NO880831L - Rekombinant human vevsplasminogen-aktivatorblanding. - Google Patents
Rekombinant human vevsplasminogen-aktivatorblanding.Info
- Publication number
- NO880831L NO880831L NO880831A NO880831A NO880831L NO 880831 L NO880831 L NO 880831L NO 880831 A NO880831 A NO 880831A NO 880831 A NO880831 A NO 880831A NO 880831 L NO880831 L NO 880831L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tpa
- mixture
- activator
- protein
- cells
- Prior art date
Links
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 title claims abstract description 157
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 title claims abstract description 157
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 title claims abstract description 154
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 33
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 33
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 15
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 15
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 7
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 claims description 3
- XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N (2s)-1-[(2r,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010075079 isoleucyl-prolyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 77
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 abstract description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 101100067721 Caenorhabditis elegans gly-3 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 abstract 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 20
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 20
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 20
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 18
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 12
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 12
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 9
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000001471 fibrinogenolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 2
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 2
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 2
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 2
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-n-(4-nitrophenyl)hexanamide Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 CAJXYXPLLJDEOB-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010011091 Coronary artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N Fe3+ Chemical compound [Fe+3] VTLYFUHAOXGGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 1
- 102000010631 Kininogens Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 101710146079 Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 102000003801 alpha-2-Antiplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108090000183 alpha-2-Antiplasmin Proteins 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L calcium;(2s,3s,4s,5s,6r)-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxy-6-[(2r,3s,4r,5s,6r)-2-carboxylato-4,5,6-trihydroxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Ca+2].O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H](C([O-])=O)[C@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O2)C([O-])=O)O)[C@H](C(O)=O)O1 OKHHGHGGPDJQHR-YMOPUZKJSA-L 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 208000002528 coronary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Sammendrag Fremgangsmåte ved fremstilling og rensing av en ny human vevsplasminogen-aktivatorblanding. tPA-blandingen fremstilles i nyelomaceller, fortrinnsvis i nerver av epsilon-aninokapron-syre. Den kan renses fra dyrkningsmediet ved sekvensfraksjoner-ing pi kontrollert porestørrelseglass og pi affinitetskromato-grafimedier. Den omfatter en blanding av proteiner son er ner homogen enn tPA-blandingen son fremstilles i CHO-celler. Oet er overveiende enke1tkjedet materiale. Den omfatter en blanding av to kjeder, en hovedmengde av en sekvens som begynner med ser + 1 (ferdigform), og en liten mengde av en sekvens son begynner med gly-3. Beskrivelsen muliggjør produksjon i stor skala av en aktiv human tPA-blanding som er meget lik naturlig endogent humant tPA.
Description
Bakgrunnen for oppfinnelsen
Denne oppfinnelsen vedrører en human vevsplasminogen-aktivatorblanding fremstilt ved bruk av rekombinant DNA-teknologi i myelomaceller. Nærmere bestemt vedrører den en fremgangsmåte for fremstilling av en vevsplasminogen-aktivatorblanding med forbedret homogenitet i forhold til andre aktivatorpreparater fremstilt i dyreceller.
Human vevsplasminogen-aktivator (tPA) utskilles av celler
og sirkulerer gjennom det vaskulære systemet. Den består av en komponent fra det fibrinolytiske system som er i dynamisk likevekt med koaguleringssystemet. Den fibrinolytiske prosess innbefatter det proteolytiske enzymet plasmin, som dannes fra sitt zymogenplasminogen. Plasminogen overføres i plasmin, eller "aktiveres", av forskjellige forbindelser innbefattende vevsplasminogen-aktivator, urokinase og streptokinase.
EPA-publikasjonsnummer 41766 beskriver en human melanoma-cellelinje som utskiller et tPA som hevdes å ikke kunne skilles verken immunologisk eller i aminosyresammensetning fra human plasminogen-aktivator isolert fra normale vev. Cellelinjen, kjent som Bowe's melanoma, har gitt fagmannen en dyrkbar kilde for mRNA som koder for humant tPA og en kilde for selve proteinet. Disse oppdagelser sammen med utviklingen av en måling for pålitelig påvisning av nærvær av tPA har gjort det mulig for fagmannen å utlede med etablerte metoder DNA-sekvensen til det humane tPA-genet. Fremgangsmåtene innbefatter konstruksjonen av radioaktivt merkede oligonukleotidprober som brukes i hybridiser-ingseksperimenter mot et cDNA-bibliotek konstruert med revers transkriptase fra størrelsesfraksjonert mRNA som stammer fra melanomacellelinjen. Se f.eks. Pennica et al, Infra. Firmaer som utnytter rekombinant DNA-teknologi, har oppnådd ekspresjon av protein med aminosyresekvensen til humant tPA i celler som ikke normalt produserer det. Se f.eks. GB 2 119 804A, publisert 23. november 1983, som beskriver ekspresjon av tPA-genet i kinesisk hamster-eggstokk-(CHO)-celler.
Skjønt ekspresjonen av aminosyresekvensen til humant tPAi forskjellige dyrkbare cellelinjer ofte er et fagmessig spørsmål, er det velkjent at betydelige post-translasjonelle modifikasjoner av proteinet kreves for å gi molekylet de sekundære og tertiære strukturelle trekk som er ansvarlige for dets fibrinaffinitet og enzymatiske aktivitet. Et protein som omfatter aminosyresekvensen til det naturlige protein, men mangler den tilsvarende konformasjon, kan være enzymatisk inaktivt eller ha redusert eller ingen affinitet til fibrin. Således er det den vanlige oppfatning at tPA ikke kan fremstilles i prokaryotiske celler eller gjær uten etterfølgende in vitro-modifikasjon, da disse ekspresjonssystemer ikke inneholder det nødvendige molekylære maskineri for å glykosylere molekylet korrekt eller å skape de riktige disulfid-bindinger.
Et humant tPA-produkt fremstilt i CHO-celler gjennomgår for tiden klinisk utprøvning. Generelt er dette tPA-produkt funnet å noen ganger indusere betydelig perifer blødning, hvilket tyder på at dets affinitet til fibrin er mindre enn optimalt,
og å vise et skuffende aktivitetsnivå ved bruk in vivo som et intravaskulært fibrinolytisk middel. Disse observasjoner tyder på at de for tiden tilgjengelige humane rekombinante tPA-produkter kan være forskjellige fra det naturlige protein på
det tertiære strukturelle nivå. Følgelig kan disse handels-produkter i aminosyresekvens tilsvare naturlig fremstilt humant tPA, men likevel i dette viktige aspekt ikke være samme substans som endogent humant tPA.
Med mindre noen midler kan finnes for å forbedre den post-translasjonelle modifikasjon av tPA fremstilt i rekombinante vertsceller, vil den forventede anvendelighet av dette potens-ielle nye legemidlet for behandling av myokardiale infarkt, dype venetromboser, slag, emboli og andre vaskulære sykdommer kanskje ikke kunne realiseres..
Før publikum i tillegg kan nyte godt av tPA, må industrien
i tillegg oppskalere produksjons- og renseteknikker. Utviklingen av teknologien for det tekniske produksjonstrinn byr på mange utfordrende tekniske problemer. Disse innbefatter f.eks. at dyreceller normalt bare vokser til høy densitet i medier tilsatt serum, samtidig som serum inneholder proteiner som hydrolyserer, bindes til eller på annen måte reduserer aktiviteten og/eller utbyttet av tPA-høsten. Ved ønsket høy konsentrasjon utfelles også tPA.
Det er et mål for denne oppfinnelsen å tilveiebringe en human vevsplasminogen-aktivatorblanding med homogenitet i forhold til nåværende tilgjengelige tPA-produkter. Et annet mål er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av humant tPA ved å bruke rekombinante DNA-teknikker til å produsere et tPA-produkt som ligner mer på det naturlige materialet. Enda et annet mål er å tilveiebringe en effektiv fremgangsmåte for å rense tPA fra dyrkningsmedier.
Disse og andre mål for oppfinnelsen vil fremgå klart for fagmannen fra beskrivelsen og kravene som følger.
