PL194989B1

PL194989B1 - Sposób otrzymywania genisteiny

Info

Publication number: PL194989B1
Application number: PL335526A
Authority: PL
Inventors: Osman Achmatowicz; Wiesław Pucko; Wiesław Szelejewski; Grzegorz Grynkiewicz; Maria Krystyna Lypacewicz; Bartłomiej Górecki; Bożenna Cichy; Aleksander P. Mazurek; Krzysztof Biniecki; Lech Kozerski; Robert Kawęcki
Original assignee: Inst Farmaceutyczny
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2007-07-31
Also published as: PL335526A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania genisteiny o wzorze 1, znamienny tym, że floroglucynę o wzorze 2 poddaje się reakcji z cyjankiem 4-hydroksybenzylu o wzorze 3, po czym wyodrębniony produkt pośredni - deoksybenzoinę o wzorze 4 poddaje się reakcji formylowania i cyklizacji w jednym etapie, a następnie surową genisteinę oczyszcza się

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania genisteiny, stanowiącej substancję o potencjalnym zastosowaniu terapeutycznym między innymi w profilaktyce przeciwnowotworowej.

Genisteina (4',5,7-trihydroksyizoflawon) przedstawiona wzorem 1, należąca do grupy flawonoidów, stanowiła dotychczas odczynnik do badań biochemicznych i farmakologicznych, gdyż jak ustalono, jest kompetytywnym inhibitorem proteinowych kinaz tyrozynowych (PTK), spełniającym rolę analogu strukturalnego adenozynotrifosforanu (ATP) (T.J.O'Dell i in., Nature, 353, str. 558 (1991). Badania nad biologiczną rolą enzymów z grupy PTK w kaskadzie przekazu sygnałów chemicznych od receptorów błon komórkowych do efektorów jądrowych regulujących ekspresję i transkrypcję genów, stanowią obecnie jeden z najbardziej obiecujących kierunków chemii medycznej (P.W. Groundwater i in., Progr. Med. Chem., 33, str. 233 (1996), przy czym oczekuje się, że selektywne inhibitory fosforylacji dadzą początek nie tylko nowej generacji leków, np. przeciwnowotworowych, ale także związkom, które umożliwią hamowanie onkogenezy, a więc prewencję chorób nowotworowych.

Z drugiej strony, wyniki przeprowadzonych badań epidemiologicznych wskazują, że genisteina pochodząca z pożywienia głównie soi, jest przyczyną niskiej zachorowalności kobiet rasy azjatyckiej na nowotwory sutka. Badania zdrowych ochotników przyjmujących żywność bogatą w soję doprowadziły do wykrycia w ich moczu znacznych ilości substancji hamującej wzrost komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, która okazała się być identyczna z genisteiną (T. Fotsis i in., J.Nutr., 125, 790S (1995). Odkryta zdolność genisteiny do hamowania angiogenezy może mieć ogromne znaczenie w zwalczaniu guzów litych. Dalsze badania przeciwnowotworowej aktywności genisteiny w modelach in vitro i in vivo (S. Barnes, J. Nutr., 125, 777S (1995)), pomimo potwierdzenia jej hamującego działania na komórki nowotworowe nie doprowadziły na razie do jednoznacznego wskazania biomakromolekularnych celów tego ligandu (Z.-M. Shao i in., Cancer Res., 58, str. 4851 (1998)). Obecnie klasyfikuje się genisteinę pod względem medycznym jako fitoestrogen i zalicza do nowej klasy związków biologicznie czynnych określanych mianem selektywnych receptorów estrogenowych (SERM).

Pozyskanie genisteiny ze źródeł naturalnych jest bardzo trudne i kosztowne, stąd wzrasta zainteresowanie otrzymywaniem związku w sposób syntetyczny.

Wśród znanych sposobów otrzymywania izoflawonów, zebranych przez K. Wahala i in. (Proc. Spc. Exp. Biol. Med. 208,1995 str. 27-32), ważne miejsce zajmuje oksydatywna przemiana pośrednich chalkonów, otrzymywanych z acetofenonów i aldehydów aromatycznych.

