PL168711B1 - Method of obtaining a recombinate of novel antibody encompassing the region of bonding the antigen of mouse's monoclonal antibody br 96 - Google Patents

Abstract

1 .Sposób wytwarzania rekombinatu nowego przeciwciala obejmujacego region wiaza- nia antygenu mysiego przeciwciala monoklonalnego BR 96 wykazujacego te sama specyfi- cznosc wiazania co przeciwcialo BR 96, znamienny tym, ze przylacza sie region wiazacy antygen pochodzacy z przeciwciala BR 96 z przynajmniej czescia drugiego bialka. PL1. A method of producing a recombinant novel antibody comprising the antigen binding region of the murine monoclonal BR 96 antibody having the same binding specificity as the BR 96 antibody, characterized in that an antigen binding region derived from the BR 96 antibody attaches to at least a portion of the second protein. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciała BR-96. Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rekombinantu przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego, przeciwciała monoklonalnego BR 96. Klasa nowych przeciwciał, do których należy wytwarzany sposobem według wynalazku rekombinant przeciwciała BR 96 zdolna jest do reagowania z ludzkimi komórkami rakowymi. Mysie przeciwciała monoklonalne reagują z antygenem błony komórkowej związanym z wieloma ludzkimi rakami, włącznie z rakami okrężnicy, piersi, jajników i płuc. Mysie przeciwciało monoklonalne jest w wysokim stopniu specyficzne wobec raków, nie przejawiając żadnej lub bardzo niską reaktywność wobec normalnych tkanek ludzkich lub innych typów nowotworowych, takich jak chłoniaki lub mięsaki. Przeciwciała te mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Przeciwciała BR 96 są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej ADCC, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności CDC. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotworowe, jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.The present invention relates to a method of recombinant production of the new BR-96 antibody. More particularly, the invention relates to a method of producing a recombinant antibody comprising a murine antigen binding region, monoclonal antibody BR 96. The class of novel antibodies to which the recombinant BR 96 antibody produced according to the invention belongs is capable of reacting with human cancer cells. Murine monoclonal antibodies react with the cell membrane antigen associated with many human cancers, including colon, breast, ovarian, and lung cancers. The murine monoclonal antibody is highly cancer specific, showing no or very little reactivity to normal human tissues or other neoplastic types such as lymphomas or sarcomas. These antibodies have several additional advantages. First, they are internalized into the cancer cells with which they bind. Thus, BR 96 antibodies are useful for therapeutic applications, for example, as the antibody component of antibody-drug or antibody-toxin conjugates where it is desired to internalize the conjugate. Second, the antibodies mediate the antibody dependent cellular cytotoxicity of ADCC, and the complement dependent cytotoxicity of CDC. Third, the antibodies in unconjugated form can kill antigen-positive tumor cells when sufficiently concentrated. The antibodies are also useful in diagnostic methods, such as in vitro or in vivo cancer detection.

Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość ukierunkowywania różnych czynników antynowotworowych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny. [Baldwin i Byers, (red.), w: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych, które posiadają bezpośrednio aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żadnego komponentu godpodarza [Drebin i in., Oncogene 2:387-394 (1988)].Monoclonal antibodies to human differentiating tumor associated antigens provide the ability to target various anti-tumor agents such as radioisotopes, chemotherapeutic drugs, and toxins. [Baldwin and Byers, (eds.), In: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, London, Academic Press (1985)]. Furthermore, an advantage of some monoclonal antibodies is the ability to kill tumor cells by ADCC or CDC in the presence of human effector cells or serum [Hellstrom et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)], and there are few monoclonal antibodies that directly possess anti-tumor activity independent of any host component [Drebin et al., Oncogene 2: 387-394 (1988)].

168 711168 711

Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1965); Allum i in., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41-64 (1986), 1 Houghton i in., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin, Oncol., 13(2): 165-79 (1986)].Many monoclonal antibodies are known to react with cancer associated antigens [see, e.g., Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom et al., Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1965); Allum et al., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18: 41-64 (1986), 1 Houghton et al., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin, Oncol., 13 (2): 165-79 (1986)].

Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami (patrz np. Fink i in., Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens, Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklinalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 737 579 (przeciwciała monoklonalne na nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 4 713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1 000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach. Wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 96% nie-drobnokomórkowych raków płuc [patrz Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72.3 Acta Cytol., l(5):537-56 (1987) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.]. Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, [patrz opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 708 930], rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400 - 500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych z którymi reagują.These known monoclonal antibodies can bind to a variety of cancer associated antigens including glycoproteins, glycolipids, and mucins (see, e.g., Fink et al., Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Characterization Of Human Tumor Antigens, Prog. Clin. Pathol., 9: 121-33 (1984)]. For example, monoclonal antibodies that bind to glycoprotein antigens on specific types of cancer include those described in U.S. Patent No. 4,737,579 (monoclonal antibodies for non-small cell lung cancer). U.S. Patent No. 4,753,894 (monoclonal antibodies for human breast cancer), U.S. Patent No. 4,579,827 (monoclonal antibodies for human gastrointestinal cancer), and U.S. Patent No. 4 713 352 (monoclonal antibodies against human kidney cancer). Monoclonal antibody B72.3, one of the most studied antibodies, recognizes a tumor-bearing mucin antigen with a molecular weight greater than 1,000 kd, which is specifically expressed on a wide variety of cancers. Thus, B72.3 has been shown to react with 84% of breast cancers, 94% of colon cancers, 100% of ovarian cancers and 96% of non-small cell lung cancers [see Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72 .3 Acta Cytol., 1 (5): 537-56 (1987) and U.S. Patent No. US No. 4,612,282 to Schloma et al.]. Another patented monoclonal antibody, KC-4, [see US Patent No. US No. 4,708,930], recognizes a protein antigen with a molecular weight of 400-500 kd expressed in numerous cancers such as colon, prostate, lung and breast cancer. It turned out that neither the B72.3 antibody nor the KC-4 antibody is internalized into the cancer cells with which they react.

Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2), Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monolonalnych specyficznych wobec asialo GM₂, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej który, jak ustalono, jest markerem komórek BALB/c V3T3 stansformowanych wirusem mięsaka mysiego Kirstein. Patrz także Kniep i in., Gangliotriaosylceramide (Asialo GH2) A Glysossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hadgkin's Disease, J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 507 391 ( przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).Monoclonal antibodies reactive with the glycolipid antigens associated with tumor cells are disclosed. For example, Young et al., Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions Of The Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2), Exp. Med., 150: 1008-1019 (1979) disclose the production of two monolonal antibodies specific for GM ₂ asialo, a glycosphingolipid cell-surface antigen which has been established to be a marker of BALB / c V3T3 cells transformed with Kirstein murine sarcoma virus. See also Kniep et al., Gangliotriaosylceramide (Asialo GH2) A Glysossphingolipid Marker For Cell Lines Derived From Patients With Hadgkin's Disease, J. Immunol., 131 (3): 1591-94 (1983) and US Pat. US No. 4,507,391 (monoclonal antibody to human melanoma).

Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies, Cancer Research, 44:2052-61 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc). Varki'ego i in., Antigens Associated With a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Cancer Research 44:681-67 (1984); (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., Antitumor Effects Of L6. An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.Other monoclonal antibodies that react with glycolipid antigens on cancer cells include those described by Rosen et al., Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies, Cancer Research, 44: 2052-61 (1984) (monoclonal antibodies on human small cell lung cancer). Varki et al., Antigens Associated With a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Cancer Research 44: 681-67 (1984); (monoclonal antibodies to human lung, gastric and colon adenocarcinoma and melanoma) and US Pat. US No. 4,579,827 (monoclonal antibodies to human colon adenocarcinoma). See also Hellstrom et al., Antitumor Effects Of L6. An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7059-63 (1986), which describe an L6 monoclonal antibody recognizing a carbohydrate antigen expressed on the surface of human non-small cell lung cancer, breast cancer, and colon cancer.

Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powoduAdditional monoclonal antibodies showing high specific reactivity against most cells from a wide range of cancers are very much needed. This is because of

168 711 heterogenności antygenowej wielu raków, które często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała internalizowane, tj. przeciwciała łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwnowotworowy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi, wobec którego jest ono reaktywne i uwalnia czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np. Embleton i in., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi nie są zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych, z którymi się wiążą, i na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłoby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne podejścia aby można użyć w terapii takie przeciwciała.The antigenic heterogeneity of multiple cancers, which often requires the use of multiple different monoclonal antibodies for the same tumor in diagnosis or therapy. There is a further need, especially in therapy, for so-called internalized antibodies, i.e. antibodies readily taken up by the tumor cells to which they bind. Antibodies of this type find use in therapeutic methods using antibody-drug or antibody-toxin conjugates in which the anti-neoplastic therapeutic agent is bound to the antibody for delivery to the tumor, where the antibody binds to a tumor associated antigen to which it is reactive and releases the agent. antitumor inside tumor cells [see, e.g., Embleton et al., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents in: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, pp. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Antibodies to tumor associated antigens are not capable of being internalized into the tumor cells to which they bind, and are generally not useful for preparing conjugates with anti-tumor drugs or toxins as they might not be able to reach their site of action in the cell. Other approaches may be required for such antibodies to be used in therapy.

Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in., Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol. 112:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyjny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach, i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek lub lub przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR 64.Several internalizable antibodies reactive with lymphocyte antigens are known. In contrast, such antibodies are rare when treating massive tumors. One of the few examples of an internalizable cancer-reactive antibody is the antibody disclosed in Domingo et al., Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol. 112: 238-47 (1985). This antibody reacts with the human transferrin receptor glycoprotein expressed on cancer cells. However, since the transferrous receptor is also expressed on many normal tissues, and often at high levels, the use of an anti-transferrin receptor antibody in an antibody-drug or antibody-toxin conjugate can have significant toxic effects on normal cells. The use of this antibody to specifically kill or inhibit cancer cells is therefore a moot point. Another internalizable antibody is BR 64.

Odkrycie rekombinacji homologicznej w komórkach ssaków pozwoliło na skierowanie nowych sekwencji do specyficznych loci chromosomalnych. Rekombinacja homologiczna występuje gdy hodowane komórki ssaków integrują egzogenny DNA chromosomalnym w miejscu chromosomu zawierającym sekwencje homologiczne do sekwencji plazmidowych [Folger i in., Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387 (1982); Folger i in., Symp. Quant. Biol. 49: 123-138 (1984): Kucherlapati i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153-3157 (1984); Lin i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1391-1395 (1985); de Saint Vincent i in., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 80:2002-2006 (1983); Shaul i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3781 -3784 (1985)]. Możliwość rekombinacji homologicznej w komórkach pozwala modyfikację genów endogennych in situ. Znaleziono warunki, w których sekwencje chromosomalne można modyfikować poprzez wprowadzanie do komórki plazmidowego DNA zawierającego odcinek DNA homologiczny do docelowego locus. i odcinek nowych sekwencji z pożądaną modyfikacją [Thomas i in., Cell 44: 419-428 (1986); Smithies i in., Nature 317 : 230-234 (1985); Smith i in., Symp. Quant. Biol. 49: 171-181 (1984)]. Wyniki rekombinacji homologicznej pomiędzy chromosomalnym DNA komórki ssaka i egzogennym DNA plazmidowym może być integracja plazmidu lub zastąpienie pewnych sekwencji homologicznymi sekwencjami plazmidowymi. Wynikiem tego może być umieszczenie pożądanej nowej sekwencji w endogennym locus docelowym.The discovery of homologous recombination in mammalian cells has led to the targeting of new sequences to specific chromosomal loci. Homologous recombination occurs when cultured mammalian cells integrate exogenous chromosomal DNA at a chromosomal site containing sequences homologous to the plasmid sequences [Folger et al., Mol. Cell. Biol. 2: 1372-1387 (1982); Folger et al., Symp. Quant. Biol. 49: 123-138 (1984): Kucherlapati et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3153-3157 (1984); Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1391-1395 (1985); de Saint Vincent et al., Proc. Natl. Acad. Aci. USA 80: 2002-2006 (1983); Shaul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3781-3784 (1985)]. The possibility of homologous recombination in cells allows the modification of endogenous genes in situ. Conditions have been found under which chromosomal sequences can be modified by introducing into a cell plasmid DNA containing a DNA segment homologous to the target locus. and a stretch of new sequences with the desired modification [Thomas et al., Cell 44: 419-428 (1986); Smithies et al., Nature 317: 230-234 (1985); Smith et al., Symp. Quant. Biol. 49: 171-181 (1984)]. The results of homologous recombination between the chromosomal DNA of the mammalian cell and the exogenous plasmid DNA may be plasmid integration or the replacement of certain sequences with homologous plasmid sequences. This may result in the placement of a desired new sequence at the endogenous target locus.

Sposób rekombinacji homologicznej oceniano przy użyciu genów umożliwiających selekcję dominantów, takich jak NEO lub HPRT dla kilku typów komórek [Song i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987); Rubinitz i Subramani. Mol. Celi Biol. 6: 1608-1614 (1986); i Liskay, Celi 35: 157-164 (1983)].The method of homologous recombination has been evaluated using genes allowing selection of dominants such as NEO or HPRT for several cell types [Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6820-6824 (1987); Rubinitz and Subramani. Moth. Cell Biol. 6: 1608-1614 (1986); and Liskay, Cell 35: 157-164 (1983)].

Najbardziej bezpośrednią drogą klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się. że większość przeciwciał monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała mono168 711 klonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródło dopełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki Nk lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych Cr nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.The most direct route of clinical use of anti-tumor monoclonal antibodies is to administer them unmodified, using monoclonal antibodies showing anti-tumor activity in vitro or in animal models. Seems. that most monoclonal antibodies to tumor antigens do not possess any anti-tumor activity, but certain clonal monoclonal antibodies are known to mediate complement-dependent cytotoxicity (CDC), i.e. killing human tumor cells in the presence of human serum as a source of complement [see e.g. Hellstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)], or antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) together with effector cells such as human NK cells or macrophages. To detect ADCC or CDC activity, the ability of the monoclonal antibodies to lyse cultured Cr-labeled tumor target cells is tested over a 4-hour incubation period.

Komórki docelowe znakuje się ⁵¹Cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomiędzy 0,1 gg/ml a 10 gg/ml. Jako dowód lizy komórek nowotworowych (cytotoksyczności) mierzy się uwalnianie ⁵¹Cr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, lub z albo limfocytami albo przeciwciałem momoklonalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość ⁵¹Cr, który może zostać uwolniony i oblicza ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczoną 1 : 3 do 1 : 6).Target cells are labeled with ⁵¹ Cr and then exposed for 4 hours to a combination of effector cells (in the form of human lymphocytes purified by the use of lymphocyte separating medium) and antibodies, which are added at concentrations between 0.1 gg / ml and 10 gg / ml. As evidence of tumor cell lysis (cytotoxicity), ⁵¹ Cr release from target cells is measured. Controls include the incubation of the target cells alone, or with either the lymphocytes or the momoclonal antibody separately. The total amount of ⁵¹ Cr that can be released is measured and ADCC calculated as the percentage of target cell killing observed with the monoclonal antibody plus effector cells compared to incubated target cells alone. The procedure for CDC is identical to that used to detect ADCC except that human serum is added as a complement source (diluted 1: 3 to 1: 6) in place of the effector cells.

Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vivo. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako nośniki czynników przeciwnowotworowych, zazwyczaj są nieskuteczne. Zdolność przeciwciała monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu, ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., Immunological Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, w: Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15-18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotopy IgG2a i IgG3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak i CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotworowe z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne aby prowadziły do wpływów toksycznych jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.The therapeutic use of monoclonal antibodies with ADCC or CDC activity is contemplated because they often have anti-tumor activity in vivo. On the other hand, antibodies lacking in vitro ADCC and CDC activity, in vivo, unless used as carriers for anti-tumor agents, are usually ineffective. The ability of the monoclonal antibody to activate host complement may be therapeutically beneficial not only because tumor cells can be killed, but also because the blood supply to the tumor may increase, thus facilitating drug uptake [see Hellstrom et al., Immunological Approaches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, and Anti-Idiotypes, in: Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash and Rodwell, eds. Marcel Dekker, pp. 15-18 (1989)]. Among murine monoclonal antibodies, the IgG2a and IgG3 isotopes are most commonly associated with ADCC and CDC. Antibodies having both ADCC and CDC activity with high specificity kill only the tumor cells to which they bind and are unlikely to lead to toxic effects if they bind unspecifically in the lung, liver or other organs. This may provide such antibodies with an advantage over radiolabeled antibodies or certain types of immunoconjugate.

Bardzo nieliczne przeciwciała same są zdolne do zabijania komórek nowotworowych, to jest w nieobecności komórek efektorowych lub dopełniacza jak w ADCC lub CDC. BR 96 jest takim przeciwciałem, ponieważ może ono samo zabijać komórki przy stężeniu przeciwciała około 10 gg/ml lub wyższym. Przeciwciała takie są szczególnie interesujące ponieważ mogą one interferować z pewnymi kluczowymi zdarzeniami w przeżywaniu komórek nowotworowych.Very few antibodies alone are capable of killing tumor cells, i.e. in the absence of effector cells or complement as in ADCC or CDC. BR 96 is such an antibody because it can kill cells by itself at an antibody concentration of about 10 g / ml or higher. Such antibodies are of particular interest because they can interfere with certain key events in the survival of cancer cells.

Jest zatem oczywiste, ze przeciwciało, które przejawia wyższych stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowotworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.It is therefore evident that an antibody that exhibits a higher degree of specificity for a wide range of cancers, has antitumor activity itself and is capable of being readily internalized by tumor cells, can be of great benefit in tumor therapy.

Intemalizowane przeciwciała o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków a bardziej szczegółowo, nowe przeciwciała oznaczone jako przeciwciała BR 96, są mysim przeciwciałem monoklonalnym wiążącym się z antygenem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z raka piersi płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną reaktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki. Ponadto, przeciwciała te intemalizowane są przez komórki rakowe, z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieskoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR 96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeuty6Intemalized antibodies with high specificity against a range of human cancers, and more particularly, the new antibodies designated as BR 96 antibodies, are a murine monoclonal antibody that binds to a cell membrane antigen found on human cancer cells. The antibodies are highly reactive with cancer cells such as those obtained from lung, colon, and ovarian breast cancer without or with limited reactivity with normal human cells or with other types of cancer such as lymphomas or sarcomas. Moreover, these antibodies are intemalised by the cancer cells to which they bind and are capable of killing the cancer cells themselves, i.e. in unconjugated form and without effector cells or complement. The BR 96 antibodies are therefore particularly useful in therapist applications6

168 711 cznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworowymi, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnowotworowe, włącznie z lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosować jako składnik różnych immunokoniugatów, włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczegółowo korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotworu. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro in vivo.They are active, for example, to react with tumor cells, and in conjugates as a target-specific carrier of various agents with anti-tumor effects, including chemotherapeutic drugs, toxins, immune response modulators, enzymes, and radioactive isotopes. Thus, antibodies can be used as a component of a variety of immunoconjugates, including antibody-drug and antibody-toxin conjugates, where it is particularly advantageous to internalize the conjugate and, after radiolabelling, deliver it to the tumor. In addition, the antibodies are useful in in vitro and in vivo diagnostic methods for cancer detection.

