C). Nast epuj ace reagenty do pegylacji bia lka wytworzono w Hoffmann-La Roche, Inc: 1) lacznik m-PEG-mocznik (5, 10 i 25 kDa, patrz Fig. 2D), 2) lacznik m-PEG-uretan (10 i 20 kDa, patrz Fig. 2E) lacznik m-PEG-tiouretan (10 i 20 kDa patrz Fig. 2F), a reagent lacznikowy t-butylo-m-PEG-uretan o srednim ci ezarze cz asteczko- wym 36 kDa uzyskano z DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainview, CA, patrz Fig. 2G). Reakcje pegylacji Czynnikami wp lywaj acymi na reakcj e pegylacji s a 1) pH, 2) temperatura, 3) czas reakcji, 4) sto- sunek molowy bia lka do reagentu PEG i 5) st ezenie bia lka. Kontroluj ac jeden lub wi ecej z tych czynni- ków mo zna nakierowa c reakcj e na wytwarzanie g lównie mono-, di-, tri-, itp. koniugatów PEG. Przyk la- dowo, warunki reakcji dla reagenta Shearwater Polymer SPA-PEG 5000 (N-hydroksysukcynimid) by ly 1) pH 7,3; 2) temperatura 4°C, dla mono- i di-PEG i temperatura pokojowa dla tri-PEG; 3) czas reakcji dla mono-PEG 30 minut, dla di- i tri-PEG 4 godziny i 4) stosunek molowy bia lka do reagenta 1:30. Dla wszystkich reagentów indywidualnie okre slano optymalne warunki reakcji dla wytworzenia zadanych rodzajów PEG. S a one przedstawione w Tabeli 1. Reakcj e ko nczy si e przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i zamro zenie w -20°C. Wydzielenie zmodyfikowanej i wolnej Muteiny GCSF od z mieszaniny reakcyjnej (wymiana ka- tionowa na sulfopropylu (SP)) Mieszanin e reakcyjn a zawieraj ac a oko lo 5 mg bia lka rozcie nczono 10 do 20 razy wod a i lodo- watym kwasem octowym, doprowadzono pH do 4,5. Nast epnie rozcie nczon a próbk e naniesiono na wcze sniej upakowan a 1-2 ml kolumn e Fractogel EMD SO 3 - 650S (EM Separations, Gibbstown, New Jersey), któr a zrównowa zono 10 mM octanem amonu, pH 4,5. Niezaadsorbowany reagent i produkty uboczne reakcji usuwano podczas p lukania kolumny. Zmodyfikowan a Mutein e GCSF wymywanoPL 203 462 B1 8 gradientem 0,15 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny. Niezmodyfikowan a, pozostaj ac a na kolumnie Mutein e GCSF wymywano 0,5 M NaCl w buforze do równowa zenia kolumny. Oddzielon a mieszanin e koniugatów Muteina GCSF-PEG filtrowano sterylnie przez filtr o porach 0,2 µm i przecho- wywano zamro zon a w -20°C. Charakteryzowanie koniugatów PEG Muteina GCSF Oznaczanie bia lka St ezenia bia lek oczyszczonych koniugatów PEG-Muteina GCSF okre slano stosuj ac warto sc A 280 0,86 dla roztworu o st ezeniu 1 mg/ml. Analiza SDS-PAGE Analiz e SDS-PAGE przeprowadzono stosuj ac 12 i 15% zele poliakryloamidowe lub 8-16% gradien- towe zele poliakryloamidowe w warunkach redukuj acych zgodnie, z Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970. Okre slenie procentowego sk ladu kompozycji Procentow a zawartosc w kompozycji ka zdego rodzaju (mono-, di-, tri-, itp.) w ró znych mieszani- nach reakcyjnych koniugatów PEG-Muteina GCSF okre slano z pomiarów densytometrycznych zeli SDS-PAGE wybarwionych Coomassie blue (patrz Tabela 2). Okre slanie masy PEG w koniugatach PEG - Muteina GCSF Ca lkowit a mas e PEG obecnych w ró znych preparatach okre slono ze sredniego ciezaru cz a- steczkowego PEG, identyfikacji poszczególnych koniugatów PEG (mono, di, itp.), na podstawie ru- chliwo sci elektroforetycznej, liczby przy laczonych cz asteczek PEG i procentowego sk ladu opartego na pomiarach densytometrycznych SDS-PAGE wybarwionych Coomassie blue. Ca lkowita masa PEG w poszczególnych preparatach jest sum a poszczególnych mas PEG. Poszczególne masy PEG s a obliczone przy pomocy poni zej przedstawionego równania: Masa PEG = PEG M.W. x # cz asteczek PEG x % kompozycji gdzie PEG M.W.-5, 10, 20 kDa, itd. # cz asteczek PEG =1,2,3 odpowiednio dla mono, di, tri. Dla oznaczenia ca lkowitej masy PEG zastosowano równie z spektrometri e mas (MALDI-TOF). W tym przypadku spektrum mas pozwala na identyfikacj e i okre slenie ciezaru cz asteczkowego po- szczególnych koniugatów PEG. Ciezar cz asteczkowy PEG przy laczonego do ka zdego koniugatu PEG jest ca lkowitym ciezarem cz asteczkowym poszczególnych koniugatów PEG minus ci ezar cz asteczko- wy Muteiny GCSF (18,9 kDa). Warto sci te pomno zone przez % kompozycji daj a poszczególne masy PEG; ich suma daje ca lkowit a mas e PEG. Oba sposoby by ly wykorzystane dla okre slenia mas PEG ró znych preparatów. Wyniki s a pod- sumowane w Tabeli 2. Okre slenie poziomów endotoksyny Poziomy endotoksyny okre slono przy pomocy metody LAL zgodnie z instrukcjami producenta (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hople, Massachusetts). Aktywno sci biologiczne Jak to uprzednio opisano przeprowadzono oznaczenia biologiczne in vitro na komórkach M-NFS-60 i in vivo na samicach myszy C57BL/6J. (Patrz Asano i wsp., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773.) Wyniki i dyskusja Reakcja pegylacji Ogólnie, wyniki wskazuja, ze dla uzyskania zadanej ilo sci koniugacji mniej reaktywne odczynni- ki, takie jak lacznik mocznikowy wymagaja wy zszego pH, temperatury i stosunku molowego bia l- ko:odczynnik, jak równie z d luzszego czasu reakcji (patrz Tabela 1 i 2). Oddzielenie zmodyfikowanej i wolnej Muteiny GCSF od mieszaniny reakcyjnej Typowy profil wymywania z kolumny przedstawiono na Fig.4. Dodatkowo do chromatografii ka- tionowymiennej mog a by c wymagane dodatkowe etapy, takie jak chromatograficzne s aczenie w zelu dla usuni ecia sladowych zanieczyszcze n i endotoksyny oraz dla przeprowadzenia wymiany buforu w ko n- cowym, przeznaczonym dla przechowywania produkcie. Metoda rozdzia lu przez wymian e na silnym katio- nicie mo ze by c rozszerzona do skali 30 mg dla koniugatów 20 kDa z SPA (amid) i 20 kDa z uretanem. Procedura ta daje niemal ilo sciowe odzyskiwanie zwi azków. Sk lad procentowy kompozycji i masa PEG Wyniki oznaczenia procentowego sk ladu kompozycji i masy PEG przedstawiono w Tabeli 2. Z naszego do swiadczenia wynika, ze w przypadku koniugatów PEG o wysokim ci ezarze cz asteczkowymPL 203 462 B1 9 (np. 20 kDa SPA diPEG i 12 kDa GABA), identyfikacja rodzajów PEG, oparta na ruchliwo sci elektrofo- retycznej, a maj aca na celu okre slenie sk ladu % mieszaniny reakcyjnej, nie jest bardzo rzetelna. W celu okre slenia masy PEG i identyfikacji wysoko podstawionych koniugatów PEG o wysokim cieza- rze cz asteczkowym potrzebne jest zastosowanie kombinacji analiz SDS-PAGE, SP-HPLC i MALDI-TOF MS. Jednak ze koniugaty monopegylowane PEG i koniugaty PEG pochodz ace od reagentów PEG o niskim ci ezarze cz asteczkowym (np. 5 kDa) mog lyby by c zidentyfikowane z zadawalaj ac a dok ladno- sci a na podstawie odpowiednich profili SDS-PAGE. Poziomy endotoksyny Stosuj ac metode LAL, we wszystkich PEG koniugatach, z wyj atkiem jednego pochodnego ure- tanu, wykryto < 1 EU/mg endotoksyny. W tym koniugacie PEG endotoksyn e wykryto jedynie po roz- cie nczeniu. Potwierdzi lo to, ze nie jest to spowodowane zanieczyszczeniem próbki w czasie jej roz- cie nczania i co za tym idzie, w próbce tej musi wyst epowa c jaki s nieznany materia l wywo luj acy ha- mowanie oznaczenia LAL, przy wy zszym st ezeniu bia lka. Po rozcienczeniu próbki, a co za tym idzie, rozcie nczeniu substancji hamuj acej, uzyskano pozytywny wynik dla endotoksyny. Aktywno sc biologiczna W Tabeli 2 podano aktywno sci biologiczne, in vitro i in vivo, wszystkich koniugatów Muteina GCSF-PEG. Na ogó l obserwuje si e odwrotnie proporcjonaln a zale znosc mi edzy aktywno scia in vitro i stopniem podstawienia, jak równie z ciezarem cz asteczkowym PEG. Przeciwnie, zaobserwowano zwi ekszenie aktywno sci in vivo wraz ze zwi ekszeniem ciezaru cz asteczkowego podstawiaj acego PEG. Jest to równie z obserwowane przez innych (Satako-Ishikawa i wsp., Cell Struct Funct. 17(3): 157-60, 1992). Postuluje si e, ze przy laczenie chemiczne cz asteczek PEG do szkieletu polipeptydo- wego Muteiny GCSF wywo luje pewn a form e zmian konformacyjnych wp lywaj acych ujemnie na od- dzia lywania receptor/ligand, a co za tym idzie zmniejszaj ac a powinowactwo wi azania. Ponadto, sto- sunkowo krótki czas inkubacji w oznaczeniu in vitro jest prawdopodobnie niewystarczaj acy dla uzy- skania maksymalnej aktywno sci. Z drugiej strony, oznaczenie in vivo u myszy jest znacznie d luzsze (dni) i ko nczy si e kilka dni po wstrzykni eciu leku. D lu zszy czas inkubacji w polaczeniu ze zwi ekszonym pó lokresem trwania w kr azeniu Muteiny GCSF-PEG kompensuje jak akolwiek utrat e powinowactwa wi azania z powodu pegylacji. Ko ncowym wynikiem jest osi agni ecie in vivo maksymalnej aktywno sci biologicznej. Inn a hipotez a jest taka, ze Muteina GCSF-PEG, gdy wstrzyknie si e j a myszy, dzia la jako prolek. W tej sytuacji wyst epuj aca w koniugacie Muteina GCSF-PEG cz asteczka PEG jest w jaki s sposób nieustannie odcinana, co powoduje ci ag le uwalnianie minimalnych ilo sci wolnej Muteiny GCSF, odpowiedzialnej za podtrzymanie i zwi ekszenie aktywno sci in vivo. Jednak ze hipoteza proleku nie wyja snia obserwowanej in vivo, w 7 dni po pocz atkowym podaniu, aktywno sci podstawowej. Me- chanizm proleku jest ma lo prawdopodobny, poniewa z wi azanie amidowe mi edzy bia lkiem i PEG jest stabilne i nie ulega latwo ci eciu. W sród badanych 15 koniugatów Muteina GCSF-PEG ma znacz aco wy zsz a aktywno sc in vivo, w porównaniu z pozosta lymi preparatami, ujawnia ly P-12GA-1, 20 kDa SPA, 20 kDa uretan i 36 kDa uretan, (patrz Fig. 4 i Tabela 2). Ogólnie, obserwowano wprost proporcjonaln a zale znosc mi edzy ciezarem cz asteczkowym cz a- steczki PEG i zwi ekszon a aktywno scia in vivo. Zilustrowano to na Fig. 5, gdzie wzrost liczby PMN jest wyra zony jako funkcja ca lkowitej masy PEG w koniugatach PEG zwi azanych amidem (SPA) i mocznikiem. Selekcja i charakterystyka koniugatów Muteina GCSF-PEG Po starannej ocenie chemii sprz egania, biologicznych w lasciwo sci i sposobu przygotowania le- ku dotycz acej 15 koniugatów PEG, dla dalszej oceny wybrano trzy: 1) P-12GA-1, 2) 20 kDa SPA i 3) 20 kDa uretan. Oceniano pochodne 20 kDa SPA koniugaty mono-, di- i tri-PEG obecne w oczyszczo- nej SP mieszaninie reakcyjnej w bezpo srednim porównaniu g lowa do g lowy, które pokazuje, ze