Sammenfatning av oppfinnelsen
Det er nå oppdaget at myelomaceller utgjør en ideell celletype for ekspresjonen og den post-translasjonelle modifikasjonen av human vevsplasminogen-aktivator. Myelomaceller transformert med vektorer som er konstruert for å gi evnen til å uttrykke tPA-genet, kan gi en blanding av strukturelt beslektede proteiner med tPA-aktivitet og med forbedret homogenitet sammenlignet med tPA-produkter fremstilt i andre kjente typer av transformanter eller i Bowe's melanomaceller. Videre er myelomaceller som en klasse generelt relativt lette å dyrke og kan induseres til å utskille tPA i det ekstracellulære medium uten serumtilsetninger. Dette forenkler meget sterkt rensingen av produktet. Det har også blitt oppdaget at epsilon-aminokapronsyre (EACA) fortrinnsvis i citratbuffer kan brukes til å holde løseligheten av humant tPA på nøytralt pH-nivå, og at EACA er effektivt for å inhibere proteolytisk spaltning av den uttrykte enkeltkjedede form.
I ett aspekt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en human vevsplasminogen-aktivatorblanding. Fremgangsmåten omfatter trinnene ekspresjon av et DNA omfattende kodesekvensen for humant tPA (se fig. 2) eller alleliske varianter derav, et forskjellig DNA som koder for den samme aminosyresekvensen eller allelisk variant, eller en DNA-sekvens som koder for en analog sekvens av aminosyrer i en dyrkbar myelomacellelinje, og deretter høsting av tPA-produktet. Transformanter som uttrykker tPA fremstilt ved å transfektere J558L-celler (deponert hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under tilgjengelighetsnummeret ATCC CRL 9132) foretrekkes. J558L-cellelinjen er et muse-myeloma som utskiller lambda-lett-kjede av immunoglobulin A, men ikke utskiller intakt immunoglobulin.
I foretrukne aspekter holdes myeloma-cellelinjen som
utskiller tPA'et i medium fritt for tilsatt serum før høsting av tPA'et, og cellene dyrkes i porøse mikrokapsler. EACA kan brukes i vevsdyrkningsmedium for å inhibere proteolytisk nedbrytning av enkeltkjedet tPA-protein. Rensing kan oppnås ved å bruke en forskrift som omfatter trinnene fraksjonering av proteiner i mediet på glass med stort overflateområde og på en affinitets-matrise omfattende bundet antistoff, fortrinnsvis monoklonalt antistoff mot en epitop på aktivatoren. For å opprettholde løselighet og høy aktivitet, elueres aktivatoren fortrinnsvis fra den immobiliserte antistoffmatrise ved å bruke en citration-løshing inneholdende EACA. Ettersom proteinløsningens pH økes, forblir EACA løselig. Denne fremgangsmåten gjør det mulig å produsere et tPA-produkt med høy aktivitet oppløst i fysiologisk forenelig buffer omfattende citrat og EACA.
Det resulterende rensede produkt karakteriseres som følger: a. Nitti prosent av det totale aktive protein som pre-paratet inneholder, er et enkeltkjedet, meget aktivt humant tPA. b. tPA-blandingen skilles, når den gjennomgår polyakrylamidgel-elektroforese som er beskrevet, i to bånd som skiller seg ved sine respektive glykosyleringsnivåer, idet det største lavmolekylvektsbåndet utgjør minst ca. 70 % av det totale aktive protein, og typisk mer enn ca. 90 %. c. Blandingen omfatter også minst ca. 70 % og fortrinnsvis mer enn ca. 90 % av et protein bestående av den kjente aminosyresekvens med full lengde humant tPA-protein minus dets første 3 5 aminoterminale rester ("ferdigform"). Typisk har hovedsakelig alt det gjenværende aktive protein den samme sekvens pluss et gly ala arg-tripeptid på sin aminoende.
Denne blandingen kan oppløses ved høy konsentrasjon i en fysiologisk fordragelig løsning inneholdende citrat og EACA og gi en terapeutisk effektiv fibrinolytisk aktiv injiserbar blanding. Dyreforsøk viser at det tPA som er fremstilt som her beskrevet, er minst så aktivt som det tidligere kjente materialet fremstilt i CHO og Bowes's melanoma. In vitro-forsøk ved bruk av det kromogene substrat S-2288-forsøkssystemet viser at det tPA som her er beskrevet, viser en økning i Vmaks (og ingen økning i Km) ved aktivering med monomert fibrin, og således i det minste ved høyere konsentrasjoner av substratet, kan det være et katalytisk mer effektivt preparat enn de tidligere kjente tPA'er. Forsøk på primater som er utviklet for å bestemme videre det nye tPA's farmakokinetiske egenskaper, skulle bestemme om denne forskjellen har praktiske terapeutiske konsekvenser.
Oppfinnelsen vil bli mer forståelig ved lesning av beskrivelsen, kravene og tegningene som følger.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 er en to-dimensjonal fremstilling av humant tPA-protein i full lengde som viser hva som antas å være dets disulfidbindinger, dets glykosyleringsseter og dets aminosyresekvens (aminosyrer identifisert i standardkode). Restene -1 til
-35 utgjør et signalpeptid og en variabel prosekvens som spaltes fra det ferdige protein; Fig. 2 er DNA-sekvensen til det humane tPA-genet inneholdende dets signalpeptidområde og dets start- og stoppsignaler, men utelukker dets 3'-ikke-translaterte område; Fig. 3A-3D er den fulle DNA-sekvensen til plasmid pEMpl - tPA, den foretrukne ekspresjonsvektor for bruk i fremstillingen av tPA ifølge oppfinnelsen; Fig. 4 er et diagram av plasmid pEMpl - tPAK; Fig. 5 er en kurve av optisk densitet mot fraksjonsnummer som illustrerer affinitetskromatografi-elueringsmønsteret til den meget aktive human tPA-blanding ifølge oppfinnelsen; Fig. 6 er en fotografisk produksjon av et eksempel på polyakrylamidgel, elektroforeseseparasjon av tPA-blandingen i oppfinnelsen; og Fig. 7 er en kurve for den resiproke verdi av plasminogen-aktiveringsgraden (optiske densitetsenheter per minutt) mot den
resiproke plasminogen-konsentrasjonen (målt ved konsentrasjonen av S-2288) i nærvær eller uten (åpne sirkler) av fibrinmonomer.
Beskrivelse
Oppfinnelsen gir en nyhuman vevsplasminogen-aktivatorblanding omfattende en aminosyresekvens som er den samme som eller analog med den kjente publiserte sekvens, men som adskiller seg fra vanlig tilgjengelige tPA-produkter i sitt glykosylerings-mønster og protein-undergruppefordeling. Oppfinnelsen bygger på den oppdagelse at myelomaceller gir et intracellulært miljø som er i stand til å modifisere tPA-proteinet etter translasjon og før utskillelse og fører til et forbedret, relativt homogent produkt. Dyre- og in vitro-forsøk viste at ut fra et effektiv-itetssynspunkt og terapeutisk effekt er tPA-sammensetningen i oppfinnelsen lignende Bowe's melanoma-tPA, bortsett fra at det nye tPA viser en økning i Vmaks i nærvær av fibrin, mens Bowe's eller CHO-produserte tPA'er ikke gjør det.
Under henvisning til tegningene viser Fig. 1 en to-dimensjonal modell av det enkeltkjedede tPA-protein. Den standardiserte 1-bokstav-kode for hver av aminosyrene er angitt i de åpne sirkler. Linjene viser den utledede plassering av disulfidbroer. Trekanten viser spaltningssetet mellom de tunge og lette kjeder. Markørene Ser, Asp, His utgjør tilsammen det som antas å være det proteaseaktive setet (se Ny et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 81, 1984, s. 5358). I den viste modellen er fire asparaginrester 10, 12, 14 og 16 illustrert som glykosylerte. De første 35 restene spaltes fra proteinet under modningen, og er per konvensjon nummerert -35 til -1, med -1-resten inntil den første resten på det ferdige protein (ser + 1).
Modellen som er vist i Fig. 1, behøver ikke være den korrekte modell for endogent humant tPA. Det som er klart, er at tPA fremstilt ved ekspresjon i myelomaceller er strukturelt forskjellig fra tPA uttrykt i melanoma- eller CHO-celler. Selv om sammenhengen mellom strukturen til det nye tPA og tidligere kjente materialer ennå ikke er blitt fullstendig avklart, er det fastslått at tPA produsert fra Bowe's melanoma omfatter to nær beslektede grupper: en (ca. 70 vekt%) hvor sukkerrester er knyttet til glykosyleringssetene 10 og 16; og en (ca. 3 0 vekt%) hvor sukkerrester er knyttet til setene 10, 12 og 16. Det vises ingen sukkerrester ved glykosyleringssetet 14 i Bowe's melanoma-tPA. Glykosyleringsmønsteret til tPA fremstilt i myelomaceller er ennå ikke kjent. Imidlertid fremstilles to typer i et forhold som typisk overskrider 70:30 forholdet av tPA-typer fra Bowe's melanomaceller. I produksjonssatser som anvender fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, oppnås ofte mer enn et 90:10 forhold, idet hovedfraksjonen er lett glykosylert og har en lavere molekylvekt enn den mindre fraksjon. Polyakrylamidgel-elektroforese-separasjoner av blandingen fører ofte til et tydelig enkeltbånd med den lavere molekylvektform.
