PL194697B1

PL194697B1 - Zastosowanie szczepu Lactobacillus

Info

Publication number: PL194697B1
Application number: PL98338578A
Authority: PL
Inventors: Hanna Bukowska; Marie-Louise Johansson; Marek Naruszewicz
Original assignee: Probi Ab
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2007-06-29
Also published as: EP0990024B1; CN1142995C; KR20010022617A; ES2259457T3; EP0990024A1; DE69834560D1; SE9702860L; SE510753C2; US6214336B1; NO20000268L; PL338578A1; WO1999007827A1; NO324881B1; CA2297023A1; CN1265141A; NO20000268D0; BR9811825A; JP2001512747A; ATE326524T1; JP4651814B2

Abstract

1. Zastosowanie szczepu Lactobacillus do wytwarzania leku do obnizania poziomu fibrynogenu we krwi u ssaków, w tym u czlowieka, w profilaktyce i/lub leczeniu chorób ukladu krazenia. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu Lactobacillus do wytwarzania leku.

Fibrynogen jest białkiem osocza, syntetyzowanym w wątrobie, które w ostatnim etapie kaskady krzepnięcia krwi jest przekształcane przez aktywowaną trombinę w nierozpuszczalną fibrynę. Z kolei fibryna ulega rozkładowi w wyniku reakcji fibrynolizy pod działaniem plazminy, zwanej również fibrynolizyną. Jest to fizjologiczny mechanizm usuwania z krążenia niewielkich zakrzepów zawierających fibrynę.

Stężenie fibrynogenu w osoczu wzrasta wraz z wiekiem od około 2,3 mg/ml w wieku 20 lat do 3,5 mg/ml w wieku 70 lat. Ten wzrost jest związany z około 20% zmniejszeniem endogennej aktywności fibrynolitycznej w tym samym czasie. W warunkach stresu lub urazu poziom fibrynogenu we krwi może ulec podwojeniu lub potrojeniu w ciągu 48 godzin. Potwierdzono, że fibrynogen we krwi jest głównym czynnikiem wpływającym na lepkość krwi i osocza w mikrokrążeniu, na agregację krwinek czerwonych i płytek krwi oraz na progresję zmian miażdżycowych. Poziom fibrynogenu we krwi zwiększa się, a endogenna aktywność fibrynolityczna maleje pod wpływem stanów lub czynników powodujących zwiększenie stężenia wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) w osoczu, patrz Pickart, L., Pharmacology 23: 271-280, 1981.

Wzrost poziomu fibrynogenu jest związany ze wzrostem szybkości opadania erytrocytów (OB), co od dawna wiązano z ryzykiem zapadalności na niedokrwienną chorobę serca. W ostrym zawale mięśnia sercowego poziom fibrynogenu w osoczu, jak również poziom wolnych kwasów tłuszczowych, są podwyższone.

Fibrynogen jako czynnik ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego opisali Ernst, E. i inni w Annals of Internal Medicine 118: 956-963, 1993. W sześciu prospektywnych badaniach epidemiologicznych oceniano korelację poziomu fibrynogenu z występowaniem następnie zawału mięśnia sercowego, udaru i zarostowej choroby tętnic obwodowych; analizowano również, czy związek ten ma charakter przyczynowo-skutkowy. Wszystkie prospektywne badania wykazały, że istnieje związek pomiędzy poziomem fibrynogenu a występowaniem następnie zawału mięśnia sercowego lub udaru. Na podstawie tych badań wywnioskowano, że istnieje patofizjologiczny związek pomiędzy fibrynogenem a incydentami sercowo-naczyniowymi oraz że fibrynogen można uważać za znaczący czynnik ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego.

Na poziom fibrynogenu u osób zdrowych i chorych wpływa szereg czynników. Niektórych z nich nie można zmienić: wieku, płci i cech dziedzicznych. Do czynników podatnych na zmiany należą czynniki związane z trybem życia, jak palenie papierosów, siedzący tryb życia, dieta i stres.