wszystkie trzy zachowuja wysok a aktywno sc granulopoetyczn a przez 5 dni po podaniu samicom my- szy C57BL/6J pojedynczej dawki 25,2 µg, (Tabela 3 i Fig. 4). Przeciwnie, dla uzyskania podobnej aktywno sci (wyniki nie przedstawione) potrzebne by lo codzienne podawanie niezmodyfikowanej Mute- iny GCSF. We wszystkich, z wyj atkiem dwóch przypadków (20 kDa SPA i P-12GA-1), aktywnosc in vivo powraca la do normalnego poziomu w 7 dniu po podaniu myszy pocz atkowej dawki (Fig. 6). Za- równo koniugat 20 kDa SPA jak i P-12GA-1 wykaza ly zwi ekszon a aktywnosc przy ni zszych dawkach 8,4 µg i powróci ly do normalnych poziomów w 7 dniu (patrz Tabela 3). Dane dotycz ace procentowego sk ladu (Tabela 3) wskazuj a, ze oba preparaty 20 kDa SPA i P-12GA-1 zawieraj a oko lo 50% dimeru, a pozosta le 50% jest roz lo zone mi edzy monomerem i trimerem. Reagent 20 kDa uretan wytwarza w stosowanych warunkach eksperymentalnych g lównie mono-PEG (patrz Tabela 3). Oceniono aktyw-PL 203 462 B1 10 no sc in vitro wszystkich koniugatów PEG, w lacznie z dominuj ac a monomeryczn a pochodn a uretanow a zgodnie z ogólnym wzorem odwrotnej zale zno sci mi edzy stopniem podstawienia jak równie z ciezarem cz asteczkowym PEG. Ocena aktywno sci biologicznej in vivo koniugatów PEG wykaza la wprost pro- porcjonaln a zale zno sc wzgl edem ciezaru cz asteczkowego PEG, poza zakresem ci ezaru cz asteczko- wego badanych koniugatów (Fig. 5). Wniosek W sród 15 badanych koniugatów Muteina GCSF-PEG dobre profile aktywno sci in vivo wykazuj a preparaty P-12GA-1, 20 kDa SPA i 20kDa z lacznikiem uretanowym. 20 kDa Muteina GCSF-PEG wykaza la najlepsze wszystkie w la sciwo sci, w lacznie z ekonomiczno scia jej wytwarzania. T a b e l a 1. Warunki reakcji stosowane do wytwarzania ró znych koniugatów PEG MW Chemia Warunki reakcji pH Temperatura Czas Stosunek 5k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 5k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 10k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 10k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 10k uretan 10 4°C 1 godz. 1:30 15k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 20k amid 7,3 RT 4 godz. 1:30 20k tiouretan 8 RT 17 godz. 1:30 20k uretan 10 4°C 1 godz. 1:30 25k mocznik 10 RT 1 godz. 1:100 36k uretan 8 4°C 6 godz. 1:3 RT- temperatura pokojowa T a b e l a 2. Kompozycja, masa PEG i dane o aktywno sci biologicznej ró znych koniugatów Muteina GCSF-PEG Aktywno sci Rodzaj lacznika * sk lad procentowy mono-, di-, tri-, oligo *masa dodanego PEG M-NFS-60 WBC PMN (% kontroli) 1 2 3 4 5 6 Amid (b) 5K 17,3 22,3 51,3 9,1 12600** 9% 22,48 536+40 (a) 5K 0 0 0 100 20000 5% 18,65 539+23 (b) 10K 9,8 63 27,2 0 21700** 11% 20,48 632+82 (a) 10K 10 11 53 26 29500 4% 20,13 701+92 (b) 15K 13,7 61,2 25,1 0 31710 6% 26,68 751+115PL 203 462 B1 11 cd. tabeli 2 1 2 3 4 56 (c) 20K 27,6 49,5 22,9 0 39100** 5% 29,23 977+120 Mocznik (a) 5K 28 19 23 23 11350 40% 12,78 254+27 (a) 10K 29 19 13 23 22800 42% 14,4 364+50 (b) 25K 24,7 15,4 41,6 18,7 63775 6% 27,78 716+87 Uretan (b) 10K 15,8 12,6 36,5 35 29050 10% 19,9 412+88 (c) 20K 81,8 4 14,2 0 26800** 7% 25,83 656+52 (a) 36K 50 50 0 0 54000 15% 25,05 888+132 Tiouretan (b) 20K 70,8 12 17,3 0 28440 20% 21,85 494,71 GABA (b) 5K 43,4 54,3 2,3 0 18100** 11% 29 598+117 (c) 12K 36 47 17 0 46500** 3% 30,03 886+120 % sk lad i mas e dodanych PEG obliczono w oparciu o pomiar densytometryczny wybarwionego Coomassie-blue SDS-PAGE(*) lub przez analiz e MALDI TOF MS (**) (a), (b), (c): ka zde oznacza odr ebne oznaczenie biologiczne; dane dotycz a PMN 5 dnia T a b e l a 3. Sk lad, masa PEG, miejsca pegylacji i dane dotycz ace aktywno sci biologicznej trzech wiod acych cz asteczek Sk lad procentowy Aktywno sc cz asteczka PEG mono di tri oligo WBC PMN (% kontroli) Masa PEG (kDa) ** M- NFS 60 Dzie n 5 Dzie n 7 Dzie n 5 Dzie n 7 No snik (kontrola) ND 28: pojedyncze wstrzykni ecie 25,2 µg ND 28: codzienne wstrzykni ecie 25,2 µg 8,78 8,05 26,5 8,97 6,1 24,58 100 86 1182 100 76 906 Dawka 8,4 µg 25,4 µg8,4 µg 25,2 µg8,4 µg 25,2 µg 8,4 µg 25,2 µg 12K GABA 36,0 47,0 17,0 0,0 46,5 3% 22,75 30,3 10,7 24,1 701 1064 140 556 20K SPA 27,6 49,5 22,9 0,0 38,1 5% 13,58 21,63 7,5 15,45 519 978 103 447 20K uretan 81,8 4,0 14,2 0,0 26,8 7% 8,35 17,43 6,78 7,93 222 729 74 119PL 203 462 B1 12 Samicom myszy C57BL/6J podano 8,4 lub 25,2 µg koniugatu PEG zarówno jako dawk e dzien- n a ND-28 lub jako pojedyncz a dawk e. Dnia 5 i dnia 7 po pocz atkowym podaniu pobrano próbki krwi zylnej i przeprowadzono ró znico- w a analiz e leukocytów. * W oparciu o densytometryczny pomiar SDS-PAGE barwionego Coomassie. ** Okre slona przez MALDI TOF MS. P r z y k l a d 2: Wytwarzanie 20 kDa PEG skoniugowanego z rhG-CSF Mutein a Modyfikacj e muteiny G-CSF 20 kDa kwasem metoksy-PEG sukcynimidylopropionowym (SPA) przeprowadzono w nast epuj acy sposób. Reagent PEG rozpuszczono w destylowanej wodzie do st e- zenia ~200 mg/ml i dodano do roztworu muteiny G-CSF (~5 mg/ml) w stosunku molowym od 4:1 do 6:1 (nadmiar reagenta). Reakcja przebiega la przez 20 godzin w temperaturze od 4°C do 8°C w pH ~7,5. Przy ko ncu reakcji, w celu jej zatrzymania, dodano lodowatego kwasu octowego. Pegylowan a Mutein e GCSF (okre slan a równie z jak PEGG) nast epnie oczyszczono od pozosta lo sci niezmodyfikowanej muteiny, nadmiaru reagenta PEG i innych zanieczyszcze n i sk ladników buforu obecnych w czasie reakcji modyfikacji. Poza pegylowanym bia lkiem jako produkty uboczne reakcji powstaj a N-hydroksy- sukcynimid i kwas polietylenoglikolokarboksylowy. PEGG oczyszczono przez kationowymienna chromatografi e, a nast epnie ultras aczenie. Kolum- n e do wymiany kationowej za ladowano i przemyto 20 mM octanem sodu, pH 4,0. Przez wymywanie liniowym gradientem chlorku sodu oddzielono PEGG od wszystkich innych sk ladników obecnych w mieszaninie reakcyjnej. Nast epnie w celu zatezenia PEGG do stezenia ~4,0 mg/ml zastosowano ultrafiltracj e/diafiltracj e i wymieniono bufor na 20 mM octan sodu, 50 mM chlorek sodu, pH 6,0. W warunkach podanych powy zej przeprowadzono pi ec reakcji pegylacji i oczyszczania, które analizowano przez chromatografi e jonowymienn a na kationicie, co pokaza lo powtarzalno sc reakcji pegylacji muteiny G-CSF. Wykazano, ze reakcja pegylacji jest powtarzalna w zakresie do 2,5 g (ko n- cowa ilosc uzyskanego PEGG), gdy by la prowadzona w ni zej podanych optymalnych warunkach: stosunek 20 kDa-SPA-PEG: muteina 4 do 6:1; pH ~7,5, 4°C, 20 godzin. Sredni sk lad procentowy mie- szaniny PEGG okre slono na 21,7% mono-PEGG (%RSD=16,6), 60,3% di-PEGG (%RSD=6,6), 15,1% tri-PEGG (%RSD=4,0) i 2,9% tetra-PEGG (%RSD=26,1), jak pokazano w Tabeli 4. T a b e l a 4: Analiza przez jonowymian e na kationicie wzgl ednego procentowego sk ladu mono-, di-, tri- i tetra-PEGG w pi eciu mieszaninach otrzymanych przez syntez e i oczyszczanie PEGG. Numer syntezy Mono-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Di-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Tri-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) Tetra-PEGG (%RSD, pi ec oznacze n) 1 21,9% (8,0) 60,3% (2,2) 15,1% (2,2) 2,7% (4,7) 2 27,5% (2,3) 54,4% (1,0) 15,7% (0,8) 2,4% (1,2) 3 18,2% (7,1) 65,5% (0,6) 14,3% (6,6) 2,0% (9,3) 4 21,7% (2,7) 60,1% (1,0) 14,8% (0,5) 3,5% (0,9) 5 19,2% (1,8) 61,3% (0,9) 15,7% (3,7) 3,8% (4,5) Sredni sk lad 21,7% (16,6) 60,3% (6,6) 15,1% (4,0) 2,9% (26,1) P r z y k l a d 3 Mobilizacja komórek macierzystych krwi obwodowej Opracowano sposoby pobudzenia zarówno pierwotnych komórek macierzystych jak i pocho- dz acych ze szpiku kostnego i namna zania kr az acych we krwi obwodowej komórek progenitorowych. Takie pobudzone komórki mog a by c zdolne do po sredniczenia we wczesnym i podtrzymywanym wszczepieniu si e po letalnym napromienianiu i przeszczepie szpiku kostnego lub komórek macierzys- tych, Neben S. Marcus K i Mauch, P: Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell subpopu- lations from the marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and/or granulocyte colony- -stimulating factor. Blood 81: 1960 (1993). W laczanie komórek macierzystych krwi obwodowej (PBSC) mo ze pomóc w skróceniu odnowy hematopoetycznej u pacjentów z zanikiem szpiku kostnego indu- kowanym przez chemioterapi e lub u tych pacjentów, u których zastosowane jest inne traktowanie niszcz ace szpik, Roberts AW i Metcalf D: Granulocyte colony-stimulating factor induces selective elevations of progenitor cells in the peripheral blood of mice. Experimental Hematology 22: 1156 (1994).PL 203 462 B1 13 Zarówno czynniki wzrostowe jak i leki chemioterapeutyczne by ly u zywane do pobudzenia mobilizacji, Bodine, D: Mobilization of peripheral blood „stem” cells: where there is smoke, is there fire? Experi- mental Hematology 23: 293 (1995). Po pobudzeniu PBSC aktywowane komórki s a zbierane przez leukoferez e i przechowywane w temperaturze ciek lego azotu a z do momentu, gdy b ed a potrzebne. Obecnie stosowane protoko ly kliniczne wymagaj a powtarzanego zbierania przez leukoferez e koncen- tratów PBSC po typowej chemioterapii z zastosowaniem wysokiej dawki (CHT) i powtarzanego co- dziennie dawkowania lub ci ag lego wlewu z czynnikami wzrostowymi, trwaj acego czasem dwa tygo- dnie i d luzej, Brugger W, Bross K, Frisch J, Dern P, Weber B, Mertelsmann R i Kanz, L: Mobilization of peripheral blood progenitor cells by sequential administration of Interleukin-3 and granulocyte- -macrophage colony-stimulating factor following polychemotherapy with etopside, fosfamide, i cispla- tin. Blood 79: 1193 (1992). Opisane poni zej badania przeprowadzono na dwóch mysich modelach mobilizacji PBSC; w pierwszym modelu stosowano normalne myszy, a w drugim myszy poddane chemioterapii. Do swiadczenia pokaza ly zwi ekszon a skuteczno sc pegylowanej G-CSF Muteiny wed lug wynalazku (PEGG), w porównaniu z NEUPOGEN (G-CSF), pod wzgl edem zdolno sci mobilizowania komórek macierzystych. Równie z pokazano przewag e pegylowanej muteiny z uwagi na znacz aco zmniejszony i bardziej skuteczny re zim dawkowania. W badaniach tych oceniono zdolno sc do