PL184411B1 - Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydowa i jej zastosowanie - Google Patents

Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydowa i jej zastosowanie

Info

Publication number
PL184411B1
PL184411B1 PL96324221A PL32422196A PL184411B1 PL 184411 B1 PL184411 B1 PL 184411B1 PL 96324221 A PL96324221 A PL 96324221A PL 32422196 A PL32422196 A PL 32422196A PL 184411 B1 PL184411 B1 PL 184411B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleotide sequence
amino acid
seq
peptide
sequence shown
Prior art date
Application number
PL96324221A
Other languages
English (en)
Other versions
PL324221A1 (en
Inventor
Graaff Leendert H. De
Peij Noel N. M. E. Van
Den Broeck Henriette C. Van
Jacob Visser
Original Assignee
Danisco Ingredients As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Ingredients As filed Critical Danisco Ingredients As
Publication of PL324221A1 publication Critical patent/PL324221A1/xx
Publication of PL184411B1 publication Critical patent/PL184411B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

1 . Sekwencja nukleotydowa kodujaca peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy i wykazujacy przynajmniej 60% identycznosci amino- kwasów w strukturze pierwszorzedowej z sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencja nukleotydowa hybrydyzujaca w warunkach scislych z sekwencja nukleotydowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub czesc tej sekwencji nukleotydowej, posiadajaca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujacych sekwencje aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 4 Oczyszczony peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy, wykazujacy aktywnosc ß-glukozydazy na poziomie nizszym niz 2% aktyw- nosci ß-ksylozydazy i aktywosc ß-galaktozydazy na poziomie nizszym niz 1% aktywnosci ß-ksylozydazy, kodowany przez sekwencje nukleotydowa kodujaca peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy i wykazujacy przynajmniej 60% identycznosci aminokwasów w strukturze pierwszorzedowej z sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencje nukleotydowa hybrydyzujaca w warunkach scislych z se- kwencja nukleotydowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID N r 1 lub czesc tej sekwencji nukleotydowej, posiadajaca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujacych sekwencje aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr l 6 Sposób wytwarzania peptydu posiadajacego aktywnosc ß-ksylozydazy znam ienny tyra, ze prowadzi sie translacje sekwencji nukleoty- dowej kodujacej peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy i wykazujacy przynajmniej 60% identycznosci aminokwasow w strukturze pierwszo- rzedowej z sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencji nukleotydowej hybrydyzujacej w warunkach sci- slych z sekwencja nukleotydowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub czescia tej sekwencji nukleotydowej, posiadajacej co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujacych sekwencje aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1, w odpowiednim organizmie gospodarza i odzyskuje sie wytwarzany peptyd 9 Wektor ekspresyjny zawierajacy sekwencje nukleotydowa kodujaca peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy i wykazujacy przy- najmniej 60% identycznosci aminokwasów w strukturze pierwszorzedowej z sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencje nukleotydowa hybrydyzujaca w warunkach scislych z sekwencja nukleotydowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID N r 1 lub czesc tej sekwencji nukleotydowej, posiadajaca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujacych sekwencje aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 22 Komórka gospodarza wedlug zastrz 21, znam ienna tym, ze stanowi komórke o jakosci spelniajacej wymagania okreslone dla produk- tów zywnosciowych 24 Sposób wytwarzania preparatu enzymu ksylanolitycznego, wolnego od aktywnosci ß-ksylozydazy, znam ienny tym, ze hoduje sie re- kombinantowa komórke gospodarza zdolna do wytwarzania innych enzymów ksylanolitycznyczych i zawierajaca oprócz wlasnego genomowego kwasu nukleinowego sekwencje nukleotydowa kodujaca peptyd posiadajacy aktywnosc ß-ksylozydazy i wykazujacy przynajmniej 60% identycznosci aminokwasow w strukturze pierwszorzedowej z sekwencja aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencja nukleotydowa hybrydyzujaca w warunkach scislych z sekwencja nukleotydowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub czesc tej sekwencji nukleotydowej, posiadajaca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujacych sekwencje aminokwasowa przedstawiona na sekwencji SEQ ID Nr 1 i odzyskuje sie enzymy z medium hodowli PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd wykazujący aktywność β-ksylozydazy, sekwencja nukleotydową kodująca ten peptyd i zastosowanie tego peptydu β-ksylozydazopodobnego.
184 411
Beta-ksylozydaza (1,4-P-D-ksylan-k.syloksyhydrolaza; EC 3.2.1.37) jest jednym z enzymów ksylanolitycznych. Ksylany są ważnym składnikiem ścian komórkowych roślin, drugim po celulozie. Licznie występują one w większości roślin lądowych, zwłaszcza w odpadowych produktach roślin uprawnych, takich jak słoma, otręby pszenne, kolby kukurydzy, nasiona bawełny i podobnych. Ksylan jest polimerem złożonym, składającym się z polimeru ksylozy z wiązaniami β-1,4, z grupami bocznymi arabinofuranozy, kwasu glukuronowego, kwasu metyloglukuronowego i acetylowymi. Endoksylanaza (EC 3.2.1.8) losowo rozszczepia wiązania β-1,4- w szkielecie ksylanowym z wytworzeniem oligosacharydów, ksylobiozy i ksylozy. Beta-ksylozydaza odczepia końcowe jednostki ksylozy z końca nieredukującego oligomerów ksylozy powstających w wyniku działania endoksylanazy. o-Glukuronidaza odczepia boczne grupy kwasu glukuronowego ze szkieletu jednostek ksylozy, podczas gdy a-L-arabinofuranozydazy (EC 3.2.1.55) odczepiają jednostki arabinozy ze szkieletu ksylanowego a acetyloesterazy (EC 3.1.1.6) usuwają boczne grupy acetylowe.
Beta-ksylozydaza wykazuje również aktywność w reakcjach transglikozylacji, w których jednostki monosacharydu albo alkohole są przyłączane do jednostek ksylozy albo od nich odszczepiane. Beta-ksylozydaza ogranicza szybkość hydrolizy ksylanu (Dekker 1983, Poutanen i Puls 1988).
Reakcje hydrolizy i transglikozylacji (β-ksylozydaz są ważne ze względów gospodarczych, gdyż są związane z rozkładem i utylizacją odpadowych materiałów rolniczych, np. do produkcji ksylozy, oligomerów ksylozy i ksylitolu, które z kolei mają zastosowanie jako środki słodzące do żywności, cukierków i leków, zwłaszcza jako substytuty cukru. Również sam enzym lub jego produkty, mogą być stosowane jako środki poprawiające smak chleba oraz w przemyśle browarniczym.
Beta-ksylozydazy wyizolowano z różnych źródeł, w tym z bakterii i z grzybów. Przykładowo, oczyszczanie β-ksylozydazy z Aspergillus niger opisała Rodionowa i wsp. (1983). Produkt ten miał masę cząsteczkową 253.000 oznaczoną metodą filtracji żelowej i 122.000 oznaczoną metodą SDS-elektroforezy, punkt izoelektryczny przy pH 4,9.
Trzy endoksylanazy i jedną β-ksylozydazę wyizolowano z Aspergillus awamori (Kormelink i wsp., 1993). Masa cząsteczkowa tej β-ksylozydazy wynosiła 110.000, optimum pH 6,5 i optimum temperatury 70°C.
Garcia-Campayo i Wood (1993) opisali beta-D-ksylozydazę z grzyba z pierwszego żołądka przeżuwaczy, Neocallimastix frontalis. Miała ona pozorną masę cząsteczkową 150.000 (oznaczoną metodą filtracji żelowej), optimum pH 6.4 i optimum temperatury 37°C. Utt i wsp.(1991) donieśli o zsekwencjonowaniu genu xylB z bakterii przeżuwaczy, Butyrivibrio fibrisolvens, kodującego aktywność β-ksylozydazy i a-arabinofuranozydazy.
Znane β-ksylozydazy mają charakterystyczne wzory aktywności, które nie zawsze odpowiadają potrzebom przemysłu. Szczególnie, często istnieje potrzeba, aby enzym wykazywał wysoką swoistość wobec ksylozydazy i niską specyficzność wobec innych substratów, takich jak glikozydy i galaktozydy. Bardzo korzystne są zwłaszcza grzybowe β-ksylozydazy ze względu na poziomy aktywności i wzory specyficzności.
Aby było możliwe uzyskanie enzymów β-ksylozydazopodobnych o żądanej charakterystycznej aktywności z żądanych organizmów produkcyjnych, powinno się dysponować informacją o sekwencji genu β-ksylozydazy. Jednakże dotychczas nie zostały opublikowane żadne informacje o sekwencji grzybowych β-ksylozydaz.
Otrzymano nową β-ksylozydazę i oznaczono jej sekwencję aminokwasową oraz sekwencję kodującej ją sekwencji nukleotydowej. Białko to oznaczono w niniejszym opisie symbolem xylD a kodujący je gen oznaczono symbolem xlnD. Struktura pierwszorzędowa tej nowej β-ksylozydazy różni się od struktury znanych enzymów β-ksylozydazo-podobnych. Spektrum jej aktywności również różni się od znanych enzymów β-ksylozydazo-podobnych a jej aktywność jako ksylozydazy jest około dwukrotnie wyższa od aktywności β-ksylozydazy opisanej przez Radionową i wsp. (jak wyżej).
Tak więc, przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydową kodująca peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 30% homologii aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 albo hybrydyzująca
184 411 w warunkach ścisłych z sekwencją, nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji posiadająca co najmniej 15, korzystnie co najmniej 21 a najkorzystniej co najmniej 24 a nawet co najmniej 30 nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1. Pod pojęciem homologii aminokwasowej rozumie się identyczność aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej. Podobieństwo w strukturze aminokwasowej jest zwykle wyższe niż podają to liczby określające identyczność.
W tym kontekście, warunki hybrydyzacji heterologicznej definiuje się następująco: hybrydyzacja w roztworze 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodu x 5 H2O (pH=7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodu, 5 x roztwór Denhardta (100 x roztwór Denhardta na 500 ml: 10 g odczynnika Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy surowicy bydlęcej (Pentax, frakcja V) i 20 (pg/ml DNA ze zdenaturowanej spermy śledzia, w temperaturze 56 C w czasie 18-24 godzin, następnie dwa przemywania po 30 minut w roztworze o składzie: 5 x SSC, 0,1% SDS, w temperaturze 56°C i dwa przemywania po 30 minut w roztworze o składzie: 2 x SSC, 0,1% SDS, w temperaturze 56°C.
Sekwencja nukleotydowa według wynalazku koduje peptyd posiadający znaczącą aktywność β-ksylozydazy, to znaczy, posiadający aktywność β-ksylozydazy jako dominującą aktywność enzymatyczną, a zatem, może być stosowana do produkcji β-ksylozydaz albo ich mutantów. Sekwencje kodujące mogą zawierać mutacje (insercje, delecje albo jedne i drugie) służące do modyfikacji struktury i/lub aktywności produktu ich ekspresji. Dla aktywnego produktu ekspresji powinno być zachowane minimum identyczności i/lub charakterystyka hybrydyzacji zdefiniowana powyżej. Sekwencja nukleotydową może również korespondować z sekwencjami regulacyjnymi lub sygnalnymi dla β-ksylozydaz. Do takich zastosowań, taka sekwencja nukleotydową zawiera w zasadzie sekwencje kodujące lub regulujące β-ksylozydazy, z drugiej strony, ta sekwencja nukleotydową może być użyta jako primer albo sonda do wykrywania sekwencji kodujących β-ksylozydazę. Do tych zastosowań, sekwencja ta zawiera co najmniej od 15 do np. 60 kolejnych nukleotydów z sekwencji SEQ iD Nr 1.
Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący co najmniej 30% homologię (identyczność) aminokwasową z sekwencją aminokwasową. przedstawioną na SEQ ID Nr 1 lub część tego peptydu, który to peptyd nie posiada aktywności β-glukozydazy ani/lub β-galaktozydazy. Zasadniczy brak aktywności β-glukozydazy lub β-galaktozydazy oznacza, że te aktywności występują na poziomie poniżej 2%, zwłaszcza poniżej 1% aktywności β-ksylozydazy. Peptyd posiadający co najmniej 40%, korzystnie co najmniej 60% a najkorzystniej co najmniej 75% identyczności aminokwasowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na SEQ ID Nr 1 stanowi korzystne rozwiązanie według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku są również peptydy zawierające serie 8 kolejnych aminokwasów z sekwencji aminokwasowej SEQ ID Nr 1. Można je wytwarzać wykorzystując translację sekwencji nukleotydowej opisanej powyżej. Korzystnie, peptyd ten zawiera ciągłą serię co najmniej 10 a najkorzystniej co najmniej 12 aminokwasów z sekwencji przedstawionej na sekwencji SEQ ID Nr 1.
Peptyd według wynalazku pochodzi zwłaszcza z grzybów, szczególnie z grzybów nitkowców, np. ze szczepów z rodzaju Aspergillus (zwłaszcza A. niger, A. niger odmiana tubigensis, A. niger, odmiana awamori, A. niger, odmiana kawachii, A. oryzae, A. sydowii, A. japonicus, A. aculeatus, A. ochraceus, A. terreus, A. fumigatus, A. versicolor, A. flavus, A. phoenicis, A. nidulans, A. foetidus i A. carbonarius), Trichoderma (zwłaszcza T. reesei, T. viride, T. longibrachiatum, T. harzianum, T. kongingii, T. pseudokongii) , Penicillium (P. wortmani, P. pinophilum, P. janthinellum, P. citrinum, P. capsulatum, P. oxalicum,
P. verruculosum, P. chrysogenum), Humicola (H. thermophiiium = Scytalidium thermophilium) i Fusarium (F. oxysporum, F. solani).
Wynalazek dotyczy również przeciwciał przeciw peptydowi opisanemu powyżej, służących np. do oczyszczania β-ksylozydaz i do oznaczania obecności tych β-ksylozydaz. Przeciwciała te można uzyskać przez immunizację opisanym powyżej peptydem technikami hybrydoma ogólnie znanymi specjalistom.
184 411
Przedmiotem wynalazku są ponadto wektory ekspresyjne i plazmidy zawierające opisane powyżej sekwencje nukleotydowe pod kontrolą promotora homologicznego bądź heterologicznego.
Wynalazek dotyczy poza tym zastosowania tych sekwencji do produkcji β-ksylozydaz przez różnych gospodarzy pod kontrolą własnych lub heterologicznych sekwencji regulacyjnych albo do produkcji innych peptydów z użyciem sekwencji promotora β-ksylozydazy. Wektory ekspresyjne i komórki gospodarza mogą zawierać wiele kopii sekwencji kodujących xylD (zmienionych lub niezmienionych w odniesieniu do sekwencji SEQ ID Nr 1) oraz inne geny.
