NO884304L - EXPRESSION OF PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITT PROTEIN WHICH DOES. - Google Patents
EXPRESSION OF PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITT PROTEIN WHICH DOES.Info
- Publication number
- NO884304L NO884304L NO884304A NO884304A NO884304L NO 884304 L NO884304 L NO 884304L NO 884304 A NO884304 A NO 884304A NO 884304 A NO884304 A NO 884304A NO 884304 L NO884304 L NO 884304L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- vector
- falciparum
- fragment
- yeast
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 57
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 title claims description 56
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 89
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 claims description 82
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 65
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 41
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 14
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 4
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000009188 Phyllostachys vivax Species 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 3
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 101100174613 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TDH3 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 101150060644 ARG3 gene Proteins 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101900205473 Plasmodium falciparum Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 2
- 101100462418 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ARG3 gene Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229940124735 malaria vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- VIWIWXKTPWZMEW-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropanoic acid;propane-1,2,3-triol Chemical compound CC(O)C(O)=O.OCC(O)CO VIWIWXKTPWZMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 6,7-dihydrodipyrido[1,2-b:1',2'-e]pyrazine-5,8-diium;dibromide Chemical compound [Br-].[Br-].C1=CC=[N+]2CC[N+]3=CC=CC=C3C2=C1 ODPOAESBSUKMHD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700024123 Arginases Proteins 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000005630 Diquat Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150103048 ERG3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 108010026624 GTCGAC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001120470 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710113020 Ornithine transcarbamylase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 241000224028 Plasmodium cynomolgi Species 0.000 description 1
- 241000223801 Plasmodium knowlesi Species 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- -1 beta-lactoglobin Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- CETPSERCERDGAM-UHFFFAOYSA-N ceric oxide Chemical compound O=[Ce]=O CETPSERCERDGAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000422 cerium(IV) oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 108010013908 endodeoxyribonuclease HpaI Proteins 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 101150111766 sc gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Ekspresjon av falciparum circumsporozoitt-protein hos gjær Expression of falciparum circumsporozoite protein in yeast
Bakgrunn for oppfinnelsenBackground for the invention
Foreliggende oppfinnelse angår ekspresjonen av P\ falci<p>arum circumspozositt-protein av gjær, samt en vaksine omfattende en immunobeskyttende mengde av slikt protein. The present invention relates to the expression of P\ falci<p>arum circumspozosite protein by yeast, as well as a vaccine comprising an immunoprotective amount of such protein.
Mange nylige studier antyder at beskyttende immunitet i en følsom vertsorganisme for infeksjon av sporozoitt-stadiet hos en spesiell type plasmodium kan overføres via antistoff dannet av en slik vertsorganisme mot circumsporozoitt-protein (CS protein) av den spesielle sporozoitt. Foreliggende oppfinnelse muliggjør dannelsen av CS proteinet til den menneskelige malariaparasitt P^.falciparum eller et immunogent derivat derav fra gjær ved rekombinante DNA-teknikker. Many recent studies suggest that protective immunity in a susceptible host organism to infection by the sporozoite stage of a particular type of plasmodium can be transferred via antibody produced by such a host organism against the circumsporozoite protein (CS protein) of that particular sporozoite. The present invention enables the formation of the CS protein of the human malaria parasite P^.falciparum or an immunogenic derivative thereof from yeast by recombinant DNA techniques.
Det er ønskelig å bruke gjær for dannelsen av slikt P. falciparum CS-protein av flere grunner, innbefattende de velkjente og pålitelige fermenteringskarakteristika av endotoksin når slikt CS-protein blir fremstilt i gjær i stedet for gram-negative bakterieceller, såsom L coli. It is desirable to use yeast for the production of such P. falciparum CS protein for several reasons, including the well-known and reliable fermentation characteristics of endotoxin when such CS protein is produced in yeast rather than gram-negative bacterial cells, such as L coli.
Nussenzweig et al., US patent 4.466.917, foreslår et sporozoitt polypeptid fra Plasmodium falciparum. identi-fisiert som Pf-44 proteinet, og dets kloning og ekspresjon i E. coli. Nussenzweig et al., US patent 4,466,917, proposes a sporozoite polypeptide from Plasmodium falciparum. identified as the Pf-44 protein, and its cloning and expression in E. coli.
Sharma et al., Science. 228, 279-281 (1985) beskriver ekspresjonen av en del av circumsporozoitt-proteinet (CS) i Plasmodium knovlesi av gjær ved å bruke en ekspre-sjonsvektor inneholdende den 5' regulatoriske region til gjæralkohol-dehydrogenase I-genet i stedet for den 5' oppstrømsregion til P. knovlesi SC gensekvensen. Sharma et al., Science. 228, 279-281 (1985) describes the expression of part of the circumsporozoite protein (CS) in yeast Plasmodium knovlesi using an expression vector containing the 5' regulatory region of the yeast alcohol dehydrogenase I gene instead of the 5' ' upstream region of the P. knovlesi SC gene sequence.
New York University, PCT ansøkning, publikasjonsnummer WO 84-02922-A, publisert 2. august 1984, beskriver kloning av en del av den kodende region for P. knovlesi CS-protein gjentagelsesenheten samt ekspresjon av beta-lactamase og beta-galactosidase-fusjoner derav i E. coli. New York University, PCT Application, Publication Number WO 84-02922-A, published August 2, 1984, discloses cloning of a portion of the coding region of the P. knovlesi CS protein repeat unit and expression of beta-lactamase and beta-galactosidase fusions hence in E. coli.
Kemp et al., W084-02917-A, beskriver kloning og ekspresjon i E. coli av en kodende sekvens for CS-proteinet avledet fra blodstadiet til P. falciparum. Kemp et al., WO84-02917-A, describe the cloning and expression in E. coli of a coding sequence for the CS protein derived from the blood stage of P. falciparum.
Dame et al., Science 225, 593 (1984) angir kloning og ekspresjon av CS-protenet til P. falci<p>arum i E. coli. Proteinet er beskrevet som bestående av ca. 412 aminosyrer med en omtrentlig molekylvekt på 44.000. Den omfatter 41 tandem-repetisjoner av et tetrapeptid. Syntetiske 7-, 11-og 15-residiums-peptider avledet fra gjentagelsesregionen bandt seg til monoklonale antistoffer fremskaffet mot CS proteinet. Dame et al., Science 225, 593 (1984) report cloning and expression of the CS protein of P. falci<p>arum in E. coli. The protein is described as consisting of approx. 412 amino acids with an approximate molecular weight of 44,000. It comprises 41 tandem repeats of a tetrapeptide. Synthetic 7-, 11- and 15-residue peptides derived from the repeat region bound to monoclonal antibodies raised against the CS protein.
Ellis et al., Nature, 302, 536 (1983), angir ekspresjon av beta-lactamase - P. knowlesi CS-proteinfusjon i E. coli. Ellis et al., Nature, 302, 536 (1983), report expression of beta-lactamase - P. knowlesi CS protein fusion in E. coli.
Weber et al., Molecular and Bacterial Parasitology. 15, 305-316 (1985), beskriver bruken av et CS-protein-gen fra en brasiliansk stamme av P. falciparum.klonet i E. coli, som en sonde for å analysere strukturen til 17 andre P. falciparum- st ammer ved nukleinsyrehybridisering og oppsummerer at CS-proteingenet er sterkt konservert i P. falciparum og at utvikling av malariavaksine med CS-proteinet er lite sann-synlig og blir komplisert ved stammevariasjoner. Weber et al., Molecular and Bacterial Parasitology. 15, 305-316 (1985), describes the use of a CS protein gene from a Brazilian strain of P. falciparum cloned in E. coli as a probe to analyze the structure of 17 other P. falciparum strains by nucleic acid hybridization and summarizes that the CS protein gene is highly conserved in P. falciparum and that the development of a malaria vaccine with the CS protein is unlikely and is complicated by strain variations.
Arnot et al., Science. 230, 815-818 (1985) beskriver Arnot et al., Science. 230, 815-818 (1985) describes
kloningen av CS-proteinet fra P. vivax ved å bruke en sonde avledet fra P. cynomolgi CS-genet for å isolere det homologe gen fra et bakteriofag bibliotek av klonet P. vlvax genomisk DNA samt bestemmelse av dets totale kodende sekvens, og konkluderer med at den kodende sekvens til CS-proteinet fra the cloning of the CS protein from P. vivax using a probe derived from the P. cynomolgi CS gene to isolate the homologous gene from a bacteriophage library of cloned P. vlvax genomic DNA as well as determination of its total coding sequence, concluding with that the coding sequence of the CS protein from
P. vivax er homolog med den til CS-genet fraP. vivax is homologous to that of the CS gene from
P. knowlesl.men ikke P. falciparum.P. knowlesl.but not P. falciparum.
Young et al, Science, 228, 958-962 (1985), beskriver ekspresjonen av P. falciparum CS-proteiner i E. coli for mulig bruk i en menneskelig malariavaksine. Young et al, Science, 228, 958-962 (1985), describe the expression of P. falciparum CS proteins in E. coli for possible use in a human malaria vaccine.
The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, PCT patentsøknad W084/02917 publisert 2. august 1984, beskriver kunstig konstruerte polynukleotidsekvenser som i hovedsak tilsvarer alt eller en del av P. falciparum mRNA eller genomisk DNA, peptidet som tilsvarer en slik sekvens samt en metode for fremstilling derav og en binding for å stimulere immunforsvaret mot P. falciparum antigener omfattende slike peptider i pattedyr. The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, PCT patent application W084/02917 published August 2, 1984, discloses artificially constructed polynucleotide sequences that correspond substantially to all or part of P. falciparum mRNA or genomic DNA, the peptide corresponding to such sequence, and a method for the production thereof and a bond for stimulating the immune system against P. falciparum antigens comprising such peptides in mammals.
Mazier et al., Science, 231, 156-159 (1986), beskriver at antistoff fremskaffet i mus immuniset med flere rekombinante og syntetiske peptider av circumsporozoitt-proteinet fra P. falciparum ble vurdert for beskyttende aktivitet i et humant hepatosytt kultursystem. Mazier et al., Science, 231, 156-159 (1986), describe that antibody raised in mice immunized with several recombinant and synthetic peptides of the circumsporozoite protein from P. falciparum was assessed for protective activity in a human hepatocyte culture system.
Barr et al. "Modern Approaches to New Vaccines and Aids", side 22, Cold Spring Harbor, New York, 3.-14. september 1986, beskriver ekspresjonen hos S. cerevlsiae av en del av den P. vivax CS-proteinkodende sekvens fusert med en gjæralkohol-dehydrogenase-2/glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase hybrid promoter. Barr et al. beskriver bruken av en regulert hybridpromoter for ekspresjon av P. vivax CS-proteinet. Denne promoters nøyaktige struktur er ikke beskrevet. CS-sekvensen brukt for fusjon til promoteren mangler C-terminalregionen, som er en "anker"-region for innsetning i cellemembranen. Den nøyaktige grense er ikke angitt. Hvorvidt gensekvensen som brukes ved dannelsen også innholder signalsekvensen, er ikke beskrevet. Barr et al. "Modern Approaches to New Vaccines and Aids", page 22, Cold Spring Harbor, New York, 3-14 September 1986, describes the expression in S. cerevliae of a portion of the P. vivax CS protein coding sequence fused to a yeast alcohol dehydrogenase-2/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase hybrid promoter. Barr et al. describes the use of a regulated hybrid promoter for expression of the P. vivax CS protein. The exact structure of this promoter has not been described. The CS sequence used for fusion to the promoter lacks the C-terminal region, which is an "anchor" region for insertion into the cell membrane. The exact limit is not specified. Whether the gene sequence used in the formation also contains the signal sequence has not been described.
Oppsummering av oppfinnelsenSummary of the invention
Foreliggende oppfinnelse omhandler en rekombinant DNA-vektor omfattende en DNA-sekvens operativt forblindet med en ekspresjonskontrollsekvens, og eventuelt i tillegg omfattende et replikon som er funksjonelt i gjær, hvor DNA-sekvensen innholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum. The present invention relates to a recombinant DNA vector comprising a DNA sequence operatively blinded with an expression control sequence, and possibly additionally comprising a replicon that is functional in yeast, where the DNA sequence contains the coding sequence for the circumsporozoite protein from Plasmodium falciparum.
