PL170842B1

PL170842B1 - Sposób wytwarzania antybiotyków ß -laktamowych PL PL PL

Info

Publication number: PL170842B1
Application number: PL92304123A
Authority: PL
Inventors: Kim Clausen
Original assignee: Gist Brocades Bv
Priority date: 1991-12-19
Filing date: 1992-12-18
Publication date: 1997-01-31
Also published as: GR940300079T1; SK63894A3; DE618979T1; US5470717A; JPH07502168A; ES2059285T1; AU3345193A; EP0618979A1; WO1993012250A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania antybiotyków ( ß -laktamowych zawierajacych rdzen 7-amino- 8-keto-5-tia-1-aza-bicyklo[4.2.0]-okt-2-enowy na drodze acylowania enzymatycznego, znamienny tym, ze proces tworzenia antybiotyku { ß -laktamowego prowadzi sie w obecnos- ci naftalenu lub pochodnej naftalenu w mieszaninie reakcyjnej. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy ulepszonego sposobu wytwarzania cefalosporyn, to jest antybiotyków β-laktamowych zawierających rdzeń 7-amino-8-keto-5-tia-'l-azabicyklo-|4.2.0'Jokt-2-enowy.

Wielki rynek antybiotyków (β-laktamowych stanowi w dużym stopniu pole współzawodnictwa, a jednym z parametrów wpływających na ceny jest czystość produktu, dlatego więc dla producenta jest bardzo ważne posiadanie dostępu do sposobu produkcji zapewniającego dużą wydajność bardzo czystego produktu.

Obecnie większość stosowanych cefalosporyn to tak zwane produkty półsyntetyczne. To określenie oznacza, że są one otrzymywane przez modyfikację za pomocą jednej lub wielu reakcji chemicznych produktów ββ-laktamowych wytwarzanych przez fermentację. Jedną z typowych reakcji stosowanych w ramach tej modyfikacji jest acylowanie grupy 7-aminowej półproduktowego rdzenia cefalosporynowego, który wytwarza się przez fermentację jako związek wyjściowy i ewentualnie dodatkowo modyfikuje go na drodze innych reakcji chemicznych

W dalszym tekście dla grupy acylowej wprowadzanej do grupy aminowej stosuje się nazwę cefalosporynowy łańcuch boczny lub tylko łańcuch boczny Kwas odpowiedni dla łańcucha bocznego jest określany mianem: kwas łańcucha bocznego. Nazwa rdzeń cefalosporynowy oznacza związek, którego acylowanie cefalosporynowym łańcuchem bocznym powoduje powstanie antybiotyku β-laktamowego lub, dokładniej, cefalosporyny.

Acylowanie można wykonać przez poddanie ewentualnie zabezpieczonej postaci rdzenia cefalosporynowego reakcji z pochodną, np. chlorkiem kwasu - ewentualnie zabezpieczonej postaci cefalosporynowego łańcucha bocznego w środowisku rozpuszczalnika organicznego zwłaszcza chlorku metylenu - w obecności zasady. Alternatywnie w stosunku do chlorku kwasu można użyć do acylowania bezwodnik mieszany. W obydwóch przypadkach acylowanie należy wykonywać w środowisku bezwodnym, korzystnie w temperaturze poniżej zera.

Reakcja acylowania nigdy nie dochodzi do końca i już niedługo od momentu rozpoczęcia się jej mieszanina reakcyjna zawiera zarówno żądany produkt jak i nieprzereagowany surowiec wyjściowy oraz możliwe produkty uboczne. Po acylowaniu, grupy zabezpieczające, jeżeli są takie, należy usunąć albo in situ (w miejscu) lub po wyodrębnieniu zabezpieczonego półproduktu Obróbka półprpoduktu i usuwanie grup zabezpieczających wymaga na ogół wykonania co najmniej jednej operacji, w ramach której produkt styka się z wodą lub z rozpuszczalnikiem rozcieńczonym wodą. Podczas operacji odbezpieczania należy bardzo uważać na to, aby uniknąć rozszczepienia wprowadzonego wiązania acylowego.

W końcowym oczyszczaniu antybiotyków β-laktamowych może przeszkadzać fakt, że właściwości kwasowo-zasadowe kilku zanieczyszczeń zawartych w surowym produkcie nie różnią się bardzo od podobnych właściwości żądanego produktu. Znaczy to, że podczas wytrącania lub przekrystalizowywania surowego produktu mogą także łatwo wytrącać się wraz z nim zanieczyszczenia i dlatego może -być trudne równoczesne osiągnięcie dużej czystości i dużej wydajności produktu.

Alternatywnie w stosunku do wyżej wymienionych sposobów można wprowadzać łańcuch boczny przez acylowanie katalizowane enzymatycznie. W tym przypadku jako źródło grupy acylowej można użyć wolny kwas odpowiedni dla łańcucha bocznego albo jego aktywowaną pochodną, taką jak amid lub niższy ester alkilowy. Acylowanie enzymatyczne można wykonywać w temperaturze otoczenia i dzięki temu zostają wyeliminowane koszty i kłopoty wiążące się z pracą w niskiej temperaturze. Rozpuszczalnikiem jest woda lub mieszanina wody z mieszającymi się z wodą rozpuszczalnikami organicznymi. Trwałość żądanego produktu i szybkość reakcji acylowania zależą od wartości pH w mieszaninie reakcyjnej. I tak, przy wartości pH około 4 żądane produkty są całkowicie trwałe a szybkość reakcji acylowania jest dość mała Przy wartości pH około 7 dezacetylacja żądanego produktu czyni postępy a równocześnie szybkość reakcji acylowania jest duża. Znaczy to, że wartość pH, przy której acylowanie enzymatyczne przebiega najkorzystniej w normalnych warunkach stanowi kompromis między tymi dwoma przeciwstawnymi priorytetami.

Sposób oczyszczania cefaleksyny jest opisany w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 003 896 (według Novo Industri A/S). Według tego opisu do roztworu

170 842 wodnego zawierającego surową cefaleksynę dodaje się naftalen lub pochodną naftalenu w celu otrzymania trudno rozpuszczalnego kompleksu naftalenu lub pochodnej naftalenu z cefaleksyną Ten kompleks wyodrębnia się i rozkłada aby otrzymać bardzo czystą cefaleksynę z duzą wydajnością. Chociaż opisany sposób oczyszczania działa znakomicie, to jednak nie zapewnia osiągania dobrej wydajności operacji oczyszczania.