Figura 1 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR 96 wobec glikolipidów, jak opisano w przykładzie II.Figure 1 is a bar graph of the results of BR 96 reactivity testing against glycolipids as described in Example II.

Figura 2 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR 96 wobec neoglikoprotein, jak opisano w przykładzie II.Figure 2 is a bar graph of the results of BR 96 reactivity testing against neoglycoproteins as described in Example II.

Figura 3 jest wykresem przedstawiającym wpływy przeciwnowotworowe niezmodyfikowanego BR 96 na linię komórek nowotworowych H2987, jak opisano w przykładzie III.Figure 3 is a graph showing the anti-tumor effects of unmodified BR 96 on the H2987 tumor cell line as described in Example III.

Figura 4 jest wykresem słupkowym ilustrującym nieobecności nowotworów przy końcu leczenia zwierząt traktowanych BR 96, jak opisano w przykładzie III.Figure 4 is a bar graph illustrating the absence of tumors at the end of treatment in BR 96 treated animals as described in Example III.

Figura 5 przedstawia wpływ dawek przeciwciała BR 96 po implantacji komórek H2707, określane poprzez objętość nowotworu, jak opisano w przykładzie III.Figure 5 shows the effect of doses of BR 96 antibody after H2707 cell implantation, determined by tumor volume, as described in Example III.

Przeciwciała BR 96 stosować można do izolowania i charakteryzowania antygenów z którymi się one wiążą. A zatem, przeciwciała BR 96 można stosować jako sondy do identyfikacji i charakteryzowania rozpoznawanych epitopów i do dalszego określania antygenów z którymi one reagują [patrz np. Nudelman i in., Characterization of Human Melanoma-Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2, J. Biol. Chem. 257 (1) 12752-56 (1982) iHakomori. Tumor Associated Carbohydrate Antigens, Ann. Rev. Immunol., 2:103-26 (1984)].BR 96 antibodies can be used to isolate and characterize the antigens to which they bind. Thus, BR 96 antibodies can be used as probes to identify and characterize recognized epitopes and to further define the antigens with which they react [see, e.g., Nudelman et al., Characterization of Human Melanoma-Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2, J. Biol. Chem. 257 (1) 12752-56 (1982) and Hakomori. Tumor Associated Carbohydrate Antigens, Ann. Rev. Immunol., 2: 103-26 (1984)].

Wyniki wstępnych poszukiwań epitopów przeprowadzonych z przeciwciałem monoklonalnym wskazywały, że antygen na komórkach rakowych, z którym one się wiążą jest fukozylowaną odmianą antygenu Lewis Y. Antygen Lewis Y (Le^y) został opisany przez Abe i in., J. Biol. Chem. 258: 8934 (1983): Lloyd i in., Immunogenetics 17: 537 (1983); Brown i in., Biosci. Rep. 3: 163 (1983); Hellstrom i in., Cancer Res. 46: 3917 (1986). Fukozylowany antygen Lewis Y został opisany przez Abe i in., Caner Res. 46: 2639-2644 (1986).Initial epitope searches performed with the monoclonal antibody indicated that the antigen on the cancer cells to which they bind is a fucosylated variant of the Lewis Y antigen. The Lewis Y (Le ^y ) antigen has been described by Abe et al., J. Biol. Chem. 258: 8934 (1983): Lloyd et al., Immunogenetics 17: 537 (1983); Brown et al., Biosci. Rep. 3: 163 (1983); Hellstrom et al., Cancer Res. 46: 3917 (1986). A fucosylated Lewis Y antigen is described by Abe et al., Caner Res. 46: 2639-2644 (1986).

Przeciwciało monoklonalne można wytwarzać stosując dobrze znane techniki z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz, Kohler i Milstein, Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256: 495-97 (1975). Patrz także Brown i in., Structural Characterisation Of Humon Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown i in., Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 255: 4980-83 (1980); Yeh i in., Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979); i Yeh i in., A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Gangliside Fraction And Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer. 29: 269-75 (1982)].A monoclonal antibody can be produced using well known hybridoma techniques first introduced by Kohler and Milstein [see Kohler and Milstein, Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature, 256: 495-97 (1975). See also, Brown et al., Structural Characterization Of Humon Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown et al., Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation with Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 255: 4980-83 (1980); Yeh et al., Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (6): 297-31 (1979); and Yeh et al., A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Gangliside Fraction And Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer. 29: 269-75 (1982)].

Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy), tak aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie, limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukującego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zostosować można każdą z licznych linii komórek szpiczaka, na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1Ag4-1, P3-x63-Ag8 lub Sp2/0 Ag 14. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection, (ATCC) w Rockville, Maryland.These techniques include injection of an immunogen (e.g., antigen-bearing cells or cell extracts or purified antigen) to an animal (e.g., a mouse) so as to elicit a desired immune response (i.e., an antibody) in the animal. After an appropriate period of time, antibody-producing lymphocytes are obtained from the animal, either from the spleen, lymph nodes or peripheral blood. Preferably, the lymphocytes are obtained from the spleen. The spleen-derived lymphocytes are then fused to the myeloma cell line, usually in the presence of a fusion-inducing agent such as polyethylene glycol (PEG). According to standard techniques, any of a number of myeloma cell lines may be used for fusion, for example the myeloma lines P3-NS1 / 1Ag4-1, P3-x63-Ag8, or Sp2 / 0 Ag 14. These lines are available from the American Type Culture Collection. (ATCC) in Rockville, Maryland.

Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodo168 711 wać w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolownych klonów. Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in vitro i in vivo (w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki [patrz Fink i in., supra str. 123, Fig. 6-11]. Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalnych obejmują wytwarzanie siarczanem amonu, chromatografię jonowymienną i chromatografię powinowactwa [patrz np. Zola i in., Techniques For The Production And Charakterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, w: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRC Press 1982)].The obtained cells, including the desired hybridomas, are then grown on a selective medium, such as HAT medium, in which unfused parental myeloma cells, or optionally lymphocytes, die. Only the hybridoma cells survive, and they can be grown under restrictive conditions to obtain isolate clones. Hybridoma supernatants are tested for the presence of antibodies with the desired specificity, e.g. by immunoassay techniques using the antigen that was used for immunization. The positive clones can then be subcloned under restrictive conditions and the monoclonal antibodies produced can be isolated. Hybridomas generated according to these methods can be propagated in vitro and in vivo (in ascites fluid from the peritoneal cavity) using known techniques [see Fink et al., Supra p. 123, Figs. 6-11]. Common methods for purifying monoclonal antibodies include ammonium sulfate production, ion exchange chromatography, and affinity chromatography [see, e.g., Zola et al., Techniques For The Production And Characterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, in: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (ed. ), pp. 51-52 (CRC Press 1982)].

Przeciwciało monoklonalne oznaczone BR 96, wytworzono poprzez opisane tu poniżej techniki z wykorzystaniem hybrydom stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę BR 96, przygotowaną jak opisano tu poniżej i wytwarzająca przeciwciało BR 96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana: BR 96 ArCC Nr identyfikacyjny: HB 10036.The monoclonal antibody designated BR 96 was produced by the hybridoma techniques described herein below using the breast cancer cell line 3396 as an immunogen. The BR 96 hybridoma, prepared as described herein below and producing the BR 96 antibody, was deposited on February 22, 1989 at the ATCC, where it is as follows identification method: BR 96 ArCC Identification no .: HB 10036.

Przeciwciało BR 96 należy do podklasy IgG3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR 96 nie przejawia wiązania z innymi typami komórek nowotworowych, takich jak linie komórkowe komórek T chłoniaka, CEM i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłoniaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR 96 może być internalizowane przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne wobec antygenododatnich komórek nowotworowych, pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo, tj. w formie niezmodyfikowanej, jest cytotoksyczne. Przeciwciała BR 96 wydają się rozpoznawać antygen Le^y.The BR 96 antibody belongs to the IgG3 subclass. The antibody is highly specific for cancer cells in a variety of organs, for example breast, lung, colon and ovarian cancers, as well as cultured cell lines established from a variety of breast, lung and colon cancers. In addition, the BR 96 antibody does not bind to other types of cancer cells such as the lymphoma T cell lines, CEM and MOLT-4, the P3HR-1 lymphoma B cell line, and melanoma cell lines. The BR 96 antibody can be internalized by antigen-positive tumor cells, is toxic to antigen-positive tumor cells, mediates ADCC and CDC activity, and is surprisingly cytotoxic by itself, i.e. in unmodified form. The BR 96 antibodies appear to recognize the Le ^y antigen.

Poprzez trawienie pepsyną oczyszczonego BR 96, można wytwarzać fragmenty F(ab')2 przeciwciałamonoklonalnego BR 96 [Nisonoff i in., The Antibody Molecule, Academic Press, New York (1975)]. Wykazano, że wiązanie fragmentów F(ab')2 z komórkami nowotworowymi (3396) i MCF7 porównywalne jest z wiązaniem całego przeciwciała monoklonalnego BR 96.By pepsin digestion of purified BR 96, F (ab ') 2 fragments of monoclonal antibody BR 96 can be generated [Nisonoff et al., The Antibody Molecule, Academic Press, New York (1975)]. The binding of F (ab ') 2 fragments to tumor cells (3396) and MCF7 has been shown to be comparable to that of the whole monoclonal antibody BR 96.