Podwyższony poziom cholesterolu, jak również podwyższone ciśnienie krwi, stanowią inne ważne czynniki ryzyka chorób serca. Na poziom cholesterolu w surowicy składa się stężenie HDL, lipoprotein o dużej gęstości, oraz LDL, lipoprotein o małej gęstości. Podczas gdy podwyższony poziom cholesterolu LDL może wiązać się z patogenezą miażdżycy, okazało się, że wyższe stężenie cholesterolu HDL zmniejsza ryzyko chorób serca.

Istnieje szereg środków obniżających poziom lipidów, które oprócz trwałego zmniejszenia poziomu FFA w osoczu, powodują również obniżenie poziomu fibrynogenu we krwi oraz nasilenie aktywności fibrynolitycznej poprzez zmniejszenie syntezy fibrynogenu i antyfibrynolizyn w wątrobie, patrz Pickart, L., Pharmacology 23(5), 271-80, 1981. Do takich środków, różniących się właściwościami biochemicznymi i budową, należą przykładowo disulfid allilowo-propylowy, aktywny składnik zawarty w czosnku i cebuli, kwas acetylosalicylowy i klofibrat, analog kwasów tłuszczowych. Większość tych środków powoduje występowanie nieprzyjemnych lub poważnych działań niepożądanych, a zatem istnieje potrzeba opracowania bardziej skutecznych środków.

Dane dotyczące potencjalnego, obniżającego poziom cholesterolu działania sfermentowanych produktów mlecznych u człowieka są sprzeczne, a zagadnienie czy spożywanie takich produktów chroni przed występowaniem choroby wieńcowej pozostaje niewyjaśnione. Gilliland, S. E. i inni w Applied and Environmental Microbiology, 49(2): 377-381, 1985, ustalili, że niektóre szczepy Lactobacillus acidophilus, ale nie wszystkie, bezpośrednio oddziałują na cholesterol w przewodzie żołądkowo-jelitowym, a zatem mogą być skuteczne w obniżaniu poziomów cholesterolu w surowicy, co spowoduje zmniejszenie częstości występowania choroby wieńcowej. Doniesiono również, że niektóre z tych szczepów odznaczają się zdolnością do dekoniugacji soli kwasów żółciowych. W tym badaniu jako model zwierzęcy stosowano świnie.

PL 194 697 B1

W EP 181170 ujawniono szczepy Bifidobacterium i Lactobacillus o działaniu obniżającym poziom cholesterolu, a także środek farmaceutyczny do zmniejszania poziomu cholesterolu w surowicy krwi, zawierający żywe i/lub martwe komórki tych drobnoustrojów.

W EP 671468 opisano szczepy Lactobacillus, które obniżają poziom cholesterolu we krwi i w wątrobie, a przy tym nie powodują dekoniugacji sprzężonych kwasów żółciowych.

Obecnie nie jest znana substancja, która bezpiecznie i selektywnie obniża poziom fibrynogenu u pacjentów w grupie ryzyka.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że podane doustnie żywe bakterie Lactobacillus powodują spadek poziomu fibrynogenu w surowicy.

Tak więc wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Lactobacillus do wytwarzania leku do obniżania poziomu fibrynogenu we krwi u ssaków, w tym u człowieka, w profilaktyce i/lub leczeniu chorób układu krążenia.

Lek jest przeznaczony szczególnie do profilaktyki i/lub leczenia chorób układu krążenia, takich jak miażdżyca tętnic, choroby układu sercowo-naczyniowego, choroba wieńcowa, zawał serca, choroba niedokrwienna serca, udar.

Korzystnie stosuje się szczep Lactobacillus należący do gatunku Lactobacillus plantarum lub Lactobacillus rhamnosus, a zwłaszcza Lactobacillus plantarum 299v, numer depozytu DSM 9843.

Szczep Lactobacillus może powodować również spadek poziomu cholesterolu w surowicy, a zatem może być przydatny do obniżania poziomu cholesterolu we krwi.

Szczep Lactobacillus można stosować w połączeniu z substancją czynną przeciwdziałającą hiperlipoproteinemii do obniżania poziomu fibrynogenu, a także poziomu cholesterolu, we krwi. Dzięki temu będzie możliwe podawanie niższej dawki leku zmniejszającego stężenie lipoprotein, którego podawanie często wiąże się z występowaniem poważnych działań niepożądanych.

