NO880794L - USE OF MULLERIAN INHIBITIVE SUBSTANCE AS A CONTRACTIVE AGENT. - Google Patents
USE OF MULLERIAN INHIBITIVE SUBSTANCE AS A CONTRACTIVE AGENT.Info
- Publication number
- NO880794L NO880794L NO880794A NO880794A NO880794L NO 880794 L NO880794 L NO 880794L NO 880794 A NO880794 A NO 880794A NO 880794 A NO880794 A NO 880794A NO 880794 L NO880794 L NO 880794L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- mis
- mullerian
- female
- substance
- oocytes
- Prior art date
Links
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 108010005853 Anti-Mullerian Hormone Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000868 anti-mullerian hormone Substances 0.000 claims description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 22
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 claims description 16
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims description 14
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 9
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 9
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 9
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 7
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims description 7
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 6
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 101710122877 Muellerian-inhibiting factor Proteins 0.000 description 120
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 79
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 35
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 8
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-M [(4ar,6r,7r,7ar)-6-[6-(butanoylamino)purin-9-yl]-2-oxido-2-oxo-4a,6,7,7a-tetrahydro-4h-furo[3,2-d][1,3,2]dioxaphosphinin-7-yl] butanoate Chemical compound C([C@H]1O2)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-M 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 101001011645 Homo sapiens Muellerian-inhibiting factor Proteins 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- -1 alkaline earth metal cations Chemical class 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000033199 negative regulation of oocyte maturation Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 description 3
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 210000000318 mullerian duct Anatomy 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 230000031877 prophase Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101001011647 Bos taurus Muellerian-inhibiting factor Proteins 0.000 description 1
- WDPFQABQVGJEBZ-MAKOZQESSA-N Bothermon Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WDPFQABQVGJEBZ-MAKOZQESSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100120663 Drosophila melanogaster fs(1)h gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000010454 developmental mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000030699 diplotene Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N gelgreen Chemical compound [I-].[I-].C1=C(N(C)C)C=C2[N+](CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]3=C4C=C(C=CC4=CC4=CC=C(C=C43)N(C)C)N(C)C)=C(C=C(C=C3)N(C)C)C3=CC2=C1 TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 231100000503 infertility induction Toxicity 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 125000005208 trialkylammonium group Chemical group 0.000 description 1
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Paper (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår mulleriansk inhiberingssubstans og dettes bruk som kontraseptiv. The present invention relates to Mullerian inhibiting substance and its use as a contraceptive.
I. Mulleriansk inhiberingssubstansI. Mullerian inhibitory substance
Mulleriansk inhiberingssubstans, MIS, er et 140 000 dalton glykoprotein som er ansvarlig for regresjon av mulleriankanalen hos et hannembryo (Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol., 140:463:464 (1946); Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol., 141:135-136 (1947); Balanchard, M.G., et al., Ped. Res., 8:968-971 (1974); Donahoe, P.K., et al., Biol. Repro., 15:329-334 (1976); Donahoe, P.K., et al., J. Ped. Surg. , 12:323-330 (1977); Donahoe, P.K., et al., Biol. Repro., 16:238-243 (1977)). Mullerian inhibitory substance, MIS, is a 140,000 dalton glycoprotein responsible for regression of the Mullerian duct in a male embryo (Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol., 140:463:464 (1946); Jost, A., Comptes Rend. Soc. Biol., 141:135-136 (1947); Balanchard, M. G., et al., Ped. Res., 8:968-971 (1974); Donahoe, P. K., et al., Biol. Repro. , 15:329-334 (1976); Donahoe, P.K., et al., J. Ped. Surg., 12:323-330 (1977); Donahoe, P. K., et al., Biol. Repro., 16:238 -243 (1977)).
Mullian-inhiberingssubstansen er funnet å være et glyko-proteinhormon. Substansen produseres ved fetale og neonatale sertoli-celler av testes. MIS har vært delvis renset og er funnet å være et dimert glykoprotein på 72 000 henholdsvis 74 000 dalton (Budzik, G.P., et al., i: Lash, J.W., Saxen, L. , (utg.), Developmental Mechanisms: Normal and Abnormal. New York, Alan R. Liss, s. 207-223 (1985)). Rensingen av MIS er beskrevet av Donahoe, P.K., et al., (US-PS 4 510 131). The Mullian inhibitory substance has been found to be a glyco-protein hormone. The substance is produced by fetal and neonatal Sertoli cells of the testes. MIS has been partially purified and found to be a dimeric glycoprotein of 72,000 and 74,000 daltons, respectively (Budzik, G.P., et al., in: Lash, J.W., Saxen, L. , (eds.), Developmental Mechanisms: Normal and Abnormal. New York, Alan R. Liss, pp. 207-223 (1985)). The purification of MIS is described by Donahoe, P.K., et al., (US-PS 4,510,131).
Monoklonale antistoffer til MIS er utviklet og funnet å være brukbare ved rensing og fremstilling av MIS (Shima, H. , et al., Hybridoma, 3:201-214 (1984); Donahoe, P.K., et al., US-PS 4 487 833), Necklaws, E.C., et al., Endocrinology 118:791:796 (1986). Ved bruk av disse monoklonale antistoffer er det utviklet en radioimmunoanalyse for å påvise MIS (Hayashi, M. , et al., J. Histochem. Cytochem., 32:649:654 Monoclonal antibodies to MIS have been developed and found to be useful in the purification and preparation of MIS (Shima, H., et al., Hybridoma, 3:201-214 (1984); Donahoe, P.K., et al., US-PS 4 487,833), Necklaws, E.C., et al., Endocrinology 118:791:796 (1986). Using these monoclonal antibodies, a radioimmunoassay has been developed to detect MIS (Hayashi, M., et al., J. Histochem. Cytochem., 32:649:654
(1984)). Denne radioimmunoanalyse har påvist MIS i follikulær fluidet av modne bovinovarier (Vigler, B., et al., Endocrinol., 114:1315-1320 (1984), i fluid fra store og små follikler til nyfødte ovarier (Necklaws, E. , et al., Endocrinol., 2:791-796 (1986), og i inkuberingsmedia til bovingranuloseceller (Vigler, B., et al., supra, (1984)). (1984)). This radioimmunoassay has detected MIS in the follicular fluid of mature bovine ovaries (Vigler, B., et al., Endocrinol., 114:1315-1320 (1984), in fluid from large and small follicles of newborn ovaries (Necklaws, E., et al. al., Endocrinol., 2:791-796 (1986), and in incubation media of bovine granulosa cells (Vigler, B., et al., supra, (1984)).
MIS er funnet å være cytotoksisk mot humanovariecancerceller in vitro (Donahoe, P.K., et al., Science, 205:913-915 MIS has been found to be cytotoxic against human ovarian cancer cells in vitro (Donahoe, P.K., et al., Science, 205:913-915
(1979)). De er også funnet å være effektive mot denne cancer in vivo (Donahoe, P.K., et al., US-PS 4 510 131). (1979)). They have also been found to be effective against this cancer in vivo (Donahoe, P.K., et al., US-PS 4,510,131).
Genet for MIS er klonet og eksprimert i vevkulturceller; både DNA- og aminosyresekvensene er kjent (Cate, R.L. , et al., Cell, 45:685-698 (1986)). The gene for MIS has been cloned and expressed in tissue culture cells; both the DNA and amino acid sequences are known (Cate, R.L., et al., Cell, 45:685-698 (1986)).
II. PattedyrembryologiII. Mammalian Embryology
Pattedyroocyttene går inn i den første meiotiske del under det fetale liv, men stanses i den sene profase (i dicytatet eller diffus diplotentrinnet i meiose) før eller akkurat etter fødsel (Beaumont, H.M., et al., Proe. R. Soc. London (Series Biological Sciences) 155:557-579 (1962)). Gjenopptak av meiose skjer vanligvis ikke inntil kort før ovulering når et behov for gonadotropiner fremmer gjenopptak av den meiotiske modning (Dekel, N. , et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:4369-4373 (1978)). Preovulart gjenopptak av meiose karakteriseres ved: (1) nedbrytning av strukturer kjent som germinale vesikler, GV; (2) ekspulsering av det første polare legemet; og (3) fremskriden til metafasen for den andre meiotiske del (Tsafriri, A., et al., J. Repro. Fertil., 64:541-551 (1982). Hos rotter faller MIS-produksjonsperioden til ovariet sammen med perioden for oocyttmeiotisk stans. De fysiologiske mekanismer som er ansvarlig for å holde oocytten i en tilstand av meiotisk stans er ukjent, men er ikke vesentlig for en forståelse av foreliggende oppfinnelse. Slike mekanismer antas å reguleres ved oppfinnelsens MIS. Det er imidlertid velkjent at visse gnager-, storfe- eller svin-oocytter dyrkes in vitro og deretter isoleres fra follikler, gjenopptar de meiosen spontant (Edwards, R.G., Nature, 196:446-450 (1962); Foote, W.D., et al., Anal. Biol. Animale Bloch. Biophys. (Paris), 9:329-349 (1969)=. The mammary thyrocytes enter the first meiotic division during fetal life, but are arrested in the late prophase (in the dicytate or diffuse diplotene stage of meiosis) before or just after birth (Beaumont, H.M., et al., Proe. R. Soc. London ( Series Biological Sciences) 155:557-579 (1962)). Resumption of meiosis usually does not occur until shortly before ovulation when a need for gonadotropins promotes resumption of meiotic maturation (Dekel, N., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:4369-4373 (1978)) . Preovular resumption of meiosis is characterized by: (1) breakdown of structures known as germinal vesicles, GV; (2) ejection of the first polar body; and (3) the progression to metaphase of the second meiotic division (Tsafriri, A., et al., J. Repro. Fertil., 64:541-551 (1982). In rats, the MIS production period of the ovary coincides with the period of oocyte meiotic arrest. The physiological mechanisms responsible for keeping the oocyte in a state of meiotic arrest are unknown, but are not essential for an understanding of the present invention. Such mechanisms are believed to be regulated by the MIS of the invention. However, it is well known that certain rodents , bovine or porcine oocytes are cultured in vitro and then isolated from follicles, they spontaneously resume meiosis (Edwards, R.G., Nature, 196:446-450 (1962); Foote, W.D., et al., Anal. Biol. Animale Bloch .Biophys.(Paris), 9:329-349 (1969)=.