Alternatywny sposób otrzymywania izoflawonów polega na zamykaniu pierścienia polihydroksydeoksybenzoin. Sposób ten pozwala na uzyskanie stosunkowo wysokich wydajności produktu końcowego jedynie w przypadku liczby grup hydroksylowych substratów mniejszej niż 2. Korzystny wariant sposobu polegającego na zamykaniu pierścienia częściowo niezabezpieczonych pochodnych deoksybenzoiny, opisany przez R.J. Bass (J. Chem. Soc., Chem. Commun.,1976, s.78) polega na formylowaniu, a następnie cyklizacji polihydroksydeoksybenzoin za pomocą N,N-dimetyloformamidu i chlorku metanosulfonowego wobec eteratu trifluorku boru. Sposobem tym otrzymuje się pochodną 4'-metoksylową genisteiny (5,7-dihydroksy-4'-metoksyizoflawon), którą trzeba poddać demetylowaniu w obecności trójbromku boru do genisteiny.

Sposoby te wymagają wprowadzania i usuwania grup zabezpieczających, oraz szczególnie ostrożnego doboru warunków reakcji ze względu na dużą reaktywność substratów polifenolowych, które łatwo ulegają reakcjom polikondensacji lub utleniania. Ponadto istotne ograniczenie tych sposobów stanowi dostępność stosowanych surowców wyjściowych, hydroksylowych pochodnych fenoli i aldehydów aromatycznych w syntezie pośrednich chalkonów lub deoksybenzoin.

Opisany przez K. Wahala i T.Hase (J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 1991, str. 3005) sposób otrzymywania polihydroksyizoflawonów w jednostopniowej reakcji nie wymagającej zabezpieczania grup hydroksylowych polega na reakcji Friedla-Craftsa podstawionych fenoli i kwasów octowych w środowisku eteratu trifluorku boru. Reakcję można przerwać na etapie utworzonej deoksybenzoiny lub bez wydzielania produktu pośredniego przeprowadzić katalizowaną cyklizację wobec DMF i chlorku metanosulfonowego do izoflawonów.

Mimo deklarowanej przez autorów całkowitej wydajności reakcji otrzymywania genisteiny w reakcji floroglucyny z kwasem 4-hydroksyfenylooctowym w środowisku eteratu trifluorku boru rzędu 50%, w praktyce okazało się, że w mieszaninie poreakcyjnej pozostaje duża ilość nieprzereagowanych substratów, powstaje duża ilość produktów ubocznych i jedynie śladowe ilości deoksybenzoiny.

PL 194 989 B1

Nieoczekiwanie okazało się, że można uzyskać genisteinę o wysokim stopniu czystości i z wysoką wydajnością stosując w reakcji regioselektywnego C-acylowania pierścienia aromatycznego fenolu całkowicie niezabezpieczone surowce.

Sposób otrzymywania genisteiny o wzorze 1 polega na tym, że floroglucynę o wzorze 2 poddaje się reakcji z cyjankiem 4-hydroksybenzylu o wzorze 3, po czym wyodrębniony produkt pośredni - deoksybenzoinę o wzorze 4 poddaje się reakcji formylowania i cyklizacji w jednym etapie, a następnie surową genisteinę oczyszcza się.

Reakcję floroglucyny z cyjankiem 4-hydroksybenzylu prowadzi się wobec katalitycznych ilości chlorku cynku w rozpuszczalniku eterowym, przepuszczając przez mieszaninę reakcyjną strumień suchego chlorowodoru w temp. 0-5°C. Jako rozpuszczalnik eterowy stosuje się na przykład eter dietylowy, eter diizopropylowy, eter tert-butylometyIowy. Korzystnie jako rozpuszczalnik stosuje się eter typu glimu (etery glikolu etylenowego i jego oligomerów), zwłaszcza dimetoksyetan.

Cyklizację deoksybenzoiny prowadzi się w N,N-dimetyloformamidzie wobec eteratu trifluorku boru i chlorku metanosulfonowego. N,N-dimetyloformamid odgrywa w reakcji podwójną rolę - czynnika formylującego i rozpuszczalnika. Korzystnie stosuje się pięciomolowy nadmiar trifluorku boru i trójmolowy nadmiar chlorku metanosulfonowego w stosunku do deoksybenzoiny. Reagenty te dodaje się kolejno do mieszaniny reakcyjnej w temperaturze 20-45°C, jednocześnie oddestylowując z mieszaniny reakcyjnej eter, co umożliwia prowadzenie końcowego etapu syntezy w podwyższonej temperaturze (65-70°C).

