PL177555B1

PL177555B1 - Sposób rozdzielania składników z czerwonych krwinek

Info

Publication number: PL177555B1
Application number: PL94311001A
Authority: PL
Inventors: Karin Erlansson; Hans Jungvid; Bo Mattiasson; Göran Nilsson; Thomas Olin; Torbjörn Sund
Original assignee: Gramineer Ab
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1994-04-08
Publication date: 1999-12-31
Also published as: PL311001A1; ATE209499T1; JPH08508749A; SE9301188D0; DE69429255D1; CN1122574A; US5872227A; HU9502936D0; EP0692966B1; HU219817B; AU681649B2; HUT72701A; EP0692966A1; AU6515294A; WO1994023729A1; CA2160157A1

Abstract

1. Sposób rozdzielania skladników z czerwonych krwinek, polegajacy na poddawa- niu czerwonych krwinek lizie, poddawaniu lizatu etapowi fizycznego rozdzielania, pod- czas którego oddzielane sa blony komórkowe zawierajace lipidy i skladniki rozpuszczalne w wodzie, znamienny tym, ze dodaje sie do krwinek, przed lub po ich lizie, rozpuszczal- ny w wodzie kwasny zwiazek obnizajacy pH, rozdziela sie uzyskany zawierajacy agregaty lizat w etapie fizycznego rozdzielania na wzbogacona w hemoglobine frakcje rozpusz- czalna w wodzie w olna od blon komórkowych zawierajacych lipidy i na frakcje wzbogacona w blony komórkowe zawierajace lipidy, a nastepnie poddaje sie dal- szej obróbce frakcje wzbogaconej w blony komórkowe zawierajace lipidy i/lub rozpuszczalna w wodzie frakcje w zbogacona w hemoglobine PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania składników z czerwonych krwinek.

Wynalazek ujawnia oddzielanie błon komórkowych z frakcji rozpuszczalnej w wodzie. Wynalazek umożliwia również skuteczną obróbkę surowego materiału w celu otrzymania lipidów związanych z błonami krwinek czerwonych. Wynalazek ułatwia także oczyszczanie składników z rozpuszczalnej w wodzie frakcji krwinek czerwonych, przez zmniejszenie w takich rozpuszczalnych w wodzie preparatach zawartości lipidów. Wynalazek ułatwia ponadto otrzymywanie glikolipidów lub fosfolipidów z ekstraktów lipidowych takich błon.

Do rozdzielania błon komórkowych i rozpuszczalnej w wodzie frakcji krwinek czerwonych w celach analitycznych i preparatywnych przeważnie używa się wirowania. Wydaje rozdzielanie nienaruszonych błon komórkowych z frakcji rozpuszczalnej w wodzie wymaga za177 555 stosowania dużej siły odśrodkowej. Duża siła odśrodkowa i możliwa do zaakceptowania szybkość płynięcia produktu są trudne do pogodzenia w czasie obróbki krwinek czerwonych na skalę przemysłową. Owocuje to niską wydajnością otrzymywania błon komórkowych.

W celu zwiększenia wydajności otrzymywania frakcji krwi w czasie wirowania, rozwinięto techniki wspomagające, na przykład system worków na krew w połączeniu z ogranicznikami ciśnienia (EP-A-026417) i syntetyczne żele, które oddzielają komórki od frakcji rozpuszczalnej w wodzie (EP-A1-520185). Sposoby te są wydajne przy obróbce małych objętości krwi, ale nie nadają się do wytwarzania na skalę przemysłową.

W celu wzbogacenia w całe krwinki czerwone lub ich specyficzne frakcje stosuje się również techniki filtracyjne (japońskie zgłoszenie patentowe Nr 61181963, dokument patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4 946 603). Jednakże błony komórkowe niszczą filtry, ograniczając przepływ, i w ten sposób zmniejszając wydajność procesu.

Wiadomo obecnie, że agregację lub aglutynację komórek krwi można wywołać przez wiązanie krzyżowe ujemnych ładunków błony powierzchniowej komórek krwi i amin polimerycznych takich jak polilizyna (EP-A-438192) i chitosan (Senstad C. i Mattison B. Biotechnology and Bioengineering 34(3), 387-393, 1989). Ten tym agregacji ułatwia oddzielenie komórek krwi od frakcji rozpuszczalnej w wodzie. Wytwarzanie polilizyny jest materiałochłonne, co ogranicza jej zastosowanie, jako narzędzia do agregacji błon komórkowych na skalę przemysłową. Chitosan agreguje błony komórkowe ale jednocześnie zwiększa lepkość roztworu. Zwiększenie lepkości utrudnia osadzanie się błon komórkowych wywołane przez agregację. Aminy polimeryczne powodujące wiązanie krzyżowe przylegają do składników błony powierzchniowej komórek, na przykład kwasu sialowego w glikolipidach lub glikoproteinach. Otrzymywanie nienaruszonych form, na przykład aktywnych biologicznie glikolipidów, może wymagać dodatkowego etapu oddzielania, w którym usuwa się związane aminy polimeryczne.