III. Meiose- inhibitorerIII. Meiosis inhibitors
Tre forskjellige typer molekyler er angitt å være involvert i meiose-inhibering hos pattedyroocytter: (1) en lav-molekyl-vektsproteinfraksjon av follikulær fluid eller granulosaceller (kalt "oocyttmeiose-inhibitor" ), (2) steroider, og (3) cAMP og andre nukleotider (Downs, S.M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:454-458 (1985 ); McGaughey, R.W., Endocrinol., 100:39-45 (1977); Dekel, N., et al., Biol. Repro., 20:191-197 (1979); og Hubbard, C.J., et al., Biol. Repro., 26:628:632 (1982)). Oocyttmeiose-inhibitoren fremstilles av granulosaceller og er tilstede i mullerian-follikulærfluid. Partiell rensing av dette fluid har vist at oocyttmeiose-inhibitoren er et lite polypeptid med en molekylvekt på under 6 000, Sato. E. , et al., Differentiation, 26;59-62 (1984). Dette protein forhindrer det spontane gjenopptak av meiose i dyrkede kumuluscelle-innelukkede oocytter, men ikke i avkledde oocytter, Hillensjo, T. et al., Adv. Exper. Med. Biol., 147:175-188 Three different types of molecules have been suggested to be involved in meiosis inhibition in mammalian oocytes: (1) a low-molecular-weight protein fraction of follicular fluid or granulosa cells (termed "oocyte meiosis inhibitor"), (2) steroids, and (3) cAMP and other nucleotides (Downs, S.M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:454-458 (1985); McGaughey, R.W., Endocrinol., 100:39-45 (1977); Dekel, N. , et al., Biol. Repro., 20:191-197 (1979); and Hubbard, C.J., et al., Biol. Repro., 26:628:632 (1982)). The oocyte meiosis inhibitor is produced by granulosa cells and is present in mullerian follicular fluid. Partial purification of this fluid has shown that the oocyte meiosis inhibitor is a small polypeptide with a molecular weight of less than 6,000, Sato. E., et al., Differentiation, 26;59-62 (1984). This protein prevents the spontaneous resumption of meiosis in cultured cumulus cell-enclosed oocytes, but not in undressed oocytes, Hillensjo, T. et al., Adv. Exper. With. Biol., 147:175-188
(1982). Proteinets inhiberende virkning kan overvinnes ved luteiniseringshormonet, LH. De inhiberende virkninger kan også snus ved å fjerne faktoren fra dyrkningsmediet (Sato. E. et al., supra). (1982). The protein's inhibitory effect can be overcome by the luteinizing hormone, LH. The inhibitory effects can also be reversed by removing the factor from the culture medium (Sato. E. et al., supra).
Som en oppsummering beskriver således den kjente teknikk at MIS, et høy-molekylvektsglykoprotein, fremstilles av pattedyrtestes. MIS er i stand til å styre regresjonen av mulleriankanalen i et hannembryo under utvikling. I fravær av denne substans vil mulleriankanalen fortsette sin utvikling til det kvinnelige reproduktivsystem. Thus, as a summary, the prior art describes that MIS, a high molecular weight glycoprotein, is produced by mammalian testes. MIS is able to direct the regression of the Mullerian duct in a developing male embryo. In the absence of this substance, the Mullerian duct will continue its development into the female reproductive system.
Når det er dannet i embryon under utvikling, blir den etterfølgende utvikling av pattedyr occytter stanset i det sene profasetrinn av meiosen. Denne inhibering av utviklingen antas å være resultatet av interaksjoner mellom det kvinnelige reproduktivsystem og enten en lav-molekylvektsoocytt-meiose-inhibitor, steroider eller nukleotider slik som cAMP. Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at mullerian-inhiberingssubstansen er funnet å inhibere oocyttmeiose. Denne inhibering forhindrer dannelsen av mature oocytter og resulterer derfor i en infertilitetstilstand. Viktig er at denne inhibering er reversibel via administrering av forbindelser som epidermal vekstfaktor. Således angår foreliggende oppfinnelse anvendelsen av MIS som et kontraseptivt middel. Søkeren tror, men ønsker ikke å være bundet av denne teori, at kontraseptivevnen til MIS stammer fra MIS's evne til å interferere med oocyttmodningen. Once formed in the developing embryo, the subsequent development of mammalian oocytes is arrested in the late prophase stage of meiosis. This inhibition of development is believed to be the result of interactions between the female reproductive system and either a low molecular weight oocyte meiosis inhibitor, steroids or nucleotides such as cAMP. The present invention is based on the discovery that the mullerian inhibitory substance has been found to inhibit oocyte meiosis. This inhibition prevents the formation of mature oocytes and therefore results in a state of infertility. Importantly, this inhibition is reversible via the administration of compounds such as epidermal growth factor. Thus, the present invention relates to the use of MIS as a contraceptive. Applicant believes, but does not wish to be bound by this theory, that the contraceptive ability of MIS derives from MIS' ability to interfere with oocyte maturation.
I detalj, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et preparat egnet for bruk som et kontraseptivmiddel og som omfatter mullerian-inhiberingssubstans som er i det vesentlige fri for naturlige kontaminanter. In detail, the present invention provides a preparation suitable for use as a contraceptive and comprising mullerian inhibitory substance which is substantially free of natural contaminants.
I tillegg angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for kontrasepsjon som omfatter til en kvinne å tilveiebringe en effektiv mengde av det ovenfor angitte preparat. In addition, the invention relates to a method for contraception which comprises providing a woman with an effective amount of the above-mentioned preparation.
Oppfinnelsen er også rettet mot et preparat egnet for bruk som et fertilitetslnduserende middel som omfatter et antistoff i stand til binding til mullerian-inhiberingssubstansen hvorved antistoffet er i det vesentlige fritt for naturlige kontaminanter. The invention is also directed to a preparation suitable for use as a fertility-inducing agent comprising an antibody capable of binding to the mullerian inhibitory substance whereby the antibody is essentially free of natural contaminants.
Oppfinnelsen er videre rettet mot en fremgangsmåte for å indusere fertilitet hos kvinner og som omfatter å tilveiebringe hos kvinnen en effektiv mengde av det ovenfor angitte antistoffpreparat. The invention is further directed to a method for inducing fertility in women and which comprises providing the woman with an effective amount of the above-mentioned antibody preparation.
Oppfinnelsen er videre rettet mot en fremgangsmåte for å reversere den kontraseptive aktivitet av mullerian-inhiberingssubstans og som omfatter hos en kvinnelig mottager av mullerian-inhiberingssubstans å gi et middel I stand til å reversere kontraseptivaktiviteten i en mengde tilstrekkelig til å oppnå denne reversering. The invention is further directed to a method for reversing the contraceptive activity of mullerian inhibiting substance and which comprises in a female recipient of mullerian inhibiting substance providing an agent capable of reversing the contraceptive activity in an amount sufficient to achieve this reversal.
Oppfinnelsen tilveiebringe i tillegg en fremgangsmåte for å kontrollere fertiliteten hos en kvinne og denne omfatter: (a) å tilveiebringe en initialmengde mullerian-inhiberende substans i tilstrekkelig grad til å indusere en infertilitetstilstand hos kvinnen, (b) å opprettholde infertilitetstilstanden i en ønsket tidsperiode ved å tilveiebringe en ytterligere mengde The invention additionally provides a method for controlling fertility in a woman and this comprises: (a) providing an initial amount of mullerian-inhibiting substance sufficient to induce a state of infertility in the woman, (b) maintaining the state of infertility for a desired period of time by to provide a further quantity
mullerian-inhiberingssubstans, ogmullerian inhibitory substance, and
(c) hvis ønskelig, å tilveiebringe et middel i stand til å (c) if desired, to provide a means capable of
reversere den infertilitetstilstand som er indusert av mullerian-inhiberingssubstansen i en mengde tilstrekkelig til å Indusere en fertilitetstilstand. reversing the state of infertility induced by the mullerian inhibitory substance in an amount sufficient to induce a state of fertility.