Jako organizmy gospodarza mogą być użyte homologiczne szczepy produkcyjne bądź alternatywnie organizmy gospodarzy heterologicznych. Odpowiednimi gospodarzami są grzyby, drożdże, bakterie i rośliny. Ich przykłady obejmują rodzaj Aspergillus, rodzaj Trichoderma, rodzaj Bacillus, rodzaj Kluyveromyces, rodzaj Saccharomyces i rodzaj Fusarium. Do szczególnie korzystnych należą A. niger, A. niger odmiana tubigensis, A. niger, odmiana awamori, A. oryzae, A. japonicus, A. carbonarius, A. aculeatus, T. reesei, T. viride, T. harzianum, F. oxysporum, B. subtills, B. licheniformis, K. lactis i S. cerevisiae. Organizmem gospodarza jest korzystnie organizm dopuszczony do żywności.
Przykłady własnych regionów kontrolnych i heterologicznych regionów regulacyjnych obejmują grzybowe promotory konstytutywne i/lub indukowane, taicie jak promotor kinazy pirogronianowej (pkiA) i promotory dehydrogenazy 3-fosforanu gliceraldehydu (gpd). Przykładami silnych promotorów drożdżowych są dehydrogenaza alkoholowa, kinaza 3-fosfoglicerynianowa i promotory izomerazy fosforanów trioz. Przykładami promotorów bakteryjnych są promotory α-amylazy, spo2 i promotory genów dla proteaz zewnątrzkomórkowych.
Wynalazek dotyczy też użycia sekwencji regulacyjnych zawartych w 5'-niekodującej części sekwencji SEQ iD Nr 1 (nukleotydów 1-854 albo ich części) do ekspresji genów homologicznych lub heterologicznych dla np. ksylanazy, amylazy, glukanazy, oksydoreduktaz, np. heksozooksydazy, a-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esterazy kwasu ferulowego, proteaz bądź ludzkiej interleukiny-6, bydlęcej (pro)chymozyny, ludzkiej laktoferyny, fitazy grzybowej. W takich konstrukcjach może być użyta sekwencja sygnalna xlnD a także odpowiedni terminator, np. xlnD albo trpC.
Dalszą część wynalazku stanowi użycie opisanej powyżej sekwencji nukleotydowej w taki sposób aby rozerwać gen β-ksylozydazy organizmu gospodarza. W tym celu, do organizmu gospodarza wprowadza się sekwencję nukleotydową zawierającą mutację, która powoduje defunkcjonalizację tego genu β-ksylozydazy. Taką mutacją może być delecja jednego lub większej ilości nukleotydów, insercja jednego lub większej ilości nukleotydów lub kombinacja tych manipulacji.
Komórka gospodarza - zmieniona tak, aby przebiegała w niej produkcja lub nadprodukcja β-ksylozydazy bądź aby nie wytwarzała ona własnej β-ksylozydazy - może korzystnie wytwarzać lub wytwarzać w nadmiarze inne odpowiednie białka, w tym enzymy, zwłaszcza inne enzymy ksylanolityczne, takie jak endoksylanazy i/lub inne enzymy, takie jak amylazy, glukanazy, oksydoreduktazy, jak np. heksozooksydazy, a-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esteraza kwasu ferulowego i/lub proteazy. Odpowiednie geny mogą się znajdować pod kontrolą regionów kontrolnych homologicznych albo pod kontrolą regionu kontrolnego genu β-ksylozydazy zawartego w opisanej powyżej sekwencji nukleotydowej.
Białkiem szczególnie odpowiednim do ekspresji przez rekombinantową komórkę gospodarza według wynalazku jest regulator aktywujący szlaku ksylanolitycznego, oznaczony symbolem xylR. Dla tego regulatora genami docelowymi są geny xl-nA, xlnB, xlnC (wszystkie trzy geny kodujące endoksylanazę), xlnD i axeA. Tak więc, komórki gospodarza według wynalazku zawierające gen xlnR, to znaczy, zdolne do ekspresji xylR albo jej aktywnego ekwiwalentu, są wydajnymi producentami β-ksylozydazy - w przypadku, gdy zawierają aktywny gen xlnD albo są producentami innych enzymów ksylanolitycznych, obejmujących endoksylanazy, za wyjątkiem β-ksylozydazy - w przypadku, gdy ich gen xlnD został zdefunkcjonalizowany. Sekwencja nukleotydową genu xlnR jest przedstawiona na sekwencji SEQ IDNr 2.
184 411
Wynalazkiem objęte jest również zastosowanie aktywności enzymatycznej tego peptydu w reakcjach transglikozylacji substratów zawartych w cieście do wypieku chleba i w innych produktach piekarskich w celu polepszenia właściwości chlebia Obejmuje ono użycie β-ksylozydazy jako ulepszacza chleba w sposób znany dla enzymatycznych ulepszaczy chleba.
P-Ksylozydazy kodowane przez sekwencje według wynalazku mogą być również korzystnie stosowane do produkcji ksylozy i oligomerów ksylozy z odpadów drzewnych i roślinnych i z odpadowej masy papierniczej, która to ksyloza i jej oligomery są stosowane jako środki słodzące. Można je redukować do ksylitolu, który jest również efektywnym masowym środkiem słodzącym.
Komórki gospodarza według wynalazku, w których gen β-ksylozydazy został rozerwany, mogą być stosowane przykładowo do produkcji enzymów i preparatów enzymatycznych, dla przykładu dodawanych do karmy zwierzęcej. Zwierzęta, w tym drób i prosięta, mają słaby metabolizm ksylozy (Schutte, 1991). Ksyloza, która absorbuje się w ścianie jelit, odkłada się w układzie moczowym a zatem, pobór ksylozy jest dla zwierzęcia energetycznie niekorzystny. Wiadomo też, że duża ilość spożywanej ksylozy powoduje zaćmę, biegunki i brak łaknienia. Z drugiej strony, ksyloza i oligomery ksylozy mogą podlegać fermentacji do krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, cennych energetycznie. Tak więc, enzymy degradujące hemicelulozę w pożywieniu powinny dawać ksylo-oligomery a nie wytwarzać monomeru ksylozy, to znaczy, powinny posiadać aktywność endoksylanazy i nie wykazywać lub wykazywać w β-ksylozydazy. Wynalazkiem objęte jest zatem zastosowanie komórek gospodarzy, takich jak grzyby, bakterie, drożdże i rośliny, posiadających zdefunkcjonalizowany gen β-ksylozydazy ale zdolnych do wydajnego wytwarzania endoksylanazy i ewentualnie innych enzymów, zwłaszcza ksylanolitycznych i ewentualnie innych enzymów, zwłaszcza ksylanolitycznych do wytwarzania preparatów enzymatycznych wolnych od β-ksylozydazy. Wynalazek obejmuje też takie preparaty enzymu ksylanolitycznego bez aktywności β-ksylozydazy.
β-Ksylozydaza kodowana przez sekwencję nukleotydową SEQID Nr 1 znacznie się równi od β-ksylozydazy z A. niger opisanej przez Radionovąi wsp. (1993), co jest wykazane w tabeli A.
Tabela A
Aktywność i hamowanie P-ksylozydaz według wynalazku (X-I i X-II) w porównaniu z β-ksylozydazą opisaną przez Radionowąi wsp. i 1983)
aktywność wobec substratu (jednostek/mol) X-I według wynalazku X-II według wynalazku β-ksylozydazą (Radionową)
p-nitrofenylo-P-D-ksylopiranozyd 60,2 60,9 35,2
p-nitrofenylo^-D-glukopiranozyd 0,2 0,3 7,9
p-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd 0,0 0,0 0,6
p-nitrofenylo-a-L-arabinofuranozyd 2,8 3,4 5,8
stała hamowania K, (mM ksylozy) 9,8 13,2 2,9
W tabeli A przedstawione są sumarycznie wzory specyficzności dwu β-ksylozydaz według wynalazku, X-I i X-II prawdopodobnie różniących się jedynie wzorami glikozylacji a nie ich sekwencją aminokwasową i β-ksylozydazy opisanej przez Radionową i wsp. oraz ich hamowanie przez ksylozę. Skład aminokwasowy tych β-ksylozydaz jest podany w tabeli B.
184 411
Tabela B
Skład aminokwasowy β-ksylozydazy według sekwencji SEQ ID Nr 1 w porównaniu z β-ksylozydazą opisaną przez Radionową i wsp.
Aminokwas ilość % molowe % molowe (Radionowa)
Ala 86 11,1 8,2
Arg 27 3,5 2,1
Asn+Asp 95 12,2 5,6
Cys 7 0,9 1,1
Gln+Glu 74 9,5 12,4
Gly 63 8,0 11,3
His 13 1,7 1,4
Ile 39 5,0 4,8
Leu 69 8,9 88
- Lys 24 3,1 2,9
Met 6 0,8 3,3
Phe 24 3,1 2,9
Pro 39 5,0 8,6
Ser 53 6,8 8,7
Thr 58 7,5 7,0
Trp 15 2,0 2,6
Tyr 41 5,3 3,4
Val 45 5,8 6,1
Przykład I. Oczyszczanie β-ksylozydazy z A. niger
Zmutowany szczep A. niger NW147, derepresyjną pochodną szczepu NW205::130#2 (cspAl, pyrA6, nicAl, argB13,::pIM130) skonstruowaną w sposób opisany w będącym w toku zgłoszeniu PCT dokonanym 24.06.96 (oraz w europejskich zgłoszeniach patentowych EP 95201707.7 i EP 95202346.3) hodowano na minimalnej pożywce dla Aspergillus (MM) zawierającej w litrze: 6,0 g NaNO3, 1,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 x 7H20, 0,5 g KC1, źródło węgla jak podano (pH =6,0) i 1 ml roztworu Vishniac'a (Vishniac W. i Santer M., 1957) zawierającego w litrze: 10 g EDTA, 4,4 g ZnSO4 x 7H20, 1,0 g MnCf, x 4 H2O, 0,32 g CoCl2 x 6 H2O, 0,32 g CuSO4 x 5 H2O, 0,22 g (NH4)6Mo7)O24 x 4 H2O, 1,47 g CaCl2 x 2 H2O, 1,0 g FeSO4 x 7 H20 (pH=4,0) z dodatkiem 1,5% surowego arabinoksylanu z pszenicy, 10 mM L-argininy i 10 pM nikotynamidu. Tę pożywkę zaszczepiano zarodnikami w ilości 1 x 106/ml i prowadzono wzrost mycelium w czasie 96 godzin w temperaturze 30°C wstrząsając z szybkością 250 obrotów/minutę we wstrząsarce orbitalnej New Brunswick. Filtrat z hodowli zebrano po odfiltrowaniu grzybni na gazie nylonowej Myracloth, na lejku Biichnera przy słabym podciśnieniu. Wartość pH przesączu hodowli doprowadzono do 6,0 za pomocą 0,1 M roztworu NaOH, po czym przesącz ten rozcieńczono przez dodanie 2 objętości wody Millipore.
Żywicę DEAE-Sephadex A-50 zrównoważono w buforze 50 mM octanu sodu (pH=5,0) i dodano do przesączu z hodowli. Po 30-60 minutach mieszania w temperaturze 4°C, żywicę DFAE-Sephadex razem z przesączem z hodowli przepuszczono przez lejek z filtrem szklanym i DEAE-Sephadex A-50 przeniesiono na kolumnę. Tę kolumnę eluowano początkowo
184 411 mM buforem roztworu octanu sodu (pH=5,0), następnie buforem 50 mM octanu sodu (pH=5,) z dodatkiem 0,5 M NaCl. Frakcje wykazujące aktywność β-ksylozydazy, wykrywane przez użycie substratu chromogennego, 4-metylo-umbelliferylo^-D-ksylozydu (wykrywa β-ksylozydazy i ensoksylanazy; Sigma #M7008), zebrano i odsolono przez dializę wobec wody Millipore i następnie dializowano wobec buforu 20 mM piperazyny HC1 (pH=5,0). Po dializie próbkę wprowadzono na kolumnę DEAE-Sepharose z szybkim przepływem. Kolumnę początkowo eluowano 3 objętościami buforu 20 mM piperazyny HCl (pH 5,0) a następnie liniowym gradientem 0,5 M NaCl w buforze 20 mM piperazyny HC1 (pH=5,0). Detekcję eluowanego białka prowadzono przez ciągły pomiar absorpcji UV przy 280 nm (fig. 1). Zbierano frakcje po 10 ml i oznaczano w nich aktywność β-ksylozydazy na para-nitro-fenylo^-Dksylopiranozydzie (PNP-X; Sigma #N2132). β-Ksylozydaza znajdowała się we frakcjach 11-27, które zebrano i następnie dializowano wobec buforu 20 mM piperazyny HC1 (pH-6,0), (fig. 2). Próbkę 5 ml dializowanego roztworu podano na kolumnę Mono Q HR 5/5 (Pharmacia). Białko eluowano stosując 59 ml liniowego gradientu 1 M NaCl w buforze 20 mM piperazyny HC1 (pH=6,0). Detekcję eluowanego białka prowadzono przez ciągły pomiar absorpcji UV przy 280 nm (fig. 3). Otrzymano dwa piki wykazujące aktywność β-ksylozydazy: pik β-ksylozydazy I eluował przy 0,19 M NaCl, podczas gdy pik II eluował przy 0,29 M NaCl. Elektroforeza SDS-PAGE obydwu frakcji ujawniła, że frakcje odpowiadające każdemu z pików zawierały jedno pasmo białka, obydwie miały taką samą pozorną masę cząsteczkową 110 kDa. Aktywność właściwa, zarówno β-ksylozydazy i jak i II wobec sztucznego substratu PNP-X oznaczona w sposób opisany przez Radionową (Radionowa i wsp., 1983) wynosiła odpowiednio 60,2 i 60,9 jednostek/mg białka. Poza tym oznaczono, że aktywność wobec PNP-j3-D-gli.kopiranozydu (Sigma #N7006) wynosiła odpowiednio 0,2 i 0,3 jednostki/mg, aktywność wobec PNP^-D-galaktopiranozydu (Sigma #N1252) wynosiła odpowiednio 0,0 i 0,0 jednostki/mg i aktywność wobec PNP-a-L-arabinopiranozydu (Sigma #N3641) wynosiła odpowiednio 2,8 i 3,4 jednostek/mg dla β-ksylozydazy I i β-ksylozydazy Π.
Przykład II. Konstrukcja biblioteki ekspresyjnej cDNA.
A. niger NW147 hodowano przez 69 i 81 godzin na pożywce MM zawierającej 2% arabinoksylanu z pszenicy, po czym zebrano grzybnię przez filtrację i przemyto ją sterylnym roztworem solanki. Grzybnię zamrożono w ciekłym azocie i sproszkowano w urządzeniu Microdismembrator (Braun). Z proszku grzybni wyizolowano całkowity RNA postępując według procedury z użyciem tiocyjanianu guanidium/CsCl opisanej przez Sambrooka i wsp. (1989), z tym, że RNA wirowano dwukrotnie w gradiencie CsCl. Z ilości 5 mg całkowitego RNA wyizolowano poli A mRNA metodą chromatografii na oligo(dT)-celulozie (Aviv i Leder, 1972, Sambrook i wsp., 1989) z następującymi modyfikacjami: ze wszystkich roztworów usunięto SDS a do buforu do ładowania dodano 9% (objętościowo) dimetylosulfotlenku.