Glutamin-glutaminsyrebindingen merket B i tegningen på Fig. 1 antas å begrense signalpeptidet fra resten av det uspaltede tPA-molekylet. Ytterligere spaltning må foregå når tPA'er isolert fra Bowe's cellekultur og andre naturlige kilder har flere ytterligere rester avspaltet som forsekvenser. Enzymer i myelomacellene spalter N-enden av proteinet forskjellig, hvilket fører til dannelse av en overvekt av en proteinundergruppe som begynner med serin (aminosyre 3 6 på Fig. 1, + 1 i det ferdige protein). Små mengder av et lengre protein som begynner med glycin ved aminosyre 3 3 på tegningen (-3), dannes også ofte. Typisk er ca. 70 % og fortrinnsvis mer enn 90 % av det totale aktive protein den korte undergruppe.
Pilen mellom arg-ile (aminosyrene 275-276) viser et spalt-ningssete åpent for angrep med endoprotease, som fører til en disulfid-bundet to-kjede-form av proteinet. Anvendelsen av protease-inhibitorer såsom epsilon-aminokapronsyre i dyrkningsmediet og det høstede produkt hindrer spaltning av enkeltkjeden, slik at typisk er mer enn 90 % av det aktive proteinet i blandingene i oppfinnelsen i den enkeltkjedede form.
De rekombinante DNA-teknikker for fremstilling av ekspresjonsvektorer og myelomatransformanter som er anvendelig i denne oppfinnelsen, er velkjente og utviklet. De medfører bruk av forskjellige restriksjonsenzymer som foretar sekvens-spesifikke avskjæringer i DNA og gir stumpe ender eller heftende ender, DNA-ligaser, teknikker som muliggjør enzymatisk addisjon av heftende ender til stump-endede DNA-molekyler, cDNA-syntese-teknikker, syntetiske prober for isolering av gener med en spesiell funksjon, vanlige transfeksjonsteknikker og likeledes vanlige teknikker for kloning og subkloning av DNA. Forskjellige typer vektorer kan brukes såsom plasmider og virus innbefattende animalske virus og fager. Vektorene vil normalt benytte forskjellige markørgener som vil gi en riktig transfektert celle en påviselig fenotypisk egenskap som kan brukes til å identifisere hvilke individer i en cellepopulasjon som har fått det rekombinante DNA fra vektoren riktig innsatt. Foretrukne markører for bruk i myelomacellelinjer omfatter DNA'er som koder for et enzym som normalt ikke uttrykkes (eller bare uttrykkes i lav grav) av cellene som gjør det mulig for cellene å overleve i et medium som inneholder et toksin. Eksempler på slike enzymer innbefatter tymidinkinase (TK), adenosinfosforibosyltransferase (APRT) og hypoksantinfosforiboksyltransferase (HPRT), som gjør det mulig for TK-, APRT- eller HPRT-manglende celler henholdsvis å vokse i hypoksantin/aminopterin/tymidin-medium; dihydrofolat-reduktase (DHFR), hvilket gjør det mulig for DHFR-manglende celler å vokse i nærvær av metotreksat; E. Coli-xantin-guanosin-fosforibosyltransferase (XGPRT, produktet fra qpt-genet), hvilket gjør det mulig for normale celler å vokse i nærvær av mykofenolsyre; og det prokaryotiske enzymet Tn5 fosfotransferase, hvilket gjør det mulig for normale celler å vokse i nærvær av neomycin. Andre passende markørgener vil være anvendelig i vektorene som brukes til å transformere myelomaceller ifølge oppfinnelsen. Følgelig bør eksempelet som følger bare oppfattes som et eksempel i alle henseende, som gir en detaljert beskrivelse av en tPA-fremstillingsforskrifts-utførelsesform av oppfinnelsen, og en beskrivelse av den beste utførelsesform man for tiden kjenner for utøvelse av oppfinnelsen.
Fig. 2 beskriver det som antas å være den fullstendige kodesekvens for naturlig humant tPA tatt fra den publiserte litteratur og starter med ATG-begynnelseskodonet og ender med TGA-translasjons-stoppsignalet. Genet inneholder basene som koder for signalpeptidområdet, men utelukker et 3'-ikke-translatert område og polyadenyleringssetet som normalt befinner seg forbi stoppsignalet. Basebetegnelsene er nummerert fra 20 til 1710. Denne kodesekvensen er den som har vært brukt for å konstruere ekspresjonsvektorer, som har blitt transfektert til myelomacellelinjer for å gi det her krevede tPA. Imidlertid vil en fagmann på området forstå at på grunn av den genetiske kodens utbredelse, kan et forskjellig DNA fra det som er beskrevet i Fig. 2, konstrueres, som koder for den samme proteinsekvensen. Naturlige alleliske variasjoner av genet kan forekomme fra individ til individ. Det er også mulig at forskjellige innskudd eller delesjoner, basesubstitusjoner eller addisjoner i kodesekvensen ville gi en human tPA-aminosyresekvens som er modifisert etter translasjon i myelomaceller liksom proteinet kodet for av det naturlige gen. Alle slike proteiner fremstilt fra gener som spesifiserer en forskjellig, men funksjonelt virkende aminosyresekvens, refereres her til som en analog sekvens. Alle slike analoge sekvenser anses å ligge innenfor omfanget av oppfinnelsen som ekvivalente materialer.
Figurene 3a - 3d og 4 beskriver henholdsvis nukleotid-sekvensen til den foretrukne plasmidvektor som brukes i tPA-fremstillingsprosessen ifølge denne oppfinnelsen, og et restriksjonskart av plasmidet. Denne foretrukne vektoren er kalt pEMpl-tPA og omfatter 7533 basepar. Den innbefatter et for-sterkerelement som forsterker transkripsjon av mRNA fra cDNA'et som koder for tPA (se Gillies et al, Cell, 1983, infra og U.S. 4,663,281), og benytter vektorkonstruksjonsprinsipper som regulerer selektivt forsterkerfunksjonen ifølge det som er beskrevet i den samtidige US-patentsøknad nr. 837,595, innsendt 7. mars, 1986. Det naturlige 3' ikke-translaterte området av tPA-DNA med full lengde ble avskåret for å gi mRNA-stabilitet.
Vektoren som er beskrevet på Fig. 3 og 4, og andre passende ekspresjonsvektorer brukes ifølge oppfinnelsen til å transfektere myelomaceller, fortrinnsvis av musedyrsopprinnelse, såsom cellelinjen J558 (ATCC-TIB 6), Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581), og P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Den foretrukne myelomacellelinje er J558L (ATCC CRL 9132, se Oi et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, V. 80, s. 825 1983). Disse celler omfatter maligne transformanter av B-celler fra kretsløpsystemet til Balb/C-musen, og stammer fra myeloidvev. Bruken av myelomaceller fra mus- eller rotteopprinnelse foretrekkes fremfor human-myelomaceller, ettersom muligheten for kontaminasjon av det rekombinante tPA med humanvirus reduseres sterkt.
Det er blitt oppdaget at myelomaceller av den ovenfor beskrevne typen kan dyrkes i suspensjon eller fortrinnsvis i mikrokapsler ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i US-patent nr. 4,409,331 til F. Lim. For å gjøre rensingen lettere og gi etter-sekresjonsstabilitet til tPA-produktet, foretrekkes det at cellene dyrkes i serumfritt medium og i nærvær av epsilon-aminokapronsyre. Det ekstracellulære proteinet kan høstes daglig ettersom mediet erstattes. Denne formen har fordelen ved å fremstille produktet hovedsakelig fritt for virkningen av kontaminerende proteolytiske enzymer, tPA-komplekseringsmidler og andre inaktiverende faktorer som ofte er tilstede i storfe-eller hestesera. Den foretrukne J558L-cellen utskiller lambda-lett-kjede av immunoglobulin A i betydelige mengder. Dette og andre kontaminerende proteiner kan lett adskilles fra tPA-produktet ved å bruke den enkle rensemetode som er beskrevet nedenunder. tPA-produktet renset ifølge denne fremgangmåten beholder aktiviteten til molekylet når det utskilles.