Obecnie stwierdzono niespodziewanie, że można osiągnąć m situ bardzo dużą wydajność kompleksu cefalosporyny z naftalenem lub pochodną naftalenu w wyniku bardzo szybkiej reakcji, gdy odpowiedni rdzeń cefalosporynowy podda się acylowaniu enzymatycznemu w wodzie lub w rozpuszczalniku rozcieńczonym wodą w obecności naftalenu lub pochodnej naftalenu kwasem odpowiednim dla cefalosporynowego łańcucha bocznego lub pochodną kwasu, np. amidem lub niższym estrem alkilowym kwasu, jako środkiem acylującym. Produkowany kompleks jest trudno rozpuszczalny w wodzie i w środowiskach wodnych, zawierających rozpuszczalniki organiczne mieszające się z wodą. Wiązanie cefalosporyny w trudno rozpuszczalnym kompleksie nie jest podatne do hydrolizy i dlatego wartość pH w mieszaninie reakcyjnej może być zoptymalizowana w celu zapewnienia jak największej szybkości reakcji acylowania bez ryzyka niepożądanej hydrolizy lub deacylacji żądanego produktu. Po zakończeniu reakcji enzymatycznej kompleks może być oddzielony i rozłożony znanym sposobem w celu otrzymania z dużą wydajnością cefalosporyny o doskonałej czystości.

Także wówczas, gdy grupy zabezpieczające półprodukt cefalosporyny mają być usunięte przez hydrolizę np. po wprowadzeniu łańcucha bocznego przez acylowanie nieenzymatyczne, hydrolizę można wykonać korzystnie w obecności nadmiaru naftalenu lub pochodnej naftalenu. Gdy hydroliza zostanie zakończona powstały kompleks może być oddzielony i dalej przetworzony w wyżej wymieniony sposób.

Tak więc, niniejszy wynalazek nawiązuje do sposobu wytwarzania cefalosporyny metodą acylowania enzymatycznego obejmującego dodawanie naftalenu lub pochodnej naftalenu do mieszaniny reakcyjnej, w której cefalosporyna jest produkowana, z następującym po tym wykonywanym znanym sposobem, wyodrębnianie cefalosporyny z trudno rozpuszczalnego kompleksu.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku mieszaniną reakcyjną, do której dodaje się naftalen lub pochodną naftalenu, jest mieszanina reakcyjna, w której tworzy się cefalosporynę przez acylowanie grupy 7-aminowej rdzenia cefalosporynowego, jaki jest podstawiony 7-amino-8-keto-5-tia-l-Ezabicyklo[4 2 0]-okt-2-en, za pomocą kwasu cefalosporynowego, łańcucha bocznego lub pochodnej kwasu pod wpływem enzymu.

Korzystnie rdzeniem cefalosporynowym, który acyluje się jest kwas 7-aminocefalosporanowy, kwas 7-amino-7-metoksy-cefalosporynowy, kwas 7-aminodezacetoksy-cefalosporynowy i 3-chloro-7-amino-3-cefem-4-karboksylowy.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku, cefalosporynowym łańcuchem bocznym, stosowanym jako środek acylujący, jest D-fenyloglicyna, amid D-fenyloglicyny, ester metylowy D-fenyloglicyny, ester etylowy, ester propylowy lub ester izopropylowy D-fenyloglicyny, D-4-hydroksyfenyloglicyna, ester metylowy D-4-hydroksyfenyloglicyny, ester etylowy, ester propylowy lub ester izopropylowy D-4-hydroksyfenyloglicyny, kwas 2-amino-2-fenylopropionowy, 2-amino-2-fenylopropionamid, ester metylowy kwasu 2-armno-2-fenylopropionowego, ester etylowy, ester propylowy lub ester izopropylowy kwasu 2-amino-2-fenylopropionowego.

Korzystnie rdzeń cefalosporynowy acyluje się pod działaniem enzymu, który można sklasyfikować jako acylazę penicyliny lub jako hydrolazę ampicyliny.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku rdzeń cefalosporynowy acyluje się pod działaniem enzymu z Escherichia coli, Acetobacter pcsteuricrnus, Xanihomonas citrii, Kluyvera citoprohila, Bacillus megaterium lub Pseudomonas melcmogeum.

Korzystnie rdzeń cefalosporynowy acyluje się pod działaniem immobilizowanego enzymu i ewentualnie po zakończeniu reakcji cząstki niosące immobilizowany enzym oddziela się od reszty mieszaniny reakcyjnej, która zawiera stałe cząstki kompleksu powstałego antybiotyku β-laktamowego z naftalenem lub pochodną naftalenu i ewentualnie stałe cząstki jednego (lub wielu) innego (innych) składnika(ów) oraz ciecz, tworzące kompleks antybiotyku β-laktamo170 842 wego ze stałymi cząstkami innego(ych) składnika(ów), jeżeli są takie cząstki, których wymiary są różne od wymiarów cząstek niosących enzym i filtruje się lub odwirowuje mieszaninę reakcyjną używając urządzeń, które zatrzymują składniki mające większe cząstki, niezależnie od tego, czy będą nimi cząstki niosące immobilizowany enzym czy też inny(e) stały(e) składmk(i) a przepuszczają resztę mieszaniny.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku rdzeń cefalosporynowy acyluje się pod działaniem enzymu a po zakończeniu reakcji cząstki niosące enzym oddziela się od reszty mieszaniny reakcyjnej, która zawiera stałe cząstki kompleksu powstałego antybiotyku β-laktamowego z naftalenem lub pochodną naftalenu i ewentualnie stałe cząstki jednego (lub wielu) innego (innych) składnika(ów) oraz ciecz, tworzące kompleks antybiotyku (β-laktamowego ze stałymi cząstkami innego(ych) skladnika(ów), jeżeli są takie cząstki, których wymiary są mniejsze od wymiarów cząstek niosących enzym i filtruje się lub odwirowuje mieszaninę reakcyjną używając urządzeń, które zatrzymują cząstki niosące immobilizowany enzym a przepuszczają resztę mieszaniny.

Cefalosporyna powstaje w wyniku odbezpieczenia zabezpieczonego półproduktu, zaś antybiotyk β-laktamowy powstaje w środowisku wody, jako jedynego rozpuszczalnika lub w środowisku będącym mieszaniną wody i jednego lub więcej mieszających się z wodą rozpuszczalników organicznych.