Figur 1 er en tegning av en matur graf-follikkel som viser de relative posisjoner av immatur oocytt, kumulusceller og den germinale vesikkelstruktur. Figur 2 viser tidssekvensen for oocyttmodning, målt ved germinal vesikkelnedbrytning av avkledde rotteoocytter 1 nærvær av eller fravær av MIS. Figur 3 viser den midlere prosentandel germinal vesikkelnedbrytning som ble funnet å skje i nærvær eller fravær av MIS etter en inkuberingstid på 4-5 timer. Stjernene antyder at disse datas signifikans har en p-verdi på mindre enn 0,01. Figur 4 viser virkningen av varigheten av MIS-nærværet på prosentandelen oocytter som undergår germinal vesikkelnedbrytning. Reversibiliteten til MIS-aktiviteten er vist. Figurene 5A henholdsvis 5B viser virkningen av dibutyryl-cyklisk AMP og MIS på prosentandelen av avkledde oocytter eller kumulus celle-Innelukkede oocytter som undergår germinal vesikkelnedbrytning. Figur 6 viser virkningen av reproduktive hormoner på MIS-indusert inhibering av germinal vesikkelnedbrytning i avkledde og kumulus celle-innelukkede oocytter. Figur 7 viser virkningen av MIS på germinal vesikkelnedbrytning i avkledde og kumulus celle-innelukkede museoocytter. Figur 8 viser evnen til rekombinant human MIS-preparater til Figure 1 is a drawing of a mature graph follicle showing the relative positions of the immature oocyte, cumulus cells and the germinal vesicle structure. Figure 2 shows the time sequence of oocyte maturation, measured by germinal vesicle breakdown of stripped rat oocytes 1 in the presence or absence of MIS. Figure 3 shows the mean percentage of germinal vesicle degradation found to occur in the presence or absence of MIS after an incubation time of 4-5 hours. The asterisks indicate that the significance of these data has a p-value of less than 0.01. Figure 4 shows the effect of the duration of MIS presence on the percentage of oocytes undergoing germinal vesicle breakdown. The reversibility of the MIS activity is shown. Figures 5A and 5B respectively show the effect of dibutyryl-cyclic AMP and MIS on the percentage of undressed oocytes or cumulus cell-enclosed oocytes undergoing germinal vesicle breakdown. Figure 6 shows the effect of reproductive hormones on MIS-induced inhibition of germinal vesicle breakdown in undressed and cumulus cell-enclosed oocytes. Figure 7 shows the effect of MIS on germinal vesicle degradation in undressed and cumulus cell-enclosed mouse oocytes. Figure 8 shows the ability of recombinant human MIS preparations to
å inhibere nedbrytning av germinalveslkler.to inhibit the breakdown of germinal vesicles.
Figur 9 viser evnen til epidermal vekstfaktor til å reversere evnen til MIS til å Inhibere germinal vesikkelnedbrytning. Figure 9 shows the ability of epidermal growth factor to reverse the ability of MIS to inhibit germinal vesicle degradation.
Mullerian-inhiberende substans kan oppnås ved et antall forskjellige metoder. Substansen kan renses fra testikulaervev i henhold til Donahoe, P.K. , et al., (US-PS 4 510 131 og 4 404 188). Alternativt kan MIS renses fra testikulaervev ved bruk av immunoaffinitetskromatografi som beskrevet av Donahoe, P.K., et al., (US-PS 4 487 833). Materialet kan også oppnås ved hjelp av rekombinant DNA-teknikker (Cate, R.L., et al., Cell, 45:685-698 (1986)). Mullerian inhibitory substance can be obtained by a number of different methods. The substance can be purified from testicular tissue according to Donahoe, P.K. , et al., (US-PS 4,510,131 and 4,404,188). Alternatively, MIS can be purified from testicular tissue using immunoaffinity chromatography as described by Donahoe, P.K., et al., (US-PS 4,487,833). The material can also be obtained by recombinant DNA techniques (Cate, R.L., et al., Cell, 45:685-698 (1986)).
Uttrykket "mullerian-inhiberingssubstans! (også angitt som "MIS") er ment å inkludere forbindelser og stoffer som er strukturelt like MIS. Eksempler på slike inkluderer stoffer og materialer som salter, derivater og aglykone former av MIS. I tillegg er foreliggende oppfinnelse ment å inkludere mutante former av MIS som har i det vesentlige den samme biologiske aktivitet som MIS. Eksempler på slike mutante former er MIS-molekyler som har en utelatelse, et innskudd eller en endring i aminosyresekvensen. MIS kan oppnås fra enhver pattedyrkilde eller, som antydet ovenfor, fra ikke-pattedyrkllder via bruk av rekombinant DNA-teknologi, eller fra den kjemiske syntese av MIS-proteinet. The term "mullerian inhibitory substance! (also referred to as "MIS") is intended to include compounds and substances structurally similar to MIS. Examples of such include substances and materials such as salts, derivatives and aglycone forms of MIS. In addition, the present invention is intended to include mutant forms of MIS that have substantially the same biological activity as MIS. Examples of such mutant forms are MIS molecules that have a deletion, insertion, or change in the amino acid sequence. MIS can be obtained from any mammalian source or, as indicated above, from non-mammalian lineages via the use of recombinant DNA technology, or from the chemical synthesis of the MIS protein.
Uttrykket "peptidfragment" er ment å inkludere både synte-tisk og naturlig forekommende aminosyresekvenser som kan avledes fra den naturlig forekommende aminosyresekvens av The term "peptide fragment" is intended to include both synthetic and naturally occurring amino acid sequences that can be derived from the naturally occurring amino acid sequence of
MIS. MIS.
Et peptid sies å være "avledbart fra den naturlig forekommende aminosyresekvens av MIC" hvis den kan oppnås ved fragmentering av den naturlig forekommende valgte MIS-sekvens, eller hvis den kan syntetiseres basert på kunnskap om sekvensen til den naturlig forekommende aminosyresekvens eller det genetiske materialet (DNA eller RNA) som koder denne sekvens. A peptide is said to be "derivable from the naturally occurring amino acid sequence of the MIC" if it can be obtained by fragmentation of the naturally occurring selected MIS sequence, or if it can be synthesized based on knowledge of the sequence of the naturally occurring amino acid sequence or the genetic material ( DNA or RNA) that encodes this sequence.
Et materiale sies å være "i det vesentlige fritt for naturlige kontaminanter" hvis det i vesentlig grad er renset for materialer med hvilket det vanligvis og naturlig finnes men før rensing. Eksempler på naturlige kontaminanter med hvilke MIS kan forbindes er: andre peptider, karbohydrater, glykosylerte peptider, lipider, membran, osv. Et materiale sies også å være i det vesentlige fritt for naturlige kontaminanter hvis disse i det vesentlige er fraværende fra en prøve av materialet. A material is said to be "substantially free of natural contaminants" if it has been substantially cleaned of materials with which it usually and naturally exists but before cleaning. Examples of natural contaminants with which MIS can be associated are: other peptides, carbohydrates, glycosylated peptides, lipids, membrane, etc. A material is also said to be essentially free of natural contaminants if these are essentially absent from a sample of the material .
Et gen er sagt å være et "rekombinant" gen, hvis det stammer fra anvendelse av rekombinant DNA-teknikker. Eksempler på rekombinant DNA-teknikker er kloning, mutagenese, transfor-mering, osv. Rekombinant DNA-teknikker er beskrevet av Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982). A gene is said to be a "recombinant" gene, if it originates from the application of recombinant DNA techniques. Examples of recombinant DNA techniques are cloning, mutagenesis, transformation, etc. Recombinant DNA techniques are described by Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Oppfinnelsen angår videre polypeptlder som 1 tillegg til den valgte sekvens kan inneholde eller mangle en eller flere aminosyrer som Ikke behøver å være tilstede i den naturlig forekommende sekvens, der slike polypeptlder funksjonelt tilsvarer det valgte polypeptid. SLike polypeptlder kalles for oppfinnelsens formål "funksjonelle derivater", forutsatt at de viser aktivitet som i det vesentlige tilsvarer den til The invention further relates to polypeptides which, in addition to the selected sequence, may contain or lack one or more amino acids which need not be present in the naturally occurring sequence, where such polypeptides functionally correspond to the selected polypeptide. For the purposes of the invention, similar polypeptides are called "functional derivatives", provided that they show activity substantially equivalent to that of
MIS. MIS.
