NO873504L - Fremgangsmaate for behandling av angina og myokardialinfarkter med omentallipider. - Google Patents

Description

Hjerteangrep er en hovedårsak for død og den totale dødsgrad ved de første måneder etter MI er i gjennomsnitt 3096. De fleste dødstllfeller skjer i løpet av de første 12 timer.

Myokardial infarkt er ischemisk nekrose på grunn av okklusjon eller vesentlig innsnevring av en koronararterie på grunn av trombose, eller ved arteriosklerose, eller ved hemori I en arteriosklerotisk plaque, eller ved spastisk konstriksjon, eller ved en kombinasjon av disse mekanismer.

Behandling for myokardialinfarkt har hovedsakelig vært et for bibeholdelse og stabilisering av en pasient. Symptomene behandles og ingen terapi er tilgjengelig for å hjelpe oppbygning av skadet vaskulært eller myokardialt system. Forskjellige diskusjoner i medisinen kan anføres. F.eks. skal nevnes Krupp et al., "Current Medical Diagnosis and Treatment", 1985 Lange Medical Publications, Los Altos, California, som karakteristisk beskriver dette på side 121 og følgende.

Dagens behandling består av hvile; beroligelse; smerte-stillende (analgetiske) midler; oksygen-; antikoagulanter og/eller trombolytisk midler slik som streptokinas eller TPA (vevplasminogenaktivator); systemiske vasopressorer; diuretika; lokale vasodilatorer slik som nitroprussid, nitroglyserin, inotropiske midler slik som digitalis; aorta-ballong-motpulsering som en sirkulatorisk støtte, og i den senere tid, gjenåpning av den akutte okklusjon ved ballong-kateteret og tilsvarende innretninger (angioplasti), eller forbiløpskirurgi. Ingen terapi foreligger for kardialrupturer annet enn kirurgi og dette kun i tilfeller der lekkasjen er langsom. SulfInpyrazon (Anturane) er vist å virke ved plateaggregering og har en virkning med henblikk på for-hindring av gjenopptreden av myokardialInfarkter opptil 7 måneder. p<->adrenergiske blokkmedikamenter reduserer også sannsynligheten for reinfarkt i månedene etter et akutt myokardialt infarkt; slike medikamenter inkluderer limolol, propranolol, alprenolol og metoprolol. Rehabiliteringsmål inkluderer tidlig tilbakevenden til visse fysiske og progres-sive aktiviteter, akseptable livskvaliteter og eventuelt givende ansettelsesforhold.

De fleste av disse vanlige behandlinger er symptomatiske og er Ikke rettet mot den prinsipielle skade. Selv de mest moderne interventive tilnærmelser (trombolyse, angioplasti eller forbiløpskirurgi ) reperfuserer innløp, dvs. de store kar, men øker ikke kapillærkarmengden eller utløpet eller kollateraliseringen. Enkelte ganger fører øket innløp uten riktig kapillardrenering til en uønsket tilstand som kalles "reperfusjonsskade". Metoder og stoffer er nødvendige for å forbedre og/eller akselerere prinsipielle helbredelses-mekanismer for å fremme perfusjon, neovaskularisering og arrdannelse og kollagendannelse. Dette er metoden Ifølge oppfinnelsen der den ovenfor nevnte helingsmekanisme inkluderer neovaskularisering slik man ser ved pattedyrmyokardial-infarkter.

Foreliggende oppfinnelse anvender systemiske (og/eller lokal) applikasjon av omentum-avledede lipidfraksjoner eller bruken av disses bio- eller organisk-syntetiske eller rensede analoger for akselerering av vaskularisering, neovaskularisering, vaskularkollateralisering, promosjon av perfusjon og kollagendannelse eller arrdannelse, og organisering (cellulær og kollagen) av myokardialischemiske lesjoner.

Dette er et overraskende resultat fordi lipidmaterialer mer anses som arteriosklerotiske midler.

TJS-PS 4.296.100 beskriver en proteinf ibroblast-vekstf aktor med direkte injeksjon i hjertet og har det som synes å være en forhindrende virkning med henblikk på arealet som påvirkes av MI. Ved sårheling kan man se et middel som fremmer heling etter vaskularisering eller det er en diskusjon om midler som kan fremme vaskularisering. Det er overraskende å se mate rialet som i foreliggende oppfinnelse fremmer både vaskularisering og cellulær/kollagen-organisering in vivo, spesielt som en lokal effekt på lesjonssetet som svar på systemisk applikasjon.

De følgende fire applikasjoner kan siteres som eksempler for behandling av hjertetilstander. 1. Behandling av akutte myokardialinfarkt med den hensikt å oppnå hurtig og effektiv neovaskularisering av lesjonen og de tilliggende soner, redning av et maksimalt antall partielt skadede hjertemuskelceller, hurtig tilgang til levende reparerte celler til det skadede vev og akselerert dannelse av et mekanisk stabilt arr; 2. Behandling av generell myokardialischemi (angina) ved permanent økning av den totale vaskularisering og kollate-ralisering som tillater forbedret myokardialperfusjon; 3. Forbedring av vaskulariseringen og perfusjonen av transplanterte hjerter; og 4. Forbedring av de vaskulære leier supplert av koronar-, aorta- og perifervaskulærpodinger og/eller gjenåpnede koronararterier (ved angioplasti, trombolyse eller tilsvarende interventive prosedyrer) for å minimalisere podingsutløpsobstruksjon og å øke sjansen for å helbedre de angjeldende lemmer eller organer.

"Øket vaskularisering" kan defineres ved "øket antall effektive (eller åpne) store og små kar inkludert kapillærer, pr. volumenhet vev".

"Øket perfusjon" kan defineres ved "forbedret blodstrøm til, gjennom og fra et spesifikt vaskulærleie". Dette kan oppnås ved bedre åpning og akselerert strøm gjennom eksisterende

kar, eller ved dannelse av ytterligere nye kar (angiogenese) eller begge deler.

Øket myokardial vaskularisering er et ønsket terapeutisk mål fordi det fører til stimulering av veksten av små blodkar og perfusjon i:

1) hjerter med fokalt utilstrekkelig blodtilførsel på grunn av alvorlig innsnevring av en eller flere koronararterier eller disses hovedforgreninger, karakteristisk ved arteriosklerotiske lesjoner og disses komplikasjoner (ischemisk myokardium, anginapasienter); 2) myokardialinfarkter der mangelen på tilstrekkelig koronar-blodtilførsel har ført til en fokal myokardial celledød; 3) transplanterte hjerter der eksisterende blodkar kan være skadet; og 4) hjerter med vaskulære forbiløpspodinger eller gjenåpnede koronararterier (ved de interventive prosedyrer som er nevnt ovenfor) for å sikre optimal fordeling av den gjenopprettede blodstrøm (tilsvarende argumenter gjelder også i andre organer og lemmer som mates av vaskulær-podinger).

Den spontane heling av et myokardialinfarkt er forbundet med øket vaskulær perfusjon og involvering av et antall levende celler med spesifikke funksjoner i reparasjonsekvensen. Slike celler som hovedsakelig bringes til setet via kar inkluderer: polymorfonuklære leukocytter, makrofager, vaskulære celler (endotelium, pericytter, glatt muskel; involert i angiogenese), og fibroblaster.

Det spesifikke mål er økningen av disse vaskulære prosesser ved systemisk (eller lokal) applikasjon av nye omentum-avledede vaskulære vekstfaktorer for å forbedre vaskulari seringen og perfusjonen av det avdøde myokardium og dettes grenseområder, og å akselerere og å fremme på denne måte helbredelse av de mest mulige kontrakterbare celler, aksessen av celler som er involvert i organisasjon og reparasjon, og tidlig dannelse av et organisert kollagent erstatningsvev med adekvat strekkstyrke.

Disse resultater kan oppnås ved lokal, systemisk eller perfusjon av det innf Utrerte området med omentum-avledet angiogene lipidfraksjoner.