Używany tutaj termin przeciwciało BR96 obejmuje całe, nianaruszone przeciwciała poliklonalne monoklonalne, takie jak mysie przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydomę ATCC Nr HB 10036. Opisane powyżej przeciwciało BR 96 obejmuje wszystkie jego fragmenty zawierające aktywny region wiązania antygenu przeciwciała, takie jak fragmenty Fab, F(ab')2 i Fv, stosując dobrze znane techniki [patrz np. Rouseaux i in., Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different TRat IgG Subclasses w: Methods Enzymol., 121: 663-69 (Academic Press 1986)].The term BR96 antibody as used herein includes whole, intact polyclonal monoclonal antibodies, such as the murine monoclonal antibody produced by the ATCC hybridoma No. HB 10036. The BR 96 antibody described above includes all fragments thereof containing an active antibody antigen-binding region, such as Fab, F (ab ') 2 and Fv using well known techniques [see, e.g., Rouseaux et al., Optimal Conditions For The Preparation of Proteolytic Fragments From Monoclonal IgG of Different TRat IgG Subclasses in: Methods Enzymol., 121: 663-69 (Academic Press 1986 )].

Ponadto stwierdzono, że przeciwciało BR 96 nie przejawia żadnego immunohistologicznie wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serce, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR 96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrami, i wiąże się z komórkami gronistymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem, przeciwciało BR 96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwnowotworowe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i in., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash/Rodwell (red.), str. 1-39 (Mercell Dekker, Inc., 1989) i Bagshawe, Tumor Markers - Where Do We Go From Here, Br. J. Cancer, 48: 167-75 (1983)].Moreover, the BR 96 antibody was found to exhibit no immunohistologically detectable binding to normal human tissues from major organs such as kidney, spleen, liver, skin, lung, breast, colon, brain, thyroid, heart, lymph nodes or ovaries. The antibody also does not bind to peripheral blood leukocytes. The BR 96 antibody exhibits limited binding to certain cells in the tonsils and testes, and binds to acinar cells in the pancreas and to epithelial cells in the stomach and esophagus. Thus, the BR 96 antibody outperforms the most known anti-cancer antibodies in a high degree of specificity for tumor cells compared to normal cells [see e.g. Hellstrom et al., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines, And Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash / Rodwell (eds.), Pp. 1-39 (Mercell Dekker, Inc., 1989) and Bagshawe, Tumor Markers - Where Do We Go From Here, Br. J. Cancer, 48: 167-75 (1983)].

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinantu nowego przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 wykazującego tę samą specyficzność wiązania co przeciwciało BR 96, polegający na tym, że przyłącza się region wiążący antygen pochodzący z przeciwciała BR 96 z przynajmniej częścią drugiego białka.The invention relates to a method of producing a recombinant new antibody comprising the antigen binding region of the murine monoclonal antibody BR 96 having the same binding specificity as the BR 96 antibody, wherein the antigen binding region derived from the BR 96 antibody is attached to at least a portion of a second protein.

168 711168 711

Korzystnie jako drugie białko stosuje się białko ludzkie, przy czym jako drugie białko stosuje się białko wykazujące aktywność przeciwnowotworową i region wiążący antygen przeciwciała BR 96 łączy się z co najmniej funkcjonalnie czynną częścią tego drugiego białka. Jako drugie białko można stosować białko wybrane z grupy obejmującej enzymy, limfokiny, onkostatyny i toksyny, korzystnie stosuje się region wiążący antygen BR 96 rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę α1-3 wariantu antygenu Le^y.Preferably, a human protein is used as the second protein, a protein exhibiting anti-tumor activity is used as the second protein and the antigen binding region of the BR 96 antibody binds to at least a functionally active portion of the second protein. As the second protein, a protein selected from the group consisting of enzymes, lymphokines, oncostatin and toxins may be used, preferably the BR 96 antigen binding region recognizing part of an epitope containing the α1-3 fucose of the variant Le ^y antigen ^{is used} .

Przeciwciała te posiadają taką samą specyficzność antygenową co przeciwciała BR 96. lecz różniące się pochodzeniem gatunkowym, izotypem, powinowactwem wiązania lub funkcjami biologicznymi (np. cytotoksycznością). Można na przykład skonstruować klasy, izotypy lub inne warianty przeciwciał otrzymywanych sposobem według wynalazku posiadające region wiązania antygenu przeciwciała BR 96 stosując znane techniki rekombinacyjne zmiany klasy i tworzenia fuzji [patrz np. Thammana i in., .Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In a Hibridoma, Eur. J. Immunol., 13· 614 (1983); Spira i in., The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay, J. Immunol. Meth. 74: 307-15 (1984); Neuberger i in., Recombinant Antibodies Possessing Novel Effector Functions, Nature 312: 604-608 (1984); i Oi i in., Chimeric Antibodies, Biotechniques, 4 (3): 214-21 (1986)].These antibodies have the same antigen specificity as BR 96 antibodies but differ in species origin, isotype, binding affinity, or biological function (e.g. cytotoxicity). For example, classes, isotypes, or other variants of the antibodies of the invention having the antigen binding region of the BR 96 antibody can be constructed using known recombinant class switching and fusion forming techniques [see, e.g., Thammana et al., Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In a Hibridoma, Eur. J. Immunol., 13, 614 (1983); Spira et al., The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ELISA Assay, J. Immunol. Meth. 74: 307-15 (1984); Neuberger et al., Recombinant Antibodies Possessing Novel Effector Functions, Nature 312: 604-608 (1984); and Oi et al., Chimeric Antibodies, Biotechniques, 4 (3): 214-21 (1986)].

Rekombinant przeciwciała BR 96 użyteczny jest także do zastosowań diagnostycznych, zarówno in vitro jak i in vivo, do wykrywania ludzkich raków posiadających antygen wobec którego przeciwciała są specyficzne. Metody diagnostyczne in vitro obejmują immunohistologiczne wykrywanie antygenów komórek nowotworowych (np. na tkance ludzkiej, komórkach lub wyciętych próbkach nowotworów) lub serologiczne wykrywanie antygenów towarzyszących nowotworom (np. w próbkach krwi lub innych płynów biologicznych).The recombinant BR 96 antibody is also useful for diagnostic applications, both in vitro and in vivo, to detect human cancers having an antigen for which the antibodies are specific. In vitro diagnostic methods include immunohistological detection of tumor cell antigens (e.g., on human tissue, cells, or resected tumor specimens) or serological detection of tumor associated antigens (e.g., in blood or other biological fluids).

Techniki immunohistochemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, rekombinantem przeciwciała Br 96 a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skompleksowanego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takie jak techniki immunoenzymatyczne, np. technikę awidyna-biotyna (ABC), lub techniki immunoflourescencyjne [patrz np. Ciocca i in., Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies, Meth. Enzymol. 121: 562-79 (1986); Hellstrom i in., Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Research, 46: 3917-23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immunology (wyd. II), str. 113-117 (Macmillan Pub. Co. (1986)].Immunohistochemical techniques involve staining biological samples, such as tissue samples, with recombinant Br96 antibody, and then detecting the presence of the antibody complexed with its antigen on the sample. The formation of such antibody-antigen complexes with the sample indicates the presence of cancer cells in the tissue. Detection of an antibody on a sample can be performed using known techniques such as enzyme immunoassay techniques, e.g., the avidin-biotin (ABC) technique, or immunofluorescence techniques [see, e.g., Ciocca et al., Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies, Meth. Enzymol. 121: 562-79 (1986); Hellstrom et al., Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Research, 46: 3917-23 (1986); and Kimball (eds.), Introduction To Immunology (II Ed.), pp. 113-117 (Macmillan Pub. Co. (1986)].

Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały zrzucone do surowicy lub innych płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmunologiczne (RIA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecności antygenu w próbce płynu [patrz np. Uotila i in., Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48,51]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR 96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR 96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. A zatem jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR 96 stosować można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen-przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA, zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in. (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].Serological diagnostic techniques include the detection and quantification of associated antigens of tumors that have been secreted or have been shed into the serum or other biological fluids of cancer patients. Such antigens can be detected in body fluids using known techniques such as radioimmunoassays (RIAs) or ELISAs, in which an antibody reactive with the discharged antigen is used to detect the presence of the antigen in the fluid sample [see, e.g., Uotila et al., Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) and Allum et al., Supra at pp 48.51]. These assays using the disclosed BR 96 antibodies can therefore be used to detect glycolipid antigens in biological fluids which react with BR 96 antibodies and thus detect human cancer in patients. Thus, as can be seen from the above data, BR96 antibodies can be used in most antigen-antibody assays. These assays include, but are not limited to, standard RIA techniques, both in liquid and solid phase, as well as ELISA assays, immunofluorescence techniques, and other immunocytochemical assays [see, e.g., Sikora et al. (eds.), Monoclonal Antibodies, pp. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 1984)].

Zestawy diagnostyczne jakie można wytwarzać do oznaczeń opisanych powyżej, zawierają przeciwciało monoklonalne BR 96, jego fragmenty, fuzję białek lub koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikamiThe diagnostic kits that can be generated for the assays described above include the BR 96 monoclonal antibody, fragments thereof, a protein fusion or a conjugate containing an antibody specific binding agent and a label capable of producing a detectable signal. The reagents may also contain auxiliary agents such as buffering agents and protein stabilizing agents (e.g., polysaccharides). The diagnostic kits can further include, where necessary, other signal triggering system components including factors

168 711 obniżającymi intergerencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu.168 711 to reduce interference with background, controls, or apparatus or container for testing.