Det ble observert at tPA hefter til mange overflater innbefattet glass, og av denne grunn unngås normalt glass-apparatur- og andre glassflater under hele tPA-fremstillings-forskriften. Imidlertid er glass med stort overflateområde såsom materialet solgt i kuleform av forskjellige fabrikanter og kjent som "kontrollert poreglass" anvendelig i et første rensetrinn. tPA binder til glasset under passende pH-betingelser, mens immunoglobuliner f.eks. bare har lav ikke-spesifikk affinitet og vil gå gjennom eller kan elueres selektivt fra en kontrollert poreglasskolonne. Fraksjoner med mye tPA kan elueres fra glasset ved behandling med et passende elueringsreagens såsom tris-bufret saltvann. Den kontrollerte poreglassfraksjonering kan føre til en 40-50 gangers økning i konsentrasjon og en 30-40 gangers rensing av tPA-produktet fra det høstede medium.
Et ytterligere trinn i rensingen innbefatter vanlig affinitetskromatografi ved bruk av immobiliserte antistoffer, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff mot en epitop på aktivatoren. tPA'et kan elueres fra antistoffmatrisen ved pH 3 ved bruk av citrationløsning. Deretter kan de tPA-holdige fraksjoner nøytraliseres til fysiologisk pH (EACA forhindrer tPA-utfelling ved denne pH). Denne løsningen har ofte et proteininnhold omfattende mer enn 90 % enkeltkjedet, aktivt, humant tPA, som typisk bare inneholder små mengder av to-kjedede materialer. Det kan være egnet for terapeutisk bruk som der, ettersom citratbuffer og EACA har blitt godkjent for intravenøs injeksjon.
Oppfinnelsen vil bli videre forståelig fra det følgende ikke-begrensende eksempel.
Fremstilling av tPA- produserende myelomatransformanter
En ekspresjonsvektor, pEMpl, ble konstruert fra de
følgende fragmenter: (a) et 2,25 kB PvuII-BamHI-fragment fra pSV2-gp_t (Mulligan and Berg, Science; V. 209, 1422-1427, 1980) inneholdende SV40-forsterkeren og tidlig regionspromotor,
E. coli qpt-genet, den SV40 lille tumor-antigen-mellomliggende sekvens og SV40-transkripsjonsavslutningen og polyadenylerings-signalene; (b) et 2,3 kB PvuII-EcoRI-fragment fra pBR322 inneholdende ampicillinase-genet og den bakterielle replikasjons-opprinnelse (Sutcliffe, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, V. 75,
3737, 1978); (c) et 0,3 kB PvuII-EcoRI-fragment inneholdende en immunoglobulin-tungkjedeforsterker (Gillies et al, Cell, V. 33, s. 717-728, 1983); (d) et 0,25 kB SacI-BglII-fragment inneholdende metallotionein I-promotoren (Brinster et al, Nature, V.
296, 39-42, 1982); og (e) et 0,4 kB AvaII-HaeIII-fragment fra det 3' ikke-translaterte området (UT) av immunoglobulin-kappa-lettkjedegenet, som inneholder polyadenyleringssignalet (Max et al, J. Biol. Chem., V. 256, 5116-5120, 1981). Et 0,26 kB Xbal-BstNI-fragment inneholdende immunoglobulin-lettkjedepromotoren, TATAA-sekvensen, transkripsjonsbegynnelsessetet og de første 2 2 nukleotidene deretter, ble stump-ende-ligert til Sall-setet på en ende av IgH-forsterkersegmentet. Denne promotor-sekvensen ble satt til blokkforsterkning av transkripsjon av E. Coli qpt-genet med immunoglobulin-tungkjedeforsterkeren. Disse fragmenter ble ligert sammen i en rekke reaksjoner ifølge velkjente metodikker (se f.eks. Maniatis et al, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982).
cDNA'et for tPA erholdtes ved standardteknikker (Maniatis, supra). PolyA+ RNA isolert fra dyrkede Bowe's celler ble primet med oligo (dT) for syntese av første kjede med revers transkriptase, nikk-translatert med RNase H og DNA-polymerase I for syntese av annenkjede (Gubler & Hoffman, Gene, V. 25, 263, 1983), metylert med EcoRI-metylase, ligert til EcoRI-linkere og innsatt i EcoRI-setet til lambda fagvektoren gtlO. Fag-plaquer ble undersøkt med radioaktivt merkede oligonukleotid-tPA-spesifikke prober, hvis sekvenser ble bestemt fra den publiserte DNA-sekvensen for tPA cDNA (Pennica et al, Nature, V. 3 01, s. 214-231, Januar, 1983). tPA-kloner som inneholder hele kodeområdet og ca. 800 basepar av 3' UT-område, ble identifisert og bekreftet ved nukleotid-sekvensbestemmelse.
De ekstremt lange 3' UT av tPA cDNA ble oppdaget å bevirke budbringer-RNA-ustabilitet. Hoveddelen av det 3' UT-området ble derfor fjernet ved spaltning ved Sau3A-setet som befinner seg 34 nukleotider nedstrøms for translasjonsstoppsetet. Et 1,7 kB-fragment inneholdende tPA cDNA med det avskårede 3' UT ble ligert til Xhol-linkere.
tPA cDNA-fragmentet ble så innsatt i det eneste Xhol-setet som foreligger i pEMpl-vektor og gav rekombinant plasmid pEMpl-tPA. Et diagram av vektoren pEMpl-tPA er vist på Fig. 4; vektorens fullstendige nukleotidsekvens er beskrevet i Fig. 3A-3D.
De tPA-holdige plasmidene ble transfektert i J558L myelomaceller ved protoplastfusjonsmetoden (Gillies et al, supra) . Celler inneholdende plasmidet og derfor gp_t-genet ble selektert ved dyrking i medier som inneholdt mykofenolsyre. Resistente kolonier inneholdende pEMpl-tPA ble underklonet og undersøkt med hensyn til tPA-ekspresjon. Syntesen og utskil-lelsen av tPA i mediet ble bestemt ved hjelp av en måling hvori tPA overfører plasminogen til plasmin, som deretter spalter det kromogene tripeptidet S2251 (Pennica et al, supra). Fordi det er kjent at serum inneholder inhibitorer for både tPA og plasmin (Coilen and Lijnen, CRC Critical Rewievs in Oncology/ Hematology, V. 4, 249-301, 1986), ble transformanter dyrket i 48 timer i serumfritt medium før måling. Aktiviteten ble målt i internasjonale enheter (IU) basert på en standard levert av World Health Organization og bekreftet ved en tPA-standard fra American Diagnostics, Inc.
Seksten av transformantene man fikk med pEMpl-tPA ble undersøkt etter tPA-aktivitet i mediet. Syv av de 16 var positive, idet aktivitetene varierte mellom 1000 og 6000 IU/ml.
Cellekultur
Et klon av de transformerte J558L-celler som var utplukket, ble selektert for videre eksperimenter medførende laboratorie-skalaproduksjon av tPA. En inokulum-kultur av klonet ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle Medium (Gibco, Catalogue #320-1965) tilsatt 10 % kalvefosterserum (Hazelton), penicillin, streptomycin og 2 mM glutamin.
Ca. 6xl0<9>levedyktige celler med en densitet på ca. lxlO<6>celler/ml (90 % levedyktighet målt ved trypan-blå-ekskludering) ble sentrifugert ved 1,25 K opm i 15 minutter. Supernatanten ble helt fra, og cellene ble gjenoppslemmet i det ovenfor beskrevne modifiserte Dulbecco's Medium (men serumfritt) ytterligere tilsatt 25 TI enheter/ml aprotinin (protease-inhibitor). 1500 ml alikvoter av cellesuspensjonen med en levedyktig celledensitet på ca. lxlO<6>celler/ml ble fordelt i Belco Microcarrier spinner Flasks. Kulturene ble inkubert ved 37°C i tre dager, sentrifugert, slått sammen og brakt til en konsentrasjon på 0,01 % overflateaktivt middel (Tween 80) og 5 mM EDTA.
