PL167620B1 - Sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciala monoklonalnego BR96 PL - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciala monoklonalnego BR96 nalezacego do podklasy IgG 3, znam ienny tym, ze zaszczepia sie mysz komórkami antygenowymi z gruczolaka ludzkiej piersi 3396 i otrzymane limfocyty poddaje sie fuzji z komórkami linii szpiczaka, otrzymuje sie komórki hybrydoma, hoduje sie komórki hybrydoma na podlozu selekcyjnym i wyselekcjonowuje sie hybrydome wydzielajaca mysie przeciwcialo monoklo- nalne BR96, zdeponowanego w ATCC pod nr 10036. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciała monoklonalnego BR 96. Przeciwciała BR 96 są nowymi przeciwciałami reagującymi z ludzkimi komórkami rakowymi. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy wytwarzania nowych mysich przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenem błony komórkowej związanym z wieloma ludzkimi rakami, włącznie z rakami okrężnicy, piersi, jajników i płuc. Mysie przeciwciało monoklonalne jest w wysokim stopniu specyficzne wobec raków, nie przejawiając żadnej lub bardzo niską reaktywność wobec normalnych tkanek ludzkich lub innych typów nowotworów, takich jak chłoniaki lub mięsaki. Przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku mają kilka dodatkowych zalet. Po pierwsze, ulegają one internalizacji do komórek rakowych, z którymi się wiążą. Przeciwciała BR 96 otrzymane sposobem według wynalazku są więc użyteczne do zastosowań terapeutycznych, na przykład, jako przeciwciałowy składnik koniugatów przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna gdzie pożądana jest internalizacja koniugatu. Po drugie, przeciwciała pośredniczą w zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej ADCC, i zależnej od dopełniacza cytotoksyczności CDC. Po trzecie, przeciwciała w formie nieskoniugowanej mogą zabijać antygenododatnie komórki nowotworowe jeśli obecne są w dostatecznym stężeniu. Przeciwciała użyteczne są także w metodach diagnostycznych, takich jak wykrywanie raków metodami in vitro lub in vivo.

Przeciwciała monoklonalne na ludzkie różnicujące antygeny towarzyszące nowotworowi zapewniają możliwość ukierunkowywania różnych czynników antynowotworowych, takich jak radioizotopy, leki chemioterapeutyczne i toksyny. [Baldwin i Byers, (red.), w: Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therepy, Londyn, Academic Press (1985)]. Ponadto, korzystną cechą pewnych przeciwciał monoklonalnych jest możliwość zabijania komórek nowotworowych przez ADCC lub CDC w obecności ludzkich komórek efektorowych lub surowicy [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)], i niewiele jest przeciwciał monoklonalnych które posiadają bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową, niezależną od żadnego komponentu gospodarza [Drebin i in., Oncogene 2:387-394 (1988)].

Znanych jest wiele przeciwciał monoklonalnych reagujących z antygenami towarzyszącymi rakowi [patrz np. Papsidero, Recent Progress In The Immunological Monitoring Of Carcinomas Using Monoclonal Antibodies, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985); Schlom i in., Potential Clinical Utility Of Monoclonal Antibodies In The Management Of Human Carcinomas, Important Adv. Oncol., 170-92 (1985); Allum i in., Monoclonal Antibodies In The Diagnosis And Treatment of Malignant Conditions, Surg. Ann., 18:41 -6411986), 1 Houghton i in., Monoclonal Antibodies: Potential Applications To The Treatment Of Cancer, Semin. Oncol., 13(2): 165-79 (1986)].

Te znane przeciwciała monoklonalne mogą wiązać się z różnorodnymi antygenami towarzyszącymi rakowi włącznie z glikoproteinami, glikolipidami i mucynami (patrz np. Fink i in.,

167 620

Monoclonal Antibodies As Diagnostic Reagents for The Identification And Charactereization Of Human Tumor Antigens, Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)]. Na przykład, przeciwciała monoklonalne wiążące się z antygenami glikoproteinowymi na specyficznych typach raków obejmują te opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 737 579 (przeciwciała monoklonalne na nie-drobnokomórkowego raka płuc), opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 753 894 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka piersi), opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka żołądkowo-jelitowego) i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 713 352 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego raka nerki). Przeciwciało monoklonalne B72.3, będące jednym z najbardziej badanych przeciwciał, rozpoznaje towarzyszący nowotworowi antygen mucynowy o masie cząsteczkowej wyższej niż 1 000 kd, który jest specyficznie eksprymowany na licznych różnych rakach, wykazano zatem, że B72.3 reaguje z 84% raków piersi, 94% raków okrężnicy, 100% raków jajnika i 95% nie-drobnokomórkowych raków płuc (patrz Johnston, Applications of Monoclonal Antibodies In Clinical Cytology As Exemplified By Studies With Monoclonal Antibody B72.3, Acta Cytol., 1(5):537-56 (1987) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 612 282 Schloma i in.]. Inne opatentowane przeciwciało monoklonalne, KC-4, [patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 708 930], rozpoznaje antygen białkowy o masie cząsteczkowej 400-500 kd eksprymowany na licznych rakach, takich jak rak okrężnicy, prostaty, płuc i piersi. Okazało się, że ani przeciwciało B72.3 ani przeciwciało KC-4 nie ulega internalizacji do komórek rakowych z którymi reagują.

Ujawniono przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami glikolipidowymi towarzyszącymi komórkom nowotworowym. Na przykład, Young i in., Production Of Monoclonal Antibodies Specific For Two Distinct Steric Portions OfThe Glycolipid Ganglio-N-Triosylceramide (Asialo GM2), J. Exp. Med., 150:1008-1019 (1979) ujawniają wytwarzanie dwóch przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec asialo GM2, glikosfingolipidowego antygenu powierzchni komórkowej który, jak ustalono, jest markerem komórek BALB/c V3T3 stransformowanych wirusem mięsaka mysiego Kirstein. Patrz także Kniep i in., Gangliotriaosylceramide (Asialo GM2) A Glycossphingolipid Marker For Celi Lines Derived From Patients With Hodgkin's Disease, J. Immunol., 131(3): 1591-94 (1983) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 507 391 (przeciwciało monoklonalne na ludzkiego czerniaka).

Inne przeciwciała monoklonalne reagujące z glikolipidowymi antygenami na komórkach rakowych obejmują te opisane przez Rosena i in., Analysis Of Human Small Cell Lung Cancer Differentiation Antigens Using A Panel Of Rat Monoclonal Antibodies, Cancer Research, 44:2052-61 (1984) (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc), Varki’ego i in., Antigens Associated with a Human Lung Adenocarcinoma Defined by Monoclonal Antibodies, Cancer Research 44:681-87 (1984); (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka płuc, żołądka i okrężnicy i czerniaka) i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 579 827 (przeciwciała monoklonalne na ludzkiego gruczolakoraka okrężnicy). Patrz także Hellstrom i in., Andtumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 83:7059-63 (1986), którzy opisują przeciwciało monoklonalne L6 rozpoznające węglowodanowy antygen eksprymowany na powierzchni ludzkiego nie-drobnokomórkowego raka płuc, raka piersi i raka okrężnicy.

Dodatkowe przeciwciała monoklonalne przejawiające wysoką, specyficzną reaktywność wobec większości komórek z szerokiego zakresu raków są bardzo potrzebne. Jest tak z powodu heterogenności antygenowej wielu raków, które często wymagają, w diagnozie lub terapii, stosowania licznych różnych przeciwciał monoklonalnych na ten sam guz nowotworowy. Istnieje dalsze zapotrzebowanie, zwłaszcza w terapii, na tak zwane przeciwciała internalizowane, tj. przeciwciała które są łatwo pobierane przez komórki nowotworowe, z którymi się wiążą. Przeciwciała tego typu znajdują zastosowanie w metodach terapeutycznych wykorzystujących koniugaty przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna, w których przeciwnowotworowy czynnik terapeutyczny związany jest z przeciwciałem w celu dostarczenia do nowotworu, gdzie przeciwciało wiąże się z antygenem towarzyszącym nowotworowi wobec którego jest ono reaktywne i uwalnia czynnik przeciwnowotworowy do wewnątrz komórek nowotworowych [patrz np. Embleton i in., Antibody Targeting Of Anti-Cancer Agents, w : Monoclonal Antibodies For

167 620

Cancer Detection and Therapy, str. 317-44 (Academic Press, 1985)]. Przeciwciała na antygeny towarzyszące nowotworowi, które nie są zdolne do internalizacji do komórek nowotworowych z którymi się wiążą na ogół nie są użyteczne do przygotowywania koniugatów z lekami lub toksynami przeciwnowotworowymi, ponieważ mogłyby nie być zdolne do osiągnięcia swojego miejsca działania w komórce. Mogą być konieczne inne podejścia aby można było użyć w terapii takie przeciwciała.

Znanych jest kilka mogących ulegać internalizowaniu przeciwciał reagujących z antygenami limfocytów. W przeciwieństwie, przeciwciała takie są rzadkie kiedy traktuje się masywne nowotwory. Jednym z nielicznych przykładów mogącego ulegać internalizowaniu przeciwciała reagującego z rakami jest przeciwciało ujawnione w Domingo i in., Transferrin Receptor As A Target For Antibody-Drug Conjugates Methods Enzymol. 112:238-47 (1985). Przeciwciało to reaguje z ludzką glikoproteiną będącą receptorem transferyny eksprymowaną na komórkach nowotworowych. Jednakże, ponieważ receptor transferyny eksprymowany jest także na wielu normalnych tkankach i często na wysokim poziomie, stosowanie przeciwciała skierowanego przeciwko receptorowi transferyny w koniugacie przeciwciało-lek lub przeciwciało-toksyna może wywierać znaczący wpływ toksyczny na normalne komórki. Wykorzystanie tego przeciwciała do specyficznego zabijania lub hamowania komórek nowotworowych jest dlatego sprawą sporną. Innym mogącym ulegać internalizowaniu przeciwciałem jest BR64 wiążące się z wieloma rakami.

Technika fuzji komórek dla wytwarzania przeciwciał monoklonalnych [Kohler i Milstein, Nature (London) 256:495 (1975)] pozwoliła rozwinąć liczne mysie przeciwciała monoklonalne reagujące z antygenami, włącznie z antygenami uprzednio nieznanymi. Mysie przeciwciała monoklonalne mogą jednakże zostać rozpoznane jako substancje obce i zneutralizowane przez ludzki układ immunologiczny, tak że ich możliwości w terapii u ludzi nie są realizowane.

Najbardziej bezpośrednią drogą klinicznego stosowania przeciwnowotworowych przeciwciał monoklonalnych jest podawanie ich w formie niezmodyfikowanej, przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przejawiających aktywność przeciwnowotworową in vitro lub w modelach zwierzęcych. Wydaje się, że większość przeciwciał monoklonalnych na antygeny nowotworowe nie posiada żadnej aktywności przeciwnowotworowej, lecz znane są pewne przeciwciała monoklonalne, które pośredniczą w zależnej od dopełniacza cytotoksyczności (CDC), tj. zabijające ludzkie komórki nowotworowe w obecności ludzkiej surowicy jako źródła dopełniacza [patrz np. Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1499 - 1502 (1985)], lub zależnej od przeciwciała cytotoksyczności komórkowej (ADCC) wraz z komórkami efektorowymi, takimi jak ludzkie komórki NK lub makrofagi. W celu wykrycia aktywności ADCC lub CDC testuje się zdolność przeciwciał monoklonalnych do lizowania hodowanych, znakowanych ⁵¹Cr nowotworowych komórek docelowych przez 4-godzinny okres inkubacji.

Komórki docelowe znakuje się ⁵1 Cr i następnie eksponuje przez 4 godziny na połączenie komórek efektorowych (w formie limfocytów ludzkich oczyszczonych przez zastosowanie podłoża rozdzielającego limfocyty) i przeciwciała, które dodaje się w stężeniach pomiędzy 0,1 (J.g/ml a 10 gg/ml. Jako dowód lizy komórek nowotworowych (cytotoksyczności) mierzy się uwalnianie ^5lCr z komórek docelowych. Kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych lub z albo limfocytami albo przeciwciałem monoklonalnym oddzielnie. Mierzy się całkowitą ilość ^5lCr, który może zostać uwolniony i oblicza się ADCC jako procent zabijania komórek docelowych obserwowany z przeciwciałem monoklonalnym plus komórki efektorowe w porównaniu z inkubowanymi samymi komórkami docelowymi. Procedura dla CDC identyczna jest do procedury stosowanej do wykrywania ADCC z tym wyjątkiem, że w miejsce komórek efektorowych dodaje się surowicę ludzką jako źródło dopełniacza (rozcieńczona 1 : 3 do 1 : 6).