Foreliggende oppfinnelse omhandler også en gjær-vertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor hvor nevnte vektor omfatter en DNA-sekvens operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens, og eventuelt i tillegg omfatter et replikon som er funksjonelt i nevnte vertscelle hvor DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasamodium falciparum. Foreliggende oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for å fremstille en slik transformert vertscelle som omfatter og trans-formerer en gjærvertscelle med en slik rekombinant vektor. The present invention also relates to a yeast host cell transformed with a recombinant DNA vector where said vector comprises a DNA sequence operatively linked to an expression control sequence, and possibly additionally comprises a replicon that is functional in said host cell where the DNA sequence contains the coding sequence for the circumsporozoite protein from Plasamodium falciparum. The present invention also relates to a method for producing such a transformed host cell which comprises and transforms a yeast host cell with such a recombinant vector.
Foreliggrend oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for fremstiling av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium f alcifarum. som omfatter å dyrke en gjærvertscelle transformert med en rekombinant DNA-vektor i et passende kul-turmedium og isolere et slikt protein fra et kulturlysat av en slik vertsorganisme, hvori nevnte vektor består av en DNA-sekvens operativt forbundet med ekspresjonskntrollse-kvens, og eventuelt i tillegg omfatter en replikon som er funksjonelt i nevnte vertscelle, hvor DNA-sekvensen inneholder den kodende sekvens for circumsporozoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum. Foreliggende oppfinnelse omhandler også proteinet som er således fremstilt, samt en vaksine bestående av en immunobeskyttende mengde av et slikt protein. The present invention also relates to a method for producing the circumsporozoite protein from Plasmodium f alcifarum. which comprises cultivating a yeast host cell transformed with a recombinant DNA vector in a suitable culture medium and isolating such a protein from a culture lysate of such a host organism, wherein said vector consists of a DNA sequence operatively linked to an expression control sequence, and optionally additionally comprises a replicon that is functional in said host cell, where the DNA sequence contains the coding sequence for the circumsporozoite protein from Plasmodium falciparum. The present invention also relates to the protein thus produced, as well as a vaccine consisting of an immunoprotective amount of such a protein.
Kort beskrivelse av tegningeneBrief description of the drawings
Fig. 1 er et strømningskart som illustrerer fremstilingen av pRIT10162. Fig. 2 er et restriksjonsendonukleasekart av plasmidene pRIT10172, pRIT12570 og pRIT12569. Fig. 3 er et restriksjonsendonukleasekart av pRIT12290. Fig. 4 er et strømningskart som illustrerer fremstillingen av pRIT12570. Fig. 1 is a flow chart illustrating the preparation of pRIT10162. Fig. 2 is a restriction endonuclease map of plasmids pRIT10172, pRIT12570 and pRIT12569. Fig. 3 is a restriction endonuclease map of pRIT12290. Fig. 4 is a flow chart illustrating the preparation of pRIT12570.
Fig. 5 er et restriksjonsendonukleasekart av pMC200.Fig. 5 is a restriction endonuclease map of pMC200.
Fig. IA er et skjematisk restriksjonskart som illustrerer sekvenseringsstrategien av klon XmPf1. Fig 2A illustrerer nukleotidsekvensen av CS-proteingenet fra P. falciparum. Fig. 1A is a schematic restriction map illustrating the sequencing strategy of clone XmPf1. Fig 2A illustrates the nucleotide sequence of the CS protein gene from P. falciparum.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsenDetailed description of the invention
Med uttrykket "circimsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum" menes det immunodominante overflateantigen på sporozoitten fra Plasmodium falclparum ("CS-protein"). By the term "circumsporozoite protein from Plasmodium falciparum" is meant the immunodominant surface antigen on the sporozoite from Plasmodium falciparum ("CS protein").
Den DS-proteinkodende sekvens fra Plasmodium falciparum er beskrevet av Dame et al., Science, 225. 593-599 (1984). The DS protein coding sequence from Plasmodium falciparum is described by Dame et al., Science, 225. 593-599 (1984).
Som brukt heri vil uttrykkene "cicumsporozoittprotein", "CS" eller "CS-protein" innbefatte både circusporozoitt-proteinet av full lengde fra Plasmodim falciparum såvel som ethvert immunogent derivat derav. Med uttrykket "immunogent derivat" av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum menes (a) ethvert derivat av circumspotosoitt-proteinet fra Plasmodium falciparum, såsom derivatet kodet for av et subfragment av den kodende sekvens for CS-protein av full lengde, eller en serie av tandem subfragmenter som opprettholder beskyttende immunogen aktivitet, eller (b) ethvert protein avledet fra en modifisert kodende sekvens av circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum som har beskyttende immunogen aktivitet. Slike immunogene derivater kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker såsom ved metoden til Botstein et al, Science, 229. 1193 (1985). Enkelte immunogene syntetiske derivater av den CS-proteinkodende sekvens fra £_;_ falciparum er beskrevet i Ballou et al., Science. 228. 996-999 (1985). As used herein, the terms "cicumsporozoite protein", "CS" or "CS protein" will include both the full length circumsporozoite protein from Plasmodim falciparum as well as any immunogenic derivative thereof. By the term "immunogenic derivative" of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein is meant (a) any derivative of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein, such as the derivative encoded by a subfragment of the full-length CS protein coding sequence, or a series of tandem subfragments which maintains protective immunogenic activity, or (b) any protein derived from a modified coding sequence of the circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum which has protective immunogenic activity. Such immunogenic derivatives can be prepared by conventional techniques such as by the method of Botstein et al, Science, 229, 1193 (1985). Certain immunogenic synthetic derivatives of the CS protein coding sequence from E. falciparum are described in Ballou et al., Science. 228. 996-999 (1985).
Den rekombinante vektor ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et DNA-molekyl operativt forbundet til en ekspresjonskontrollsekvens og eventuelt består den ytterligere av et replikon som er funksjonelt i gjær, hvor DNA-molekylet inneholder den kodende sekvens for circumsporozoittproteinet fra Plasmodium falciparum. Med uttrykket "replikon" menes den minste region av DNA sm virker for å opprettholde en rekombinant vektor i en gjær-vertsmikroorganisme transformert med denne. Slike replikon er velkjent i faget. Med uttrykket "ekspresjonskontrollsekvens" menes enhver region som regulerer transkripsjonen av et strukturelt gens kodende sekvens. Slike ekspresjonskontrollsekvenser er velkjente i faget. Foretrukne ekspresjonskontrollsekvenser innbefatter gjær-glyceraldehyd-3P-dehydrogenasegen (TDH3) promoteren og gjær-ornitin-karbamoyl-transferasegen (ARG3) transkripsjonsavslutningsregionen. Eksempler på andre anvendelige eksepresjonskntrollsekvensregioner innbefatter dem som er avledet fra gjærgener fra glykolysen, såsom de kodende for enolase, aldolase og fosfoglyceratkinase, gjæralkohol-dehydrogenasegenet og generelt gener involvert i katabolis-men, såsom arginasegenet. Slike vektorer kan fremstilles ved konvensjonelle teknikker, såsom ved å sette inn den SC-kodende sekvens fra Plasmodium falciparum i fase i en vektor som på forhånd inneholder et replikon og en ekspresjonskontrollsekvens på en slik måte at DNA-molekylet blir operativt forbundet til slike ekspresjonskontrollsekvenser. Eksempler på anvendelige vektorer i hvilke den SC-kodende sekvens kan settes inn, innbefatter plasmidet YEpl3, som er istand til replisering og opprettholdelse både i E. coli og S. cerevislae og derfor er kjent som en skyttelvektor. Flere andre gjærvektorer er kjent og tilgjengelige. Trans formering med plasmidvektorer inneholdende autonome repli-seringssekvenser (replikons) og som virker i gjær, vil normalt gi ekstra-kromosomal opprettholdelse av DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen som et plasmid. Slike replikon er velkjent i faget. Transformering med plasmidvektorer som ikke inneholder replikons som er virksomme i gjær kan resultere i inkorporering av DNA-molekylet i det kromosomale DNA. Foretrukket ligeres DNA-molekylet til en vektor som er istand til ekspresjon i gjærfamilien Saccaromyces. spesielt S. cerevisiae. The recombinant vector according to the present invention comprises a DNA molecule operably connected to an expression control sequence and possibly further consists of a replicon that is functional in yeast, where the DNA molecule contains the coding sequence for the circumsporozoite protein from Plasmodium falciparum. By the term "replicon" is meant the smallest region of DNA which functions to maintain a recombinant vector in a yeast-host microorganism transformed with it. Such replicons are well known in the art. By the term "expression control sequence" is meant any region that regulates the transcription of a structural gene's coding sequence. Such expression control sequences are well known in the art. Preferred expression control sequences include the yeast glyceraldehyde 3P dehydrogenase gene (TDH3) promoter and the yeast ornithine carbamoyl transferase gene (ARG3) transcription termination region. Examples of other useful expression control sequence regions include those derived from yeast genes of glycolysis, such as those encoding enolase, aldolase and phosphoglycerate kinase, the yeast alcohol dehydrogenase gene, and generally genes involved in catabolism, such as the arginase gene. Such vectors can be prepared by conventional techniques, such as by inserting the SC coding sequence from Plasmodium falciparum in phase into a vector that previously contains a replicon and an expression control sequence in such a way that the DNA molecule is operatively linked to such expression control sequences. Examples of useful vectors into which the SC coding sequence can be inserted include the plasmid YEpl3, which is capable of replication and maintenance in both E. coli and S. cerevisiae and is therefore known as a shuttle vector. Several other yeast vectors are known and available. Trans formation with plasmid vectors containing autonomous replication sequences (replicons) and which work in yeast, will normally provide extra-chromosomal maintenance of the DNA molecule according to the invention as a plasmid. Such replicons are well known in the art. Transformation with plasmid vectors that do not contain replicons that are functional in yeast can result in the incorporation of the DNA molecule into the chromosomal DNA. Preferably, the DNA molecule is ligated into a vector capable of expression in the yeast family Saccaromyces. especially S. cerevisiae.
Restriksjon av DNA for å fremstille DNA-fragmenter brukt i oppfinnelsen, ligering av slike fragmenter for å fremstille rekombinante DNA-molekyler brukt i oppfinnelsen og innsetning i mikroorganismer utføres ved kjente teknikker, såsom teknikker beskrevet i de foregående og senere angitte referanser. Betingelsene blir valgt med henblikk på å unngå denaturering av DNA og enzymer. For eksempel bufres pH for å forbli ved ca. 7,0 til 11,0 og temperaturen holdes under ca. 60°C. Fortrinnsvis utføres restriksjon ved en temperatur på ca. 30-40°C og ligering utføres ved ca. 0-10"C. Restriksjonsenzymer og ligaser brukt ved utføring av oppfinnelsen er kommersielt tilgjengelige og bør brukes i samsvar med instruksjonen som er innbefattet med disse. T4 DNA ligase er den foretrukne ligase. Restriction of DNA to produce DNA fragments used in the invention, ligation of such fragments to produce recombinant DNA molecules used in the invention and insertion into microorganisms are performed by known techniques, such as techniques described in the preceding and later references. The conditions are chosen with a view to avoiding denaturation of DNA and enzymes. For example, the pH is buffered to remain at approx. 7.0 to 11.0 and the temperature is kept below approx. 60°C. Restriction is preferably carried out at a temperature of approx. 30-40°C and ligation is carried out at approx. 0-10"C. Restriction enzymes and ligases used in the practice of the invention are commercially available and should be used in accordance with the instructions included with them. T4 DNA ligase is the preferred ligase.
De forskjellige fragmenter og endelige konstruksjoner kan skjøtes sammen på vanlig måte. I mange tilfeller har gener blitt isolert og kartlagt ved restriksjon såvel som sekvensert. I denne utstrekning kan man velge ut sekvensen av interesse såsom den CS-proteinkodende sekvens ved restriksjon av genet ved å bruke ytterligere manipulering etter som det er nødvendig, såsom restriksjon med Bal31, in vitro mutagenese, primer reparasjon eller lignende, for å fremskaffe et fragment av ønsket størrelse innbefattende den ønskede sekvensen og som har de passende terminaler. Linkere og adaptere kan bli brukt som skjøtende sekvenser såvel som for å erstatte tapte sekvenser hvor restriksjons- setet er innvendig i forhold til området av interesse. De forskjellige fragmenter som isoleres kan bremses ved elektroforese, elektroelueres, ligeres til andre sekvenser, klones, reisoleres og manipuleres ytterligere. The various fragments and final constructions can be joined together in the usual way. In many cases, genes have been isolated and mapped by restriction as well as sequenced. To this extent, one can select the sequence of interest such as the CS protein coding sequence by restriction of the gene using further manipulation as necessary, such as restriction with Bal31, in vitro mutagenesis, primer repair or the like, to provide a fragment of the desired size including the desired sequence and having the appropriate terminals. Linkers and adapters can be used as splicing sequences as well as to replace lost sequences where the restriction site is internal to the region of interest. The various fragments that are isolated can be slowed down by electrophoresis, electroeluted, ligated to other sequences, cloned, reisolated and further manipulated.