namna zania si e mobilizowanych, niedojrza lych mysich PBSC stymulowanych in vitro wieloma czynnikami wzrostowymi w siedmiodniowym te scie wzrostu kolonii na agarze. Poza zdolno scia do tworzenia kolonii, przeprowadzono pe lne badania hematolo- giczne na krwi wszystkich myszy plus oszacowano ca lkowit a liczb e neutrofili (ANC). Okre slono rów- nie z poziomy G-CSF w surowicy. Po optymalizacji oznaczenia, kilkakrotnie przeprowadzono ekspery- menty badaj ac wysokie i niskie dawki G-CSF. Modele do swiadczalne obejmowa ly mobilizowanie indu- kowane przez G-CSF- i cycklofosfamid (Cytoxan), jak równie z leczenie skojarzone przy pomocy za- równo CHT jak i cytokiny. Materia ly i metody We wszystkich do swiadczeniach stosowano 6- do 10-tygodniowe samice myszy C57BL/6J, któ- re otrzymano z The Jackson Laboratory. W dniu - 1 myszom wstrzykni eto IP albo 200 mg/kg Cytoxanu lub no snika, którym jest solanka buforowana fosforanem (PBS). W dniu 0 zwierz etom wstrzykni eto S.C. albo 0,1 ml NEUPOGEN (GCSF), PEGG (20 kDa SPA zwi azanego z pegylowan a mutein a, partia #P20W3) lub nosnika PBS zawieraj acego 1% normaln a surowic e myszy. Myszy otrzymuj ace Neupo- gen dostawa ly codziennie iniekcje takiej samej dawki, podczas gdy wszystkie inne myszy otrzymywa ly no snik. W dniu zabicia zbierano krew obwodow a z zatoki ocznej znieczulonych myszy, do probówek zawieraj acych EDTA. Dla ka zdej grupy dodano niewielk a ilo sc spulowanej pe lnej krwi potrójnie na szalki do hodowli tkankowych o powierzchni 35 mm 2 , zawieraj ace 1000 U/ml zrekombinowanej (rm) mysiej Interleukiny-3, 100 ng/ml rm czynnika z komórek macierzystych i 1000 U/ml rm Interleukiny-6 w ca lkowitej objeto sci 1 ml po zywki RPMI 1640, uzupe lnionej 15% p lodow a surowic a bydl ec a i 0,35% agarem Difco. Zestalone agarem hodowle inkubowano przez jeden tydzie n w 37°C w wilgotnej atmos- ferze powietrza zawieraj acej 5% CO 2 . Kolonie liczono w ciemnym polu stosuj ac mikroskop stereoskopowy. Wyniki W pierwszym do swiadczeniu normalne myszy otrzymywa ly codziennie, w dniach 0-5, dawk e 25 µg/mysz NEUPOGEN lub jednorazowy zastrzyk, w dniu 0, z 25 µg/mysz PEGG. Myszy zabijano w dniach 3-7. Jak pokazano na Fig. 7, mobilizacja pokazana przez tworzenie kolonii by la znacz aco wi eksza, w dniach 3 i 4 u myszy, którym wstrzykni eto NEUPOGEN, lecz stopniowo zmniejsza la si e do poziomu podstawowego w dniu 5 (mimo wstrzykiwania NEUPOGEN przez 5 dni). Z drugiej strony myszy, którym wstrzykni eto PEGG wykaza ly wi eksz a liczb e kolonii, która pozosta la na poziomie pla- teau przez 7 dni. Paradygmat dla modelu chemioterapii by l podobny. Myszy w grupach CHT otrzyma ly w dniu - 1 zastrzyk Cytoxanu. Niektóre myszy w kolejnych dniach otrzymywa ly jedynie no snik, podczas gdy inne poddane by ly leczeniu skojarzonemu zarówno przez wstrzykiwanie NEUPOGEN w dniach 0-5 jak i pojedynczy zastrzyk z PEGG w dniu 0. Fig. 8 pokazuje, ze maksymalny efekt dzia lania Cytoxanu u myszy przypada na 4 dzie n, a w kolejnych dniach nast epuje stopniowy powrót do poziomów pod- stawowych. Zarówno w przypadku grupy NEUPOGEN jak i PEGG maksymalny efekt przypada na dzie n 5, pokazuj ac znaczne zwi ekszenie liczby kolonii. Jednak ze, warto sci dla Cytoxan + PEGG po- zostaj a znacz aco wy zsze ni z w przypadku grupy Cytoxan + NEUPOGEN w dniach 6 i 7. Na Fig. 9 pokazano synergistyczny efekt leczenia skojarzonego wzgl edem samego Cytoxanu lub samego G-CSF.PL 203 462 B1 14 Wyniki drugiego badania przedstawiono na Fig. 10 i 11. Normalne myszy, które otrzymywa ly codziennie iniekcje z ni zsz a dawk a, 3 µg/mysz NEUPOGEN przez 10 kolejnych dni, wykaza ly stosun- kowo niski poziom „wielofazowej” mobilizacji w czasie prowadzonego do swiadczenia. Zwierz eta, któ- rym wstrzykni eto pojedyncz a dawk e, 3 µg/mysz, PEGG wykaza ly w przybli zeniu pi eciokrotnie wi ecej mobilizowanych komórek progenitorowych w krazeniu obwodowym w dniu 4, chocia z efektem by l pojedynczy wyrzut, który zasadniczo zanika l w ci agu 6 dni. U myszy, którym wstrzykni eto Cytoxan, pojedyncza dawka 3 µg/mysz PEGG indukuje z grub- sza równowa zn a wielkosc mobilizacji PBSC jak 30 µg/mysz NEUPOGEN wstrzykiwany przez 10 dni w dawce 3 µg/dzie n (Fig. 11). Obie grupy wykazywa ly maksymaln a mobilizacj e komórek progenitoro- wych w dniu 5 i wielko sc tej mobilizacji by la identyczna. Jedyn a ró znic a wydaje si e by c nieznacznie d lu z- szy efekt opó znienia obserwowany w przypadku NEUPOGEN. Liczba kolonii w modelu CHT by la 4-10 razy wy zsza ni z obserwowana dla modelu normalnych myszy. Do swiadczenia te pokazuj a dwie wyra zne potencjalne korzy sci p lyn ace z pegylowanej muteiny wzgl edem NEUPOGEN. Po pierwsze, widoczna jest wi eksza skuteczno sc PEGG w porównaniu z NEUPOGEN pod wzgl edem zdolno sci do wywo lania mobilizacji PBSC, zarówno w przypadku myszy normalnych jak i myszy poddanych chemioterapii. Po drugie, pokazano ze pegylowana muteina jest bardziej skuteczna u myszy ni z NEUPOGEN, gdy stosuje si e zmniejszony i bardziej wydajny re zim dawkowania ni z ten, obecnie wykorzystywany dla stosowanego klinicznie produktu. PL PL PLDescription of the Invention The present invention relates to physiologically active granulocyte colony stimulating factor (GCSF) conjugates, compositions comprising them, and a method for producing a PEG-GCSF conjugate. Granulocyte colony stimulating factor (GCSF) is a pharmaceutically active protein that regulates the proliferation, differentiation and functional activation of obstructive granulocytes (Metcalf, Blood 67: 257 (1986); Yan et al. Blood 84 ( 3): 795-799 (1994); Bensinger, et al. Blood 81 (11): 3158-3163 (1993); Roberts et al., Expt'l Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben et al. Blood 81 (7): 1960-1967 (1993)). GCSF can stimulate bone marrow stem and progenitor cells and is used in the treatment of patients whose granulocyte counts have decreased as a result of chemotherapy or as an introduction to bone marrow transplantation. In the U.S. Patent No. 5,214,132 discloses a human GCSF mutein that differs from the natural hGCSF at positions 1, 3, 4, 5 and 17, in which Ala, Thr, Tyr, Arg and Ser appear instead of the natural amino acids for GCSF (See also, by Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe et al. (Blood 75 (9): 1788-1793 (May 1, 1990)) with a derivative of rhGCSF, in which amino acids are replaced at five sites in the N-terminal region of rhGCSF, showing higher sc activity specific to intact rhGCSF, in two assays on murine and / or human bone marrow progenitor cells. In the U.S. Patent No. 5,218,092 discloses a human GCSF mutein that differs from the natural hGCSF at positions 1, 3, 4, 5, 17, 145 and 147, where instead of the natural GCSF amino acids in the mutein are respectively Ala, Thr , Tyr, Arg, Ser, Asn and Ser. U.S. patents No. 5,214,132 and 5,218,092 are incorporated herein by reference. The bioavailability of therapeutic proteins such as GCSF is often limited by their short plasma half-life and their sensitivity to degradation by proteases, thereby reducing their maximum clinical potential. Studies of other therapeutic proteins have shown that such difficulties can be overcome by coupling the protein to polymers such as polyethylene glycol (PEG), usually with the aid of a linker molecule covalently linked to both the protein and the protein. and with PEG. Such PEG conjugated biocides have been shown to be clinically useful (Inada et al., J. Bioact. And Compatible Polymers, 5: 343 (1990); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9:249 (1992); and Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91 (1993)). These tendencies are, inter alia, better physical and thermal stability, protection against enzymatic degradation, increased solubility and extended in vivo half-life, decreased clearance, decreased immunogenicity, antigenicity and decreased toxic sc. PEG-GCSF conjugates with a structure different from that of the conjugates of the invention are disclosed in European Patent Publication No. EP 0 335 423; in European Patent Publication No. EP 0 401 384; R.W. Niven et al., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); and Satake-Ishikawa et al., Cell Structure and Function, 17: 157-160 (1992)). The invention relates to a new class of GCSF derivatives with polyethylene glycol hereinafter referred to as PEG. As shown below, the conjugate of the invention has an amide linker. The physiologically active conjugate according to the invention is represented by the formula I wherein G is a granulocyte colony stimulating factor without an amine group or groups which form in the conjugate an amide bond with a polyethylene glycol molecule; R is lower alkyl; n is an integer a integer and from 420 to 550, m is an integer a and an integer from 1 to 5. Preferably R is methyl, n is from 450 to 490, and m is from 1 to 4, more preferably m is 2. Preferably the granulocyte colony stimulating factor is a Mutein and a GCSF having the sequence shown in Fig. 1. Preferably the n in the conjugate is from 450 to 490, and m is from 1 to 4, more preferably m is 2. The conjugate according to the invention it has a longer half-life in the body and greater, in vivo, granulopoietic activity than with the corresponding unconjugated factor stimulating the formation of granulocytes colonies. A preferred conjugate according to the invention is represented by the formula I wherein R is methyl; n has a value of sc from 450 to 490; m is 2 and G is Mutein e GCSF having the sequence depicted in Fig. 1 without the amino groups which form in the conjugate an amide bond with the polyethylene glycol molecule. The invention also relates to a composition comprising physiologically active conjugates of formula I wherein in each conjugate, G is a granulocyte colony stimulating factor without an amino group or groups which form in the conjugates an amide bond with a polyethylene glycol molecule; R in each conjugate is independently lower alkyl; n in each conjugate is independently a number and an integer from 420 to 550; m in each