Terapeutyczne stosowanie przeciwciał monoklonalnych z aktywnością ADCC lub CDC rozważa się ponieważ często mają one aktywność przeciwnowotworową in vitro. Z drugiej strony, przeciwciała pozbawione in vitro aktywności ADCC i CDC, in vivo, o ile nie są zastosowane jako nośniki czynników przeciwnowotworowych, zazwyczaj są nieskuteczne. Zdolność przeciwciała monoklonalnego do aktywacji dopełniacza gospodarza może być korzystna terapeutycznie nie tylko dlatego że komórki nowotworowe mogą zostać zabite, lecz także

167 620 dlatego ponieważ może wzrosnąć dopływ krwi do nowotworu. Ułatwiając zatem pobieranie leków [patrz Hellstrom i in., Immunological Approches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccianes and Anti-Idiotypes, w: Covalently Modified Antigens and Antibodies in Diagnosis and Therapy, Quash & Rodwell, red. Marcel Dekker, str. 15 - 18 (1989)]. Wśród mysich przeciwciał monoklonalnych, najpowszechniej z ADCC i CDC związane są izotopy IgG2a i IgG3. Przeciwciała posiadające zarówno aktywność ADCC jak i CDC z wysoką specyficznością zabijają tylko komórki nowotoworowe z którymi się wiążą i jest nieprawdopodobne aby prowadziły do wpływów toksycznych jeśli zwiążą się niespecyficznie w płucach, wątrobie lub innych organach. Może to zapewnić takim przeciwciałom przewagę nad przeciwciałami znakowanymi radioaktywnie lub pewnymi typami immunokoniugatów.

Bardzo nieliczne przeciwciała same są zdolne do zabijania komórek nowotworowych, to jest w nieobecności komórek efektorowych lub dopełniacza jak w ADCC lub CDC. BR96 jest takim przeciwciałem, ponieważ może ono samo zabijać komórki przy stężeniu przeciwciała około 10 gg/ml lub wyższym. Przeciwciała takie są szczególnie interesujące ponieważ mogą one interferować z pewnymi kluczowymi zdarzeniami w przeżywaniu komórek nowotworowych.

Jest zatem oczywiste, że przeciwciało, które przejawia wyższy stopień specyficzności wobec szerokiego zakresu raków, samo posiada aktywność przeciwnowotworową i zdolne jest do łatwego ulegania internalizacji przez komórki nowotworowe, może być bardzo korzystne w terapii nowotworów.

Sposób według wynalazku dostarcza intemalizowanych przeciwciał o wysokiej specyficzności wobec szeregu ludzkich raków. Bardziej szczegółowo, nowe przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku, oznaczone jako przeciwciała BR96, są mysim przeciwciałem monoklonalnym wiążącym się z antygenem błony komórkowej, którego obecność stwierdzono na ludzkich komórkach rakowych. Przeciwciała są w wysokim stopniu reaktywne wobec komórek rakowych, takich jak otrzymane z rakapiersi, płuc, okrężnicy i jajnika, nie przejawiając, lub przejawiając ograniczoną reaktywność z normalnymi komórkami ludzkimi lub innymi typami nowotworów, takimi jak chłoniaki lub mięsaki. Ponadto, przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku internalizowane są przez komórki rakowe z którymi się wiążą i same zdolne są do zabijania komórek nowotworowych, tj. w formie nieskoniugowanej i bez komórek efektorowych lub dopełniacza. Przeciwciała BR96 są zatem szczególnie użyteczne w zastosowaniach terapeutycznych, na przykład do reagowania z komórkami nowotworowymi, i w koniugatach jako specyficzny wobec celu nośnik różnych czynników posiadających wpływy przeciwnowotworowe, włącznie z lekami chemioterapeutycznymi, toksynami, modulatorami odpowiedzi immunologicznej, enzymami i izotopami radioaktywnymi. Przeciwciała można zatem stosować jako składnik różnych immunokoniugatów włącznie z koniugatami przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna, gdzie szczególnie korzystna jest internalizacja koniugatu, a po znakowaniu izotopem radioaktywnym jego dostarczenie do nowotworu. Przeciwciała BR96 mogą także być korzystne terapeutycznie nawet w formie niezmodyfikowanej. Ponadto przeciwciała użyteczne są w przeznaczonych do wykrywania raka metodach diagnostycznych in vitro lub in vivo.

Figura 1 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka piersi 3396 traktowanych immunotoksyną BR96-RA przy różnych stężeniach jak opisano w przykładzie III. BR6-RA jest internalizowanym przeciwciałem używanym jako kontrola negatywna, ponieważ nie wiąże się ono z komórkami 3396.

Figura 2 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA 2707 komórek raka płuc 2707 traktowanych immunotoksyną BR96-RA przy różnych stężeniach jak opisano w przykładzie III. BR6-RA wiąże z komórkami 2707.

Figura 3 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka okrężnicy HCT116 traktowanych immunotoksyną BR96 przy różnych stężeniach jak opisano w przykładzie III. BR6 nie wiąże się z komórkami HCT116.

Figura 4 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka okrężnicy C traktowanych immunotoksyną BR96-RA przy różnych stężeniach jak opisano w przykładzie III. BR6-RA nie wiąże się z komórkami C; L6-RA wiąże się z komórkami C, lecz nie jest internalizowane.

167 620

Figura 5 przedstawia procent hamowania włączania tymidyny do DNA komórek raka okrężnicy 3347 traktowanych immunotoksyną BR96-RA przy różnych stężeniach jak opisano w przykładzie III. BR6-RA nie wiąże się z tymi komórkami, podczas gdy BR6 wiąże się.

Figura 6 przedstawia wyniki analizy FACS cytotoksyczności wobec barwionych komórek raka piersi 3396, komórek raka płuc 2987 i komórek raka okrężnicy 3619, jak opisano w przykładzie IV.

Figura 7 przedstawia wpływy BR96 na proliferację komórek różnych linii komórkowych, jak opisano w przykładzie IV.

Figura 8 ilustruje wpływ BR96 na wzcost komórek różnych linii komórkowych, jak opisano w przykładzie IV.

Figura 9 ilustruje wyniki testów w celu określenia aktywności ADCC BR96, jak opisano w przykładzie V.

Figura 10 opisuje wyniki testów w celu określenia aktywności CDC BR96, jak opisano w przykładzie VI.

Figura 11 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR96 wobec glikolipidów, jak opisano w przykładzie VII.

Figura 12 jest wykresem słupkowym wyników testowania reaktywności BR96 wobec neoglikoprotein, jak opisano w przykładzie VII.

Figura 13 jest wykresem przedstawiającym wpływy przeciwnowotworowe niezmodyfikowanego BR96 na linię komórek nowotworowych H2987, jak opisano w przykładzie VIII.

Figura 14 jest wykresem słupkowym ilustrującym nieobecność nowotworów przy końcu leczenia zwierząt traktowanych BR96, jak opisano w przykładzie VIII.

Figura 15 przedstawia wpływy dawek przeciwciała BR96 po implantacji komórek H2707, określane poprzez objętość nowotworu, jak opisano w przykładzie VIII.

Figura 16 ilustruje wpływy leczenia fragmentami F(ab’)₂ i chimerycznym BR96 po implantacji komórek 2707, określane przez objętość nowotworu, jak opisano w przykładzie VIII.

Figura 17 ilustruje nieobecność nowotworów po leczeniu różnymi dawkami przeciwciała BR96, w porównaniu z wpływami fragmentów F(ab ’)2 chimerycznym BR96, jak opisano w przykładzie VIII.

Aby opisany tu wynalazek mógł być bardziej zrozumiały, poniżej podaje się następujący szczegółowy opis.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowego mysiego przeciwciała monoklonalnego BR96, należącego do podklasy IgG3, polega na tym, że zaszczepia się mysz komórkami antygenowymi z gruczolaka ludzkiej piersi 3396 i otrzymane limfocyty poddaje się fuzji z komórkami linii szpiczaka, otrzymuje się komórki hybrydoma, hoduje się komórki hydrydoma na podłożu selekcyjnym i wyselekcjonowuje się hydrydomę wydzielającą mysie przeciwciało monoklonalne BR96, zdeponowanego w ATCC pod nr 10036.

Przeciwciała BR96 stosować można do izolowania i charakteryzowania antygenów, z którymi się one wiążą. A zatem, przeciwciała BR96 można stosować jako sondy do identyfikacji i charakteryzowania rozpoznawanych epitopów i do dalszego określenia antygenów, z którymi one reagują [patrz np. Nudelman i in., Characterization of Human Melanoma Associated Ganglioside Antigen Defined By A Monoclonal Antibody, 4.2, J. Biol. Chem. 257 (1) 12752 56 (1982) i Hakamori Tumor Associated Carbohydrate Antigens, Ann. Rev. Immunol., 2: 103 -2611984)].

Mysie przeciwciała monoklonalne otrzymywane sposobem według wynalazku wytwarzać można stosując dobrze znane techniki, z wykorzystaniem hybrydom po raz pierwszy wprowadzone przez Kohlera i Milsteina [patrz Kohler i Milstein, Continous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Pre-Defined Specificity, Nature 256:495 - 97 (1975). Patrz także Brown i in., Structural Characterisation Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies, J. Immunol., 127 (2): 539-46 (1981); Brown i in., Protein Antigens Of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation With Monoclonal Antibodies, J. Biol. Chem. 255: 4980 - 83 (1980); Yeh i in., Cell Surface Antigens Of Human Identified By Monoclonal Antibody, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (6): 297 - 31 (1979) i Yeh i in., A

167 620

Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction and Shared By Human Melanoma, Int. J. Cancer 29: 269 - 75 (1982)].

Techniki te obejmują iniekcję immunogenu (np. komórek lub ekstraktów komórkowych niosących antygen lub oczyszczonego antygenu) zwierzęciu (np. myszy) tak, aby u zwierzęcia tego wywołać pożądaną odpowiedź immunologiczną (tj. przeciwciała). Po odpowiednim czasie otrzymuje się ze zwierzęcia limfocyty wytwarzające przeciwciała, albo ze śledziony, węzłów chłonnych albo z krwi obwodowej. Korzystnie, limfocyty otrzymuje się ze śledziony. Limfocyty pochodzące ze śledziony poddaje się następnie fuzji z linią komórek szpiczaka, zazwyczaj w obecności czynnika indukującego fuzję, takiego jak glikol polietylenowy (PEG). Zgodnie ze standardowymi technikami, do fuzji zastosować można każdą z licznych linii komórek szpiczaka: na przykład linie szpiczaka P3-NS1/1Ag4-1, P3-X63-Ag8 lub Sp2/) Ag 14. Linie te dostępne są w American Type Culture Collection (ATCC) w Rockville, Maryland.

Otrzymane komórki, obejmujące pożądane hybrydomy, hoduje się następnie na podłożu selekcyjnym, takim jak podłoże HAT, w którym niesfuzjowane rodzicielskie komórki szpiczaka lub ewentualnie limfocyty zamierają. Przeżywają tylko komórki hybrydomy, i można je hodować w warunkach ograniczających dla otrzymania wyizolowanych klonów. Supernatanty hybrydom testuje się na obecność przeciwciał o pożądanej specyficzności np. technikami oznaczeń immunologicznych stosując antygen, który został użyty do immunizacji. Klony dodatnie można następnie subklonować w warunkach ograniczających i izolować można wytwarzane przeciwciała monoklonalne. Hybrydomy wytworzone według tych metod można namnażać in vitro i in vivo (w płynie puchlinowym z jamy otrzewnowej) stosując znane techniki [patrz Fink i in., supra str. 123, Fig. 6-11]. Powszechnie stosowane metody oczyszczania przeciwciał monoklonalnych obejmują wytrącanie siarczanem amonu, chromatografię jonowymienną i chromatografię powinowactwa [patrz np. Zola i in., Techniques For The Production And Charakterization Of Monoclonal Hybridoma Antibodies, w: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (red.), str. 51-52 (CRC Press 1982)].