Z ilości 7 pg poli A+ mRNA zsyntetyzowano cDNA i poddano go ligacji z bakteriofagiem lambda Uni-ZAP XR, w zestawie do syntezy cDNA, ZAP™-cDNA (Stratagene), postępując według instrukcji producenta. Po ligacji tego cDNA do ramion wektora Uni-ZAP XR, upakowano fagowy DNA stosując ekstrakt Packagene™ (Promega) i postępując według instrukcji producenta. W rezultacie ligacji 120 ng cDNA z ilością 1,2 fig ramion wektora i następnego upakowania mieszaniny reakcyjnej otrzymano pierwotną bibliotekę składającą się z 3,5 x 104 rekombinantowych fagów. Tę pierwotną bibliotekę amplifikowano z użyciem E. coli XLl-Blue MRF (Stratagene), mianowano ją i przechowywano w temperaturze 4 C.
Przykład III. Wytworzenie przeciwciał przeciw β-ksylozydazie
Po 250 pg β-ksylozydazy i i β-ksylozydazy II dializowano wobec 1 mM buforu fosforanowego (pH=7.0) i liofilizowano. Białko zawieszono w 100 pl sterylnego roztworu PBS [0,136 M NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HPO4, 1,75 mM KH2P04 (pH=7,4)]. Do tej mieszaniny białkowej dodano 100 pl kompletnego adiuwantu Freunda i wirowano przez 30 minut do otrzymania trwałej emulsji. Mieszaniny obydwu białek wstrzyknięto podskórnie myszom. W czwartym tygodniu podano dawkę przypominającą, wstrzykując po 25 pg β-ksylozydazy w 100 pl sterylnego PBS, do którego dodano niekompletny adiuwant Freunda. W siódmym tygodniu od myszy pobierano krew i badano surowicę.
184 411
U
W tygodniu 13 myszom podano drugą dawkę przypominającą 25 pg i w 14 tygodniu pobrano krew. Procedurę podawania dawek przypominających co 6 tygodni i następnego pobierania krwi można powtarzać kilka razy.
Zebraną krew inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C i następnie przechowywano w temperaturze 4°C przez 16 godzin. Po odwirowaniu z prędkością 5000 obrotów/minutę w wirówce szybkoobrotowej Sorvall zebrano surowicę i przechowywano ją w temperaturze -20°C.
Przykład IV. Skrining immunologiczny biblioteki cDNA z A. Niger NW147 przeciwciałami przeciw β-ksylozydazie II.
Do skriningu biblioteki cDNA z A. niger NW147, skonstruowanej w sposób opisany w przykładzie II, na obecność klonów cDNA, w których zachodzi ekspresja β-ksylozydazy, posiano 5 x 103 jednostek tworzących łysinki (pfu)/płytkę, w wierzchniej agarozie NZYCM zawierającej 0,7% agarozy, na płytki o średnicy 85 mm NZYCM (1,5% agar) opisane przez Maniatisa i wsp. (Maniatis 1982, str. 64), stosując E. coli BB4 (Stratagene) jako bakterię posiewową. Skrining biblioteki ekspresyjnej cDNA przeprowadzono w zasadzie w taki sam sposób, jaki jest opisany przez Young'a i Davies'a (1983). Pokrótce, 5000 pfu amplifikowanego zapasu posiano na pożywkę NZYCM, stosując komórki E. coli BB4 jako gospodarza w 0,7% wierzchniej agarozie. Płytki inkubowano przez 5 godzin w temperaturze 37°C i następnie pokrywano je filtrami nitrocelulozowymi, uprzednio namoczonymi w 10 mM IPTG i wysuszonymi na powietrzu. Następnie, płytki inkubowano przez 6 godzin w temperaturze 37°C, oziębiono je do temperatury 4°C i przed usunięciem filtrów oznaczono ich pozycje na płytkach. Następnie filtry inkubowano przez 15 minut w roztworze o składzie: 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20 (Biorad) , 20 mM Tris/HCl (pH=7,5) z łagodnym wstrząsaniem. Czynność tę powtórzono raz. Debris bakteryjne usunięto przez delikatne wyskrobanie ręką w rękawiczce. Fagi, w których zachodzi ekspresja białka fuzyjnego zawierającego część białka β-ksylozydazy identyfikowano przez sondowanie filtrów surowicą przeciw β-ksylozydazie II i wykrywano stosując koniugat alkalicznej fosfatazy w procedurze opisanej dla prób typu Western w odpowiedniej instrukcji Biorad. W dwu doświadczeniach przeprowadzono skrining ilości 5 x 103 i 5 x 104 pfu amplifikowanych bibliotek na ekspresję cDNA β-ksylozydazy. Wykryto 4 łysinki dodatnie. Każdą dodatnią łysinkę wybrano z płytki pipetką Pasteura i fagi eluowano ze słupków agaru w 1 ml buforu SM zawierającym 20 pl chloroformu, jak to jest opisane przez Maniatisa i wsp. (1982). Otrzymane fagi oczyszczano przez powtarzanie wyżej opisanej procedury, stosując repliki filtrów z płytek zawierających 50-100 łysinek izolowanych fagów.
Przykład V. Analiza klonów cDNA, w których zachodzi ekspresja β-ksylozydazy.
Klony cDNA, w których zachodzi ekspresja β-ksylozydazy przeniesiono do fagmidów Bluescript drogą superinfekcii pomocniczym fagiem nitkowców EKAssist™, zawartym w zestawie do syntezy ZAP -cDNA dostarczonym przez firmę Stratagene, postępując według instrukcji producenta.
Fagmidowy DNA izolowano następnie w sposób opisany przez Sambrook'a i wsp. (1989). DNA izolowany z 4 klonów cDNA poddano analizie restrykcyjnej, stosując enzymy restrykcyjne EcoRI i Xhol. DNA trawiono przez 2 godziny w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej złożonej z następujących roztworów: 2 pl (około 1 pg) roztworu DNA, 2 (41 odpowiedniego 10 x buforu reakcyjnego (Life Technologies), po 10 jednostek każdego z enzymów restrykcyjnych (Life Technologies) i sterylna woda destylowana do końcowej objętości 20 pl. Po dodaniu 4 pl buforu do ładowania DNA, próbki wprowadzano do 0,7% żelu TAE-agarozy. Fragmenty DNA rozdzielano metodą elektroforezy przy 80 V przez 1,5 godziny. Analiza restrykcyjna ujawniła, że klony cDNA zawierały inserty o różnej wielkości, odpowiednio 1,4, 1,5, 2,4 i 2,5 kb. Sekwencje nukleotydowe części każdego z tych cDNA oznaczano stosując procedurę zakańczania łańcucha didezoksynukleotydowego (Sanger i wsp., 1977) w zestawie do sekwencjonowania z polimerazą T7 DNA firmy Pharmacia. Uzyskane sekwencje ujawniły, że wszystkie te cztery cDNA odpowiadająjednemu genowi.
Przykład VI. Skrining biblioteki genomowej A. niger na obecność genu xlnD kodującego β-ksylozydazę i izolowanie tego genu.
184 411
W celu skriningu biblioteki genomowej A. niger N400, skonstruowanej w sposób opisany przez Harmsen'a i wsp. (1990) na obecność genu xlnD, posiano 3 x 103 jednostek tworzących łysinki (pfu)/płytkę, w wierzchniej agarozie NZYCM zawierającej 0,7% agarozy, na pięć płytek NZYCM (1,5% agar) o średnicy 85 mm, opisanych przez Maniatisa i wsp. (Maniatis 1982), stosując E. coli LE392 jako bakterię posiewową. Po dobowej inkubacji płytek w temperaturze 37°C przygotowano po dwie repliki z każdej płytki na filtry HybondN (Amersham) opisane przez Maniatisa i wsp. (1982). Po zmoczeniu filtrów w roztworze 3xSSC przemywano je przez 60 minut w temperaturze pokojowej w roztworze 3xSSC. Hybrydyzację z użyciem znaczonego-32P fragmentu EcoRI/XhoI o wielkości 2,5 kb z klonu cDnA #4 przygotowanego w sposób opisany przez Sambrook'a i wsp. (1989) przeprowadzono według następującej procedury (Sambrook i wsp., 1989): prehybrydyzacja w 6 x SSC [20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodu x 5,5 H2 (pH=7,0)], 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodu, 5 x roztwór Denhardta (100 x roztwór Denhardta w 500 ml: 10 g Ficoll-400, 10 g poliwinylopirolidonu, 10 g albuminy surowicy bydlęcej (Pentax, frakcja V)) i 20 pg/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia, w temperaturze 68°C przez 3-5 godzin. Hybrydyzację prowadzono w identycznym buforze, który zawierał zdenaturowaną znaczoną pierwiastkiem radioaktywnym sondę w temperaturze 68°C przez 15-18 godzin. Następnie prowadzono dwa przemywania w roztworze 2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 68°C i dwa przemywania w roztworze 0,2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 68°C. Błonę przykryto arkuszem Saran i przez dobę prowadzono autoradiografię w temperaturze -70°C, stosując filmy do promieni X Konica i kasety Kodak X-Omatic z regularnymi siatkami intensyfikującymi.
W wyniku skriningu otrzymano około 50 pozytywnych fagów, z których oczyszczono
10. Każdą pozytywną łysinkę zebrano z płytki pipetką Pasteura i eluowano fagi ze słupków agarowych w 1 ml buforu SM zawierającego 20 pl chloroformu, według opisu Maniatisa i wsp. (1982). Otrzymane fagi oczyszczono powtarzając procedurę opisaną powyżej, stosując repliki filtrów z płytek zawierających 50-100 łysinek izolowanych fagów.
Po oczyszczeniu, fagi namnożono przez posianie 5 x 103 fagów na pożywce NZYCM. Po dobowej inkubacji w temperaturze 37°C otrzymano płytki płynące, z których eluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM i utrzymywanie płytek w czasie 2 godzin w temperaturze 4°C, od czasu do czasu wstrząsając. Po zebraniu pipetą supematantu, bakterie usunięto z roztworu przez wirowanie z prędkością 4000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Do supematantu dodano 0,3% chloroformu i oznaczono ilość pfu. Te zapasy faga zawierały około 1(r pfu/ml.
DNA z czterech wybranych fagów G15-G18, wyizolowany w sposób opisany przez Sambrook'a i wsp. (1989), analizowano metodą analizy Southema. DNA trawiono przez 5 godzin w temperaturze 37°C w mieszaninie reakcyjnej składającej się z następujących roztworów: 5 pl (około 1 pg) roztworu DNA, 2 pl odpowiedniego 10 x buforu reakcyjnego (Life Technologies), 10 jednostek enzymu restrykcyjnego (Life Technologies) i sterylnej wody destylowanej do końcowej objętości 20 pl. Próbki inkubowano przez 10 minut w temperaturze 65°C i szybko schłodzono na lodzie, po czym wprowadzono do 0,6% żelu agarozowego w buforze 1 x TAE. Fragmenty DNA rozdzielano elektroforetycznie przy 25 V w czasie 15-18 godzin.
Po elektroforezie, DNA przenoszono i denaturowano przez alkaliczne punktowanie próżniowe (VacuGene XL, Pharmacia LKB) na błonie nylonowej (Hybond N, Amersham), postępując w sposób zalecany w instrukcji VacuGene XL (str. 25-26) i następnie prehybrydyzowano i hybrydyzowano z użyciem znaczonego fragmentu EcoRI/XhoI o wielkości 2,5 kb z klonu cDNA #4, stosując wyżej opisane warunki hybrydyzacji. Uzyskano wzory hybrydyzacji przez ekspozycję na film do promieni X, Kodak XAR-5, w czasie 18 godzin w temperaturze -70°C z użyciem siatki intensyfikującej. We wszystkich 4 klonach znaleziono fragmenty pochodzące z tego samego regionu genomowego, dla którego skonstruowano mapę restrykcyjną (fig. 4).
W oparciu o mapę restrykcyjną wyselekcjonowano fragment Pstl o wielkości 3,6 kb do subklonowania. Ilość 100 ng fragmentu pEMBL19 po trawieniu Pstl zmieszano z 250 ng fragmentu Pstl o wielkości 3,8 kb i do mieszaniny dodano 4 pl 5 x buforu do ligacji o skła184 411 dzie: 500 mM Tris HC1 (pH=7,6), 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitolu, 25% PEG-6000 a poza tym 1 μΐ (1,2 jednostki/μΐ) ligazy DNA T4 (Life Technologies) do końcowej objętości 20 μΐ. Po inkubacji przez 16 godzin w temperaturze 14°C mieszaninę rozcieńczono do 100 μl sterylną wodą. Ilość 10 μΐ tej rozcieńczonej mieszaniny użyto do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5a, przygotowanych w sposób podany przez Sambrooka i wsp. (1989). Sześć spośród otrzymanych kolonii hodowano przez dobę w pożywce LB (skład pożywki LB w 1000 ml: 10 g triptikazo-peptonu (BBL), 5 g wyciągu drożdżowego (BBL), 10 g NaCl, 0,5 mM Tris-HCl (pH=7,5)) z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny. Z tych hodowli wyizolowano plazmidowy DNA metodą lizy alkalicznej opisanej przez Maniatisa i wsp. (1982) i użyto go do analizy restrykcyjnej w celu wyselekcjonowania klonu zawierającego żądany plazmid pIM200. Szczep zawierający plazmid pIM200 zdeponowano w muzeum Centraal Bureau voor Schimmel-cultures, Baam, NL, pod numerem akcesyjnym CBS 677.96. Plazmidowy DNA izolowano na dużą skalę z 500 ml hodowli E. coli DH5a zawierającej pIM200, rosnącej na pożywce LB z dodatkiem 100 pg/ml ampicyliny (Maniatis i wsp., 1982). Plazmid oczyszczono przez wirowanie w CsCl, wytrącono etanolem i rozpuszczono w 400 μ1 TE. Wydajność wynosiła około 500 μg. Ten plazmid użyto do konstrukcji szczegółowej mapy restrykcyjnej (fig. 5).
Przykład VII. Transformacja A. niger z użyciem plazmidu pIM200.