Bruken av ekspresjonskontrollsekvenser for å kontrollere transkripsjonen av den CS-proteinkodende sekvens tillater vekst av vertscellene til høy tetthet uten eller med lavt ekspresjonsnivå av den CS-proteinkodende sekvens, for derpå å innbefatte ekspresjon ved å forandre de ytre betingelser, f.eks. næringsmiddel, temperatur osv. The use of expression control sequences to control the transcription of the CS protein coding sequence allows growth of the host cells to high density without or with low expression levels of the CS protein coding sequence, then to induce expression by changing the external conditions, e.g. food, temperature, etc.
For eksepel kan gjærcellen med den GAL4 regulatoriske region bli dyrket i rike medier med en kombinasjon av glycerol-melkesyre til en høy tetthet, f.eks. midlere eller senere logaritmisk fase, fulgt av overgang til galaktose som karbonkilde. For PH05 regulering kunne man dyrke cellene ved høy fosfatkonsentrasjon til ca. 0,1-0,5 mM. For temperaturfølsomhet kunne man dyrke cellene ved 25 °C - 37°C og derpå forandre temperaturen på passende måte ved ca. 5°C - 20°C. Vertcellene ville ha det regulatoriske system assosiert med den anvendte regulatoriske region. For example, the yeast cell with the GAL4 regulatory region can be grown in rich media with a combination of glycerol-lactic acid to a high density, e.g. middle or later logarithmic phase, followed by transition to galactose as carbon source. For PH05 regulation, the cells could be grown at a high phosphate concentration to approx. 0.1-0.5 mM. For temperature sensitivity, one could grow the cells at 25 °C - 37 °C and then change the temperature appropriately at approx. 5°C - 20°C. The host cells would have the regulatory system associated with the applied regulatory region.
Fusering av den CS-proteinkodende sekvens til ekspre-sj onskontrol len kan utføres ved å bruke mellomliggende vektorer eller alternativt kan den kodende sekvens settes inn direkte i en vektor som inneholder ekspresjonskontrollsekvensen. Foretrukket blir den CS-proteinkodende sekvens plassert relativt til ekspresjonskontrollsekvensen, slik at det syntetiserte protein ved ekspresjon av den CS-proteinkodende sekvens er fri for overflødige aminosyreresidier. Fusing the CS protein coding sequence to the expression control can be performed using intermediate vectors or alternatively the coding sequence can be inserted directly into a vector containing the expression control sequence. Preferably, the CS protein coding sequence is placed relative to the expression control sequence, so that the synthesized protein upon expression of the CS protein coding sequence is free of redundant amino acid residues.
Foreliggende oppfinnelse omhandler også en gjærvertcelle transformert med en slik rekombinant vektor, samt en fremgangsmåte for å fremstille en slik vertsorganisme. En slik transformering utføres med vanlige teknikker, såsom metoden til Ito et al., J.Bacter: 153, 163-168 (1983). Foretrukne gjærvertsceller omfatter dem som tilhører slekten Saccaromyces cerevlsiae. The present invention also relates to a yeast host cell transformed with such a recombinant vector, as well as a method for producing such a host organism. Such transformation is carried out by conventional techniques, such as the method of Ito et al., J.Bacter: 153, 163-168 (1983). Preferred yeast host cells include those belonging to the genus Saccaromyces cerevliae.
Foreliggende oppfinnelse omhandler også en fremgangsmåte for fremstilling av Plasmodium falciparum cicumsporozoittprotein som omfatter å dyrke de transformerte gjærceller ifølge oppfinnelsen i passende kulturmedier og isolere slike proteiner fra et kulturlysat av disse vertsceller. Med "passende kulturmedier" menes at slike medier vil tillate den transformerte vertsorganisme å overleve, og som også vil tillate slike vertsorganismer å uttrykke CS-proteinet i gjenvinnbare mengder. Det vil forstås av fagmannen at passende kulturmedier som skal brukes vil avhenge av den anvendte vertscelle. Isoleringen av CS-proteinet fra et kulturlysat av slike vertsorganismer utføres ved vanlige proteinisoleringsteknikker. The present invention also relates to a method for the production of Plasmodium falciparum cicum sporozoite protein which comprises growing the transformed yeast cells according to the invention in suitable culture media and isolating such proteins from a culture lysate of these host cells. By "appropriate culture media" is meant that such media will allow the transformed host organism to survive, and which will also allow such host organisms to express the CS protein in recoverable amounts. It will be understood by those skilled in the art that the appropriate culture media to be used will depend on the host cell used. The isolation of the CS protein from a culture lysate of such host organisms is carried out by conventional protein isolation techniques.
Foreliggende oppfinnelse omhandler også en vaksine inneholdende en immunbeskyttende mengde av P. falcifarum CS-protein, fremstilt ved metoden ifølge oppfinnelsen. Med uttrykket "immunbeskyttende" menes at nok av CS-proteinet ifølge oppfinnelsen tilføres et smittet menneske for å fremskaffe tilstrekkelig beskyttende antistoffrespons mot påfølgende P. falciparum parasittinfeksjon. I vaksinen ifølge oppfinnelsen kan en vandig oppløsnng av polypeptid ifølge oppfinnelsen, dvs. P. falci<p>arum CS-protein uttrykt av de transformerte gjærvertsceller ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis bufret ved fysiologisk pH, bli brukt direkte. Alternativt kan polypeptidet med eller uten forutgående frysetørking, blandes eller absorberes med ethvert kjent hjelpestoff. Slike hjelpestoffer innbefatter bl.a. alumi-niumhydroksyd, muramyldipeptid og saponiner, såsom Quil A. Som et ytterligere eksempelvis alt ernativ kan polypeptidet innkapsles i mikropartikler såsom liposomer. I enda et annet eksempelvis alternativ kan polypeptidet konjugeres til et immunstimulerende makromolekyl, såsom avlivet Bordetella eller et tetanustoksid. The present invention also relates to a vaccine containing an immunoprotective amount of P. falcifarum CS protein, produced by the method according to the invention. By the term "immunoprotective" is meant that enough of the CS protein according to the invention is administered to an infected person to elicit a sufficient protective antibody response against subsequent P. falciparum parasite infection. In the vaccine according to the invention, an aqueous solution of polypeptide according to the invention, i.e. P. falci<p>arum CS protein expressed by the transformed yeast host cells according to the invention, preferably buffered at physiological pH, can be used directly. Alternatively, the polypeptide, with or without prior freeze-drying, can be mixed or absorbed with any known excipient. Such excipients include i.a. aluminum hydroxide, muramyl dipeptide and saponins, such as Quil A. As a further exemplary alternative, the polypeptide can be encapsulated in microparticles such as liposomes. In yet another exemplary alternative, the polypeptide can be conjugated to an immunostimulating macromolecule, such as killed Bordetella or a tetanus oxide.
Fremstilling av vaksine er generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vaccines, redigert av Voller et al., Vaccine preparation is generally described in New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al.,
University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Inn-kapsling i liposomer er beskrevet f.eks. av Fullerton, US University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. In-encapsulation in liposomes is described e.g. of Fullerton, US
Patent 4.235.877. Konjugering av proteinet til makromole-kyler er beskrevet f.eks. av Likhite, US patent 4.372.945 og av Armor et al., US patent 4.474.757. Anvendelse av Quil A er beskrevet, f.eks. av Dalsgaard et al., Acta Vet. Scand, bind 18, side 349 (1977). Patent 4,235,877. Conjugation of the protein to macromolecules has been described e.g. by Likhite, US Patent 4,372,945 and by Armor et al., US Patent 4,474,757. Application of Quil A is described, e.g. by Dalsgaard et al., Acta Vet. Scand, volume 18, page 349 (1977).
Mengden av gjæravledet P. falci<p>arum CS-polypeptid som er tilstede i hver vaksinedose velges som en mengde som induserer en immunbeskyttende respons uten å indusere vesentlige uheldige bivirkninger. Slike mengder vil variere, avhengig av de spesielle polypeptider som anvendes, og hvorvidt vaksinen har et hjelpemiddel. Generelt er det ventet at hver dose vil innbefatte 1-1000 ug polypeptid, fortrinnsvis 10-200 pg. En optimal mengde for en spesiell vaksine kan finnes ved standard studier som innbefatter observasjon av antistofftiteret og andre responser i pasienter. Etter en opprinneig vaksinering vil pasientene fortrinnsvis motta en forsterkning etter ca. 4 uker, etterfulgt av gjentatte forsterkninger hver 6. måned så lenge risiko for infeksjon eksisterer. The amount of yeast-derived P. falci<p>arum CS polypeptide present in each vaccine dose is selected as an amount that induces an immunoprotective response without inducing significant adverse side effects. Such amounts will vary, depending on the particular polypeptides used and whether the vaccine has an adjuvant. In general, it is expected that each dose will contain 1-1000 µg polypeptide, preferably 10-200 µg. An optimal amount for a particular vaccine can be found by standard studies that include observation of the antibody titer and other responses in patients. After an initial vaccination, patients will preferably receive a boost after approx. 4 weeks, followed by repeated boosters every 6 months as long as the risk of infection exists.
EksemplerExamples
De følgende eksempler er lllustratorlske og ikke begrensende for oppfinnelen. Alle temperaturer er i Celsiusgrader. Enzymene brukt i DNA-behandling var fra Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs og/eller Boehringer, og ble brukt i henhold til forhandlers anvisninger. The following examples are illustrative and not limiting of the invention. All temperatures are in degrees Celsius. The enzymes used in DNA processing were from Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs, and/or Boehringer, and were used according to the vendor's instructions.
I de følgende eksempler kan de følgende forkortelser bli brukt: YNB Gjærnitrogenbase uten aminosyrer (Difco Lab) In the following examples, the following abbreviations can be used: YNB Yeast nitrogen base without amino acids (Difco Lab)
0,675$, inneholdende 2$ glukose0.675$, containing 2$ of glucose
PBS Fosfatbufret saltvann (pr. liter):PBS Phosphate-buffered saline (per litre):
8,0 g NaCl8.0 g NaCl
0,2 g KC10.2 g KCl
1,15 g NA2HP04pH 7,4 1.15 g of Na 2 HPO 4 pH 7.4
0,2 g KH2P040.2 g of KH 2 PO 4
0,1 g CaCl20.1 g of CaCl2
0,1 g MgCl2.6H200.1 g of MgCl2.6H2O
BSA bovint serum albumin (A4378, Sigma)BSA bovine serum albumin (A4378, Sigma)
L buljong (pr. liter) 10 g trypton; 5 g NaCl; 5 g gjærekstrakt; 1 ml 0,1 M MgS04. Tilsett 5 ml aseptisk oppløsning av tiamid (1 mg/ml) etter autoklavering. For faste medier tilsett L broth (per litre) 10 g tryptone; 5 g NaCl; 5 g of yeast extract; 1 ml of 0.1 M MgSO 4 . Add 5 ml of aseptic solution of thiamide (1 mg/ml) after autoclaving. For solid media added
15 g agar pr. liter.15 g agar per litres.
X-gal 5-brom-4-klorindoyl-3-D-galactopyranosid. X-gal 5-bromo-4-chloroindoyl-3-D-galactopyranoside.