Zgodnie z korzystnym wykonaniem sposobu według wynalazku wytworzono przeciwciało BR96 z wykorzystaniem hybrydom, stosując jako immunogen linię komórkową raka piersi 3396. Hybrydomę bR96, przygotowaną jak opisano poniżej i wytwarzająca przeciwciało BR96, zdeponowano 22 lutego 1989 w ATCC, gdzie jest w następujący sposób identyfikowana:BR96 ATCC Nr identyfikacyjny: HB 10036.

Przeciwciało BR96 należy do podklasy IgG 3. Przeciwciało przejawia wysoką specyficzność wobec komórek raka różnych organów, na przykład nowotworów piersi, płuc, okrężnicy i jajnika, jak również hodowanych linii komórkowych założonych z różnych raków piersi, płuc i okrężnicy. Ponadto przeciwciało BR96 nie przejawia wiązania z innymi typami komórek nowotworowych, takimi jak linie komórkowe komórek chłoniaka, cEm i MOLT-4, linia komórkowa komórek B chłoniaka P3HR-1 i linie komórkowe czerniaka. Przeciwciało BR96 może być internalizowane przez antygenododatnie komórki nowotworowe, jest toksyczne wobec antygenododatnich komórek nowotworowych. Pośredniczy w aktywności ADCC i CDC i, co zaskakujące, samo tj. w formie niezmodyfikowanej, jest cytotoksyczne. PrzeciwciałaBR96 wydają się rozpoznawać antygen LeV.

W oparciu o technikę wytwarzania mysiego przeciwciała monoklonalnego można również wytworzyć chimeryczne (mysie/ludzkie) przeciwciało stosując dwuetapową procedurę rekombinacji homologicznej opisaną przez Fella i in., w Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8507 - 8511 (1989).

Ważną cechą przeciwciała BR96 otrzymywanego sposobem według wynalazku jest to, że nie przejawia ono żadnego immunohistologicznego wykrywalnego wiązania z normalnymi tkankami ludzkimi z głównych organów, takich jak nerki, śledziona, wątroba, skóra, płuca, piersi, okrężnica, mózg, tarczyca, serce, węzły chłonne lub jajniki. Przeciwciało nie wiąże się także z leukocytami krwi obwodowej. Przeciwciało BR96 przejawia ograniczone wiązanie z pewnymi komórkami w migdałkach i jądrach, i wiąże się z komórkami graniastymi w trzustce oraz z komórkami nabłonkowymi w żołądku i przełyku. A zatem przeciwciało BR96 przewyższa najbardziej znane przeciwciała przeciwnowotworowe wysokim stopniem specyficzności wobec komórek nowotworowych w porównaniu z komórkami normalnymi [patrz np. Hellstrom i

167 620 in.,Immunological Approches to Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccianes and Antibodies In Diagnosis and Therapy, Quash & Rodwell, (red.), str. 1 - 39 (Marcel Dekker Inc. (1989) iBagshave, Tumor Markers- Where Do We Go From Here, Br. J. Cancer, 48: 167 -75 (1983)].

Można także wytwarzać przeciwciała, które zdolne są do wiązania się z tą samą determinantą antygenową co przeciwciała BR96 i współzawodniczenia z przeciwciałami o wiązanie z tym miejscem. Obejmują one przeciwciała posiadające taką samą specyficzność antygenową co przeciwciała BR96, lecz różniące się pochodzeniem gatunkowym, izotypem, powinowactwem wiązania lub funkcjami biologicznymi (np. cytoksyczością). Można na przykład skonstruować klasy, izotopy lub inne warianty przeciwciał BR96 posiadające region wiązania antygenu przeciwicialaBR96 stosując znane techniki rekombinacyjne zmiany klasy i tworzenia fuzji [patrz np. Thammana i in., Immunoglobulin Heavy Chain Class Switch From IgM to IgG In A Hybridoma, Eur. J. Immunol., 13: 614 (1983); Supra i in., The Identification Of Monoclonal Class Switch Variants By Subselection And ElISA Assay, J. Immunol. Meth. 74: 307 - 15 (1984); Neuberger i in., Recombinant Antibodies Possessing Novel Effector Functions, Nature 312: 604 - 608 (1984); i Oi i in., Chimeric Antibodies, Biotechniques 4(3): 214 - 21 (1986)].

Technikami immunologicznymi można wytwarzać ponadto przeciwciała antyidiotypowe na przeciwciało BR96. Te przeciwciała antyidiotypowe wytwarzać można stosując jako immunogeny przeciwciało BR96 i jego fragmenty i użyteczne są do celów diagnostycznych w wykrywaniu odpowiedzi humoralnej na nowotwory i w zastosowaniach terapeutycznych, np. w szczepionkach, do indukcji odpowiedzi przeciwnowotworowej u pacjentów [patrz np. Nepom i in., Anti-Idiotypic Antibodies And The Induction Of Specific Tumor Immunity w: Cancer And Metastasis Reviews, 6: 487 - 501 (1987)].

Mysie przeciwciało monoklonalne BR96 otrzymane sposobem według wynalazku użyteczne jest także do zastosowań diagnostycznych, zarówno in vitro jak i in vivo, do wykrywania ludzkich raków posiadających antygen wobec którego przeciwciała są specyficzne. Metody diagnostyczne in vitro obejmują immunohistologiczne wykrywanie antygenów komórek nowotworowych (np. na tkance ludzkiej, komórkach lub wyciętych próbkach nowotworów) lub serologiczne wykrywanie antygenów towarzyszących nowotworom (np. w próbkach krwi lub innych płynów biologicznych).

Techniki immunohistochemiczne obejmują barwienie próbek biologicznych, takich jak próbki tkanki, przeciwciałem BR96, a następnie wykrywanie na próbce obecności przeciwciała skompleksowanego z jego antygenem. Tworzenie takich kompleksów przeciwciało-antygen z próbką wskazuje na obecność w tkance komórek rakowych. Wykrywanie przeciwciała na próbce przeprowadzać można stosując znane techniki, takie jak techniki immunoenzymatyczne, np. technikę barwienia immunoperoksydazą lub technikę awidyna - blotyna (ABC), lub techniki immunofluorescencyjne [patrz np. Clocca i in., Immunohistochemical Techniques Using Monoclonal Antibodies, Meth. Enzymol., 121: 562 - 79 (1986); Hellstrom i in., Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma, Cancer Research 46: 3917 - 23 (1986); i Kimball (red.), Introduction To Immunology (wyd. II), str. 113-117 (Macmillan Pub. Co. (1986)]. Barwienie immunoperoksydazą zastosowano na przykład jak opisano w przykładzie II do wykazania reaktywności przeciwciała BR96 z rakami płuc, piersi, okrężnicy i jajnika i niskiej reaktywności przeciwciała z próbkami normalnych tkanek ludzkich.

Serologiczne techniki diagnostyczne obejmują wykrywanie i określanie ilościowe antygenów towarzyszących nowotworom, które uległy sekrecji lub zostały zrzucone do surowicy lub innych płynów biologicznych pacjentów cierpiących na raka. Antygeny takie można wykryć w płynach ciała stosując znane techniki, takie jak oznaczenia radioimmunologiczne (RIA) lub ELISA, w których przeciwciało reagujące ze zrzuconym antygenem stosowane jest do wykrywania obecności antygenu w próbce płynu [patrz np. Uotila i in., Two-Site Sandwich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP, J. Immunol. Methods, 42: 11 (1981) i Allum i in., supra na str. 48 - 51)]. Oznaczeń tych, stosując ujawnione przeciwciała BR96, można dlatego użyć do wykrywania w płynach biologicznych glikolipidowych antygenów reagujących z przeciwciałami BR96, a zatem wykrywania ludzkiego raka u pacjentów. A zatem jak wynika z powyższych danych, przeciwciała BR96 otrzymywane sposobem według wynalazku stosować

167 620 można w większości oznaczeń obejmujących reakcje antygen - przeciwciało. Oznaczenia te obejmują, ale nie są ograniczone do standardowych technik RIA zarówno na płynnej jak i stałej fazie, jak również oznaczeń ELISA, technik immunofluorescencyjnych i innych oznaczeń immunocytochemicznych [patrz np. Sikora i in., (red.), Monoclonal Antibodies, str. 32 - 52 (Blackwell Scientific Publications (1984)].

W oparciu o otrzymane sposobem według wynalazku mysie przeciwciało monoklonalne BR96 można sporządzać także zestawy diagnostyczne do oznaczeń opisanych powyżej. W jednym z rodzajów, zestaw diagnostyczny zawiera przeciwciało monoklonalne BR96, jego fragmenty, fuzję białek lub przeciwciało chimeryczne i koniugat zawierający czynnik specyficznie wiążący przeciwciało i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Odczynniki mogą także zawierać czynniki pomocnicze, takie jak czynniki buforujące i czynniki stabilizujące białka (np. polisacharydy). Zestawy diagnostyczne mogą dalej zawierać, tam gdzie jest to konieczne, inne składniki układu wywoływania sygnału włącznie z czynnikami obniżającymi interferencję z tłem, odczynnikami kontrolnymi lub aparatem bądź pojemnikiem do przeprowadzania testu. W innym rozwiązaniu zestaw diagnostyczny zawiera koniugat przeciwciał i znacznik zdolny do wytwarzania wykrywalnego sygnału. Czynniki pomocnicze, jak wspomniane powyżej także mogą być obecne.

Przeciwciało BR96 otrzymywane sposobem według wynalazku użyteczne jest także w zastosowaniach diagnostycznych in vivo do wykrywania raka u ludzi. Jedno takie podejście obejmuje wykrywanie nowotworów in vivo techniką uwidaczniania nowotowru (tumor imaging). Według tego podejścia przeciwciało BR96 znakuje się odpowiednim czynnikiem wytwarzającym wykrywalny sygnał. Przykłady takich odczynników, których można użyć obejmują, ale nie są ograniczone do znaczników radioaktywnych, takich jak ^ηΤ, 1¹ 4n, ^I23I, ^99mTc, ³²P, ¹²³I, ³H i ^l4C, znaczników fluorescencyjnych, takich jak fluoresceina i rodamina oraz czynników chemiluminescencyjnych, takich jak lucyferyna. Przeciwciało można wyznakować takim odczynnikiem stosując znane techniki. Na przykład patrz Wensel i Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, Nowy Jork (1983) dla technik dotyczących radioaktywnego znakowania przeciwciał [patrz także Colcher i in., Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy, FASEB J. 4 188 - 193 (1990)]. Jeszcze inne zastosowanie terapeutyczne przeciwciała BR96 obejmuje zastosowanie w obecności dopełniacza lub jako część koniugatu przeciwciało - lek lub przeciwciało - toksyna, do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego pacjentów z rakiem. Zgodnie z tym podejściem, autologiczny szpik kostny można oczyścić ex vivo przez traktowanie przeciwciałem i szpik ponownie wszczepić pacjentowi [patrz np. Ramsay i in., Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies, J. Clin. Immunol., 8(2): 81 -88 (1988)].

Ponadto, jak opisano wcześniej, w celach terapeutycznych stosować można chimeryczne lub inne rekombinowane przeciwciała BR96. Na przykład fuzję białka zawierające przynajmniej region wiążący antygen przeciwciała połączony z co najmniej aktywną funkcjonalnie częścią drugiego białka posiadającego aktywność przeciwnowotworową, np. limfokina lub onkostatyna, zastosować można do leczenia ludzkiego raka in vivo.

Ostatecznie, przeciwciała antyidiotypowe do przeciwciała BR96 można zastosować terapeutycznie w aktywnej immunizacji przeciwnowotworowej i terapii nowotworów [patrz np. Hellstrom i in., Immunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines And Anti-Idiotypes w: Covalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis And Therapy, supra, str. 35 - 41.