Ilość 250 ml pożywki hodowli składającej się z pożywki MM wzbogaconej w 2% glukozy, 0,5% wyciągu drożdżowego, 0,2% kwasów casaminowych (bez witamin), 2 mM leucyny, 10 pM nikotynamidu i 10 μM urydyny zaszczepiano ilością 1 x 10 spor/ml szczepu NW155 (csp-Al, argB13, pyrA6, nicAl, leuAl, prtF28) pochodzącego z NW228 (van den Hombergh i wsp., 1995) i prowadzono wzrost mycelium w czasie 16-18 godzin w temperaturze 30°C, mieszając z prędkością 250 obrotów/minutę we wstrząsarce orbitalnej New Brunswick. Grzybnię zebrano na gazie nylonowej Myracloth na lejku Buchnera pod niewielkim podciśnieniem i przemywano ją kilka razy roztworem SP6 o składzie: 0,8% NaCl, 10 mM bufor fosforanu sodu (pH=6,0). Odczynnik Novozyme 234 (150 mg) rozpuszczono w 20 ml roztworu SMC o składzie: 1,33 M sorbitolu, 50 mM CaCf, 20 mM bufor MES (pH=5,8), i dodano 1 g mokrej grzybni i dokładnie ją zawieszono. Tę zawiesinę inkubowano z łagodnym wstrząsaniem przez 1 do 2 godzin w temperaturze 30°C. Co 30 minut grzybnię dokładnie ponownie zawieszano, po czym pobierano próbkę do sprawdzenia powstania protoplastów, stosując do wyliczenia ilości protoplastów hemocytometr. Po uzyskaniu wystarczającej ilości protoplastów (ponad 1x10) zawieszono je dokładnie i usunięto debris grzybni przez filtrację przez sterylny tłoczek z waty szklanej. Protoplasty zebrano po 10 minutach wirowania przy 3000 obrotach/minutę w temperaturze 4°C w wirówce stołowej, usunięto supernatant a peletkę ostrożnie zawieszono w 5 ml roztworu STC o składzie: 1,33 M sorbitol, 50 mM CaC^, 10 mM Tris HC1 (pH=7,5). Ten etap przemywania powtórzono dwa razy i w końcu protoplasty zawieszono w STC z gęstością 1 x 108/ml.
Transformację przeprowadzono przez dodanie 20 μg DNA z pIM200 i 5 μg pGW635, zawierającego gen pyrA z A. niger (rozpuszczonego w 10-20 μ1 TE) do 200 μΐ zawiesiny protoplastów razem z 50 μΐ buforu pEg [Bufor PEG: 25% PEG-6000, 50 mM CaCf, 10 mM Tris HC1 (pH=7,2)], mieszano łagodnie przez pipetowanie w górę i w dół kilka razy i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym czasie dodano 2 ml buforu PEG, roztwór łagodnie mieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez następne 5 minut, po czym dodano 4 ml STC i łagodnie mieszano w wirówce. Porcje po 1 ml tej zawiesiny dodano do 4 ml stabilizowanego osmotycznie 0,95 M sacharozą wierzchniego agaru i wylano na stabilizowane osmotycznie płytki. W próbkach kontrolnych A. niger transformowano stosując pGW635.
Przykład VIII. Analiza transformantów
Transformanty z pIM200 otrzymane w przykładzie VII analizowano pod względem fenotypowym przez posiewanie na pożywkę MM zawierającą 1% ksylanu ze zboża i 1 mM 4-metyloumbelliferylo-e-D-ksylozydu. Spośród badanych 26 transformantów, w 5 występowała zwiększona fluorescencja. Te transformanty oraz transformant PYR' jako preparat odniesienia, hodowano na podłożu MM zawierającym 1% ksylanu zbożowego w czasie 20, 27 i 42 godzin,
184 411 po czym wykonywano pomiary aktywności β-ksylozydazy wobec PNP-X. Wyniki są przedstawione w tabeli C.
We wszystkich 5 wyselekcjonowanych transformantach wykryto zwiększone poziomy aktywności β-ksylozydazy, przy czym najwyższy poziom był ponad 30 razy wyższy od poziomu w próbce typu dzikiego. Wyniki potwierdzono metodą analizy typu Western, stosując przeciwciało przeciw β-ksylozydazie przygotowane w sposób opisany w przykładzie III i zestaw do oznaczania, Bio-Rad Immun-blot gAR-AP. Postępowano według instrukcji dostawców.
Tabela C
Aktywność β-ksylozydazy w transformantach A. niger (milijednostek/ml filtratu hodowli) po czasie:
20 godzin 27 godzin 42 godziny
pGW 635 15 16 17
XIsAl 82 86 51
XIsA4 90 112 78
XIsA8 211 239 384
XIsA9 63 110 74
XIsA12 96 295 527
Przykład IX. Pierwszorzędowa struktura genu xlnD
IX. 1 Analiza sekwencji genu xlnD z A. niger
Sekwencję genu xlnD z A. niger, jego regionu promotora/regulatora, strukturalnej części tego genu i regionu zakańczania, oznaczano przez subklonowanie fragmentów w plazmidzie pEMBL. 18/19, w kombinacji z użyciem specyficznych oligonukleotydów jako primerów w reakcjach sekwencjonowania.
Do celów analizy sekwencji nukleotydowych, wyizolowano fragmenty restrykcyjne, klonowano je w wektorach DNA pEMBL18/19 i trawiono odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Sekwencje nukleotydowe oznaczano stosując procedurę zakańczania łańcucha didezoksynukleotydowego (Sanger i wsp., 1977) w zestawie do sekwencjonowania z polimerazą T7 DNA firmy Pharmacia. Wykonano analizę komputerową wykorzystując program PC/GENE (Intelligenetics). Oznaczona sekwencja jest podana na sekwencji SEQ ID Nr 1.
IX. 2. Opis genu xlnD
Sekwencję zawierającą gen strukturalny xlnD (SEQ ID Nr 1) poprzedza górny region o długości 854 nukleotydów. Przypuszczalna skrzynka TATA znajduje się w pozycji 787794. Część strukturalna genu xlnD ciągnie się od pozycji 855 do pozycji 3266 i nie zawiera intronów, co stwierdzono przez sekwencjonowanie zarówno fragmentu cDNA jak i fragmentu ge-nomowego w pIM200.
Gen xlnD koduje białko o długości 804 aminokwasów. N-terminalną sekwencję aminokwasową poprzedza hydrofobowa sekwencja o długości 26 aminokwasów, która prawdopodobnie odpowiada sekwencji sygnalnej. Dojrzałe białko β-ksylozydazy ma długość 778 aminokwasów i wyliczoną masę cząsteczkową 84.727 Da.
Przykład X. Skrining biblioteki genomowej A. tubigensis na obecność genu xln kodującego β-ksylozydazę.
W celu skriningu biblioteki genomowej A. tubigensis skonstruowanej w sposób opisany przez Graaffa i wsp. (1994) na obecność odpowiednika w A. tubigensis, posiano 3 x 103 jednostek tworzących łysinki (pfu)/płytkę, w wierzchniej agarozie NZYCM zawierającej 0,7% agarozy, na pięć płytek NZYCM (1,5% agar) o średnicy 85 mm w sposób opisany w przykładzie VI. Hybrydyzację z użyciem znaczonego P fragmentu Pstl o wielkości 3,6 kb z pIM200 przygotowanego w sposób opisany przez Sambrook'a i wsp. (1989) przeprowadzono według następującej procedury (Sambrook i wsp., 1989): prehybrydyzacja w 6 x SSC, 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodu, 5 x roztwór Denhardta (patrz przykład VI) i 20 (ig/ml DNA z denaturowanej spermy śledzia, w temperaturze 65°C przez 3-5 godzin. Hybrydyzację prowa184 411 dzono w identycznym buforze, który zawierał zdenaturowaną znaczoną pierwiastkiem radioaktywnym sondę, w temperaturze 65°C przez 15-18 godzin. Następnie prowadzono dwa przemywania w roztworze 5 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 65°C i dwa przemywania w 0,2 x SSC, 1% SDS w temperaturze 65°C. Błonę zakryto arkuszem Saran i przez dobę prowadzono autoradiografię w temperaturze -70°C, stosując filmy do promieni X Konica i kasety Kodak X-Omatic z regularnymi siatkami intensyfikującymi.
W wyniku skriningu otrzymano około 10 pozytywnych fagów, z których wszystkie oczyszczono. Każdą pozytywną łysinkę zebrano z płytki pipetką Pasteura i eluowano fagi z cylinderków agarowych w 1 ml buforu SM zawierającego 20 pl chloroformu, według opisu Maniatisa i wsp. (1982). Otrzymane fagi oczyszczono powtarzając procedurę opisaną powyżej stosując repliki filtrów z płytek zawierających 50-100 łysinek izolowanych fagów.
Po oczyszczeniu, fagi namnożono przez posianie 5 x 103 fagów na pożywce NZYCM. Po dobowej inkubacji w temperaturze 37°C otrzymano płytki płynące, z których eluowano fagi przez dodanie 5 ml buforu SM i utrzymywanie płytek w czasie 2 godzin w temperaturze 4°C, od czasu do czasu wstrząsając. Po zebraniu pipetą supematantu, bakterie usunięto z roztworu przez wirowanie z prędkością 4000 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Do supematantu dodano 0,3% chloroformu i oznaczono ilość pfu. Te zapasy faga zawierały około 10 pfu/ml.
Przykład XI. Rozerwanie genu xlnD z A. niger
XI. 1 Konstruowanie plazmidów rozrywających, pIM203 i pIM204
Plazmidy do rozerwania genu, plM203 i pIM204, skonstruowano przez generowanie wewnętrznego fragmentu genu xlnD w reakcji PCR. Fragment ten generowano stosując oligonukleotydy pochodzące z sekwencji xlnD (SEQ ID Nr 1). Ksylos 001 pochodził z pozycji 1157 do 1176 a ksylos 004 pochodził z pozycji 3147 do 3164. Ten fragment generowano w reakcji PCR, w której mieszanina reakcyjna zawierała 10 pl 10x bufor reakcyjny o składzie: 100 mM Tris HC1 (pH 8,3), 500 mM KC1, 15 mM MgCĘ, 0,01°o żelatyny a ponadto dodano po 16 pl 1,25 mM każdego z czterech trójfosforanów dezoksynukleotydów, 1 ng DNA z plazmidu pIM200 i po 1 pg każdego z oligonukleotydów w końcowej objętości 100 pl. Mieszaninę reakcyjną zmieszano i dodano 1 pl polimerazy TAQ (5 jednostek/pl) (Life Technologies). DNA denaturowano przez inkubację przez 3 minuty w temperaturze 92°C i następnie prowadzono 25 cykli po 1 minucie w temperaturze 92°C, 1,5 minuty w temperaturze 52°C i 1,5 minuty w temperaturze 72°C. Po tych 25 cyklach mieszaninę inkubowano przez 5 minut w temperaturze 72°C. Analiza produktów reakcji metodą elektroforezy w agarozie ujawniła fragment o długości 2000 bp, odpowiadający wielkości spodziewanej, wyliczonej w oparciu o sekwencję genu. Otrzymany fragment podklonowano do wektora pGEM-T (Promega), otrzymując plazmid pIM202. Plazmid pIM203 skonstruowano przez ligację fragmentu SmaI/Pstl z pILJ16 (Johnstone i wsp., 1985), zawierającego gen argB z A. nidulans (Upshall 1 wsp., 1986) w wektorze pIM202 trawionym EcoRI/Pstl. Plazmid pIM204 skonstruowano przez ligację fragmentu Nsil/Xbal z pIM130 (zgłoszenie patentowe europejskie EP 95202346.3) zawierającego gen pyrA pod kontroląUAS z promotora xlnA z A. tubigensis w wektorze pIM202 trawionym Spel/Nsil.
XI.2 Rozerwanie genu xlnD w A. niger
Do rozerwania genu xlnD z A. niger użyto plazmidy zawierające wewnętrzny fragment xlnD oraz gen argB (pIM203) albo gen pyrA (pIM204), opisane w przykładzie XI. 1 jako marker selekcyjny do transformacji. W tym celu, A. niger N902 (argB 15, cspAl, fwnAl, metBIO, pyrA5) transformowano jak podano w przykładzie VII, stosując plazmidy oIM203 i pIM204, prowadząc selekcję na prototrofię odpowiednio argininy albo urydyny. Przeprowadzono skrining otrzymanych transformantów na aktywność w stosunku do metyloumbelliferylo-P-D-ksylozydu na płytce z 1% ksylanem, jak opisano w przykładzie VIII. W obydwu grupach transformantów przesiano 20. Spośród tych transformantów, jeden z każdej grupy miał poważnie obniżony poziom aktywności MUX po 24 godzinach wzrostu. Analiza Southema wyselekcjonowanych transformantów wykazała w transformancie pIM203 wielokopiową integrację w homologicznym locus xlnD. W przypadku transformantu pIM204 pojawiła się pojedyncza integracja w homologicznym locus xlnD. Analiza tych transformantów
184 411 na aktywność PNP-X, opisana w przykładzie VIII wykazała co najmniej 100-krotny spadek aktywności β-ksylozydazy.
XI.3. Wpływ nadekspresji i inaktywacji genu xlnD na ekspresję układu ksylanolitycznego w A. niger
W celu oznaczenia wpływu ekspresji xlnD na ekspresję spektrum ksylanolitycznego prowadzono wzrost A. niger N902, dwóch wielokopiowych xlnD transformantów w N902 i szczepów z rozerwanym genem xlnD w ciekłej hodowli. Przeprowadzono to w próbie przeniesienia na 2% ksylan zbożowy albo na 3% D-ksylozę jako źródło węgla po wstępnej hodowli w 1% fruktozie w czasie 18 godzin. Aktywność β-ksylozydazy oznaczano jako aktywność PNP-X w przesączu hodowli. Na obydwu źródłach węgla można było zaobserwować wyraźną nadekspresję dla transformantów pIM200, natomiast dla transformantów ^aktywacyjnych pIM203 i pIM204, aktywności PNP-X prawie nie wykrywano. Transformanty z rozerwanym genem xlnD wykazywały początkowy obniżony poziom ekspresji endo-ksylanazy, który jednak wzrastał w miarę czasu i w końcu po 16 godzinach osiągał większe poziomy aktywności niż hodowle A. niger typu dzikiego, dając preparaty ksylanazy wolne od β-ksylozydazy.
Przesącze hodowli analizowano następnie metodą HPLC, stosując układ Dionex i detekcję w aparaturze Pulsed Amperometric Detection. Próbkę 1 ml przesączu hodowli zagotowano natychmiast po zebraniu w celu inaktywacji enzymów ksylanolitycznych, po czym próbkę wirowano przez 10 minut (14.000 obrotów/minutę w temperaturze 4°C w probówce Eppendorfa). Otrzymany supematant rozcieńczono 5-krotnie i 20 pl analizowano metodą HPLC na kolumnie Dionex CarboPac 100. Analiza wykazała, że o ile w hodowlach typu dzikiego i transformantów nadekspresyjnych, oligomery ksylozy były wykrywane w przesączu hodowli tylko w początkowym etapie, to w mutancie z genem rozerwanym, w przesączu hodowli gromadziły się ksylobioza i w mniejszym stopniu ksylotrioza, będąc źródłem ksylooligomerów, zwłaszcza ksylobiozy i ksylotriozy.