Ekstraheringen av katte-omentum er beskrevet i en parallelt-løpende US-SN 642.624. Det finnes også en publikasjon som gjelder angiogenesefaktoren fra omentum "Lipid Angiogenesis Factor From Omentum" av Harry S. Goldsmith et al., (1984), J. Amer. Med. Ass'n. 252:2034. Videre skal det henvises ti US-SN 782.724. Lipidpreparatene som oppnås fra omentum fra dyr var resultatet av en ekstrahering ved bruk av minst et organisk oppløsningsmiddel. Det angiogene materialet som ble oppnådd ved denne prosess fra dette omentum er rikelig i forråd og inneholder minst en potent angiogen faktor som forårsaker utvikling av tallrike neovaskulære forbindelser i levende vev. Lipidpreparatet selv er heterogent i sammensetning og er funnet å inneholde minst fem lipidsubfraksjoner som virker seg imellom for å gi den mest potente angiogene virkning.

Det angiogene materialet benyttes ved sårhelingsforsøk i den paralleltløpende US-SN 805.205.

Videre skal det henvises til bruken av angiogent omentum-materiale ved benheling i US-SN 811.894 og for hudtilstander i US-SN 811.505.

Eksempel I

I. Oppnåelse av kloroform- metanol- lipidholdlg ( CMFr ) fraksjon Voksne hunnkatter med en vekt på 2,4-3,2 kg ble bedøvet ved intramuskulær injeksjon av Ketamine i en foretrukket dose på 7,0 mg/kg. Etter bedøvelse ble det gjennomført en laparatoml gjennom et mldtlInjesnitt 1 henhold til konvensjonelt kjent kirurgiske prosedyrer. Omenta ble kirurgisk fjernet og plassert i sterile plastposer som ble holdt ved 4°C for umiddelbar prosessering. Samtidig ble subkutant fett også fjernet og behandlet på en måte identisk med omentalvev for bruk i prosedyrer som en ikke-omental lipidkontroll.

Ved å bruke riktig aseptisk teknikk ble omenta veiet, spredd ut på en plastoverflate og skåret i individuelle stykker på ca. 4 cm<2>i størrelse ved bruk av kirurgisk utstyr. Disse individuelle omentalstykker som veiet individuelt fra 7 til 66 g ble anbragt i en steril Waring-blander inneholdende 300 ml fosfatbufret saltoppløsning, heretter kalt PBS, som var forkjølt til 4°C. Omentalstykkene ble blandet i 5 minutter ved 20.500 omdr./min. og man oppnådde et omentalhomogenat som deretter ble anbragt i sterile 250 ml plastflasker og sentrifugert ved 1600 x g i en avkjølt sentrifuge ved 4°C i 20 minutter. Etter sentrifugering var tre distinkte og separerbare fraksjoner synlige i flaskene; en pellet av blandet sammensetning; et uklart homogenat inneholdende i det vesentlige alt proteinholdig materiale, og en flytende, kremfarget lipidkake. Hver av disse fraksjoner ble Isolert individuelt.

Pelleten av blandet sammensetning ble kassert helt. Den turbide homogenatfraksjon ble helt mettet, dvs. til 100$, med vandig ammoniumsulfat som bevirket presipitering av det totale proteininnhold i fraksjonen. Utprøving av den turbide homogenatfraksjon og den totale proteinpresipitant (resuspendert i PBS) ved kornea-analysen viste at ingen av disse preparater hadde god angiogen aktivitet.

Lipidfraksjonen som ble isolert som en flytende lipidkake besto av to distinkte sjikt: en øvre skummende blanding og et mer tett, kompakt sjikt som var mørkere av farge enn det øvre. Hvert sjikt ble bedømt og funnet å inneholde en aktiv angiogen faktor i vesentlig mengde. Av denne grunn ble hvert av sjiktene individuelt og i kombinasjon funnet å omfatte den aktive lipidfraksjon. Vekten av den lipide kake omfattende begge sjikt ble funnet å være ca. 93$ av den totale vekt av det omentum hvorfra de var avledet og det er denne lipide kake som benyttes for å fremstille den konsentrerte organiske ekstrakt omfattende den aktive angiogene faktorblanding.

Aktive lipidfraksjoner ble ekstrahert ved bruk av mengder og andeler av lipidkake som gitt i tabell I:

De antydede mengder av lipidkake ble kombinert med ca. 21 ml av et organisk oppløsningsmiddel omfattende kloroformrmetanol i volumforholdet 2:1, i en Eberbach 8575 mikroblander og der homogenisert i 2 minutter. Lipid/oppløsningsmiddelhomogenatet ble så sentrifugert ved 200 x g i en klinisk sentrifuge ved romtemperatur i 10 minutter for derved å oppnå en klar, gylden farget supernatant og et partikkelformig presipitat. Supernatanten ble isolert ved bruk av konvensjonelle prosedyrer og underkastet rotasjonsfordamping ved 37°C under vakuum for totalt å fjerne kloroform/metanol-oppløsnings- midlet. Andre metoder for oppløsningsmiddelfjerning er kjent og kan benyttes. Det ble oppnådd en viskøs væske som så fortrinnsvis ble suspendert i ca. 4 ml PBS for bruk ved kornea- og kamanalyser.

II. Oppnåelse av rene fraksjoner

CMFr, oppnådd ovenfor, ble oppløst i en blanding av heksan (ca. 60 ml heksan pr. 10 g ekstrakt), og 0,66 volumer 95 %- ig etanol ble tilsatt. Fasene ble blandet grundig og ble tillatt separering. Den øvre fase, heksanfasen, ble reekstrahert med 95 #-ig etanol og den resulterende nedre fase av reekstra-heringen ble kombinert med den første etanolfraksjon. De kombinerte etanolfraksjoner ble så reekstrahert med heksan og det resulterende heksansjikt kombinert med den første heksanfraksjon. Begge faser ble tørket for å oppnå "heksan-øvre-fase-materiale" og "etanol-lavere-fase-materiale"

(heretter kalt heksan-UP og etanol-LP).

Etanol-LP-fraksjonen ble så underkastet Folch-fordeling i henhold til Folch et al., "J. Biol. Chem.", 226:497-509

(1957) (dvs. fraksjonen ble oppløst i kloroform:metanol i en mengde av 20 volumer i forhold 2:1, volum:vekt), og det ble tilsatt 0,2 volumer vann. Fasene ble grundig blandet og tillatt separering. Den øvre fase fra Folch-fordelingen ble fjernet og den nedre ble vasket med 0,4 volumer metanol:vann 1:1. Dette gir en øvre metanolfase som kombineres med Folch-øvre-fasen og den tørkes så for å oppnå den andel som heretter kalles Folch-UP. Den nedre andel tørkes også og betegnes heretter Folch-LP.

Folch-LP-andelen ble oppløst i kloroform og ble så underkastet kromatografi på en silisiumsyre, Unisil-kolonne som beskrevet av Vance et al. i "J. Lipid Res." 8:621-630 (1967). Kolonnen ble eluert suksessivt med 20 kolonnevolumer kloroform, aceton:metanol 9:1, og metanol. Denne suksessive eluering separerer nøytrallipider (kloroform), glykolipider (aceton:metanol ) og fosforlipider (metanol). Folch-UP-andelen ble opplst 1 omtrent 3 ml/mg metanol:vann 1:1 og ble så bragt på en C^g-reversfasepatron som beskrevet av Williams et al., "J. Neurochem.", 35(1). 266-269 (1980), og patronen ble så vasket med 4 volumer metanol:vann 1:1 for derved å oppnå "ikke-lipid UP-materiale" etter tørking og 4 volumer kloroform:metanol 2:1 for å oppnå lipid-UP-materiale etter tørking.

Lipid-UP-materlale ble så oppløst i metanol:kloroform:vann i forholdet 60:30:8 og påført på en DEAE-Sephadex-acetatkolonne i henhold til Christie, "Lipid Analysis", Pergamom Press, 2. utgave, s. 109-110 (1982). Denne kolonne ble så eluert med 10 volumer av metanol:kloroform:vannblandingen som opprinnelig ble benyttet for å oppnå det som kalles en "nøytral-1ipid-øvre-fase-fraksjon", eller "nøytral-lipid-UP". Ekstrahering med metanol:kloroform:0,8 natriumacetat i forholdet 60:30:8 ga gngliosidfraksjoner. Begge fraksjoner ble fordampet til tørr tilstand og glykosidfraksjonen ble avsaltet ved bruk av en Cig-reversfasepatron.