Korzystnie w mieszaninie reakcyjnej utrzymuje się wartość pH od około 2,5 do około 9 a zwłaszcza od około 4 do około 8, z zastrzeżeniem, że gdy cefalosporynę wytwarza się przez bezpośrednie acylowanie rdzenia cefalosporynowego wolnym kwasem łańcucha bocznego jako środkiem acylującym, wówczas wartość pH wynosi zwłaszcza od około 4 do około 9.

Stosowana pochodna naftalenu ma wzór: naftylo - R, w którym naftylo oznacza grupę

1- naftylowąlub 2-naftyiowy a R oznacza atom chlorowca, grupę wodorotlenową, nitrowy cyjanową, rozgałęzioną lub nie rozgałęzioną grupę alk^i<^o^^ zwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np. grupę metylowy etylową, propylową, izopropylowy butylową, izobutylowy sec-butylową lub tert-butylową, ewentualnie podstawioną grupą cyjanową, np. grupę cyjanometylową lub

2- cyjanoetylową, rozgałęzioną lub nie rozgałęzioną grupę alkoksylową, zwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np. grupę metoksylową, etoksylową, propoksylową, izopropoksylową, butoksylową, izobutoksylową, sec-butoksylową lub tert-butolsylową, albo grupę alkanoiiową, zwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np. grupę formyyow^, acetylową lub propanoilową.

Korzystnie jako pochodną naftalenu stosuje się 2-naftol.

W korzystnej postaci wykonania wynalazku, stosunek molowy ilości 2-naftolu do ilości cefaleksyny w mieszaninie reakcyjnej, w której powstaje cefalosporyna wynosi co najmniej 0,45.

Korzystnie część naftalenu lub pochodnej naftalenu w mieszaninie reakcyjnej jest w postaci stałej.

W dalszej uprzywilejowanej postaci wykonania wynalazku, stosowana pochodna naftalenu ma wzór. naftylo - R, w którym naftylo oznacza grupę 1-naftylową lub 2-naftylowy a R oznacza atom chlorowca, grupę wodorotlenowy nitrową, cyjanową, rozgałęzioną lub nie rozgałęzioną grupę alkilową, zwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np. grupę metylowy etylową, propylową, izopropylową, butylowy izobutylowy sec-butylową lub tert-butylową, ewentualnie podstawioną grupą cyjanowy np. grupę cyjanometylową lub 2-cyjanoetylowy rozgałęzioną lub nie rozgałęzioną grupę alkoksylową, zwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np grupę metoksylowy etoksylową, propoksylową, izopropoksylowy butoksylową, izobutoksylową, sec-butoksylową lub tert-butolsytowy albo grupę alkanoiiozwłaszcza z 1 do 6 atomami węgla, np. grupę formylową, acetylową lub propanoilową.

W dalszej uprzywilejowanej postaci wykonania wynalazku stosuje się 2-naftol.

W dalszej uprzywilejowanej postaci wykonania wynalazku, stosunek molowy ilości

2-naftolu do ilości cefaleksyny w mieszaninie reakcyjnej, w której powstaje cefalosporyna wynosi co najmniej 0,45.

W dalszej uprzywilejowanej postaci wykonania wynalazku, część naftalenu lub pochodnej naftalenu w mieszaninie reakcyjnej jest w postaci stałej.

170 842

Zalety niniejszego wynalazku są inter aha (między innymi) następujące:

1) Liczba ogniw reakcji w procesie jest zmniejszona w porównaniu z poprzednim sposobem. Daje to oszczędność czasu i kosztów.

2) Acylowanie można wykonywać bardzo szybko Pozwala to na zwiększenie przepustowości tych samych urządzeń, więc przyczynia się do polepszenia ekonomiki procesu.

3) W operacji acylowania można stosować duże stężenia reagentów. Pozwala to na zwiększenie przepustowości tych samych urządzeń, więc przyczynia się do polepszenia ekonomiki procesu.

4) Wydajność acylowania jest prawie ilościowa. Ułatwia to oczyszczanie, więc przyczynia się do polepszenia ekonomiki procesu.

5) Zlikwidowane jest zjawisko rozkładania się żądanego produktu (np. dezacylowanie grupy 7-aminowej lub otwieranie się pierścienia (β-laktamowego). Ułatwia to oczyszczanie żądanego produktu, więc zapewnia większą wydajność.

6) Gdy środkiem acylującym jest amid lub ester kwasu łańcucha bocznego, wówczas duża szybkość reakcji acylowania zapewnia korzystny stosunek żądanej reakcji acylowania do niepożądanej reakcji ubocznej, która powoduje hydrolizę środka acylującego. W ten sposób jest zapewnione dobre wykorzystanie środka acylującego i istnieje możliwość zawracania nieprzereagowanego środka acylującego.

7) Gdy środkiem acylującym jest amid lub ester kwasu łańcucha bocznego, wówczas zwolnienie przebiegu hydrolizy świadczy o tym, że zawartość wolnego kwasu łańcucha bocznego w mieszaninie reakcyjnej jest mała. Ułatwia to oczyszczanie.

8) Żądany produkt może być produkowany bez stosowania chlorowanych rozpuszczalników (np. chlorku metylenu) w stadium acylowania lub odbezpieczania i późniejszej obróbki produktu Stanowi to zaletę, ponieważ zawartość chlorowanego rozpuszczalnika dopuszczalna przez specjalistów z dziedziny zdrowia jest tak mała, że spełnienie tego wymagania może być bardzo trudne w przypadku użycia chlorowanego rozpuszczalnika.

Przykładami cefalosporyn, które mogą być produkowane sposobem według niniejszego wynalazku są: cefaleksyna, cefadroksyl, cefaklor, cefaloglicyna, cefatryzyna, cefalotyna i cefaparol.

Podczas produkowania cefalosporyny półsyntetycznej przez acylowanie nieenzymatyczne rdzenia cefalosporynowego konieczne jest w niektórych przypadkach wprowadzanie grup zabezpieczających do rdzenia cefalosporynowego a niekiedy także do środka acylującego jeszcze przed samym acylowaniem. Po reakcji acylowania grupy zabezpieczające muszą być usuwane. Można to wykonać przez selektywną hydrolizę grup zabezpieczających w środowisku wodnym lub w środowisku rozpuszczalnika rozcieńczonego wodą, lecz należy zachować dużą ostrożność, aby uniknąć hydrolizy cefalosporynowego łańcucha bocznego. Jednak, gdy podczas hydrolizy jest obecny, jak podano, naftalen lub pochodna naftalenu, wówczas żądana cefalosporyna wtrąca się natychmiast w postaci trudnorozpuszczalnego kompleksu z naftalenem lub pochodną naftalenu, gdy cefalosporyna jest wytwarzana z półproduktu

Zarówno rdzenie cefalosporynowe jak i kwas łańcucha bocznego lub pochodne kwasu używane jako surowce wyjściowe w sposobie według niniejszego wynalazku są dostępne w handlu lub mogą być otrzymywane sposobami znanymi per se.