At disse kulturer produserte tPA, ble bekreftet ved å ekstrahere 1 ml-prøver med en plastpipette. Semi-kvantitativ analyse med ELISA med hensyn på nærvær av tPA og en måling av tPA-aktivitet bekrefter at kulturene produserer et tPA, overveiende (mer enn 95 %) med en enkeltkjedet struktur.
For produksjon i stor skala ble cellemedium innkapslet ifølge fremgangsmåten til Lim (se US-patent 4,409,331), og dyrket i medium som inneholdt det dobbelte av den normale mengde aminosyrer og redusert CaCl2-konsentrasjon (EMA).
Et subklon som grodde godt i kapslene, ble isolert, dyrket i spinnerflasker som angitt ovenfor, og deretter brukt som en inokulum-kultur for en laboratorieskala-tPA-produksjonssats. Cellekulturen ble blandet med 1,6 % natriumalginat som ble formet til kuler og satt til en CaCl2-løsning og gav gelkuler inneholdende celler. Disse ble oppslemmet i en natriumklorid-løsning inneholdende 2 5 TI enheter/ml aprotinin. Kalsiumalginat-gelkulene ble vasket i saltvann tre ganger, oppslemmet seks minutter i en vandig løsning av poly-L-lysin (750 mg/l i 0,9 % natriumklorid) for å avsette en hydrogel-membran rundt gelkulene. Kapslene fikk sette seg, supernatanten ble suget av, og kapslene ble vasket i 60 ml 2 % CHES-buffer, pH 8,4, i en vandig løsning omfattende 0,6 % NaCl og 0,2 % CaCl2. Etter tre minutter ble kapslene vasket i 0,3 % CaCl2i tre minutter, fysiologisk saltvann i tre minutter, og deretter belagt en gang til med poly L lysin (ca. 62.000 dalton gjennomsnittlig molekylvekt) ved bruk av en 400 mg/l løsning av PLL i 0,9 % NaCl-vask i 5 minutter. Kapslene fikk så sette seg, ble suget av, vasket i saltvann og behandlet i 4 minutter i en 0,15 % natriumalginatløsning med lav viskositet. Kapslene ble deretter vasket en gang til med saltvann og to ganger (10 minutter, 6 minutter) i 55 mM natriumcitrat (i 0,9 % NaCl) for å få innmaten av kapslene tilbake i væskeform. Disse celle-holdige kapslene ble deretter vasket i saltvann, EMA-medium, EMA-medium tilsatt 5 % serum og epsilon-aminokapronsyre, og igjen med et medium inneholdende serum, epsilon-aminokapronsyre, 2 mM L-glutamin og 10 mM HEPES-buffer.
Kapslene inneholdt ca. 2,25xl0<6>celler per ml. 100 ml av kapslene ble dyrket i 1,5 1 medium i en 3 liters spinnerflaske. Den innkapslede kultur ble oppslemmet i EMA-medium tilsatt 5 % serum, 2 mM L-glutamin, 5 mM EACA og 10 mM HEPES i 13 dager.
Når den intrakapsulære celledensiteten var større enn ca. IO<7>celler/ml, ble kapslene vasket i serumfrie sterile medier
og deretter oppslemmet i et serumfritt medium omfattende EMA-mediet tilsatt 1 mg/ml storfeserumalbumin, 2 0 mikromolar jern-(III)fruktose, 1 mikrogram per ml av hver av linolensyre og oleinsyre, 5 mM EACA og 1,2 mikrogram per ml etanolamin. Den innkapslede kulturen holdes i dette medium i ytterligere 12 til 3 0 dager. Ca. 2/3 av mediumvolumet kan forandres daglig og oppbevares. Før forandring til serumfritt medium hadde celledensiteten nådd 2,8xl0<7>celler/ml kapsler. 39,7 % av
cellene var levedyktige, hvilket viste en levedyktig celledensitet på ca. I,llxl0<7>celler/ml. Etter forandring til det serumfrie medium var veksten langsom i to dager og begynte så å øke i 6 dager til, og nådde en høyde på 6,75xl0<7>totale celler/ml med en 48,3 % levedyktighet, og en samlet levedyktig celledensitet på 3,26xl0<7>celler/ml. Det tok ca. tre dager til for kulturen å dø av etter dens levedyktige celletelling hadde nådd toppen. Under de siste tre dagers dyrking falt den levedyktige celletelling, men likevel var det tilstrekkelig levedyktige celler til å la det totale antall celler/ml i kapslene nå nesten lxlO<8>.
Prøver av mediet ble tatt fra 15. dag til og med 25. dag og målt ved å bruke en aktivitetsmåling og en ELISA for å påvise tPA-produksjonen.
Rensing
tPA'et i mediet ble renset, først ved å utsette det for en glassmatrise med høyt overflateområde (kontrollert poreglass, Sigma PG-1,000-200) pakket i en kolonne. Kolonnen ble vasket med 4 liter 100 mM NaOH, etterfulgt av4liter 100 mM HC1 og 4 liter ionefritt vann. Kolonnen ble så påsatt serumfritt medium fra kulturen. Serumholdige medium kan brukes, men det reduserer kolonnens kapasitet sterkt. Mediet ble filtrert gjennom et 6 mikrometer Sealclean-filter og satt på CPG-kolonnen med en strømningshastighet på 255 cm/time. Kolonnen ble vasket med 4 liter buffer inneholdende 200 mM Tris HCl, pH 8,3, 5 mM EDTA, 0,01 % overflateaktivt middel (Tween 80), 5 mM EACA og 500 mM NaCl. Dette trinn eluerer svakt bundet protein, for eksempel alt aprotinin og den lette IgA-kjeden utskilt av de tPA-produserende kloner.
tPA-et elueres med 4 liter buffer inneholdende 500 mM tris HCl, pH 8,3, 5 mM EDTA, 0,01 % Tween 80, 5 mM EACA og 1,5 mM natriumklorid. Dette trinnet eluerer det bundne tPA, og gir en fraksjon som inneholder ca. 50 % tPA blandet med andre proteiner.
Kolonnen kan deretter vaskes med 4 liter 100 mM NaOH etterfulgt av 4 liter 100 mM HCl for å eluere alt gjenværende protein for resirkulering.
Den foregående fremgangsmåte fører til en 4 0-50 gangers økning i konsentrasjonen av tPA'et og 30-40 gangers rensing. Virkningsgraden av rensingen avhenger av mengden storfeserumalbumin og andre proteiner i utgangsmediet. tPA-utvinninger større enn 70 % oppnås rutinemessig ved denne separasjonen.
Dette råmateriale ble deretter renset videre med affinitetskromatografi. I dette trinnet ble fremgangsmåten til Kohler og Milstein brukt for å fremstille et hybridoma som utskiller et monoklonalt antistoff spesifikt for en epitop av det humane tPA-produkt. En Balb/C-mus ble immunisert med humant tPA fra American Diagnostics Inc. På dag 0 ble 10 mikrogram materiale
i fullstendig Freunds adjuvans injisert intraperitonealt (IP). Fjorten til femten dager senere ble ytterligere 10 mikrogram av tPA'et i ufullstendig Freunds adjuvans injisert IP som et skudd, og den 21. dag ble muse-sera undersøkt etter anti-tPA-aktivitet med ELISA. En 50 % styrke målt ved en større fortynning enn 1/1.000 ble tatt som en positiv avlesning.
De positive dyrene fikk 10 mikrogram tPA i fosfat-bufret saltvann innført IP og ble avlivet tre dager senere. Miltene deres ble presset gjennom en sikt for å gi en enkeltcelle-suspensjon. B-cellene og SP2/0 myeloma ble oppslemmet sammen ved et forhold på 4:1 B-celler til myeloma. Fusjonen ble utført ved 45 % polyetylenglykol (1000 dalton). Seleksjon av kloner ble utført i HAT-medium i 7 dager, og overlevende kloner ble dyrket i HT Dulbecco's minimums-essensielle medium tilsatt 10 % kalvefosterserum. Fusjonsfrekvensen var l-3xl0~<7>. De tPA-antistoff-utskillende kloner ble videre undersøkt etter et hybridoma som utskilte et antistoff som reagerte med både de dobbelt- og enkeltkjedede tPA-typene, men ikke reagerte med urokinase eller med tPA kompleksert med serum-tPA-inhibitor.
Det utplukkede hybridoma produserte følgelig monoklonalt antistoff mot en epitop av tPA'et som ikke inngitt i dets enzymatiske aktivitet.