Inkludert innenfor oppfinnelsens ramme er de peptidfragmenter i MIS som er i stand til å virke som inhibitorer for oocyttmodning. Også inkludert er bruken av ytterligere aminosyrerester tilsatt for å forbedre koblingen til baererproteinet eller aminosyrerester som tilsettes for å øke den Inhiberende effekt. Som kjent 1 denne teknikk kan aminosyrerestene til MIS foreligge i beskyttet eller ikke-beskyttet form ved bruk av egnede amino- eller karboksyl-beskyttende grupper. MIS kan også foreligge i form av kationiske saltgrupper. Brukbare kationer er alkali- eller jordalkalimetallkationer, f.eks. Na, K, Li, tøCa, tøBa, etc, eller aminkationer slik som tetraalkylammonium, trialkyl-ammonium, der alkyl kan være C^-C^g'Included within the scope of the invention are those peptide fragments in MIS that are capable of acting as inhibitors of oocyte maturation. Also included is the use of additional amino acid residues added to improve binding to the carrier protein or amino acid residues added to increase the inhibitory effect. As known in the art, the amino acid residues of MIS can be in protected or unprotected form using suitable amino or carboxyl protecting groups. MIS can also exist in the form of cationic salt groups. Useful cations are alkali or alkaline earth metal cations, e.g. Na, K, Li, tøCa, tøBa, etc, or amine cations such as tetraalkylammonium, trialkylammonium, where alkyl can be C^-C^g'
MIS-preparatet kan foreligge i form av de frie aminer (på N-terminus), eller syreaddisjonssalter derav. Vanlige syreaddisjonssalter er hydrogenhalogensyresalter som HBr, HI eller helst HC1. The MIS preparation can be in the form of the free amines (at the N-terminus), or acid addition salts thereof. Common acid addition salts are hydrohalic acid salts such as HBr, HI or preferably HC1.
MIS-preparatene Ifølge oppfinnelsen kan formuleres i henhold til kjente metoder for fremstilling av farmasøytisk brukbare preparater, der MIS eller funksjonelle derivater derav kombineres i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Egnede bærere og disses formulering inkludert andre human-proteiner, f.eks. humanserumalbumln, er f.eks. beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences (16. utg. A. Oslo. utg. Mack, Easton PA (1980)). For å danne et farmasøytisk aksepterbart preparat egnet for effektiv administrering vil slike preparater inneholde en effektiv mengde MIS eller dettes funksjonelle derivat, sammen med en egnet mengde bærer. The MIS preparations according to the invention can be formulated according to known methods for the production of pharmaceutically usable preparations, where MIS or functional derivatives thereof are combined in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. Suitable carriers and their formulation including other human proteins, e.g. human serum albumin, is e.g. described in Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed. A. Oslo. ed. Mack, Easton PA (1980)). To form a pharmaceutically acceptable preparation suitable for effective administration, such preparations will contain an effective amount of MIS or its functional derivative, together with a suitable amount of carrier.
En "egnet mengde" MIS er en mengde som er tilstrekkelig til å oppnå kontrasepsjon i et ovulerende menneske eller dyr. I henhold til oppfinnelsen kan kontrasepsjon oppnås ved å interferere med den naturlige utvikling av stansede oocytter til mature oocytter. Den effektive mengde kan variere avhengig av kriterier som alder, vekt, fysikalsk tilstand, tidligere medisinsk historie samt resipientsensitivitet, men ligger fortrinnsvis mellom 10~<7>til IO"<2>M. An "appropriate amount" of MIS is an amount sufficient to achieve contraception in an ovulating human or animal. According to the invention, contraception can be achieved by interfering with the natural development of arrested oocytes into mature oocytes. The effective amount may vary depending on criteria such as age, weight, physical condition, previous medical history and recipient sensitivity, but is preferably between 10~<7> to 10"<2>M.
Fordi kontraseptivaktiviteten til MIS er reversibel, er det foretrukket kontinuerlig å tilveiebringe en effektiv mengde MIS til en resipient for å opprettholde en forlenget tilstand av indusert infertilitet. F.eks. kan månedlig eller to-månedlig administrering benyttes. Alternativt kan det benyttes preparater med langsom avgivelse av aktivt materiale. Faktorer som ville påvirke administreringsfrekvensen for MIS inkluderer de farmakokinetiske data ved opphold i ovariet, preparatpotensen, osv. Because the contraceptive activity of MIS is reversible, it is preferred to continuously provide an effective amount of MIS to a recipient to maintain a prolonged state of induced infertility. E.g. monthly or bi-monthly administration can be used. Alternatively, preparations with a slow release of active material can be used. Factors that would affect the frequency of administration of MIS include the pharmacokinetic data on residence in the ovary, the formulation potency, etc.
Preparater inneholdende MIS eller funksjonelle derivater kan administreres oralt, intravenøst, intramuskulært, subkutant eller lokalt. Preparations containing MIS or functional derivatives can be administered orally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously or locally.
For parenteral administrering beskrives det preparater inneholdende MIS i destillert vann, der pH-verdien er justert til ca. 6-8. For å lette lyof iliseringsprosessen som resulterer i et egnet produkt, kan laktose tilsettes til oppløsningen. Oppløsningen ble så flltersterillsert, fylt på ampuller og lyofllisert. Konsentrasjonen av MIS I disse preparater kan variere fra IO"<7>til IO-<2>M. For parenteral administration, preparations containing MIS in distilled water are described, where the pH value has been adjusted to approx. 6-8. To facilitate the lyophilization process resulting in a suitable product, lactose may be added to the solution. The solution was then filter sterilized, filled into ampoules and lyophilized. The concentration of MIS in these preparations can vary from IO"<7> to IO-<2>M.
Ytterligere farmasøytiske metoder kan benyttes for å kontrollere vlrkningsvarigheten. Preparater med kontrollert avgivelse kan oppnås ved bruk av polymerer for å kompleks-danne eller adsorbere MIS eller de funksjonelle derivater derav. Den kontrollerte avgivelse kan utøves ved valg av egnede makromolekyler Ø(f.eks. polyestere, polyaminosyrer, povinylpyrrolldon, etylenvinylacetat, metylcellulose, karboksymetylcellulose og protaminsulfat) og konsentrasjonen av makromolekylene så vel som metodene for Innarbeiding av disse for å styre avgivelsen. En annen mulig metode for å kontrollere varigheten av virkningen ved kontrollert avgivelse av et preparat er å innarbeide MIS i partikler av et polymermateriale slik som polyestere, polyamlnosyrer, hydrogeler, poly(melkesyre) eller etylenvinylacetat-kopolymerer. Alternativt og i stedet for å innarbeide MIS i disse polymerpartikler, er det mulig å fange inn MIS i mikrokapsler som f.eks. er fremstilt ved koaserverings-teknikker eller ved en grenseflatepolymerisering, f.eks. hydroksymetylcellulose eller gelatin-mikrokapsler og poly(metylmetakrylat)mikrokapsler, eller i kolloide medikamentavgivelsessystemer som f.eks. llposomer, albumin-mikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsjoner. Dette er beskrevet nærmere i Remington's Pharmaceutical Sciences, supra (1980). Additional pharmaceutical methods can be used to control the duration of exposure. Controlled release preparations can be obtained by using polymers to complex or adsorb MIS or its functional derivatives. The controlled release can be carried out by choosing suitable macromolecules Ø (e.g. polyesters, polyamino acids, povinylpyrroldone, ethylene vinyl acetate, methylcellulose, carboxymethylcellulose and protamine sulfate) and the concentration of the macromolecules as well as the methods for their incorporation to control the release. Another possible method to control the duration of the effect by controlled release of a preparation is to incorporate MIS into particles of a polymer material such as polyesters, polyamlinic acids, hydrogels, poly(lactic acid) or ethylene vinyl acetate copolymers. Alternatively and instead of incorporating MIS into these polymer particles, it is possible to capture MIS in microcapsules such as e.g. is produced by coaservation techniques or by an interfacial polymerization, e.g. hydroxymethyl cellulose or gelatin microcapsules and poly(methyl methacrylate) microcapsules, or in colloidal drug delivery systems such as e.g. Liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules or in macroemulsions. This is described in more detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, supra (1980).
Oppfinnelsens MIS kan administreres ved bruk av enten et "bolus"- eller et "forsinket avgivelse"-preparat. Uttrykket "bolus" er ment å henvise til enhver administreringsform som medfører å tilveiebringe MIS i diskrete og separerbare doser. Piller, tabletter, kapsler, Injeksjonsenheter, osv. utgjør alle eksempler på bolus-administrering. Når det gjelder forsinket avgivelse, henviser dette til enhver admini-strasjonsform som medfører tilveiebringelse av MIS på kontinuerlig måte i lang tid. Eksempel på dette er implan-tater, infusjonselementer, tidsavgivende innretninger, osv. The MIS of the invention can be administered using either a "bolus" or a "delayed release" formulation. The term "bolus" is intended to refer to any form of administration which involves providing MIS in discrete and separable doses. Pills, tablets, capsules, injection devices, etc. are all examples of bolus administration. When it comes to delayed submission, this refers to any form of administration that entails the provision of MIS continuously for a long time. Examples of this are implants, infusion elements, time-releasing devices, etc.
Oppfinnelsens MIS og de funksjonelle derivater derav, enten alene eller i farmakologisk aksepterbare preparater, er brukbare som kontraseptive midler i ovulerende mennesker eller dyr. Evnen til MIS til å gripe inn overfor normal oocyttmaturasjon antas, uten å være bundet av noen teori, å skyldes den konseptive effektivitet til MIS. The MIS of the invention and the functional derivatives thereof, either alone or in pharmacologically acceptable preparations, are usable as contraceptives in ovulating humans or animals. The ability of MIS to intervene against normal oocyte maturation is believed, without being bound by theory, to be due to the conceptive efficiency of MIS.