Eksempel A Dannelse av plasmid pRIT10167 Example A Generation of plasmid pRIT10167
Utgangsmaterialet var plasmid p6y inneholdende et 2,1 kb HindiII-fragment av gjær DNA som koder for TDH3-genet klonet på pBR322. pBR322 er beskrevet av Bolivar et al., Gene. 2, 95-113 (1977). p6y plasmidet ble konstruert ogkarakterisertav Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) og mottatt fra Dr. M. Rosenberg fra The National Institute of Health. HindiII-fra<g>mentet var reklonet på et pBR322 derivat hvori EcoRI-setet hadde blitt ødelagt for å gi plasmid pRIT10164 (en ikke nødvendig utføring). De følgende behandlinger ble utført for å danne et BamHI-sete beliggende ved G-residiet Utgangsmaterialet var plasmid p6y inneholdende et 2,1 kb HindiII-fragment av gjær DNA som koder for TDH3-genet klonet på pBR322. pBR322 er beskrevet av BolIvar et al., Gene, 2, 95-113 (1977). p6y plasmidet ble konstruert ogkarakterisertav Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) og mottatt fra Dr. M. Rosenberg fra The National Institute of Health. HindiII-fragmentet var reklonet på et pBR322 derivat hvori EcoRI-setet hadde blitt ødelagt for å gi plasmid pRIT10164 (en ikke nødvendig utføring). De følgende behandlinger ble utført for å danne et BamHI-sete beliggende ved G-residiet av ATG-kodonet til den TDH3 kodende sekvens og for å erholde et Hindlll- BamHI DNA-fragment med TFH3 promoteraktivitet, hvori TDH3-sekvensene er intakte og uforandrede ved be-handlingen. DNA til pRIT10164, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble renset ved to omganger av CsCl - etidiumbromid-tetthetsgradient-sentrifugering i hovedsak som beskrevet av Kahn et al., Methods in Enzymology, 68, 268 (1979). 150 pg pRIT10164 DNA ble fordøyet forskjellig med 75 enheter Xbal endonuklease, ekstrahert med fenol og eter, utfelt med etanol og DNA ble resuspendert I 0,01 M trometamin-HCL-buffer ved en konsentrasjon på 1 pg pr. pl. Prøver på 20 pg av dette Xbal-behandlede DNA ble fordøyet med Bal31 nuklease for å spalte de 61 basepar av DNA mellom ATG-kodonet og Xbal-setet. Fordøyinger med Bal31 ble utført ved 30°C i 1 til 3 minutter i buffer inneholdende 600 mM NaCl, 12 mM CaC12, 12 mM MgC12, 1 mM EDTA, 20 mM trometamin-HCL, pH 3,1 ved å bruke en enhet Bal31 nuklease pr. 20 pg DNA i et endelig reaksjonsvolum på 200 pl. The starting material was plasmid p6y containing a 2.1 kb HindiII fragment of yeast DNA encoding the TDH3 gene cloned on pBR322. pBR322 is described by Bolivar et al., Gene. 2, 95-113 (1977). The p6y plasmid was constructed and characterized by Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) and received from Dr. M. Rosenberg of The National Institute of Health. The HindiII fragment was recloned onto a pBR322 derivative in which the EcoRI site had been destroyed to give plasmid pRIT10164 (a non-essential variant). The following treatments were performed to create a BamHI site located at the G residue. The starting material was plasmid p6y containing a 2.1 kb HindiII fragment of yeast DNA encoding the TDH3 gene cloned on pBR322. pBR322 is described by Bolívar et al., Gene, 2, 95-113 (1977). The p6y plasmid was constructed and characterized by Musti et al., Gene, 25, 133 (1983) and received from Dr. M. Rosenberg of The National Institute of Health. The HindiII fragment was recloned onto a pBR322 derivative in which the EcoRI site had been destroyed to give plasmid pRIT10164 (a non-essential variant). The following treatments were performed to create a BamHI site located at the G residue of the ATG codon of the TDH3 coding sequence and to obtain a HindIII-BamHI DNA fragment with TFH3 promoter activity, in which the TDH3 sequences are intact and unaltered by the treatment. DNA of pRIT10164, prepared as described above, was purified by two rounds of CsCl - ethidium bromide density gradient centrifugation essentially as described by Kahn et al., Methods in Enzymology, 68, 268 (1979). 150 pg of pRIT10164 DNA was differentially digested with 75 units of XbaI endonuclease, extracted with phenol and ether, precipitated with ethanol and the DNA was resuspended in 0.01 M tromethamine-HCL buffer at a concentration of 1 pg per pl. Samples of 20 µg of this XbaI-treated DNA were digested with Bal31 nuclease to cleave the 61 base pairs of DNA between the ATG codon and the XbaI site. Digestions with Bal31 were performed at 30°C for 1 to 3 min in buffer containing 600 mM NaCl, 12 mM CaCl 2 , 12 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA, 20 mM tromethamine-HCL, pH 3.1 using one unit of Bal31 nuclease per 20 pg DNA in a final reaction volume of 200 pl.
Enzymreaksjonene ble stoppet ved tilsetning av etylenbis-(oksyetylenitrilo)tetraeddiksyre (EGTA) for å gi 20 mM endelig konsentrasjon og prøvene ble ekstrahert med like volumer fenol, eter og utfelt med etanol. Hver DNA prøve ble resuspendert i 20 pl 10 mM trometamin-HCl-buffer pH 7,5. Graden av Bal31 fordøying ble målt ved å fordøye ca. 2,5 pg av hver DNA-prøve med Hpal endonuklease og sammenligne størrelsen av Hpal- Xbal-fragmentene med 335 bp Hpal- Xbal-fragmentet fra pRIT10164. En 2 minutters fordøyelse med Bal31 ble funnet å fjerne ca. 41 - 88 nukleotider fra Xbal- Hpal-fragmentet av pRIT10164. The enzyme reactions were stopped by the addition of ethylenebis-(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid (EGTA) to give 20 mM final concentration and the samples were extracted with equal volumes of phenol, ether and precipitated with ethanol. Each DNA sample was resuspended in 20 µl of 10 mM tromethamine-HCl buffer pH 7.5. The degree of Bal31 digestion was measured by digesting approx. 2.5 pg of each DNA sample with HpaI endonuclease and compare the size of the HpaI-XbaI fragments with the 335 bp HpaI-XbaI fragment from pRIT10164. A 2 minute digestion with Bal31 was found to remove approx. 41 - 88 nucleotides from the XbaI-HpaI fragment of pRIT10164.
Dette resultatet Indikerer at et lignende antall basepar hadde blitt fjernet fra de andre Xbal ender mot ATG-kodonet. 5pg av DNA gjenvunnet fra 2-minutters Bal31-fordøying, ble fordøyet med BamHI endonuklease, ekstrahert med fenol og gjenvunnet ved etanolutfelling. Dette DNA ble behandlet med 5 enheter T4 polymerase i nærvær av deoksynukleotid-trifos-fater for å fylle ut og gjøre enkeltkjedede BamHI og enhver Bal31 ekstrahert med fenol og gjenvunnet med etanolutfelling buttendede. 2,3 pg av dette DNA ble behandlet med 5 enheter T4 DNA ligase og halvparten av ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av coli K12 stamme MM294 fremstilt i henhold til metoden til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 69. 2110 (1972). 1 ml av den transformerte E_j_ coli populasjon ble fortynnet i 350 ml L-buljong med 200 pg/ml ampicillin og det fullstendige plasmid DNA ble renset fra den resulterende kultur. 80 pg av dette plasmid DNA inneholdende en populasjon av plasmidmolekyler med Bal31 induserte uttak på ca. 40 - 80 basepar ble fordøyet sekvensielt med 75 enheter Hindlll endonuklease og 96 enheter av BamHI endonuklease for å frigjøre DNA-fragmenter fra disse plasmider hvori et BamHI sete hadde blitt gjendannet etter behandlingene beskrevet ovenfor, dvs. hvor Bal31 fordøyingen hadde stoppet ved et G-residium. Denne DNA-fordøying ble foretatt på en preparativ 1$ agarosegel og de ønskede Hindlll- BamHI fragmenter tilsvarende størrelser fra 1100 til 1000 bp ble skåret ut fra gelen i to skiver, hvorav én tilsvarte DNA på ca. 1070 bp og den andre på ca. 1030 bp. DNA ble gjenvunnet fra de to agarosegelskiver ved cykler med frysing og tining fulgt av høyhastighetsentrifugering for å pelletere agarosen. Supernatantvæsken ble filtrert gjennom et Millipore GV Millex filter og DNA ble gjenvunnet ved to omganger av etanolutfelling og resuspendert i 20 pl av 0,01 M trometamin-HCl buffer pH 7,5. This result indicates that a similar number of base pairs had been removed from the other XbaI ends towards the ATG codon. 5 µg of DNA recovered from 2-minute Bal31 digestion was digested with BamHI endonuclease, extracted with phenol and recovered by ethanol precipitation. This DNA was treated with 5 units of T4 polymerase in the presence of deoxynucleotide-triphos-fats to fill in and blunt-end single-stranded BamHI and any Bal31 extracted with phenol and recovered by ethanol precipitation. 2.3 µg of this DNA was treated with 5 units of T4 DNA ligase and half of the ligation mixture was used to transform competent cells of coli K12 strain MM294 prepared according to the method of Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. 69. 2110 (1972). 1 ml of the transformed E. coli population was diluted in 350 ml L broth with 200 µg/ml ampicillin and the complete plasmid DNA was purified from the resulting culture. 80 pg of this plasmid DNA containing a population of plasmid molecules with Bal31 induced extraction of approx. 40 - 80 base pairs were digested sequentially with 75 units of HindIII endonuclease and 96 units of BamHI endonuclease to release DNA fragments from these plasmids in which a BamHI site had been restored after the treatments described above, i.e. where Bal31 digestion had stopped at a G- residue. This DNA digestion was carried out on a preparative 1$ agarose gel and the desired HindIII-BamHI fragments corresponding in size from 1100 to 1000 bp were cut out from the gel in two slices, one of which corresponded to DNA of approx. 1070 bp and the other of approx. 1030 bp. DNA was recovered from the two agarose gel slices by freeze-thaw cycles followed by high-speed centrifugation to pellet the agarose. The supernatant fluid was filtered through a Millipore GV Millex filter and DNA was recovered by two rounds of ethanol precipitation and resuspended in 20 µl of 0.01 M tromethamine-HCl buffer pH 7.5.
Analyse ved agarosegelelektroforese og sammenligning med en Hindlll plus Xbal-fordøying av pRIT10164 DNA samt fragmentene fra en Hindlll plus EcoRI fordøying av fag X DNA viste at to distinkte populasjoner av HindiII- BamHI fragmenter ble erholdt, den ene med en beregnet størrelse på ca. 1070 bp og den andre med en beregnet størrelse på ca. 1030 bp sammenlignet med det parentale 1120 bp Hindlll- Xbal fragment fra pRIT10164. Ca 100 ng av 1030 bp Hindlll- Xbal fragment-populasjonen ble ligert med 200 ng plasmid pUC9 som hadde blitt fordøyet med Hindlll og BamHI endonukleaser og behandlet med alkalisk fosfatase (se Shine, US patent 4.264.731) og ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler ac E_;_ coli stamme JM103 hvor utvel-gelse ble foretatt for ampicillin-resistens. Transformasjon av Ej_ coli stamme JM103 ble utført i henhold til metoden til Cohen et al. referert ovenfor. Analysis by agarose gel electrophoresis and comparison with a HindIII plus XbaI digestion of pRIT10164 DNA as well as the fragments from a HindIII plus EcoRI digestion of phage X DNA showed that two distinct populations of HindiII-BamHI fragments were obtained, one with a calculated size of approx. 1070 bp and the other with a calculated size of approx. 1030 bp compared to the parental 1120 bp HindIII-XbaI fragment from pRIT10164. About 100 ng of the 1030 bp HindIII-XbaI fragment population was ligated with 200 ng of plasmid pUC9 which had been digested with HindIII and BamHI endonucleases and treated with alkaline phosphatase (see Shine, US patent 4,264,731) and the ligation mixture was used to transform competent cells ac E_;_ coli strain JM103 where selection was made for ampicillin resistance. Transformation of Ej_ coli strain JM103 was performed according to the method of Cohen et al. referred to above.