conjugate is an integer independently a from 1 to 4, where the percentage of conjugates in which m is 1 is between eighteen and twenty-five percent; the percentage of conjugates in which m is 2 ranges from fifty to sixty-six percent; the percentage of conjugates with m equal to 3 ranges from twelve to sixteen percent and the percentage of sc conjugates where m is equal to 4 is up to five percent. Preferably R is e methyl and n and R are the same in each conjugate. Preferably the n in the conjugate is from 450 to 490. Preferably, each of the granulocyte-stimulating factor conjugates is a Mutein and a GCSF having the sequence shown in Figure 1. Preferably the composition comprises conjugates wherein R is methyl in formula I; n in each conjugate has the same a value of sc i is an integer a from 450 to 490; G is a GCSF Mutein having the sequence depicted in Fig. 1 without the amino groups which form, in each conjugate, an amide bond with a polyethylene glycol molecule; m in each conjugate is an independent integer and an integer from 1 to 4; wherein the percentage of sc conjugates in which m is equal to 1 is from eighteen to twenty-five percent; the percentage of sc conjugates in which m is equal to 2 ranges from fifty to sixty-six percent; the percentage of sc conjugates where m is 3 is from twelve to sixteen percent and the percentage of sc of conjugates where m is 4 is up to five percent. Also within the scope of the invention is a method for producing a PEG-GCSF conjugate with a slower half-life in the body and greater in vivo granulopoietic activity than a corresponding unconjugated GCSF comprising a covalent bond from a reagent of formula PL 203 462 B1 4 to GCSF. to form a conjugate. Preferably the GCSF is a Mutein and a GCSF having the sequence shown in Fig. 1. Compared to unmodified GCSF (i.e., GCSF without PEG bound), the conjugate exhibits increased loosened half-life and plasma immunity, decreased clearance and increased activity. granulopoietic in vivo. Moreover, compared to PEG-GCSF conjugates, the conjugates of the present invention have better granulopoietic properties. Other PEG-GCSF conjugates are disclosed in European Patent Publication No. EP 0 335 423; in European Patent Publication No. EP 0 401 384 and in Niven, et al., Ibid. However, the conjugates according to this invention have a structure different from those of the conjugates and have better tendency, in particular, they reveal a long-lasting high granulopoietic activity observed in vivo at low doses. The GCSF used in the conjugates of the invention is a mutein and a GCSF, which has a tendency equivalent to or better than the natural GCSF and has the same uses as the GCSF. Mutein has the same amino acid sequence as GCSF, with the exception of sites 1, 3, 4, 5 and 17, where instead of the amino acids found in natural GCSF, the mutein contains Ala, Thr, Tyr, respectively , Arg and Ser (mutein a GCSF) (See Fig. 1). Such a mutein is disclosed in U.S. Patent No. No. 5,214,132. The conjugates of the present invention have the same utility as GCSF. In particular, the conjugates of the present invention are useful in treating patients whose granulocyte counts are depleted by chemotherapy or as an introduction to bone marrow transplant in the same manner as when using GCSF. However, the conjugates of the present invention have improved in all properties, including excellent stability, increased solubility, improved circulatory half-life, and plasma resistance times. Description of the Figures Fig. 1: The primary structure of the GCSF Mutein and the GCSF differs from wild-type human GCSF at positions 1, 3, 4, 5 and 17, where instead of the natural GCSF amino acids there are and Ala, Thr, Tyr, Arg and Ser, respectively. Fig. 2: Pegylation reagents Fig. 3: Separation of 20 kDa modified and unmodified GCSF mutein. Typical leakage profile for PEG reaction mixture. Column: 1-2 ml Fractogel® EMD SO 3 650S Column equilibration buffer: 10 mM ammonium acetate, pH 4.5 Column elution buffers: 1. 0.15 M NaCl in column equilibration buffer 2. 0 . 5 M NaCl in buffer for column equilibration. Fig. 4: Sc PEG-GCSF mutein activity on day 5 after a single injection Female C57BL / 6J mice will be injected subcutaneously with 25.2 µg of the PEGylated GCSF mutein conjugate; on the fifth day after administration, venous blood samples were collected from the retroorbital sinus. Hematological analyzes by Coulter's method and differential analysis of leukocytes were performed; the determined level of neutrophils was standardized in each experiment with respect to the vehicle control. The results are averages ± S.E. obtained for a group of four mice. Figure 5: Increase in PMN number as a function of PEG mass (kDa) in GCSF PEG mutein conjugates with amide and urea linkers. For conjugates made with the SPA reagent PMN = 0.277MW + 3.95. For conjugates made with urea PMN = 0.152 MW + 2.74. Fig. 6: PEG-GCSF mutein sc activity on day 7 after single injection Female C57BL / 6J mice will be injected subcutaneously with 25.2 µg of pegylated GCSF mutein conjugate; on day 7 after administration, venous blood samples were collected from the retroorbital sinus. The hematological analyzes by the Coulter method and the differential leukocyte analysis were performed; the determined level of neutrophils was standardized in each experiment with respect to the vehicle control. The results are the mean values ± S.E. obtained for a group of four mice. Fig. 7: Assay of stimulation of mouse PBSC colonies (peripheral blood stem cells) Fig. 8: Assay of stimulation of mouse PBSC colonies Fig. 9: Assay of stimulation of mouse PBSC colonies Fig. 10: Assay of stimulation of mouse PBSC colonies Fig. 11: Assay of stimulation of mouse PBSC colonies PBSC In the formula I of the conjugate according to the invention, the nimsa value is chosen such that the resulting conjugate of formula I has a physiological activity comparable to that of unmodified GCSF, which activity may be the same, greater than or may be c part of the activity of the corresponding unmodified GCSF. n represents the number of e of ethylene oxide residues in the PEG unit. A single PEG subunit of the OCH 2 CH 2 test has a molecular weight of approximately 44 Daltons, m represents the number of PEG units to be attached to a GCSF molecule. The conjugate of the invention may contain one, two, three, four or five PEG units per GCSF molecule. Thus, the molecular weight of the conjugate (excluding the molecular weight of the GCSF) depends on the value n m. N can take a value of sc ranging from 420 to 550, which gives a conjugate where each PEG unit passes has an average part weight. from about 18 kilodaltons to about 25 kilodaltons per PEG unit. Preferably, n takes a value of sc from 450 to 490, resulting in a conjugate in which each PEG unit has a molecular average of about 20 kilodaltons, m may be 1, 2, 3, 4 or 5. Preferably m is 1-4 and m is particularly preferably 2. The molecular weight range of the conjugates according to the invention is from about 18 kilodaltons (n = 420, m = 1) to about 125 kilodaltons (n = 550, m = 5). When n is from 420 to 550 and m is 1 to 4, the molecular weight range of the PEG portion of the conjugates of the invention is from about 18 kilodaltons (n = 420, m = 1) to about 97 kilodaltons (n = 550; m = 4). The term "about" next to a number denoting a molecular weight means that it falls within a reasonable range from that value as determined by conventional analytical techniques. In a preferred conjugate, n is 450 to 490, and m is 1-4, in which case the molecular weight of the PEG portion of the conjugates ranges from about 20 kilodaltons (n = 450; m ~ 1) to about 86 kilodaltons ( n = 490; m = 4). In another preferred conjugate, n is 420 to 550 and m is 2 in which case the molecular weight of the PEG portion of the conjugate ranges from about 37 kilodaltons (n = 420) to about 48 kilodaltons (m = 550). In a particularly preferred conjugate, n is 450 to 490 and m is 2, in which case the molecular weight of the PEG portion of the conjugate ranges from about 40 kilodaltons (n = 450) to about 43 kilodaltons (n = 490). R can represent any lower alkyl group, by which is meant an e alkyl group containing from one to six carbon atoms, such as a methyl, ethyl, isopropyl group, etc. of this importance, branched chain alkyls are included. A preferred alkyl is methyl. By GCSF is meant a natural or recombinant protein, preferably human, obtained from conventional sources such as tissue, protein synthesis, natural or recombinant cell culture. The term includes any protein with GCSF activity such as muteins or otherwise modified proteins. The preparation and isolation of GCSF from natural or recombinant sources is well known (see, for example, U.S. Patent Nos. 4,810,643 and 5,532,341). A preferred GCSF conjugate is a mutein conjugate of GCSF as described in U.S. Patent No. No. 5,214,132. The physiologically active conjugate of formula I has a GCSF activity by which is meant any part or multiple of the sc of any known GCSF activity, defined by various terms known in the art. In particular, the conjugate according to the present invention has GCSF activity as shown by the ability of the sc to increase the number of PMNs. This is the known activity of the GCSF sc. Such conjugate activity can be determined by analyzes well known in the art, for example those described below (See also: Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773; Yamasaki et al., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; and Neben, et al., Blood (1993) 81: 1960. Conjugates of Formula I are prepared by covalently binding GCSF to the succinimidyl ester of PEG -propionic (SPA) -mediate reagent of formula II The reagent of formula II may be obtained by conventional methods according to known procedures (see US Patent No. 5,672,662). n is the same as above in formula I, i is selected so as to give a conjugate with a given molecular weight. Preferred are those where n is from 450 to 