Et aspekt ved foreliggende oppfinnelse stammer fra den oppdagelse at den kontraseptive virkning til MIS (dvs. evnen til MIS til å inhibere oocyttmaturering) kan reverseres ved forbindelser slik som epldermal vekstfaktor, EGF. Både effektiviteten av den kontraseptive aktivitet til MIS og muligheten for reversering ved hjelp av forbindelser slik som EGF, øker med økende MIS-konsentrasjon. Epidermal vekstfaktor er et peptidhormon som stimulerer veksten og differen-sieringen av epidermalvev under embryogenese (Carpenter, G. , et al., Exper. Cell. Res. 164:1-10 (1986); Kris, R.M., et al., Blo-Technol. 3:135-140 (1985)). EGF kan renses fra naturlige kilder eller oppnås via anvendelse av rekombinant DNA-teknologl. Mengden EGF som er nødvendig for å reversere kontraseptlvvirkningene av MIS bestemmes generelt via en betraktning av de samme faktorer som de som ble tatt opp ved bestemmelse av doseringen og administreringsmåten for MIS. Den mengde EGF som er nødvendig for å reversere den kontraseptive virkning vil generelt variere fra ca. IO-<7>til ca. IO-<2>M. EGF kan oppnås fra Collaboratlve Research, Lexington, One aspect of the present invention stems from the discovery that the contraceptive effect of MIS (ie, the ability of MIS to inhibit oocyte maturation) can be reversed by compounds such as epidermal growth factor, EGF. Both the effectiveness of the contraceptive activity of MIS and the possibility of reversal using compounds such as EGF increase with increasing MIS concentration. Epidermal growth factor is a peptide hormone that stimulates the growth and differentiation of epidermal tissue during embryogenesis (Carpenter, G., et al., Exper. Cell. Res. 164:1-10 (1986); Kris, R.M., et al., Blo -Technol. 3:135-140 (1985)). EGF can be purified from natural sources or obtained via the use of recombinant DNA technology. The amount of EGF necessary to reverse the contraceptive effects of MIS is generally determined via consideration of the same factors as those considered in determining the dosage and mode of administration of MIS. The amount of EGF required to reverse the contraceptive effect will generally vary from approx. IO-<7> to approx. IO-<2>M. EGF can be obtained from Collaboratlve Research, Lexington,
MA. MA.
Slik det ville være klart for fagmannen, er den foregående diskusjon når det gjelder farmasøytiske preparater også anvendbar på formulering av farmasøytisk egnede formuleringer av epidermal vekstfaktor eller anti-MIS-antisera. As would be apparent to those skilled in the art, the foregoing discussion regarding pharmaceutical preparations is also applicable to the formulation of pharmaceutically suitable formulations of epidermal growth factor or anti-MIS antisera.
Anti-MIS-antisera eller monoklonalt antlstofff kan benyttes for å fremme fertilitet hos hunnpasienter hvis infertiliteten er forårsaket av abnormt høy produksjon av MIS. Antistoffet kan administreres lokalt eller på enhver annen egnet måte. Doseringsområdene er fra 10~<7>til IO"<2>M. Anti-MIS antisera or monoclonal antibody can be used to promote fertility in female patients if the infertility is caused by abnormally high production of MIS. The antibody may be administered locally or by any other suitable means. The dosage ranges are from 10~<7> to IO"<2>M.
Etter at oppfinnelsen nå er beskrevet generelt, vil den forstås bedre under henvisning til visse spesifikke eksempler som her Innarbeides for å illustreres, uten å virke begrens-ende, på oppfinnelsen. After the invention has now been described in general, it will be better understood with reference to certain specific examples which are incorporated here to illustrate, without being limiting, the invention.
EKSEMPEL 1EXAMPLE 1
Rensing av mullerlan- lnhiberende substans Purification of mullerlan-lnhibiting substance
Mulllerian-inhiberende substans ble renset i henhold til Budzik, G.P., et al., Cell, 21:909-915 (1980) og Budzik, G.P., et al., Cell, 34:307-314 (1983). Kort sagt ble testikler fra kalver på under to uker oppmalt til 1 mm fragmenter i iset, serumfritt Ham's F10 medium (Budzik, G.P., et al., (1980), supra) og deretter inkubert ved 37° C i 45 minutter under mild omrøring. Mediet ble konsentrert ved ammoniumsulfatutfelling, reekvilibrert 250 mM NaCl, 10 mM natriumfosfat, 0,03$ natriumazid, 1 mM EDTA, pH 8, og så tilført til en dietylaminoetyl bio-gel-A-kolonne. Det ble funnet høy biologisk aktivitet i den ikke-bundne fraksjon. Denne fraksjon ble så justert til pH 5 ved forbruk av fortynnet HC1, sentrifugert ved 40 000 x g i 10 minutter for å fjerne presipitatet, og supernatanten ble så ført gjennom en karboksymetyl bio-gel-A-kolonne som var forekvilibrert med 50 mM NaCl, 10 mM natriumfosfat, 0,03$ natriumazid, 1 mM EDTA, pH 6. Den ikke-bundne fraksjon som igjen viste høy biologisk aktivitet, ble konsentrert 3 ganger på et "Amicon PM-30"-ultrafilter og direkte fylt på en hvetespirelektin (WGL)-sefarose-6MB-kolonne (Budzik, G.P., et al., (1980), supra) som var ekvilibrert med 10 mM HEPES (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0,01$ Nonidet P-40 (NP-40). Etter en buffervasking ble den biologisk aktive fraksjon eluert med 100 mg/ml N-acetylglukosamin og uten ytterligere ekvilibrering fylt på en affinitetskolonne inneholdende Matrex Gel Green A® (AMICON) (Budzik, G.P., et al., (1983), supra) som på forhånd var ekvilibrert i 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM 2-merkaptoetanool, 0,01$ NP-40, pH 8,0. Etter eluering med denne buffer alene og med 10 mM ATP, ble den bundne fraksjon inneholdende MIS biologisk aktivitet eluert med fylling av buffer inneholdende 500 mM NaCl. Denne siste fraksjon ble konsentrert 80 ganger ved vakuumdialyse mot fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,01* NP-40, og lagret 1 1 ml aliqouter ved -80°C for etterfølgende bruk. Hver ampulle inneholdt 0,15 mg protein pr. ml 1 PBS (pH 7) og 0,01* NP-40. Fortynninger av dette materialet ble gjennomført ved bruk av Krebs-Ringer's bikarbonat (KRB) (Donahoe, R.P., J. Exper. Zool. 169:237-250. Mullerian inhibitory substance was purified according to Budzik, G.P., et al., Cell, 21:909-915 (1980) and Budzik, G.P., et al., Cell, 34:307-314 (1983). Briefly, testes from calves less than two weeks of age were minced into 1 mm fragments in ice-cold, serum-free Ham's F10 medium (Budzik, G.P., et al., (1980), supra) and then incubated at 37°C for 45 minutes with gentle agitation . The medium was concentrated by ammonium sulfate precipitation, reequilibrated 250 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, 0.03% sodium azide, 1 mM EDTA, pH 8, and then fed to a diethylaminoethyl bio-gel-A column. High biological activity was found in the unbound fraction. This fraction was then adjusted to pH 5 using dilute HCl, centrifuged at 40,000 x g for 10 min to remove the precipitate, and the supernatant was then passed through a carboxymethyl bio-gel-A column pre-equilibrated with 50 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, 0.03$ sodium azide, 1 mM EDTA, pH 6. The unbound fraction, which again showed high biological activity, was concentrated 3 times on an "Amicon PM-30" ultrafilter and directly loaded onto a wheat germ lectin (WGL )-sepharose-6MB column (Budzik, G.P., et al., (1980), supra) which was equilibrated with 10 mM HEPES (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0, 01$ Nonidet P-40 (NP-40). After a buffer wash, the biologically active fraction was eluted with 100 mg/ml N-acetylglucosamine and, without further equilibration, loaded onto an affinity column containing Matrex Gel Green A® (AMICON) (Budzik, G.P., et al., (1983), supra) as was previously equilibrated in 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoethanol, 0.01$ NP-40, pH 8.0. After elution with this buffer alone and with 10 mM ATP, the bound fraction containing MIS biological activity was eluted with filling buffer containing 500 mM NaCl. This last fraction was concentrated 80 times by vacuum dialysis against phosphate buffered saline containing 0.01* NP-40, and stored 1 1 ml aliquots at -80°C for subsequent use. Each ampoule contained 0.15 mg of protein per ml 1 PBS (pH 7) and 0.01* NP-40. Dilutions of this material were carried out using Krebs-Ringer's bicarbonate (KRB) (Donahoe, R.P., J. Exper. Zool. 169:237-250.
(1968)) oppløsning for å oppnå MIS-konsentrasjoner på 1,5 x IO-2 til 1,5 x IO-<9>mg/ml. (1968)) solution to achieve MIS concentrations of 1.5 x IO-2 to 1.5 x IO-<9>mg/ml.