Både pUC9 vektorplasmidet og den mottagende E^. coli stamme JM103 har blitt beskrevet av Vieira og Messing i Gene, 19, 259 (1982) og ble erholdt fra J. Messing (University of Minnesota). pUC9 vektoren er kommersielt tilgjengelig fra Amersham (Buckinghamshire, England) og Pharmacia (Uppsala, Sverige). E^. coli stamme JM103 er tilgjengelig fra J. Messing (Univ. of Minnesota). En annen E_;_ coli stamme med særtrekkene til E^coli stamme JM103, dvs. JM101, kan er-holdes fra The American Type Culture Collection, Bockville, Maryland, under tilgangsnummer ATCC 33876 og kan også bli anvendt som vertsorganisme. Ca. 400 ampicillinresistente kolonier pr. ml ble erholdt, og av 98 kolonier undersøkt på medium inneholdende X-gal var 95 hvite, noe som indikerer suksessrik innsetning av et fremmed DNA-fragment mellom Hindlll og BamHI-setene på vektoren. Both the pUC9 vector plasmid and the recipient E^. coli strain JM103 has been described by Vieira and Messing in Gene, 19, 259 (1982) and was obtained from J. Messing (University of Minnesota). The pUC9 vector is commercially available from Amersham (Buckinghamshire, England) and Pharmacia (Uppsala, Sweden). E^. coli strain JM103 is available from J. Messing (Univ. of Minnesota). Another E. coli strain with the characteristics of E. coli strain JM103, i.e. JM101, can be obtained from The American Type Culture Collection, Bockville, Maryland, under accession number ATCC 33876 and can also be used as a host organism. About. 400 ampicillin-resistant colonies per ml was obtained, and of 98 colonies examined on medium containing X-gal, 95 were white, indicating successful insertion of a foreign DNA fragment between the HindIII and BamHI sites of the vector.
Plasmider fra individuelle transformantkolonier ble fremstilt ved fremgangsmåte i liten målestokk [Birnboim og Doly, Nucl. Acid 7, 1513 (1979)] etter forsterking av plasmidene ved tilsetning av spectinomycin (150 pg/ml) til de voksende Plasmids from individual transformant colonies were prepared by the small-scale method [Birnboim and Doly, Nucl. Acid 7, 1513 (1979)] after amplification of the plasmids by addition of spectinomycin (150 pg/ml) to the growing
kulturer.cultures.
De rekombinante plasmider ble analysert på 7,5 % acrylamid-geler etter dobbel fordøying med AvalI og BamHI endonukleaser og sammenlignet med 450 bp AvaII- XbaI-fragmentet omfattende den promoter-N-terminale region av pRIT10164 samt med fragmentene av en HpalI fordøying av pBR322 DNA. Et AvalI- BamHI fragment tilsvarende delesjoner på fra 20 til 90 basepar var tilstede i 36 av 36 undersøkte plasmider når de ble sammenlignet med pRIT10164. Tre plasmider som represen-terer delesjoner av ca. 80 basepar (pRIT10166), 50 basepar (pRIT10167, figur I) og 45 basepar (pRIT10165) ble utvalgt for videre studium. Plasmid DNA ble fremstilt ved CsCl-etidiumbromid-tetthetssentrifugering og 25 pg av hvert ble fordøyet med EcoRI. EcoRI endene ble merket med S-<32>P-ATP ved utbyttekinering og nukleotidsekvensen til Hindlll-EcoRI fragmentene fra hvert plasmid ble bestemt ved den kjemiske modifiseringmetode til Maxam og Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499 (1980). Merking og sekvensering fra EcoRI setet I pUC9 vektordelen av hvert rekombinant plasmid er en passende måte for å bestemme sekvensen omkring det tilstørende BamHI sete som markerer slutten på delesjonen i TDH3 DNA-fragmentet. Denne sekvenseringsanalyse viste at The recombinant plasmids were analyzed on 7.5% acrylamide gels after double digestion with AvalI and BamHI endonucleases and compared with the 450 bp AvaII-XbaI fragment comprising the promoter N-terminal region of pRIT10164 as well as with the fragments of an HpaI digestion of pBR322 DNA. An AvalI-BamHI fragment corresponding to deletions of from 20 to 90 base pairs was present in 36 of 36 examined plasmids when compared to pRIT10164. Three plasmids representing deletions of approx. 80 base pairs (pRIT10166), 50 base pairs (pRIT10167, Figure I) and 45 base pairs (pRIT10165) were selected for further study. Plasmid DNA was prepared by CsCl-ethidium bromide density centrifugation and 25 µg of each was digested with EcoRI. The EcoRI ends were labeled with S-<32>P-ATP by yield annealing and the nucleotide sequence of the HindIII-EcoRI fragments from each plasmid was determined by the chemical modification method of Maxam and Gilbert, Methods in Enzymology, 65, 499 (1980). Labeling and sequencing from the EcoRI site in the pUC9 vector part of each recombinant plasmid is a convenient way to determine the sequence around the adjacent BamHI site that marks the end of the deletion in the TDH3 DNA fragment. This sequencing analysis showed that
i plasmid pRIT10166 er BamHI setet gjendannet ved et in plasmid pRIT10166 the BamHI site is restored by et
gelresidium beliggende i den 5' ikke-translaterte region 25 basepar oppstrøms i ATG kodonet. I pRIT10165 er BamHI setet beliggende ved andre base av tredje kodon, og i pRIT10167 er BamHI setet beliggende ved G-residiet av ATG kodonet. gel residue located in the 5' untranslated region 25 base pairs upstream of the ATG codon. In pRIT10165 the BamHI site is located at the second base of the third codon, and in pRIT10167 the BamHI site is located at the G residue of the ATG codon.
Hindlll- BamHI fragmentet av TDH3 DNA således konstruert i pRIT10167 inneholder alle sekvensene som er nødvendige for TDH3 promoteraktivitet i uforandret form. The HindIII-BamHI fragment of TDH3 DNA thus constructed in pRIT10167 contains all the sequences necessary for TDH3 promoter activity in unaltered form.
Eksempel B Konstruksjon av vektor pRIT10172Example B Construction of vector pRIT10172
1050 bp Hindlll- BamHI TDH3 DNA-innskuddet fra pRIT10167, fremstilt som beskrevet i eksempel A, ble reklonet på The 1050 bp HindIII-BamHI TDH3 DNA insert from pRIT10167, prepared as described in Example A, was recloned onto
YEpl3 skyttelvektoren beskrevet av Broach et al. Gene. 8, 121 (1979) mellom Hindlll setet i 2 micron DNA-delen av vektoren og BamHI setet for å gi det rekombinante plasmid pRIT12159. DNA fra pRIT12159 ble så fordøyet med Xbal og BamHI endonukleaser og det resulterende 1650 bp fragment ble ligert på plass i et lignende Xbal- BamHI fragment inneholdende ARG3-promoteren på plasmid pRIT10774. Plasmid pRIT10774 er beskrevet av Cabezon et al., Proe. Nati. Acad. Schi. U. S.. 81, 6594-6598 (1986) såvel som Cabezon et al., U.S. pat. søkn. 575.122 innlevert 30. januar 1984, og omfatter YEpl3-replikonet, hvorfra den naturlige vektors BamHI og XHoI seter har blitt fjernet ved in vitro manipulering sammen med et 1470 bp Hindlll- BamHI innskudd omfattende ARG3 promoterregionen og et 1150 bp BamHI- HindiII fragment omfattende ARG3 transkripsjonsavslutningsregionen. Erstat-ning av ARG3 promoterinskuddet på pRIT10774 med TDH3 promoterinskuddet gir plasmid pRIT10172, som følgelig inneholder et enkelt BamHI sete beliggende ved ARG kodonet av TDH3 promoterinnskuddet og før et funksonelt signal for transkripsjonsavslutning på 1150 bp BamHI- Hlndlll ARG3 DNA-fragmentet. Fremmed DNA kan følgelig klones ved dette sete. Videre er de to DNA innskudd flankert av Hindlll seter som tillater fjerning av ekspresjonsenhetmodulen (kassett) som et 2200 bp Hindlll fragment for innsetning i andre vektorer. Figur 2 er et restriksjonsendonuklease-spaltningskart av pRIT10172. The YEpl3 shuttle vector described by Broach et al. Gene. 8, 121 (1979) between the HindIII site in the 2 micron DNA portion of the vector and the BamHI site to give the recombinant plasmid pRIT12159. DNA from pRIT12159 was then digested with XbaI and BamHI endonucleases and the resulting 1650 bp fragment was ligated into place in a similar XbaI-BamHI fragment containing the ARG3 promoter on plasmid pRIT10774. Plasmid pRIT10774 is described by Cabezon et al., Proe. Nati. Acad. Ski. U.S. 81, 6594-6598 (1986) as well as Cabezon et al., U.S. pat. apply. 575,122 filed January 30, 1984, and comprises the YEpl3 replicon, from which the native vector's BamHI and XHoI sites have been removed by in vitro manipulation together with a 1470 bp HindIII-BamHI insert encompassing the ARG3 promoter region and a 1150 bp BamHI-HindiII fragment encompassing ARG3 the transcription termination region. Replacement of the ARG3 promoter insert on pRIT10774 with the TDH3 promoter insert gives plasmid pRIT10172, which consequently contains a single BamHI site located at the ARG codon of the TDH3 promoter insert and before a functional signal for transcription termination on the 1150 bp BamHI-Hlndlll ARG3 DNA fragment. Foreign DNA can therefore be cloned at this site. Furthermore, the two DNA inserts are flanked by HindIII sites that allow removal of the expression unit module (cassette) as a 2200 bp HindIII fragment for insertion into other vectors. Figure 2 is a restriction endonuclease cleavage map of pRIT10172.
Eksempel 1Example 1
Ekspresjon av den P. falciparum circumsporozoitt protein-kodende sekvens minus dets antatte signalsekvens i gjær Expression of the P. falciparum circumsporozoite protein-coding sequence minus its putative signal sequence in yeast
A. Konstruksjon av plasmidene pRIT12570 og pRIT12569 Plasmid WR201 ble erholdt fra the Walter Reed Army Institute of Research og stammer fra innsetning av et 2,3 kilobaser (kb) EcoRI fragment fra XmPfl [se Dame et al., Science, 225. 593-599, (1984)], og som koder for det fullstendige circumsporozoitt-proteingen Plasmodium falciparum i vektor pUC8. Figur IA viser et skjematisk restriksjonskart og sekvenseringsstrategi av XmPf1. Beliggenhetene av restrik-sjonsenzym-spaltningssetene vist i figuren ble bestemt fra sekvensen og bekreftet ved fordøying: A, AvalI; Ac, AccI; A. Construction of Plasmids pRIT12570 and pRIT12569 Plasmid WR201 was obtained from the Walter Reed Army Institute of Research and originates from the insertion of a 2.3 kilobase (kb) EcoRI fragment from XmPfl [see Dame et al., Science, 225. 593- 599, (1984)], and which encodes the complete circumsporozoite protein gene of Plasmodium falciparum in vector pUC8. Figure IA shows a schematic restriction map and sequencing strategy of XmPf1. The locations of the restriction enzyme cleavage sites shown in the figure were determined from the sequence and confirmed by digestion: A, AvalI; Ac, AccI;
B, BstnI; D, Dral; Dd, Ddel; F, Foki; N, Ndel; R, Rsal; S, Stul; T, Tthlll; Tq, Taql; X, XhoII. Piler angir start-punktet, retningen og utstekningen av den bestemte sekvens. Den CS proteinkodende region er vist som en uthevet linje. B, BstnI; D, Dral; Dd, Ddel; F, Phocis; N, Ndel; R, Rsal; S, Chair; T, Tthllll; Tq, Taql; X, XhoII. Arrows indicate the starting point, the direction and the projection of the particular sequence. The CS protein coding region is shown as a solid line.
Fig. 2A viser nukleotidsekvensen til CS proteingenet til P. falciparum. Nukleotidsekvensen av CS proteingenet i XmPfl er vist. Vektor pUC8 er beskrevet av Vieira et al., Gene, 19, 259 (1982). Vektor pUC8 er kommersielt tilgjengelig fra Amersham, Buckinghamshire, England, og Pharmacia, Pis-cataway, New Jersey, USA, og Uppsala, Sverige. Et 1215 basepar (bp) Stul- Rsal fragment av plasmid WR201 inneholdende den P. falciparum CS-proteinkodende sekvens minus de første 52 bp av den CS-proteinkodende sekvens ble renset ved elektroeluering fra en 7,5$ polyakrylamidelektroforese-gel. Restriksjonsendonuklease Stul spalter CS-proteingenet i attende kodon av sekvensen. Siden sekvensen av de første aminosyrer til CS-proteinet er karakteristisk for et spaltet signalpeptid (Dame et al. Science. 225. 593-599 (1984)) er disse aminosyrer antatt å være fraværende fra det ferdigutviklede CS-protein på sporozoitter. Fig. 2A shows the nucleotide sequence of the CS protein gene of P. falciparum. The nucleotide sequence of the CS protein gene in XmPfl is shown. Vector pUC8 is described by Vieira et al., Gene, 19, 259 (1982). Vector pUC8 is commercially available from Amersham, Buckinghamshire, England, and Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA, and Uppsala, Sweden. A 1215 base pair (bp) Stul-RsaI fragment of plasmid WR201 containing the P. falciparum CS protein coding sequence minus the first 52 bp of the CS protein coding sequence was purified by electroelution from a 7.5$ polyacrylamide electrophoresis gel. Restriction endonuclease Stul cleaves the CS protein gene in the eighteenth codon of the sequence. Since the sequence of the first amino acids of the CS protein is characteristic of a cleaved signal peptide (Dame et al. Science. 225. 593-599 (1984)) these amino acids are believed to be absent from the fully developed CS protein on sporozoites.