Dlatego też jest oczywiste, że mysie przeciwciała monoklonalne mogą być użyteczne do sporządzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia ludzkich raków. Należą do nich na przykład kompozycje farmaceutyczne do stosowania w leczeniu ludzkich raków zawierające skuteczną farmaceutycznie ilość przeciwciała BR96 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Kompozycje mogą zawierać przeciwciało albo niezmodyfikowane, skoniugowane z czynnikiem terapeutycznym (np. lekiem, toksyną, enzymem lub drugim przeciwciałem), albo w formie zrekombinowanej. Kompozycje mogą dodatkowo zawierać inne przeciwciała lub koniugaty do leczenia raka (np. mieszaninę przeciwciał).

167 620

Kompozycje przeciwciał można podawać używając konwencjonalnych sposobów podawania obejmujących lecz nie ograniczonych do dożylnego, dootrzewnowego, doustnego, śródchłonnego lub bezpośrednie podawanie do nowotworu. Korzystne jest podawanie dożylne.

Kompozycje przeciwciał mogą mieć różne formy dawkowania obejmujące, lecz nie ograniczone do ciekłych roztworów lub zawiesin, tabletek, pigułek, proszków, czopków, polimerycznych mikrokapsułek lub mikrovehiculum, liposomów i roztworów iniekcyjnych lub infuzyjnych. Korzystna forma zależy od sposobu podawania i zastosowania terapeutycznego.

Kompozycje przeciwciał zawierają także konwencjonalne, farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i znane adjuwanty, takie jak albumina surowicy ludzkiej, wymieniacze jonowe, tlenek glinu, lecytyna, substancje buforowe, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasu i sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy.

Najbardziej skuteczny sposób podawania i dawkowania dla kompozycji zależy od przebiegu i zaawansowania choroby, zdrowia pacjenta, odpowiedzi na leczenie i orzeczenia leczącego lekarza. Przeto, dawkowanie kompozycji powinno być określane dla pojedynczego pacjenta. Niemniej jednak, dawka skuteczna kompozycji przeciwciał może pozostawać w zakresie od około 1 do około 2000 mg/m².

W celu umożliwienia pełniejszego zrozumienia opisanego tu wynalazku, poniżej przedstawia się następujące przykłady.

Przykład I. Wytwarzanie monoklonalnego przeciwciała BR 96

Monoklonalne przeciwciało BR 96 wytwarza się według wynalazku, stosując technikę fuzji hybrydomowej, opisaną wcześniej przez M. Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) supra i Yeh et al., Int. J. Cancer (1982) supra. W skrócie, trzymiesięczne myszy BALB/c uodporniano, stosując jako immunogen eksploatowane komórki hodowli gruczolakoraka piersi ludzkich, oznaczanego 3396 lub M 3396 (z gruczolakoraka piersi pochodzącego od pacjenta, hodowane w hodowli Oncogen, Leattle, Washington, Stany Zjednoczone Ameryki). Mysz otrzymała iniekcje przy pięciu okazjach, przy pierwszych czterech okazajch, mysz otrzymywała jedną iniekcję dootrzewnowo i 1 iniekcję podskórną w czterech miejscach na ciele myszy. Przy piątej okazji mysz otrzymywała tylko jedną iniekcję dootrzewnowo. Łącznie przy każdej okazji wstrzykiwano około 10⁷ komórek. W trzy dni po ostatnim szczepieniu usuwano myszy śledzionę i komórki śledziony zawieszano w pożywce hodowlanej RPMI. Następnie komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka myszy P3-X63-Ag 8.653 w obecności glikolu polietylenowego (PEG) i pozwalano na wzrost komórek we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania w selektywnej pożywce MAT, jak opisano w publikacji Yeh et al., supra [patrz Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 - 97 (1975) i Eur. J. Immunol., 6: 511 - 19 (1976)]. Mieszaninę zaszczepiono tak, aby utworzyć hodowle o małej gęstości, pochodzące od pojedynczych komórek lub klonów, powstałych w wyniku fuzji.

Supernatanty z tych hodowli hybrydomowych poddawano następnie skriningowi, aby określić bezpośrednio aktywność wiązania z linią komórkową raka piersi, 3396, i z linią komórkową fibroblastów uzyskaną na drodze biopsji skóry za pomocą próby ELISA, podobnej do opisanej w publikacji Donillard et al., Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme - Labeled Second Antibody, Meth. Enzymol., 92: 168-74(1983).

Zgodnie z tą próbą, antygen (z którym poddano skriningowi przeciwciało dla określenia jego reaktywności) unieruchomiono na płytkach do mikromiareczkowania i następnie inkubowano z supernatantami hybrydomowymi. Jeśli supernatant zawierał pożądane przeciwciało, było one wiązane z unieruchomionym antygenem i wykrywane przez dodanie konjugatu antyimmunoglobuliny z enzymem i podłoża przeciwciała enzymu, co prowadziło do dających się zmierzyć zmian gęstości optycznej. Podczas prowadzonych badań, komórki raka piersi lub kontrolne komórki fibroblastów umieszczono na płytce do hodowli tkankowej z 96 wgłębieniami (Costar Cambridge, MA) i inkubowano przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO2). Komórki doprowadzono następnie do końcowego stężenia we wgłębieniu wynoszącego 0,5% za pomocą 100 gl świeżo przyrządzonego 1% aldehydu glutanowego i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym przemyto trzykrotnie 1 x roztworem solanki buforowanej fosforanem (PBS). Następnie komórki blokowano w ciągu 30 minut 5% białkiem

167 620 surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i ponownie przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano supernatanty z hodowli hybrodomowych w ilości 100 gl/wgłębienie, zawartość wgłębień inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej i komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano kozią antymysią peroksydazę chrzanową (Zymed, CA) rozcieńczoną w 0,1 % BSA i PBS do stężenia 100 gl/wgłębienie. Mieszaninę reakcyjną inkubowano albo w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej albo w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C, po czym komórki przemyto trzykrotnie PBS. Następnie dodano o-fenylenodwuaminę (OPD) w ilości 100 gl/wgłębienie i płytki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej w ciągu 5-45 minut. Przeciwciała związane z komórkami wykrywano poprzez zmianę barwy we wgłębieniach, występującą w ciągu 10-20 minut. Reakcję przerwano dodatkiem 100 gl H2SO4wgłębienie i dokonano odczytu absorbancji na automatycznym urządzeniu odczytującym Dynatech (Alexandria VA) Microelisa przy 490 nm.

Należy zauważyć, że próbę tę można przeprowadzić stosując nienaruszone komórki lub oczyszczone rozpuszczalne ekstrakty antygenowe lub komórkowe w postaci unieruchomionego antygenu. Gdy jako antygen stosowano rozpuszczalny antygen lub ekstrakty komórkowe, antygen umieszczano początkowo na płytkach w ilości 50 gl/wgłębienie w PBS i płytki przed rozpoczęciem próby inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Gdy jako antygen stosuje się nienaruszone komórki, można je stosować świeże lub po unieruchomieniu. W każdym przypadku komórki umieszczano najpierw na płytkach w ilości 10⁴ komórek w 50 gl/wgłębienie w pożywce hodowlanej i inkubowano przez noc w inkubatorze w temperaturze 37°C (5% CO 2).

W ten sposób wyselekcjonowano hybrydomy wytwarzające przeciwciała wiązane przez linię komórkową raka piersi a nie przez komórki ludzkich fibroblastów i badano je w urządzeniu do sortowania komórek FACS na leukocytach krwi obwodowej, (PBLS), jak opisano w przykładzie II. Hybrydomy ujemne wobec PBLS klonowano, ekspandowano in vitro i badano dalej pod kątem specyficzności przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciała reagujące z rakiem piersi ludzkiej ponownie klonowano, ekspandowano i wstrzykiwano pierwotnie uczulonym trzymiesięcznym myszom BALB/c, gdzie wzrastały powodując wodobrzusze.

Postępując w opisany wyżej sposób, uzyskano hybrydomy linii komórkowej BR 96, klonowane i wstrzykiwane myszom w celu rozwinięcia się nowotworu powodujące wodobrzusze. Jak ujawniono poprzednio, hybrydomy BR 96 zdeponowano w kolekcji ATCC. Monoklonalne przeciwciała BR 96 oczyszczano z płynów wodobrzusza za pomocą chromatografii powinowactwa na unieruchomionym rekombinantowym białku A (Repligen, Cambridge, MA). Sklarowane płyny rozcieńczono równą objętością buforu wiążącego (1 m fosforan potasowy, pH 8) i nanoszono na kolumnę z białkiem A, poprzednio zrównoważoną buforem wiążącym. Kolumnę obficie przemyto buforem wiążącym i następnie eluowano przeciwciało 50 milimolowym roztworem kwasu fosforowego, pH 3. Oczyszczoną frakcję zawierającą przeciwciało zobojętniono 1m roztworem Tris, pH 9, i następnie dializowano wobec roztworu soli buforowanego fosforanem. Oczyszczone BR 96 odsączono wreszcie w warunkach jałowości i przechowywano w stanie schłodzonym lub zamrożonym.

Przykład II. Określanie właściwości monoklonalnego przeciwciała BR 96

Określenie izotypu. W celu określenia klasy immunoglobuliny wytworzonej przez hybrydoma BR 96, stosowano następujące metody.

a) Immunodyfuzja techniką Ouchterlony’ego. Próbkę supematantu komórek hybrydomy umieszczono w środkowym wgłębieniu płytki z 25% agarem. W zewnętrznych wgłębieniach płytki umieszczono przeciwciała królicze antymysie o izotypie Ig (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) i płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 24-28 godzin. Następnie dokonano odczytu linii strącania.

b) Badanie izotypu na urządzeniu ELISA.

Płytki Dynatech Immulon o 96 wgłębieniach powleczono kozimi antymysimi przeciwciałami Ig w stężeniu 1 gg/ml, 50 gl/wgłębienie w PBS i pozostawiono przykryte przez noc w temperaturze 4°C, po czym przemyto je PBS/Twen 20, 0,05%, i blokowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej pożywką w ilości 100 gl/wgłębienie. Po przemyciu płytek, dodano supernatanty z hybrydoma BR 96 i inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Po przemyciu PBS zawierającym 2% białko surowicy bydlęcej (BSA) płytki inkubowano w

167 620 ciągu 30 minut w temperaturze 37°C z monospecyficznymi króliczymi antymysimi przeciwciałami o izotypie Ig sprzężonymi z peroksydazą (Zymed, Louth San Francisco, CA). Po kolejnym przemyciu płytki inkubowano z 1 mg/ml OPD i 0,03% H 2O2 w 0,1 m buforze cytrynianowym, pH 4,5. Gęstość optyczną przy 630 nm oznaczano na urządzeniu odczytującym z płytek Dynatec ELISA.

W ten sposób ustalono, że monoklonalne przeciwciało BR 96 ma izotyp IgG 3.

Charakterystyka monoklonalnego przeciwciała BR 96.

Przeciwciało BR 96 wykazuje wysoki stopień reaktywności wobec szerokiego zakresu komórek rakowych i tylko ograniczoną reaktywność wobec komórek normalnych. Wykazano to w badaniach immunohistologicznych na kawałkach zamrożonych tkanek, jak również na podstawie badania jego wiązania się z hodowlami nienaruszonych komórek.

Immunohistologia. Do badań immunohistologicznych stosowano metodę peroksydaza -antyperoksydaza opisaną w Immunochemistry, str. 1(04-169 (John Wiley and Sons, New York, 1979) i zmodyfikowanej jak opisano w publikacji H. J. Garrigues et al., Detection of A Humań Melanoma- Associated Antigen, str. 9/, In Histological Sections of Primary Humań Melanomas, Int. J. Cancer, 29: 511 - 15 (1982). Docelową tkankę do tych prób uzyskano chirurgicznie i zamrożono w ciągu 4 godzin po pobraniu, stosując izopentan wstępnie ochłodzony w ciekłym azocie. Tkanki przechowywano następnie przed użyciem w ciekłym azocie lub w temperaturze - 70°C. Preparowano zamrożone kawałki tkanki, suszono je na powietrzu, traktowano acetonem i suszono ponownie [patrz Garrigues et al., wyżej]. Kawałki tkanki do badań histologicznych barwiono hematoksyliną. W celu obniżenia niespecyficznego tła, kawałki tkanki inkubowano wstępnie z normalną surowicą ludzką rozcieńczoną 1/5 w PBS [patrz Garrigues, wyżej]. Przeciwciała mysie, królicze antymysie IgG i mysie PAP rozcieńczono w roztworze 10% normalnej surowicy ludzkiej i 3% surowicy króliczej. Przeciwciało królicze antymysie IgG (Stemberger - Meyer Immunochemicals, Inc. Jerettsville, MD) stosowano w rozcieńczeniu 1/50. Mysie kompleksy PAP (Stenberger - Meyer Immunochemicals, Inc.) zawierające 2 mg/ml specyficznie oczyszczonego PAP stosowano w rozcieńczeniu 1/80.