EKSEMPEL 2EXAMPLE 2
Analyse på oocytt- matureringsinhiberende aktivitetAnalysis of oocyte maturation inhibitory activity
Ovarier av prepubertale Sprague-Dawley-rotter i en alder av 25-27 dager (omtrentlig kroppsvekt 50-60 g) eller sveitsiske mus med en kroppsvekt på ca. 15-20 g ble dissektert umiddelbart etter avlivning og anbragt i KRB-oppløsningen som beskrevet i eksempel 1. Vevet ble holdt på en varmeplate ved 35°C. Oocyttene ble visualisert under et mikroskop og kumulus-innelukkede oocytter ble befridd fra folliklene ved terging med en steril nål. I enkelte tilfeller ble adherende kumulus-oofore celler strippet fra oocyttene ved hurtig trekking av aggregerte celler inn og ut av en pipette for å oppnå en avkledd oocytt. Helt utvokste oocytter inneholdende en intakt germinal vesikkel med og uten kumulus-celler ble benyttet i løpet av 3 minutter etter isoleringen. Premature og små oocytter ble kassert. 10-20 oocytter ble pipettert inn i 0,2 ml media under lett paraffinolje og dyrket i en inkubator i 1 til 24 timer umiddelbart etter gjenvinning ved 37°C. Oocyttene ble kontinuerlig spylt med 95* luft og 5* C02mettet med vann. Figur 1 viser en diagramatisk representasjon av en oocytt under utvikling. Ovaries of prepubertal Sprague-Dawley rats at the age of 25-27 days (approximate body weight 50-60 g) or Swiss mice with a body weight of approx. 15-20 g were dissected immediately after killing and placed in the KRB solution as described in example 1. The tissue was kept on a hot plate at 35°C. The oocytes were visualized under a microscope and cumulus-enclosed oocytes were freed from the follicles by aspiration with a sterile needle. In some cases, adherent cumulus-oophoric cells were stripped from the oocytes by rapid pulling of aggregated cells in and out of a pipette to obtain a stripped oocyte. Fully grown oocytes containing an intact germinal vesicle with and without cumulus cells were used within 3 minutes of isolation. Premature and small oocytes were discarded. 10-20 oocytes were pipetted into 0.2 ml of media under light paraffin oil and cultured in an incubator for 1 to 24 hours immediately after recovery at 37°C. The oocytes were continuously flushed with 95% air and 5% CO 2 saturated with water. Figure 1 shows a diagrammatic representation of a developing oocyte.
På hvert valgte tidspunkt ble oocyttene bedømt somm immature (intakt germinal vesikkel med nukleus) eller som mature (hvis ingen germinal vesikkel kunne detekteres). At each selected time point, the oocytes were judged as immature (intact germinal vesicle with nucleus) or as mature (if no germinal vesicle could be detected).
Prosentandelen oocytter i de to kategorier ble beregnet for hver eksperimentelle behandling. For å prøve forskjellene mellom grupper av statistisk signifikans ble Chi-kvadrat-prøven benyttet. En p-verdi på under 0,01 ble ansett som signifikant. The percentage of oocytes in the two categories was calculated for each experimental treatment. To test the differences between groups for statistical significance, the Chi-square test was used. A p-value of less than 0.01 was considered significant.
EKSEMPEL 3EXAMPLE 3
Bestemmelse av tldssekvensen for oocyttmatureringDetermination of the tlds sequence for oocyte maturation
MIS ble fremstilt som beskrevet i eksempel 1. Virkningen av MIS på tldssekvensen for oocyttmaturering ble bestemt via bruken av analyse på oocyttmatureringsinhiberende virkning som beskrevet i eksempel 2. Således ble avkledde rotteoocytter inkubert med KRB-medium alene eller med tilsatt MIS, og tidsforløpet og graden av germinal vesikkelnedbrytning ble bestemt. Prosentandelen spontan germinal vesikkelnedbrytning for oocyttene ble beregnet ved inkrementale inkuberingstider. Etter 5 timers inkubering og kontrollmedium opptrådte spontan germinal vesikkelnedbrytning i mer enn 80* av avkledde oocytter, noe som Indikerer at en vesentlig andel av oocyttene undergikk maturering. En vesentlig og doseavhengig inhibering av spontan germinal vesikkelnedbrytning ble observert i oocyttpreparater som var inkubert i nærværet av MIS-inneholdende fraksjoner ved konsentrasjoner på 1,5 x 10~<7>til 10~<2>mg protein/ml. Resultatene av dette forsøk er vist i figur 2. Dette forsøk viser at MIS er en potent Inhibitor for oocyttmaturering. Som vist i figur 3 forårsaket tilsetning av MIS-holdig ved disse konsentrasjoner, men ikke IO-<9>eller 10~<8>mg proteln/ml, betydelig og økende inhibering av germinal vesikkelnedbrytning av både avkledde og kumulus-celleomsluttede rotteoocytter. Ved ekvimolare konsentrasjoner var det ingen signifikant forskjell 1 MIS-indusert inhibering av germinal vesikkelnedbrytning mellom avkledde eller kumulus-celle-omsluttede oocytter. Den Inhiberende effekt av MIS på oocyttmatureringen ble derfor funnet å være doseavhengig og kumulus-celle-uavhengig. MIS was prepared as described in Example 1. The effect of MIS on the tlds sequence of oocyte maturation was determined via the use of the oocyte maturation inhibitory effect assay as described in Example 2. Thus, stripped rat oocytes were incubated with KRB medium alone or with added MIS, and the time course and degree of germinal vesicle degradation was determined. The percentage of spontaneous germinal vesicle breakdown for the oocytes was calculated by incremental incubation times. After 5 hours of incubation and control medium, spontaneous germinal vesicle breakdown occurred in more than 80* of stripped oocytes, indicating that a substantial proportion of the oocytes underwent maturation. A significant and dose-dependent inhibition of spontaneous germinal vesicle breakdown was observed in oocyte preparations incubated in the presence of MIS-containing fractions at concentrations of 1.5 x 10~<7> to 10~<2>mg protein/ml. The results of this experiment are shown in Figure 2. This experiment shows that MIS is a potent inhibitor of oocyte maturation. As shown in Figure 3, addition of MIS-containing at these concentrations, but not 10-<9> or 10~<8>mg protein/ml, caused significant and increasing inhibition of germinal vesicle breakdown of both undressed and cumulus cell-enclosed rat oocytes. At equimolar concentrations, there was no significant difference 1 MIS-induced inhibition of germinal vesicle breakdown between undressed or cumulus-cell-enclosed oocytes. The inhibitory effect of MIS on oocyte maturation was therefore found to be dose-dependent and cumulus cell-independent.
EKSEMPEL 4EXAMPLE 4
Reversibilitet av MIS- lnhiberingenReversibility of the MIS inhibition
For å bestemme hvorvidt MIS-inhiberingen av oocyttmaturering var reversibel, ble et tidsforløp for oocyttmaturering satt opp. Således ble i timeintervaller, avkledde rotteoocytter, fremstilt som i eksempel 2, undersøkt med henblikk på tegn på maturering enten i nærvær eller i fravær av MIS. Resultatene av disse forsøk er vist 1 figur 4. Ved en time ble 10* avkledde rotteoocytter funnet å ha undergått spontant germinal vesikkelnedbrytning i kontrollerte media. Denne nedbrytning ble funnet å øke i progressive inkrementer inntil, ved 5 timer, 81* av oocyttene som opprinnelig var tilstede hadde undergått germinal vesikkelnedbrytning. Nærværet av 1,5 x IO-<3>mg protein/ml MIS totalt, forhindret opptreden av germinal vesikkelnedbrytning ved 1 time og redusert germinal vesikkelnedbrytning ved omtrent 50* (dvs. 43* av oocyttene hadde undergått germinal vesikkelnedbrytning etter 5 timer). To determine whether the MIS inhibition of oocyte maturation was reversible, a time course of oocyte maturation was set up. Thus, at hourly intervals, stripped rat oocytes, prepared as in Example 2, were examined for signs of maturation either in the presence or in the absence of MIS. The results of these experiments are shown in Figure 4. At one hour, 10* stripped rat oocytes were found to have undergone spontaneous germinal vesicle breakdown in controlled media. This degradation was found to increase in progressive increments until, at 5 hours, 81* of the oocytes initially present had undergone germinal vesicle degradation. The presence of 1.5 x 10-<3>mg protein/ml MIS in total prevented the occurrence of germinal vesicle breakdown at 1 hour and reduced germinal vesicle breakdown by approximately 50* (ie 43* of the oocytes had undergone germinal vesicle breakdown at 5 hours).
Etter 2 timer MIS inkubering ble en del av oocyttprøven vasket tre ganger i KRB-oppløsnlng og overført til en frisk KRB-oppløsning. 74* oocytter som var behandlet på denne måte viste germinal vesikkelnedbrytning etter 5 timer, noe som antyder at MIS-virkningen på avkledde oocytter var reversibel . After 2 hours MIS incubation, part of the oocyte sample was washed three times in KRB solution and transferred to a fresh KRB solution. 74* oocytes treated in this way showed germinal vesicle breakdown after 5 hours, suggesting that the MIS effect on undressed oocytes was reversible.
Dette forsøk antyder videre at den kontraseptive effektivitet for MIS er avhengig av det kontinuerlige nærvær av en effektiv mengde MIS. This experiment further suggests that the contraceptive efficacy of MIS is dependent on the continuous presence of an effective amount of MIS.