Gdy cefalosporyny są produkowane przez acylowanie enzymatyczne rdzenia cefalosporynowego, wówczas środkiem acylującym może być D-fenyloglicyna, D-4-hydroksyenyloglicyna lub wolny kwas odpowiedni dla innego cefalosporynowego łańcucha bocznego albo pochodna kwasu odpowiednia dla żądanego łańcucha bocznego, taka jak amid lub niższy ester alkilowy kwasu. Amidy i estry są uprzywilejowane Środek acylujący może być użyty w postaci soli, np. chlorku lub siarczanu. Gdy jako środek acylujący jest stosowana pochodna kwasu, wówczas ważnym problemem jest to, że żądana acylacja współzawodniczy z hydrolizą środka acylującego i żądanego produktu. Powoduje to rozkład środka acylującego i utrudnia oczyszczanie produktu. W sposobie według niniejszego wynalazku zapobiega się hydrolizie żądanego produktu i dlatego zapewnia się bardzie efektywne wykorzystanie środka acylującego.

170 842

Rozpuszczalność środka acylującego, takiego jak pochodna D-fenyloglicyny lub D-4-hydroksyfenyloglicyny, zależy od rodzaju pochodnej i od składu środowiska reakcji. W środowisku wodnym rozpuszczalność chlorowodorku amidu D-fenyloglicyny wynosi około 40 mM przy wartości pH w zakresie 2-7. Rozpuszczalność jest jednak zależna od soli zawartych w roztworze, jak również od wartości pH i od temperatury roztworu. Ponieważ mieszanina reakcyjna zawiera nierozpuszczony naftalen lub pochodną naftalenu jak również powstały wkrótce jego(j) nierozpuszczalny kompleks, więc zwykle staje się zawiesiną. Początkowo mieszanina reakcyjna może także zawierać nierozpuszczony środek acylujący i/lub rdzeń cefalosporynowy, które rozpuszczają się całkowicie lub częściowo podczas trwania reakcji.

Enzymami stosowanymi w procesie według tego wynalazku mogą być enzymy katalizujące reakcję. Takie enzymy stały się znane już około 1966 r. Enzymami nadającymi się do używania są np. enzymy zwane amidazami penicyliny lub acylazami penicyliny, sklasyfikowane jako F.C. 3.5.1.11. Pewna liczba znanych enzymów bakteryjnych odznaczających się tą aktywnością wywodzi się np. z Acetobacter, Xanthomonas, Mycoplana, Protaminobacter, Aeromonas (zastosowanie patentu zachodnioniemieckiego nr 2 163 792), Pseudomonas (patent austriacki nr 243986), Flavobacterium (zastosowanie patentu holenderskiego nr 70-09138), Aphanocladium, Cephalosporium (zastosowanie patentu zachodnioniemieckiego nr 2 621 618), Acetobacter pasteunanus, Bacillus megaterium, Xanthomonas citrii, (zastosowanie patentu europejskiego nr 339 751), Kluyvera citoprohila (Agr. Biol. Chem. 37/1973/, 2797-2804). Enzym z Escherichia coli jest dostępny w handlu. Enzymami mogą być także tak zwane: hydrolaza, acylaza lub amidaza ampicyliny. Informacja na ten temat jest, inter aha, podana w Hako to Kogyo 38 (1980), 216 et. seg., których zawartość jest włączona w informację.

W procesach prowadzonych na skalę przemysłową, wymagających używania katalizatora lub enzymu, cena katalizatora jest często bardzo ważnym parametrem w ekonomice całego procesu. W takich przypadkach bardzo ważną zaletą katalizatora jest możliwość ponownego używania go bez znaczącej straty jego aktywności katalitycznej. Tak więc, chociaż rozpuszczony enzym można używać w sposobie według niniejszego wynalazku, to jednak w większości przypadków jest korzystne posiadanie enzymu w postaci zawracalnej, np. w postaci zamkniętej lub immobilizowanej. Taki enzym może być otrzymany znanym sposobem Immobilizowany enzym Escherichia coli jest dostępny w handlu, np. jako wyrób firmy Boehringer Mannheim GmbH, Niemcy, pod nazwą fabryczną Enzygel.

Gdy katalizator jest jedynym stałym składnikiem obecnym w mieszaninie reakcyjnej po reakcji katalizowanej za pomocą stałego rozdrobnionego katalizatora (np. immobilizowanego enzymu), wówczas może on być łatwo oddzielony przez filtrację lub dekantację

Jednakże, po reakcji katalizowanej za pomocą stałego rozdrobnionego katalizatora, mieszanina reakcyjna może zawierać w niektórych przypadkach stałe składniki inne niż katalizator, np. żądany produkt, ewentualnie półprodukty lub nieprzereagowane surowce wyjściowe. W tym przypadku katalizator można niekiedy oddzielić przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym i/lub kwasem albo zasadą, który(a) rozpuszcza substancje stałe z wyjątkiem katalizatora. Jednakże, aktywność katalizatorów, włącznie z enzymami, jest bardzo wrażliwa na obecność tak zwanych trucizn katalizatorowych. Trucizny katalizatorowe wpływają na ich aktywność, np. wskutek bardzo silnego wiązania się z katalizatorem lub przez rozłożenie go Tak więc, mocne kwasy i zasady wywierają działanie obniżające aktywność katalizatorów a zwłaszcza enzymów, które generalnie ulegają nieodwracalnym uszkodzeniom w przypadku narażenia ich na działanie kwasów i zasad o dużych stężeniach Narzuca to pewne ograniczenia w używaniu kwasów i zasad do obróbki mieszanin reakcyjnych z reakcji enzymatycznych, gdy enzym ma być zawracany bez znaczącej utraty aktywności. Inne ograniczenia warunków obróbki mogą być oczywiście narzucane przez rodzaj żądanego produktu, który sam może być nietrwałym związkiem.