Otrzymaną surową genisteinę oczyszcza się poddając ją reakcji hydrolizy w środowisku wodno-metanolowym przy pH 8-13,5 w temperaturze pokojowej lub wyższej, a następnie ochłodzoną do temperatury 0-10°C klarowną mieszaninę reakcyjną zakwasza się roztworem kwasu mineralnego do pH 0,5-3,5 i czysty krystaliczny osad wydziela się w znany sposób.

Do zawiesiny jednej części molowej surowej genisteiny dodaje się dwie części molowe roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego. Po rozpuszczeniu się zawiesiny produktu mieszanie kontynuuje się przy pH 8-13,5, korzystnie przy pH 11, w temperaturze pokojowej lub wyższej przez 2 godziny. Następnie do klarownego i ochłodzonego do temp. 0-10°C roztworu dodaje się dwie części molowe roztworu kwasu mineralnego, korzystnie kwasu solnego, do uzyskania pH 0,5-3,5. Krystaliczny osad odsącza się, przemywa wodą i suszy, otrzymując genisteinę o wysokiej czystości (ok. 99,8% według HPLC).

Sposób według wynalazku pozwala uzyskać substancję o potencjalnym zastosowaniu przeciwnowotworowym - genisteinę o wysokim stopniu czystości i z dobrą wydajnością z łatwodostępnych surowców, w wyniku kilku nieskomplikowanych etapów reakcji.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania.

P r z y k ł a d 1.

Cyjanek 4-hydroksybenzylu

A. Alkohol 4-hydroksybenzylu

Aldehyd 4-hydroksybenzoesowy (900 g; 7,37 mola) rozpuszczono w 4 l metanolu w temp. pokojowej. Po ochłodzeniu mieszaniny do ok. +10°C na łaźni woda z lodem, dodawano porcjami (po ok. 5 g) przez ok. 3 godziny borowodorek sodu (174 g; 4,6 mola), utrzymując temperaturę mieszaniny w granicach +15-20°C. Postęp reakcji kontrolowano za pomocą chromatografii TLC na żelu krzemionkowym, w układzie chloroform:etanol:kwas octowy (90:10:0,01). Następnie mieszaninę zakwaszono kwasem octowym (270 ml) przy temperaturze 15°C, do pH 5,5. Rozpuszczalniki odparowano, odzyskując 3,5 l destylatu. Pozostałość zadano zimną wodą (1 l) i octanem etylu (2 l) i mieszano przez 1 godzinę. Warstwy organiczną i wodną rozdzielono, po czym warstwę wodną ekstrahowano dodatkowo octanem etylu (3x1 l). Połączone fazy organiczne przemyto solanką (2x1,5 l) i suszono bezw. siarczanem sodu (150 g). Po odsączeniu, roztwór octanu etylu zatężono na wyparce, odzyskując 4 l rozpuszczalnika. Do wilgotnej pozostałości krystalicznego osadu dodano 2x0,5 l toluenu i odparowano rozpuszczalniki na wyparce przy temp. ok.70°C. Uzyskano 870 g czystego alkoholu 4-hydroksybenzylowego. Wydajność 95%.

T.t. 114-122°C.

IR ⁽KBl cm^-1): 3387^, 3111, 16^ 1598^, 1454^, 1370^, 1236^, 1208^, 994^, 838^, 565^, 491.

B. Cyjanek 4-hydroksybenzylu

W kolbie umieszczono 186,2 g (1,5 mola) alkoholu 4-hydroksybenzylowego, 91,6 g cyjanku sodu i 1 l suchego dimetyloformamidu. Mieszaninę energicznie mieszano i ogrzewano w atmosferze azotu w temp. 110-130°C na łaźni olejowej przez 20 godzin. Następnie mieszaninę ochłodzono do

PL 194 989 B1 temp. pokojowej, dodano 200 ml zimnej wody, 25 g wodorotlenku sodu i mieszano 1 godzinę. Z mieszaniny reakcyjnej usunięto rozpuszczalniki na wyparce obrotowej przy ciśnieniu 0,1-1 mm Hg (0,13-1,33 hPa) przy temp. łaźni wodnej 45°C. Do pozostałości dodano 500 ml zimnej wody i mieszano do rozpuszczenia się osadu. Całość zobojętniono 75 ml kwasu octowego do pH 5,5. Roztwór wodny ekstrahowano chloroformem (2x200 ml i 2x100 ml). Połączone warstwy organiczne przemyto 200 ml solanki i suszono bezw. siarczanem sodu. Odsączono środek suszący i roztwór chloroformowy zatężono na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość (358,8 g) ciemnobrunatnego oleju poddano wstępnej destylacji próżniowej pod ciśnieniem 18-20 mm Hg (24,0-26,6 hPa) w temp. 70°C uzyskując 157,1 g przedgonu. Zasadniczą destylację prowadzono w temp. 157°C pod ciśń. 0,5 mm Hg (0,66 hPa). Otrzymano 172,5 g czystego cyjanku 4-hydroksybenzylu, krystalizującego w postaci bezbarwnych do jasnosłomkowych kryształów w temp. poniżej 70°C. Wydajność: 86,4%.