Kloroform:metanol-fraksjonen ble ekstrahert med 1, 0% eddiksyre i et volumforhold på 1:10, vekt:volum, ved omrøring med en magnetisk rører i 10-12 minutter. Ekstrakten ble sentrifugert ved 2000 omdr./min. i 5 minutter i 200 ml flasker. Toppsjiktet, dvs. den eddiksyre-uoppløselige fraksjon ble så fjernet. Den eddiksyre-oppløselige fraksjonen ble kombinert med et tilsvarende volum kloroform og ble sentrifugert som ovenfor for å oppnå en ren separering av de to faser. Hver fase ble vasket tilbake to ganger med det motsatte oppløs-ningsmiddel og alle kloroformfaser ble samlet. Fordamping av kloroformen ga den "eddiksyre-oppløselige" fraksjon.

Affinitetskromatografi (heparin- og gelatin-binding) av Folch-UP- og PBS-homogenatfraksjonene ble gjennomført som følger: Heparin-Sepharose CL-6B kuler eller gelatin-Sepharose-kuler, ca. 3 g hver, ble vasket med 450 ml vann i et slntret glassfilter. Sepharosekulene ble suspendert i vann og pakket i 2,5 x 9 cm kromatografikolonne. Overskytende vann ble helt av og den tørre prøve (f.eks. Folch-UP) ble suspendert i 0,01 fosfatbuffer, pH 7,0 og ført på kolonnen. Elueringen ble gjennomført med den samme buffer, tilsammen 100 ml ved en strømningshastighet på 2 ml pr. minutt. Dette ble fulgt av en vasking med 100 ml vann for å fjerne salter fra kolonnen. Slutteluering av heparin eller gelatinbindingsmaterialet ble gjennomført med 50 ml 0,5$ eddiksyre. Etter fordamping av eddiksyre ble materialet resuspendert i fosfatbuffer for utprøving.

Kloroform:metanol, 2:1, 1ipidfraksjonen ble viderekarakteriserthva angår komponentdelene eller subfraksjonene ved bruk av silikagel eller iatrokule-væskekromatografi. For disse kromatografiske fraksjoneringer benyttet man de prosedyrer som er beskrevet av A. Kuksin, "Chromatography Part B'" (E. Heftmann, utgiver), Elsevier, New York, 1983. I foreliggende metode ble 5,0 ml kloroform:metanol-lipidekstrakt anbragt i en kromatografikolonne inneholdende silikagel (100-200 mesh Sigma Chemical Company) som på forhånd var ekvilibrert med kloroform. Ved bruk av silikagelkolonnene ble det gjennomført elueringer i sekvens ved bruk av 100 ml mengder av de følgende oppløsningsmidler: kloroform; etylacetat; etylacetat:metanol, 3:1; metanol:vann, 4:1; fulgt av 200 ml av en oppløsningsmiddelblanding omfattende kloroform:metanol:eddiksyre:vann i forholdet 25:15:4:2. Fem individuelle eluerings-fraksjoner ble oppnådd, nummerert I-V.

Gelpermeasjonskromatografi ble gjennomført på en Sephadex LH-20-kolonne. 100 mg av kloroform-metanolekstrakten eller av etanol-LP ble anbragt på kolonnen og elueringen gjennomført med et kloroform:metanol 1:1 oppløsningsmiddel. Fraksjonene ble samlet og oppløsningsmidlet fordampet for utprøving.

III. Analyse av fraksjonene

Nedre fase glykolipidene ble undersøkt ble HPTLC med kloroform rmetanol : vann i forholdet 60:35:8 som utviklende opp-løsningsmiddel og visualisert med orcinolsprayreagensen som beskrevet av Svennerholm, "J. Neurochem." 1:42 (1956). De ble også analysert ved HPLC som perbenzoylderivater som tidligere angitt av Ullman et al., "J. Lipid Res.", 19:910-913 (1978). Den øvre fase komplekse, nøytrale glykolipidfraksjon ble undersøkt ved HPTLC og ved immunoblotting med Forsmann og SSEA-l-antistoffer. Hovedkomponenten av den øvre fase komplekse nøytrale glykolipidfraksjon ble ytterligere renset ved preparativ TLC eller ved kromatografi på en Iatrobead-kolonne (1 x 50 cm, 60 jj ), eluert med heksan: isopropanol:vann som beskrevet av Kannagi et al., "J. Biol. Chem." 237 (24 ) 14865-14874 (1982); og Hakomori et al., "J. Biol. Chem.", 259(7), 4672-4680 (1984).

Gangliosidfraksjonen ble behandlet med 0.25N natriumhydroksyd i metanol i 2 timer ved 37°C, nøytralisert med iseddik og avsaltet med en C^g-reversfasepatron. Den alkalibehandlede gangliosidfraksjon ble så underkastet kromatografi på en DEAE-Sephadex-kolonne og eluert med 0,02M, 0,08M og 0,05M ammoniumacetat i metanol for derved å oppnå mono-, di- og polysialo-gangliosidfraksjoner, se Ledeen et al., "Methods in Enzymol." v.83, del D, s. 139-191 (1982). Gangliosid-fraksjonene ble separert i individuelle komponenter ved kromatografi på en 0,4 x 50 cm, 10 ytm partikkel, latrobead-kolonne og eluert med kloroform:metanol:vann i forholdet 65:35:8. Fraksjoner på 1,2 ml ble samlet, mengder undersøkt ved HPTLC og fraksjoner inneholdende enkeltkomponenter slått sammen på egnet måte. Det ikke-lipide materialet ble ekstrahert med metanol, sentrifugert og supernatanten fjernet. Den uoppløse-lige rest ble oppløst i vann og vann- og metanol-oppløselige fraksjoner ble undersøkt ved HPTLC i diverse oppløsnings-middelsystemer.

Rensede gangliosider ble tørket under nitrogen og 300 pl 0,05M natriuraacetatbuffer, pH 5,5, inneholdende 0,025$ CaCl2tilsatt. V. cholerae neuramindase (100 pl, 0,1 enheter) ble tilsatt og prøven inkubert i 3 timer ved 37"c. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 2 ml kloroform:metanol, 2:1 og blandingen bragt på en reversfasepatron og de ikke-lipide komponenter eluert med vann. Gjenværende gangliosider og lipidreaksjonsproduktene ble eluert med metanol og kloroform:metanol og undersøkt ved HPTLC. De frisatte sialsyrer ble også undersøkt ved TLC på samme måte som deres trimetyl-silylderivater i henhold til Ledeen, supra.

Når det gjelder sukker- og fettsyreanalyse ble glykolipidene underkastet metanolyse i vannfri 0.75N HC1 i metanol i henhold til Ledeen, supra samt Kozulec et al., "Analytical Biochem.", 94:36-39 (1979). Fettsyremetylesteren ble analysert ved TLC. Metylglykosidene ble analysert på samme måte som trimetylsilylderivatene på den samme 0V-l-kolonne som beskrevet av Kozulec, ovenfor. For HPTLC-analyse av de nedre fase nøytrale glykolipider, ble fraksjonen perbenzoylert med benzoylklorid i pyridin og de benzoylerte glykossfingolipider separert og kvantitert ved HPLC på en ikke-belagt Zipax-kolonne med en gradienteluering og 230 nm detektering som tidligere beskrevet av Ullman, supra. For direkte probe massespektrometri ble glykolipid- eller gangliosidprøver på 5-50 pg trimetylsilylert i 25 pl pyridin:heksametyldi-silan:trimetylklorsilan:N,O-blstrimetylsilyltrifluoracetamid. Alt fra 1-5 pg av derivatet ble anbragt i en prøvekopp og proben oppvarmet fra 100-350°C i en hastighet på 30°C/min. Massespektra ble oppnådd med et Finnigan modell 4500 kvadrupol-massespektrometer utstyrt med Teknivent, modell 56K-datasystem. Det ble drevet med en ioniserende strøm på 0,5 mA og en ioniserende spenning på 70 eV. Ioniserings-temperaturen var 150°C. Repetitive skanderinger av masse-området fra 100 m/e til 950 m/e ble oppnådd ved 5 sekunders intervaller.