Gdy w sposobie według niniejszego wynalazku jest używany immobilizowany enzym, wówczas kwas lub zasada nie może być stosowany(a) do rozpuszczania stałego(ych) składnika(ów) mieszaniny reakcyjnej poza katalizatorem w stadium, w którym kompleks żądanego

170 842 antybiotyku (β-laktamowego z naftalenem lub pochodną naftalenu oddziela się od enzymu przez filtrację, ponieważ powodowałyby one zbędny rozkład kompleksu. Równocześnie, zależnie od warunków, np. wartości pH, temperatury i czasu trwania procesu, enzym ulegałby częściowej lub całkowitej inaktywacji. Także żądany antybiotyk β-laktamowy mógłby ulec częściowemu rozkładowi, również zależnemu od wartości pH, temperatury i czasu trwania procesu. Ponadto naftalen jest nierozpuszczalny w kwasach lub zasadach, tak jak i wiele pochodnych naftalenu.

Jako alternatywę dla rozpuszczania stałego(ych) składnika(ów) mieszaniny reakcyjnej po reakcji poza stałym katalizatorem i oddzielania katalizatora przez filtrację, można więc według niniejszego wynalazku wykonywać oddzielanie katalizatora przez odcedzanie lub filtrowanie mieszaniny reakcyjnej po reakcji albo ewentualnie w ciągły sposób. W szczególnie uprzywilejowanej odmianie tej postaci wykonania wynalazku używa się katalizator posiadający cząstki o dokładnie określonych wymiarach a inny(e) składnik(i) mieszaniny reakcyjnej (np. naftalen lub pochodne naftalenu) ma(ją) nadane wymiary cząstek mniejsze niż katalizator. Oddzielanie wykonuje się następnie przez przelewanie lub przetłaczanie pompą zawiesiny zawierającej mieszaninę reakcyjną przez sito albo filtr, który zatrzymuje cząstki katalizatora a przepuszcza resztę mieszaniny. Jak wiedzą o tym fachowcy, istnieje kilka możliwości oddziaływania na wymiary i kształty cząstek, które mają być oddzielone od katalizatora. Gdy cząstki są np. kryształami, co będzie częstszym przypadkiem, wówczas silne mieszanie mieszaniny reakcyjnej podczas tworzenia się ich powoduje powstawanie mniejszych kryształów niż podczas umiarkowanego mieszania. Innymi parametrami, które oddziaływują na rośnięcie kryształów są. wybór rozpuszczalnika lub mieszaniny rozpuszczalników, temperatura, gradient temperatury, szczepienie i starzenie się kryształów w rozpuszczalniku. Oddzielanie może być ułatwione, gdy płytka filtracyjna lub sito podlega wibracji podczas oddzielania lub gdy zawiesina na płytce filtracyjnej jest mieszana, zwłaszcza za pomocą małego mieszadła tnącego. Po oddzieleniu katalizatora mieszaninę reakcyjną można przesączyć na filtrze, który nie przepuszcza pozostałego(ych) stałego(ych) składnika(ów). Przesącz i placek filtracyjny można przerobić oddzielnie, przy czym niektóre składniki ewentualnie mogą być zawrócone do procesu razem z katalizatorem.

W dalszej uprzywilejowanej postaci wykonania sposób według wynalazku może być stosowany do wytwarzania cefalosporyny metodą ciągłą. Można do tego celu wykorzystać układ dwóch zbiorników. W układzie tym immobillzowany enzym ładuje się do zbiornika 1 posiadającego w dnie sito, które zatrzymuje immobilizowany enzym a przepuszcza całą pozostałą mieszaninę reakcyjną, a zmikronizowany 2-naftol ładuje się do zbiornika 2 zaopatrzonego w dnie w filtr, który zatrzymuje stałe substancje obecne w zbiorniku 2 zaś przepuszcza roztwór macierzysty. Obydwa zbiorniki są ze sobą połączone tak, że odcinek z dna zbiornika 1 jest podawany pompą do górnej części zbiornika 2. W rurociąg przepływowy ze zbiornika 1 do zbiornika 2 może być ewentualnie włączona jednostka filtracyjna lub odwirowująca. Odciek z dna zbiornika 2 podaje się pompą do górnej części zbiornika 1. Także w rurociąg przepływowy ze zbiornika 2 do zbiornika 1 może być ewentualnie włączona jednostka filtracyjna lub odwirowująca. Obydwa zbiorniki mogą być wyposażone w mieszadła. Najpierw ładuje się surowce wyjściowe do zbiornika 1 i niedługo po tym jak zacznie się odprowadzanie produktu można dodawać do zbiornika 1 dodatkowe ilości surowców wyjściowych, doprowadzając je w sposób ciągły lub w odpowiednich odstępach czasu.

Proces według wynalazku prowadzi się na ogół w środowisku wodnym. Ewentualnie można dodawać rozpuszczalniki organiczne. Korzystne są rozpuszczalniki organiczne wybrane spośród rozpuszczalników mieszających się z wodą, takich jak metanol, etanol, 1-propanol,

2-propanol, 1-butanol, 1,4-butanodiol, aceton, acetonitryl, N,N-dimetyloformamid i sulfotlenek dimetylowy. W niniejszym opisie nazwa rozpuszczalnik lub środowisko nie będzie stosowana w wyrażeniach dotyczących reagentów.

Proces można prowadzić w temperaturze otoczenia. Gdy wytwarzanie trudno rozpuszczalnego kompleksu odbywa się w powiązaniu z syntezą enzymatyczną cefalosporyny, wówczas uprzywilejowaną temperaturą jest zazwyczaj temperatura reakcji enzymatycznej. Dolna granica przedziału temperatur, w którym proces może być prowadzony jest zdeterminowana

170 842 przez temperaturę krzepnięcia rozpuszczalnika rozcieńczonego wodą, natomiast górna granica tego przedziału, wówczas gdy jest stosowany enzym, jest określona przez temperaturę, która powoduje inaktywację enzymu.

Jeżeli w mieszaninie reakcyjnej występuje nadmiar stałego naftalenu lub pochodnej naftalenu, wówczas wyodrębnia się go razem z wytrąconym kompleksem i oddziela od cefalosporyny przez ekstrakcję lub filtrację, gdy kompleks zostanie rozłożony.