Właściwości przeciwciała BR 96 oraz jego rekombinantów: a) bardzo wysoka specyficzność wobec komórek nowotworowych; b) internalizacja; c) toksyczność wobec antygenododatnich komórek nowotworowych samego przeciwciała, tj. w formie niezmodyfikowanej, jeśli używane jest w odpowiednich stężeniach; i d) aktywność CDC i ADCC, sugerują liczne zastosowania terapeutyczne in vivo. Przeciwciała można używać w połączeniu z odpowiednim czynnikiem terapeutycznym do traktowania raka ludzkiego. Na przykład, przeciwciało można użyć w połączeniu ze standardowymi lub konwencjonalnymi metodami leczenia, takimi jak chemioterapia, naświetlania, lub można skoniugować bądź związać z lekiem terapeutycznym lub toksyczną, jak również z limfokiną lub czynnikiem hamującym wzrost nowotworów w celu dostarczenia czynnika terapeutycznego do miejsca występowania raka. Techniki koniugowania takich czynników terapeutycznych z przeciwciałami są dobrze znane [patrz np. Amon i in., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, w: Monocklonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld i in. (red.), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i in., Antibodies For Drug Delivery, w: Controlled Drugi Delivery (2 wyd.), Robinson i in. (red.), str. 623-53 (Mercel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, w: Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera i in. (red.), str. 475-506 (1985); i Thorpe i in., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62:11958 (1982)]. Przeciwciało BR 96 jest szczególnie odpowiednie do stosowania w koniugacie terapeutycznym ponieważ jest ono łatwo internalizowane w komórkach rakowych z którymi się wiąże i może zatem dostarczać czynnik terapeutyczny do wewnątrzkomórkowych miejsc działania.Properties of the BR 96 antibody and its recombinants: a) very high specificity towards neoplastic cells; b) internalization; (c) the toxicity to antigen-positive tumor cells of the antibody itself, ie in its unmodified form, when used at appropriate concentrations; and d) CDC and ADCC activity suggest numerous therapeutic applications in vivo. The antibodies can be used in conjunction with an appropriate therapeutic agent for the treatment of human cancer. For example, the antibody can be used in conjunction with standard or conventional treatments, such as chemotherapy, radiation therapy, or can be conjugated or bound to a therapeutic or toxic drug, as well as to a lymphokine or tumor growth inhibitory agent to deliver the therapeutic agent to the site of the cancer. . Techniques for conjugating such therapeutic agents to antibodies are well known [see, e.g., Amon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, in: Monocklonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.) pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in: Controlled Drugi Delivery (2nd ed.), Robinson et al. (eds.) pp. 623-53 (Mercel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in: Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.) pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev., 62: 11958 (1982)]. The BR 96 antibody is particularly suitable for use in a therapeutic conjugate because it is readily internalized in the cancer cells to which it binds and can therefore deliver a therapeutic agent to intracellular sites of action.

Alternatywnie, przeciwciało BR 96 można sprzęgać z czynnikami o wysokoenergetycznym promieniowaniu, np. izotopem promieniotwórczym takim jak ¹³¹I; który, po umieszczeniu przy miejscu nowotworu, powoduje zabijanie kilku warstw komórek [patrz np. Order, Analysis, Resuls, And Future Perspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, w: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i in. (red.), str. 303-16 (Academic Press (1985)].Alternatively, the BR 96 antibody can be conjugated to agents with high energy radiation, e.g., a radioisotope such as ¹³¹ I; which, when placed at the tumor site, kills several layers of cells [see, e.g., Order, Analysis, Resuls, And Future Perspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, in: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. . (eds.) pp. 303-16 (Academic Press (1985)].

Jeszcze inne zastosowania terapeutyczne przeciwciała BR 96 oraz jego rekombinantu obejmują koniugację lub związanie, np. poprzez techniki rekombinacji DNA, z enzymem zdolnym do przekształcania proleksu w lek cytotoksyczny i zastosowanie tego koniugatu przeciw-ciało-enzym w kombinacji z prolekiem do przekształcania proleksu w czynnik cytotoksyczny w miejscu występowania nowotworu [patrz np. Senter i in., Anti-Tumor Effects Of Antibody-ałkaline Phosphatase, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etopside Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates, Cancer Research 49: 5789-5792 (1989); i Senter, Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4:188-193 (1990)]. Jeszcze inne zastosowanie terapeutyczne przeciwciała BR 96 obejmuje zastosowanie w obecności dopełniacza lub jako część koniugatu przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Zgodnie z tym podejściem, autologiczny szpik kostny można oczyścić ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik ponownie wszczepić pacjentowi [patrz np. Ramsay i in., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)].Still other therapeutic uses of the BR 96 antibody and its recombinant include conjugation or binding, e.g., by recombinant DNA techniques, to an enzyme capable of converting a prolex into a cytotoxic drug and the use of the antibody-enzyme conjugate in combination with a prodrug to convert the prolex into a cytotoxic agent. at the site of the tumor [see, e.g., Senter et al., Anti-Tumor Effects Of Antibody-alkaline Phosphatase, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4842-46 (1988); Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etopside Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates, Cancer Research 49: 5789-5792 (1989); and Senter, Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4: 188-193 (1990)]. Yet another therapeutic use of the BR 96 antibody includes the use in the presence of complement or as part of an antibody-drug or antibody-toxin conjugate to remove tumor cells from the bone marrow of cancer patients. According to this approach, autologous bone marrow can be purified ex vivo by antibody treatment and the marrow is re-implanted into a patient [see, e.g., Ramsay et al., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8 (2): 81-88 (1988)].

W celach terapeutycznych stosować można rekombinowane przeciwciała BR 96 otrzymane sposobem według wynalazku. Na przykład fuzję białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokiną lub onkostatyną, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo.For therapeutic purposes, recombinant BR 96 antibodies obtained by the method of the invention can be used. For example, a fusion protein comprising at least an antibody antigen binding region linked to at least a functionally active portion of a second protein having anti-tumor activity, e.g., a lymphokine or an oncostatin, can be used to treat human cancer in vivo.

Kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierają skuteczną farmaceutycznie ilość rekombinantu przeciwciała BR 96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.Pharmaceutical compositions for use in treating human cancers contain a pharmaceutically effective amount of the recombinant BR 96 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.

168 711168 711

Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących, lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystnie jest podawanie dożylne.The antibody compositions can be administered using conventional administration routes including, but not limited to, intravenous, intraperitoneal, oral, intra-lymphatic, or direct administration to the tumor. Administration is preferably intravenously.

Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków polimerycznych, mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.The antibody compositions can take a variety of dosage forms including, but not limited to, liquid solutions or suspensions, tablets, pills, powders, polymeric suppositories, microcapsules or microcapsules, liposomes, and injection or infusion solutions. The preferred form depends on the mode of administration and therapeutic application.

Kompozycje przeciwciał mogą zawierać także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu, i sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy.The antibody compositions may also contain conventional, pharmaceutically acceptable carriers and known adjuvants such as human serum albumin, ion exchangers, alumina, lecithin, buffer substances such as phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, and salts or electrolytes such as sulfate protamines.

Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania dla kompozycji zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta i odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, dawka skuteczna kompozycji przeciwciał może pozostawać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m².The most effective mode of administration and dosage for a composition depends on the course and severity of the disease, the health of the patient, and the response to treatment and judgment of the treating physician. Therefore, the dosage of the compositions should be determined for an individual patient. Nevertheless, an effective dose of the antibody compositions may be in the range of from about 1 to about 2000 mg / m ^2.

W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady. 'In order to provide a more complete understanding of the invention described herein, the following examples are provided below. '

Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR 96.Example 1. Production of the monoclonal antibody BR 96.

Monoklonalne przeciwciało BR 96 wytwarza się stosując technikę fuzji hybrydonowej, opisaną wcześniej przez M. Yeh. et al., Proc. Natl. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cancer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniano, stosując jako immunogen eksploatowane komórki hodowli gruczolakorakapiersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Leattle, Washington, St. Zjedn. Ameryki). Mysz otrzymała iniekcje przy pięciu okazjach, przy pierwszych czterech okazjach, mysz otrzymywała jedną iniekcją dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele myszy. Przy piątej okazji mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łączenie przy każdej okazji wstrzykiwano około 10⁷ komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMi. Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PRG) i pozwalano na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6:5511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyć hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów, powstałych w wyniku fuzji.The BR 96 monoclonal antibody is produced using the hybridon fusion technique previously described by M. Yeh. et al., Proc. Natl. Sci. USA (1979) supra and Yeh et al., Int. J. Cancer (1982) supra. Briefly, 3-month-old BALB / c mice were immunized using as an immunogen used human breast adenocarcinoma cells, designated 3396 or M 3396 (from a patient-derived breast adenocarcinoma, cultured in Oncogen, Leattle, Washington, US culture). The mouse was injected on five occasions, on the first four occasions, the mouse received one intraperitoneal injection and 1 subcutaneous injection at four sites on the mouse. On the fifth occasion, the mouse received only one intraperitoneal injection. Splicing Approximately ¹⁰⁷ cells were injected at each opportunity. Three days after the last inoculation, the mice were removed from the spleen and the spleen cells were suspended in RPMi culture medium. The spleen cells were then fused with mouse myeloma cells P3-X63-Ag 8.653 in the presence of polyethylene glycol (PRG) and the cells were allowed to grow in the wells of a microtiter plate in selective MAT medium as described in Yeh et al., Supra [see, Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975) and Eur. J. Immunol., 6: 5511-19 (1976)]. The mixture was seeded to form low density cultures derived from single cells or clones resulting from the fusion.