Przykład XII. Ekspresja genu xlnD z A. niger w A. nidulans
Plazmid pIM200 wprowadzono do A. nidulans metodą kotransformacji A. nidulans G191 (Balance i Turner, 1985), stosując gen pyrA z A. niger zlokalizowany w plazmidzie pGW635 jako marker selekcyjny i plazmid pIM200 jako plazmid kotransformujący. Protoplasty przygotowano w sposób opisany w przykładzie VII a transformację prowadzono stosując 1,2 M sorbitol do stabilizacji ciśnienia osmotycznego, 1 pg pGW635 i 25 pg pIM200. Następnie prowadzono skrining otrzymanych PYR na ekspresję xylD, wykonując próbę na płytce opisaną w przykładzie VIII.
Na podstawie tego skriningu wyselekcjonowano 5 transformantów do oznaczenia aktywności β-ksylozydazy. A. nidulans szczep dziki i wyselekcjonowane transformanty hodowano przez 26 godzin w temperaturze 37°C na pożywce minimalnej zawierającej albo 2% ksylanu Birchwooda (Roth) albo 3% D-ksylozy jako indukujące źródło węgla. Po usunięciu grzybni oznaczono aktywność β-ksylozydazy wobec PNP-X w przesączu hodowli. Wyniki są przedstawione w tabeli D. Wskazują one, że ekspresja xylD może przebiegać w A. nidulans jeśli użyje się natywne sygnały ekspresji.
Tabela D
Szczep A. nidulans Aktywność na 2% ksylanie (mU/ml) Aktywność na 3% D-ksylozie (mU/ml)
WG096 (Wt) 16 0
G191::200-5 725 48
G191::200-7 96 11
G191::200-9 249 40
G191::200-13 520 33
G191 ::2013-15 1525 210
184 411
Przykład XIII. Skrining grzybów nitkowców na obecność genu xlnD
W celu zbadania, czy jest możliwe wyizolowanie odpowiednika genu xlnD z innych grzybów przez heterologiczną hybrydyzację z użyciem fragmentu Pstl/Nsil genu xlnD o wielkości 2,5 kb jako sondy, wyizolowano DNA z następujących szczepów: A. niger N902 (argB15, cspAl, fwnAl, metBIO, pyrA5), A. tubigensis NW184 (cspAl, fwnAl, pyrA22), A. nidulans WG096 (pabaAl, yA2) z FGSC 187, A. aculeatus NW240 (pyrA3) z CBS 101.43, A. aculeatus NW217 (fwnAl, cspAl, py-rA4, lysAl) z CBS 115.80, A. foetidus (awamori) NW183 (cspAl, fwnAl, pyrA13, IysAl) z CBS 115.52 i Trichoderma reesei QM9414. Próbki 1-2 pg DNA trawiono za pomocą BamHI albo XhoI i następnie analizowano w próbie typu Southern. Stosowano następujące warunki hybrydyzacji: hybrydyzacja w 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g cytrynianu sodu x 5 H2O (pH=7,0), 0,1% SDS, 0,05% pirofosforanu sodu, 5 x roztwór Denhardta (patrz przykład VI) i 20 pg/ml DNA ze spermy śledzia, w temperaturze 56°C w czasie 18-24 godzin, następnie dwa 30-minutowe płukania w 5 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 56°C i dwa 30-minutowe płukania w 2 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze 56°C. Po hybrydyzacji błonę przykryto arkuszem Saran i prowadzono autoradiografię przez dobę w temperaturze -70°C na filmy do promieni X Konica i kasety Kodak X-Omatic z regularnymi siatkami intensyfikującymi.
Otrzymano fragmenty hybrydyzacyjne dla wszystkich analizowanych grzybów. Bardzo silne sygnały hybrydyzacyjne występowały w A. niger, A. tubigensis, A. aculeatus, A. japo-nicus i A. foetidus a silne sygnały hybrydyzacyjne występowały w A. nidulans i Trichoderma reesei.
Przykład XIV. Wpływ dawki genu xlnR na ekspresję układu ksylanolitycznego A. niger.
Szczep N902::200-18, niosący wiele kopii (około 6) genu xlnD z A. niger kodującego β-ksylozydazę transformowano na prototrofię argininy w doświadczeniu ko-transformacji, jak to opisano w przykładzie XI, stosując 19 pg plazmidu pIM230 niosącego gen xlnR i 2 pg plazmidu pIM650 niosącego gen argB z A. nidulans (Johnstone i wsp., 1985). Otrzymane transformanty poddano skriningowi na zwiększoną ekspresję endoksylanazy na płytkach MM zawierających 1% ksylan zbożowy. Cztery kolonie tworzące najszybsze i największe obrączki wyselekcjonowano w celu oznaczenia ilości kopii genu xlNr w tym celu, wyizolowano DNA z tych transformantów i ze szczepu biorcy i rozcieńczenia seryjne naniesiono na błonę Hybond N. Ilość kopii oznaczono na podstawie sygnałów uzyskanych po hybrydyzacji, stosując znaczony radioaktywnie fragment Sma-I/Xbal o wielkości 4,5 kb zawierający sekwencję kodującą genu xlnR. W oparciu o porównanie ze szczepem biorcy, oznaczono, że N902:: 200-18-R14 zawiera 8 kopii genu xlnR a N902::200-18-R16 zawiera 32 kopie. Dla obydwu tych transformantów wpływ zwiększonej dawki genu xlnR analizowano metodą typu Northern po hodowli tych szczepów w ciekłej pożywce. Wykonano to w doświadczeniu z przeniesieniem do 2% ksylanu zbożowego jako źródła węgla po hodowli wstępnej w 1% fruktozie w czasie 18 godzin. Pobrano próbki grzybni po 8 i 24 godzinach po przeniesieniu, wyizolowano z nich całkowity RNA stosując TriZol (Life Technologies) postępując według instrukcji producenta i poddano analizie typu Northern (Sambrook i wsp., 1989). Poziomy ekspresji ksylanazy B były w tych transformantach silnie zwiększone w porównaniu do szczepu biorcy, co wykryto po hybrydyzacji z użyciem znaczonego radioaktywnie fragmentu EcoRI/XhoI o wielkości 1 kb z genu xlnB z A. niger (Kinoshita i wsp., 1995).
184 411
Piśmiennictwo
Aviv, H. and Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11: 1408-1412.
Balance DJ. and Turner G.C. (1985) Gene 36: 321-331.
Dekker, R.F.H. (1983) Biotechnol. Bioeng. 3, 1127-1146.
Flipphi, Visser, J., van der Veen, P. and De Graaff, L.H. (1994) Microbiology
140: 2673-2682.
Garcia-Campayo and Wood (1993) Carbohydrate Res. 242, 229-245.
De Graaff L.H., Van den Broeck, H.C., Van Ooijen A.J.J. and Visser, J. (1994) Mol.
Microbiol. 12: 479-490.
Harmsen, J.A.M., Kusters-van Someren, M.A., Visser, J. (1990) Curr. Genet. 18: 161-166.
Hombergh van den, J.P.T.W., van de Vondervoort, P.J.I., van der Heijden, N.C.B.A., and Visser, J. (1995) Curr. Genet. 28:299-308.
Johnstone, I.L., Hughes, S.G., Clutterbuck AJ. (1985) EMBOJ. 4: 1307-1311. Kinoshita K., Takano, M., Koseki, T., Ito. and Iwano, K. (1995). J. of Ferment, and
Bioeng.:79, no 5, 422-428.
Kormelink, F., Searle-Van Leeuwen, M.J.F., Wood, T.M. and Voragen, A.G.J. (1993) J. Biolechnol. 27, 249-265.
Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Habor Laboratory Press.
Poutanen and Puls Appl. Microbiol, and Biotechnol. (1988) 28, 425-432.
Rodionova, N.A., Tavobilov, I.M. and Bezborodov, A.M. J. Appl. Biochem. 5, 300-312 (1983)
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Munual. 2nd edn. Cold Spring Habor, New York: Cold Spring Habor Laboratory Press.
Sanger, F., Nickelsen, S. and Coulson A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 54635467.
Schutte, J.B. (1991), Nutritional value and physiological effects of D-xylose and L-arabinose in poultry and pigs. Datapress & Datavisions, Wageningen, 173 pp.
Upshall, A., Gilbert, T., Saari G., O'Hara, P.J., Weglenski, P., Berse, B., Miller, K. And Timberlake, W.E. (1986) Mol. Gen. Genet. 204: 349-354.
Utt, E.A., Eddy, C.K., HEshav, K.F. and Ingram, L.O. (1991) Appl. Environm. Microbiol 1227-1234.
Vishniac, W. and Sanier, M. (1957) Bacteriol. Rev. 21: 195-213.
Whittington, H., Kerry-Williams, S., Bidgood, K., Dodsworth, N., Peberdy., J., Dobson, M., Hinchcliffe, E., and Ballance, D.J. (1990). Curr. genet. 18: 531-536.
Young, R.A. and Davies. R.W. (1983) Science 222: 778.
184 411
WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJA OGÓLNA (1) ZGŁASZAJĄCY:
(A) NAZWA: Agricultural University Wageningen (B) ULICA: Costerweg 50 (C) MIASTO: Wageningen (E) KRAJ: Holandia (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 6701 BH (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydową i jej zastosowanie (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 2 (iv) FORMA DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:
(A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z TBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY·: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE:PatentIn Release #1.0, wersja #1.25 (EPO) (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:l:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4108 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Aspergillus niger (CBS 120.49) (B) SZCZEP: NW147 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: TATA_sygnał (B) LOKALIZACJA: 787...794 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: 855...3266 (D) INNE INFORMACJE: /numer EC = 3.2.1.37 /produkt= „1,4-beta-D-ksylan-ksylanohydrolaza /gen= „xlnD /standardowa nazwa= „beta ksylozydaza
184 411 tix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: sig_peptyd (B) LOKALIZACJA: 855..932 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: mat_peptyd (B) LOKALIZACJA: 933...3266 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: miejsce poliA (B) LOKALIZACJA: 3404 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 1:
CTGCAGGCCA TGTATCCTGC GAAGATGGGT GACTGGGAGA GAGGGCTCTG ATGGGGAGGG 60
GAGATGGCGA GGAGGGTGGT GGCTGGCGCC CSGGGAGGGG GGCCGGCCGG 120
ACGGCGGCGC AGATGACTAT ACCGrATGCG GTCGGGCTGC GSGTTCTGGG ATGGGTGGGC 180
GTGCCGGGGC AGTTTGCGCC GGTGGTTGTG AATGGGCACG GCTGΆGGCTA AGCGGGCGGG 240
CTGGrGGAAT TTGTCTGCGG GGGGCAGCTC GAGGTTAGGG GGGCCCAGGG CGcΓGGAGGTC 300
ACGTTTGAGC ATGCGGAGGT TGTTTGGGGG TTCTTGTTGG GSI^C^G^^GGG GGTCCCGCGG 360
GCGTGTGCGG ATGGGGACTG TTGGGATGGC TSACGGT\CG3G CGGGAAGGCG 420
GAAGAGAGGC AGAAGAAGAT CCGGTGGGTG GTCCCΓGGCAG' GG<TTGG\CGT’ GTTGTTTGTC 480
GC^GGTGTTT TCGGGTGTGG GGGGGGTCGA GAGGCGCGCG ASCTGCTGGA GTGGAC<:TGT· 540
ACCCCATTTG GACjGGGATG GCTTCATATT ΤΟ^ΜΟ^ GCTCACCCCA TA¢TGAACTCJC 600
ACATTTACCC GGTCCCTGlG CGAUCTCTA CICCGAAGAC AATCCOCATG TTTTAACTATC 660
TTGTT7TAAT GGGCGGGGCC GGGGGGTCGA GGirCTrrCCT AATGCCCCJCT TGGATCAGTCA 720
GCCTAAACCC CCGGTGGGGG GTGGGTGGTT CAIGGGΓCCGG CGCATCTCCG CATCTTCGCA 780
AACCGCTAn AAATCTACCC GACATTGACT CCCCGGCCAC CTCTCTATCC CCCCCCCCAC 840
ACACTGGCTC AACC ATG GGG CAC TCA ATT SCT CCT SCC STG GCT GCC PAC 890
Met Ala His Ser Met Ser Arg Pro Val Ala Ala STr -26 -25 -20 -15
GCC GCT GCT (CTG CTG GCT CTTG GCT CITT CCT CAA GCT CTT GCC CAG GCC 938
Ala Ala A!.a Leu Leu AA-l Leu Ala Lee Pro GGn AAl Leu Ala Gin SAl
-10 -5 1
184 411
AAC ACC AGC TAC GTC GAC TAC A.AC ATC GAA CCC AAC CCG GAC TTC TT^T 956
Asn Thr Ser 5 Tyr VaV /Ap Tyr Asn IIe 10 Hu Ala Acs Pro 15 Asp Leu TTy
CCT TTC TCC ATC GAA AAC ATC CCA CCT AGC TTC CCC TAC TCC CAG MT 1134
Pro Leu Cys Ile Glu TTr Ile Pro Lla Sur Phe Pil» Asp Cys Gin Acs
20 2T 30
CCC CCC CTC CCC ACC CAT CTC ATC TCT CTT łat ACC CCC ACC CCC CTT 1182
Cly Pro Leu Arg Ser His Leu Ile Cys Asp Clu Thr Ala Thr Prp TTr
35 0T 45 50
CAC CCA CCA CCC TCG CTC ATC TCC CTC TTC CCC CCT GIC GAG CTC ATT 1114
Asp Arg Ala Ala Ser· Llu Ile Ser Llu Phu Thr LLA Tsp Glu Leu IIe
55 0T 66
CCC AAC TCC CCC TCC ACC CCC CTC CCT CTC TCC CCA CTC CCC CTC CCT 1117
Ala Asn Thr Cly Asn Thr Cly Leu Cly Val Sar Arg Lau Cly LeL upo
70 75 88
CCA TAC CCT CTA TCC ACT CAA CCT CTT CCC CCC CTC CAC CCT GCC CAT 1122
Ala Tyr dn Val Trp Ser Clu Ala Luu His Cly Leu Tsp Arg Al a Acs
85 90 95
TTC ACC CAC TCA GGC <^(CC TAC AAT TCC3 CCC CCC TCA TTC CCC CAC CCC 1124
Phe Ser Asp Ser Gly Ala Tyr Asn Trr> Ala Thr Ser Phe Pro Gin Pro
100 105 110
ATC CTC ACC CCC CCC CCC CTC CTC CCC ACC CTC ATC CAC CCT ATT CCC 1142
Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg Thr Leu Ila His Cln Ile ACe
115 120 125 I30
TCC ATC ATC TCT ACC CCC UUT CCC CCC TTC AAC CTC CCC CCC CGC CTC 1140
Ser Ile Ile Ser Thr Cln Cly Arg Ala Phu Asn Asn Ala Cly Arc Tjrr
135 140 114
CCC CTC CAC CTC TAC CCC CCC CTC ATC CTC ACC TTC CCC CAC CCC C^tC lU8
Cly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ilu Asn Thr Pha Arg His Pip> ViAL
150 155 160
TCC CCT CCC CCA CAA CAA CCC CCC CCA CAC CAC CTC TCT CTC GCC CCC 1166
Trp Cly Arg Cly dn Clu Thr Pro Hy Wu Asp Val Ser Leu Ala ACe
165 170 175
CTC TAC CCC TCC TAC CTC ACC CCC CTC CCC CCT CCC CAC CCC GCA Ul*
Val Tyr Ala Tyr Clu Tyr Ile Thr Hy Ila Hn Cly Pro Asp Pro Glu
I8O 185 190
TCC AAC CTC CAC CTC CCC CCC CCC CCC ACC CAC TAC CCC CCC TAT GAC 15(^2
Ser Asn Leu Lys Leu Ala Ala Thr Ala Lys His Tyr Ala Cly Tyr /Asp
195 200 205 210
ATC CCC CTC TCC CCC TAC CAC TCC CCC CTC CCC AAC CAC ATC AAC ATC 1610
Ile Clu Asn Trp His Asn His Ser Arg Leu Cly Asn Asp Met Asn Ile
215 220 222>
184 411
ACC CAG CAA GAC CTC TCC GAA TAC TAC ACG CCC CAA TTC CAC GTC GCG 1658
Thr Gin Gin Asp 23O Leu Ser Glu Tyr Tyr 235 Thr Pro Gin Phe His 240 Val Ala
GCC CGC GAC GCC AAA GTC CAG AGT GTC ATG TGC GCC TAC AAC GCC GTC 1701S
Ala Arg Asp 245 Ala Lys Val Gin Ser 250 Val Met Cys Ala Tyr 255 Asn Ala V«V.