Således bør 1215 bp Stul- Rsal fragmentet eller plasmid WR201 kode for alle, bortsett fra de første to aminosyrer av det ferdigutviklede protein forutsagt fra sekvensen. Dette buttendende Stul- Rsal fragment fuseres i fase til transla-sjonsstartkodonet tilstøtende det DNA polymerasereparerte BamHI-sete av gjærekspresjonsvektor pRIT10172, fremstilt som beskrevet i eksempel B (ligeringen av det innfylte BamHI-sete til Stul-setet gjendanner BamHI-setet). DNA av plasmid pRIT10172 ble fordøyet med BamHI endonuklease, behandlet med E. coli DNA polymerase I (Klenow-fragment), ekstrahert med fenol og gjenvunnet ved etanolutfelling. 0,4 pg av dette DNA ble blandet med 0,2 pg av 1215 BP Stul- Rsal fragmentet fra WR201 beskrevet ovenfor, behandlet med T4DNA ligase og legeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coil K12 stamme MM294 fremstilt i henhold til fremgangsmåten til Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA. 69, 2110 (1972). 1200 kolonier ble undersøkt ved kolonihybridiseringsmetoden (Grundstein and Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 72, 3961 (1975)) på Whatman 541-filtere ved å bruke Stil- Rsal fragmentet, radiomerket med<32>P ved spaltningsforflytning, som sonde. 20$ av klonene ga et positivt signal med sonden. 28 plasmider fra positive kolonier ble fremstilt ved en fremgangsmåte i liten skala [Birnboim et al. Nuclelc Acids Research. 7, 1513 (1979)]. Stul-Rsal-fragmentets orientering ble undersøkt ved dobbel fordøying med BamHI og Sali endonukleaser. Blandt plasmidene hadde syv plasmider fragmenter i riktig orientering (hvorav ett ble betegnet pRIT12570, fig. 2) og 12 plasmider haddde fragmentet i gal orientering (hvorav ett ble betegnet pRIT12569, fig. 2). Fig. 4 er et strømningskart som viser fremstillingen av pRIT12570. Thus, the 1215 bp Stul-Rsal fragment or plasmid WR201 should encode all but the first two amino acids of the mature protein predicted from the sequence. This butt-ended Stul-Rsal fragment is fused in phase to the translation start codon adjacent to the DNA polymerase-repaired BamHI site of yeast expression vector pRIT10172, prepared as described in Example B (the ligation of the filled-in BamHI site to the Stul site restores the BamHI site). DNA of plasmid pRIT10172 was digested with BamHI endonuclease, treated with E. coli DNA polymerase I (Klenow fragment), extracted with phenol and recovered by ethanol precipitation. 0.4 pg of this DNA was mixed with 0.2 pg of the 1215 bp Stul-Rsal fragment from WR201 described above, treated with T4DNA ligase and the fusion mixture was used to transform competent cells of E. coil K12 strain MM294 prepared according to the method of Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei., United States. 69, 2110 (1972). 1200 colonies were examined by the colony hybridization method (Grundstein and Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 72, 3961 (1975)) on Whatman 541 filters using the Stil-Rsal fragment, radiolabeled with<32>P by cleavage displacement, as a probe. 20$ of the clones gave a positive signal with the probe. 28 plasmids from positive colonies were prepared by a small-scale method [Birnboim et al. Nuclelc Acids Research. 7, 1513 (1979)]. The orientation of the Stul-RsaI fragment was examined by double digestion with BamHI and SalI endonucleases. Among the plasmids, seven plasmids had fragments in the correct orientation (one of which was designated pRIT12570, Fig. 2) and 12 plasmids had the fragment in the wrong orientation (one of which was designated pRIT12569, Fig. 2). Fig. 4 is a flow chart showing the preparation of pRIT12570.
Plasmidene pRIT12570, pRIT12569 og pRIT10172 ble satt inn i gjær ( Saccharomycea cerevislae) stammer DC5 ( leu2-3. Ieu2-112, his3, canl-11) og 10S44C (leu2-3, leu2-112. p_ep_4-3) erholdt fra M. Crabeel, Ceria Institute, Anderlecht, Belgia, ved trnsformering av litiumacetat-behandlede celler (Ito et al., J. Bacteriol. 153. 163-168 (1983)] og utvalgt for leucinuavhengighet. Proteinet forutsagt ved denne konstruksjon inneholder 394 aminosyrer av det ferdigutviklede P. falciparum CS protein fusert til tre aminosyrer (Met-Asp-Pro-) ved dets NHg-ende og som er avledet fra vektorsekven-sen (pRIT10172). S^. cerevislae stamme 10S44C ble deponert ved The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. i samsvar med bestemmelsene i Budapestav-talen 18. august 1988 under tilgangsnummer ATCC 20819. S. cerevisla stamme DC5 ble deponert ved The American Type Culture Collection 2. juni 1982 i samsvar med bestemmelsene i Buda- pestavtalen under tilgangsnummer ATCC 20630. Plasmids pRIT12570, pRIT12569 and pRIT10172 were inserted into yeast ( Saccharomycea cerevislae ) strains DC5 ( leu2-3 . Ieu2-112 , his3 , canl-11 ) and 10S44C ( leu2-3 , leu2-112 . p_ep_4-3 ) obtained from M . Crabeel, Ceria Institute, Anderlecht, Belgium, by transformation of lithium acetate-treated cells (Ito et al., J. Bacteriol. 153. 163-168 (1983)] and selected for leucine independence. The protein predicted by this construct contains 394 amino acids of the full-length P. falciparum CS protein fused to three amino acids (Met-Asp-Pro-) at its NHg terminus and derived from the vector sequence (pRIT10172). S. cerevislae strain 10S44C was deposited at The American Type Culture Collection , Rockville, Maryland, U.S.A. in accordance with the provisions of the Budapest Treaty on 18 August 1988 under accession number ATCC 20819. S. cerevisla strain DC5 was deposited at The American Type Culture Collection on 2 June 1982 in accordance with the provisions of the Budapest Treaty under accession number ATCC 20630.
B. Syntese av P. falciparum circumsporozoittprotein i gjær. Gjær ( Saccharomyses cerevislae) stammer DC5 eller 10S44C inneholdende enten pRIT2570, pRIT12569 eller pRIT10172, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble separat dyrket i flytende medium som manglet leucin (YNB + 80 pg/ml histidin eller YNB). CS proteinsekvenser ble identifisert ved proteinlmmunoblotting-teknikk [se Burnette, Anal. Biochem.. 112. 195-203 (1981); Gershoni and Palade, Anal. Biochem.. 131, 1-15 (1983); Towbin and Gordon, J. Immunol. Methods. 72, 313-340 (1984)] ved å bruke en blanding av 5 monoklonale antistoffer mot CS protein (Dame et al., Science, 225, 593-599 (1984)]. Etter elektroblotting av proteinene på et nitrocellulosefilter (Schleicher og Schull, 045 u) [Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Si.. U. S. A.. 76, 4350-4354, 1979)] ble filteret preinkubert i 1 time ved 39°C med 3$ gelatin i PBS. Deretter ble filteret vasket 5 ganger i 5 minutter hver gang med PBS inneholdende 0,1$ Tween 20 (polyoksy-etylensorbitanmonolaurat), og arket ble behandlet i 1 time ved romtemperatur med en blanding av 5 monoklonale antistoffer mot CS protein [Dame et al., Science 225, 593-599, B. Synthesis of P. falciparum circumsporozoite protein in yeast. Yeast ( Saccharomyses cerevislae ) strains DC5 or 10S44C containing either pRIT2570, pRIT12569 or pRIT10172, prepared as described above, were separately grown in liquid medium lacking leucine (YNB + 80 pg/ml histidine or YNB). CS protein sequences were identified by protein immunoblotting technique [see Burnette, Anal. Biochem.. 112. 195-203 (1981); Gershoni and Palade, Anal. Biochem.. 131, 1-15 (1983); Towbin and Gordon, J. Immunol. Methods. 72, 313-340 (1984)] using a mixture of 5 monoclonal antibodies against CS protein (Dame et al., Science, 225, 593-599 (1984)]. After electroblotting the proteins on a nitrocellulose filter (Schleicher and Schull , 045 u) [Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Si.. U. S. A.. 76, 4350-4354, 1979)] the filter was preincubated for 1 hour at 39°C with 3% gelatin in PBS. Then the filter was washed 5 times for 5 minutes each time with PBS containing 0.1% Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), and the sheet was treated for 1 hour at room temperature with a mixture of 5 monoclonal antibodies against CS protein [Dame et al. , Science 225, 593-599,
(1984)] i PBS, 1$ gelatin. Filterarkene ble vasket 5 ganger i 5 minutter hver gang med RBS, 0,1$ Tween 20, og et andre biotynilert saue anti-muse antistoff (Amersham) i PBS, 1$ gelatin ble tilsatt i 1 time ved romtemperatur. Arkene ble igjen vasket med PBS, 0,1$ Tween 20, 5 ganger i 5 minutter hver gang, og ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med atreptavidin-biotinylert pepperrot-peroksydase (HRP)-kompleks (Amersham). Arkene ble igjen vasket 3 ganger i 5 minutter hver gang med PBS 0,1$ Tween 20, og ble endelig inkubert med 30 jjI H2O2og HRP fargeutviklingsreagens inneholdende 4-klor-l-naftol (BioRad), 30 mg i 10 ml metanol, i 50 ml PBS. Molekylvekten til antigenene ble beregnet fra på forhånd fargede proteinmarkører, ovalbumin, alfa-chymo-trypsinogen, beta-lactoglobin, lysozym, cytokrom C (BRL). (1984)] in PBS, 1$ gelatin. The filter sheets were washed 5 times for 5 minutes each time with RBS, 0.1% Tween 20, and a second biotinylated sheep anti-mouse antibody (Amersham) in PBS, 1% gelatin was added for 1 hour at room temperature. The sheets were again washed with PBS, 0.1% Tween 20, 5 times for 5 minutes each time, and were incubated for 30 minutes at room temperature with atreptavidin-biotinylated horseradish peroxidase (HRP) complex (Amersham). The sheets were again washed 3 times for 5 minutes each time with PBS 0.1$ Tween 20, and were finally incubated with 30 µl H2O2 and HRP color development reagent containing 4-chloro-1-naphthol (BioRad), 30 mg in 10 ml methanol, in 50 ml of PBS. The molecular weight of the antigens was calculated from pre-stained protein markers, ovalbumin, alpha-chymo-trypsinogen, beta-lactoglobin, lysozyme, cytochrome C (BRL).
Immunreaksjonen som er spesifik for proteiner avledet fra pRIT12570-inneholdende celler, viste en type som hadde molekylvekt fra 30.000 til 50.000 dalton. Dette viser at det P. falciparum CS-relaterte produkt uttrykt av gjær er heterogent. Mer av dette heterogene materiale ble funnet blandt proteinene fra 10S44C transformerte celler enn blandt DC5 transformerte celler. The immunoreaction specific for proteins derived from pRIT12570-containing cells showed a type having a molecular weight of 30,000 to 50,000 daltons. This shows that the P. falciparum CS-related product expressed by yeast is heterogeneous. More of this heterogeneous material was found among the proteins from 10S44C transformed cells than among DC5 transformed cells.