W opisie zgłoszeniowym z Wielkiej Brytanii GB-A-1430217 podaje się sposób otrzymywania nadającego się do infuzji i stabilnego w czasie przechowywania roztworu hemoglobiny przez hemolizę zawierającego erytrocyty materiału wyjściowego za pomocą βpropiolaktonu, odmycia β-propiolaktonu i oddzielenie materiału zespolonego od roztworu hemoglobiny, przez jego związanie na kationowym materiale jonowymiennym w pH od 5,0 do 5,5.

W certyfikacie SU 940066 twórcy opisują sposób wytwarzania hemoglobiny i materiału zespolonego do użycia medycznego. Erytrocyny w roztworze buforującym hemolizuje się w roztworze buforującym, w tym przypadku buforze fosforanowym o pH 6,1-6,5, a następnie oddziela się wolną hemoglobinę od komórkowego materiału zespolonego, przez związanie hemoglobiny na kationowym materiale jonowymiennym, podczas gdy materiał zespolony pozostaje w otaczającym roztworze.

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdzielania składników z czerwonych krwinek, polegający na poddawaniu czerwonych krwinek lizie, poddawaniu lizatu etapowi fizycznego rozdzielania, podczas którego oddzielane są błony komórkowe zawierające lipidy i składniki rozpuszczalne w wodzie, charakteryzujący się tym, że w celu uzyskania agregacji błon komórkowych, dodaje się do krwinek, przed lub po ich lizie, rozpuszczalny w wodzie kwaśny związek obniżający pH, rozdziela się uzyskany zawierający agregaty lizat w etapie fizycznego rozdzielania na wzbogaconą w hemoglobinę frakcję rozpuszczalną w wodzie wolną od błon komórkowych zawierających lipidy i na frakcję wzbogaconą w błony komórkowe zawierające lipidy otrzymaną w wyniku agregacji błon komórkowych, następnie odzyskuje się jeden lub więcej składników z frakcji wzbogaconej w błony komórkowe zawierające lipidy i/lub z rozpuszczalnej w wodzie frakcji wzbogaconej w homoglobinę.

W korzystnym sposobie wykonania krwinki czerwone zawierające lipidy poddaje się lizie przed dodaniem kwaśnego związku obniżającego pH.

Kwaśny związek obniżający pH korzystnie dodaje się w takiej ilości, która umożliwia osiągnięcie pH równego od 1 do 6,8.

Jeszcze bardziej korzystnie kwaśny związek obniżający pH dodaje się w takiej ilości, która umożliwia osiągnięcie pH równego od 4,5 do 5,5.

177 555

W sposobie według wynalazku w korzystnym wykonaniu do krwinek czerwonych zawierających lipidy wstępnie dodaje się kwaśnego związku obniżającego pH w ilości, która umożliwia uzyskanie stężenia komórkowego tego związku w mieszaninie 0,01-1,5%, ewentualnie 0,03-1%, a następnie błony komórkowe zawierające lipidy poddaje się lizie.

W takim traktowaniu błon z frakcji wzbogaconej w błony komórkowe zawierające lipidy ekstrahuje się jeden lub więcej lipidów.

Korzystnie dodatkowo uzyskany roztwór lipidów inkubuje się w temperaturze od -5°C do 20°C, korzystnie od -5°C do 10°C, i w tym przypadku z precypitatu oddziela się glikolipidy, natomiast z roztworu oddziela się fosfolipidy, korzystnie fosfatydylocholinę i fosfatydylodietanoloaminę.

Korzystnie w sposobie według wynalazku z rozpuszczalnej w wodzie frakcji wzbogaconej w hemoglobinę odzyskuje się hemoglobinę.

W korzystnych odmianach sposobu według wynalazku jako kwaśny związek obniżający pH stosuje się kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas szczawiowy, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, kwas α-ketoglutarowy, kwas fosforowy, kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy, korzystnie kwas cytrynowy, kwas fosforowy lub kwas chlorowodorowy lub ich mieszaniny.

Dwa szczególnie korzystne sposoby wykonania sposobu według wynalazku są następujące:

1. Czerwone krwinki lizuje się przez dodanie 2 objętości wody. Następnie do roztworu dodaje się 1 objętość wody z kwasem cytrynowym do osiągnięcia pH 5. Zagregowane błony komórkowe oddziela się od frakcji rozpuszczalnej w wodzie za pomocą separatora odśrodkowego lub odpowiedniego fizycznego sposobu oddzielania, takiego jak filtracja, szczególnie filtracja przez błony, flotacja, sedymentacja lub dekantacja lub inne techniki wykorzystujące różnice w gęstości lub lepkości. Błony komórkowego ekstrahuje się etanolem, a ekstrakt inkubuje w temperaturze 4°C. Następnie oddziela się osad wzbogacony w glikolipidy. Frakcję rozpuszczalną w wodzie oczyszcza się następnie metodami chromatograficznymi.