490 (MW = 20 kDa). Other molecular weights can be obtained by changing In the PEG-alcohol starting material for the reagent of formula II, the SPA reagent of formula II and molecular weights of 5, 10, 15 and 20 kDa can be found profit from Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Alabama). The reagent of formula II may be conjugated to GCSF by conventional methods. The setting occurs via an amide bond. Specifically, the reagent of formula II essentially reacts with one or more primary amino groups (for example N-terminus and lysine side chains) with GCSF to form an amide bond between the GCSF and the PEG polymer backbone. The NH group shown in formula I is derived from the primary amino group (s) of GCSF which reacts with the reagent of formula II to form an amide bond. To a lesser extent, the reagent of formula II may also react with the serine-66 hydroxyl group at position 66 of the GCSF to form an ester bond between the GCSF and the PEG polymer backbone. The reaction conditions are conventional and known to those skilled in the art, and are set out in detail below. The attachment of the reactants to the GCSF can be accomplished by conventional means. PEG can be used with any molecular weight (n) selected according to this invention. For example, the reaction can be performed in a solution having a pH of 5 to 10 at a temperature of 4 ° C to room temperature for 30 minutes to 20 hours using a mole ratio of reagent to protein from 4: 1 to 30: 1. The reaction conditions can be chosen so as to direct the reaction towards producing a predetermined level based on n. Generally, low temperature, low pH (e.g. pH 5) and short reaction times lead to a reduction in the number of PEG molecules ( smaller m). High temperature, neutral to high pH (eg pH = 7) and a longer reaction time increase the number of combined PEG molecules (larger). For example, in the case of a reagent of formula II with a molecular weight of 5 kDa, at pH 7.3 and a molar ratio of reagent to protein of 30: 1, at a temperature of 4 ° C and a reaction time of 30 minutes, mainly mono-conjugates are formed. PEG; at 4 ° C and a reaction time of 4 hours, mainly di-PEG conjugates are formed, and at room temperature and a reaction time of 4 hours, mainly tri-PEG conjugates are formed. The reaction is ended by acidifying the reaction mixture and freezing it at -20 ° C. In general, a pH of 7 to 7.5 and a mole ratio of reagent to protein of 4: 1 to 6: 1 are preferred. Purification methods such as cation exchange chromatography, which efficiently separates conjugates due to their different molecular weights, can be used to separate conjugates by charge difference. For example, a cation exchange column can be loaded followed by a pancake with ~ 20 mM sodium acetate, pH ~ 4, and then eluted with a linear gradient (0 M to 0.5 M) buffered NaCl. at a pH of 3 to 5.5, preferably at a pH of ~ 4.5. The fraction content of the fractions obtained by cation exchange chromatography can be determined by determining the molecular weight by conventional methods, for example by SDS-PAGE spectroscopy or by other means of separating the molecules due to their molecular weight. Then the fractions are identified as containing a conjugate of formula I with a given number (m) of attached PEG molecules, and purified from the unmodified form of GCSF and conjugates with a different number of joined PEG molecules . Also part of this invention is a conjugate composition which comprises conjugates of various m values in specific ratios. The composition is also prepared by reacting a pegylating reagent with GCSF in a molar ratio of 4 to 6: 1 (excess reagent). The reaction proceeds at 4 ° C to 8 ° C for 20 hours, with a pH close to 7.5. At the end of the reaction, acetic acid is added. The conjugate is then purified from unmodified protein residue, excess pegylation reagent, and other contaminants and buffer components present during the reaction. In addition to pegylated protein, N-hydroxysuccinimide and polyethylene glycol carboxylic acid are produced as reaction by-products. The following Examples illustrate the invention described and do not limit it in any way. The GCSF Mutein was used in these Examples. Also, other types of GCSF can be conjugated to PEG by the methods exemplified herein. Example 1 Pegylation reagents 1. GABA amide linker (P-6GA-1, P-12Ga-1) The GABA amide linkage contains 2 PEG strands with a molecular weight of 6 or 12 kDa. The structures are shown in Fig. 2-A. 2. Amide connector (P-5am-1, P-10am-1). Connectors with a molecular weight of 5 and 10 kDa were manufactured. The structure is shown in Fig. 2-B. 3. Amide linker The reagent was a commercially available succinimidyl propionic acid (SPA), made from 5, 10, 15 and 20 kDa PEG molecules, and its general structure is shown in Fig. 2. -C. 4. Urea linker This reagent was made from 5, 10 and 25 kDa PEG molecules and its typical structure is shown in Fig. 2-D. 5. Urethane Fastener 10 and 20 kDa urethane fasteners were prepared and their structure is shown in Fig. 2-E. 6. Urethane linker As shown in Fig. 2-G the structure of a commercially available 36 kDa PEG reagent, one end of the PEG reagent is blocked by the t-butyl group. stitches the molecular weight of the PEGs used in this example. 7. Thiourethane linker The structure of this pegylation reagent can be seen in Fig. 2-F. The molecular weight of the PEG used in this reagent is 12 kDa. The following reagents were provided by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokyo, Japan: 1) G-CSF mutein labeled GCSF Mutein, GCSF mutein conjugated to branched methoxypolyethylene glycol (m-PEG) containing 2 chains m-PEG with either a 6 or 12 kDa molecular weight (PEG-GABA-NHS, see Fig. 2A). Mutein and GCSF conjugated to a linear ester / amide m-PEG reagent with a molecular weight of 5 and 10 kDa (see Fig. 2B). 5, 10, 15 and 20 kDa m-PEG-succinimidylpropionic acid (NHS PEG-SPA) reagents were purchased from Shearwater Polymers, (Huntsville, Alabama, see Fig. 2C). The following protein pegylation reagents were prepared by Hoffmann-La Roche, Inc: 1) m-PEG-urea linker (5, 10 and 25 kDa, see Fig. 2D), 2) m-PEG-urethane linker (10 and 20 kDa, see Fig. 2E) m-PEG-thiourethane linker (10 and 20 kDa see Fig. 2F) and 36 kDa mean molecular weight t-butyl-m-PEG-urethane linker reagent was obtained from DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainview, CA, see Fig. 2G). PEGylation reactions Factors influencing pegylation reactions are 1) pH, 2) temperature, 3) reaction time, 4) molar ratio of protein to PEG reagent and 5) protein concentration. By controlling one or more of these factors, one can direct the reaction to the production of predominantly mono-, di-, tri-, etc. PEG conjugates. For example, the reaction conditions for Shearwater Polymer SPA-PEG 5000 (N-hydroxysuccinimide) reagent were 1) pH 7.3; 2) 4 ° C temperature for mono- and di-PEG and room temperature for tri-PEG; 3) reaction time for mono-PEG 30 minutes, for di- and tri-PEG 4 hours and 4) molar ratio of protein to reagent 1:30. The optimal reaction conditions for the production of the desired PEG species were individually determined for all reagents. They are shown in Table 1. The reaction is terminated by acidifying the reaction mixture and freezing at -20 ° C. Isolation of the modified and free GCSF Mutein from the reaction mixture (cation exchange with sulfopropyl (SP)) The reaction mixture containing about 5 mg of protein was diluted 10 to 20 times with water and glacial acetic acid, pH adjusted to 4.5. The diluted sample was then applied to a pre-packed 1-2 ml Fractogel EMD SO 3 - 650S column (EM Separations, Gibbstown, NJ) which was equilibrated with 10 mM ammonium acetate, pH 4.5. The unadsorbed reagent and reaction by-products were removed during the column blanking. The modified Mutein GCSF was eluted with a 0.15 M NaCl gradient in column equilibration buffer. Unmodified GCSF remaining on the column was eluted with 0.5 M NaCl in the column equilibration buffer. The separated Mutein GCSF-PEG conjugate mixture was sterile filtered through a 0.2 µm filter and stored frozen at -20 ° C. Characterization of PEG Mutein GCSF Conjugates Protein Determination The protein concentrations of the purified PEG-Mutein GCSF conjugates were determined using a sc value of A 280 0.86 for a 1 mg / ml solution. SDS-PAGE analysis SDS-PAGE analysis was performed using 12 and 15% polyacrylamide gels or 8-16% gradient polyacrylamide gels under reducing conditions according to Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970. Composition Trace The percentage of each composition (mono-, di-, tri-, etc.) in the different PEG-Mutein GCSF conjugate reaction mixtures was determined from densitometric measurements of SDS-PAGE gels stained with Coomassie blue (see Table 2). Determination of the PEG mass in PEG-Mutein GCSF conjugates The total mass of PEG present in the various preparations was determined from the average molecular weight of the PEG, the identification of individual PEG conjugates (mono, di, etc.), based on the mobility electrophoretic rate, number of PEG molecules joined and percentage composition based on SDS-PAGE densitometric measurements stained with Coomassie blue. The total PEG weights in the individual preparations are the sum of the individual PEG weights. The individual PEG masses are calculated using the following equation: PEG mass = PEG M.W. x # PEG molecules x% composition where PEG M.W.