En antistoff-gelkolonne ble fremstilt ved å immobilisere det tPA-monoklonale antistoff på cyanogenbromid-aktivert sepharose (Pharmacia) ifølge fremgangsmåten til Kohn og Wilchek (Biochem. Biophys. Res. Comm., V. 107, s. 878-884, (1982).
Gelen aktiveres i 60 % aceton ved -15 til -20°C med cyanogen bromid ved bruk av trietylamin som et "cyano-overførings"-reagens. Den aktiverte gelen overføres så til vann (4°C), og
antistoffet tilsettes oppslemmet i natriumkarbonatbuffer,
pH 8,3, inneholdende natriumklorid. Etter blanding i to timer ved romtemperatur, blokkeres de usubstituerte gruppene med etanolamin i karbonatbufferen. Normalt immobiliseres mellom 5 og 10 milligram antistoff per ml gel.
Anti-tPA-sepharosen pakkes i en 2,6 cm diameter kolonne, 4 cm høy, og ekvilibreres med 0,1 M natriumcitrat, pH 7,0, IM NaCl, 20 mM epsilon-aminokapronsyre og 0,01 % Tween 80. Kapronsyren kreves ettersom antistoffet er forurenset med protease, som kunne redusere utbyttet av tPA i mangel av en protease-inhibitor. Det delvis rensede tPA-produkt fra det kontrollerte poreglass-trinn inneholder 500 ml tris, 1,5 M NaCl, EDTA og overflateaktivt middel. Dets pH justeres til 7, og det settes på kolonnen. Etter prøve-påsetting vaskes kolonnen i citratbufferen for to kolonnevolumer, og deretter elueres tPA med 0,15 M sitronsyre, pH 3,0, tilsatt 2 0 mM epsilon-aminokapronsyre og 0,01 % Tween 80. Et eksempel på elueringsprofil er angitt i Fig. 5. tPA samles, og løsningens pH justeres til 7. Av det totale proteininnhold i disse elueringsvolumer er mer enn 95 % humant tPA.
Karakteriseringsdata
Typisk omfatter mer enn 90 % av den rensede tPA-blanding enkeltkjedede tPA-typer som vist ved adskillelse på reduserende geler.
Det rensede produkt ble underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel-elektroforese. Resultatene av eksperimentet er vist på Fig. 6. Fremgangsmåten ble utført på 10 % gel under reduserende betingelser ifølge metoden til Laemmli, NATURE, 227, 680-685 (1970). Sporene 1, 2 og 9 ble påsatt lavmolekyl-vektstandarder fra Pharmacia. Hvert av sporene 3-8 ble påsatt 5,0 mikrogram av forskjellige tPA-blandinger. Sporene 3 og 8 inneholdt tPA-blandingen fra oppfinnelsen. Sporene 4 og 7 inneholdt tPA fra separate kilder fremstilt ved ekspresjon i CHO-celler. Sporene 5 og 6 inneholdt duplikatprøver av en tPA-blanding fra Bowe's melanoma.
CHO-tPA vandrer langsommere enn både melanoma- og myeloma-tPA. Både CHO og Bowe's materiale vandrer som to adskilte bånd, og viser en molekylvektsheterogenitet som skyldes forskjeller i glykosylering. Det øvre båndet antas å skyldes formen av tPA med 3 N-bundne glykosyleringsseter, og det nedre båndet antas å skyldes formen med 2 N-bundne glykosyleringsseter. Myeloma-tPA</>et i denne oppfinnelsen har hovedsakelig den samme mobilitet som Bowe's melanoma-tPA, hvilket tyder på at dens glykosylering sannsynligvis ligner meget på "naturlig" tPA til forskjell fra materiale som stammer fra CHO.
N-terminal sekvensbestemmelse av myeloma-tPA på Applied Biosystems 470 og 477A gassfase-sekvensbestemmere tyder på
nærvær av to typer tPA, en som starter ved ser + 1 og den andre med sekvensen GLY ALA ARG før ser + l-form bestemt fra forholdet av primær- til sekundærsekvens oppnådd, under N-terminal-analyse. I Bowe's melanoma-tPA er forholdet mellom de to former 1:1 (Wallen et al Eur J. Biochem 132 s. 681-686, 1983).
tPA-blandingene fremstilt som angitt ovenfor, har blitt undersøkt utstrakt i in vitro-målinger og dyremodeller ved bruk av etablerte forskrifter for å bestemme dets virkning som et intravaskulært fibrinolytisk middel mot andre tPA-blandinger og andre fibrinolytiske preparater.
Et sett av in vitro-eksperimenter sammenlignet de spesi-
fikke aktivitetene til rekombinant, overveiende enkeltkjedet tPA-blanding fra denne oppfinnelsen ("DPA") med tPA fremstilt med Bowe's melanoma fra forskjellige kilder: enkelt- og dobbeltkjedede typer fra American Diagnostics, en dobbeltkjedet type fra Bioscot (BSdc) og en enkeltkjedet type. Den fibrinolytiske aktiviteten til de forskjellige tPA-typene ble målt ved å bestemme deres evne til å aktivere elementer i humant plasma (innbefattet plasminogen) til å lyse en<125>I-fibrinogen-merket sammenklumpning. Trombolysegraden ble beregnet fra mengden radioaktivitet frigjort fra sammenklumpningen til plasmaet. Fibrinogenolytisk aktivitet ble bestemt ved å måle mengden av
<125>I som var igjen i plasmaet etter utsettelse for tPA og derfor tilgjengelig for sammenklumpning. Disse in vitro-
undersøkelser viste dose-relaterte virkninger i det undersøkte området. Imidlertid ble ingen signifikante forskjeller i de lytiske aktiviteter for de forskjellige tPA'er observert.
Direkte og indirekte in vitro-aktivitetsmålinger av DPA mot en standard tPA (produsert fra Bowe's melanoma, American Diagnostics, Inc.) er også blitt utført. Den indirekte måling innbefatter det kromogene substrat S-2251; den direkte måling innbefatter substratet S-2288. Forsøksmetodene er velkjente (se f.eks. Current Status of Activity Assays for Tissue Plasminogen Activator, Enzyme Engineering, No. 7, Vol. 434). I den indirekte målingen bestemmes aktiviteten av forsøksprøven ved å måle fargeutviklingen av S-2251 ettersom den spaltes med plasmin. Plasmin produseres ettersom plasminogen spaltes av tPA'et i nærvær av fibrinogen. I den direkte måling spaltes tPA'et med plasmin og gir de dobbeltkjedede undertyper, plasminet inaktiveres og S-2288 settes til reaksjonsblandingen. Det tp-kjedede tPA virker direkte på substratet. Aktiviteten i er proporsjonal med fargeintensiteten. I begge fremgangsmåter ble substratkonsentrasjonene utover Km anvendt.
I den indirekte målingen viste DPA i nærvær av fibrinogen en aktivitet som var omtrent to ganger større enn for standard-tPA'et (ca. IO<6>enheter/mg); i den direkte målingen var aktiviteten til både DPA og standard hovedsakelig identisk.
I et separat forsøk ble aktiviteten av DPA'et målt ved å bruke et modifisert direkte forsøk innbefattende S-2288. Matrex Pd 102-kuler (Amicon) ble belagt med fibrinmonomer. Kulene er 1-2 mikron i diameter, og omfatter polyakrylnitril innbefattende N-hydroksysuksinimid-karboksylatestergrupper og fri karboksylgrupper for kovalent kobling med fri aminogrupper på protein. Fibrinogen ble koblet til kulene, og deretter omdannet til fibrinmonomer med trombin. Dette reagenset ble så brukt i den direkte aktivitetsmålingen. Disse eksperimentene viste mettbar, spesifikk binding av DPA til fibrin. DPA hydrolyserte S-2288 i fravær av fibrinmonomer med typiske genetiske konstanter på ca. 0,3 3 mM<-1>for Km og kca-t- =
3,51 s-<1>. I nærvær av oppløselig fibrinmonomer (67^g/ml dannet fra fibrinogen i nærvær av 1,5 mM glykoyl-prolyl-arginyl-prolin) enzymatisk aktivitet ble betydelig øket med Km
relativ konstant på ca. 0,34 mM-<1>, men kcat<=>9,02 s-1.