2. Czerwone krwinki lizuje się przez dodanie 2 objętości wody. Do roztworu dodaje się kwasu chlorowodorowego do osiągnięcia pH 5,5. Zagregowane błony komórkowe oddziela się od frakcji rozpuszczalnej w wodzie za pomocą separatora odśrodkowego lub innego odpowiedniego sposobu. Frakcję rozpuszczalną w wodzie oczyszcza się następnie metodami chromatograficznymi. Błony komórkowe ekstrahuje się etanolem, a ekstrakt inkubuje w temperaturze -20°C. Następnie oddziela się osad wzbogacony w glikolipidy.

Sposób według wynalazku umożliwia wydajne oddzielenie składników z czerwonych krwinek, wykorzystuje się w , nim agregację błon komórkowych wywołaną przez dodanie rozpuszczalnego w wodzie związku obniżającego pH, a następnie roztwór poddaje się etapowi oddzielenia, w którym frakcję rozpuszczalną w wodzie oddziela się od błon komórkowych, a błony komórkowe ekstrahuje się i przez obniżenie temperatury ekstraktu selektywnie oddziela się i odzyskuje lipidy.

Fosfolipidy i glikolipidy stanowią główne klasy lipidów błon komórkowych. Bakterie patogenne często wiążą się z glikolipidami powierzchni tkanek. Przyłączenie się bakterii jest początkowym etapem wielu infekcji. Dobrze scharakteryzowanym przykładem jest wiązanie się wywołującej choroby dróg moczowych bakterii E. coli z receptorami glikolipidów grupy globo. Podanie wolnych glikolipidów może zahamować wiązanie się bakterii i ich występowanie na powierzchni tkanek. Taki typ aktywności receptorów ma fundamentalne znaczenie dla rozwoju nowych produktów terapeutyczny i diagnostycznych.

Fosfolipidów można używać jako nośników dla niezbędnych odżywczych kwasów tłuszczowych. Ponadto, fosfolipidów używa się w różnych produktach, na przykład jako związków emulgujących w produktach żywnościowych i kosmetykach i jako części liposomów w systemie dostarczania leków.

Lipidy mogą być używane jako dodatki do produktów odżywczych lub wytwarzane jako kompozycje farmaceutyczne. Jako przykłady kompozycji farmaceutycznych można przytoczyć tabletki, krople, czopki, preparaty do podawania miejscowego, takie jak maści, żele,

177 555 kremy, pudry, krople i zawiesiny. Przeważnie, substancja czynna stanowi 0,01% do 99% wagowych kompozycji, lub na przykład 0,05% do 50% w przypadku preparatów przeznaczonych do podawania doustnego i od 0,05% do 80% w przypadku preparatów przeznaczonych do podawania miejscowego.

Lipidy mogą także być używane do celów diagnostycznych jako specyficzne ligandy dla patogenów lub toksyn.

Sposób według wynalazku jest metodą ułatwiającą wzbogacenie w glikolipidy, fosfolipidy, cholesterol lub białka błonowe frakcji błon komórkowych czerwonych krwinek i wzbogacenie w hemoglobinę, glukozo-6P-dehydrogenazę, 2,3-difosfoglicerynian i ATP frakcji czerwonych krwinek rozpuszczalnej w wodzie.

Agregację błon komórkowych prowadzi się przez dodanie związku obniżającego pH, co powoduje zmianę działania sił utrzymujących komórki z całości. Proponowany mechanizm agregacji błon komórkowych, w odróżnieniu od mechanizmu zaproponowanego dla amin polimerycznych, nie ma charakteru wiązań krzyżowych, a więc użyteczne są również kwasy jednowartościowe. Agregacja błon komórkowych za pomocą związku obniżającego pH nie powoduje modyfikacji struktur powierzchniowych, jest więc przydatna do otrzymywania, na przykład glikolipidów aktywnych biologicznie.

Zagregowane błony komórkowe mają większy współczynnik sedymentacji niż nietraktowane błony komórkowe, co powoduje, że można je oddzielić od frakcji rozpuszczalnej w wodzie przy użyciu mniejszej siły odśrodkowej niż jest potrzebna w innych przypadkach. Połączenie techniki agregacji błon komórkowych przez dodanie związku obniżającego pH i tradycyjnego wirowania dostarcza niespodziewanie wydajnego sposobu oddzielania błon komórkowych od frakcji rozpuszczalnej w wodzie, zarówno do celów analitycznych jak i wytwarzania na skalę przemysłową. Sposób według wynalazku ma podobne zalety w połączeniu z, na przykład metodą dekantacji i flotacji lub innymi technikami wykorzystującymi różnice w gęstości lub lepkości.