Glykolipider ble kromatografert på aluminium-bakte HPTLC-plater med kloroformrmetanol:vann i forholdet 60:35:8, tørket og så dyppet i 0,05$ polyisobutylmetakrylat i heksan som beskrevet av Brockhause et al., "J. Biol. Chem.", 256:13223-13225 (1981). Platene ble så dynket i fosfatbufret saltopp-løsning inneholdende 1$ bovinserumalbumin i 2 timer før tilsvarende eksponering til antistoff i 2 timer ved 40°C. Platen av øvre fase nøytralt glykolipid ble behandlet med Forssman-monoklonalt antistoff IgM, ervervet fra ATCC (T1B 121). TLC-platene av disialogangliosidfraksjonen ble behandlet med GD3-monoklonalt antistoff IgM fremstilt av foreliggende søkere. Etter vasking i PBS ble platene eksponert til gjet anti-mus IgM, konjugert til pepperrotperoksy-dase, i 2 timer ved 4°C. Etter vasking i PBS, ble platene fremkalt med 33 mN 4-klor-naftol i 0,02 tris-HCl-buffer inneholdende 20$ metanol og 0,025$ B^Og•

IV. Karakterisering av fraksjonene

Felin omentum ble homogenisert, sentrifugert og den flytende lipidkake ble ekstrahert med kloroform:metanol og ytterligere fraksjonert som vist i fig. 2. Heksanfasen inneholdt ca. 98$ av materialet I CMFr og ble påvist å bestå hovedsakelig av triglyserider, bestemt ved TLC. Alkalisk metanolyse og GC/MS-analyse av de resulterende fettsyremetylestere viste at 14:0, 16:0, 16:1, 17:0, 18:0, 18:1 og 18:2 var de hovedsakelig triglyseridfettsyrer (der det første tallet antyder karbon-kjedelengden for fettsyre og det andre antallet umettede bindinger).

Etanolfasematerialet ble underkastet Folch-oppløsnings-fordeling og de nedre faselipider som besto av 80$ av etanolfaselipidene, ble fraksjonert på en Unisil-kolonne. Den nøytrale 1ipidfraksjon gjenvunnet fra Unisil-kolonnen besto altså hovedsakelig av triglyserider og små mengder kolesterol og frie fettsyrer ble detektert ved TLC-analyse. Aceton-glykolipidfraksjonen ble undersøkt ved TLC og komponenter som migrerte som heksosylceramid, laktosylceramid, globotriaosyl- ceramid og globosid var tilstede. Kvantitativ analyse av disse glukolipider ved HPTLC er beskrevet infra. Metanol-fosfolipidfraksjonen ble undersøkt ved TLC og komponenter som migrerte som fosfatidylserin, fosfatidylkolin og sfingomyelin var tilstede.

Ca. 20 vekt-$ av etanolfasematerialet ble gjenvunnet I Folch-UP. Dette Folch-UP-materialet ble bragt på en reversfasepatron og ikke-lipidfraksjonen ble eluert med metanol-vann og lipidene eluert med kloroform:metanol. Lipid-UP-materialet ble påført på en DEAE-kolonne og den nøytrale fraksjon som ikke ble holdt tilbake på kolonnen, ble samlet og funnet å bestå av 40$ av lipid-UP-materialet. Ved undersøkelse ved HPTLC ble denne fraksjon funnet å inneholde hovedsakelig et glykolipid som migrerte under globosid, og små mengder mer komplekse glukolipider.

Gangliosidfraksjonen ble eluert fra DEAE-kolonnen med ammoniumacetat i metanol og avsaltet ved bruk av en reversfasepatron. Eksaminering av HPTLC viste nærværet av resor-clnolkomponenter som migrerte som GM3, GM1, GD3 og diverse mindre polysialogangliosidkomponenter. Den ytterligere rensing og identifisering av disse gangliosider er beskrevet inf ra.

Ikke-lipid-øvre-fase-fraksjonen, ikke-1ipid-UP, ble bragt til tørr tilstand og ekstrahert med metanol. Hovedandelen av materialet var ikke-metanoloppløselig og suspensjonen ble sentrifugert og supernatanten fjernet. Det uoppløselige materialet var lett oppløselig I vann. Disse fraksjoner ble undersøkt ved TLC og den vannoppløselige fraksjon viste kun et ninhydrin positivt bånd. Mesteparten av dette vannoppløse-lige materialet så ut til å være salt. Det metanoloppløselige materialet inneholdt minst 6 orcinol- og ninhydrin-positive komponenter og en GC/MS-analyse indikerte etter trimetyl-silylering at dette materialet var en kompleks blanding av sukkere, aminosyrer, peptider og glykopeptider. Vektfor- delingen av fraksjonene fra omentum-rålipid-ekstraktene er vist i tabell II.

Andeler av glykolipidfraksjonen ble benzoylert med benzoylklorid i pyridin og de perbenzoylerte derivater analysert ved HPLC med 230 nm deteksjon. Resultatene er vist i figur 3. Disse data viser at prosentandelsfordelingen av glykolipider i fraksjonen er GlcCer (Nfa), 26$; GalCer (Nfa), 9,6$; GlcCer (Hfa) + GalCer (Hfa) + Ga0se2Cer (Nfa), 12$; LacCer, 11$; Gb0se3Cer, 10$; Gb0se4Cer, 26$.

Den øvre-fase-nøytrale lipidfraksjonen ble undersøkt ved HPTLC og funnet å bestå av ca. 90$ av et orcinol positivt materiale som migrerte noe langsommere enn globosidstan-darden, så vel som små mengder av 3-4 mer polare orcinol positive komponenter. Immunoblotting med Forsmann- og SSEA-1-antistoff antydet at hovedkomponenten var Forsmann positiv og at det ikke var tilstede noen SSEA-1 positive komponenter. Hovedkomponenten ble ytterligere renset ved kromatografi på en Iatrokule-kolonne og underkastet metanolyse og komponent-analyse ved GC/MS. Heksoseforholdene ble funnet å være Glc/Gal/NAcGal 1:2:2. Fettsyrene som var tilstede var primært . Det intakte glykolipid ble også silylert og undersøkt ved direkte probe-massespektrometri. Disse spektra, vist i figur 3, antydet nærværet av terminal heksosamin, interne heksorester, nærværet av C^g-sfingosin og fettsyrer. Tatt sammen antyder disse data at glykolipidet er Forsmann pentaglykosylceramid. Selv om posisjonen og konfigu-rasjonen av bindingene ikke direkte er bestemt, bekrefter antistoffreaktiviteten og glykolipidanalytiske data sterkt denne struktur.

Gangliosidfraksjonen ble behandlet med mild alkali for å destruere alle esterbindinger som kunne være tilstede og så separert til mono-, di og polysialogangliosidfraksjoner ved DEAE-Sephadex-kromatografi. Monosialogangliosidfraksjonen ble vist ved HPTLC å bestå primært av komponenter som migrerte som en triplett av bånd tilsvarende mobiliteten til GM3-standarden og en liten mengde materiale som migrerte som GM1. Monosialogangliosidfraksjonen ble ytterligere renset ved kromatografi på en iatrokulekolonne og fraksjonene inneholdende kun komponenter som migrerte som GM3 ble samlet. Dette materialet ble behandlet med neuraminidase og lipid-produktet blekarakterisertsom laktosylceramid ved hjelp av HPTLC og ved direkte probe-MS. Den frisatte sialsyre ble vist ved GC-analyse å bestå kun av N-acetylneuraminsyre. Det intakte gangliosid ble underkastet metanolyse og sukkere og fettsyrer undersøkt ved GC-analyse. Forholdene Gle/Gal ble funnet å være 1:1 og fettsyrene besto primært av 16:0, 18:0, 20:0, 22:0, 23:0, 24:0 og 24:1. Preparatet ble også undersøkt ved direkte probe-massespektrometri som trimetylsilyleter-derivatet. Et massespektrum tilsvarende det gitt av gangliosid GM3 standard (sialyl[2-3]galaktosyl[l-4]glukosyl[1-1]ceramid).

Disialogangliosidfraksjonen ble ved HPTLC vist å bestå primært av en komponent som migrerte som GD3. Dette materialet ble ytterligere renset ved kromatografi på en Iatrokulekolonne og fraksjonene som kun inneholdt en enkelt komponent som migrerte som GD3 ble samlet. Preparatene ble underkastet metanolyse og metylglykosidene og fettsyremetyl-estrene undersøkt ved GC/MS. Forholdet Gle/Gal ble funnet å være 1:1 og hovedfettsyrekomponentene var 16:0, 18:0, 18:1, 24:0, 24:1. Materialet ble behandlet med neuraminidase og 1ipidproduktet identifisert som laktosylceramid ved hjelp av HPTLC og direkte probe-MS-analyse. Den frisatte sialsyre ble vist å bestå kun av N-acetylneuraminsyre ved hjelp av GC-analyse. Direkte probe-MS av TMS-derivatet ga spektra som var konsistente med GD3. Materialet ble også vist ved immunoblotting å reagere med et monoklonalt antistoff som ble preparert i søkerens laboratorium med demonstrert reaktivitet mot GD3.