T.t. 67^-70°C. ¹H NMR ⁽200 MHz, CDCl₃), d ^(ppm^): 3^,68 (s, 2H^); 5^,19 (s, 1H^); 6^,83 (dd.J^^Hz, J2=6,6Hz, 2H); 7,18 (dd, J(=2,2Hz, J2=6,6Hz, 2H).

P r z y k ł a d 2.

2,4,6,4'-Tetrahydroksydeoksybenzoina.

W kolbie umieszczono 152,15 g (1 mol) stopionego cyjanku 4-hydroksybenzylu. Ochłodzony cyjanek 4-hydroksybenzylu rozpuszczono w 500 ml bezwodnego eteru dimetoksyetylowego w czasie 15 minut. Następnie dodano 126,11 g (1 mol) floroglucyny. Do klarownego roztworu dodano 68,14 g (0,5 mola) bezwodnego chlorku cynku oraz 500 ml eteru dimetoksyetylowego. Mieszaninę energicznie mieszano, chłodzono na łaźni woda z lodem do temp. 0-5°C i dozowano suchy strumień chlorowodoru (generowany z 535 g NH₄Cl i 535 ml stęż. H2SO4). Nasycanie chlorowodorem kontynuowano przez 2 godziny, a następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono w temp. poniżej 10°C na 24 godziny. Po tym czasie z mieszaniny wypadła niewielka ilość żółtego krystalicznego osadu chlorowodorku ketoiminy. W celu całkowitego przereagowania substratów, mieszaninę reakcyjną poddano w analogiczny sposób ponownemu wysyceniu suchym chlorowodorem. Z mieszaniny wypadła duża ilość krystalicznego osadu, który pozostawiono w temp. poniżej 10°C na 3 doby. Przebieg reakcji Friedla-Craftsa kontrolowano metodą TLC na żelu krzemionkowym w układzie chloroform:etanol:kwas octowy 90:10:0,01 (obj.). Powstały żółty osad produktu odsączono i przemyto eterem dimetoksylowym (400 ml). Osad zadano 2% roztworem wodnym kwasu solnego (1000 ml) i całość ogrzewano w temp. wrzenia przez 3,5 godziny. Po ochłodzeniu do temp. pokojowej produkt odsączono i przemyto wodą (2x500 ml), a następnie krystalizowano z mieszaniny woda-metanol (2:1, 2,4 l). Wydzielone żółte kryształy odsączono, przemyto mieszaniną woda-metanol (2:1,240 ml) i wysuszono w temp. 100-105°C. Wydajność 161 g (61,9%). T.t. 270-272°C.

IR ⁽KBl cm^1): 3490^, 3323^, 3205^, 1646^, 1611, 1592^, 1540^, 15^ 1475^, 14^ 12^ 1079^, 994^,819, 799, 529.

¹H^-NMR ⁽200 MH^ aceton-d6), d ^(ppm^): 4^,30 (s, 2H^); 5^,93 (s, 2H^); 6^,75 (dd, ^=2,0^, J2=6,4Hz, 2H); 7,10 (dd, J(=2,0Hz, J2 = 6,4Hz, 2H); 8,13 (bs, 1H); 11,74 (bs, 1H).

P r z y k ł a d 3.

4',5,7-Trihydroksyizoflawon (genisteina)