Następną zaletą sposobu według wynalazku jest dostarczenie sposobu oddzielania błon komórkowych od frakcji rozpuszczalnej w wodzie przy użyciu techniki filtracji. Błony komórkowe traktowane zgodnie ze sposobem według wynalazku tworzą duże agregaty, co zmniejsza ryzyko zatkania porów filtra. Zagregowane błony komórkowe można także wydajnie oddzielić od frakcji rozpuszczalnej w wodzie bez czerwonych krwinek przy użyciu filtrów o większej średnicy porów niż używane do oddzielania nietraktowanych błon komórkowych. Zwiększenie średnicy porów filtra zwiększa przepustowość urządzenia filtracyjnego.

Rozpuszczalna w wodzie frakcja krwinek czerwonych wytworzona sposobem według wynalazku jest całkowicie wolna od błon komórkowych, co ułatwia dalsze oczyszczanie pojedynczych substancji, ponieważ błony komórkowe zaburzają mikro- i ultrafiltracje oraz oddzielanie związków za pomocą żeli.

Rozpuszczalna w wodzie frakcja zlizowanych krwinek czerwonych zawiera głównie hemoglobinę. Z frakcji rozpuszczalnej w wodzie można otrzymać proszek hemoglobinowy całkowicie wolny od błon komórkowych, który charakteryzuje się niską zawartością bakterii w czasie przedłużonego przechowywania i jest łatwiejszy do sprasowania w tabletki niż proszek hemoglobinowy o wysokiej zawartości lipidów.

Lipidy z błon komórkowych można wyekstrahować za pomocą rozpuszczalników organicznych. W czasie ekstrakcji pewnymi rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak etanol, wymywają się także związki o charakterze zanieczyszczeń. Takie zanieczyszczenia można oddzielić od lipidów tradycyjnymi technikami chromatograficznymi. Ten etap oczyszczania jest często czynnikiem limitującym przepustowość procesu. Sposobem według wynalazku białka oddziela się od lipidów przez obniżenie temperatury ekstraktu. Taki sposób oparty na obniżeniu temperatury umożliwia uzyskanie większej przepustowości procesu w porównaniu z tradycyjnymi technikami chromatograficznymi.

Wiadomo, że glikolipidy można wytrącać z roztworów organicznych przez obniżenie temperatury do -10°C (Koscielak J, i wsp., Eur J Biochem, tom 37, strony 214-225, 1973). Znaną niedogodnością tej metody jest duża ilość związków zanieczyszczających wytracają6

177 555 cych się razem z glikolipidami, wynikająca z niskiej zawartości glikolipidów w fazie stałej. Sposób według wynalazku pozwala na wytrącenie glikolipidów o zwiększonej czystości. Proces precypitacji reguluje się zarówno temperaturą, jak i polarnością roztworu lipidów. Dalej opisane są sposoby oddzielania pewnych fosfolipidów od glikolipidów.

Wyekstrahowane lipidy można także wzbogacić dodając związku absorbującego lipidy, a następnie oddzielając tworzące się kompleksy od otaczającego roztworu. Związek absorbujący może mieć charakter cząstkowy, tworzyć cząstkowe kompleksy z lipidami, powodować rozdzielenie się faz, w ekstrakcie lub wybiórczo wiązać się z fazą stałą i w ten sposób jako kompleks z lipidami może być oddzielony od zanieczyszczeń.

W czasie wytwarzania produktów żywnościowych, dodatków spożywczych lub kompozycji farmaceutycznych korzystnie stosuje się nietoksyczne środki wspomagające przetwarzanie, tak więc dopuszczalna jest większa liczba takich środków wspomagających. To oznacza z kolei, obniżenie wymogów dla procesu oczyszczania w czasie procesu wytwarzania. Nietoksyczne środki wspomagające przetwarzanie ułatwiają także utylizację odpadów i są korzystne dla środowiska pracy.

Sposób według wynalazku obejmuje użycie związku obniżającego pH, który jest dopuszczalnym dodatkiem do pożywienia, na przykład kwasu cytrynowego i kwasu chlorowodorowego. Rozdzielenie glikolipidów sposobem według wynalazku zastępuje technikę chromatograficzną, która w wielu przypadkach może powodować zanieczyszczenie produktu substancjami toksycznymi.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym figura 1 jest diagramem pokazującym rozmieszczenie lipidów w próbce osadu w przykładzie VI. Figura 2 jest diagramem pokazującym rozmieszczenie lipidów w próbce supernatantu w przykładzie VI.

Na figurach liczby oznaczają jeden lub więcej pików 1:fosfatydylodietanoloamina, 2: globozyd, 3: fosfatydylocholina, 4: sfngomielina.