Polysialogangliosidfraksjonen ble vist å inneholde komponenter som migrerte på HPTLC som gangliosid GDla, GTlb, men utilstrekkelige mengder ble oppnådd for ytterligere analyse.

V. Angiogenese

Den angeiogene aktivitet av 1ipidpreparatene som beskrives i figur I og av silikagelkromatografifraksjonene I-V ble prøvet ved kanin-korneaprøven på følgende måte: en serie hvite New Zealand-kaniner ble anestetisert med intravenøs pentobarbitol (30 mg/kg). Fra hvert preparat som vist i tabell I, ble det gjort en enkelt 50 pl injeksjon av den vandige lipidsuspen-sjon gjennom en nål nr. 25, anbragt i intrastromalt i kornea i hvert øye. Dyrenes kornea ble undersøkt grovt og med et operasjonsmikroskop den andre, fjerde, sjette, åttende og tiende dagen etter okkulærinjeksjonen. Blodkarveksten og nærværet av kornealt ødem og/eller inflammasjon ble notert. Den 10. dagen etter visuell eksaminasjon ble kaninene individuelt avlivet og histologiske snitt, flekket med hematoksylin og eosin på konvensjonell måte ble oppnådd fra 6 pm tykke snitt skåret ut fra de formalInfikserte enukleerte øyne. Fotoopptak av positive kaninøyne ble gjennomført.

Den angiogene respons ble gradert som følger: 0, identifisert ingen angiogenese og en klar kornea; 1+, identifiserte dilasjon av skleralkar med rødfarging bemerket på limbus; 2+, identifiserte flere individuelle blodkar som migrerte fra limbus 2/3 av veien til injeksjonssetet; 3+, identifiserte mange blodkar som strakk seg fra limbus til injeksjonssetet og involverte 10-20$ av kornea; 4+, identifiserer tett blodkardannelse som strekker seg fra limbus til injeksjonssetet og involverer minst 30-40$ av kornea.

For sammenligningsformål ble en vandig suspensjon av omental lipidkaken og et vandig preparat av det subkutane ikke-omentale fett også preparert og prøvet. Ikke-omental fett-preparatet ble oppnådd ved å kombinere en 3 g andel av det subkutane fettvev med 4 ml PBS og å homogenisere denne blanding ved bruk av Eberbach-mikroblanderen i 2 minutter ved 4°C. På tilsvarende måte ble det fremstilt en vandig suspensjon av omental-1ipidkaken ved homogenisering av 4 g andeler av kaken med 4 ml PBS i mikroblanderen i 2 minutter ved 4°C. Homogenatet av hele omentum før sentrifugering til protein-holdige fraksjoner og lipidfraksjoner ble også bedømt. Resultatene er som vist i tabell II nedenfor.

Disse data viser at utmerket angiogen aktivitet ble observert etter en enkel 50 pl sentral kornealinjeksjon av kloroform/- metanol-lipidekstrakten CMFr. I sammenligning ble kun minimal angiogen aktivitet notert med PBS-homogenatet av det totale omentum og med PBS-homogenatet a det totale omentum og med PBS-homogenatet av lipidkaken før ekstrahering. Bemerk imidlertid har at en heparinbindingskomponent ble konsentrert ved affinitetskromatografi fra PBS-homogenatet som viste angiogen aktivitet ved CAM-analysen (se nedenfor). Ingen angiogenese I det hele tatt skjedde i de tilfeller som fulgte injeksjon av PBS alene eller det subkutane ikke-omentale fett PBS-homogenat. En komplikasjon ble imidlertid bemerket i disse data I tabell II, nemlig at det injiserte subkutane fett som ble tatt fra katte-abdominalveggen forårsaket alvorlig betennelse av kornea innen to dager etter kornealinjeksjon.

Forløpet av den angiogene respons i kornea på det injiserte vandige suspenderte kloroform/metanol-lipidpreparat fulgte et konsistent mønster av hurtig utvikling og intens aktivitet. Etter injisering av den ekstraherte lipidfraksjon, ble det observert en mild korneal betennelsesreaksjon i løpet av 24 timer og som ga seg i løpet av 48 timer. Denne initiale betennelse karakteriseres ved lett uklarhet av kornea og der minimal erytem av skleralarealet ofte var ledsaget av en lett utsondring fra øyet. En pannus, opptredenen av et teppe av blodkar rundt korneakanten, med interstitial blodkardannelse, ble sterkere tydelig 3-4 dager etter injeksjonen. På den 7. til 10. dag hadde blodkarene dannet et tett og rikt struktu-rert nettverk i kornea. Dette Illustreres ved fotografiet i figur 3. Histologisk undersøkelse av enukleerte øyne inn-hentet den 10. dag viste multippelkapillarer i kornealstroma; et fotografi av det histologiske snitt som viser slike multippelkapillarer i stroma er vist i figur 4.

Det er spesielt å merke seg at den oppløsningsmiddelekstra-herte lipidfraksjon i vandig medium initierer og understøtter angiogenese etter kun en enkelt 50 pl doselnjeksjon. Selv om mekanismen for denne angiogene prosess og responsen i dag ennu ikke er kjent, er det åpenbart at injeksjonen av den ekstraherte lipidfraksjon fra omentum initierer og utvikler dannelsen av nye blodkar som blir organisert til tette og godt strukturerte vaskulære nettverk i løpet av 7 til 10 dager.

Som vist i figur 3, ble ytterligere fraksjonering av CMFr gjennomført ved silikagelkromatografi. Etterfølgende prøving av hver av de fem lipidsubfraksjoner med kornea-analysen, viste at angiogen aktivitet var tilstede kun i subfraksjon V med en merkbart angiogen effekt fra enhver av subfraksjonene I-IV. Den totale aktivitet til subfraksjon V var Imidlertid målbart mindre enn den til kloroform/metanol-1ipidekstrak-sjonspreparatet som opprinnelig ble oppnådd. Det ble etterpå funnet at subf raks j onene I-IV, selv om de ikke hadde noen angiogen aktivitet i seg selv, ved kombinasjon med subfraksjon V bevirket en økning og forbedring av aktiviteten og potensen til det angiogene preparat som en helhet.

De forsøk som er angitt nedenfor, viser at CMFr viser angiogen aktivitet. Det ble deretter gjennomført ytterligere forsøk ved bruk av ytterligere fraksjoner som ble fremstilt ved å følge retningslinjene i figur 1. Forsøkene besto av å gjennomføre CAM-analyser, definert infra. Dette fører til utledningen av den "angiogene indeks", som er et mål på den effekt fraksjonen hadde ved CAM-analysen. En ytterligere verdi, "diskrimineringsenheten", ble også definert og begge forklares infra.

De beskrevne forsøk ble Ikke begrenset til omental-fraksjoner oppnådd ved de ovenfor beskrevne forsøk. Etter at den generelle molekylære sammensetning av de mer effektive fraksjoner var bestemt til å inneholde lipidholdige mole kyler, spesielt gangliosider, ble det benyttet ytterligere lipidholdige molekyler som er kjent i denne teknikk. Det ble uventet funnet at mange av disse stoffer også hadde sterk, uventet angiogen virkning. Ytterligere forsøk ble gjennomført ved bruk av kommersielt tilgjengelige gangliosider i nye kombinasjoner. Igjen ble det funnet uventede angiogene egenskaper. Av sågar større interesse er det faktum at preparater med blandinger av forskjellige gangliosider hadde mer en additiv angiogen effekt.

VI. CAM- analyser

Angiogene egenskaper for ekstrakter, fraksjonater og preparater ble bestemt ved å underkaste disse "Chick Embryo Chorioallantoic Membrane Assays", de såkalte CAM-analyser.

Disse CAM-analyser benytter fertiliserte kyllingegg og medfører følgende trinn: Preparering av eggene: Ved bruk av en drill ble et 2 cm<2>skallstykke fjernet fra det fertiliserte egg på dag 4 etter inkubering. Denne åpning kalles nå et "vindu". Cellofan-tape tetter vinduet mot den utenforliggende omgivelse. Eggene bringes så i en inkubar i ytterligere 4 dager ved 37°C.