Eksempel IIExample II
Antistoffrespons - ELISA. CS reaktivitet av antisrum mot p. falciparum CS- protein fremstilt i gjær, hepatocyttblok-kering Antibody response - ELISA. CS reactivity of antiserum against p. falciparum CS protein produced in yeast, hepatocyte blocking
P. falciparum CS polypeptidet fremstilt i gjær i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan vurderes for sin immunogenisitet i henhold til metodene skissert i Ballou et al., US patentsøknad serienummer 699.116, inngitt 7. februar 1985, hvorav hele beskrivelsen herved er innbefattet pr. referanse. The P. falciparum CS polypeptide produced in yeast according to the method according to the invention can be assessed for its immunogenicity according to the methods outlined in Ballou et al., US patent application serial number 699,116, filed on February 7, 1985, the entire description of which is hereby included per reference.
Eksempel IIIExample III
Vaksine inneholdende P. falciparum CS protein uttrykt av g- 1ær Vaccine containing P. falciparum CS protein expressed by g-1 ear
En illustratorisk vaksine ifølge oppfinnelsen fremstilles som følger: Til en bufret, vandig oppløsning av 3$ alumi-niumhydroksyd (10 mM natriumfosfat, 150 mM.NaCl, pH 6,8, sterilisert ved filtrering) hvor gjær-avledet P. falciparum CS polypeptid ifølge oppfinnelen i lignende buffer tilsettes under omrøring til en endelig konsentrasjon på 100 Mg/ml polypeptid og 0,5 mg/ml aluminium (Al<3+>). pH opprettholdes ved 6,8. Blandingen oppbevares over natten ved ca. 0°C. Timerosal tilsettes til en endelig konsentrasjon på 0,0005$. pH undersøkes og justeres om nødvendig til 6,8. An illustrative vaccine according to the invention is prepared as follows: To a buffered, aqueous solution of 3$ aluminum hydroxide (10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 6.8, sterilized by filtration) where the yeast-derived P. falciparum CS polypeptide according to the invention in a similar buffer is added with stirring to a final concentration of 100 Mg/ml polypeptide and 0.5 mg/ml aluminum (Al<3+>). The pH is maintained at 6.8. The mixture is stored overnight at approx. 0°C. Thimerosal is added to a final concentration of 0.0005$. The pH is checked and, if necessary, adjusted to 6.8.
Eksempel IVExample IV
Konstruksjon av vektorer for ekspresjon av Immunogene deler av den tetrapeptidgjentagende region av P. falciparum PC-proteinet i gjær Construction of vectors for the expression of immunogenic parts of the tetrapeptide repeat region of the P. falciparum PC protein in yeast
A. Dannelse av pRIT12290A. Generation of pRIT12290
Et 1050 bp Hindlll- EcoRI fragment fra pRIT10167 (figur 1) fremstilt som beskrevet i eksempel A og inneholdende Hindlll- BamHI TDH3 promoterfragmentet sammen med BamHI-Smal- EcoRI delen av pUC9 polylinkeren ble reklonet mellom Hindlll og EcoRI-setene av et pBR322 derivatplasmid på forhånd utskilt fra BamHI-setet ved innfylling med T4 DNA polymerase og religering. Det resulterende rekombinante plasmid ble identifisert som pRIT12176. A 1050 bp HindIII-EcoRI fragment from pRIT10167 (Figure 1) prepared as described in Example A and containing the HindIII-BamHI TDH3 promoter fragment together with the BamHI-SmaI-EcoRI portion of the pUC9 polylinker was recloned between the HindIII and EcoRI sites of a pBR322 derivative plasmid on previously excised from the BamHI site by filling in with T4 DNA polymerase and religation. The resulting recombinant plasmid was identified as pRIT12176.
Plasmid DNA av pRIT 10158 (figur 1), fremstilt som beskrevet i eksempel V, ble fordøyet med EcoRI endonuklease og behandlet med T4 DNA polymerase for å fylle i EcoRI enkeltkjedede forlengelser. Dette preparat ble ytterligere fordøyet med Clal endonuklease. En ytterligere prøve på pRIT10158 DNA ble fordøyet med Clal og Haelll endonuklease og et 1150 bp Clal- Haelll fragment som bærer transkripsjonsavslutningsregionen av ERG3-genet ble gjenvunnet ved preparativ agarosegelelektroforese og elektroeluering. Dette fragment ble ligert med EcoRI. T4 DNA polymerase, Clal-behandlet pRIT10158 DNA, og ligeringsblandingen ble brukt for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 fremstilt som beskrevet av Cohen et al. ovenfor, til ampicillinresistens. Fra de transformerte kolonier ble et plasmid identifisert som pRIT10162 Isolert, hvori Clal-Haelll ARG 3 transkripsjonsavslutningsfragmentet var satt inn på pRIT10158 mellom Clal og de innfylte ECORI-seter. og hvori EcoRI-setet har blitt gjendannet. Figur 1 er et strømningskart som illustrerer fremstillingen av pRIT10162. Plasmid DNA av pRIT10162 ble fordøyet med EcoRI og Pstl endonukleaser blandet med plasmid DNA av pRIT12176, fremstilt som beskrevet ovenfor (også fordøyet med EcoRI og Pstl endonukleaser) og blandingen ble ligert og brukt for å transformere celler av E. coli K12 stamme MM294 til ampicillinresistens ved metoden til Cohen et al.som er angitt ovenfor. Et plasmid, pRIT12208, ble gjenvunnet fra en koloni fra denne transformasjon, hvori det store 4630 bp EcoRI- PstI fragment fra pRIT12176 hadde blitt ligert til det lille 1930 bp EcoRI- PstI fragment fra pRIT10162 og hvori ARG3 transkripsjonsavslutningsregionen nå ligger overfor TDH3-promoteren. ARG3 og TDH3 DNA regionene kan fjernes fra pRIT12208 som et enkelt 2200 bp fragment ved fordøying med Hindlll endonuklease. For å erholde den andre orientering av dette fragment med hensyn til vektorsekvensene, ble det 2200 bp Hindlll fragment fra pRIT12208 reklonet i HindiII-setet av et pBR322 derivatplasmid hvori de naturlige EcoTI og BamHI-seter separat hadde blitt fjernet ved innfylling med T4 DNA polymerase og religering. Det resulterende plasmid med det 2200 bp HindiII-fragment satt inn i motsatt orienterng med hensyn til vektorsekvensene sammenlignet ned pRIT12208 er identifisert som pRIT12290. Plasmid DNA of pRIT 10158 (Figure 1), prepared as described in Example V, was digested with EcoRI endonuclease and treated with T4 DNA polymerase to fill in EcoRI single-stranded extensions. This preparation was further digested with ClaI endonuclease. An additional sample of pRIT10158 DNA was digested with ClaI and HaelII endonuclease and a 1150 bp ClaI-HaelII fragment carrying the transcription termination region of the ERG3 gene was recovered by preparative agarose gel electrophoresis and electroelution. This fragment was ligated with EcoRI. T4 DNA polymerase, ClaI-treated pRIT10158 DNA, and the ligation mixture were used to transform competent cells of E. coli strain MM294 prepared as described by Cohen et al. above, to ampicillin resistance. From the transformed colonies, a plasmid identified as pRIT10162 was isolated, in which the ClaI-HaelII ARG 3 transcription termination fragment was inserted into pRIT10158 between ClaI and the filled-in ECORI sites. and wherein the EcoRI site has been restored. Figure 1 is a flow chart illustrating the preparation of pRIT10162. Plasmid DNA of pRIT10162 was digested with EcoRI and Pstl endonucleases mixed with plasmid DNA of pRIT12176, prepared as described above (also digested with EcoRI and Pstl endonucleases) and the mixture was ligated and used to transform cells of E. coli K12 strain MM294 to ampicillin resistance by the method of Cohen et al., which is indicated above. A plasmid, pRIT12208, was recovered from a colony from this transformation in which the large 4630 bp EcoRI-PstI fragment from pRIT12176 had been ligated to the small 1930 bp EcoRI-PstI fragment from pRIT10162 and in which the ARG3 transcription termination region now lies opposite the TDH3 promoter. The ARG3 and TDH3 DNA regions can be removed from pRIT12208 as a single 2200 bp fragment by digestion with HindIII endonuclease. To obtain the second orientation of this fragment with respect to the vector sequences, the 2200 bp HindIII fragment from pRIT12208 was recloned into the HindiII site of a pBR322 derivative plasmid in which the natural EcoTI and BamHI sites had been separately removed by filling in with T4 DNA polymerase and religation. The resulting plasmid with the 2200 bp HindiII fragment inserted in the opposite orientation with respect to the vector sequences compared to pRIT12208 is identified as pRIT12290.
Figur 3 er et restriksjonsendonuklease-spaltningskart av pRIIT12290. Både I pRIT2208 og pR IT2290 vektorene er TDH3 promoteren og ARG3 transkripsjonsavslutningsfragmentene ad-skilt av enestående BamHI, Smal og EcoRI restriksjonsseter som er anvendelige for kloningen av DNA-fragmenter som bærer kodende sekvenser, og promoter og transkripsjons-avslutningsregioner kan skilles ut sammen på et 2200 Figure 3 is a restriction endonuclease cleavage map of pRIIT12290. In both the pRIT2208 and pR IT2290 vectors, the TDH3 promoter and ARG3 transcription termination fragments are separated by unique BamHI, SmaI and EcoRI restriction sites that are useful for the cloning of DNA fragments carrying coding sequences, and the promoter and transcription termination regions can be separated together on a 2200
bp HindiII fragment som en modul eller kassett for over-føring til andre vektorer. bp HindiII fragment as a module or cassette for transfer to other vectors.
BamHI setet er spesielt anvendelig, idet det er lokalisert ved ATG kodonet av TDH3 genet og kan anvendes for fusjon av andre gener til TDH3 promoteren med en mulighet for å uttrykke disse i gjær, som eksemplifisert nedenfor. Slike fusjoner kan gjenvinnes fra pRIT12208 eller pRIT12290 derivatene i form av kassetter eller moduler for innsetning på gjærskyttelvektorer ved fordøying med Hindlll endonuklease eller ved bruk av andre restriksjonsendonukleaser som spalter ved flankerende restriksjonsseter. The BamHI site is particularly useful, as it is located at the ATG codon of the TDH3 gene and can be used for fusion of other genes to the TDH3 promoter with an option to express these in yeast, as exemplified below. Such fusions can be recovered from the pRIT12208 or pRIT12290 derivatives in the form of cassettes or modules for insertion into yeast shuttle vectors by digestion with HindIII endonuclease or by using other restriction endonucleases that cleave at flanking restriction sites.
B. Konstruksjon av et plasmid som inneholder en syntetisk linker for innsetning av en del av P. falciparum CS protein tetrapeptid g. 1 entagelsesreglonen B. Construction of a plasmid containing a synthetic linker for the insertion of a portion of the P. falciparum CS protein tetrapeptide g. 1 consensus reglon
Plasmid pR IT12290, fremstilt som beskrevet i del A ovenfor, fordøyes med BamHI og EcoRI endonukleaser og blandes med et syntetisk DNA fragment med følgende sammensetning Plasmid pR IT12290, prepared as described in part A above, is digested with BamHI and EcoRI endonucleases and mixed with a synthetic DNA fragment of the following composition
Blandingen av fragmentene føres sammen og ligeres med T4 DNA ligase og brukes for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 for ampicillinresistens i henhold til vanlige teknikker. Plasmider fremstilt fra enkle kolonier undersøkes for tilstedeværelse av enkle EcoRI og BamHI endonukleaserestriksjonsseter og for fravær av et Smal sete som er tilstede på den opprinnelige pRIT12290 vektor, men ikke på den ønskede rekombinant. Riktigheten av plasmidet som velges ut kan bekreftes ved DNA sekvensering. Innsetning av det syntetiske DNA fragment gjendanner et BamHI sete etter TDH3 ATG kodonet og gir et stoppkodon (TAA) i fase med ATG-kodonet. Formålet med å danne et slikt plasmid er å danne en passende vektor for fusjon av 192 basepar-delen av P. falciparum CS protein tetrapeptid gjentagelsesregionen til TDH3promoterregionen og fremskaffe et stoppkodon umiddelbart 3' til en slik kodende region. The mixture of fragments is pooled and ligated with T4 DNA ligase and used to transform competent cells of E. coli strain MM294 for ampicillin resistance according to standard techniques. Plasmids prepared from single colonies are examined for the presence of single EcoRI and BamHI endonuclease restriction sites and for the absence of a Smal site present on the original pRIT12290 vector but not on the desired recombinant. The correctness of the plasmid that is selected can be confirmed by DNA sequencing. Insertion of the synthetic DNA fragment restores a BamHI site after the TDH3 ATG codon and provides a stop codon (TAA) in phase with the ATG codon. The purpose of creating such a plasmid is to create a suitable vector for fusing the 192 base pair portion of the P. falciparum CS protein tetrapeptide repeat region to the TDH3 promoter region and providing a stop codon immediately 3' to such a coding region.