Trudno rozpuszczalne w wodzie kompleksy można otrzymywać z cefalosporyny i z dużej grupy pochodnych naftalenu włącznie z samym naftalenem. Ponadto kompleksy, jako trudno rozpuszczalne w wodzie, są także trudno rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych takich jak metanol, etanol, butanol, aceton, octan etylu i octan butylu. Gdy proces prowadzi się w taki sposób, że początkowo większa część pochodnej naftalenu występuje w stałej postaci, wówczas uprzywilejowana powinna być postać drobnego proszku. Po wyodrębnieniu trudno rozpuszczalnego kompleksu i przerobieniu go, można zawrócić pochodną naftalenu do ponownego wykorzystania. Nie zaobserwowano ujemnego wpływu naftalenu lub pochodnych naftalenu na aktywność enzymów.

Niniejszy wynalazek jest dalej zilustrowany za pomocą przykładów, które jednak nie ograniczają zakresu ochrony. Cechy znamienne ujawnione w powyższym opisie i w poniższych przykładach oraz zastrzeżeniach patentowych, stosowane oddzielnie lub w dowolnych połączeniach mogą stanowić materiał do realizacji wynalazku w rozmaitych postaciach.

Definicje i metody analityczne.

Nazwy skrócone

7-ACA to kwas 7-aminocefalosporanowy, 7-ADCA to kwas 7-aminodezacetoksycefalosporanowy, Cex to cefaleksyna, D-PG to D-fenyloglicyna, D-PGA do amid D-fenyloglicyny i D-PGM to ester metylowy D-fenyloglicyny, Cedrox to cefadroksyl, D-HPGA to amid D-4-hydroksyfenyloglicyny oraz D-HPG to D-4-hydroksyfenyloglicyna.

Aktywność enzymu

Jest użyta następująca definicja aktywności acylazy penicyliny G; jedna jednostka (U) odpowiada takiej ilości enzymu, która hydrolizuje w ciągu 1 minuty 1 μ mol penicyliny G w warunkach standardowych (5% penicylina G, 0,2 M bufor z fosforanu sodowego, wartość pH 8,0, temperatura 28°c).

Analiza składników reakcji za pomocą HPLC Kolumna: Ci, YMC 120 A, 5 μm (4,6 x 250 mm).

Eluowanie mieszaniną eluentów A i B według tabeli 1 Eluent A: 25 mM bufor z fosforanu sodowego, wartość pH 6,5.

Eluent B: acetonitryl.

Tabela 1

Czas, minuty	Eluent B, %
0-5	1
5-15	1-20
15-20	20-50
20-25	50
25-27	50-1
27-40	1

Przepływ. 1,0 ml/min.

Detekcja: UV przy 215 nm

Czas retencji w minutach: D-PG 4,33

7-ADCA 7,51

D-PGA 14.37

170 842

Cex	19,14
2-naftol	27,17
D-HPG	2,60
D-HPGA	3,70
Cedrox	20,20

Przykład I. Synteza enzymatyczna cefalexyny w obecności 2-naftolu.

Doświadczenia A-D wykonano w temperaturze pokojowej.

Doświadczenie A (wzorzec).

D-PGA 1/2 H2 SO4 (15 m moli) 1 7-ADCA (4 m mole) rozpuszczono w wodzie. Dodano immobilizowany enzym (4 g, Eupergit PCA, 100 U/g (na mokro), nabyty w Rohm-Pharma) i zwiększono objętość do 20 ml przez dodanie wody, po czym nastawiono wartość pH na 6,4. Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie 0, 1, 2, 3, 4 1 5 godzin i zanalizowano za pomocą HPLC. Otrzymane wyniki zostały podane w tabeli 2.

Tabela 2

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/1) oznaczone za pomocą HPLC
	D-PGA	7-ADCA	Cex	D-PG
0	755	196	—	—
1	605	121	78,9	64,7
2 -	550	95,0	102,4	92,4
3	504	86,2	112,8	131
4	460	64,3	135	151
5	420	43,1	155	165

Doświadczenie B.

Wykonano w takich samych warunkach jak doświadczenie A, z wyjątkiem tego, że na początku doświadczenia dodano drobno zmielony 2-naftol (3 m mole). Trudno rozpuszczalny kompleks cefaleksyny z 2-naftolem ma przybliżony skład Cex - 2-naftoli/ a 2-naftol został dodany z nadmiarem w ilości około 50% w stosunku do ilości potrzebnej teoretycznie do otrzymania kompleksu z całą cefaleksyną, która mogła powstać w reakcji. Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie 0, 1,

2,3,4,5 godzin i zanalizowano za pomocą HPLC. Wyniki zostały podane w tabeli 3.

Tabela 3

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/1) oznaczone za pomocą HPLC
	D-PGA	7-ADCA	Cex	D-PG
0	748	198	—	—
1	630	116	89,3	28,0
2	571	70,7	130	49,4
3	514	28,3	168	64,7
4	460	4,1	193	92,0
5	428	3,0	195	119

Doświadczenie C.

Wykonano w takich samych warunkach jak doświadczenie B, z wyjątkiem tego, że reakcja biegła przy wartości pH 6,7. Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające

170 842 stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie 0, 1, 2, 3 i 4 godzin i zanalizowano za pomocą HPLC. Otrzymane wyniki zostały podane w tabeli 4.

Tabela 4

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/1) oznaczone za pomocą HPLC
	D-PGA	7-ADCA	Cex	D-PG
0	756	198	—	—
1	615	100	98,4	32,1
2	513	13,3	182	55,7
3	448	2,1	196	104
4	413	2,2	197	142

Doświadczenie D.

Wykonano w takich samych warunkach jak doświadczenie B, z wyjątkiem tego, że reakcja biegła przy wartości pH 7,0. Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie 0, 1, 2, 3 i 4 godzin i zanalizowane za pomocą HPLC. Otrzymane wyniki zostały podane w tabeli 5.