-5, 10, 20 kDa, etc. # PEG molecules = 1,2,3 for mono, di, tri, respectively. PEG was also used with mass spectrometry (MALDI-TOF) to determine total mass. In this case, the mass spectrum allows the identification and determination of the molecular weight of the individual PEG conjugates. The molecular weight of the PEG attached to each PEG conjugate is the total molecular weight of the individual PEG conjugates minus the molecular weight of the Mutein GCSF (18.9 kDa). These values multiplied by the% composition give the individual PEG weights; their sum gives the total mass of the PEG. Both methods were used to determine the PEG weights of various preparations. The results are summarized in Table 2. Determination of Endotoxin Levels Endotoxin levels were determined using the LAL method according to the manufacturer's instructions (Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hople, Massachusetts). Biological Activities As previously described, in vitro bioassays were performed on M-NFS-60 cells and in vivo on C57BL / 6J female mice. (See Asano et al., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19: 2767-2773.) Results and Discussion Pegylation Reaction Overall, the results indicate that less reactive reagents such as urea coupler are obtained for the desired amount of conjugation. require higher pH, temperature, and protein: reagent molar ratios, as well as slower reaction times (see Tables 1 and 2). Separation of Modified and Free GCSF Mutein from Reaction Mixture A typical elution profile from the column is shown in Figure 4. In addition to cation exchange chromatography, additional steps such as chromatographic gel filtration may be required to remove trace contaminants and endotoxins and to effect buffer exchange in the final product for storage. The strong cation exchange separation method can be extended to the 30 mg scale for the 20 kDa SPA (amide) and 20 kDa urethane conjugates. This procedure results in an almost quantitative recovery of the compounds. Composition Percentage and PEG Weight The results of the composition percentage and PEG weight determination are shown in Table 2. Our experience has shown that in the case of PEG conjugates with a high molecular weight PL 203 462 B1 9 (e.g. 20 kDa SPA diPEG and 12 kDa GABA), the identification of PEG species, based on electrophoretic mobility, aimed at determining the% composition of the reaction mixture, is not very reliable. A combination of SDS-PAGE, SP-HPLC and MALDI-TOF MS analysis is needed to determine PEG mass and identify highly substituted PEG conjugates with high molecular weight. However, monopegylated PEG conjugates and PEG conjugates derived from PEG reagents with a low molecular weight (eg 5 kDa) could be identified with satisfactory accuracy on the basis of appropriate SDS-PAGE profiles. Endotoxin levels Using the LAL method, <1 EU / mg endotoxin was detected in all PEG conjugates except one urethane derivative. In this PEG conjugate, endotoxins were only detected upon dilution. This confirmed that it was not caused by the contamination of the sample during its dilution, and therefore, there must be some unknown material in this sample, causing inhibition of the LAL determination, at a higher concentration proteins. After diluting the sample, and thus diluting the inhibitory substance, a positive result was obtained for endotoxin. Biological Activity Table 2 lists the in vitro and in vivo biological activities of all the GCSF-PEG Mutein conjugates. In general, an inverse relationship is observed between the in vitro activity and the degree of substitution, as well as with the molecular weight of the PEG. In contrast, there was an increase in in vivo activity with an increase in the molecular weight of the substitution of PEG. This is also observed by others (Satako-Ishikawa et al., Cell Struct Funct. 17 (3): 157-60, 1992). It is postulated that the chemical attachment of PEG molecules to the polypeptide backbone of the GCSF Mutein induces a form of conformational changes negatively affecting receptor / ligand interactions, and thus reducing the binding affinity . Moreover, the relatively short incubation time in the in vitro assay is probably insufficient to obtain maximum activity. On the other hand, the in vivo assay in mice is much slower (days) and ends a few days after drug injection. The longer incubation time, combined with the increased half-life in the circulation of the GCSF-PEG Mutein, compensates for any loss of binding affinity due to pegylation. The final result is the achievement of maximum biological activity in vivo. Another hypothesis is that the GCSF-PEG Mutein, when injected into mice, acts as a prodrug. In this situation, the PEG molecule present in the Mutein GCSF-PEG conjugate is in some way constantly cleaved off, which results in the continuous release of minimal amounts of free GCSF Mutein, responsible for maintaining and enhancing in vivo activity. However, the prodrug hypothesis did not explain the basal activity observed in vivo 7 days after initial administration. A prodrug mechanism is unlikely because the amide bond between the protein and PEG is stable and not readily susceptible. Among the tested 15 conjugates, Mutein GCSF-PEG has significantly higher in vivo sc activity in comparison to the other preparations, as revealed by P-12GA-1, 20 kDa SPA, 20 kDa urethane and 36 kDa urethane, (see Fig. 4 and Table 2). Overall, a direct correlation was observed between the molecular weight of the PEG molecule and increased activity in vivo. This is illustrated in Fig. 5 where the increase in PMN number is expressed as a function of the total weight of PEG in amide (SPA) and urea-bound PEG conjugates. Selection and characterization of Mutein GCSF-PEG conjugates After careful evaluation of the conjugation chemistry, biological properties and preparation of the drug for 15 PEG conjugates, three were selected for further evaluation: 1) P-12GA-1, 2) 20 kDa SPA and 3) 20 kDa urethane. The 20 kDa SPA derivatives of mono-, di- and tri-PEG conjugates present in the SP-purified reaction mixture were assessed in a head-to-head direct comparison, which shows that all three retained high granulopoietic activity for 5 days after administration of a single dose of 25.2 µg to female C57BL / 6J mice (Table 3 and Fig. 4). In contrast, daily administration of unmodified GCSF Mutein was required to obtain similar activity (results not shown). In all but two cases (20 kDa SPA and P-12GA-1), in vivo activity returned to normal levels on day 7 after the initial dose was given to the mice (Fig. 6). Both the 20 kDa SPA and P-12GA-1 conjugate showed increased activity at the lower doses of 8.4 µg and returned to normal levels by day 7 (see Table 3). The percent composition data (Table 3) indicates that both the 20 kDa SPA and P-12GA-1 formulations contain approximately 50% dimer, the remaining 50% being distributed between the monomer and trimer. The 20 kDa urethane reagent produces predominantly mono-PEG under the experimental conditions used (see Table 3). The in vitro sc in vitro activity of all PEG conjugates, including the dominant monomeric urethane derivative, was assessed according to the general formula of an inverse relationship between the degree of substitution as well as the molecular weight of the PEG. Assessment of the in vivo biological activity of the PEG conjugates showed a directly proportional relationship with the molecular weight of the PEG beyond the range of the molecular weight of the tested conjugates (Fig. 5). Conclusion Among the 15 tested Mutein GCSF-PEG conjugates, good in vivo activity profiles are demonstrated by the preparations P-12GA-1, 20 kDa SPA and 20 kDa with a urethane coupler. The 20 kDa GCSF-PEG mutein showed the best of all properties, including the economy of its production. T a b e l a 1. Reaction conditions used to prepare the various PEG MW conjugates Chemistry Reaction conditions pH Temperature Time Ratio 5k urea 10 RT 1 hr. 1: 100 5k amide 7.3 RT 4 hrs. 1:30 10k urea 10 RT 1 hour 1: 100 10k amide 7.3 RT 4 hrs. 1:30 10k urethane 10 4 ° C 1 hr. 1:30 15k amide 7.3 RT 4 hrs. 1:30 20k amide 7.3 RT 4 hrs. 1:30 20k thiourethane 8 RT 17 h 1:30 20k urethane 10 4 ° C 1 hr. 1:30 25k urea 10 RT 1 hour 1: 100 36k urethane 8 4 ° C 6 hrs. 1: 3 RT- room temperature TABLE 2. Composition, PEG mass and biological activity data of various Mutein GCSF-PEG conjugates. Activities. Coupler type * percentage mono-, di-, tri-, oligo * weight of added PEG M-NFS-60 WBC PMN (% of control) 1 2 3 4 5 6 Amide (b) 5K 17.3 22.3 51.3 9.1 12600 ** 9% 22.48 536 + 40 (a) 5K 0 0 0 100 20,000 5% 18.65 539 + 23 (b) 10K 9.8 63 27.2 0 21 700 ** 11% 20.48 632 + 82 (a) 10F 10 11 53 26 29 500 4% 20.13 701 +92 (b) 15K 13.7 61.2 25.1 0 31 710 6% 26.68 751 + 115PL 203 462 B1 11 cont. table 2 1 2 3 4 56 (c) 20F 27.6 49.5 22.9 0 39 100 ** 5% 29.23 977 + 120 Urea (a) 5K 28 19 23 23 11 350 40% 12.78 254 + 27 (a) 10K 29 19 13 23 22 800 42% 14.4 364 + 50 (b) 25K 24.7 15.4 41.6 18.7 63 775 6% 27.78 716 + 87 Urethane (b) 10K 15.8 12.6 36.5 35 29 050 10% 19.9 412 + 88 (c) 20F 81.8 4 14.2 0 26 800 ** 7% 25.83 656 + 52 (a) 36F 50 50 0 0 54000 15% 25.05 888 + 132 Tiourethane (b) 20K 70.8 12 17.3 0 28 440 20% 21.85 494.71 GABA (b) 5K 43.4 54.3 2.3 0 18 100 ** 11% 29 598 +117 (c) 12K 36 47 17 0 46500 ** 3% 30.03 886 + 120% composition and weight of added PEGs calculated from densitometric measurement of Coomassie-blue SDS-PAGE (*) or by MALDI analysis TOF MS (**) (a), (b), (c): each is a separate bioassay; data pertaining to PMN on day 5 Table 3. Composition, PEG mass, PEGylation sites and biological activity data of the three leading molecules Percent composition Sc activity molecule PEG mono di tri oligo WBC PMN (% of control) PEG mass (kDa) ** M- NFS 60 Day 5 Day 7 Day 5 Day 7 Number (control) ND 28: single injections of 25.2 µg ND 28: daily injections of 25.2 µg 8.78 8 , 05 26.5 8.97 6.1 24.58 100 86 1182 100 76 906 Dose 8.4 µg 25.4 µg 8.4 µg 25.2 µg 8.4 µg 25.2 µg 8.4 µg 25.2 μg 12K GABA 36.0 47.0 17.0 0.0 46.5 3% 22.75 30.3 10.7 24.1 701 1064 140 556 20K SPA 27.6 49.5 22.9 0.0 38.1 5% 13.58 21.63 7.5 15.45 519 978 103 447 20K urethane 81.8 4.0 14.2 0.0 26.8 7% 8.35 17.43 6.78 7 , 93 222 729 74 119PL 203 462 B1 12 Female C57BL / 6J mice were administered 8.4 or 25.2 µg of PEG conjugate either as a daily dose of ND-28 or as a single dose. Venous blood samples were taken at the percutaneous administration and differential analysis of the leukocytes was performed. * Based on Coomassie stained