C. Dannelse av et plasmid Inneholdende en 192 basepar- del av P. falciparum CS protein tetrapeptid gjentagelsesregionen C. Generation of a plasmid containing a 192 base pair portion of the P. falciparum CS protein tetrapeptide repeat region
1215bp StuII- Rsal fragmentet av plasmid WR201, renset som beskrevet i eksempel 1 og inneholdende den SC proteinkodende sekvens minus de første 52 bp, fordøyes med Sau3A for å danne mindre fragmenter som blandt annet innbefatter 192 bp Sau3A fragment som koder for 16 tetrapeptidgjentagelser av CS proteinet. BamHI-setet av den modifiserte pRIT12290 The 1215 bp StuII-Rsal fragment of plasmid WR201, purified as described in example 1 and containing the SC protein coding sequence minus the first 52 bp, is digested with Sau3A to form smaller fragments which include, among other things, the 192 bp Sau3A fragment that codes for 16 tetrapeptide repeats of CS the protein. the BamHI site of the modified pRIT12290
vektor i del B ovenfor, beliggende ved ATG startkodonet,vector in part B above, located at the ATG start codon,
er i fase med Sau3A setene av den gjentagende epitop av CS proteinet til P. falciparum. is in phase with the Sau3A sites of the repetitive epitope of the CS protein of P. falciparum.
DNA av dette plasmid fordøyes med BAMHI endonuklease, ekstraheres med fenol og gjenvinnes ved etanolutfelling. The DNA of this plasmid is digested with BAMHI endonuclease, extracted with phenol and recovered by ethanol precipitation.
0,2 pg av dette DNA blandes med ca. 0,1-0,2 pg av Sau3A fordøyingen av Stul- Rsal fragmentet fremstilt som beskrevet ovenfor, og behandles med T4 DNA ligase, og ligeringsblandingen brukes for å transformere kompetente celler av E. coli stamme MM294 til ampicillinresistens i henhold til konvensjonelle teknikker. Plasmider fra individuelle transformanter blir fremstilt og analysert på 7,5$ akryl-amidgeler etter dobbel fordøying med BamHI og EcoRI endonukleaser og sammenlignes med den opprinnelige vektor, med Sau3A-fordøyingen av Stul-Rsal CS genfragmentet og med passende molekylvektmarkører, f.eks. en HaelII-fordøying av 0x174 DNA. 0.2 pg of this DNA is mixed with approx. 0.1-0.2 pg of the Sau3A digest of the Stul-Rsal fragment prepared as described above and treated with T4 DNA ligase, and the ligation mixture used to transform competent cells of E. coli strain MM294 to ampicillin resistance according to conventional techniques. Plasmids from individual transformants are prepared and analyzed on 7.5$ acrylamide gels after double digestion with BamHI and EcoRI endonucleases and compared with the original vector, with the Sau3A digest of the Stul-Rsal CS gene fragment and with appropriate molecular weight markers, e.g. a HaelII digest of 0x174 DNA.
Plasmider som inneholder et BamHI- EcoRI innskutt fragment på 200 bp tilsvarer innskuddet på 192 bp Sau3A fragmentet i den ønskede orientering for fusjon av den SC-kodende sekvens til ATG startkodonet. Innsetning av 192 Sau3A-fragmentet i den ønskede orientering gjendanner BamHI-setet ved ATG-kodonet. Plasmids containing a BamHI-EcoRI inserted fragment of 200 bp corresponds to the inserted 192 bp Sau3A fragment in the desired orientation for fusion of the SC coding sequence to the ATG start codon. Insertion of the 192 Sau3A fragment in the desired orientation restores the BamHI site at the ATG codon.
I tillegg vil fordøying av et slikt plasmid med Sau3A fri-gjøre et 192 bp fragment av samme størrelse som det erholdt fra fordøying av Stul- Rsal fragment inneholdende den CS protein gjentagende epitop. Denne konstruksjon vil inneholde en åpen leseramme på 67 aminosyrer som strekker seg fra ATG-kodonet ved TDH3 promotergrensen gjennom det CS gjentagende epitopinnskudd og slutter ved TAA kodonet i det innsatte syntetiske DNA-fragment umiddelbart 3' til Sau3A-setet og 5' til EcoRI-setet. Riktighet av konstruksjonen kan bekreftes ved DNA-sekvensering og fordøying av plasmidet med Hindlll endonuklease vil frigjøre et Hindlll-fragment på 2390 bp omfattende TDH3-promoteren, den CS- gjentagende epitop og den ARG3-avsluttende region. Dette Hindlll fragment kan reklones på enhver passende gjærvektor, f.eks. YEpl3 og innsettes i gjær i henhold til konvensjonelle teknikker. In addition, digestion of such a plasmid with Sau3A will release a 192 bp fragment of the same size as that obtained from digestion of the Stul-Rsal fragment containing the CS protein repeating epitope. This construct will contain an open reading frame of 67 amino acids extending from the ATG codon at the TDH3 promoter boundary through the CS repeat epitope insertion and ending at the TAA codon in the inserted synthetic DNA fragment immediately 3' to the Sau3A site and 5' to the EcoRI the seat. Correctness of the construct can be confirmed by DNA sequencing and digestion of the plasmid with HindIII endonuclease will release a HindIII fragment of 2390 bp comprising the TDH3 promoter, the CS repeat epitope and the ARG3 termination region. This HindIII fragment can be recloned on any suitable yeast vector, e.g. YEpl3 and inserted into yeast according to conventional techniques.
Plasmidet kan også fordøyes med BamHI endonuklease og blandes og ligeres igjen med Sau3A-fordøyingen av det Stul-Rsal-gjentagende epitopfragment for å innsette en tandem-kopi av epitopen som vil være i fase med den første kopi, og som lik tidligere vil gjendanne et BamHI-sete ved ATG-kodonet, forutsatt at orienteringen av innskuddet er korrekt. Fremgangsmåten kan gjentas for å bygge opp en serie gjentagelser av 192 bp epitopfragmentet omfattende to, tre, fire osv. tandemkopier. Denne prosess vil øke lengden av den åpne leseramme og resultere i stadig større proteiner, omfattende 131, 195 og 259 aminosyrer. The plasmid can also be digested with BamHI endonuclease and mixed and ligated again with the Sau3A digest of the Stul-RsaI repeat epitope fragment to insert a tandem copy of the epitope which will be in phase with the first copy and which, as before, will restore a BamHI site at the ATG codon, provided the orientation of the insert is correct. The procedure can be repeated to build up a series of repeats of the 192 bp epitope fragment comprising two, three, four, etc. tandem copies. This process will increase the length of the open reading frame and result in increasingly larger proteins, comprising 131, 195 and 259 amino acids.
Fordøying av disse konstruksjoner med Hindlll endonuklease vil progressivt frigjøre større fragmenter inneholdende ekspresjonskassettene, som kan reklones på passende gjærvektorer for transformering og innføring i gjær vedkjente metoder, såsom de beskrevet i eksempel 1. Digestion of these constructs with HindIII endonuclease will progressively release larger fragments containing the expression cassettes, which can be recloned onto suitable yeast vectors for transformation and introduction into yeast by known methods, such as those described in example 1.
Eksempel VExample V
Konstruksjon av plasmid pRIT. 10158Construction of plasmid pRIT. 10158
3300 bp Hindlll fragmenter fra plasmid pMC200 (tilgjengelig fra The American Type XCultyure Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. uten resstriksjoner under tilgangsnummer ATCC 39131), beskrevet av Crabeel M. et al; EMBO J.. 2, 205-212 (1983), ble reklonet på et pBR322 derivatplasmid på hvilket det naturlige EcoRI-sete hadde blitt fjernet ved innfylling av T4 DNA polymerase og religering. Et resulterende rekombinant plasmid, pRIT10158 (figur I), ble valgt ut, hvori Hindlll ARG3-geninnskuddet har 3' regionen av ARG3-genet nærliggende Clal-setet på den modifiserte pBR322 vektor. Figur 5 er et restriksjonsendonukleasespaltnings-kart av pMC200. 3300 bp HindIII fragments from plasmid pMC200 (available from The American Type XCultyure Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. without restriction under accession number ATCC 39131), described by Crabeel M. et al; EMBO J.. 2, 205-212 (1983), was recloned on a pBR322 derivative plasmid on which the natural EcoRI site had been removed by filling in with T4 DNA polymerase and religation. A resulting recombinant plasmid, pRIT10158 (Figure I), was selected in which the HindIII ARG3 gene insert has the 3' region of the ARG3 gene adjacent to the ClaI site of the modified pBR322 vector. Figure 5 is a restriction endonuclease digestion map of pMC200.
Selv om beskrivelsen ovenfor fullstendig beskriver oppfinnelsen og alle foretrukne utførelsesformer derav, vil det forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til utførelses-formene som er spesielt beskrevet, men innbefatter alle modifikasjoner derav som faller innenfor rammen av de følgende krav. Although the above description fully describes the invention and all preferred embodiments thereof, it will be understood that the invention is not limited to the embodiments specifically described, but includes all modifications thereof that fall within the scope of the following claims.
Claims (41)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US879187A | 1987-01-30 | 1987-01-30 | |
| PCT/BE1988/000002 WO1988005817A1 (en) | 1987-01-30 | 1988-01-25 | Expression of the p. falciparum circumsporozoite protein by yeast |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO884304D0 NO884304D0 (en) | 1988-09-28 |
| NO884304L true NO884304L (en) | 1988-10-21 |
Family
ID=25662331
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO884304A NO884304L (en) | 1987-01-30 | 1988-09-28 | EXPRESSION OF PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITT PROTEIN WHICH DOES. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO884304L (en) |
-
1988
- 1988-09-28 NO NO884304A patent/NO884304L/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO884304D0 (en) | 1988-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5112749A (en) | Vaccines for the malaria circumsporozoite protein | |
| AU722138B2 (en) | Recombinant vector containing a sequence of a lipoprotein gene for the expression of nucleotide sequences | |
| EP0652962B1 (en) | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria | |
| JPH07108920B2 (en) | Hybrid granular immunogen | |
| JP3003211B2 (en) | vaccine | |
| US5985654A (en) | Recombinant poxvirus and streptococcal M protein vaccine | |
| NO325016B1 (en) | Method of Preparation of a Bordetella Exotoxin Protein Analog, S1 Sub-Unit Polypeptide Analog from Bordetella Pertussis Toxin and Pertussis Vaccine. | |
| EP0162738A1 (en) | Production of pseudorabies virus subunit vaccines | |
| NO843872L (en) | EXPRESSION OF PLASMODIUM FALCIPARUM POLYPEPTIDES FROM THE CLONET CDNA | |
| NO302031B1 (en) | Recombinant gene comprising a nucleotide sequence encoding a flagellin infusion protein, gene-modified microorganism comprising the recombinant gene and method for expression of the | |
| JP3236610B2 (en) | Swine pleural pneumonia vaccine | |
| AU615451B2 (en) | Immunogenic recombinant yeast expression product and method for purifying it | |
| US5403581A (en) | Coccidiosis vaccines | |
| WO1988005817A1 (en) | Expression of the p. falciparum circumsporozoite protein by yeast | |
| US6113917A (en) | Modified polypeptides for enhanced immunogenicity | |
| WO1988006629A1 (en) | Polypeptides useful in diagnosis of coccidia infection and recombinant-dna methods for manufacturing same | |
| EP0474891A1 (en) | Vectors for expression of malarial antigens on the surface of Salmonella vaccine strains | |
| NO884304L (en) | EXPRESSION OF PLASMODIUM FALCIPARUM CIRCUMSPOROZOITT PROTEIN WHICH DOES. | |
| US4997647A (en) | Vaccine against the sporozoite stage of malaria | |
| EP0540719B1 (en) | Dictyostelid expression vector and method for expressing a desired protein | |
| WO1988007546A1 (en) | Immunogenic polypeptide and method for purifying it | |
| JPS63500637A (en) | recombinant virus | |
| EP0742829B1 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
| JPS63283586A (en) | Development of p.falciparum circumsporozoite protein by yeast | |
| AU617402B2 (en) | Vaccines for malaria |