Fremstillin<g>av skiver: Den 8. dag etter inkubering ble 0,4 g agarose og 10 ml PBS blandet og oppvarmet til 100° C i små glassampuller og deretter blandet ved 50° C med en 2% BSA-oppløsning i PBS. Blandingen, 2$ agarose + 1% BSA i PBS, holdes varm i et vannbad. Ved bruk av en pipette ble 20-40 ml av prøveoppløsningen, dvs. ekstrakt, fraksjonat eller blanding, blandet med en dråpe av agaroseblandingen ved konstant omrøring. Etter at den store skive er herdet ved geldannelse, deles denne opp i fire mindre skiver.

Plassering av skivene på membranet: Den 8. dag etter inkubering ble skivene plassert inne i eggene på CAM, idet man valgte arealer på CAM med forskjellige grader av blodkar- utvikling. Det utvalgte areal er ca. 1 cm borte fra kylling-embryoet, men ikke så langt borte at skiven vil ligge utenfor CAM eller klebe til den indre skallvegg. Eggene inkuberes så i ytterligere 4 dager. Alle instrumenter som ble benyttet er på forhånd behandlet i 98 %- lg etanol.

Plastskiver: Plastskiver ble preparert ved bruk av en hullstanser. Etter å ha anbragt 2,5 ml av prøveoppløsningen på hver skive, ble denne tillatt å tørke over en varm plate. Ytterligere 2,5 ml mengder av prøveoppløsningen kan tilsettes til skiven og tørkes mellom påføringene. Etter at skiven er preparert anbringes den på CAM som angitt ovenfor.

Bedømmelse av virknin<g>en: På den 12. dag etter inkubering ble skivene lokalisert inne i eggene og vinduene gjøres større ved å bryte av biter av skallet med en pinsett.

Eggene undersøkes så under lysmikroskop. Vaskulariseringen i resten av egget sammenlignes med det som omgir skiven. Graden av neovaskularisering i retning av skiven bestemmes og sammenlignes med virkningen av skivene i andre egg. Virkningen av hver skive bedømmes i henhold til en skala 1 til 5 som følger: 1 = et eller to små arealer med øket forgrening rundt skiven; i det vesentlig negativ. 2 = tre eller flere små arealer av øket forgrening rundt skiven; svak respons. 3 = lik dannelse av "hjulekeeffekten", i og for seg selvforklarende; øket forgrening rundt skiven;

moderat respons.

4 = "hjulekeeffekt" med øket forgrening rundt skiven, i en grad større enn den under "3"; en sterk respons. 5 = "hjulekeeffekt" med utstrakt forgrening rundt skiven;

meget sterk respons.

Det ble også benyttet pluss- og minus-indekser sammen med hver numeriske verdi slik at en CAM-analyse kan ha en verdi fra 1- (overhodet ingen respons) til 5+ (eksepsjonelt sterk respons med utstrakt forgrening).

Basert på det foregående bedømmelsessystem, bestemmes den angiogenetiske indeks ("A"-indeks eller "A" i de følgende tabeller). A-indeksen tillater sammenlignende analyse av prøver, uttrykt ved den angiogene aktivitet.

Den angiogene indeks defineres som:

Som et eksempel vil i en prøve inneholdende 12 CAM-analyser, hvis 7 er svake, 1 er moderat, ingen er sterke og 4 er negative, A-indeksen beregnes som følger:

Tabell III angir data oppnådd ved å analysere ekstrakter og oppløsningsmiddelfordelingskomponenter oppnådd under de prosedyrer som er gitt i figurene I, II og III. Den benyttede terminologi er den samme som er benyttet i figurene.

Prøvene ble oppnådd fra felin-, bovin-, porcin- og kanin-omenta som antydet.

Den nedenfor følgende tabell IV inneholder data tilsvarende de i tabellene I-III. Prøvene er imidlertid alle gangliosid-stoffer. Den første gruppe er gangliosid oppnådd fra katt-omentalekstrakter. Gangliosidet ble separert i mono-, di- og tri-sialyerte komponenter og ble også blandet i 1:1-henholdsvis 1:1:1-forhold. Tilsvarende analyser ble gjennom-ført med porcin omenta-avledede glykosider.

"Supelco"-gruppen presenterte analyser for kjente, kommersielt tilgjengelige gangliosider (oppføringene 1-4 i denne gruppe). Oppføringene 5-8, representerer imidlertid nye preparater av gangliosider.

Denne tabell presenterer også en verdi for disse stoffer, "DU" eller "diskrimineringsverdier".

For å bestemme DU-verdien ble A-indeksverdien ført opp så vel som prosent negative middelverdier sj og Sj for forbindelse av en klasse I, og sjj- og<S>jj-verdier for en klasse II. Disse tallene sj, Sj, sjj og Sjj bestemmer centroider av fordelingen av hver klasse av forbindelser. Ved bruk av dette bestemmes verdier og w2samt X^T, X2t; "vektkoeffisienter" bestemmes via

Jo mindre DU-verdien er, jo større er den angiogene egenskap for prøven. En bedømmelse av DU-verdier pr. forbindelse fra de beste til de dårligste er vist i tabell V. Disse resultater viser at, mens CMFr har angiogen aktivitet vis a vis CAM-analysen, har de ytterligere fraksjonater som oppnås etter prosessen som angis i figur II, større angiogene egenskaper. Under henvisning til tabell III har f.eks. katte CMFr (den første innføring) en A-verdi på 28,98, men 46,34$ av prøvene var negative. De renere, monosialogangliosider som oppnås på DEAE-kolonnen viser i motsetning en A-verdi på 34,1, der kun 39$ er negative. I motsetning til dette viser ikke-lipidfraksjoner, ogsåf ra DEAE-kolonnene, 23,6$ og 67$ negative, et fall på tross av rensingen. Til slutt og for denne sammenligning viser en blanding av mono-, di- og trisialogangliosider fra katte omentum verdier på 38,9 og kun 13$ negative.

Ytterligere sammenligninger kan trekkes fra data i tabell III. DU-verdien som vises i tabell IV og V er et brukbart hjelpemiddel for å vise virkelig effektivitet da disse verdier tar i betraktning Ikke bare A-verdien, men også prosentuale negative tilfeller. Jo lavere DU-verdlen er, jo mer effektivt er det prøvede materialet. Under henvisning til tabell VIII kan det således ses at den nye blanding av kjente gangliosider ("Supelco" mono-, di- og trisialogangliosider) og fraksjonen som inneholder felin mono-, di- og trisialogangliosider, er de mest effektive blandinger.

Disse resultater kan også vises grafisk slik det fremgår under henvisning til figurene 6-16. Disse figurer er lineære kategoriseringsdiagrammer for forskjellige stoffer. I lineær kategorisering slik dette her benyttes, blir angiogen indeks anført mot prosent negative tilfeller. Et "centroid" eller et "midlere" punkt oppnås for hver gruppe av stoffer som således føres opp og T-verdien oppnås fra en sammenligning av hver to grupper av forbindelser. Denne T-verdi er så en indeks over hvilke forbindelser som er mer effektive enn andre. Figur 3 fastlegger disse retningslinjer for T-verdien ved bruk av alle undersøkte prøver. Deretter blir i figurene 7-16 forskjellige grupper plottet mot T-verdiene. Enhver plotting til venstre for T viser håp om en angiogen blanding. Figur 16 viser de beste blandinger.

Figur 17 er inkludert for å vise et diagram av den angiogene indeks plottet mot en invertert negativ prosentual standard ved bruk av nye blandinger av kjente di- og trisialogangliosider. Diagrammet viser at den beste blanding er di- og trisialogangliosider i et l:2-forhold. Dette diagram er interessant på grunn av at kurvene som oppnås er slående like de som oppnås når antigenantistoff-kompleksdannelse plottes. Dette antyder at en kompleksdannende reaksjon ikke ulik presipitant- og agglutineringstypereaksjoner som er karakteristisk for antigen-antistoffsystemer, skjer.