Wybarwienie polega na traktowaniu kawałków tkanki albo specyficznym przeciwciałem, to jest BR 96, albo przeciwciałem kontrolnym, w ciągu 2,5 godziny, inkubowaniu w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej z króliczym przeciwciałem antymysim IgG rozcieńczonym 1/50 i następnie eksponowaniu na działanie mysich kompleksów PaP, rozcieńczonych 1/80, w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Po każdym traktowaniu przeciwciałem, szkiełka płukano dwukrotnie w PBS.

Reakcję immunohistochemiczną rozwijano, dodając w ciągu 8 minut świeżo sporządzony 0,5% roztwór czterochlorowodorku 3,3’-dwuaminobenzydyny (Sigma Chemical Co., St. Lonis, Mo) i 0,01% roztwór H 2O2 w 0,05 m buforze Tris, pH 7,6 [patrz Hellstrom et al., J. Immunol. 127: 157 - 60 (1981)]. Dalsza ekspozycja w ciągu 20 minut na działanie 1% roztworu C 5O4 w wodzie destylowanej intensyfikuje zabarwienie. Kawałki tkanki zraszano wodą, odwadniano alkoholem, kolorowano w ksylenie i umieszczano na szkiełkach. Równolegle kawałki tkanki zabarwiano hematoksyliną.

Szkiełka kodowano i zakodowane próbki były oceniane przez niezależnego badacza. Typowe preparaty na szkiełkach fotografowano, stosując różnicową interferencyjną optykę kontrastową (Zeiss - Nomarski). Stopień zabarwienia przeciwciała określano jako O (brak reaktywności), + (kilka słabo pozytywnych komórek), ++ (co najmniej jedna trzecia komórek pozytywnych), +++ (większość komórek pozytywnych), ++++ (niemal wszystkie komórki silnie pozytywne). Ponieważ różnice pomiędzy oceną zabarwienia + a O jest mniej wyraźna niż pomiędzy oceną zabarwienia + a ++, zabarwienia oceniane jako ++ lub więcej uważa się za dodatnie. W próbkach nowotworów obserwowano zarówno komórki nowotworowe jak i komórki osnowy. Rejestrowane zabarwienie jest zabarwieniem komórek nowotworowych, ponieważ komórki osnowy w ogóle nie ulegały zabarwieniu lub zabarwiły się znacznie słabiej niż komórki nowotworowe.

W tabeli 1 przedstawiono wyniki immunohistologicznego wybarwiania próbek różnych tkanek nowotworowych i normalnych tkanek przy użyciu monoklonalnego przeciwciała BR 96. Jak wyraźnie widać w tej tabeli, przeciwciało BR 96 reaguje z szeroką gamą rakowych komórek

167 620 ludzkich, nie reaguje z komórkami mięsaków i wykazuje tylko rzadką reaktywność wobec komórek czerniaka. Ponadto uzyskane wyniki wskazują na ograniczoną tylko reaktywność tego przeciwciała w stosunku do licznych badanych tkanek ludzkich. Jedyną reaktywność wobec normalnych komórek, jaką wykryto, było wiązanie przeciwciała przez małą subpopulację komórek, w migdałkach i w jądrach oraz wiązanie do komórek tkanki groniastej w wątrobie i do komórek nabłonkowych żołądka i przełyku.

Tabela 1

Wybarwienie immunooksydazy próbek tkanek nowotworów ludzkich i normalnych tkanek ludzkich z monoklonalnym przeciwciałem BR 96

Rodzaj tkanki	Liczba próbek pozytywnych Liczba próbek badanych
Nowotworowe rak płuc (non-small cek)	14/17
rak piersi	17/19
rak okrężnicy	15/18
rak jajników	4/4
rak macicy	2/2
czerniak	215
mięsak	0/5
rak żołądka	2/2
rak trzustki	2/2
rak przełyku	2/2
rak szyjki macicy	2/2
Normalne płuca	0/7
śledziona	0/5
piersi	0/2
okrężnica	0/7
nerki	0/7
wątroba	0/5
mózg	0/2
serce	0/3
skóra	0/3
tarczyca	0/2
nadnercze	0/2
jajniki	0/2
węzły limfatyczne	0/2
płytki limfacytów	0/4
trzustka	2/2 (tylko komórki tkanki groniastej reagowały pozytywnie)
macica	0/7
siatkówka	0/1
migdałki	2/2 (tylko niewielka subpopulacja komórek reagowała pozy-
jądra	tywnie) 2/2 (tylko niewielka populacja komórek reagowała pozytywnie)
żołądek	2/2 (komórki nabłonkowe reagowały pozytywnie)
przełyk	2/2 (komórki nabłonkowe reagowały pozytywnie)

Oceniano także wiązania przeciwciała BR 96 do różnych hodowanych linii komórkowych. Przeciwciało wiążące się z powierzchnią komórki nienaruszonych hodowanych komórek identyfikowano albo w próbie bezpośredniego wiązania przeciwciała znaczonego ¹²⁵J, jak opisano w publikacji Quantitative Analysis of Melanoma - Associated Antigen p ⁷ In Normal And Neoplastic Tissues, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:539 - 43 (1981), albo metodą bezpośredniej

167 620 immunofluorescencji przy użyciu urządzenia sortującej komórki aktywowane fluorescencyjnie Coulter Epics C (FACS) Ii [Mellstrom et al., Cancer Res. 46: 3917 - 3923 (1986)].

Do badania wiązania przeciwciała za pomocą urządzenia FACS, przygotowano próbki 2 x 10⁵do 1 x 10⁶ hodowlanych komórek w 15% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) w pożywce IMDM (Gibco, NY) o całkowitej objętości 500 gl/probówkę. Komórki odwirowywano w ciągu 1,5 minuty na wirówce Serofuge i usunięto supematant. Do każdej probówki dodano 100 gl monoklonalnego przeciwciała BR 96 w stężeniu 10 gl/ml po czym zawartość każdej probówki mieszano i inkubowano na lodzie w ciągu 30 minut. Mieszaninę reakcyjną przemyto trzykrotnie 50 gl 15% FBS/IMDM przez odwirowanie w ciągu 1,5 minuty na wirówce Serofuge (probówki osuszono bibułą po trzecim przemyciu). Następnie, do każdej probówki dodano optymalizowane FITC sprzężone z kozim przeciwmysim przeciwciałem IgG (Tago, Burlingame, CA) rozcieńczone 1:25 w 15% FBS/IMDM i mieszaninę reakcyjną mieszano i inkubowano w ciągu 30 minut. Powtórzono operację przemywania i po wysuszeniu probówek bibułą, każdą pastylkę zawieszano ponownie w 200 - 500 gl PBS. Każdą próbkę badano na urządzeniu Coulter Epics C FACS i określano średnią intensywność fluorescencyjną (MFI). Na podstawie MFI, określano liniowy równoważnik fluorescencyjny (LFE). Wartość LFE każdej badanej próbki podzielona przez wartość LFE negatywnej próbki kontrolnej wyrażała stosunek jasności komórek specyficznie wybarwionych względem przeciwciała kontrolnego. Dane dotyczące wiązania podano w tabeli 2.

T a b e1a2

Wyniki analizy wiązania BR 96 przez różne typy zawieszonych komórek na urządzeniu FACS

Linia komórkowa	Stosunek (10 gg/ml)
rak piersi	3396	54
rak piersi	MCF-7	38
rak piersi	3630	22
rak piersi	3680	22
rak płuc	2987	15
rak płuc	2707	30
rak płuc	2964	2
rak płuc	3655-3	18
rak okrężnicy	RCA	34
rak okrężnicy	3619	22
rak okrężnicy	3347	5
rak okrężnicy	HCT 116	1
rak okrężnicy	CB 5	27
rak okrężnicy	C	30
rak okrężnicy	3600	16
rak jajników	3633-3	11
czerniak	2669	1
czerniak	3606	1
czerniak	3620	1
linia komórkowa T
chłoniaka	CEM	1
linia komórkowa T
chłoniaka	MOLT-4	1
linia komórkowa B
chłoniaka	P3MR1	1
leukocyty obwodowego
układu krwionośnego		1

Jak widać z tabeli 2, monoklonalne przeciwciało BR 96 reaguje z liniami komórkowymi raka piersi, płuc i okrężnicy natomiast nie reaguje z liniami komórkowymi czerniaka ani z liniami komórkowymi B i T chłoniaka, ani też normalnymi leukocytami obwodowego układu krwio167 620 nośnego. Analiza metodą Scatcharda przy użyciu znaczonego promieniotwórczo przeciwciała wskazuje, że dla linii komórkowej wiążącej Br 96 przybliżona obliczona stała asocjacji (Ka) BR 96 wynosiła 3,6 x 10⁶ miejsc antygenowych/komórkę.

Dane te wskazują, że monoklonalne przeciwciało BR 96 rozpoznaje powierzchnię komórek do obfitej ekspresji antygenów (do 106cząsteczek/komórkę) na większości ludzkich komórek rakowych.

Przykład III. Internalizacja monoklonalnego przeciwciała BR 96 w komórkach raka

Przeprowadza się badania w celu zmierzenia internalizacji przeciwciała monoklonalnego w antygenowo pozytywnych komórkach raka. Zgodnie z jednym ze sposobów postępowania, BR96 sprzęga się z toksyną-łańcuchem A rycyny w celu utworzenia immunotoksyny, BR96-RA, a następnie określa się jej internalizację przez komórki raka. Pobranie koniugatów przez komórki raka szacuje się za pomocą określenia rozmiaru, w którym komórki nowotworu zostały zabite przez łańcuch A rycyny.

Koniugację przeciwciała z toksyną przeprowadza się następująco. Deglikozylowany łańcuch A rycyny (Inland Labs, Austin, TX) [patrz także : Blakey i in., Cancer Res., 47, 947 - 952 (1987)] poddaje się działaniu 5 mM ditiotreitolu przed filtracją żelową na Sephadex G-25 z zastosowaniem PBS (pH 7,2) jako eluentu. Dodaje się go w stosunku molowym 2 : 1 do przeciwciała w PBS, które to przeciwciało zostało uprzednio zmodyfikowane N-sukcynoimidyio-3-(2-pirydyloditio)propionianem (SPDP) (Pierce, Rockford, IL) według sposobu postępowania Lamberta i in. J. Biol. Chem., 260, 12035 - 12041 (1985). Reakcji pozwala się zachodzić w ciągu 12 - 24 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńcza się roztwór jedną objętością wody. Usunięcia przeciwciała, które nie zostało sprzężone, dokonuje się przy użyciu Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Sweden) [patrz : Knowles i in., Anal. Biochem., 160,440-443 (1987)].

Koniugat i nadmiar łańcucha A rycyny eluuje się wysokosolnym PBS (10 x PBS) i poddaje dalszemu oczyszczaniu na Sephacryl-300 (Pharmacia) z zastosowaniem PBS jako eluentu. Utworzony koniugat jest wolny od nie związanego przeciwciała monoklonalnego lub łańcucha A rycyny i składa się głównie z adduktów 1:1.