Przykład I. Czerwone krwinki lizowano przez dodanie dwóch objętości wody. Stopień zlizowania komórek wynosił ponad 90%. Zlizowane krwinki czerwone podzielono na trzy równe części, które były traktowane jak następuje:

Próbka 1. Próbkę rozcieńczono wodą do stężenia końcowego 25% krwinek czerwonych. W celu określenia zawartości błon komórkowych pobrano podwójne próbki.

Próbka 2. Próbkę rozcieńczono wodą do stężenia końcowego 25% krwinek czerwonych i odwirowano w wirówce (2000 g) przez 10 minut w temperaturze 10°C. W celu określenia zawartości błon komórkowych z osadu i supernatantu pobrano podwójne próbki.

Próbka 3. Próbkę rozcieńczono zgodnie ze sposobem według wynalazku roztworem kwasu cytrynowego do stężenia końcowego 25% krwinek czerwonych i 0,5% kwasu cytrynowego. Próbkę odwirowano w wirówce (2000 g) przez 10 minut w temperaturze 10°C. W celu określenia zawartości błon komórkowych z osadu i supernatantu pobrano podwójne próbki.

Po dodaniu do próbki 3 kwasu cytrynowego sposobem według wynalazku rozpoczęła się agregacja błon komórkowych. Agregację można śledzić wizualnie pobierając próbki i rozpuszczając je w 10 objętościach wody. W tak rozcieńczonych próbkach można zobaczyć nitkowate agregaty, które rosną i oddzielają się od roztworu hemoglobiny.

Tabela 1

Ilość nietraktowanych i zagregowanych błon komórkowych po odwirowaniu przy 2000 g w ciągu 10 minut

Próbka	Rozmieszczenie błon komórkowych¹
Osad (produkt)	Supernatant (strata)
Próbka 2 Krwinki czerwone + woda	<10%	>90%
Próbki 3 Krwinki czerwone + roztwór kwasu cytrynowego	>95%	<5%

'Ilość błon komórkowych, odpowiednio, w osadzie i supematancie podano w procentach całkowitej ilości glikolipidów specyficznych dla błon komórkowych w nie oddzielonej próbce 1 (patrz powyżej).

177 555

Wyniki analizy chemicznej wykazały, że wydajna sedymentacja błon komórkowych idzie w parze z optycznym klarowaniem się supematantu.

Przykład II. 400 l krwinek czerwonych (RBC) pochodzenia świńskiego lizowano przez dodanie 400 l wody i inkubowano w temperaturze 8°C przez 12 godzin. Stopień zlizowania komórek wynosił ponad 90%. W celu określenia wydajności oddzielania błon komórkowych od frakcji rozpuszczalnej w wodzie określono ilość globozydów, glikolipidów specyficznych dla błon komórkowych. Ze zlizowanych komórek krwi pobrano podwójne próbki i określono stężenie globozydów, które wynosiło do 400 mg na litr koncentratu RBC. Zlizowane RBC podzielono na cztery porcje po 200 l i traktowano jak następuje:

Próbka 1. 200 l zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 100 l wody (rozcieńczenie całkowite 1+2).

Próbka 2. 200 ml zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 200 l wody (rozcieńczenie całkowite 1+3).

Próbka 3. 200 l zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 100 l wody i dodano 2,4 kg kwasu cytrynowego. Obserwowano agregację błon komórkowych (rozcieńczenie całkowite 1+2).

Próbka 4. 200 l zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 200 l wody i dodano 2,4 kg kwasu cytrynowego. Obserwowano agregację błon komórkowych (rozcieńczenie całkowite 1+3).

Próbki 1 do 4 osobno przepompowywano przez separator odśrodkowy typu Westfalia CSAS-06-476, przy szybkości przepływu 50 l na godzinę. Osobno zbierano osad i fazą klarowną. W każdej frakcji oznaczono zawartość globozydów.

Ilość globozydów w osadzie znacząco zwiększyła się wraz z agregacją błon komórkowych wywołaną przez kwas cytrynowy (próbka 3, tabela 2). Ilość zagregowanych błon komórkowych można jeszcze zwiększyć przez dodanie dodatkowej porcji wody (próbka 4, tabela 2).

Tabela 2

Wpływ kwasu cytrynowego i rozcieńczenia na ilość globozydów w osadzie i fazie klarownej po odwirowaniu 100 l 1 RBC, które były traktowane według odpowiedniego sposobu przygotowywania próbek

	Ilość globozydów w:
Nr próbki	Rozcieńczenie	Kwas cytrynowy	Osadzie (produkt)	Fazie klarownej (odpad)
Próbka 1	1+2	-	500 mg	39500 mg
Próbka 2	1+3	-	950 mg	39050 mg
Próbka 3	1+2	+	33050 mg	6950 mg
Próbka 4	1+3	+	38000 mg	2000 mg

Zawartość określono w osadzie, a odpad określono przez odjęcie zawartości w osadzie od całkowitej ilości uzyskanej z próbki.