Korzystny szczep Lactobacillus powinien odznaczać się zdolnością do przejścia w stanie żywym przez żołądek do dalszych odcinków przewodu żołądkowe-jelitowego oraz zdolnością do kolonizacji jelit. Dwa czynniki wydają się kluczowe do wywoływania pożądanego działania przez bakterie Lactobacillus. Pierwszym jest zdolność do kolonizacji jelita, to znaczy do przeżywania w dużych ilościach przez okres czasu, jaki upłynął od momentu ostatniego podania żywych bakterii. Drugim czynnikiem jest zdolność do bezpośredniego wiązania się z komórkami nabłonkowymi jelit. Może to być jeden z czynników ułatwiających kolonizację, ale nie jest warunkiem kolonizacji. Zdolność przywierania do komórek nabłonka nie gwarantuje, że szczep jest zdolny do kolonizacji.

Do przykładów użytecznych gatunków Lactobacillus należą L. plantarum i L. rhamnosus. Różne szczepy tych bakterii opisano w zgłoszeniu PCT/SE92/00528 opublikowanym jako WO 93/01823, dotyczącym sposobu izolowania szczepów Lactobacillus, odznaczających się zdolnością przywierania do ludzkich błon śluzowych jelit in vivo, a także do pozostawania na błonach śluzowych po podaniu doustnym przez co najmniej 10 dni. Zgłoszenie to dotyczy zwłaszcza dwóch nowych szczepów Lactobacillus, zdeponowanych zgodnie z Porozumieniem Budapesztańskim w DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH - Braunschweig, Niemcy, 2 lipca 1991 r., to znaczy L. plantarum 299, numer DSM 6595, oraz L. casei ssp. rhamnosus 271, numer DSM 6594, jak również ich wariantów. Korzystnym szczepem jest Lactobacillus plantarum 299v, zdeponowany w DSM 16 marca 1995 r. pod numerem DSM 9843. Ten szczep, jak również inne szczepy L. plantarum, opisano w WO 96/29083. Szczep Lactobacillus może być podawany wraz z pożywieniem lub środkiem farmaceutycznym, zapewniającym żywotność szczepu w jelicie grubym. Środek zawierający ten szczep może być podawany w dowolny sposób, korzystnie doustnie lub doodbytniczo, np. w postaci wlewu. Może być również podawany dojelitowo poprzez cewnik wprowadzony do jelita przez żołądek lub bezpośrednio do jelita.

Nośnikiem szczepu Lactobacillus w środku farmaceutycznym jest np. fizjologicznie dopuszczalny substrat ulegający fermentacji pod wpływem danych bakterii, zwłaszcza na bazie skrobi lub mleka. Odpowiedni substrat może zawierać ciecz lub stałe włókna, które nie ulegają wchłanianiu w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Do odpowiednich substratów zawierających skrobię przykładowo należą produkty zbożowe, takie jak owies i pszenica, kukurydza, warzywa korzeniowe, takie jak ziemniaki, oraz niektóre owoce, np. zielone banany. Korzystnym substratem do stosowania w środku farmaceutycznym, nadającym ponadto preparatowi doskonałą wartość odżywczą, jest roztwór odżywczy na bazie mąki owsianej, np. opisany w WO 89/08405. Sfermentowany produkt można również zmieszać z produktem spożywczym, korzystnie na bazie owoców lub jagód, takich jak owoce dzikiej róży,

PL 194 697 B1 czarne borówki, truskawki, ale również wraz z obojętną substancją stałą lub ciekłą, taką jak roztwór soli lub woda.

Podawanie powinno odbywać się raz lub kilka razy dziennie przez pewien okres czasu. Dla uzyskania wyraźnego działania szczep Lactobacillus powinien być podawany w dawce dziennej nie mniejszej niż około 10 bakterii.

Test biologiczny

Celem tego badania było ustalenie wpływu produktu spożywczego (ProViva®), zawierającego Lactobacillus plantarum 299v, na stężenie lipidów w surowicy, zwłaszcza cholesterolu LDL, oraz poziom fibrynogenu u osób z umiarkowanie podwyższonym stężeniem cholesterolu.