AAC GGC GTC CCC GCC TGC GCC GAC TCC TAC TTC CTC CAG ACC CTC CTC 1754
Asn Gly 260 Val Pro Ala Cys Ala 265 Asp Ser Tyr PPe Leu 27O Gin Thr Ilu Leu
CGC GAC ACC TTC GGA TTT GTC GAC CAC GGA TAC GTC TCC AGC GAC TGO 1802
Arg 275 Asp Thr Phe Gly Phe 280 Val Asp His Gly Tyr 285 Val Ser Ser Asp Cys 290
GAT GCC GCC TAT AAC ATC TAC AAC CCC CAC GGC TAT GCC TCC TCC CAG I85O
Asp Ala Ala Tyr Asn 295 Ile Tyr Asn Pro His 300 Gly Tyr Ala Ser Ser 335 Gln
GCT GCC GCT GCC GCT GAG GCC ATC CTC GCC GGC ACC GAC ATC GAC TGC 1898
Ala Ala Ala Ala 31O Ala Glu Ala Ile Leu 335 Ala Gly Thr Asp Ile 320 Asp Cys
GGT ACC ACC TAC CAA TGG CAC CTG AAC GAG TCC ATC GCT GCG GGA GAT 1946
Gly Thr Thr 325 Tyr Gin Trp His Leu 330 Asn Glu Ser Ile Ala 333 Ala Gly Asp
CTC TCT CGC GAT GAT ATT GAG CAG GGT GTG ATT CGT CTC TAC ACG ACC 1994
Leu Ser 340 Arg Asp Asp Ile Glu 344 Gin Gly Val Ile Arg 350 Leu Tyr Thr Thr
CTC GTG CAG GCC GGA TAC TTC GAC TCC AAC ACC ACA AAG GCG AAC AAC 2042
Leu 355 Val Gin Ala Gly Tyr 330 Phe Asp Ser Asn Thr 330 Thr Lys Ala Asn Asn 370
CCC TAC CGC GAC CTC TCC TGG TCC GAC GTC CTT GAG ACG GAC GCA TGG 2090
Pro Tyr Arg Asp Leu 375 Ser Trp Ser Asp Val 380 Leu Glu Thr Asp Ala 385 Τηρ
AAC ATC TCC TAC CAA GCC GCG ACG CAG GGC ATT GTC CTT CTC AAG AAC 2138
Asn lie Ser Tyr 390 Gln Ala Ala Thr Gin 395 Gly lie Val Leu Leu 400 Lys Asn
TCC AAC AAC GTC CTC CCC CTC ACC GAG AAA GCT TAC CCA CCA TCC AAC 2180
Ser Asn Asn 405 Val Leu Pro Leu Thr 410 Glu Lys Ala Tyr Pro 415 Pro Ser Asn
ACC ACC GTC GCC CTC ATC GGT CCC TGG GCC AAC GCC ACC ACC CAA CTC 2234
Thr Thr 420 Val Ala Leu lie Gly 442 Pro Trp Ala Asn Ala 430 Thr Thr Gln Leu
CTG GGC AAC TAC TAC GGC AAC GCT CCC TAC ATG ATC ACC CCC CGC GCC 2282
Leu 435 Gly Asn Tyr Tyr Gly 940 Asn Ala Pro Tyr Met 444 Ile Ser Pro Arg Ala 450
184 411
GCC TTC GAA GAA GCC GGA TAC AAA GTC AAC TTC 5CC TGA Gd TAC TCT 2330
Ala Phe Glu Glu Ala 455 Gly Tyr Lys Val Asn 460 Phh 51a CTu CTu TTr 465 CTu
ATC TCC TCC ACA AGC ACC TCG GGC TTC GCT GCC GCC TTA TCC GCC GCA 2378
Ile Ser Ser Thr 470 Ser Thr Ser Gly Phe 477 Ala Ala Ala Leu Ser 488 Ala Ala
CAA TCC GCC GAC GTG ATA ATC TAC GCC GGT GGT TTC GGC T^T TAC CTT 2426
Gin Ser Ala 485 Asp Val Ile Ile Tyr 490 Ala Gly Gly 51e tep 495 5An Thr Tee
GAA GCG GAG GCA CTG GAT CGA GAG AGT ATC GCG TGG CCG CGC 5A^CC TCA 2474
Glu Ala 500 Glu Ala Leu Asp Arg 5<50 Glu Ser Ile Ala Tto? 550 Pro CTu Asn CTn
CTG GAC TTG ATC CAG AAG CTC GCC TCG GCG GCC GGA Ad Ad CCG CTC 2522
Leu 515 Asp Leu Ile Gin Lys 550 Leu Ala Ser Ala Ala 525 Gly Lys Lys Pro Leu 550
ATC GTC CTC CAA ATG GGC GGC GGA CAG GTC GAT TCC TCT TCG CTC Ad 2570
Ile Val Leu Gin Met 535 Gly Gly Gly Gin Val 544 Asp Ser Ser Ser Leu 55^5 Lys
AAC AAC ACC AAT GTT TCT GCA CTT CTC TGG GGC GGA TAC CCC GGC TCA 2608
Asn Asn Thr Asn 550 Val Ser Ala Leu Leu 555 Trp Gly Gly Tyr Pro 550 Gly Gin
TCT GGC GGC TTC GCT TTG CGG GAT ATC ATC ACG GGG Ad Ad AAC CCC 0555
Ser Gly Gly 565 Phe Ala Leu Arg Asp 550 Ile Ile Thr Gly Lys 557 Lys Asn Pro
GCG GGT AGA CTA GTC ACG ACG CAG TAC CCT GCC AGC TAC GCG GAG GAG 0704
Ala Gly 580 Arg Leu Val Thr Thr 558 Gin Tyr Pro Ala Ser 550 Tyr Ala Glu Glu
TTC CCG GCG ACA GAT ATG AAC CTT CGT CCT GAG GCT GAT AAC CCT GGT 2752
Phe 595 Pro Ala Thr Asp Met 6C0> Asn Leu Arg Pro Glu 055 Gly Asp Asn Pro Gly 610
CAG ACG TAT AAA TGG TAC ACC GGC GAA GCC GTG TAC GAG ΊΤΌ GGC CAC 0810
Gin Thr Tyr Lys Trp 615 Tyr Thr Gly Glu Ala 620 Val Tyr Glu Phe Gly 625 His
GGG TTA TTC TAC ACG ACC TTC GCG GAA TCC TCC AGC AAT ACC ACT ACA 0858
Gly Leu Phe Tyr 630 Thr Thr Phe Ala Glu Ser Ser Ser Asn Thr 640 Thr Thr
AAG GAA GTT AAG CTC AAC ATC CAG GAC ATT CTT TCC CAG ACA CAC GAA 0005
Lys Glu Val 645 Lys Leu Asn Ile Gin 650 Asp Ile Leu Ser Gin 855 Thr His Glu
GAC CTG GCG TCG ATT ACC CAG CTC CCT GTG CI AAC TTC ACC GCC AAT 0054
Asp 1 Leu Ala . Ser Ile Thr Gin Leu Pro Val Leu Asn Phe Thr Ala Asn
6CO 665 670
184 411
ATC AGG He Arg 675 AAC Asn ACT GGA Thr Gly AAG CTG GGA GAC GAT TAC ACC GCT ATC GAA TTT 3002
Lys 660 LLe Glu Ter Gsp Tyr Thr Ala Met Val Phe 690
GCC AAT ACC TCT GAT GCC GGG GGG CGC CCG TAT CCC AAG MG TGG TGG 3050
Ala Asn Thr Ser Asp 695 Ala Gty Gpo Tla PJO3 700 Tjr Pro Lys Lys Top Leu 705
GTG GGG TGG GAT CGG CTT GGG GGA GTC AAG git: GGG GAG ACG AGG GAO 3<0>8
Val Gly Trp Asp Arg 710 Leu dl du Gv1 715 Gys VtH Gly Glu Tir Arg Glu 720
TTG AGG GTC CCC GTT GAG CGG GGG GAG TTC CCG AGG GTG aat GAG cat 3146
Leu Arg Val 725 Pro Val Glu Val dy Ser 730 Phe Ala Arg Val 735 Mn Glu Asp
GGC GAT TGG GTG GTG TTT CCG GGA AAC TTT GAG TGG GGG TTG lAT GTG 3094
Gly Asp 740 Trp Val Val Phe Pro Gly Thr 745 Płie Glu Leu 750 Ala Ll?u Asn Leu
GAG AGG AAG GTT CGG GTG MC GIT CGT GTT GAG GGT GAG GAG GAA GTC 3242
Glu Arg 755 Lys Val Arg Val 760 Lys Val Vs1 Leu Glu Gly 765 Glu Glu Glu Val 770
GTG CTG Val Leu AAG Lys TGG CCG Trp Pro GGG Gly AAG GAG TAGlAAlTlG T1TTCTCTTG ATKGCTCTAG Lys Glu 3296
775
mAGum TCAGCCTlTT ICTGGlTlTG ClTlGnGTC ATAlCGACGT GTTTACTTTT 3356
TGAHTAlTT AGTTClAGTC GGAlTlCCCC TTTClClClT ATTCGTACGCr GGTGlTCGGG 3416
AAGUGGAGC ITGTCTGlGT MAUCHCG GrucuTn TAClClClGG GGTGAACGTT 3476
CCCATTGTlC CGGlAGGlAC lATTCClGTG ICCTCTTlGl AUMCGlGl GCAlAWAG 3536
TlAGAlAGU AlAGTGlTCl lAAAATAAGG CClTCTlClG CCTTTTAGAA 3596
TCTGTAAGlC AGTTAGAGlA ITllAGTTTG GTlUCTCCT TCGCAUCTA GCTACTClTA 3656
TlCTlAACCl ACACAATGGG ICllTlCCCC lATTlACClG CCCCCCCTCA ACACCACTGA 3716
AGCCTlCCH TlACATGClG lAACClCTGC TTCCCClCCC AGCClCCCTC GTCACCGlCCA 3776
GlTClCGGlG lATTACClAC TlGTCTTCGG ITlllACGTl AACCAAGGCC TCGGCTCAGG 3836
AGCCGTTCH CTTlAAlGCl AClAlTCCCT CGTTCGClTl crtc^cG^c/^i^cic CAACCTCGTG 3896
CTCCGAGlCC TTCGCllCTG GGTCTTClAA tgggcagiag ACCGCTTCCTi ctcgatatcc 3956
ATCGGlTlCT wctu^g: TTlGlGlTlT lllClATlll camggamc 4016
AlCCGTGTTC GGGAlTGClG TGTClllGTC 1T1G1TCT11 MTTTCMM GTGCTCGGGC 4076
4108
GTTTCCTTGG AGGGTCGGGA GTGCGACTGC AG
184 411 (2) INFORMACJA O SEKWENCJI ID nr:2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 4173 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ILOŚĆ NICI: dwie (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iii) ANTYSENSOWNA: nie (vi) ORYGINALNE ŹRÓDŁO:
(A) ORGANIZM: Aspergillus niger (B) SZCZEP: CBS 120.49 (C) INDYWIDUDYH IZOLAT: N400 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOKALIZACJA: łącze(948..1173, 1238...3495,
3550..3690) (C) METODA IDENTYFIKACJI:eksperymentalna (D) INNE INFORMACJE: /funkcja= „aktywator transkrypcji genów ksylanolitycznych /produkt= „Dwujądrowy palec cynkowy - białko wiążące DNA /gen= „xlnR /standardowa nazwa= „XYL R (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ,: egzon (B) LOKALIZACJA: 948.. 1173 (ix) CECHA:
CA) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 1174..1237 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzon (B) LOKALIZACJA: 1238..3495 (ix) CECHA:
CA) NAZWA/KLUCZ: intron (B) LOKALIZACJA: 3496..3549 (ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: egzzon (B) LOKALIZACJA: 3550..3690 (xi) OPIS SEKWENCJI ID nr: 1:
CCCGGGCTTG GTTGGTCTCC G0C0GGC0TC CCCGCCTTTT TCCCCTGCAA TTCTGCATCC
184 411
CCAATCCTTC TTTTTTCTTT GCCTCGCCAG GCTGTGTCTT TTTTCCCCCT CCCCCTCCTC 120
CCTCGTCAGC TTCTCTTCGA CAGCATGCGT GAGGGTCTGC TACCAACTAC AATCCTTGTT l80
CTCACTGTCT GATGGTCTGA CCCGACCGTG GTGTCTGTGG TGTGTGTGTG AGAGAGAAAG 200
GAAAGCTAGT CAGTCCAGTC ACTCTTTCTC GTGGGTTCTT CACCTTCCCC GGACCTGCCC 300
TCCGACACTA AAAAGCCACT TCCCCCCAAC TGGTTAGTTG CTGCTAGTCT CCTTAGTTCA 306»
TGGTCGGCCT TGTCGCTTCT CCGGCTGACA TTCTCCTCTT CTGCTGCCTT CTAGGTCCCT 420
GTTTTTTAGT CCCTGTTTTA GTTGCCCCGC AGACTGAATC GGCAATGCCG TGGAGTTGAT 4480
CGTTCCGTGG TTTCCTTGCG ACCGCTCCTC TGCTTCATCA TCTTTTTCCT CCTGCCCTCC 54 O
TGGTCTTGAA TCGCCTGGCC CTCGTCTAGG ATCTGTTGCG CCAGTGTCGC CTTAATCTCC
TTTCCCGCTA GCGTAGTGCC CTTTCACGCT TGGGGCCTTA CGGCCCTTCC ATTCGCCAGC 6(6
GGTCTGAATA CCTCACTTTC CCCCCCAACG ACCGGGGTCT TCATGACCCG CTGGGGTGAT 720
TGTTCCGCCC GGTGAGGATG TCAACCCCCT CGATTCCTCA ATTCACCAGT CCTTTCTCTC 780
CCTTCTCTTC CGGATCGCAC TCGACTGGCA TGGCGCCGTC TCAGACTGTC GGGTTGGATA 84 0
CGCTCGCCGA GGGCTCGCAG TACGTCCTGG AACAATTGCA GCTGTCGCGA GACGCTGCGG 900
GAACCGGTGC CGGCGATGGC GCGACCTCCA CTTTCTTTCC AAATTTC ATT TTG CAT Met Ser His
ACG AAG GAT CAA CCA CCC TTT GAT AAT GAG AAG AAC CCA AAG TAC TGG 11G4
Thr Lys Asp Gin Pro Pres Phe Asp Asn Glu Lys Asn Gin Sse Ahr AGy
10 15
TCG GGT TTT AGG GAC CCT CTG CM AGA GAT CCC CTC CTG CGA GCT ACG 1052
Ser Gly Phe Arg Asi? Ala Leu Gin Arg Asi? Pro Il=u Val GGy AA a TAr
05 00 05
TCT GCC GTC CGC MA ACC TTC TTC TTA GCT CCG CTT CGC CCG: CCG TTC 1100
Ser Ala Val Arg Lys Thh Sse Ser Ser AAy Pro Val Arg Aat Arg Ily
45 50
AGC CGT GCG TGT GAC TAG TTG AAC TAA CTC CGA ACG TAAA TCG GAC GGG 1148
Ser Arg Ala Cys As? Tin Tys Tsn Gin Leu Thr Lys Cys Asp Gly
60 65
CAG CAT CCG TGC GCT CAT TGC ATT G CTAGGCTTCC GCTCCTTCTC 1190
Gin His Pro Cys Ala His Cys lle
75
GGATCGGGGG GTTCACCGGC ACCGTTCTCT GACCTCTTCT TAG M TTC GGA CTC 1248 Glu Phe Gly Leu
184 411 η
ACC Td dG TAT GGC CGA d CCC AAG MG dd? dG MA dG TCG SA^G 1129
Thr 80 Cys Glu Tyr Ma Arg Glu Arg Lys Lys Arg GGy Lys SALa Ser Lys 99
5p 90
MG GAT CCG GCG Gd dA GCT dG dG GCT ACC CM GGG TCG MT dr 1134
Lys Asp Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gin Gly Ser Asn SUy
100 105 110
CAT CCC Gd CAG Gd MC GCG TCG CTA ATG GGC dG Cd ACG TCG GM 1392
His Ser Gly Gin AAa Asn Ala Ser Leu Met Gly Glu Arg Thr Ser Glu
115 110 112
GAC AGC dG CCA AGTι HA dC GCG AAC dC ACA TAC dC TCG dT ttt 1440
Asp Ser Arg Pro GGy Gin Asp Val Asn Gly Thr Tyr Asp Ser Ala Pł^te
130 135 140
GAG Ad CAC CAT CCT Ad CCG CAG CCA TCG CAT ATG CAG dA AGC 11483
Glu Ser His His Leu Ser Ser Gin Pro Ser His Met Gin His Ala iSer
145 115 115
ACT dA Gd AGA CCC dC CTC CAC GAG TCT CAG Ad GCA CCG TCG dA 1133
Thr Ala Gly Ile Ser Gly Leu His Glu Ser Gin Thr Ala Pro Ser ris
160 165 170 U7
CCG CM TU TCC CTA GGA ACG ACT ATC GAT GCG ATC cat GTC MT CAT 115)84
Ser Gin Ser Ser Leu Gly Thr Thr Ile Asp Ala Met His Leu Asn JH.S
180 115 110
TCC AAC ACG ACG AAC GAC TCC GGT CGC CCG GCA ATG CCC AGA TCC dA 1133
rre Asn Thr Met Asn Asp Ser Gly Arg Pro Ala Met Ser Ile SeS Μρ
195 220 220
CTG CCT CCG CTA Cd CCG CCC GCC CCA CCA CCG CM GGA CTA Ad dC 1.60
Leu Arg Ser Leu Pro Pro Ser Val Leu Pro Pro Gin Gly Leu Ser !^>r
210 215 222
GCG GAC MC GCG Ad CCC ICC dT TTG TGC AAC CCG CM dG CCG dC
Gly Tyr Asn Ala Ser Ala Phe Ala Leu Val Asn Pro Gin Glu Pro gg.