Tabela 5

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/1) oznaczone za pomocą HPLC
	D-PGA	7-ADCA	Cex	D-PG
0	755	196	—	—
1	518	13,9	184	44,5
2	444	3,1	195	111
3	370	2,1	197	179
4	315	1,9	197	234

Wydajności Cex i stosunki ilości powstałej Cex do ilości powstałej D-PG uwzględniające niepożądane reakcje uboczne w doświadczeniach A, B, C i D odpowiednio po upływie 5, 4, 2 i 1 godziny są podane w tabeli 6. Liczby wskazują na to, że obydwa czynniki, jak szybkość powstawania Cex oraz efektywność zużywania się D-PGA jako środka acylującego, są silnie zależne od warunków reakcji. Należy podkreślić, że wydajności podane w tabeli 6 nie są wydajnościami optymalnymi

Tabela 6

Doświadczenie	A	B	C	D
Czas (godziny)	5	4	2	1
Wydajność, Cex	~ 78%	> 95%	> 90%	> 90%
Powstała Cex / powstała D-PG	0,94	2,08	3,23	4,17

Przykład II. Synteza enzymatyczna cefaleksyny w obecności 2-naftolu i wyodrębnianie produktu

Wartość pH mieszaniny D-PGA 1/2 H₂S<0ą (74,7 g, 0,375 mola), 7-ADCA (21,4 g, 0,10 mola) i 2-naftolu (10,8 g, 0,075 mola) w około 400 ml wody nastawiono na 6,71 przez dodanie 4 M wodorotlenku amonowego. Następnie uzupełniono objętość do 450 ml wodą z dodatkiem rozpuszczalnej acylazy PenG z E. coli (50 ml, w przybliżeniu 345 U/ml, otrzyma12

170 842 nej z Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung, Braunschweig, Niemcy) i mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C.

Po upływie 3 godzin mieszaninę reakcyjną przefiltrowano na filtrze ze szkła spiekanego Stałą pozostałość przemyto octanem butylu (200 ml) a następnie przeprowadzono w stan zawiesiny w mieszaninie wody (150 ml) i octanu butylu (150 ml). Wartość pH nastawiono na 1,5 przez dodanie 3 M kwasu siarkowego i mieszano przez 10 minut. Następnie oddzielono fazę wodną od fazy octanu butylu i przemyto ją dalszymi porcjami octanu butylu (2 x 20 ml). Objętość fazy wodnej zmniejszono do 75 ml przez odparowanie, dodano 2-propanol (75 ml) i nastawiono wartość pH na 4,7 przez dodanie 4 M wodorotlenku amonowego. Otrzymaną zawiesinę ochłodzono do temperatury 5°C w ciągu 15 minut, po czym odsączono stałą substancję na filtrze ze szkła spiekanego i przemyto mieszaniną woda/2-propanol (1:1, 25 ml). Po wysuszeniu w piecu próżniowym w temperaturze 30°C w ciągu 12 godzin, otrzymano 33,8 g (92,5% wydajności teoretycznej) monohydratu cefaleksyny w postaci białego proszku (czystość oznaczona za pomocą HPLC: 99,8%).

Przykład III. Synteza enzymatyczna cefaleksyny w obecności 2-naftolu i z użyciem immobilizowanego enzymu, który może być zawracany do obiegu.

E. coli mające aktywność acylazy penicyliny G poddano fermentacji według Gebauer’a A. et. al. Bioprocess Engineering-2 (1987) 55-58. Immobilizację wykonano według Wupelmann’a M. et. al. US Patent No. 4 892 825 (ak w Novo Industri A/S). Substancję zawierającą immobilizowany enzym wytłoczono i wysuszono aż do zawartości wody resztkowej około 10% (wagowo). Wysuszoną substancję zmielono a po przesianiu zmielonego produktu przez odpowiednie sito otrzymano frakcję o rozkładzie wielkości cząstek w przedziale 100-200 gm. W tej frakcji stwierdzono aktywność enzymu w wysokości około 200 jednostek acylazy Penicyliny G/g. Po spęcznieniu w wodzie rozkład wielkości cząstek wynosił w przybliżeniu 200-500 μηι.

Wartość pH mieszaniny (zawiesiny) D-PGA 1/2 H2SO4 (74,7 g, 0,375 mola), 7-ADCA (21,4 g, 0,10 mola) i 2-naftolu (10,8 g, wielkość cząstek <100 gm) w około 300 ml wody nastawiono na 6,7 przez dodanie 4 M wodorotlenku amonowego. Następnie uzupełniono objętość do 400 ml wodą z dodatkiem immobilizowanej acylazy penicyliny G z E. coli otrzymanej w wyżej opisany sposób (50 g na suchym podkładzie w postaci zawiesiny w wodzie o objętości całkowitej 100 ml) i mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C.

Po upływie 3 godzin wylano mieszaninę na sito o wielkości otworów 100 gm, które zatrzymało cząstki niosące enzym a przepuściło pozostałą część mieszaniny reakcyjnej, będącą nadal zawiesiną. Zawiesinę przechodzącą przez sito fiitrowano przez filtr ze szkła spiekanego, który zatrzymał substancje stałe a część roztworu macierzystego użyto do przemycia substancji stałej zatrzymanej na sicie 100 (tm w celu uwolnienia cząstek enzymu od domieszki przywartej do nich drobnej zawiesiny zawierającej syntetyzowany produkt. Popłuczki przefiltrowano także przez ffltr ze szkła spiekanego. Produkt zebrany na filtrze szklanym przemyto octanem butylu (200 ml) a następnie sporządzono jego zawiesinę w mieszaninie wody (150 ml) i octanu butylu (150 ml). Wartość pH fazy wodnej nastawiono na 1,5 przez dodanie 3 M kwasu siarkowego i mieszano przez 10 minut. Następnie oddzielono fazę wodną od fazy octanu butylu i przemyto ją dalszymi porcjami octanu butylu (2 x 20 ml). Objętość fazy wodnej zredukowano do 75 ml przez odparowanie, dodano 2-propanolu (75 ml) i nastawiono wartość pH na 7,4 przez dodanie 4 M wodorotlenku amonowego. Otrzymaną zawiesinę ochłodzono do temperatury 5°C w ciągu 15 minut, po czym odsączono na filtrze ze szkła spiekanego i przemyto mieszaniną woda/2-propanol (1:1, 25 ml). Po wysuszeniu w piecu próżniowym w temperaturze 30°C w ciągu 12 godzin, otrzymano 33,6 g (92,4% wydajności teoretycznej) monohydratu cefaleksyny w postaci białego proszku (czystość oznaczona za pomocą HPLC: 99,9%).

Cząstki użytego enzymu, zatrzymane na sicie 100 gm, przemyto wodą (3 x 100 ml), odsączono i wysuszono do końcowej zawartości wody około 10%. Ważyły one w przybliżeniu

49,5 g a stwierdzona aktywność wynosiła około 198 jednostek acylazy Penicyliny G/g, co

170 842 wskazywało na to, że praktycznie nie nastąpiła strata aktywności. Tak więc immobilizowany enzym nadawał się do zawrócenia go do obiegu, np. w wyżej opisanym procesie.

Przykład IV. Synteza enzymatyczna cefadroksylu w obecności 2-naftolu.