Resultatene av disse eksperimentene er grafisk illustrert på
Fig. 7. Denne aktivitetsøkningen frembrakt med fibrinmonomerer adskiller seg fra tilsvarende for CHO-avledet og Bowe's tPA,
hvori fibrin-indusert aktivering medfølges av en reduksjon i Km uten en signifikant økning i kca-t-. Med hensyn til naturlig forekommende tPA, skyldes aktivitetsøkningen i nærvær av fibrin en øket affinitet for plasminogen av fibrin-bundet tPA, og ikke forandring av den katalytiske hastighetskonstant (Houlaerts et al., J. Biol. Chem., 257, 2912, 1982). Observasjonen av den økede kca-(- for DPA i nærvær av fibrin koblet med den observasjon at nærvær av fibrinogen øker DPA-aktiviteten i det indirekte forsøket med overskudd substrat i forhold til naturlig materiale, tyder på at DPA erkarakterisert vedforskjellig farmakokinetisk virkning med en økning i Vmax i nærvær av fibrin.
En gruppe av in vivo-eksperimenter sammenlignet de trombolytiske virkninger og halveringstider av DPA med tilsvarende for BSdc og urokinase (UK) hos kaniner. Plasma-prøver oppnådd fra kaniner infusert med de forskjellige aktivator-løsninger ble undersøkt etter deres fibrinolytiske aktivitet ved lysingstidsmåling av fortynnet blodsammenklumpning. Plasma oppnådd fra kaniner behandlet med DPA lyset fullstendig en in vitro-sammenklumpning i løpet av en 24-timers inkuberingstid,
mens den som var oppnådd fra kaniner behandlet med BSdc eller UK, ikke gjorde det. Halveringstiden for DPA var sammenlignbar
med den for BSdc, men var kortere enn den for UK ved lignende konstanttilstands-konsentrasjoner.
Virkningene av disse trombolytiske midlene på koaguleringssystemet ble bestemt ved å måle protrombin-tid (PT) som påviser abnormaliteter i koaguleringsfaktorene VII, X, II, V og I for det utvendige forløp, og partiell tromboplastin-tid (PTT) som bestemmer svikter i koaguleringsfaktorene VIII, IX, X, XII, prekallikrien og kininogen for det innvendige forløp (samt for II, V, X og I) for plasma. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom DPA- eller BSdc-behandlet plasma og kontroll. Imidlertid var en forlengelse av PT tydelig i det UK-behandlede plasma.
Fibrinogenolytiske parametre for blod ble undersøkt under og etter infusjon med disse trombolytiske midler. Ingen signifikante forskjeller ble observert i konsentrasjonene av fibrinogen eller plasminogen i de tPA-behandlede grupper sammenlignet med kontroller; UK-behandling førte til reduksjoner av begge faktorer. Antiplasmin-nivåer i DPA-behandlede kaniner avtok til 62 % av kontrollen, og for BSdc til 46 % av kontrollen under infusjon, men disse nivåer ble gjenopprettet til kontroll-nivåer umiddelbart etter infusjon; nivåer i UK-behandlede
kaniner falt til 1 % av kontrollen under og etter infusjon.
Disse resultater tyder på at UK har en forlenget systemisk fibrinolytisk virkning i motsetning til tPA, og at DPA kan ha større klinisk verdi enn tPA som stammer fra Bowe's melanoma på grunn av sin økte trombolytiske aktivitet målt ved lysingstidsmåling av fortynnet blodsammenklumpning, og dets reduserte
virkning på konsentrasjonene av alfa-2-antiplasmin.
Andre arbeider søkte , å. sammenligne-' de -trombolytisket^,^-
virkninger av DPA med et tilsvarende for streptokinase (STR) i en in vivo-(hunde-)-modell av koronararterie-trombose. I disse eksperimenter ble koronararterie-infarkt frembrakt ved elektro-lytisk stimulering. Den nødvendige tid for å oppnå reperfusjon av arterien ble redusert hos hunder behandlet med en høy dose DPA i forhold til en mellomliggende eller lav dose, eller behandling med STR, selv om forskjellen ikke var statistisk signifikant. Med høy-dose-DPA-behandling var imidlertid ingen trombus tilbake tre timer etter medikamentinfusjon, og hyppig-heten av retrombose var lavere. I tillegg var DPA's trombolytiske aktivitet ved enhver undersøkt konsentrasjon større enn
for STR bestemt ved måling av trombus-massen, og denne aktiviteten virket på en dose-avhengig måte. PT, PTT og fibrinogen-analyse ble utført hovedsakelig som beskrevet ovenfor for å bestemme hvilke virkninger intravenøst DPA hadde på resirkuler-ende koaguleringsfaktorer. Målbar fibrin/fibrinogen-spaltning eller -spaltningsprodukter (FSP) var en indikasjon på den proteolytiske nedbrytning av fibrin/fibrinogen.
PT-, PTT-, FSP- og fibrinogen-nivåene var signifikant abnormale under og etter infusjon av høye doser av DPA- medikamentet. I tillegg ble en reduksjon i plasma-konsentrasjonen av fibrinogen samtidig med en økning i fibrin/ fibrinogen nedbrytningsprodukter (FSP) observert. Ved mellomliggende doser av DPA var disse målingene abnormale under infusjon, men vendte tilbake til nær normal etter infusjon.
Til tross for tidligere rapporter av systemisk fibrinolyse sammen med blødning etter STR-administrering, påviste under-søkelsen ingen vesentlige forandringer i blodkoagulerings-parametre; PT og PTT var sammenlignbare med kontroll både under og etter infusjon, og det var bare en svak reduksjon i plasma-fibrinogenkonsentrasjonen sammen med en moderat økning i FSP.
I den andre modellen (hunn) ble sammenklumpninger som inneholdt en gamma-kilde fremstilt i Chandler-sløyfer. Sammenklumpningene ble så overført til en ekstfakorporeal sløyfe, som deretter ble innført i halsvenen. De trombolytiske aktiviteter for IV-injisert DPA, både enkelt- og dobbeltkjedede undertyper, ble sammenlignet med sådanne for UK ved å kontrollere forsvinning av tellinger i kretsen (sammenklumpningslysing). Resultatene tyder på at DPA-enkeltkjede undersøkt ved 0,14 mg/kg gav 1,2 x mer lysing enn den samme konsentrasjonen av DPA-dobbeltkj ede.
I den tredje modellen som medførte venøs trombose hos kaniner, ble en trombus dannet i halsvenen fra<125>I-fibrinogen, blod og trombin. Trombolysen ble bestemt ved å måle isotop som ble frigjort i blodet. De økende doser av DPA's evne til å lyse sammenklumpningen ble sammenlignet med tilsvarende for tPA som stammet fra Bowe's melanoma og ble bestemt i andre under-søkelser ved å bruke den identiske modellen. Ved enhver undersøkt konsentrasjon hadde DPA større lytisk aktivitet i denne modellen enn tPA fra Bowe's melanoma. Disse resultater tyder på at DPA kan ha større klinisk verdi i noen in vivo-modeller enn i andre.
Enda en annen serie eksperimenter utført ved The University of Texas Health Science Center, sammenlignet effektiviteten av vevsplasminogen-aktivatorer fra muse-myelomaceller (DPA); fra kinesiske hamster-eggstokkceller (CHO tPA); og fra Bowe's melanomaceller (Bowe's tPA). Undersøkelsene ble foretatt ved å bruke kanin-halsvene-klumpmodellen som beskrevet av Coilen og en modifikasjon av denne modell som anvender en bolus-injeksjon utviklet i laboratoriet ved The University of Texas. DPA ble oppdelt i to typer basert på prosentdelen av enkeltkjedet tPA
(D-I var ca. 60 % enkeltkjedet, D-II var større enn 90 % enkeltkjedet. CHO tPA'et var ca. 75 % enkeltkjedet, og Bowe's tPA var ca. 90 % enkeltkjedet.
Halsveneklumpen ble fremstilt som beskrevet av Coilen og
fikk eldes i 30 minutter før klemmene ble fjernet. Vevsplasminogen-aktivatoren ble levert med en pumpe med konstant hastighet over et tidsrom på fire timer i den kontralaterale venen. Dosen ble fortynnet i 20 ml bærerbuffer (0,3 M NaCl med 0,01 % Tween 80). To milliliter ble gitt som en bolus-injeksjon og de gjenværende 18 ml ble gitt over 4 timers-tidsrommet. Blodplasma og blodprøver ble tatt ved 0, 1,0, 3,0 og 4,5 timer. Serumprøvene ble samlet i en aprotininløsning og ble brukt for fibrinogen-spaltningsprodukt-bestemmelser. Ved 4,5 timer ble klumpen fjernet, og trombolysegraden beregnet som en forskjell mellom den opprinnelige radioaktivitet som var i klumpen og den som var igjen i venesegmentet. Resultatene ble uttrykt i prosent av den opprinnelige radioaktivitet.