Materiał i metody

Produkt spożywczy ProViva® był napojem z owoców dzikiej róży zawierającym owies (0,75 g mąki owsianej, czyli 0,07 g włókien owsa/100 ml). Produkt zawierał około 5 x 10⁷ cfu/ml Lactobacillus plantarum 299v i około 0,035 g kwasu DL-mlekowego/100 ml). W procesie wytwarzania tego produktu sfermentowany owies i napój z owoców dzikiej róży przygotowano oddzielnie, a następnie zmieszano razem w ilości 5% (objętościowo) sfermentowanego owsa (zawierającego 18,5% (objętościowo) mąki owsianej) i 95% (objętościowo) napoju z owoców róży. Jako placebo stosowano czysty napój z owoców dzikiej róży, składający się ze sproszkowanych owoców dzikiej róży, sacharozy, środka zagęszczającego, kwasu cytrynowego, kwasu askorbinowego i wody. Oba produkty zostały wytworzone przez firmę Skanemejerier (Lunnarp, Szwecja).

Badaniem objęto 30 mężczyzn w wieku 42,6 ±2,8 lat, poddanych uprzednio dokładnemu badaniu w kierunku objawów ze strony przewodu żołądkowe-jelitowego, stosowanych leków, palenia tytoniu, nawyków żywieniowych oraz spożywania alkoholu. Z badania wyłączono osoby z rozpoznaną chorobą układu sercowo-naczyniowego, cukrzycą oraz nadciśnieniem tętniczym. Zapisywano wagę pacjentów, wzrost, wartość ciśnienia tętniczego krwi i częstość tętna oraz pobierano krew do badań biochemicznych. Badanie miało postać podwójnie ślepej próby, a uczestników w sposób losowy podzielono na dwie grupy o jednakowej liczebności, otrzymujące odpowiednio preparat ProViva® lub placebo. Charakterystykę pacjentów objętych badaniem przedstawiono w poniższej tabeli 1.

Każda z badanych osób spożywała 200 ml preparatu ProViva® lub placebo codziennie rano przez sześć tygodni i prowadziła taki sam tryb życia jak dotychczas. Pod koniec tego okresu uczestnicy zostali poddani ponownemu badaniu oraz ponownie pobrano im krew do badań biochemicznych.

Poziomy cholesterolu i triglicerydów w surowicy określono z użyciem zestawów enzymatycznych (CHOD-PAP, GPO-PAP). Stężenie cholesterolu HDL mierzono po wytrąceniu lipoprotein zawierających apoB kwasem fosforowolframowym w obecności jonów Mg²⁺. Stężenie cholesterolu LDL określano po wytrąceniu LDL poli(siarczanem winylu). Procedury laboratoryjne były oparte na zestawach do badań z firmy Boehringer-Mannheim. Stężenie glukozy mierzono z użyciem oksydazy glukozowej oraz zestawów testowych firmy Analco (PAP), natomiast fibrynogen w osoczu oznaczano zgodnie z metodą Claussa w oparciu o czas trombinowy (zestawy testowe z firmy bioMerieux).

Tabel a 1

Charakterystyka osób badanych w obu grupach

Parametr	ProViva®	Placebo
Liczba	15	15
Wiek (lata)	43,0 ± 2,0	42,3 ± 3,0
BMI (kg/m)	26,6 ± 3,7	25,9 ± 2,6
Ciśnienie skurczowe (mmHg)	133 ± 12	125 ± 15
Ciśnienie rozkurczowe (mmHg)	88 ± 7	83 ± 9

PL 194 697 B1

Tabel a 2

Parametry biochemiczne u osób badanych po spożyciu ProViva® lub placebo

Parametr	ProViva®	Placebo
mg/dl	przed 6 tyg.	po ⁶ tyg.	przed 6 tyg.	po ⁶ tyg.
Triglicerydy	122 ± 61	121 ± 52	127 ± 42	112 ± 32
Cholesterol	233 ± 36	216 ± 33*	216 ± 31	208 ± 40
Cholesterol LDL	156 ± 36	141 ± 34*	140 ± 32	134 ± 41
Cholesterol HDL	47 ± 10	46 ± 10	48 ± 10	46 ± 8
Glukoza	110 ± 11	112 ± 11	104 ± 10	109 ± 16
Fibrynogen	319 ± 82	276 ± 58**	320 ± 85	307 ± 60