Supernatanty z tych hodowli hydrodomowych poddano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi, 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., EnzymeLinked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Produktion Using Enzyme - Labeled Second Antibody, Meth. Enzymol., 92: 168 74(1983).Supernatants from these hydrodome cultures were then screened to determine directly binding activity to the breast cancer cell line, 3396, and to the fibroblast cell line obtained by skin biopsy by ELISA, similar to that described in Donillard et al., EnzymeLinked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Produktion Using Enzyme - Labeled Second Antibody, Meth. Enzymol., 92: 168-74 (1983).

Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowanoz supematantami hybrydomowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było one wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Costar Cambrige, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2). Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą 100 μl świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutenowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 raz roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5%According to this assay, the antigen (with which the antibody was screened to determine its reactivity) was immobilized on microtiter plates and then incubated with hybridoma supernatants. If the supernatant contained the desired antibody, it was bound to the immobilized antigen and detected by addition of the anti-immunoglobulin enzyme conjugate and the enzyme antibody substrate, resulting in measurable changes in optical density. During the study, breast cancer cells or control fibroblast cells were placed in a 96-well tissue culture plate (Costar Cambrige, MA) and incubated overnight in a humid incubator at 37 ° C (5% CO2). The cells were then adjusted to a final well concentration of 0.5% with 100 μl of freshly prepared 1% gluten aldehyde and incubated for 15 minutes at room temperature, then washed three times with phosphate buffered saline (PBS) three times. Cells were then blocked for 30 minutes 5%

168 711 białkiem surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano supernatanty z hodowli hybrydomowych w ilości 100 gg/wgłębienie, zawarłośc wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1% BSA i PBS do stężenia 100 ).iwwj^^^ę:bie^ieie.168 711 bovine serum protein (BSA) in PBS and again washed three times with PBS. Then, the hybridoma supernatants were added at 100 gg / well, the contents of the wells were incubated for 1 hour at room temperature and the cells were washed three times with PBS. Goat anti-mouse horseradish peroxidase (Zymed, CA) diluted in 0.1% BSA and PBS to a concentration of 100 was then added. And wwj ^^^ e: bie ^ ieie.

Mieszaninę reakcyjną inkubowano albo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano o-fenylceodwuamieę (OPD) w ilości 100 gl/wgłębienie i płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywane poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 10 -10 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 gl H2SOwwgłęeiee ie i dokonano odczu tu abrbrbcncji na automatyeznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Aleksadria VA/Microelisa przy 490 nm.).The reaction mixture was incubated either for 1 hour at room temperature or for 30 minutes at 37 ° C, after which the cells were washed three times with PBS. O-phenylceodiamine (OPD) was then added at 100 µl / well and the plates were incubated in the dark at room temperature for 5-45 minutes. Cell-associated antibodies detected by discoloration in cavities, occurring within 10-10 minutes. The reaction was quenched by the addition of 100 µl of H 2 SO 2 deep and abrasion was felt on a Dynatech automatic reading device (Aleksadria VA / Microelisa at 490 nm).

Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomionego antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczano początkowo na płytkach w ilości 50 gl/wgłębienie w PBS i płytki przed rozpoczęciem próby inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, możnaje stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 10⁴ komórek w 50 gl/wgłębienie w pożywce hodowlanej i inkubowano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2).It should be noted that this assay can be performed using intact cells or purified soluble antigen or cell extracts in the form of an immobilized antigen. When soluble antigen or cell extracts were used as antigen, the antigen was initially placed on the plates at 50 µl / well in PBS and the plates were incubated overnight at room temperature before starting the assay. When intact cells are used as an antigen, they can be used fresh or immobilized. In each case, cells were first plated at 10 ⁴ cells per 50 µl / well in culture medium and incubated overnight in an incubator at 37 ° C (5% CO 2).

W ten sposób wyselekcjonowano hybrydomy wytwarzające przeciwciało wiązane przez linię komórkową raka piersi a nie przez komórki ludzkich fibroblastów i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej. Hybrydomy ujemne wobec PBLS klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.In this way, hybridomas producing an antibody bound by a breast cancer cell line and not by human fibroblast cells were selected and tested in a FACS cell sorting machine on peripheral blood leukocytes. PBLS negative hybridomas were cloned, expanded in vitro, and further tested for antibody specificity. Hybridomas producing antibodies reactive to human breast cancer were recloned, expanded and injected into primary sensitized 3-month-old BALB / c mice where they grew to cause ascites.

Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR 96, klonowane i wstrzykiwane myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR 96 zdeponowano w kolekcji aTCc. Monokloealne przeciwciała BR 96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, Ma). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważoną buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zobojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR 96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.Following the procedure described above, hybridomas of the BR 96 cell line were obtained, cloned and injected into mice to develop an ascites tumor. As previously disclosed, BR 96 hybridomas have been deposited in the aTCc collection. BR 96 monocloeal antibodies were purified from ascites fluids by affinity chromatography on immobilized recombinant protein A (Repligen, Cambridge, Ma). The clarified fluids were diluted with an equal volume of the binding buffer (1M potassium phosphate, pH 8) and applied to the protein A column, previously equilibrated with the binding buffer. The column was washed extensively with binding buffer and then the antibody was eluted with 50 mM phosphoric acid, pH 3. The purified fraction containing the antibody was neutralized with 1M Tris, pH 9, and then dialyzed against phosphate buffered saline. The purified BR 96 was finally sterile filtered and stored chilled or frozen.

Przykład II. Oznaczenie reaktywności BR 96 wobec glikolipidów i glikopi^otein.Example II. Determination of BR 96 reactivity towards glycolipids and glycopyrins.

Przeciwciało BR 96 bada się pod względem reaktywności wobec rozmaitych unieruchomionych antygenów glikolipidowych o znanej strukturze węglowodanowej i syntetycznych wlikoproteie (tak zwanych neoglikoprotein) przy zastosowaniu ELISA, przy czym glikolipidów i glikoprotein oraz przeciwciała używa się w nadmiarze [Dr John Magnatii, Bioca^, Gaithersburg, MD; Lloyd i in., Immunogenetics, 17, 537 - 541 (1983)]. Glikolipidy suszy się z metanolu w mikrolitrowych dołkach przy 10 ng/dołek. Syntetycznymi glikoproteinami powleka się powierzchnie dołków przez inkubację glikoproteiny rozcieńczonej do 200 ng/dołek w roztworze soli buforowanym fosforanami, pH 7,4. Oczyszczone przeciwciało BR 96 badane w stężeniu 10 gg/ml w 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4 zawierającym 1% BSA i 1% bydlęcej albuminy surowiczej, a przeciwciała z płynu puchlinowego w rozcieńczeniu 1: 100 w tym samym buforze. W tych wysokich stężeniach łatwo jest wykryć większość wiążących oddziaływań. Wartości aęsoręaecji oblicza się jako średnią z dwóch powtórkowych dołków. Wyniki analiz zostały przedstawione na figurach 1 i 2 i ujawniają one, że BR 96 reaguje z antygenem LcCThe BR 96 antibody is tested for reactivity to a variety of immobilized glycolipid antigens of known carbohydrate structure and synthetic polycoproteins (so-called neoglycoproteins) by ELISA, where glycolipids and glycoproteins and the antibody are used in excess [Dr John Magnatii, Bioca ^, Gasburg, MD; Lloyd et al., Immunogenetics, 17, 537-541 (1983)]. The glycolipids are dried from methanol in microlitre wells at 10 ng / well. Synthetic glycoproteins are coated on well surfaces by incubating glycoprotein diluted to 200 ng / well in phosphate buffered saline, pH 7.4. Purified BR 96 antibody tested at 10 gg / ml in 0.01 M Tris-HCl, pH 7.4 containing 1% BSA and 1% bovine serum albumin, and ascites fluid at a dilution of 1: 100 in the same buffer. At these high concentrations, most of the binding interactions are easily detected. Absorption values are calculated as the average of two duplicate wells. The results of the analyzes are shown in Figures 1 and 2 and reveal that BR 96 reacts with the LcC antigen

168 711168 711

Stwierdzenia te wskazują na to, że BR 96 może wiążąc się z wariantową postacią antygenu Lewis Y/Fuc a 1 -2Gal β 1 -4/ Fuca 2-3/GlcNAc i że fukoza a 1 -3 przyłączona do GlcNAc tworzy część epitopu pokrewnego Le^y rozpoznawanego przez BR 96. Wysoka swoistość BR 96 wobec nowotworu i zdolność intenalizowania się (nie opisana iprzednio dla przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z antygenami Le^y) sugeruje, że przeciwciało rozpoznaje epitop złożony, którego część obejmuje antygen Le^y.These findings indicate that BR 96 can bind to the variant form of Lewis Y / Fuc a 1 -2Gal β 1 -4 / Fuca 2-3 / GlcNAc antigen and that fucose a 1 -3 attached to GlcNAc forms part of the Le related epitope ^y recognized by BR 96. The high tumor specificity of BR 96 and the ability to intenalize (not previously described for monoclonal antibodies reactive with Le ^y antigens) suggests that the antibody recognizes a complex epitope, part of which includes Le ^y antigen.

Przykład III. Ocena działania przeciwciał BR 96 in vivo.Example III. In vivo evaluation of BR 96 antibodies.