De følgende forsøk viser at CMFr, beskrevet ovenfor, har in vivo-effektivitet ved angiogenese. Forsøkene angis i US-SN 642.624. Slik det fremgår og under henvisning til tabellene III-VII, har CMFr en lavere angiogen indeks og en høyere diskrimineringsenhetsverdi enn de ytterligere fraksjoner og blandinger som ble prøvet på tilsvarende måte (dvs. ved CAM-analysen). Fagmannen vil derfor se at det skulle kunne forventes at disse forsøk kan gjentas med de ytterligere fraksjoner, med forventede overlegne resultater.

Andre kommersielt tilgjengelige lipidforbindelser, ervervet primært fra Supelco og Sigma Chemical, eller levert av individuelle forskere, ble prøvet med henblikk på evnen til å Indusere angiogenese ved CAM-analysen. Disse resultater er vist I tabell VI. Fagmannen vil se at ytteligere vev,karakterisert vednærvær av lipid- og/eller gangliosidholdige molekyler, kan analy-seres på denne måte for å oppnå potensielt aktive fraksjoner lipidholdige og/eller gangliosidholdige pattedyrvev slik som lever-, hjerne- eller epitelvev, osv., så vel som plantevev og spesielt frø. Planter er kjente som gode kilder for lecitiner og angiogenetisk aktive bio- eller organosynteti-serte lecitiner kan finnes. Syntetisk produserte lipider kan også benyttes alene. Andre pattedyromentale kilder slik som porcin, bovin, ovin eller equin kan benyttes på samme måte.

Et sett forsøk ble gjennomført for å vise neovaskulerings-virkningene på det ikke-vandige 1ipidpreparat på et sete der den normale vaskularisering i vevet med hensikt var ødelagt. Voksne hunnkatter ble bedøvet med en intramuskulaer injeksjon av Ketamin ved bruk av en dose på 7 ml/kg. Hver katt ble anbragt i supin posisjon og et innsnitt gjort mellom kneet og inguinalfolden i begge bakben. Femoralarteriene ble isolert, ligert og fjernet mellom lysken og den første dype femoral-gren (Hunters kanal). Innsnittet ble lukket og hver katt underkastet umiddelbart intravenøs injeksjon av tinn(II)-klorid/Technitium-99 som fester seg til og radioaktivt merker de røde blodceller i vevet. Lokasjonen og mengden av dette radionuklid kan identifiseres ved bruk av'y-kameraunder-søkelser. På denne måte blir blodlegemer og kapillærer som bærer radioaktivt merkede røde blodlegemer spesifikt visualisert. Tinn(II)klorid/fosfatpreparatet inneholdt 10 mg natriumpyrofosfat, 30 mg natriumtrimetafosfat og 0,95 mg tinn(II)klorid. Preparatet ble rekonstituert ved tilsetning av 2,0 ml PBS og 1,0 ml av denne oppløsning ble Injisert intravenøst i kattens bronkialvene. 20 minutter senere ble en intravenøs dose av 10 m Curries Technisium-99m injisert for å radiomerke de røde blodlegemer i dette vevområdet. Nukleær bildeskannering og digital integrering av blodstrømmen ble observert og fulgt.

Etter at kattene var prepareret kirurgisk ble det gjort en "basislinje" skannering for bakgrunnsradioaktiviteten til de kirurgiske seter fulgt av injeksjon av mellom 6 og 7 ml av det kloroform/metanol-ekstraherte og fordampede viskøse, flytende lipid som er suspendert i PBS intramuskulært i like mengder til to på forhånd valgte og markerte seter på det høyre ben i det området der femoralarterien var fjernet. En placebo-injeksjon inneholdende kun PBS ble gjennomført på to tilsvarende identifiserte og merkede seter på det venstre ben. Under vanlige omstendigheter vil den erkjente respons for kroppen mot denne typen kirurgi være å søke og etablere kollateral blodsirkulering til det skadede vev ved å danne nye kapillærer og blodkar i det området der femoralarterlen er skadet. Ved å følge og å sammenligne hastighet og grad av ny blodsirkulasjon i hvert ben etter kirurgi, oppnår man en direkte og verifisebar bedømmelse av de angiogene egenskaper og kraften av det kloroform/metanol-ekstraherte 1ipidpreparat på nøyaktig måte.

Etterfølgnede intravenøs injeksjon av tinn(II)klorid/- Technitium-99m-preparatet skjedde i de på forhånd valgte seter på hvert ben og hvert ben ble underkastet nukleær skannering 3, 6 og 9 dager etter operasjonen. Resultatet av disse nukleære skanneringer er vist i figurene 18-20 som eksemplifiserer virkningene av lipidfraksjonen på neovaskula-riseringen hos en representativ katt. Disse data viser at økningen i blodkardannelsen i det høyre ben til denne katt (injisert med omental-lipidpreparatet) og den vesentlige høyere integrerte radioaktivitetstelling enn det venstre (kontroll) benet. 72 timer etter inngrepet ble det observert en differanse på 29,6$ i radioaktiviteten; 6 dager etter operasjonstiden ble det observert en økning på 38,2$ i radioaktiviteten i høyre ben sammenlignet med det venstre; og etter 9 dager viste neovaskulariseringsgraden i høyre ben en 65,8$ økning i forhold til det venstre ben. Fotografiene i figurene 18-20 gir visuelle bevis på de vesentlige forskjeller i ny blodkardannelse ved bruk av kloroform/metanol-ekstrakt-lipidfraksjonen. Et diagram som viser en lineær økning i radioaktiviteten (av tellinger) som sammenligner den 1ipidinjiserte benvaskularisering med vaskulariseringen til det saltoppløsningsinjiserte ben vises i figur 21. Disse data viser en hastighet på 0,25$ pr. time økning av neovaskulari-ser ingen i det høyre ben sammenlignet med det venstre. Dette viser klart den angiogene virkning av lipidfraksjonen, påvist ved den vesentlige økning i ny blodkardannelse og vaskulær-organisering og struktur I det høyre ben. Disse data overser imidlertid muligheten for en felles systemisk virkning ved å benytte lipidekstraktpreparatet som var vist å være virksomt ved de følgende ytterligere kontrollforsøk.

I denne ytterligere kontroll, ble ytterligere en katt operert kirurgisk for å fjerne femoralarteriene som beskrevet ovenfor. I dette tilfellet ble det imidlertid ikke gitt noen slags injeksjon, -y-kamerasveip i 3- og 6-dagers intervaller etter inngrepet er vist i figurene 22-24. Sveipet på høyre og venstre ben er vist i figur 22, der det ikke er synlig noen adskillbar differanse i nyblodkar-kollateral sirkulering etter 3 dagers varighet. Figur 23 viser et blikk forfra av et ben den 6. dag etter inngrepet og figur 24 viser det samme ben sett bakfra den samme dag. Sveipet indikerte ingen forskjeller i tellinger mellom de to ben på noe tidspunkt etter inngrepet og en meget mindre grad av neovaskularisering sammenlignet med det tidligere forsøk. Således var neovasku-lariseringen merkbar mindre i dette ytterligere forsøk enn i det venstre (kontroll) ben i det tidligere arbeid. I lys av dette og det faktum at i det tidligere forsøk viste kattens venstre ben (injisert kontroll) en relativt høyere grad av neovaskularisering (selv om vesentlig mindre enn i det høyre ben), er det en grunn til å tro at en del av 1ipidpreparatet i høyre ben muligens ble systemisk overført til det venstre i de tidligere forsøk.

In vivo-f orsøkene ved bruk av CMFr kan gjentas med forskjellige materialer oppnådd etter heksan/etanol-ekstrahering. Da en sammenligning mellom disse fraksjoner og CMFr kan gjennomføres ut fra de i tabellene III-VII ovenfor gitte data, vil fagmannen kunne konkludere at disse rensede ekstrakter ville resultere i sågar hurtigere og bedre angiogenese. Blandingene som har angiogent aktive lipidholdige molekyler er oppnådd fra pattedyrvev. Blandingene i terapeutisk effektive mengder er vist å bevirke angiogen aktivitet på en måte som tidligere ikke var ventet. Vev lik omentum slik som lipidholdig pattedyrvev og plantevev kan forventes å ha angiogene aktive molekyler også. Syntetiske lipider basert på strukturene av molekylene som viste seg å være angiogent aktive, er også omfattet.

Andre organiske oppløsningsmidler kan benyttes for å ekstrahere også omentum.

Det er også mulig å ekstrahere omentum ved bruk av andre organiske oppløsningsmidler for å oppnå aktive angiogene fraksjoner. Det skal også påpekes bruk av superkritisk gassekstrahering for omentumfaktorer slik som beskrevet i US-SN 793.622.