* p < 0,01 ** p < 0,001

Wyniki

Nie było znaczących różnic pomiędzy grupami w zakresie wieku, wskaźnika masy ciała (BMI), wartości skurczowego lub rozkurczowego ciśnienia krwi (tabela 1). Wyniki badań biochemicznych przedstawiono w tabeli 2. Początkowe stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterolu LDL i fibrynogenu były umiarkowanie podwyższone w obu grupach, natomiast stężenia triglicerydów i cholesterolu HDL pozostawały w granicach normy. W tym punkcie nie stwierdzono statystycznie istotnych różnic pomiędzy grupami.

Wyniki przedstawiono w mg/dl. W przypadku badań biochemicznych obliczono wartości średnie i odchylenia standardowe oraz porównano je z zastosowaniem nie-sparowanego testu t-Studenta (pomiędzy grupami) lub testem sparowanym w obrębie jednej grupy. Przyjęto poziom istotności p < 0,05. Po sześciu tygodniach eksperymentu poziom fibrynogenu w grupie otrzymującej preparat ProViva® spadł z 319 ± 82 do 276 ± 58 mg/dl (p < 0,001), co stanowi zmniejszenie o 13,5% w stosunku do wartości początkowej. Podobnie, poziomy cholesterolu całkowitego i cholesterolu LDL spadły o 7,3%, odpowiednio (z 233 ± 33 do 216 ± 31) oraz 9,6% (z 156 ± 36 do 141 ± 34). Poziomy triglicerydów, glukozy i cholesterolu HDL pozostały niezmienione w tej grupie.

W grupie otrzymującej placebo nie stwierdzono występowania statystycznie istotnych różnic w zakresie wartości początkowych i końcowych.

Badanie to potwierdza wcześniejsze obserwacje, że produkty spożywcze zawierające pewne szczepy Lactobacillus zmniejszają poziom cholesterolu we krwi. Po raz pierwszy jednakże stwierdzono, że szczep Lactobacillus jest skuteczny w obniżaniu poziomu fibrynogenu. Tak więc dodatek bakterii Lactobacillus do pożywienia może być korzystny u pacjentów z umiarkowanie podwyższonym stężeniem cholesterolu, co zmniejsza zagrożenie wystąpienia chorób układu sercowo-naczyniowego.

Potwierdzono, że fibrynogen jest niezależnym czynnikiem ryzyka choroby niedokrwiennej serca, a jego poziom we krwi jest regulowany przez czynniki genetyczne i środowiskowe. Stwierdzenie, że preparat ProViva® zmniejsza zarówno poziom fibrynogenu, jak i cholesterolu sprawia, że może być on obiecującym produktem spożywczym do stosowania we wczesnym zapobieganiu chorobie niedokrwiennej serca.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie szczepu Lactobacilluu do w\^t\^£^r^^£^rn£a I eku do obniżania pc^^ic^r^u fibrynogenu we krwi u ssaków, w tym u człowieka, w profilaktyce i/lub leczeniu chorób układu krążenia.

PL 194 697 B1
2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym lek jest przeznaczony do profilaktyki i/lub leczenia chorób gkłnOg krążsain, Oskich jnk minżOżkzn tętaiz, zhsosbk bkłcOb odozsws-aczakaiswdgs, zhsosbc wicńzswc, enwnł osrzn, zhsrsbn aisOskrwisayn osrzn, bOnr.
3. ZastooowasiewaSłub zactr^. 1 albb2,w którym soezes LactobacillusiialesżdO ggCubakLactobacillss plantarsm lub Lactobacillus rhamnosss.
4. Zastooowasie waSłub z^^trr^. 3, w którym zoezes ztósyoa LLatobbaCiuu plaatarrm d29v, namsr Ospsekrg DSM 9843.