Siłę działania terapeutycznego niemodyfikowanego przeciwciała BR 96 w leczeniu nowotworów zbadano w serii doświadczeń z użyciem ksenograftów ludzkiego nowotworu u bezwłosej myszy. Zbadano ponadto pewne parametry, które mogłyby mieć wpływ na skuteczność działania BR 96 jako środka przeciwnowotworowego. Do tych parametrów należą poziom ekspresji antygenu w linii komórek docelowego nowotworu, okres czasu pomiędzy implantacją nowotworu i zapoczątkowaniem terapii oraz wpływ dawki.The therapeutic potency of the unmodified BR 96 antibody in the treatment of tumors was tested in a series of experiments using human tumor xenografts in hairless mice. In addition, some parameters that could influence the effectiveness of BR 96 as an anti-cancer agent were investigated. These parameters include the level of antigen expression in the target tumor cell line, the time period between tumor implantation and initiation of therapy, and dose effect.

We wszystkich doświadczeniach in vivo określonej liczbie myszy Balb/c nu/nu (Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, Indiana, St. Zjedn. Ameryki) wszczepiono albo komórki z linii komórek ludzkiego raka gruczołowego płuc H2987, albo z linii nowotworu H2707. Komórki z tych linii nowotworowych, wyhodowane in vitro, zebrano, przemyto i wytworzono z nich ponownie suspensję w BPS, po czym każdej z myszy podano podskórnie 10 milionów komórek w boczną tylną część ciała. Myszy podzielono losowo na mniejsze grupy liczące po 8 - 10 zwierząt.In all in vivo experiments, a specified number of Balb / c nu / nu mice (Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, Indiana, US) were implanted with either cells from the human lung adenocarcinoma cell line H2987 or from the tumor line H2707. Cells from these tumor lines, cultured in vitro, were harvested, washed and resuspended in BPS, after which each mouse was injected subcutaneously with 10 million cells in the lateral posterior part of the body. The mice were randomized into smaller groups of 8-10 animals.

W celu zwiększenia szansy zaobserwowania wszelkich efektów działania BR 96, wziąwszy pod uwagę fakt, iż przeciwciało musi zlokalizować miejsce wszczepienia nowotworu, aby jakie kolwiek oddziaływanie rzeczywiście zaszło, terapię rozpoczęto w 24 godziny po wszczepieniu nowotworu, w dniu 2. Zarówno BR96, jak i kontrolny MAbs podawano w tej samej dawce i według tego samego planu, jakkolwiek w niektórych przypadkach następowały zmiany momentu zapoczątkowania terapii. Dawkę leczniczą w 0,2 ml PBs podawano dożylnie do żyły ogonowej myszy. Normalny plan obejmował podawanie dawki raz na trzy dni, ogółem 5 dawek (Q3Dx5). W dniu 19 i 21 od wszczepienia nowotworu H2987 w początkowym doświadczeniu przeprowadzono dodatkowe dwa wstrzyknięcia.In order to increase the chance of seeing any effects of BR 96, given that the antibody must locate the tumor site for any effect to actually take place, therapy was started 24 hours after tumor inoculation on day 2. Both BR96 and the control MAbs were administered at the same dose and schedule, although in some cases there were changes in the timing of initiation of therapy. The treatment dose in 0.2 ml of PBs was administered intravenously into the tail vein of mice. The normal schedule was once every three days for a total of 5 doses (Q3Dx5). On days 19 and 21 of tumor H2987 inoculation, two additional injections were performed in the initial experiment.

Działanie przeciwciała BR 96 na nowotwory 2987 i 2707.Action of the BR 96 antibody on tumors 2987 and 2707.

Objętość nowotworów u każdego zwierzęcia określano raz w tygodniu, przy czym pomiary rozpoczynano zazwyczaj w ósmym dniu po wszczepieniu. Objętość nowotworu obliczano na podstawie pomiarów długości i szerokości pionowej, według wzoru:Tumor volume for each animal was determined weekly, with measurements usually starting on the eighth day after implantation. Tumor volume was calculated from vertical length and width measurements as follows:

objętość nowotworu = największa długość x (pionowa szerokość²(2)tumor volume = greatest length x (vertical width ² (2)

Następnie obliczano wartości średnie dla grup i sporządzono wykresy w funkcji czasu od wszczepienia.Group mean values were then calculated and plotted as a function of time since implantation.

W początkowym doświadczeniu przedstawionym na fig. 3 w wyniku działania BR 96 uzyskano bardzo znaczące efekty pod względem działania przeciw linii komórek H2987. Jako negatywny środek kontrolny stosowano BR 64, które także ulega związaniu przez te komórki i jest przez nie intemalizowane. Nie zaobserwowano żadnego działania lub bardzo słabe działanie w porównaniu z działaniem wobec osobników kontrolnych traktowanych PBS.In the initial experiment shown in Figure 3, treatment with BR 96 resulted in very significant effects in terms of anti-H2987 cell lineage. BR 64 was used as a negative control and it also binds and is intemalised by these cells. No effect was observed or very little effect compared to that for PBS-treated controls.

W tabeli 1 zestawiono działanie wobec poszczególnych nowotworów pod koniec zabiegów w tym pierwszym doświadczeniu.Table 1 summarizes the effects on individual tumors at the end of the treatments in this first experiment.

Tabela 1Table 1

Wpływ działania niemodyfikowanego BR 96 podawanego w różnych okresach czasu od wszczepienia H2987, doświadczenie 1, dzień 28.Effect of unmodified BR 96 administered at various times after implantation with H2987, experiment 1, day 28.

Grupa Group MAb Has b Reakcja nowotworu Tumor reaction pełna full częściowa partial stała constant postęp progress 1 1 BR 96 BR 96 2 2 0 0 3 3 5 5 2 2 BR 64 BR 64 0 0 0 0 1 1 9 9 3 3 PBS PBS 0 0 0 0 0 0 10 10

168 711168 711

Tylko w wyniku działania przeciwciała BR 96 nowotwór zniknął całkowicie. Dwa zwierzęta z tej grupy były wolne od nowotworu, zaś trzy zwierzęta wykazywały ustanie wzrostu nowotworu po podziałaniu przeciwciała BR 96. Dwie myszy wolne od nowotworu wykazywały brak jego oznak przez czas trwania doświadczenia.Only as a result of the action of the BR 96 antibody has the tumor completely disappeared. Two animals in this group were tumor free, and three animals showed cessation of tumor growth upon treatment with BR 96 antibody. Two tumor free mice showed no tumor growth throughout the experiment.

Działanie przeciwnowotworowe przeciwciała BR 96 wobec nowotworów ustalonych. Jednym z celów końcowych terapii przeciwnowotworowej jest skuteczne zwalczanie nowotworów już ustalonych i rosnących. W celu stwierdzenia, czy BR 96 mogłoby mieć działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworowym, zastosowano ksenografty linii komórkowych H2987 i H2707 u bezwłosych myszy. Ze względów na to, że obie te linie nowotworowe dają wyczuwalne nowotwory po 8 dniach od podskórnego podania 10 milionów komórek, metoda badania działania przeciwnowotworowego wobec ustalonych nowotworów była oparta na opóźnieniu rozpoczęcia terapii.Antitumor activity of BR 96 antibody against established tumors. One of the end goals of anti-cancer therapy is to effectively combat established and growing cancers. To determine whether BR 96 could have an anti-tumor effect against an established tumor, xenografts of the H2987 and H2707 cell lines were used in hairless mice. Due to the fact that both of these tumor lines produce palpable tumors 8 days after subcutaneous administration of 10 million cells, the method of testing the antitumor activity against established tumors was based on delaying the initiation of therapy.

Tak więc w celu dalszego zbadania skuteczności niemodyfikowanego BR 96 przeprowadzono kilka dośwadczeń, w których zabiegi terapeutyczne rozpoczynano dopiero w 5 lub 8 dni od podskórnego wszczepienia nowotworu. Dzięki temu opóźnieniu rozpoczęcia zabiegów komórki nowotworowe miały czas na stanie się ustalonym nowotworem. W ten sposób uzyskuje się model zwierzęcy, którego leczenia jest trudniejsze, lecz stanowi on pełniejsze odzwierciedlenie rzeczywistej sytuacji klinicznej.Thus, in order to further investigate the efficacy of unmodified BR 96, several experiments were carried out in which therapeutic treatments were not initiated until 5 or 8 days after subcutaneous tumor inoculation. This delay in starting treatments gave the cancer cells time to become an established cancer. In this way, an animal model is obtained which is more difficult to treat, but which reflects more fully the actual clinical situation.

Protokół zabiegów przedsatwiono w tabeli 2. Trzem grupom myszy liczącym po 10 zwierząt podawano przeciwciało BR 96 począwszy od różnych dni w stosunku do dnia wszczepienia nowotworu. Myszy kontrolne dostawały albo FA6, albo PBS począwszy od dnia 2. FA6 jest mysim IgG3 skierowanym przeciw bakteryjnemu antygenowi nie występującemu u ssaków, działającemu jako niewiążące, negatywne kontrolne przeciwciało monoklonalne, zgodne z izotypem.The treatment protocol is shown in Table 2. Three groups of 10 mice each were dosed with BR 96 antibody starting on different days from the day of tumor inoculation. Control mice received either FA6 or PBS starting on day 2. FA6 is a murine IgG3 directed against a non-mammalian bacterial antigen acting as a non-binding negative monoclonal control monoclonal antibody, consistent with the isotype.