Przykład III. 50 ml krwinek czerwonych człowieka (tabela 3), owcy (tabela 4), wołu (tabela 5), i świni (tabela 6) zlizowano oddzielnie przez dodanie 100 ml wody. Po 6 godzinach stopień zlizowania komórek wynosił ponad 90%. Zlizowane komórki człowieka i każdego ze zwierząt podzielono na 11 probówek. Dodając do probówek różnych kwasów do osiągnięcia pH 5,0 badano ich zdolność do wywoływania agregacji błon komórkowych. Próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Agregację śledzono wizualnie, przez obserwację 1 ml próbek rozcieńczonych wodą do 10 ml. Próbki odwirowano przy 2000 g przez 10 minut. Wydajność agregacji błon komórkowych określono metodą turbidymetryczną (+/-). Za wydajne oddzielenie błon komórkowych z otaczającego roztworu uznano moment kiedy supernatant był optycznie klarowny i oznaczono go+ lub -.

177 555

Tabela 3

Agregacja zlizowanych krwinek czerwonych człowieka

Dodatek	Agregacja	Supernatant (klarowność optyczna)
Kwas mrówkowy	+	+
Kwas octowy	+	+
Kwas propionowy	+	+
Kwas masłowy	+	+
Kwas mrówkowy	+	+
Kwas mlekowy	Ί-	+
Kwas cytrynowy	+	+
Kwas α-ketoglutarowy	+	+
Kwas fosforowy	+	+
Kwas chlorowodorowy	+	+
Kwas siarkowy	+	+

Tabela 4

Agregacja zlizowanych krwinek czerwonych owcy

Dodatek	Agregacja	Supernatant (klarowność optyczna)
Kwas mrówkowy	+	+
Kwas octowy	+	+
Kwas propionowy	+	+
Kwas masłowy	+	+
Kwas szczawiowy	+	+
Kwas mlekowy	+	+
Kwas cytrynowy	+	+
Kwas α-ketoglutarowy		+
Kwas fosforowy	+	+
Kwas chlorowodorowy	+	+
Kwas siarkowy	+	+

Tabela 5

Agregacja zlizowanych krwinek czerwonych wołu

Dodatek	Agregacja	Supernatant (klarowność optyczna)
Kwas mrówkowy	+	+
Kwas octowy	+	+
Kwas propionowy	+	+
Kwas masłowy	+	+
Kwas szczawiowy	+	+
Kwas mlekowy	+	+
Kwas cytrynowy	+	+
Kwas α-ketoglutarowy	+	+
Kwas fosforowy	+	+
Kwas chlorowodorowy	+	+
Kwas siarkowy	+	+

177 555

Tabela 6

Agregacja zlizowanych krwinek czerwonych świni

Dodatek	Agregacja	Supernatant (klarowność optyczna)
Kwas mrówkowy	+	+
Kwas octowy	+	+
Kwas propionowy	+	+
Kwas masłowy		+
Kwas szczawiowy	+	+
Kwas mlekowy	+	+
Kwas cytrynowy	+	+
Kwas α-ketoglutarowy	+	+
Kwas fosforowy	+	+
Kwas chlorowodorowy	+	+
Kwas siarkowy	+	+

Wyniki wskazują, że wszystkie użyte kwasy wydajnie agregują błony komórkowe i że sposób jest użyteczny do oddzielania krwi ludzkiej i kilku gatunków zwierząt. Agregację błon komórkowych można także osiągnąć przez dodanie środka obniżającego pH z pominięciem poprzedzającej lizy.

Przykład IV. 50 ml krwinek czerwonych świni zlizowano przez dodanie 100 ml wody. Po 6 godzinach stopień zlizowania komórek wynosił ponad 90%. Zlizowane komórki podzielono na 16 probówek. W przykładzie badano zdolność różnych kwasów do wywoływania agregacji błon komórkowych przy różnych wartościach pH. Próbki miareczkowano kwasem do osiągnięcia żądanej wartości pH i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Agregację śledzono wizualnie, przez obserwację 1 ml próbek rozcieńczonych wodą do 10 ml o odpowiedniej wartości pH. Próbki odwirowano przy 2000 g przez 10 minut. Wydajność agregacji błon komórkowych określono metodą turbidymetryczną (+/-). Za wydajne oddzielenie błon komórkowych z otaczającego roztworu uznano moment kiedy supernatant był optycznie klarowny. (Patrz uwagi, Tabela 7).

Tabela 7.