EKSEMPEL 5EXAMPLE 5
Virkning av dibutyrvl- cyklisk AMP på MIS- inhibering Rotteoocytter ble dyrket 1 5 timer i kontrollert medium alene eller med 1,5 x 10"<3>mg protein/ml MIS. Dibutyryl-cyklisk AMP (dbcAMP) i konsentrasjoner på 50, 100 eller 150 x 10~<6>mM ble inkubert enten alene eller med 1,5 x IO-<3>mg proteln/ml MIS. Tilsetning av 50 x IO"<6>M dbcAMP i KRB-oppløsning endret ikke signifikant prosentandelen oocytter som underglkk germinal vesikkelnedbrytning, heller Ikke var det noen påvirkning av den inhiberende virkning av MIS (ved en konsentrasjon på 1,5 x 10~<3>mg protein/ml). Tilsetning av 100 x IO-<6>M og 150 x IO<6>M dbcAMP i KRB-oppløsning inhiberte signifikant den spontane germinale vesikkelnedbrytning, men forbedret ikke den inhiberende virkning på 1,5 x IO"<3>mg protein/ml MIS. Disse forsøk ble gjennomført både på avkledde og kumulus-celle-innesluttede oocytter. Resultatene av disse forsøk er vist i figur 5A (avkledde oocytter) og 5B (kumulus-celle-innelukkede oocytter). Effect of dibutyryl-cyclic AMP on MIS inhibition Rat oocytes were cultured for 15 hours in controlled medium alone or with 1.5 x 10"<3>mg protein/ml MIS. Dibutyryl-cyclic AMP (dbcAMP) at concentrations of 50, 100 or 150 x 10~<6>mM were incubated either alone or with 1.5 x IO-<3>mg proteinn/ml MIS. Addition of 50 x IO"<6>M dbcAMP in KRB solution did not significantly change the percentage of oocytes which underwent germinal vesicle breakdown, nor was there any influence of the inhibitory action of MIS (at a concentration of 1.5 x 10~<3>mg protein/ml). Addition of 100 x 10-<6>M and 150 x 10<6>M dbcAMP in KRB solution significantly inhibited the spontaneous germinal vesicle breakdown, but did not enhance the inhibitory effect of 1.5 x 10"<3>mg protein/ml MIS These experiments were performed on both undressed and cumulus-cell-enclosed oocytes.The results of these experiments are shown in Figure 5A (undressed oocytes) and 5B (cumulus-cell-enclosed oocytes).
Dette forsøk viser at MIS ikke virker synergistisk eller antagonistisk med dbcAMP for å inhibere oocyttmaturering. Forsøket viser videre at den MIS-inhiberende virkning var kumulus-celle-uavhengig og cAMP-uavhengig. This experiment shows that MIS does not act synergistically or antagonistically with dbcAMP to inhibit oocyte maturation. The experiment further shows that the MIS-inhibitory effect was cumulus cell-independent and cAMP-independent.
EKSEMPEL 6EXAMPLE 6
Virkning av andre reproduktive hormoner på MIS- indusert inhibering av oocyttmaturering. Effect of other reproductive hormones on MIS-induced inhibition of oocyte maturation.
Virkningen av reproduktive hormoner slik som follikkel-stimulerende hormon, FSH, lutelnlserende hormon, LH, progesteron, 17p<->estradiol og testosteron på MIS-indusert inhibering ble bestemt ved bruk av avkledde eller kumulus-celle-innesluttede rotteoocytter. For å gjennomføre denne bestemmelse ble analysen på oocyttmatureringsinhiberende aktivitet, beskrevet i eksempel 2, gjennomført ved bruk av avkledde og kumulus-celle-innesluttede rotteoocytter. MIS-konsentrasjonen var 1,5 x IO-<3>mg protein/ml. MIS-indusert inhibering ble bedømt ved varierende hormonkonsentrasjoner (0,1, 1,0 og 10 jjg/ml FSH; 0,4, 4,0 og 40 >Jg/ml LH; 0,1, 1,0 og 10 jjg/ml progesteron; 0,1, 1,0 og 10 jjg/ml 17e-estradlol; og 0,1, 1,0 og 10 jjg/ml testosteron). Som vist i figur 6, kunne disse hormoner ikke bevirke MIS-indusert inhibering hos hverken avkledde eller kumulus-celle-innesluttede oocytter. Disse resultater viser at MIS-indusert inhibering av oocyttmaturering er uavhengig av nærværet eller fraværet av andre reproduktive hormoner. The effect of reproductive hormones such as follicle-stimulating hormone, FSH, luteinizing hormone, LH, progesterone, 17β<->estradiol and testosterone on MIS-induced inhibition was determined using stripped or cumulus cell-enclosed rat oocytes. To carry out this determination, the assay for oocyte maturation inhibitory activity, described in Example 2, was carried out using stripped and cumulus cell-enclosed rat oocytes. The MIS concentration was 1.5 x 10-<3>mg protein/ml. MIS-induced inhibition was assessed at varying hormone concentrations (0.1, 1.0 and 10 µg/ml FSH; 0.4, 4.0 and 40 µg/ml LH; 0.1, 1.0 and 10 µg/ml ml progesterone; 0.1, 1.0 and 10 µg/ml 17e-estradlol; and 0.1, 1.0 and 10 µg/ml testosterone). As shown in Figure 6, these hormones failed to cause MIS-induced inhibition in either undressed or cumulus cell-enclosed oocytes. These results show that MIS-induced inhibition of oocyte maturation is independent of the presence or absence of other reproductive hormones.
EKSEMPEL 7EXAMPLE 7
Virkning av lsobutylmetylxantin på MIS- indusert inhibering av oocyttmaturering Effect of isobutylmethylxanthine on MIS-induced inhibition of oocyte maturation
Avkledde og kumulus-celle-innesluttede museoocytter ble dyrket i 3 timer i kontrollmedia alene eller med 1,5 x IO"<2>, IO-<4>, IO-<6>eller IO-<8>mg proteln/ml MIS, eller IO"<4>M lsobutylmetylxantin (IBMX). Som vist 1 figur 7 forårsaket tilsetning av IBMX signifikant inhibering av spontan germinal vesikkelnedbrytning både i avkledde og kumulus-celle-innesluttede oocytter. MIS ble funnet å være ute av stand til å Inhibere spontan germinal vesikkelnedbrytning, noe som indikerer at bovin-MIS ikke har den inhiberende virkning på museoocytt-meiose som tidligere er observert for rotteoocytter . Stripped and cumulus cell-enclosed mouse oocytes were cultured for 3 h in control media alone or with 1.5 x IO"<2>, IO-<4>, IO-<6>, or IO-<8>mg protein/ml MIS , or 10"<4>M isobutylmethylxanthine (IBMX). As shown in Figure 7, addition of IBMX caused significant inhibition of spontaneous germinal vesicle breakdown in both undressed and cumulus cell-enclosed oocytes. MIS was found to be unable to inhibit spontaneous germinal vesicle breakdown, indicating that bovine MIS does not have the inhibitory effect on mouse oocyte meiosis previously observed for rat oocytes.
EKSEMPEL 8EXAMPLE 8
Virkning av anti- MIS- antisera på MIS- inhlberingEffect of anti-MIS antisera on MIS incorporation
Monoklonale antistoffer 1 stand til å binde til renset MIS ble fremstilt i henhold til metoden ifølge Shima, H., et al., (Hybridoma, 3:201-214 (1984)). Etter en første avsøking av hybridomcellene med henblikk på deres evne til å produsere MIS-spesifikke antistoffer, ble positive hybridomer ytterligere selektert med henblikk på evnen til å inhibere MIS-biologisk aktivitet. Fordi MIS er en inhibitor av oocyttmaturering, er administreringen av anti-MIS-antisera (i stand til å inhibere den biologiske aktivitet til MIS) i stand til å blokkere og derved å reversere MIS-lnhibering. Hvis hunninfertilitet forårsakes av en abnorm produksjon av MIS, vil administreringen av et anti-MIS-antistoff, slik som det som er beskrevet ovenfor, gi gjenopprettet fertilitet. Monoclonal antibodies capable of binding to purified MIS were prepared according to the method of Shima, H., et al., (Hybridoma, 3:201-214 (1984)). After an initial screening of the hybridoma cells for their ability to produce MIS-specific antibodies, positive hybridomas were further selected for their ability to inhibit MIS biological activity. Because MIS is an inhibitor of oocyte maturation, the administration of anti-MIS antisera (capable of inhibiting the biological activity of MIS) is able to block and thereby reverse MIS inhibition. If female infertility is caused by an abnormal production of MIS, the administration of an anti-MIS antibody, such as that described above, will restore fertility.