Te b e l a 2Te b e l a 2

Wpływ leczenia niemodyfikowanym BR 96 rozpoczynanego w różnych okresach czasu po wszczepieniu H2987 i H2707, zabiegi według planu Q3Dx5, i.v.Effect of treatment with unmodified BR 96 initiated at various times after implantation of H2987 and H2707, treatments according to the Q3Dx5 plan, i.v.

Grupa Group MAb Has b Dawka (mg) Dose (mg) Dni wstrzyknięć Injection days 1 1 BR 96 BR 96 1 1 2, 2, 5, 5, 7, 7, 11, 11, 14 14 2 2 BR 96 BR 96 1 1 5, 5, 8, 8, 11, 11, 14, 14, 17 17 3 3 BR 96 BR 96 1 1 8, 8, 11, 11, 14, 14, 17, 17, 20 twenty 4 4 FA6 FA6 1 1 2, 2, 5, 5, 8, 8, 11, 11, 14 14 5 5 PBS PBS 0,2 0.2 2, 2, 5, 5, 8, 8, 11, 11, 14 14

Wyniki doświadczeń prowadzonych według powyższego protokółu dla linii komórkowych nowotworów H2987 i H2707 przedstawiono nadif. 4, stanowiącej wykres przedstawiający liczbę zwierząt bez nowotworów w funkcji czasu rozpoczęcia terapii od chwili wszczepienia nowotworu. Brak nowotworu, za który przyjmowano brak wyczuwalnego nowotworu, oceniano po zakończeniu terapii w każdej z grup. Dni, w których stwierdzano brak nowotworu były różne, gdyż terapię zaczynano w różnych dniach od wszczepienia nowotworu. Wczesne rozpoczęcie terapii było najwyraźniej skuteczniejsze, zaś skuteczność zmniejszała się w miarę wydłużenia okresu między wszczepieniem nowotworu i rozpoczęciem terapii. Opóźnienie terapii pozwala na większy wzrost i lepsze ustalenie się nowotworu, tak więc obniżenie skuteczności terapii przy późniejszym jej rozpoczęciu odzwierciedla rosnące trudności w leczeniu większych i lepiej ustalonych nowotworów.The results of the experiments carried out according to the above protocol for the cancer cell lines H2987 and H2707 are shown by nadif. 4, which is a graph showing the number of animals without tumors as a function of the time of treatment initiation since tumor inoculation. The absence of neoplasm, which was assumed to be no palpable neoplasm, was assessed after the end of therapy in each group. Neoplasm-free days varied as therapy was started on different days after tumor inoculation. Early initiation of therapy was apparently more effective, and efficacy decreased as the time lengthened between tumor implantation and initiation of therapy. Delaying therapy allows for greater growth and better tumor establishment, so that the reduction in efficacy of therapy when initiated later reflects the increasing difficulty in treating larger and better established tumors.

Uzyskane rezultaty świadczą o tym, że BR 96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw dwu różnym liniom komórkowym nowotworów. Działanie przeciwnowotworowe obserwowano wyłącznie w grupach traktowanych BR 96, podczas gdy u zwierząt traktowanych FA6 i PBS działanie takie nie wystąpiło.The obtained results show that BR 96 has an anti-tumor effect against two different tumor cell lines. The antitumor effect was only observed in the groups treated with BR 96, while the animals treated with FA6 and PBS did not.

Jest znaczące, iż różnice w skuteczności wobec lepiej ustalonych nowotworów są większe w przypadku linii nowotworu H2707 o wyższej ekspresji antygenu. Fakt, że H2707 jest bardziejIt is significant that the differences in efficacy against better established tumors are greater for the H2707 tumor line with higher antigen expression. The fact that H2707 is more

168 711 podatny na leczenie BR 96 niż H2987 jest zgodny z założeniem, ze ilość ulegającego ekspresji antygenu może wpływać na skuteczność terapii Br 96. Z powyższych danych wynika, że BR 96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworom.168 711 treatable BR 96 than H2987 is consistent with the assumption that the amount of expressed antigen may influence the efficacy of Br 96 therapy. From the above data it appears that BR 96 exhibits anti-tumor activity against established tumors.

Wpływ dawki przeciwciała BR 96Effect of BR 96 antibody dose

W innym doświadczeniu badano wpływ dawki BR 96 na linię nowotworu H2707. W doświadczeniu tym BR 96 podawano w ilości malejącej półlogarytmicznie od 1 mg/dawkę do 0,032 mg/dawkę. Wykres średniej objętości nowotworu w wersji czasu od wszczepienia nowotworu przedstawiono na fig. 5. Zwierzętom kontrolnym podawano wyłącznie najwyższą dawkę monoklonalnego przeciwciała FA6, 1 mg/dawkę. U tych zwierząt kontrolnych nie stwierdzono żadnego działania przeciwnowotworowego, podczas gdy w przypadku podawania BR 96 w wybranym zakresie dawkowania wystąpiła reakcja zależna od dawki.In another experiment, the effect of a dose of BR 96 on the H2707 tumor line was investigated. In this experiment, BR 96 was administered in a semi-logarithmic amount from 1 mg / dose to 0.032 mg / dose. A graph of the mean tumor volume versus time version since tumor inoculation is shown in Figure 5. Control animals were administered only the highest dose of monoclonal antibody FA6, 1 mg / dose. In these control animals, no antitumor activity was observed, whereas a dose-dependent response occurred when BR 96 was administered in the selected dose range.

Absorbancja przy długości fali 450 nm 1 2Absorbance at 450 nm 1 2

'JKŚsSSi'JKŚsSSi

Fg. 1Fg. 1

168 711168 711

Absorbancja przy długości fali A 50 nmAbsorbance at A 50 nm

LNFI LNFI » 0,203 »0.203 LNFII LNFII 0,1 99 0.1 99 LNFIII LNFIII msmmsmsmmsmissmsa 1.47 msmmsmsmmsmissms 1.47 LNDI LNDI 0,18 0.18 MALTOZA MALTOSE 0,21 1 0.21 1 LAKTOZA^- LACTOSE ^- 0,147 0.147 LNT LNT 0,203 0.203 LNnT LNnT M 0,181 M 0.181 LNH LNH M 0,25 M 0.25 LNnH LNnH 0,129 0.129 MELIBIOZA MELIBIOSIS 0,159 0.159 KOLOBIOZA COLOMBIOSIS 0,137 0.137 A-tri A-tri 0,184 0.184 B-tri B-tri 0,174 0.174 A-TETROZA A-TETROSE M 0,206 M 0.206 2’-FUC0 2'-FUC0 m 0,159 m 0.159 A HEPTA A HEPTA ® 0,117 ® 0.117 GANGLIO GANGLIO 0,122 0.122 ANTYGEN T ANTIGEN T. 0.241 0.241 3’—SL 3'— SL 0,148 0.148 6’—SL 6'— SL 0,155 0.155 LSTa LSTa o; 135 about; 135 LSTb LSTb 0,143 0.143 LSTc LSTc 0,131 0.131 S Le y S Le y 0,278 0.278 DISIALYL DISIALYL 0,124 0.124 CHITOTRIOSE CHITOTRIOSE O 0,181 About 0.181 MAN 1-3M MAN 1-3M 0,147 0.147 MAN 1-2M MAN 1-2M ® 0,119 ® 0.119 BIANT OCTA BIANT OCTA & 0,107 & 0.107 GLOBOTRI GLOBOTRI O 0,177 About 0.177 GLOBOTET GLOBOTET ^0,134 ^ 0.134 Le y ^_ Le y ^_ ^2 ^ 2 GM1OCTA GM1OCTA m 0,159 m 0.159 L Le x L Le x 0,117 0.117 ślepa próba blind trial S8S 0,1 6 S8S 0.1 6 KONTROLA CONTROL S 0,09 S 0.09

Fig.2 objętość nowotworuFig. 2 tumor volume

Fig. 3Fig. 3

168 711168 711

Fig. 4Fig. 4

Fig. 5Fig. 5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 90 copies. Price PLN 1.50

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowePatent claims 1.Sposób wytwarzania rekombinatu nowego przeciwciała obejmującego region wiązania antygenu mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96 wykazującego tę samą specyficzność wiązania co przeciwciało BR 96, znamienny tym, że przyłącza się region wiążący antygen pochodzący z przeciwciała BR 96 z przynajmniej częścią drugiego białka.1. A method of producing a recombinant new antibody comprising the antigen binding region of the murine monoclonal antibody BR 96 having the same binding specificity as the BR 96 antibody, characterized in that an antigen binding region derived from antibody BR 96 is attached to at least a portion of a second protein. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugie białko stosuje się białko ludzkie.2. The method according to p. The process of claim 1, wherein the second protein is a human protein. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako drugie białko stosuje się białko wykazujące aktywność przeciwnowotworową i region wiążący antygen przeciwciała BR 96 łączy się z co najmniej funkcjonalnie czynną częścią tego drugiego białka.3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the second protein is a protein exhibiting anti-tumor activity and the antigen binding region of the BR 96 antibody combines with at least a functionally active portion of said second protein. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym że jako drugie białko stosuje się białko wybrane z grupy obejmującej enzymy, limfokiny, onkostatyny i toksyny.4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the second protein is a protein selected from the group consisting of enzymes, lymphokines, oncostatins and toxins. 5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosuje się region wiążący antygen BR 96 rozpoznający część epitopu zawierającego fukozę a 1-3 wariantu antygenu Le^y.5. The method according to p. A BR 96 antigen binding region recognizing part of a fucose containing epitope and 1-3 of a Le ^y antigen variant ^{is used} .