Agregacja zlizowanych krwinek czerwonych świni

Dodatek	pH	Agregacja	Uwagi
Kwas cytrynowy	7,0	-	-
	6,8	+	pozostałości błon komórkowych w supernatancie
	6,0	++	klarowny supernatant
	5,5	+++	klarowny supernatant
	4,5	+++	klarowny supernatant
Kwas cytrynowy	3,7	+++	agregacja w ciemnym kolorze klarowny supernatant
	3,0	++	czarny bardzo drobny osad
	1,0	+	czarny bardzo drobny osad
Kwas chlorowodorowy	7,0	-	-
	6,8	+	pozostałości błon komórkowych w supernatancie
	6,8	+	klarowny supernatant
	5,5	+++	klarowny supernatant
	4,5	+++	klarowny supernatant
	3,7	+++	agregacja w ciemnym kolorze klarowny supernatant
	3,0	++	czarny bardzo drobny osad
	1 1,0	+	czarny bardzo drobny osad

177 555

Przykład V. 2000 l krwinek czerwonych (RBC) lizuje się przez dodanie 2000 l wody i inkubuje w temperaturze 8°C przez 12 godzin. Stopień zlizowania komórek wynosił ponad 90%. Zlizowane RBC podzielono na dwie porcje po 2000 l i traktowano jak następuje:

Próbka 1. 2000 l zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 2000 l wody (rozcieńczenie całkowite 1+3).

Próbka 2. 2000 l zlizowanych RBC rozcieńczono dodatkowymi 2000 l wody i dodano 2,4 kg kwasu cytrynowego. Obserwowano agregację błon komórkowych (rozcieńczenie całkowite 1+3).

W separatorze odśrodkowym w próbkach 1 i 2 oddzielono błony komórkowe od fazy klarownej zawierającej roztwór hemoglobiny. Błony komórkowe znajdowały się w osadzie. Zawartość specyficznych dla błon glikolipidów z grupy globozydów wynosiła 0,22% w osadzie próbki 1 i 0,29% w osadzie próbki 2. Następnie równe ilości próbek 1 i 2 oddzielnie poddano ekstrakcji 50 l 80% etanolu w temperaturze 80°C. Ilość wyizolowanych globozydów z próbki zawierającej zagregowane błony komórkowe (próbka 2) była 40% wyższa niż ilość z próbki zawierającej błony komórkowe nie poddane agregacji (próbka 1). Zagregowane błony komórkowe łatwo było zawiesić w czasie mieszania, co zwiększyło wydajność ekstrakcji.

Przykład VI. Otrzymywanie preparatu z krwinek czerwonych świni. Lipidy wyekstrahowano z błon 20 objętościami 80% etanolu w temperaturze 80°C przez 60 minut. Ekstrakt zawierał glikolipidy, fosfolipidy i cholesterol. Roztwór lipidów rozlano do pięciu zlewek i inkubowano w temperaturze +20°C, +5°C, -5°C, -10°C lub -20°C. We wszystkich zlewkach lipidy oddzielono w osadzie i fazie ciekłej.

Glikolipidy

Precypitaty tworzące się we wszystkich badanych temperaturach były wzbogacone w glikolipidy (figura 1 i 2). Stężenie glikolipidów wzrastało wraz z temperaturą. Stężenie glikolipidów z rodziny globo wynosiło 3% w ekstrakcie i wzrastało do około 20% w precypitacie tworzącym się w temperaturze od +5°C do -5°C i 30% w temperaturze 20°C (tabela 8). Dalszy wzrost zawartości glikolipidów w precypitacie można osiągnąć przez ponowne rozpuszczanie i wytrącanie w sposób opisany powyżej. Czas niezbędny do wytrącenia glikolipidów można skrócić przez zwiększenie polarności używanego roztworu organicznego.

Tabela 8

Stężenie glikolipidów z rodziny globo w precypitacie z ekstraktu lipidów błon komórkowych krwinek czerwonych. Precypitat uzyskano po inkubacji ekstraktu w temperaturze od -20°C do +20°C.

Temperatura inkubacji	Stężenie glikolipidów (procent suchej masy)
-20°C	10
-5°C	12
-5°C	18
5°C	20
20°C	34

Fosfolipidy

Stwierdzono, że zależność rozkładu sfingomieliny w precypitacie i fazie ciekłej po inkubacji w opisanych temperaturach zależy od jakości. Różna rozpuszczalność fosfolipidów była skorelowana z zawartością w niej długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i stopnia ich nasycenia (figura 1 i 2). Po precypitacji glikolipidów w fazie ciekłej stwierdzono większą ilość fosfatydylocholiny i fosfatydylodietanoloaminy (figura 1 i 2).

Przykład VII. Krwinki czerwone krwi świni lizuje się i do roztworu dodaje się kwasu cytrynowego do stężenia końcowego 0,5%. co powoduje agregację błon komórkowych. Błony komórkowe oddziela się i ekstrahuje etanolem, a następnie glikolipidy wytrąca się w temperaturze 5°C. Metodą TLC oddziela się pojedyncze glikolipidy i inkubuje ze znakowanymi radioaktywnie bakteriami E.coli szczep posiadający fimbrie P (Karlsson KA i StrombergN, Meth Enzymol 138, 220-232, 1988).