Następnie dokonuje się pomiarów internalizacji BR96-RA przez różne linie komórkowe carcinoma z zastosowaniem badania zahamowania pobierania tymidyny. Zgodnie z tym sposobem postępowania, zahamowanie włączania ³H-tymidyny do DNA komórek carcinoma (to jest zahamowanie proliferacji komórek) jest miarą cytoroksycznego wpływu BR96-RA na komórki, a przez to miarą internalizacji immunotoksyny w komórce. '

Do badania, komórki carcinoma przenosi się na 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przy 1.10⁴ komórek/dołek w 100 gl podłoża IMDM z 15% płodową surowicą cielęcą (FCS). Płytki inkubuje się w ciągu 12-18 godzin w temperaturze 37°C, aby doprowadzić do przylgnięcia komórek. Następnie usuwa się podłoże i płytki utrzymuje na lodzie. Później dodaje się 100 gl immunotoksyny BR96-RA w seryjnych rozcieńczeniach logarytmicznych (przy podstawie 10), zaczynając od stężenia końcowego 10 gg/ml i z rozcieńczaniem do 0,01 gg/ml. Mieszaninę reakcyjną inkubuje się w ciągu 4 godzin na lodzie. Płytki przemywa się, dodaje podłoża (200 gl/ml) i dalej inkubuje w temperaturze 37°C w ciągu 18 godzin. W tym etapie badania dodaje się 50 gl fH] - tymidyny przy 1 gCi/dołek i płytki inkubuje w ciągu 6 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Badane płytki zamraża się następnie do temperatury -70°C na okres co najmniej godziny i rozmraża w suszarce żelowej w ciągu 15 minut. Komórki zbiera się na filtrach z włókna szklanego (Filter Strips, No. 240-1, Cambridge Technology) w naczynkach scyntylacyjnych z tworzywa sztucznego stosując jako zbieracz komórek PHD. Do naczynek dodaje się 3 ml płynu do zliczania scyntylacyjnego i poddaje zliczaniu w liczniku scyntylacyjnym Beckman LS3891 β (1 minuta na próbkę).

Sporządza się wykresy procentowego zahamowania włączania tymidyny wobec stężenia immunotoksyny dla każdej linii komórek. Wykresy zostały przedstawione na figurach 1 - 5. W każdym badaniu przeprowadza się kontrolę. Wyniki badania wyraża się jako procent pH] tymidyny włączonej przez nie poddane działaniu komórki kontrolne.

Figura 1 przedstawia procentowe zahamowanie włączania tymidyny przez komórki z linii komórek raka sutka, spowodowane przez internalizację BR96-RA. Podobne wyniki otrzymano

167 620 z linią komórek raka płuca 2707 (figura 2) i linią komórek raka okrężnicy C (patrz figura 4). BR96-RA nie jest intemalizowana przez linię komórek HCT 116, linię ludzkich komórek raka okrężnicy, które nie wiążą BR96 (patrz figura 3). Figura 5 pokazuje brak internalizacji BR96-RA w 3347, linii komórek raka okrężnicy, z którą BR96 nie wiąże się, natomiast BR6-RA, która wiąże się z komórkami 3347, ulega internalizacji. Tak więc, badanie to przedstawia nie tylko internalizację przeciwciała BR96, ale także wybiórczość internalizacji przeciwciała BR96 w przypadku antygenowo pozytywnych komórek carcinoma.

Przykład IV. Cytotoksyczność nie zmodyfikowanego przeciwciała monoklonalnego BR96

Przeprowadza się trzy typy eksperymentów w celu prześledzenia nieoczekiwanej obserwacji, że przeciwciało monoklonalne BR96 okazuje się cytotoksyczne jako takie (to jest w stanie nie zmodyfikowanym) gdy bada się je w teście FACS. Aby uniknąć działania dopełniacza w surowicy, wszystkie surowice inaktywuje się termicznie (56°C w ciągu 30 minut). Oprócz tego, niektóre eksperymenty w przypadku analizy FACS (jak opisano poniżej) przeprowadza się na komórkach, które rosną w podłożu nie zawierającym surowicy i bada w nieobecności surowicy.

Po pierwsze, na żywe komórki, w zawiesinie, z różnych antygenowo pozytywnych linii carcinoma (3396,2987,3619) działa się przeciwciałem monoklonalnymBR96. Komórki (5.10⁵) inkubuje się na lodzie w ciągu 30 minut ze 100 gl BR96 lub kontrolnym przeciwciałem monoklonalnym w stężeniu 60, 30, 15, 7,5 i 3,8 gg/ml w podłożu hodowlanym (IMDM, 15% FBS). Po dwukrotnym przemyciu komórek podłożem hodowlanym, zawiesza się komórki w 500 fil podłoża i barwi, dodając barwnika propidium iodide, który barwi komórki martwe [Krishan, Celi Biol., 66,188 (1975), oraz Yeh, J. Immunol. Methods, 43,269 (1981)]. Z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml w 70% alkoholu przenosi się 5 gl barwnika do próbek komórek, inkubuje na lodzie w ciągu 15 minut, przemywa raz i w końcu zawiesza w 500 g l podłoża. Komórki ocenia się przy użyciu Coulter Epics C FACS, przy czym komórki martwe identyfikuje się na podstawie ich czerwonej fluorescencji. Analizę przeprowadza się przy użyciu dwuparametrowego monitora przy log rozproszenia światła do przodu w uwidocznieniu poziomym i log czerwonej fluorescencji w uwidocznieniu pionowym. Obliczenia wielkości komórek względem żywotności komórek otrzymuje się z użyciem programu Coulter Epics C Quadstat. Równolegle bada się komórki nowotworowe, które mogą wiązać BR96, jak i komórki nowotworowe, które nie mogą wiązać BR96. Wyniki przedstawia figura 6. Figura 6 pokazuje, że inkubacja komórek z każdego z trzech antygenowo pozytywnych carcinoma z BR96 powoduje szybkie ich zabicie. Nie poddane działaniu lub komórki antygenowo pozytywne nie zostają zabite.

Po drugie, komórki nowotworowe (3396, 3630,2987, 3619 i HCT 116) eksponuje się na BR96 (lub kontrolne przeciwciało monoklonalne) w ciągu 18 godzin w temperaturze 37°C w 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania przy 3.10³ komórek/dołek, w 150 gl podłoża IMDM zawierającego FBS, w ciągu 66 godzin, po czym dodaje się 50 gl pH] - tymidyny przy 1 gCi/dołek i płytkę inkubuje się w ciągu dalszych 6 godzin w temperaturze 37°C. Następnie zamraża się ją do temperatury -70°C na czas co najmniej godziny i rozmraża w suszarce żelowej w ciągu 15 minut. Komórki zbiera się na filtrach z włókna szklanego. Następnie wykonuje się badanie z trytowaną tymidyną jak opisano w poprzednim przykładzie, z tą różnicą, że komórki i przeciwciała inkubuje się w temperaturze 37°C. Figura 7 przedstawia wyniki. BR96 powoduje zahamowanie włączania pH] - tymidyny do antygenowo pozytywnych linii komórkowych, przy czym efekt ten zależny jest od dawki. Na antygenowo negatywną linię komórek HCT 116 nie wpływa stężenie BR96.

Po trzecie, stosując modyfikację sposobu postępowania opisanego przez Linsley'a i in. [Linsley i in., Identification and characterization of Cellular receptors for growth regulator, Oncostatin M, J. Biol. Chem., 264,4282 -4289 (1989)] przeprowadza się badanie zahamowania wzrostu. Komórki z czterech różnych linii komórek (HCT 116, 2987, 3396 i 3630) osadza się (3.103) w objętości 0,1 ml IMDM zawierającego 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w 96 dołkowej płytce do mikromiareczkowania w celu dopuszczenia do przyłączenia się, wciągu 3 godzin, w temperaturze 37°C. Następnie dodaje się pełne przeciwciało monoklonalne BR96 w różnych stężeniach, w objętości 0,1 ml, po czym inkubację w temperaturze 37°C kontynuuje

167 620 się w ciągu 72 godzin. Następnie usuwa się podłoże hodowlane i komórki zabarwia 0,1% fioletem krystalicznym w 20% metanolu w ciągu 30 minut i trzykrotnie przemywa PBS. Związany barwnik eluuje się 0,1 ml 0,1 M roztworu cytrynianu sodowego, pH 4,2, w 50% etanolu. Próbki bada się w trzykrotnym powtórzeniu na czytniku ELIS A z pomiarem absorbancji w obecności BR96, wraz z absorbancją próbek nie poddanych działaniu. Wyniki tego sposobu postępowania wyraża się jako procentowe zahamowanie wzrostu komórek. Figura 8 przedstawia wyniki. Wyniki tego badania są zgodne z wynikami przedstawionymi powyżej w przypadku badania włączania tymidyny (figura 7).

Przykład V. Aktywność ADCC przeciwciała BR96

Oznaczenia aktywności ADCC przeciwciała monoklonalnego BR96 dokonuje się sposobem opisanym przez Hellstroma i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 1499 - 1502 (1985). Mówiąc krótko, stosuje się test szybkiego uwalniania 51Cr z pomiarem uwalniania 51ęr, jak opisali Cerrotini i in., Adv. Immunol., 18, 67 - 132 (1974), świadczącego o lizie komórek nowotworowych (cytotoksyczność). Limfocyty krwi obwodowej od zdrowych osobników ludzkich oddziela się na Ficoll-Hypaque [Hellstrom i in., Int. J. Cancer, 27,281 - 285 (1981)] w celu dostarczenia komórek efektorowych odpowiadających 5% reaktywności naturalnych komórek cytotoksycznych wobec komórek SK-MEL-28. 10⁶ komórek znakuje się przez inkubację ze 100 gCi (1 Ci = 37 GBq) 5*Cr w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C, po czym przemywa się je trzykrotnie i ponownie zawiesza w podłożu. Znakowane komórki osadza się (2.10* komórek/dołek w 20 gl) w płytkach do mikromiareczkowania z dnami dołków w kształcie litery V (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA). Następnie dodaje się oczyszczone przeciwciało BR96 (10 gg/ml, 1 gg/ml i 0,1 gg/ml) a po nim limfocyty (2. ^/dołek, w 100 gl). Mieszaniny inkubuje się w ciągu 2 do 4 godzin, po czym płytki odwirowuje się przy 400 x g. Usuwa się supematanty i mierzy radioaktyność w 100 gl próbkach za pomocą licznika promieniowania y. Na grupę wypadają dwa powtórzenia, rozrzut między nimi jest mniejszy od 10%. Przeprowadza się szereg prób krzyżowych, w których bada się komórki docelowe raka płuca (lub okrężnicy) i czerniaka równolegle przeciwciałem monoklonalnym BR96 z przeciwciałem monoklonalnym MG-22 przeciw czerniakowi [Hellstrom i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1499 -1502 (1985)], które nie wiąże się z większością komórek carcinoma. Włączone kontrole obejmują inkubację samych komórek docelowych, albo z limfocytami bądź z samym przeciwciałem monoklonalnym oddzielnie.

Uwalnianie spontaniczne definiuje sięjako impulsy na minutę (cpm) uwolnione do podłoża przez komórki docelowe nie eksponowane ani na przeciwciała, ani na limfocyty, a uwalnianie ogółem jako ilość impulsów na minutę dla komórek docelowych poddanych lizie osmotycznej na końcu badania. Procent cytotoksyczności oblicza się jako :

uwalnianie w grupie badanej - uwalnianie spontaniczne χ uwalnianie ogółem - uwalnianie spontaniczne

Komórki efektorowe charakteryzuje się przez ocenę ich wrażliwości na inkubację z przeciwciałem przeciw markerowi powierzchniowemu Leu-1 1b i dopełniaczem świnki morskiej stosując sposoby postępowania opisane przez Hellstroma i in., w Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, wyd. Reisfeld & Sell, Liss, New York, tom XXVII, str. 149 - 164 (1985), co włączono do niniejszego opisu jako odnośnik. Przeprowadza się to w celu pomiaru ekspresji markera Leu-1 1b charakteryzującego naturalne komórki cytotoksyczne (NK) i wyraża jako ADCC, w której pośredniczą limfocyty, przeciw ludzkim komórkom czerniaka w obecności przeciwciała monoklonalnego BR96. Cytotoksyczność samych komórek efektorowych (naturalny efekt cytotoksyczny) została od danych przedstawionych na figurze 9 odjęta.