W kolbie umieszczono 150 g (0,576 mola) deoksybenzoiny i 858 g suchego N,N-dimetyloformamidu. Całość mieszano przez 15 minut w temp. pokojowej. Do klarownego roztworu wkroplono w czasie 45 minut 408 g (2,874 mola) eteratu trifluorku boru, obserwując wzrost temperatury mieszaniny do 40°C. Następnie oddestylowano eter dietylowy ogrzewając mieszaninę na łaźni olejowej do temp. 45°C w czasie 1 godziny. Odebrano 100 ml eteru. Kontynuując mieszanie w temp. 45°C, wkraplano 197,9 g (1,728) chlorku metanosulfonowego w czasie 30 minut. Temperatura mieszaniny wzrosła do 56°C. Mieszaninę wygrzewano w temp. 65-70°C w czasie 4 godzin przy temp. łaźni olejowej 80-85°C. Po 30 minutach wytrącił się żółty osad. Po ochłodzeniu do temp. pokojowej mieszaninę reakcyjną wylano do 4,5 l zimnej wody i mieszano przez 12 godzin. Wydzielony jasnokremowy osad odsączono i przemyto wodą (2x3 l) do pH ok. 6,5. Otrzymano 381,3 g wilgotnego osadu, z którego po wysuszeniu w temp.100-105°C uzyskano 153 g produktu o zawartości związku tytułowego 97,7% (HPLC). Wydajność: 96,03%.

Surowy produkt reakcji (2,7 g) zawieszono w 80 ml metanolu i dodano 20 ml 1M NaOH. Mieszano przez 2 godziny w temp. 24°C. Do klarownego roztworu metanolowo-wodnego dodano 20 ml 1M HCl w czasie 5 minut. Po 30 minutach do mieszaniny zawierającej wypadający krystaliczny osad dodano 40 ml zimnej wody, całość ochłodzono na łaźni woda z lodem do temp. 5-10°C i mieszano przez 1 godzinę. Osad odsączono i przemyto oziębioną mieszaniną MeOH:H2O (1:1). Po wysuszeniu

PL 194 989 B1 na powietrzu (temp. 30-35°C, 12 godz.), otrzymano 2,59 g oczyszczonej genisteiny (99,9%, HPLC). Wydajność 96,07%.

T.t. 300-301°C.

IR ⁽KBl cm^-1): 3411 3105^, 1652^, 16^ 1520^, 1504^, 1310^, 1274^, 1203^, 1180, 1145, 1044^, 791. ¹H^-NMR ⁽200 MH^ DMSO^-d6^), d ^(ppm^): 6^,20 (d, J=2,0H^z, 1H^); 6^,33 (d, J=2,0H^z, 1H^); 6^,83 (dd,

J1=2,0Hz, J2=6,0Hz, 2H); 7,33 (dd, J1=2,0Hz, J2 = 6,6Hz, 2H); 8,09 (s, 1H); 9,35 (s, 1H) 10,55 (s, 1H); 12,87 (s,1H).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sppsób otrzzmywaaia ggnisteiny o wzzrzz 1, zznmieenn tym, że florooluucnę o wzzrzz 2 poddaje się reakcji z cyjankiem 4-hydroksybenzylu o wzorze 3, po czym wyodrębniony produkt pośredni - deoksybenzoinę o wzorze 4 poddaje się reakcji formylowania i cyklizacji w jednym etapie, a następnie surową genisteinę oczyszcza się.

2. Sppsób w^e^^^g zas^r. f 1 zznmieenn tym, że fikcję florzoluccny z cc^^^r^n^h^r^ 4-hyyrzSkóbenzylu prowadzi się wobec katalitycznych ilości chlorku cynku w rozpuszczalniku eterowym, przepuszczając przez mieszaninę reakcyjną strumień suchego chlorowodoru w temp. 0-5°C.

3. Sppośb wzeługzzstrz. f zlbo 2. z znmieenn tym, żeń jak fzozusózczlnik zrerzwzstosójęsię eter typu glimu.

4. Sppsób wzeług zzstrz. 3, zznmieenn tym, że j j^^o fcs^F^L^^^c^^^lr^ik. ererzwz stesóję się; eem dimetoksyetylowy.

5. Sposób według zas-trz. 1, znamienny tym, że cykllzaccę deoksybenzoiny się w N,N-dimetyloformamidzie wobec eteratu trifluorku boru i chlorku metanosulfonowego.

6. Sppsób wzeług zzstrz. f, zznmieenn tym, że w ζ^Ιο^ ccklizzaci stesóję ssę? pięęiomolowz nadmiar trifluorku boru i trbjmolowy nadmiar chlorku metanosulfonowego w stosunku do deoksybenzoiny.

7. Spłc^oit) wzeług zzstrz. Ż1 fr^nr^ier^r^^ tym, fe żórzwz zgnisteiny fię ppdddjjc ją reakcji hydrolizy przy pH 8-13,5 w środowisku wodno-metanolowym, a następnie zakwasza się do pH 0,5-3,5 i wydziela krystaliczny osad.