177 555

Glikolipidy wytworzone sposobem według wynalazku z wysokim powinowactwem wiążą się z bakteriami, co wskazuje, że w czasie procesu oczyszczania sposobem według wynalazku aktywność biologiczna glikolipidów zostaje zachowana.

Przykład VIII. Błony komórkowe otrzymywano z krwinek czerwonych świni. Lipidy błonowe ekstrahowano 20-krotną objętością 80% etanolu w 80°C przez 60 minut. Ekstrakt zawierał fosfolipidy, glikolipidy i cholesterol. Roztwór lipidów inkubowano w-10°C. Powstały osad filtrowano i poddawano liofilizacji. Roztwór znad osadu uzupełniano wodą, tak aby stężenie etanolu wynosiło 50% i inkubowano w -10°C. Nowo powstały osad filtrowano i poddawano liofilizacji. Obydwa osady mieszano otrzymując preparat zawierający 8-10% wagowych globozydu, 24-30% wagowych fosfolipidów oraz 34-40% wagowych cholesterolu. Przygotowywano 20% roztwór preparatu w oleju parafinowym. Kapsułki żelatynowe wypełniano 450 mg roztworu parafinowego. Kapsułki pokrywano powłoczką odporną na działanie środowiska żołądka, zapewniającą uwalnianie zawartości kapsułki dopiero w jelitach, w których bytują różne potencjalnie patogenne bakterie np. E.coli szczep posiadający fimbrie P.

Objaśnienia terminów

Agregacja - dwie lub więcej jednostek połączonych sazem.

Globozyd - globotetraoktyloccnamid, glikolipid ndeńąąy dd roodiny glooo.

Jednowartościowy - .zlcony do oddania lub przyjęcia jednego elektronu, na kwas z jednym protonem.

Współczynnik sedymentacji - szybkość z jaką cząstki przemieszczają się w polu grawitacyjnym. Współczynnik zależy od masy i kształtu cząstki. Jednostką jest Svedbnrg (10'³ sekundy)

177 555

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób rozdzielania składników z czerwonych krwinek, polegający na poddawaniu czerwonych krwinek lizie, poddawaniu lizatu etapowi fizycznego rozdzielania, podczas którego oddzielane są błony komórkowe zawierające lipidy i składniki rozpuszczalne w wodzie, znamienny tym, że dodaje się do krwinek, przed lub po ich lizie, rozpuszczalny w wodzie kwaśny związek obniżający pH, rozdziela się uzyskany zawierający agregaty lizat w etapie fizycznego rozdzielania na wzbogaconą w hemoglobinę frakcję rozpuszczalną w wodzie wolną od błon komórkowych zawierających lipidy i na frakcję wzbogaconą w błony komórkowe zawierające lipidy, a następnie poddaje się dalszej obróbce frakcję wzbogaconej w błony komórkowe zawierające lipidy i/lub rozpuszczalną w wodzie frakcję wzbogaconą w hemoglobinę
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czerwone krwinki poddaje się lizie przed dodaniem kwaśnego związku obniżającego pH.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwaśny związek obniżający pH dodaje się w takiej ilości, która umożliwia osiągnięcie pH równego 1-6,8.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwaśny związek obniżający pH dodaje się w takiej ilości, która umożliwia osiągnięcie pH równego 4,5-5,5.
5. Sposób według zastrz.. 1, znamienny tym, że do czerwonych krwinek wstępnie dodaje się kwaśnego związku obniżającego pH w ilości która umożliwia, uzyskanie stężenia komórkowego tego związku w mieszaninie 0,01-1,5%, korzystnie 0,03-1%, a następnie błony komórkowe zawierające lipidy poddaje się lizie.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że z frakcji wzbogaconej w błony komórkowe zawierające lipidy ekstrahuje się jeden lub więcej lipidów.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dodatkowo uzyskany roztwór lipidów inkubuje się w temperaturze od 5°C do 20°C, korzystnie od -5°C do 10°C.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że z precypitatu oddziela się glikolipidy.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że z roztworu oddziela się fosfolipidy, korzystnie fosfatydylocholinę i fosfatydylodietanoloaminę.
10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienny tym, że z rozpuszczalnej w wodzie frakcji wzbogaconej w hemoglobinę odzyskuje się hemoglobinę.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako kwaśny związek obniżający pH stosuje się kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propionowy, kwas masłowy, kwas szczawiowy, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, kwas α-ketoglutarowy, kwas fosforowy, kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy, korzystnie kwas cytrynowy, kwas fosforowy lub kwas chlorowodorowy lub ich mieszaniny.