EKSEMPEL 9EXAMPLE 9
Evnen for rekombinant human MIS- preparater til å inhibere germinal vesikkelnedbrytning The ability of recombinant human MIS preparations to inhibit germinal vesicle degradation
Oocytt germinal vesikkelnedbrytningsanalysen ifølge eksempel 2 ble benyttet for å prøve evnen til rekombinant human-MIS-preparater til å inhibere oocyttmaturering. Rekombinant human-MIS ble fremstilt ved transfeksjon av MIS-genet (Cate, R.L., et al., Cell, 45:685-698 (1986)) til ovarieceller fra kinesisk hamster, CHO-celler, og dyrking av disse celler i et serumfritt medium (tilpasset mediet i henhold til Cate, R.L., et al., (1986)). Dette MIS ble så renset ved ionebytting og lektin-affinitetskromatografi (Budzik, G.P., et al., Cell, 21:909-921 (1980)) for derved å oppnå et MIS-preparat Inneholdende eventuelt mellom 1 og 10* MIS, mest sannsynlig ca. 1* MIS. Resultatene av denne oocyttanalyse er vist i figur 8. Slik det fremgår av figuren, ble ingen av de ikke-ioniske detergenter NP-40, fortynnet IO-<7>ganger) eller Krebs-ringer-buffer, KRB, funnet å inhibere germinal vesikkelnedbrytning. Serumfritt rekombinant human-MIS ble funnet signifikant å inhibere germinal vesikkelnedbrytning ved fortynning til IO-<2>til 10~<1>ganger. The oocyte germinal vesicle degradation assay of Example 2 was used to test the ability of recombinant human MIS preparations to inhibit oocyte maturation. Recombinant human MIS was produced by transfection of the MIS gene (Cate, R.L., et al., Cell, 45:685-698 (1986)) into Chinese hamster ovary cells, CHO cells, and culturing these cells in a serum-free medium (adapted to the medium according to Cate, R.L., et al., (1986)). This MIS was then purified by ion exchange and lectin affinity chromatography (Budzik, G.P., et al., Cell, 21:909-921 (1980)) to thereby obtain an MIS preparation containing possibly between 1 and 10* MIS, most likely about. 1* MIS. The results of this oocyte analysis are shown in Figure 8. As can be seen from the figure, none of the nonionic detergents NP-40, diluted 10-fold) or Krebs-ringer buffer, KRB, were found to inhibit germinal vesicle breakdown . Serum-free recombinant human MIS was found to significantly inhibit germinal vesicle degradation at 10-<2> to 10~<1>fold dilution.
Evnen til human rekombinant MIS til å inhibere germinal vesikkelnedbrytning ble funnet å kreve nærværet av en ikke-ioniske detergent, fortrinnsvis NP-40, ved fortynning IO"<6>til 10~<8>ganger, helst ca. 10~7 ganger. The ability of human recombinant MIS to inhibit germinal vesicle degradation was found to require the presence of a nonionic detergent, preferably NP-40, at dilutions 10"<6>to 10~<8>fold, preferably about 10~7 fold.
EKSEMPEL 10EXAMPLE 10
Evnen til EGF til å reversere evnen til MIS til å Inhibere oocyttmaturering The ability of EGF to reverse the ability of MIS to inhibit oocyte maturation
Oocytt germinal vesikkelnedbrytningsanalysen ifølge eksempel 2, ble benyttet for å prøve evnen til EGF til å reversere den kontraseptive aktivitet til MIS. Rekombinant, human MIS, fremstilt i henhold til eksempel 9, ble renset ved bruk av fargestoff-affinitetskromatografi (Budzik, G.P., et al., Cell, 34:307-314 (1983)). Dette EGF ble oppnådd fra Collaborative Research, Lexington, MA. The oocyte germinal vesicle breakdown assay of Example 2 was used to test the ability of EGF to reverse the contraceptive activity of MIS. Recombinant human MIS prepared according to Example 9 was purified using dye affinity chromatography (Budzik, G.P., et al., Cell, 34:307-314 (1983)). This EGF was obtained from Collaborative Research, Lexington, MA.
Resultatene fra dette forsøk er vist i figur 9. Figuren viser at tilsetning av KRB eller EGF til germinal vesikler ikke var i stand til å Inhibere nedbrytning av germinal vesiklene (stolpene 1 og 2). Tilsetning av MIS, renset enten ved bruk av DEAE/grønn 3 eller fase 0 ionebytting/grønn 3 kromatografi The results from this experiment are shown in figure 9. The figure shows that addition of KRB or EGF to germinal vesicles was not able to inhibit degradation of the germinal vesicles (columns 1 and 2). Addition of MIS, purified using either DEAE/green 3 or phase 0 ion exchange/green 3 chromatography
(stolpene 3 henholdsvis 5) ble funnet å inhibere germinal vesikkelnedbrytning. Tilsetningen av EGF til en prøve inneholdende MIS resulterte i en reversering av inhiberingen og en nedbrytning av germinal vesiklene (stolpene 4 henholdsvis 6). Således viser dette eksempel at den kontraseptive virkning av MIS kan reverseres med EGF. (bars 3 and 5 respectively) were found to inhibit germinal vesicle degradation. The addition of EGF to a sample containing MIS resulted in a reversal of the inhibition and a degradation of the germinal vesicles (bars 4 and 6 respectively). Thus, this example shows that the contraceptive effect of MIS can be reversed with EGF.
Mens oppfinnelsen er beskrevet i forbindelse med spesielle utførelsesformer skal det være klart at det kan gjennomføres ytterligere modifikasjoner og at søknaden er ment å dekke enhver variant, anvendelse eller tilpasning av oppfinnelsen ved generelt å følge oppfinnelsens prinsipper og inkludere slike mindre avvik i beskrivelsen som ligger innenfor vanlig kjent praksis i denne teknikk oppfinnelsen angår, og som kan anvendes på de vesentlige trekk som angitt i de ledsagende krav. While the invention is described in connection with particular embodiments, it should be clear that further modifications can be carried out and that the application is intended to cover any variant, application or adaptation of the invention by generally following the principles of the invention and including such minor deviations in the description as are within commonly known practice in this technique to which the invention relates, and which can be applied to the essential features as stated in the accompanying claims.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/877,735 US4753794A (en) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Use of mullerian inhibiting substance as a contraceptive agent |
| PCT/US1987/001514 WO1988000054A1 (en) | 1986-06-24 | 1987-06-24 | Use of mullerian inhibiting substance as a contraceptive agent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO880794D0 NO880794D0 (en) | 1988-02-23 |
| NO880794L true NO880794L (en) | 1988-04-05 |
Family
ID=26775947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO880794A NO880794L (en) | 1986-06-24 | 1988-02-23 | USE OF MULLERIAN INHIBITIVE SUBSTANCE AS A CONTRACTIVE AGENT. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO880794L (en) |
-
1988
- 1988-02-23 NO NO880794A patent/NO880794L/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO880794D0 (en) | 1988-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4753794A (en) | Use of mullerian inhibiting substance as a contraceptive agent | |
| SCHWABE et al. | Relaxin | |
| Bryant-Greenwood et al. | Human relaxins: chemistry and biology | |
| Chang et al. | Recombinant human chorionic gonadotropin (rhCG) in assisted reproductive technology: results of a clinical trial comparing two doses of rhCG (OvidrelR) to urinary hCG (ProfasiR) for induction of final follicular maturation in in vitro fertilization–embryo transfer | |
| International Recombinant Human Chorionic Gonadotropin Study Group | Induction of ovulation in World Health Organization group II anovulatory women undergoing follicular stimulation with recombinant human follicle-stimulating hormone: a comparison of recombinant human chorionic gonadotropin (rhCG) and urinary hCG | |
| Conn et al. | Potency enhancement of a GnRH agonist: GnRH-receptor microaggregation stimulates gonadotropin release | |
| US5010055A (en) | Use of EGF to reverse the contraceptive activity of MIS | |
| US4196123A (en) | Hybrid chorionic gonadotropin preparations and methods for stimulating ovulation using same | |
| EP0509047B1 (en) | Method for inhibiting follicular maturation | |
| Telleria et al. | Apoptosis induced by antigestagen RU486 in rat corpus luteum of pregnancy | |
| Paulson et al. | Addition of a gonadotropin releasing hormone (GnRH) antagonist and exogenous gonadotropins to unstimulated in vitro fertilization (IVF) cycles: physiologic observations and preliminary experience | |
| Wrathall et al. | Production of immunoactive inhibin by bovine granulosa cells in serum-free culture: effects of exogenous steroids and FSH | |
| EP0509040B1 (en) | Method for increasing fertility in females | |
| NO880794L (en) | USE OF MULLERIAN INHIBITIVE SUBSTANCE AS A CONTRACTIVE AGENT. | |
| Crawford et al. | The hypothalamic–pituitary–ovarian axis and manipulations of the oestrous cycle in the brushtail possum | |
| JP2562472B2 (en) | Use of Mueller inhibitors as contraceptives | |
| Beier et al. | Hormones and proteins involved in uterine preparation for implantation | |
| Weiss et al. | Relaxin and the cervix | |
| EP0538394B1 (en) | Treatment of male infertility | |
| Geurts et al. | PUREGON"(ORG 32489)-RECOMBINANT HUMAN | |
| Russell et al. | The N-terminal peptide of the inhibin α subunit: What are its endocrine and paracrine roles? | |
| AU646487B2 (en) | Treatment of male infertility | |
| WO1995019991A1 (en) | New composition of glycoprotein isoforms having follicle stimulating activity | |
| Ogawa et al. | Changes in the immunoreactivity of follistatin within preovulatory follicles after the primary gonadotrophin surge in rats | |
| Delves | The development of contraceptive vaccines |