SDS-PAGE densitometry measurement. ** Determined by the salt by MALDI TOF MS. Example 2: Preparation of 20 kDa PEG conjugated to rhG-CSF Mutein Modification of the 20 kDa G-CSF mutein with methoxy-PEG succinimidyl propionic acid (SPA) was performed as follows. The PEG reagent was dissolved in distilled water to a concentration of ~ 200 mg / ml and added to the G-CSF mutein solution (~ 5 mg / ml) in a molar ratio from 4: 1 to 6: 1 (excess reagent). The reaction is run for 20 hours at 4 ° C to 8 ° C at a pH of ~ 7.5. At the end of the reaction, glacial acetic acid was added to stop the reaction. The PEGylated GCSF Mutein (also referred to as PEGG) was then purified of unmodified mutein residue, excess PEG reagent, and other contaminants and buffer components present during the modification reaction. Apart from the pegylated protein, N-hydroxy-succinimide and polyethylene glycol carboxylic acid are formed as by-products of the reaction. PEGG was purified by cation exchange chromatography followed by ultrafiltration. The cation exchange columns were loaded and washed with 20 mM sodium acetate, pH 4.0. PEGG was separated from all other components present in the reaction mixture by elution with a linear sodium chloride gradient. Ultrafiltration / diafiltration was then used to concentrate the PEGG to a concentration of ~ 4.0 mg / ml and the buffer was changed to 20 mM sodium acetate, 50 mM sodium chloride, pH 6.0. Under the conditions outlined above, five pegylation and purification reactions were performed, which were analyzed by cation exchange chromatography, showing the reproducibility of the pegylation reaction of the G-CSF mutein. The pegylation reaction has been shown to be reproducible up to 2.5 g (final amount of PEGG obtained) when performed under the following optimal conditions: 20 kDa-SPA-PEG: mutein ratio 4 to 6: 1; pH ~ 7.5, 4 ° C, 20 hours. The mean percentage of the PEGG mixture was determined to be 21.7% mono-PEGG (% RSD = 16.6), 60.3% di-PEGG (% RSD = 6.6), 15.1% tri-PEGG (% RSD = 4.0) and 2.9% tetra-PEGG (% RSD = 26.1) as shown in Table 4. Table 4: Analysis by cation exchange relative to one percent mono-, di -, tri- and tetra-PEGG in the five mixtures obtained by the synthesis and purification of PEGG. Mono-PEGG Synthesis Number (% RSD, five marked n) Di-PEGG (% RSD, five marked n) Tri-PEGG (% RSD, five marked n) Tetra-PEGG (% RSD, five marked n) 1 21.9% (8.0) 60.3% (2.2) 15.1% (2.2) 2.7% (4.7) 2 27.5% (2.3) 54.4 % (1.0) 15.7% (0.8) 2.4% (1.2) 3 18.2% (7.1) 65.5% (0.6) 14.3% (6) 6) 2.0% (9.3) 4 21.7% (2.7) 60.1% (1.0) 14.8% (0.5) 3.5% (0.9) 5 19 , 2% (1.8) 61.3% (0.9) 15.7% (3.7) 3.8% (4.5) Mean composition 21.7% (16.6) 60.3 % (6.6) 15.1% (4.0) 2.9% (26.1) Example 3 Mobilization of peripheral blood stem cells Ways to stimulate both primary stem cells and those derived from bone marrow and reproduction have been developed of circulating progenitor cells in the peripheral blood. Such stimulated cells may be able to mediate early and sustained engraftment after lethal irradiation and bone marrow or stem cell transplantation, Neben S. Marcus K and Mauch, P: Mobilization of hematopoietic stem and progenitor cell subpopu- res lations from the marrow to the blood of mice following cyclophosphamide and / or granulocyte colony- -stimulating factor. Blood 81: 1960 (1993). The fusion of peripheral blood stem cells (PBSCs) may help to shorten hematopoietic recovery in patients with chemotherapy-induced bone marrow loss or in those patients receiving other marrow-destroying treatments, Roberts AW and Metcalf D: Granulocyte colony-stimulating factor induces selective elevations of progenitor cells in the peripheral blood of mice. Experimental Hematology 22: 1156 (1994) .PL 203 462 B1 13 Both growth factors and chemotherapeutic drugs were used to stimulate mobilization, Bodine, D: Mobilization of peripheral blood "stem" cells: where there is smoke, is there fire ? Experimental Hematology 23: 293 (1995). After PBSC stimulation, the activated cells are harvested by leukopheresis and stored at liquid nitrogen temperature until required. Current clinical protocols require repeated leukopheresis collection of PBSC concentrates after typical high-dose chemotherapy (CHT) and repeated daily dosing or continuous infusion with growth factors, sometimes lasting two weeks or less. , Brugger W, Bross K, Frisch J, Dern P, Weber B, Mertelsmann R i Kanz, L: Mobilization of peripheral blood progenitor cells by sequential administration of Interleukin-3 and granulocyte- -macrophage colony-stimulating factor following polychemotherapy with etopside, fosfamide, and cisplatin. Blood 79: 1193 (1992). The studies described below were performed in two murine models of PBSC mobilization; normal mice were used in the first model and chemotherapy was used in the second model. The experiments showed an increased effectiveness of the pegylated G-CSF Mutein according to the invention (PEGG) compared to NEUPOGEN (G-CSF) in terms of the ability to mobilize stem cells. Also, the advantage of the pegylated mutein has been shown due to the significantly reduced and more effective dosing regimen. These studies assessed the proliferation capacity of mobilized immature murine PBSCs stimulated in vitro with multiple growth factors in a seven-day agar colony growth test. In addition to the colony forming ability, complete hematology was performed on the blood of all mice plus the total neutrophil count (ANC) was estimated. It is also determined by the serum levels of G-CSF. After the assay was optimized, experiments with high and low doses of G-CSF were performed several times. Experimental models included G-CSF- and cyclophosphamide (Cytoxan) -induced mobilization, as well as combination therapy with both CHT and cytokine. Materials and methods 6 to 10 week old female C57BL / 6J mice, which were obtained from The Jackson Laboratory, were used in all experiments. On day - 1 mice will be injected with eto IP or 200 mg / kg of Cytoxan or the vehicle, which is phosphate buffered saline (PBS). On day 0, the animals will be injected with eto S.C. or 0.1 ml NEUPOGEN (GCSF), PEGG (20 kDa SPA bound to pegylated mutein, lot # P20W3) or PBS carrier containing 1% normal mouse serum. The mice receiving Neupogen received daily injections of the same dose, while all other mice received the meal. On the day of death, peripheral blood was collected from the ophthalmic sinus of anesthetized mice into EDTA-containing tubes. For each group, a small amount of pooled whole blood was added in triplicate onto 35 mm 2 tissue culture dishes containing 1000 U / ml recombinant (rm) murine Interleukin-3, 100 ng / ml rm of stem cell factor, and 1000 U / ml rm of Interleukin-6 in a total of 1 ml of RPMI 1640 medium, supplemented with 15% ice-cold serum, bovine serum and 0.35% Difco agar. The solidified agar cultures were incubated for one week at 37 ° C in a humid air atmosphere containing 5% CO 2. Colonies were counted in the dark field using a stereoscopic microscope. Results In the first experiment, normal mice were given a daily dose of 25 µg / mouse NEUPOGEN on days 0-5 or a single injection on day 0 with 25 µg / mouse of PEGG. Mice were sacrificed on days 3-7. As shown in Fig. 7, mobilization shown by colony formation was significantly greater on days 3 and 4 in mice injected with eto NEUPOGEN, but gradually decreased to baseline on day 5 (despite NEUPOGEN injection for 5 days). days). On the other hand, mice injected with eto PEGG showed a greater number of colonies, which remained at the plaqueau level for 7 days. The paradigm for the chemotherapy model was similar. Mice in the CHT groups received 1 injection of Cytoxan on day -. Some mice on the following days received only the carrier, while others received a combination treatment by both an injection of NEUPOGEN on days 0-5 and a single injection of PEGG on day 0. Fig. 8 shows that the maximum effect of Cytoxan in the mice fall on day 4, and in the following days there is a gradual return to basal levels. For both the NEUPOGEN and PEGG groups, the maximum effect is on day 5, showing a significant increase in the number of colonies. However, the values for Cytoxan + PEGG remain significantly higher than for the Cytoxan + NEUPOGEN group on days 6 and 7. Fig. 9 shows the synergistic effect of combination treatment with Cytoxan alone or G-CSF.PL alone. The results of the second study are shown in Figures 10 and 11. Normal mice that were injected daily with the lower dose of 3 µg / mouse NEUPOGEN for 10 consecutive days showed relatively low levels of 'multiphase'. mobilization during the service. The animal eta injected with a single dose of 3 µg / mouse of PEGG showed approximately five times more mobilized progenitor cells in peripheral circulation on day 4, although the effect was a single burst that essentially disappears in within 6 days. In mice injected with eto Cytoxan, a single dose of 3 µg / mouse of PEGG induced a roughly equivalent amount of PBSC mobilization as 30 µg / mouse of NEUPOGEN injected for 10 days at a dose of 3 µg / day n (Fig. 11). Both groups showed maximum mobilization of progenitor cells at day 5 and the magnitude of this mobilization was identical. The only difference seems to be a slightly longer delay effect observed with NEUPOGEN. The number of colonies in the CHT model was 4-10 times higher than that observed in the normal mouse model. These experiments show two clear potential benefits of the pegylated mutein fluid over NEUPOGEN. First, the PEGG sc is more effective than NEUPOGEN in its ability to trigger PBSC mobilization in both normal and chemotherapy mice. Second, it has been shown that the pegylated mutein is more effective in mice than with NEUPOGEN when a reduced and more efficient winter dosing regimen is used than that currently used for the clinically used product. PL PL PL

Claims (1)