Wyniki przedstawione na figurze 9 dla stężenia przeciwciała 10 gg/ml wskazują, że BR96 pośredniczy w aktywności ADCC jeśli jest obecne w wystarczającym stężeniu i jeśli komórki docelowe wykazują ekspresję epitopu w wystarczających stężeniach. Aktywność ADCC można zauważyć przy stężeniach przeciwciała niższych od tych, przy których przeciwciało jest cytotoksyczne jako takie (zwykle około 20 gg/ml). Gdy przeciwciało BR96 stosuje się samo jako

167 620 kontrolę, daje ono 0% zabicia przy badanych stężeniach i przy użyciu badania ⁵¹Cr. Aktywność ADCC stwierdza się tylko w przypadku linii komórek wiążących przeciwciało BR96. Tak więc, komórki z pięciu różnych linii carcinoma, które wszystkie wiążą BR96 zostają zabite via ADCC przy stężeniach przeciwciała monoklonalnego niższych od 0,1 gg/ml, podczas gdy komórki z szóstej linii, 2964, które nie wiążą BR96, nie zostają zabite. Wymaganie wiązania przeciwciała w celu otrzymania ADCC zostaje dalej wykazane przez fakt, że obydwa z dwóch raków, które mogą się wiązać z innym przeciwciałem, L6 (linie 3619 i 2987) zostawały zabite przez L6 via ADCC, podczas gdy inne nie. W warunkach badania, samo BR96 powoduje wydzielenie tylko 1% znakowania, nawet gdy jest badane w stężeniu 10 gg/ml.

Przykład VI. Zdolność BR96 do pośredniczenia w cytotoksyczności, w której pośredniczy dopełniacz (CDC)

Badania służące do oceny zdolności przeciwciała monoklonalnego BR96 do zabijania komórek nowotworowych w obecności surowicy ludzkiej jako źródła dopełniacza (cytotoksyczność, w której pośredniczy dopełniacz) (CDC) prowadzi się podobnie do badań dotyczących ADCC opisanych w przykładzie V, powyżej, z tym wyjątkiem, że na dołek do mikrobadania daje się 100 gl surowicy ludzkiej od normalnych ludzkich osobników rozcieńczonej 1 : 3 do 1 : 6 jako źródło dopełniacza zamiast zawiesiny komórek efektorowych.

Jak przedstawiono na figurze 10, CDC wobec komórek wiążących BR96 jest widoczna przy stężeniu przeciwciała 0,1 - 5,0 gg/ml, podczas gdy nie występuje CDC wobec BR96-antygenowo negatywnych linii HCT 116 i 3347. Komórki 3347 mogą jednak zostać zabite, gdy używa się przeciwciała monoklonalnego L6, które wiąże się z tymi komórkami. Zawsze włącza się kontrolne, w których bada się BR96 w nieobecności dopełniacza. Nie wykrywa się zabijania przez samo BR96 w badaniu uwalniania ⁵¹ Cr. Dane te wykazują, że BR96 wywiera działanie cytotoksyczne w obecności surowicy ludzkiej przy stężeniach, które nie są cytotoksyczne jako takie. (Przeciwciało kontrolne nie daje CDC).

Przykład VII. Oznaczenie reaktywności BR96 wobec glikolipidów i glikoprotein

Przeciwciało BR96 bada się pod względem reaktywności wobec rozmaitych unieruchomionych antygenów glikolipidowych o znanej strukturze węglowodorowej i syntetycznych glikoprotein (tak zwanych neoglikoprotein) przy zastosowaniu ELISA, przy czym glikolipidów i glikoprotein oraz przeciwciała używa się w nadmiarze [Dr John Magnani, Biocarb, Gaithersburg, MD; Lloyd i in., Immunogenetics, 17, 537 - 541 (1983)]. Glikolipidy suszy się z metanolu w mikrolitrowych dołkach przy 10ng/dołek. Syntetycznymi glikoproteinami powleka się powierzchnie dołków przez inkubację glikoproteiny rozcieńczonej do 200 ng/dołek w roztworze soli buforowanym fosforanami, pH 7,4. Oczyszczone przeciwciało BR96 badano w stężeniu 10 gg/ml w 0,01 M Tris-HCl, pH 7,4 zawierającym 1% BSA i 1% bydlęcej albuminy surowiczej, a przeciwciała z płynu puchlinowego w rozcieńczeniu 1:100 w tym samym buforze. W tych wysokich stężeniach łatwo jest wykryć większość wiążących oddziaływań. Wartości absorbancji oblicza się jako średnią z dwóch powtórkowych dołków. Wyniki analiz zostały przedstawione na figurach 11 i 12 i ujawniają one, że BR96 reaguje z antygenem LeY.

Stwierdzenia te wskazują na to, że BR96 może wiązać się z wariantową postacią antygenu Lewis Y (Fuc α 1 -2Galp 1 -4/Fuc α 2-3/GlcNAc i że fukoza β 1 -3 przyłączona do GlcNAc) tworzy część epitopu pokrewnego LeY rozpoznawanego przez BR96. Wysoka swoistość BR96 wobec nowotworu i zdolność intenalizowania się (nieopisana uprzednio dla przeciwciał monoklonalnych reaktywnych z antygenami LeY) sugeruje, że przeciwciało rozpoznaje epitop złożony, którego część obejmuje antygen LeY.

Przykład VIII. Ocena działania przeciwciał BR96 in vivo

Siła działania terapeutycznego niemodyfikowanego przeciwciała BR96 w leczeniu nowotworów zbadano w serii doświadczeń z użyciem ksenografów ludzkiego nowotworu u bezwłosej myszy. Zbadano ponadto pewne parametry, które mogłyby mieć wpływ na skuteczność działania BR96 jako środka przeciwnowotworowego. Do tych parametrów należą poziom ekspresji antygenu w linii komórek docelowego nowotworu, okres czasu pomiędzy implantacją nowotworu i zapoczątkowaniem terapii oraz wpływ dawki.

We wszystkich doświadczeniach in vivo określonej liczbie myszy Balb/c nu/nu (Harlan Spraque Dawley, Indianapolis, Indiana, St. Zj. Ameryki) wszczepiono albo komórki z linii

167 620 komórek ludzkiego raka gruczołowego płuc H2987, albo z linii nowotworu H2707. Komórki z tych linii nowotworowych, wyhodowane in vitro, zebrano, przemyto i wytworzono z nich ponownie suspensję w PBS, po czym każdej myszy podano podskórnie 10 milionów komórek w boczną tylną część ciała. Myszy podzielono losowo na mniejsze grupy liczące po 8 - 10 zwierząt.

W celu zwiększenia szansy zaobserwowania wszelkich efektów działaniaBR96, wziąwszy pod uwagę fakt, iż przeciwciało musi zlokalizować miejsce wszczepienia nowotworu aby jakiekolwiek oddziaływanie rzeczywiście zaszło, terapię rozpoczęto w 24 godziny po wszczepieniu nowotworu, w dniu 2. Zarówno BR96, jak i kontrolny Macs podawano w tej samej dawce i według tego samego planu, jakkolwiek w niektórych przypadkach następowały zmiany momentu zapoczątkowania terapii. Dawkę leczniczą w 0,2 ml PBS podawano dożylnie do żyły ogonowej myszy. Normalny plan obejmował podawanie dawki raz na trzy dni, ogółem 5 dawek (Q3Dx5). W dniu 19 i 21 od wszczepienia nowotworu H2987 w początkowym doświadczeniu przeprowadzono dodatkowe dwa wstrzyknięcia.

Działanie przeciwciała BR96 na nowotwory 2987 i 2707

Objętość nowotworów u każdego zwierzęcia określano raz w tygodniu, przy czym pomiary rozpoczynano zazwyczaj w ósmym dniu po wszczepieniu. Objętość nowotworu obliczano na podstawie pomiarów długości i szerokości pionowej, według wzoru:

objętość nowotworu = największa długość x (pionowa szerokość²/2)

Następnie obliczano wartości średnie dla grup i sporządzano wykresy w funkcji czasu od wszczepienia.

W początkowym doświadczeniu przedstawionym na fig. 13 w wyniku działania BR96 uzyskano bardzo znaczące efekty pod względem działania przeciw linii komórek H2987. Jako negatywny środek kontrolny stosowano BR64, które także ulega związaniu przez te komórki i jest przez nie internalizowane. Nie zaobserwowano żadnego działania lub bardzo słabe działanie wobec osobników kontrolnych traktowanych PBS.

W tabeli 3 zestawiono działanie wobec poszczególnych nowotworów pod koniec zabiegów w tym pierwszym doświadczeniu

Tabela 3

Wpływ działania niemodyfikowanego BR96 podawanego w różnych okresach czasu od wszczepienia H2987, doświadczenie 1, dzień 28

Grupa	MAb	Reakcja nowotworu
pełna	częściowa	stała	postęp
1	BR96	2	0	3	5
2	BR64	0	0	1	9
3	PBS	0	0	0	10

Tylko w wyniku działania przeciwciała BR96 nowotwór zniknął całkowicie. Dwa zwierzęta z tej grupy były wolne od nowotworu, zaś trzy zwierzęta wykazywały ustanie wzrostu nowotworu po podziałaniu przeciwciałem BR96. Dwie myszy wolne od nowotworu wykazywały brak jego oznak przez czas trwania doświadczenia.

Działanie przeciwnowotworowe przeciwciała BR96 wobec nowotworów ustalonych.

Jednym z celów końcowych terapii przeciwnowotworowej jest skuteczne zwalczanie nowotworów już ustalonych i rosnących. W celu stwierdzenia, czy BR96 mogłoby mieć działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworom, zastosowano ksenografty linii komórkowych H2987 i H2707 u bezwłosych myszy. Ze względu na to, że obie te linie nowotworowe dają wyczuwalne nowotwory po 8 dniach od podskórnego podania 10 milionów komórek, metoda badania działania przeciwnowotworowego wobec ustalonych nowotworów była oparta na opóźnieniu rozpoczęcia terapii. Tak więc w celu dalszego zbadania skuteczności niemodyfikowanego BR96 przeprowadzono kilka doświadczeń, w których zabiegi terapeutyczne rozpoczynano dopiero w 5 lub 8 dni od podskórnego wszczepienia nowotworu. Dzięki temu

167 620 opóźnieniu rozpoczęcia zabiegów komórki nowotworowe miały czas na stanie się ustalonym nowotworem. W ten sposób uzyskuje się model zwierzęcy, którego leczenie jest trudniejsze, lecz stanowi on pełniejsze odzwierciedlenie rzeczywistej sytuacji klinicznej.

Protokół zabiegów przedstawiono w tabeli 4. Trzem grupom myszy liczącym po 10 zwierząt podawano przeciwciało BR96 począwszy od różnych dni w stosunku do dnia wszczepienia nowotworu. Myszy kontrolne dostawały albo FA6, albo PBS począwszy od dnia 2. FA6 jest mysim IgG 3 skierowanym przeciw bakteryjnemu antygenowi nie występującemu u ssaków, działającemu jako niewiążące, negatywne kontrolne przeciwciało monoklonalne, zgodne z izotypem. .

Tabela 4

Wpływ leczenia niemodyfikowanym BR96 rozpoczynanego w różnych okresach czasu po wszczepieniu H2987 i H2707, zabiegi według planu Q3Dx5, i.v.

Grupa	MAb	Dawka (mg)	Dni wstrzyknięć
1	BR96	1	2, 5, 8, 11, 14
2	BR96	1	5, 8, 11, 14, 17
3	BR96	1	8, 11, 14, 17,20
4	FA6	1	2, 5, 8, 11, 14
5	PBS	0,2	2, 5, 8, 11, 14

Wyniki doświadczeń prowadzonych według powyższego protokołu dla linii komórkowych nowotworów H2987 i H2707 przedstawiono na fig. 14, stanowiącej wykres przedstawiający liczbę zwierząt bez nowotworów w funkcji czasu rozpoczęcia terapii od chwili wszczepienia nowotworu. Brak nowotworu, za który przyjmowano brak wyczuwalnego nowotworu, oceniano po zakończeniu terapii w każdej z grup. Dni, w których stwierdzano brak nowotworu były różne, gdyż terapię zaczynano w różnych dniach od wszczepienia nowotworu. Wczesne rozpoczęcie terapii było najwyraźniej skuteczniejsze, zaś skuteczność zmniejszała się w miarę wydłużenia okresu między wszczepieniem nowotworu i rozpoczęciem terapii. Opóźnienie terapii pozwala na większy wzrost i lepsze ustalenie się nowotworu, tak więc obniżenie skuteczności terapii przy późniejszym jej rozpoczęciu odzwierciedla rosnące trudności w leczeniu większych i lepiej ustalonych nowotworów.