Plasmaprøvene ble analysert på standard-trombin-tid og på plasminogen-nivåer etter aktivering med urokinase. Serumprøvene ble også brukt for fibrinogen-spaltningsprodukt-bestemmelser.
Et annet sett eksperimenter ble utført ved å bruke den
samme klump-fremstillingsteknikk, men dosen ble gitt i en 2 ml bolus-injeksjon over et 5-minutters tidsrom. I disse eksperimenter ble blodplasma- og blodserum-prøver tatt ved 0, 0,5,
1,0 og 2,0 timer, og klumpen ble fjernet etter 2,5 timer.
Resultatene av klumplysingsbestemmelsene er vist i Tabell
I for 4-timers-infusjonseksperimentene og i Tabell II for bolus-injeksjonseksperimentene. Alle prøvene viste god lysing av klumpen, og det var ingen signifikant forskjell mellom prøver som ble gitt ved en kontinuerlig infusjon. De Bowe's tPA-behandlede kaniner ved bolus-injeksjon var mindre aktive enn både CHO og DPA, men denne observasjon bygget på ett eneste dyr.
Fibrinogen-spaltningsprodukter ble målt ved å bruke latex-partikkelmetoden kjøpt fra Wellcome Diagnostics. Forsøket ble bare kjørt på prøvene fra 0,5 mg/kg dosen. Disse prøver viste ingen målbare fibrinogen-spaltningsprodukter sammenlignet med standard positive kontroller frembrakt med diagnosesettet. Da ingen fibrinogen-nedbrytningsprodukter var å se ved den høyeste dosen, konkluderte man med at de lavere doser også ville være negative.
Oppfinnelsen kan utføres i andre spesifikke former.
Claims (18)
1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en human vevsplasminogen-aktivatorblanding, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene:
ekspresjon, i en dyrkbar myelomacellelinje, av et DNA valgt fra gruppen bestående av DNA'et til genet som er angitt i Fig. 2, alleliske varianter derav og et DNA som koder for den samme sekvens av aminosyrer, og
høsting av en human vevsplasminogen-aktivator fra cellelinjen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, omfattende trinnet ekspresjon av DNA'et i en J558L-celle, ATCC CRL 9132.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvori aktivatoren høstes fra et medium.brukt til å opprettholde metabolisme i ; cellelinjen, hvilken fremgangsmåte omfatter det ytterligere trinn
rensing av aktivatoren ved å bruke en fremgangsmåte som medfører trinnene fraksjonering av proteiner i mediet på glass eller på en affinitetskromatografi-matrise omfattende bundet antistoff mot en epitop av aktivatoren.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, omfattende trinnene eluering av aktivatoren fra matrisen ved bruk av en citrat-løsning.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, omfattende trinnene dyrkning av myelomacellelinjen i porøse mikrokapsler oppslemmet i et medium.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, hvori mediet er fritt for serum.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, hvori myeloma-cellelinjen er plassert i et medium inneholdende EACA.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, omfattende det ytterligere trinn plassering av blandingen i en løsning av EACA for å opprettholde løseligheten derav.
9. Fremgangsmåte for rensing av en vevsplasminogen-aktivator omfattende trinnene å kontakte en vandig løsning inneholdende aktivatoren og andre proteiner med en matrise omfattende immobilisering av antistoff mot en epitop av aktivatoren for å fortrinnsvis binde aktivatoren til antistoffet, vaske matrisen og eluere aktivatoren med en citration-løsning.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende trinnet å samle en elueringsfraksjon fra matrisen med et totalt proteininnhold omfattende utover 90 vekt% av aktivatoren.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende det ytterligere trinn å fraksjonere proteinet i den vandige løsning på glass før kontakt med matrisen.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, omfattende det ytterligere trinn å plassere den eluerte aktivator i en vandig løsning av EACA for å opprettholde aktivatorens løselighet.
13. Human vevsplasminogen-aktivatorblanding med in vivo fibrinolytisk aktivitet omfattende en blanding av proteiner uttrykt fra DNA'et på Fig. 2, alleliske varianter derav, eller et DNA som koder for den samme aminosyresekvens i myelomaceller og er karakterisert ved :
a. et glykosyleringsmønster som gir et par bånd som vist i Fig. 6 på tegningen når den rensede blanding underkastes SDS-polyakrylamidgel-elektroforese under reduserende betingelser;
b. et enkeltkjede-proteininnhold utover 90 % av den totale vekt av aktivt protein i blandingen.
14. Blanding ifølge krav 13,
videre karakterisert ved :
å inneholde et første protein med en aminosyresekvens som angitt på Fig. 1, men er fri for de første 35 aminoterminale aminosyrerester, idet det første protein utgjør utover minst ca. 70 % av den totale vekten av aktivt protein i blandingen.
15. Blanding ifølge krav 14,
videre karakterisert ved at den inneholder et andre protein med en aminosyresekvens som angitt på Fig. 1, men som er fri for de første 32 aminoterminale aminosyrerester.
16. Blanding ifølge krav 13,
videre karakterisert ved en øket kca^ i nærvær av f ibrinmonomer i forhold til kca-t- i mangel av fibrin målt ved hydrolyse av det kromogene substrat S-2288.
17. Blanding ifølge krav 13 eller 14, plassert i en fysiologisk fordragelig citratløsning.
18. Blanding ifølge krav 13 eller 14,
karakterisert i en fysiologisk fordragelig EACA-løsning.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US87903886A | 1986-06-26 | 1986-06-26 | |
PCT/US1987/001569 WO1988000242A1 (en) | 1986-06-26 | 1987-06-25 | Recombinant human tissue plasminogen activator composition |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO880831D0 NO880831D0 (no) | 1988-02-25 |
NO880831L true NO880831L (no) | 1988-04-25 |
Family
ID=26775963
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO880831A NO880831L (no) | 1986-06-26 | 1988-02-25 | Rekombinant human vevsplasminogen-aktivatorblanding. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
NO (1) | NO880831L (no) |
-
1988
- 1988-02-25 NO NO880831A patent/NO880831L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO880831D0 (no) | 1988-02-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5516650A (en) | Production of activated protein C | |
EP0521873B1 (en) | Anticoagulant proteins | |
EP0370036B1 (en) | Modified factor vii/viia | |
US6573071B1 (en) | Factor X analogues with a modified protease cleavage site | |
Lijnen et al. | Biochemical and thrombolytic properties of a low molecular weight form (comprising Leu144 through Leu411) of recombinant single-chain urokinase-type plasminogen activator. | |
US5763253A (en) | Methods of preparing tissue plasiminogen activator derivative composition | |
NO311299B1 (no) | Protein C derivater, rekombinant DNA molekyl, kodende dette samt fremgangsmåte for fremstilling av proteinene | |
US4853330A (en) | Human tissue plasminogen activator | |
IE54975B1 (en) | Human tissue plasminogen activator | |
AU732953B2 (en) | Factor X deletion mutants and analogues thereof | |
US5753224A (en) | Hybrid protein C | |
US6284247B1 (en) | Human tissue plasminogen activators | |
JPH05103678A (ja) | チモーゲン型ヒトプロテインcの発現のためのベクターおよび化合物 | |
EP0506821B1 (en) | Hybrid protein c | |
JP3004375B2 (ja) | ヒトプロテインcのグリコシル化突然変異体の発現のためのベクターおよび化合物 | |
US5185259A (en) | Truncated human tissue plasminogen activator | |
NO880831L (no) | Rekombinant human vevsplasminogen-aktivatorblanding. | |
EP0275606A1 (en) | Hybrid plasminogen activators with improved thrombolytic properties and drugs comprising these plasminogen activators | |
EP0247674B1 (en) | Plasminogen activator and thrombolytic composition | |
EP0485504B1 (en) | Cell culture methods for producing activated protein c | |
EP0272315A1 (en) | Recombinant human tissue plasminogen activator composition | |
Cederholm‐Williams | Molecular biology of plasminogen activators and recombinant DNA progress | |
JP3153236B2 (ja) | 端が切り取られた軽鎖を有する組換えプロテインc | |
US5223422A (en) | T-pa mutant gk1l | |
EP0420502B1 (en) | A new plasminogen activator derivative and a method for its manufacture |