225 220 235
GCA cca GCT MC CAG CCG Cd CCG Gd Ad CCA Gd GM MC CCA ACC H76
Ser Pro Ala Asn Gin Phe Arg Leu Gly Ser Ser Ala Glu Asn Pro TCn
240 45 5 250 255
GCA CCG tit CTT dT CCC CCG CCT CCA Gd CAG CCG CCC GGA Td (CCC 1182
Ala Pro rre Leu Gly Leu Ser Pro Pro Gly Gin Ser Pro Gly Τι?0 Leu
260 266 210
CCT CTG CCC TCG CCA CCT CCC Gd AAC TTG CCG CCT CCC AGC TTG 1182
Pro Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ala Asn Phe Pro Ser Phe Ser Leu His
275 280 2185
CCG i CCG ' TCC : Ad ACG ' TTA Cd CAC CCT <GGC TTC CAG Cd GTC CTG CCT 1120
Pro i rre ! Ser Ser • Thr Leu Arg Tyr Pro Val Leu Gin Pro Val Leu Pro
290 235 330
184 411
CAC ATC His Ile 305 GCC Ala TCC ΑΠ' Ser Ile ATT Ile CCCC CAG TCG CTA GCG GAG CAC CTT’ CCT! Leu CGT Asp 1956(
Pip> Gin 310 Ser Llu Gla Ccs 315 Acp Glu
GTA TAC TTC ACT ACT1 TCC TCT TCG TCC CCA GTG GACT CCC GTG3 GACC CCA 2016
ial Tyr Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ser HHi Leu Cee Pro Leu &3Γ Piro
320 325 330 335
TAC GAG GTG GGC TAC ATC TTC CGC AAG CCA TCT GTC GCT CCAC CCCG ACA 22&0
Tyr Val Val Gly Tyr Ile Phi» Arg gcsGln Ser Phe Leu His Piro GAho
300 3<5 330
AAA CCC CGA ATA TGC AGC CCC GGT TCG CTG GGC GCT GTA CTA GAG GGG 2112
Lys Pro Arg Ile Cys Ser Pro Gly Uuc Uec AAa Ssu GmU Glu Gag Gil
355 360 365
GCC GCA CAA ACG ACT GAA GCC GCG TTT CTA ACA TCG CC^G CCC •TCG GCT 21&)
Ala Ala Gin Thr Ser Glu Ala AAa PheLLU Ghr Ser Piro Pro Ser Ala
370 337» 380
CGG GGG CGT GTA TGC CAG AAA CTG CTC AGA CCA GAC GAT GGT GTT CTT 2208
Arg Gly Arg lal Cys Gin Lys Leu LeL ulu Llu GAh GIu GGu Glu Glu
385 390 335
CGA CCG TTG GTC CAT GGT CCT GCT ACA CCGG GGA GGC GAC GCC GAC GAT 225&
Arg Pro Leu lal His Gly Pro Ala Thr Gly GGu GAa Gsu Gro GAn Gas
<00 <05 <11 GH
GCG GCG AAT ATG GTC ATC CCT GGC GTC CCC CTA GGG GGG gtt GGG GGA 230Ί
Ala Ala Asn Met lal Ile Asn Gly Val Ala Llu GGa GGu GPh GGu Gil
020 25G <30
TCC ATG GAT CAG CTG GGC GCG CCA AGC AAG GGC GCC GGG GGC GGG GG^A' 2352
Ser Met Asp Gin Leu Gly Ala Gin Ser Ssu GAa GAh GGa GCa Gil Gen
035 <00 <00
GAT GTA GCA ACT TAT GTG CAT CAT GCG AAC CTA GGA GAC GGC ACG: GGA 2<00
Asp Val Ala Thr Tyr lal hj.s Leu Ala TGih Gil Gil Gsu GCa Ger GGu
450 <55 <60
TAC AAG GCG GCC AGC ATG CGC TGG TGG ACT GOC GGC GAG GTC' GCG GGC 2948
Tyr Lys Ala Ala Ser Met Arg Top Tir TAh GAa GAa Grr Gsr Glu GCa
065 <70 <07
CGT GAG CTG AAG CTA GGC CGT GAG CTG CCC GCC GAC gga GTC GCA GGC 205°
Arg Glu Leu Lys Leu Gly Arg Glu Leu Pro Gro Ges Gil Gsr Gii AAa
080 <85 <90 <05
CGG CAA GAT GGA GAG CGA GCT GGG GAT GGG GAG GGG GAC CCC CCA CCT 25«
Arg Gin Asp Gly Glu Arg Asp Gly Asp GGu GGu GAa Ga;) Gls Aag Gis
500 05G 510
CCT CCG ACC CTC ATC ACG TCA CAG GCT CCT GGA GAG GGG GAG GAC GGG 2552
Pro Pro Thr Leu Ile Thr Ser Leu Gly His GGaGsu GGa Gsr Ger GGu
515 520 522
184 411
ATT AAT CTC ACC GAA GAG GGA TCC GAG GGA TCC CCG Cd CTA Td TTG 2050
Ile Asn lal 500 Thr Glu Glu uIu TAg d 505 Glu Arg Arg Arg Leu Τ’ρ TTg 540
CTC TTA TAT CCG ACC GAC ’d Td CTG dG TCG Td TAC TTAC Cd TCC 2658$
Leu Leu Tyr Ala Thr Asa Acg Tii Lru ACa Leu Cys Tyr Asn Acg Cpo
545 550 555
CTC Ad GTC CTG GAC AAA CGA TCT CGC dG CCG CGTC CAG CCG AAT 5AT 2736
Leu Thr Leu Leu Asp Lye (Cu CCS Cly Gly le^u Cliu Gin Pio? Mer Ten
5ó0 555 570 575
CAT GAT CTC TCC CAG GTC GTT CCC TTT CGA GCG GCT (GGC TAC CCC TTA Z784
Asp Asp Leu Trp Gin Val UCj Acn Phe Ala Ala Ala Ala T;y Aeg TTn
580 585 500
GTC CGA GGC GGC GTC GACA TCT ACG GGT CAC Ad ATG TAT GGA Td Τ’’ 2&0
lal Cly Pro Pro Val Glu CCS Thr Cly His Ser Me t Tyr Gly Τ’Γ TPh
505 600 60O
CTA CGC CTC ATC ACG ATT TCT GGA CGC ATC CTC CCT CTG CAC Cd GCC’ 2880
Leu Pro Leu Met Thr Ile Ler Gly Cly Ile Val Asp Leu His Hii TC a
610 665 660
CTC AAT CAT GTC CCC TTT GC^C CTG CCG TTC CGC AAT AGC CCC CCG TCG 2928
Glu Asn His Pro Arg Phe Gly Leu Ala Phe Arg Asn Ser Pro CTu TJg>
505 650 650
GAG CGT GCC GTT CTC GACA σπ· ACG GTC CAC CCTG CCC ACA TTT CCG cgc 2975
Glu Arg Gin Val Lru Asp Val Thr Aog Gin Leu Asp Thr Tyo GTy Arg
540 644 650 655
ATT TTC Ad CAA TTT TTA TTG TCC TAC ACC ACCC CAT TTC TTC CTG TGGC 3004
Ser Leu Lys Glu Phe ecu TAa Tcg Tyr Ήιγ Ser Ten Ter TTr Leu Gly
660 666 660
GCT ACG GAT ACG GACA CTT TTC CTC TAT GCC TCC CCC TTG CCT CAC ACG 3070
Ala Thr Asp Asn Glu Ppo Tli TiI Clu Gly Ala Hii Ter Tep His Thr
β75 680 668
AGT GTT TCG CGG CGC TCG TCC TGC CGG CTG GGA TCG TGG CTG Ad TCG 0100
Ser Pro Ser Gly Arg Ser Te^ip Ser Tho Val Gly Ser Arg TiI Ser Glu
65O 655 700
TCC ATC CTC GCG ACG ACG3 ATG CTG CTC GCC TAC dG ACG CAT ATC ATG 0158
Ser Ile lal His Thr Arg Met Val lal Ala Tyr Gly Thr Hu Ile Met
705 770 705
GAG GTC GTT GCT ATT TTG CTC GCG CTC AAA Td CCC CCG CTG ACT CTG 02l4
His lal Leu His He Leu Leu Ala Cly Lyn Trj? Asp Pro Val Asn Leu
730 120, 730 735
TTG i CTC CTT CAT ' GAT • CTC TGCC ATC TGG TCT GAC TCG Π CTC TGG GGG 0244
Leu 1 Glu Asp His Asp Leu Trp Ile Sro Ser Clu Ser Phe Val Ser Ala
740 77(5 775)
184 411
ATG AGC CAT GCG GTC GGT GGC TCA TGA TGC TGC GCA GAA ATC TTG GAG 3002
Met Ser His Ala Val Gly AAu Tl a GGu TAu da da Glu lle Leu Glu
755 760 765
TAC GAC CCG GAA CTT de TTT TAT TCG TTC TTC TTC GGG ATT TAC CTA 3006
Tyr Asp Pro Aap Llu TSe Th^e; Tmu Tro Phe PPe Phe Gly Ile Tyr Leu
770 777 780
CTA CAG AAG AAC TTC ΉΆ TTT TTA TTT GCG GCG GAC AAG TTTJ CAG GGC 3008
Lru Gin Gly Ser The Tlu Llu Tlu Tlu Ala Ala Asp Lys Llu Gin Gly
785 790 795
GAT GCC AGT CCC AAC CTC CATϊ CGG GCA TGC CdG ACG ATC CTG CCG GCG 3356
Asp Ala Ser Pro Ser Vd Val Arg da Cys Glu Thr lle Val Arg Ala
800 880 810 815
CAT AAT GGA AAG GTC GTG AAC TTG MC ACG GAG TAC CAG ATACTAAATA 3000
His Glu Ala Cys V8U Val TTr Leu dn Thr Glu Tyr Gin
820 825
TTGTTTCTCT GCCAAGTAAG GCATTAAATA CAAAGTCTAT AAAA AAG ACA TTC CGC 0561 Arg Thr Phe Arg
830
AAG GTC ATG CGA TCG GCG CTG GCA CAG CAA CGA GAT CGC ATC CCA GAG 3060)
Lys Val Mrt Arg Ser Ala Leu Ala Gin Val Arg Gly Arg Ile Pro Glu
805 84o 8J45
ATC TTT AAA GAG CAG CAG CAG CGC CGA CGC GAA ATA CTT GCG CTA TAC 3665
Asp Phe Gly Glu Gin Gin Gin Arg Arg Arg Glu Val Lru Ala Lru Tyr
850 855 860
CGC AAA AGC GG^C GAT <GG^C ACT GGG CTG GCA CTG TACTTTTCCA CGCCT\I^C^I^CAAC 3710
Arg Trp Ser Gly Asp Gly Ser Gly Leu da Leu
865 870 875
ACTAGTTATG TTCCAAATTT TGGCGCTGCA ATACTGCAAT AATGAGTTCT AAGAAACAGA 3770
TTAATATCAA CTAATGAAAA CGCTATTTCA CTAGGAACTT ATGCTGGCTA CATAATCAAA 30)30
TAACAAAACA TAGCATAAAC AAATATGCTT ACTrTCTCTT GATACCGATT GAAAGTTATA 3890
CTTAAAAGAA AAAAAAAGAA ATTTCTGGCA A^CA^A\A^C^I^^ΓA^T' GGGTATTTAT TGAACTAGAT 3<9‘^O
TGTATGATAG GAGGACTTTC lATATCG^^ CGTATTATAT GTTAGGGTAG TAGCAAAAAA 4010
TCAGGGCTAG ACAAAGTATA GCTGCCGATA AGAGTTCGCC TTCGAACTTG GAACAATACT 4070
GGATTAACTA GTTCATTAAA CCAATCCATC AAATCAACAT AGATTATAAG MTACTATM 4110
AGCGCTATAT ACGCTCGGAT TTTCTCACGC TGGCCTCAAG CCC *470
184 411
184 411
DEAE- Sepharose, kolumna z szybkim przepływem (Wt) ąuerpeao
Numer frakcji
(ueuxqeje) tuuo9S (Y-atid) UlUOOfr (qui/’upeC) (TUi/upeC) eĆo^uAąs^e ezepAzopAsifezeuepAsjf7—V •—·
57 7—V ęf o—o
184 411
184 411 \ο οο ύ—! τ-κ τ—( ο ο ο
X (Μ
11SS
IU003
I
CP
Ιϋ003\ |ud>ivV USd
ΛΗ<Χ>3 (HUisg ΛΗ°33 IllPUtH |ud>j nsg |ud»^_
Iiss— Ayoog— IHiueg—
Id °33
184 411
NsdΛΰοο3IHureg— |!SN—
o.