Uzyskane rezultaty świadczą o tym, że BR96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw dwu różnym liniom komórkowym nowotworów. Działanie przeciwnowotworowe obserwowano wyłącznie w grupach traktowanych BR96, podczas gdy u zwierząt traktowanych FA6 i PBS działanie takie nie wystąpiło.

Jest znaczące, iż różnice w skuteczności wobec lepiej ustalonych nowotworów są większe w przypadku linii nowotworu H2707 o wyższej ekspresji antygenu. Fakt, że H2707 jest bardziej podatny na leczenie BR96 niż H2987 jest zgodny z założeniem, że ilość ulegającego ekspresji antygenu może wpływać na skuteczność terapii BR96. Z powyższych danych wynika, że BR96 wykazuje działanie przeciwnowotworowe przeciw ustalonym nowotworom.

Wpływ dawki przeciwciała BR96

W innym doświadczeniu badano wpływ dawki BR96 na linię nowotworu H2707. W doświadczeniu tym BR96 podawano w ilości malejącej półlogarytmicznie od 1 mg/dawkę do 0,032 mg/dawkę.

Wykres średniej objętości nowotworu w wersji czasu od wszczepienia nowotworu przedstawiono na fig. 15. Zwierzętom kontrolnym podawano wyłącznie najwyższą dawkę monoklonalnego przeciwciała FA6, 1 mg/dawkę. U tych zwierząt kontrolnych nie stwierdzono żadnego działania przeciwnowotworowego, podczas gdy w przypadku podawania BR96 w wybranym zakresie dawkowania wystąpiła reakcja zależna od dawki.

Działanie przeciwnowotworowe fragmentu F(ab’)2 i chimerycznego BR96

Dodatkowo zbadano działanie przeciwnowotworowe fragmentu F(ab ’)2 BR96 dla stwierdzenia, czy działanie przeciwnowotworowe obserwowane in vivo występuje dzięki części Fc, czy też dla zabicia komórki wystarczy rzeczywiste związanie z nowotworem, a następnie internalizacja, na co wskazywałyby wyniki prób in vitro. Stosowano dawkę fragmentu F(ab ’)2

167 620

0,66 mg/dawkę, z użyciem takiego samego planu podawania jak przy całym BR96. Dawka ta odpowiadała w przybliżeniu równoważnikowi molowemu regionów w porównaniu z dawką 1,0 mg/dawkę całego IgG 3 BR96. Średnie wartości objętości nowotworu w funkcji czasu po wszczepieniu nowotworu dla grupy traktowanej fragmentem przeciwciała podano na fig. 16. Wystąpiło wyraźne działanie przeciwnowotworowe, jakkolwiek nie było ono tak silne jak w przypadku całego antyciała. Działanie to było wyraźniejsze we wcześniejszych punktach czasowych podczas i natychmiast po zabiegach.

W doświadczeniu tym zbadano także przeciwnowotoworowe działanie^ chimerycznego BR96. Dla chimerycznego Mab wybrano dawkę pośrednią 0,32 mg/dawkę. Średnią objętość nowotworu u myszy z tej grupy przedstawiono na fig. 16. Wyniki terapii były lepsze niż w przypadku porównywalnej dawki mysiego BR96 IgG3. Jest to zademonstrowane dodatkowo na fig. 17, z której wynika, że 6 na 8 myszy traktowanych chimerycznym BR96 było wolnych od wyczuwalnych nowotworów po zakończeniu zabiegów.

Badanie poszczególnych nowotworów przedstawionych na fig. 17 wykazało, że po zakończeniu zabiegów widoczny jest wyraźny wpływ dawki gdy weźmie się pod uwagę liczbę myszy bez nowotworów przy malejącej dawce całego przeciwciała IgG3 BR96, od 1,0 do 0,1 mg/dawkę. Nieoczekiwanie okazało się, że rezultaty uzyskane dla dawki 0,032 mg/dawkę są podobne dla uzyskanych dla dawki 0,32 mg/dawkę. Może to odzwierciedlać fakt, iż poziom komórek uśmierconych w nowotworze w wyniku terapii może być bardzo bliski minimalnej ich ilości potrzebnej nowotworowi dla dalszego rozrostu.

Trzy z ośmiu zwierząt traktowanych fragmentem F(ab ’)2 były wolne od wyczuwalnych nowotworów po zakończeniu zabiegów. Tak więc część Fc nie jest koniecznie potrzebna przeciwciału dla wywarcia przeciwnowotworowego działania in vivo, jakkolwiek powinna ona zwiększać działanie przeciwnowotoworowe BR96, zwłaszcza u zwierząt immunokompetentnych.

Powyższe wyniki udowodniają, że niemodyfikowane przeciwciała BR96 są skutecznymi środkami przeciwnowotworowymi działającymi przeciw liniom komórek nowotworowych in vivo. Ponadto przeciwciała BR96 mają działanie wobec ustalonych nowotworów rosnących. Istnieje wskazanie, iż wyższa gęstość antygenowa w linii nowotworowej może zwiększać zdolność BR96 do uśmiercania komórek. Wykazano, że wszelkie postacie przeciwciała monoklonalnego, to jest przeciwciało chimeryczne, całe mysie IgG 3 lub fragment F(ab’)2, są skutecznymi środkami przeciwnowotoworowymi. Zalecane są większe dawki oraz wcześniejsze rozpoczynanie terapii.

Przykład IX. Lokalizacja i biodystrybucja przeciwciał BR96

W celu ustalenia charakterystyk biodystrubucji zastosowano znaczone jodem promieniotwórczym monoklonalne przeciwciała BR96, w dawkach użytych w doświadczeniach terapeutycznych opisanych w przykładzie VIII. W szczególności, do lokalizacji w nowotworze i różnych innych organach zastosowano całe IgG 3, BR96, przeciwciało chimeryczne i fragment F(ab’)2, wraz z odpowiednimi przeciwciałami kontrolnymi (całe monoklonalne przeciwciało FA6, chimeryczne 96,5 i chimeryczne 96,5 F(ab’)2.

Przed doświadczalną lokalizacją zwierzętom wstrzyknięto komórki nowotworowe postąpiwszy jak w przykładzie VIII, w celu przeprowadzenia badań wpływu terapii. Pozwolono, by nowotwory wzrastały w ciągu około 2 tygodni. Po tym okresie czasu 10 gg przeciwciała BR96 lub fragmentu poddano znaczeniu ^l25I z użyciem 10 gg Iodogen przez 10 minut, w temperaturze pokojowej, zgodnie z zaleceniami producenta. Kontrolne przeciwciała lub fragmenty poddano znaczeniu ^13lJ z użyciem tej samej metody. Te znaczone przeciwciała rozcieńczono odpowiednimi nie znaczonymi przeciwciałami do uzyskania dawki stosowanej w terapii doświadczalnej. Specyficzne i niespecyficzne przeciwciała zmieszano i podano dożylnie razem, do żyły ogonowej myszy. Po z góry określonym czasie wybrano losowo myszy z grupy, znieczulono je, wykrwawiono przez splot oczodołowy i uśmiercono. Usunięto różne tkanki, zważono je i poddano zliczaniu przy użyciu licznika zdolnego do rozróżnienia sygnałów od dwóch promieniotwórczych izotopów jodu. Na podstawie tych danych obliczono procentową wstrzykniętą dawkę i procentową wstrzykniętą dawkę na gram. Dane zgromadzone dla 24-go punktu czasowego doświadczenia lokalizacyjnego zestawiono w tabeli 5.

167 620

TABELA 5

Zestawienie wyników prób biodystrybucji

% dawki wstrzykniętej po upływie ?4 godzin od jej podania na 1 gram	Płuca	O	Γ- Csl Γ- 00 m iT) CO CO ****** r-s •m> co co Csi co co \/V
Nerki	σ>	τ , r- Csi o σ> coco ****** Λ co CM <N CM r-f VV
Śledziona , I	00	O M) 00 MO COCO ******* r-i r-4<—trdi—łr-łt—ł VV
Wątroba		Csl rd 00 O ^J· 00 COCO * * - *· OO CsJ Csl rH Cs] r-ł «—1 VV
Nowotwór	MO	co rH o r- Csi co - - *· - » OO <£> csj r- csi od csj vv
Krew	m	co o σ> cm m coco S M? o m ę ę
Linia komórek nowotworowych		r- r- r- γ- οο o o o σ> r- r- t— CsJ Csl Csl Csl X X X X
Dawka (mg)	co	o o <o co mm <_> MJ m co MO M5 M O O J· J Q-
Przeciw- ciało	Cs]	co co mo m csi O O o 1 M> 1 MO X MO Z? ' S S Lc X — m CQ CQ . O O Cm
	r—ł	r-ł Csl CO •'T

167 620

Jedyną tkanką wykazującą znaczące różnice między specyficznym i niespecyficznym przeciwciałem jest nowotwór. Wszystkie inne badane tkanki wykazały w przybliżeniu równy pobór specyficznych i niespecyficznych przeciwciał. Jedynym może wyjątkiem jest niższy poziom we krwi niespecyficznego przeciwciała FA6. Wskazuje to na przyspieszone oczyszczanie krwi z tego przeciwciała. Jednakże różnica między poziomem specyficznych i niespecyficznych przeciwciał w nowotworze jest większa niż różnica w poziomie FA6 i BR96 we krwi.

Z danych w tabeli 5 wynika także, że procentowa dawka obecna w danym organie jest stała, bez względu na wielkość dawki podanej. Wskazywałoby to zatem na fakt, iż ilość przeciwciał w nowotworze jest wyższa, gdy poda się wyższą dawkę. Ponadto nie ma widocznej różnicy między dwiema liniami nowotworowymi pod względem poboru przeciwciał specyficznych i niespecyficznych.

Z tabeli 5 wynika również, że F(ab ’)2 jest usuwana z organizmu zwierzęcia znacznie szybciej niż IgG3 czy chimeryczne BR96. Może to tłumaczyć spadek skuteczności fragmentu w porównaniu ze skutecznością całego przeciwciała w terapii. Tak więc wszelkie działanie przeciwnowotworowe fragmentu musi być wywierane bardzo szybko i zachodzić w krótkim okresie czasu, przed wydaleniem fragmentu.

Chimeryczne BR96 ulega lokalizacji na poziomie porównywalnym z IgG3 BR96. W porównaniu z kontrolnym przeciwciałem chimerycznym wyższa ilość znajdowała się jedynie w nowotworze. Sugeruje to, iż zwiększenie skuteczności chimerycznego przeciwciała w porównaniu z mysim BR96 wynika ze stałego regionu podstawienia u człowieka. Równie ważne jest to, że wydaje się, iż stały region podstawienia u człowieka nie wpływa na zdolność chimerycznego przeciwciała do umiejscowienia się w nowotworze i nie oddziaływuje niekorzystnie na jego biodystrybucję.

Reasumując, IgG3 i inne postacie BR96 są zdolne do specyficznego umiejscowienia się w miejscu występowania nowotworu. Co więcej, zarówno lokalizacja, jak i działanie przeciwnowotworowe wystąpiły w tych wstępnych doświadczeniach przy podobnych dawkach. Pośrednim dowodem lokalizacji fragmentów F(ab ’)2 jest działanie przeciwnowotworowe fragmentów w terapii doświadczalnej. Działanie takie musi wystąpić przed upływem 24 godzin.

167 620 objętość nowotworu

Fig. 13

167 620

Leczenie (dzień rozpoczęcia)

Fig.14

Fig.15

167 620

Fig.16

Fig. 17

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania nowego mysiego przeciwciała monoklonalnego BR96 należącego do podklasy IgG 3, znamienny tym, że zaszczepia się mysz komórkami antygenowymi z gruczolaka ludzkiej piersi 3396 i otrzymane limfocyty poddaje się fuzji z komórkami linii szpiczaka, otrzymuje się komórki hybrydoma, hoduje się komórki hybrydoma na podłożu selekcyjnym i wyselekcjonowuje się hybrydomę wydzielającą mysie przeciwciało monoklonalne BR96, zdeponowanego w ATCC pod nr 10036.

   * it *