Zastrze zenia patentowe 1. Fizjologicznie aktywny koniugat o wzorze w którym G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; R oznacza ni zszy alkil; n jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550, a m jest liczb a ca lkowit a od 1 do 5. 2. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze R oznacza metyl. 3. Koniugat wed lug zastrz. 2, znamienny tym, ze n wynosi od 450 do 490. 4. Koniugat wed lug zastrz. 2, znamienny tym, ze m wynosi od 1 do 4. 5. Koniugat wed lug zastrz. 4, znamienny tym, ze m wynosi 2. 6. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii gra- nulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. 7. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze n wynosi od 450 do 490. 8. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze m przyjmuje wartosc od 1 do 4. 9. Koniugat wed lug zastrz. 8, znamienny tym, ze m wynosi 2. 10. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze ma d lu zszy pó lokres kr azenia w ustroju i wi eksz a in vivo aktywno sc granulopoetyczn a ni z odpowiadaj acy mu nieskoniugowany czynnik pobu- dzaj acy tworzenie kolonii granulocytów. 11. Koniugat wed lug zastrz. 10, znamienny tym, ze czynnik pobudzaj acy tworzenie granulocy- tów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. 12. Koniugat wed lug zastrze zenia 1 o wzorze IPL 203 462 B1 15 w którym R oznacza grup e metylow a; n ma wartosc od 450 do 490; m jest 2, a G oznacza Mu- tein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup aminowych, które tworz a w koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego. 13. Kompozycja zawieraj aca fizjologicznie aktywne koniugaty o wzorze I znamienna tym, ze w ka zdym koniugacie G oznacza czynnik pobudzaj acy tworzenie kolonii granulocytów bez grupy lub grup aminowych, które tworz a w koniugatach wi azanie amidowe z cz a- steczk a glikolu polietylenowego; R w ka zdym z koniugatów niezale znie oznacza ni zszy alkil; n w ka z- dym z koniugatów niezale znie jest liczb a ca lkowit a od 420 do 550; m w ka zdym z koniugatów nieza- le znie jest liczb a ca lkowit a od 1 do 4, przy czym zawartosc procentowa koniugatów, w których m jest równe 1, wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest równe 2, wynosi od pi ecdziesi eciu do sze scdziesi eciu sze sciu procent; zawarto sc procentowa koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a war- tosc procentowa koniugatów, w których m jest równe 4 wynosi do pi eciu procent. 14. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze w ka zdym z koniugatów R oznacza gru- p e metylow a. 15. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze n i R s a takie same w ka zdym koniugacie. 16. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze n ma wartosc od 450 do 490. 17. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze w ka zdym z koniugatów czynnik pobu- dzaj acy tworzenie granulocytów jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1. 18. Kompozycja wed lug zastrz. 13, znamienna tym, ze w ka zdym koniugacie o wzorze I R oznacza grup e metylow a; n w ka zdym koniugacie ma tak a sam a warto sc i jest liczb a ca lkowi- t a od 450 do 490; G oznacza Mutein e GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig. 1 bez grup amino- wych, które tworz a w ka zdym koniugacie wi azanie amidowe z cz asteczk a glikolu polietylenowego; m w ka zdym koniugacie jest niezale znie liczb a ca lkowit a od 1 do 4; przy czym procentowa zawartosc koniugatów, w których m jest równe 1, wynosi od osiemnastu do dwudziestu pi eciu procent; procento- wa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 2, wynosi od pi ecdziesi eciu do sze scdziesi eciu sze sciu procent; procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 3, wynosi od dwunastu do szesnastu procent, a procentowa zawarto sc koniugatów, w których m jest równe 4, wynosi do pi eciu procent. 19. Sposób wytwarzania koniugatu PEG-GCSF okre slonego w zastrz. 1 o d lu zszym pó lokresie krazenia w ustroju i wi ekszej in vivo aktywno sci granulopoetycznej ni z odpowiadaj acy mu nieskoniu- gowany GCSF, znamienny tym, ze obejmuje kowalencyjne wi azanie reagenta o wzorze II Z GCSF z wytworzeniem koniugatu. 20. Sposób wed lug zastrz. 19, znamienny tym, ze GCSF jest Mutein a GCSF o sekwencji przedstawionej na Fig.Claims 1. A physiologically active conjugate of formula wherein G is a granulocyte colony stimulating factor without an amine group or groups which form in the conjugate an amide bond with a polyethylene glycol molecule; R is lower alkyl; n is an integer from 420 to 550 and m is an integer from 1 to 5. The process of claim 1, wherein R is methyl. 3. A conjugate according to claim 1 A conjugate according to claim 2, characterized in that n is from 450 to 490. A conjugate according to claim 2, wherein m is from 1 to 4. A conjugate according to claim 4, characterized in that m is 2. 5. A conjugate according to claim 4, wherein m is 2. The conjugate according to claim 1, characterized in that the granulocyte colony stimulating factor is Mutein and a GCSF having the sequence shown in Fig. 1. 6. The conjugate according to claim 1, A conjugate according to claim 1, wherein n is from 450 to 490. A conjugate according to claim 1, wherein m has a value from 1 to 4. A conjugate according to claim 8, wherein m is 2. 9. A conjugate according to claim 8, wherein m is 2. The method of claim 1, characterized in that it has a longer half-life in the body and a greater in vivo granulopoietic activity than with the corresponding unconjugated granulocyte colony stimulating factor. 11. A conjugate according to claim 1 14. The conjugate according to claim 1 having the formula IPL 203 462 B1 in which R is e methyl; n has a value from 450 to 490; m is 2 and G is Mutein e GCSF having the sequence shown in Fig. 1 without the amino groups which form in the conjugate an amide bond with the polyethylene glycol molecule. 13. Composition containing physiologically active conjugates of formula I, characterized in that in each conjugate, G is a granulocyte colony stimulating factor without an amino group or groups which form in the conjugates an amide bond with a polyethylene glycol molecule; R in each conjugate is independently lower alkyl; n in each of the conjugates is an integer independently a integer from 420 to 550; m in each conjugate is independently a integer a from 1 to 4, with the percentage of conjugates where m is equal to 1 from eighteen to twenty-five percent; the percentage of conjugates where m is equal to 2 ranges from fifty to sixty-six percent; the percentage of conjugates where m is 3 is from twelve to sixteen percent and the percentage of conjugates where m is 4 is up to five percent. 14. A composition according to claim 1 14. A composition according to claim 13, characterized in that R is a methyl group in each conjugate. The method of claim 13, wherein n and R are the same in each conjugate. 16. A composition according to claim 1 A composition according to claim 13, wherein n has a value from 450 to 490. 16. A composition according to claim 13, wherein n has a value of from 450 to 490. The composition according to claim 13, characterized in that the granulocyte formation promoting factor in each conjugate is a Mutein and a GCSF having the sequence shown in Fig. 1. 13. The process of claim 13, wherein R is methyl in each conjugate of formula I; n in each conjugate has the same a value of sc i is an integer a from 450 to 490; G is a GCSF Mutein having the sequence depicted in Fig. 1 without the amino groups which form in each conjugate an amide bond with a polyethylene glycol molecule; m in each conjugate is an independent integer and an integer from 1 to 4; wherein the percentage of conjugates where m is equal to 1 is from eighteen to twenty-five percent; the percentage of sc conjugates in which m is equal to 2 ranges from fifty to sixty-six percent; the percentage of sc conjugates where m is 3 is from twelve to sixteen percent and the percentage of sc of conjugates where m is 4 is up to five percent. 19. A method of producing a PEG-GCSF conjugate as defined in claim 1. 1 having a longer systemic half-life and greater in vivo granulopoietic activity than the corresponding unconjugated GCSF, characterized in that it comprises covalently bonding the reagent of formula II with the GCSF to form a conjugate. 20. The method according to claim 19, characterized in that the GCSF is Mutein and the GCSF with the sequence shown in Fig. 1.PL 203 462 B1 16 RysunkiPL 203 462 B1 17PL 203 462 B1 18PL 203 462 B1 19PL 203 462 B1 20PL 203 462 B1 21PL 203 462 B1 22PL 203 462 B1 23PL 203 462 B1 24PL 203 462 B1 25PL 203 462 B1 26 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 z l (w tym 23% VAT) PL PL PL1.PL 203 462 B1 16 Drawings PL 203 462 B1 17PL 203 462 B1 18PL 203 462 B1 19PL 203 462 B1 20PL 203 462 B1 21PL 203 462 B1 22PL 203 462 B1 23PL 203 462 B1 24PL 203 462 B1 25PL 203 462 B1 26 Publishing Department UP RP Price PLN 4.92 (including 23% VAT) PL PL PL
PL363117A 1999-01-29 2000-01-19 Physiologically active granulocyte colony stimulating factor (GCSF) conjugates, compositions containing them and a method of producing a PEG-GCSF conjugate PL203462B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11791799P 1999-01-29 1999-01-29
US60/117,917 1999-01-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL363117A1 PL363117A1 (en) 2004-11-15
PL203462B1 true PL203462B1 (en) 2009-10-30

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1157037B1 (en) Gcsf conjugates
US6586398B1 (en) Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
JP2980569B2 (en) Interferon complex
JP5336372B2 (en) G-CSF site-specific monoconjugate
AU2001255256A1 (en) Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
US20070219357A1 (en) Chemically modified G-CSF
US20060247422A1 (en) Chemically modified G-CSF
PL203462B1 (en) Physiologically active granulocyte colony stimulating factor (GCSF) conjugates, compositions containing them and a method of producing a PEG-GCSF conjugate
EP1369429A1 (en) GCSF conjugates
AU2004233543B2 (en) GCSF Conjugates
MX2007015893A (en) Human granulocyte-colony stimulating factor isoforms