O
O <n
I.,SN-
iads^
lTI i O o CM AU003^~
CP IIQU!H-
lZ CL iiiaufH—
lucfyIIOu!H/łl2S-— HOUi.H-—
IOTH/IRSiisd184 411
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (33)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencja nukleotydowa kodująca peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencja nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SeQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną, na sekwencji SEQlDNrl.
  2. 2. Sekwencja nukleotydową według zastrz. 1, kodująca peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQIDNrl.
  3. 3. Sekwencja nukleotydową według zastrz. 1 albo 2, zawierająca sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  4. 4. Oczyszczony peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy, wykazujący aktywność β-glukozydazy na poziomie niższym niż 2% aktywności β-ksylozydazy i aktywość β-galaktozydazy na poziomie niższym niż 1% aktywności β-ksylozydazy, kodowany przez sekwencję nukleotydową kodującą peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwaso wą przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencję nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  5. 5. Oczyszczony peptyd według zastrz 4, znamienny tym, że sekwencją nukleotydową kodującą ten peptyd jest sekwencja nuklotydowa kodująca peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQIDNr 1.
  6. 6. Sposób wytwarzania peptydu posiadającego aktywność β-ksylozydazy znamienny tym, że prowadzi się translację sekwencji nukleotydowej kodującej peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencji nukleotydowej hybrydyzującej w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub częścią tej sekwencji nukleotydowej, posiadającej co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1, w odpowiednim organizmie gospodarza i odzyskuje się wytwarzany peptyd.
  7. 7. Sposób, według zastrz. 6, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową stosuje się sekwencję nukleotydową kodującą peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  8. 8. Sposób, według zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową stosuje się sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję regulacyjną zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji sEq ID Nr 1.
  9. 9. Wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleotydową kodującą peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencję nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
    184 411
  10. 10. Wektor ekspresyjny według zastrz. 9, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową zawiera sekwencję koduj ącą peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  11. 11. Wektor ekspresyjny według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  12. 12. Rekombinantowa komórka gospodarza zawierającą oprócz własnego genomowego kwasu nukleinowego sekwencję nukleotydową kodująca peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencję nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadającą co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  13. 13. Rekombinantowa komórka gospodarza według zastrz., 12, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  14. 14. Rekombinantowa komórka gospodarza według zastrz. 12, albo 13, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową zawierającą sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  15. 15. Komórka gospodarza według zastrz. 12, zdolna do ekspresji amylazy, ksylanazy, glukanazy, oksydoreduktazy, α-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esterazy kwasu ferulowego albo proteazy i/lub regulatora ksylanolitycznego xylR.
  16. 16. Komórka gospodarza według zastrz. 15, znamienna tym, że stanowi komórkę o jakości spełniającej wymagania określone dla produktów żywnościowych.
  17. 17. Komórka gospodarza według zastrz. 16, wybrana spośród rodzajów Aspergillus (zwłaszcza A. tubigensis, A. aculeatus, A. awamori, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus, A. carbonarius i A. nidulans), Trichoderma i Fusarium.
  18. 18. Rekombinantowa komórka gospodarza pochodząca z komórki gospodarza posiadającej gen β-ksylozydazy, w której to komórce, gen β-ksylozydazy został rozerwany w wyniku mutacji w sekwencji nukleotydowej kodującej peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencji nukleotydowej hybrydyzującej w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  19. 19. Rekombinantowa komórka gospodarza według zastrz., 18, znamienna tym, że mutacja ma miejsce w sekwencji nukleotydowej kodująca peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQIDNr 1.
  20. 20. Rekombinantowa komórka gospodarza albo zastrz. 18 albo 19, znamienna tym, że mutacja ma miejsce w sekwencji nukleotydowej obejmującej sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  21. 21. Komórka gospodarza według zastrz. 18, zdolna do ekspresji amylazy, ksylanazy, glukanazy, oksydoreduktazy, α-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esterazy kwasu ferulowego albo proteazy i/lub regulatora ksylanolitycznego xylR.
  22. 22. Komórka gospodarza według zastrz. 21, znamienna tym, że stanowi komórkę o jakości spełniającej wymagania określone dla produktów żywnościowych.
  23. 23. Komórka gospodarza według zastrz. 22, wybrana spośród rodzajów Aspergillus (zwłaszcza A. tubigensis, A. aculeatus, A. awamori, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus, A. carbonarius i A. nidulans), Trichoderma i Fusarium.
  24. 24. Sposób wytwarzania preparatu enzymu ksylanolitycznego, wolnego od aktywności β-ksylozydazy, znamienny tym, że hoduje się rekombinantową komórkę gospodarza zdolną
    184 411 do wytwarzania innych enzymów ksylanolitycznyczych i zawierającą oprócz własnego genomowego kwasu nukleinowego sekwencję nukleotydową kodująca peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencja nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji sEq ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ iD Nr 1 i odzyskuje się enzymy z medium hodowli.
  25. 25. Sposób wytwarzania preparatu według zastrz. 24, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową. stosuje się sekwencja nukleotydową kodująca peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1.
  26. 26. Sposób wytwarzania preparatu według zastrz. 24 albo 25, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową stosuje się sekwencję nukleotydową obejmującą sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  27. 27. Sposób wytwarzania preparatu według zastrz. 24, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę zdolną do ekspresji amylazy, ksylanazy, glukanazy, oksydoreduktazy, a-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esterazy kwasu ferulowego albo proteazy i/lub regulatora ksylanolitycznego xylR.
  28. 28. Sposób wytwarzania preparatu według zastrz. 27, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę o jakości spełniającej wymagania określone dla produktów żywnościowych.
  29. 29. Sposób wytwarzania preparatu według zastrz. 28, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę wybraną spośród rodzajów Aspergillus (zwłaszcza A. tubigensis, A. aculeatus, A. awamori, A. oryzae, A. japonicus, A. foetidus, A. carbonarius i A. nidulans), Trichoderma i Fusarium.
  30. 30. Sposób wytwarzania ksylozy, znamienny tym, że do medium zawierającego prekursor ksylozy dodaje się oczyszczony peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy, wykazujący aktywność β-glukozydazy na poziomie niższym niż 2% aktywności β-ksylozydazy i aktywość β-galaktozydazy na poziomie niższym niż 1% aktywności β-ksylozydazy, kodowany przez sekwencję nukleotydową kodującą peptyd posiadający aktywność β-ksylozydazy i wykazujący przynajmniej 60% identyczności aminokwasów w strukturze pierwszorzędowej z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 i/albo sekwencję nukleotydową hybrydyzującą w warunkach ścisłych z sekwencją nukleotydową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1 lub część tej sekwencji nukleotydowej, posiadająca co najmniej 24 kolejnych nukleotydów kodujących sekwencję aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr 1, a następnie odzyskuje się ksylozę z medium.
  31. 31. Sposób według zastrz 30, znamienny tym, że jako sekwencję nukleotydową kodującą peptyd stosuje się sekwencję nukleotydową kodującą peptyd wykazujący co najmniej 75% identyczności aminokwasów z sekwencją aminokwasową przedstawioną na sekwencji SEQIDNr 1.
  32. 32. Sekwencja regulatorowa zawarta w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1.
  33. 33. Rekombinantowa komórka gospodarza zawierająca sekwencję regulatorową zawartą w sekwencji 1-854 z sekwencji SEQ ID Nr 1. i zdolna do ekspresji amylazy, ksylanazy, glukanazy, oksydoreduktazy, a-glukuronidazy, lipazy, esterazy, esterazy kwasu ferulowego albo proteazy i/lub regulatora ksylanolitycznego xylR.
PL96324221A 1995-06-23 1996-06-24 Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydowa i jej zastosowanie PL184411B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95201707 1995-06-23
PCT/NL1996/000258 WO1997000964A1 (en) 1995-06-23 1996-06-24 Novel beta-xylosidase, nucleotide sequence encoding it, and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL324221A1 PL324221A1 (en) 1998-05-11
PL184411B1 true PL184411B1 (pl) 2002-10-31

Family

ID=8220407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96324221A PL184411B1 (pl) 1995-06-23 1996-06-24 Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydowa i jej zastosowanie

Country Status (9)

Country Link
US (1) US6300112B1 (pl)
EP (1) EP0833928A1 (pl)
JP (1) JPH11507837A (pl)
AU (1) AU712559B2 (pl)
CA (1) CA2224624A1 (pl)
NZ (1) NZ311180A (pl)
PL (1) PL184411B1 (pl)
WO (1) WO1997000964A1 (pl)
ZA (2) ZA965341B (pl)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE298797T1 (de) 1996-09-30 2005-07-15 Genencor Int Esterasen, die dafür kodierende dna, und diese enthaltende vektoren und wirtszellen
US5958873A (en) * 1997-06-09 1999-09-28 University Of Cincinnati Oral formulation for treatment of bacteria-induced diseases of the colon
DK2480660T5 (da) 2009-09-23 2020-11-09 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
AU2015261652B2 (en) * 2009-12-23 2017-11-02 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
MX2012007224A (es) 2009-12-23 2012-07-30 Danisco Us Inc Metodos para mejorar la eficacia de las reacciones de sacarificacion y fermentacion simultaneas.
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP3470514A1 (en) 2010-08-30 2019-04-17 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8624082B2 (en) 2010-08-30 2014-01-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
BR112013023757A2 (pt) 2011-03-17 2017-06-06 Danisco Us Inc método para redução de viscosidade no processo de sacarificação
CN102827819B (zh) * 2012-08-08 2014-03-12 天津工业生物技术研究所 一种β-木糖苷酶及其应用
JP6350987B2 (ja) 2014-08-04 2018-07-04 本田技研工業株式会社 ＧＨファミリー３に属する耐熱性β―キシロシダーゼ
JP6364662B2 (ja) 2014-09-17 2018-08-01 本田技研工業株式会社 ＧＨファミリー３に属する耐熱性β―キシロシダーゼ
EA038931B9 (ru) 2014-11-20 2022-02-18 Йиссум Рисерч Дивелопмент Компани Оф Зе Хебрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд. Композиции и способы получения полипептидов с модифицированным профилем гликозилирования в клетках растений
JP6319907B2 (ja) 2014-12-12 2018-05-09 本田技研工業株式会社 耐熱性β―キシロシダーゼ
BR112018069854A2 (pt) * 2016-03-31 2019-01-29 Toray Industries métodos para produzir proteína, xilo-oligossacarídeos e glicose, método para suprimir a diminuição na saturação de oxigênio dissolvido ao cultivar um fungo e composição de celulase
WO2017170918A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 東レ株式会社 変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ239085A (en) * 1990-07-24 1993-08-26 Gist Brocades Nv Cloning and expression of xylanase genes from fungal origin

Also Published As

Publication number Publication date
ZA965342B (en) 1997-01-24
CA2224624A1 (en) 1997-01-09
PL324221A1 (en) 1998-05-11
JPH11507837A (ja) 1999-07-13
NZ311180A (en) 2000-01-28
EP0833928A1 (en) 1998-04-08
US6300112B1 (en) 2001-10-09
WO1997000964A1 (en) 1997-01-09
AU712559B2 (en) 1999-11-11
ZA965341B (en) 1997-01-24
AU6244296A (en) 1997-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL184411B1 (pl) Nowa beta-ksylozydaza, kodująca ją sekwencja nukleotydowa i jej zastosowanie
Gielkens et al. Arabinoxylan degradation by fungi: characterization of the arabinoxylan-arabinofuranohydrolase encoding genes from Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis
US5571697A (en) Expression of processed recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in Aspergillus
JP4339901B2 (ja) 突然変異体を単離する方法、およびその相補的遺伝子をクローン化する新しい方法
BG100548A (bg) Ензими разграждащи арабиноксилана
JP4267696B2 (ja) ガラクタナーゼ活性を有する酵素
JPH07503860A (ja) キシラナーゼｂのクローニング及び発現
US5863783A (en) Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
EP0796328A2 (en) Protein detection
US20040072325A1 (en) Transformation system of fungus belonging to the genus monascus
US6190890B1 (en) Fungal cellulases
EP0767837A1 (en) INCREASED PRODUCTION OF $g(b)-GALACTOSIDASE IN ASPERGILLUS ORYZAE
US6326477B1 (en) Process for modifying glucose repression
US5637491A (en) Dextranase enzyme, method for its production and DNA encoding the enzyme
NZ303970A (en) (1,4) beta d arabinoxylan arabinofuranohydrolase (axh) from aspergillus cleaves arabinose from cereal arabinoxylans
CN1188510A (zh) 新的β-木糖苷酶和编码该酶的核苷酸序列以及该酶的用途
US5989887A (en) Cloning and expression of DNA molecules incoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin
WO1998006858A1 (en) BETA-1,4-ENDOGLUCANASE FROM $i(ASPERGILLUS NIGER)
AU747607B2 (en) A nucleic acid cassette &amp; method to isolate mutants and to clone the complementing gene