Doświadczenia A i B wykonano w temperaturze 25°C.

Doświadczenie A (wzorzec).

D-HPGA (130 m moli) i 7-ADCA (40 m moli) rozpuszczono w wodzie. Dodano immobilizowany enzym (50 g, Eupergit PCA, 100 U/g (na mokro), nabyty w Róhm-Pharma) i zwiększono objętość do 200 ml przez dodanie wody, po czym nastawiono wartość pH na 6,4. Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie czasów podanych w tabeli 7 i zanalizowane za pomocą HPLC. Otrzymane wyniki zostały podane w tabeli 7.

Tabela 7

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/l) oznaczone za pomocą HPLC
	D-HPGA	7-ADCA	Cedroks	D-HPG
0,07	622	183	10,2	11
0,53	583	156	35,1	49
1,05	542	146	40,0	95
1,88	468	144	48,2	162
2,50	412	137	52,1	202
3,40	310	130	56,2	263
4,20	258	122	57,4	309
5,15	¹ 180	106	60,7	382

Doświadczenie B.

Wykonano w takich samych warunkach jak doświadczenie A, z wyjątkiem tego, że na początku doświadczenia dodano drobno zmielony 2-naftol (40 m moli). Reprezentatywne próbki mieszaniny reakcyjnej zawierające stałe składniki (poza enzymem) zostały pobrane po upływie czasów podanych w tabeli 8 i zanalizowane za pomocą HPLC. Otrzymane wyniki zostały podane w tabeli 8.

Tabela 8

Czas (godziny)	Stężenie (m moli/l) oznaczone za pomocą HPLC
	D-HPGA	7-ADCA	Cedroks	D-HPG
0,12	614	162	13,5	5
0,77	601	141	35,2	18
1,58	593	130	41,6	41
2,33	586	125	49,7	69
3,23	512	120	52,7	93
4,80	435	106	58,5	140
6,05	380	100	64,7	185

170 842

Stosunki ilościowe powstałego Cedroksu do ilości powstałej D-HPG uwzględniające niepożądane reakcje uboczne w doświadczeniach A i B są podane w tabeli 9. Liczny wskazują na to, ze efektywność zużywania się D-HPGA jako środka acylującego jest silnie zależna od warunków reakcji.

T abela 9

Doświadczenie A	Doświadczenie B
Czas (godziny)	Powstały cedroks/powstała D-HPG	Czas (godziny)	Powstały cedroks/powstała D-HPG
0,07	0,93	0,12	2,70
0,53	0,72	0,77	1,96
1,05	0,42	1,58	1,01
1,88	0,30	2,33	0,72
2,50	0,26	3,23	0,57
3,40	0,21	4,80	0,42
4,20	0,19	6,05	0,35
5,15	0,16

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania antybiotyków β-laktamowych zawierających rdzeń 7-amino8-keto-5-tia-1-aza-bicyklo[4.2.0]-okt-2-enowy na drodze acylowania enzymatycznego, znamienny tym, że proces tworzenia antybiotyku β-laktamowego prowadzi się w obecności naftalenu lub pochodnej naftalenu w mieszaninie reakcyjnej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że antybiotyk β-laktamowy wytwarza się przez acylowanie enzymatyczne rdzenia cefalosporynowego kwasem lub pochodną kwasu odpowiednimi dla żądanego łańcucha bocznego.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rdzeń antybiotyku β-laktamowego jest wybrany z grupy związków obejmującej kwas 7-amino-cefalosporanowy, kwas 7-amino-7-metoksycefalosporanowy, kwas 7-amino-3-metoksy-3-cefem-4-karboksylowy, kwas 7-aminodezacetoksycefalosporanowy, kwas 3-chloro-7-amino-3-cefem-4-karboksylowy, kwas 7-amino-3-(1,2,3-tnazol-4)-5-(-iiotiometylo)-3-cefem-4-karboksylowy i kwas 7-amino-3-[2-(5-metylo-1,2,3,4-tiadiazoli-ilo)tio-metylo]-3-cefem-4-karboksylowy.

4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako środek acylujący do wprowadzania łańcucha bocznego antybiotyku β-laktamowego stosuje się D-fenyloglicynę lub D-4-hydroksyfenyloglicynę albo amid, ester metylowy, ester etylowy, ester propylowy lub ester izopropylowy jednego z tych kwasów.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosowany enzym można sklasyfikować jako acylazę penicyliny lub jako hydrolazę ampicyliny.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się enzym z Escherichia coli, Acetobacterpasteunanus, Xanthomonas citrii, Kluyvera citoprohila. Bacillus megaterium lub Pseudomonas melanogenum.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosowany enzymjest immobilizowany.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząstki niosące immolbilizowany enzym oddziela się od reszty mieszaniny reakcyjnej, która zawiera stałe cząstki kompleksu powstałego antybiotyku β-laktamowego z naftalenem lub pochodną naftalenu i ewentualnie stałe cząstki jednego (lub wielu) innego (innych) składnika(ów) oraz ciecz, tworzące kompleks antybiotyku β-laktamowego ze stałymi cząstkami innego(ych) składnika(ów), jeżeli są takie cząstki, których wymiary są różne od wymiarów cząstek niosących enzym i filtruje się lub odwirowuje mieszaninę reakcyjną używając urządzeń, które zatrzymują składniki mające większe cząstki, niezależnie od tego, czy będą nimi cząstki niosące immolbilizowany enzym czy też inny(e) stały(e) składnik(i) a przepuszczają resztę mieszaniny.

9.Sposób według zastrz 1 albo 2, znamienny tym, że podczas powstawania cefalosporyny w mieszaninie reakcyjnej utrzymuje się wartość pH od około 2,5 do około 9, a zwłaszcza od około 4 do około 7,5, z zastrzeżeniem, że gdy cefalosporynę wytwarza się przez acylowanie in situ rdzenia cefalosporynowego wolnym kwasem łańcucha bocznego jako środkiem acylującym, wówczas wartość Ph wynosi od około 4 do około 9.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, żejako pochodną naftalenu stosuje się 2-naftol.

11 Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że stosunek molowy ilości naftalenu lub pochodnej naftalenu obecnego w mieszaninie reakcyjnej do ilości antybiotyku β-laktamowego obecnego w mieszaninie reakcyjnej wynosi co najmniej 0,45.

12. Sposób według zastrz. 1 albo 10, znamienny tym, że część naftalenu lub pochodnej naftalenu w mieszaninie reakcyjnej jest w postaci ciekłej.