Her blir et superkritisk fluid, SCF, nemlig COg, benyttet for å ekstrahere omentum. Et SCF har øket oppløsningskraft ved temperaturer over det kritiske trykk., Pc, og den kritiske temperatur, Tc. Polare stoffer slik som gangliosider forblir i resten, mens ekstrakten inneholder de mer ikke polare eller lipidstoffene slik som trIglyserider. F.eks. er temperaturer som benyttes 38-39°C og trykkene er 3500 psig. Således kan disse betingelser unngå ekstrahering av toksiske materialer, toksisk eller ineffektive ekstrahering eller bruken av kostbare og tidkrevende ekstraheringer og ekstraksjons-materialer.

Det er også mulig å benytte detergenser for å isolere lipider fra omentum. Lipider fortrenges fra homogeniserte celle-membraner eller andre komplekser som involverer proteiner av amfipatiske detergensmolekyler som gjør proteinene "oppløse-lige" I vandige media. Det frigitte 1ipidmaterialet gjen-vinnes ved flotasjon etter sentrifugering.

En liste over mulige detergenser er gitt i tabellene A og B nedenfor. Disse benyttes i konsentrasjoner innen området 0,1 til 2,0$ vekt/volum og ved en pH-verdi fra 7,0 til 8,0. Kryogenteknikker kan også benyttes slik som suboppdeling av omentum i flytende nitrogen med etterfølgende bruk av det ovenfor angitte eller andre ekstraheringsteknikker. Dette er gjenstand for US-SN 811.507.

I praksis kan blandingene administreres på en hvilken som helst av de kjente standardmetoder i farmakologien med egnede bærere, kombinasjoner, inertstoffer, oppløsningsmidler og lignende. Disse metoder inkluderer intradermal, intravenøs, intramuskulær, oral og topisk administrering. Dosen eller mengden vil selvfølgelig variere fra pasient til pasient.

Uttrykkene og termene som har vært benyttet, er benyttet for å beskrive oppfinnelsen og ikke for å begrense den og det er ingen intensjon ved bruk av slike at de skal utelukke ekvivalenter av disse trekk, idet det skal erkjennes at tallrike modifikasjoner er mulige innenfor oppfinnelsens ramme.

Eksempel II

For å prøve den mulighet at angiogen ekstrakt kan fremme heling og angiogenese i et nylig myokardialt infarkt, MI, hie følgende forsøk gjennomført. 24 voksne hunder på hvilke eksperimentell akutt MI ble produsert ved ballongokklusjon (n=3) eller ligerlng (n=21) på den venstre fremre nedover-forløpende koronar-arterie. Det angiogene ekstrakt felin CMFr (n=12) eller en kontrollsalt-oppløsning (n=12) ble injisert intramuskulært daglig fra dag 1 av MI og fortsatt i 10 dager. Etter 4-5 dagers akklimati-sering, ble den følgende prosedyre gjennomført under sterile tilstander: Hjerte ble eksponert ved toraktomi etter anestesi med IV pentobarbital 74 mg/kg og hundene ble ventilert ved romtemperatur ved respirasjonspumper. Hos de første 3 hunder ble etter at perikardium var åpnet, en 3-5 mm ballongokkluder (R.E. Jones) anbragt langs en dissekert del av den fremre nedstigende koronar-arterie distalt til den første diagonale forgrening. Brystet ble så lukket og alle katetere ble eksteriorisert. Hundene ble tillatt 2 ukers konvalesens, mens de fikk en vanlig diett supplert med tabletter av NaCl 1 g/dag for å forhindre natrium-utarming. Om morgenen forsøksdagen ble 2 cm<5>felin CMFr angiogen ekstrakt eller normal saltoppløsning injisert intramuskulært. 2-3 timer senere ble ballongokkluderen blåst opp helt for å indusere myokardial infarkt både hos kontroller og dyr som fikk de angiogene ekstrakter.

Hos de neste 21 hunder ble akutt myokardialinfarkt indusert ved silkeligaturer anbragt på den venstre fremre synkende koronar-arterie i henhold til to-trinnsteknikken til Harris ("Circulation", 1, 1318 (1950)). Arterien ble dissekert og ligaturene ble anbragt ved den proksimale og distale ende av karet. En liten klemme ble festet og etterlatt hengende i 10 minutter fra den distale ende for å snevre inn karet uten helt å okkludere det. Etter 10 minutter ble ligaturene bundet inn for okkludering av karet totalt. Brystet ble så lukket som ovenfor og alle katetere ble eksteriorisert. I disse dyr var det intet behov for en 2-ukers venteperiode, slik at det akutte forsøk begynte øyeblikkelig.

Ekstrakt- eller saltinjeksjonen ble gitt daglig ved 2 cm<5>intramuskulær injeksjoner i de neste 10 dager. Ved slutten av 10 dagers perioden ble hundene avlivet med en injeksjon av pentobarbital og hjertene ble fjernet for patologisk under-søkelse. Hjertene ble skåret i tverrsnitt på omtrent 1 cm. Skiver ble undersøkt og fotografert for å registrere ny opptreden av infarktert henholdsvis ikke-infarktert område. Alle skiver ble så inkubert i 15 minutter ved 35° c i en fosfatbufret oppløsning av nitro-blå tetrazolium, NBT, som ga en intens blå flekk i en ikke-skadet del av hjertet, noe som klart oppgrenset arealene for ischemisk skade. Disse skiver ble refotografert og så fiksert i bufret formalin for ytterligere histologisk behandling. De utviklede fargemakro-fotografier ble projisert på den magnetisk tablett av en Zeiss MOP II-bildeanalysør, der de infarkte henholdsvis ikke-infarkte arealer ble sporet opp og volumet av infarktert vev ble beregnet som en prosentandel av det totale ventrikulære muskelvolum. I de med infarkter som involverte 9$ eller mer av ventrikulær myokardium, hematoksylin- og eosin-flekkede seksjoner ble fremstilt fra NBT-flekkede- (A) og ikke-flekkede- (P) regioner av myokardium og av de laterale og septale kantsoner (LB, SB) for å tillate mikroskopisk bedømmelse av tegn på skade, angiogenese, penetrering av infarkterte arealer med levende celler, cellulæreorgani-sasjon, kollagendannelse og andre kriterier på progresjon og helbredelsesgrad.

Den histologiske flekking som ble benyttet inkluderte: Hematoksilin/Eosin (HE): Flekket levende cellekjerne blått, cytoplasma rosa, døde celler intenst rødt ("eosinofilt"), røde blodlegemer røde og kollagen lys rosa.

Fibrin-trikrom, modifisert (F):

Flekket levende kjerner purpur, levende cytoplasma rødt, døde celler grått, røde legemer gule, fibrin lyserødt og kollagen grønt.

I tabell VII ser man en bedømmelse av infarktstørrelsen for hver hund.

Histologiske observasjoner

Alle hjerter ble kodet og sendt for bllndhistologistudier for å bestemme eksperimenter mot kontroll. De spesifikke histo-riske kriterier som ble benyttet ved bedømmelsen av sårhelingen i Infarkterte hundehjerter (10 dager etter koronar-arterieligering): perfusjon, vaskularisering og kollagenorganisering. 1) PERFUSJON: Et søk ble gjort med henblikk på nytt, ikke-hemolysert, ikke-koagulert blod fordelt langs gamle vaskulærkanaler i det nekrotiske senter av det infarkterte området. Disses nærvær indikerte at blodtilførselen var reetablert i vev som (ved definisjon) var dødt på grunn av et temporært fravær av blodstrøm. Et vaskulærfordelingsmønster (i motsetning til en grei diffus blødning) var viktig fordi levende, regenererende celler ble sett lokalisert langs slike vaskulærkanaler, hvis de perfuseres. Store mengder vaskulærkanaler fylt med friskt blod I det nekrotiske området og dyp penetrering av dette området med levende regenererende celler ble ansett som et positiv kriterium for optimal eller sågar akselerert sårheling. 2) VASKULARISERING: Densiteten og maturiteten for blodkar i det granulerende vev ved kantsonene mellom nekrotiske og levende hjertemuskelceller ble bedømt. En høy densitet av kar med mange vaskulære profiler viste en multisjiktet karvegg og foki av kapillarer som viste et hemangiomlignende mønster ble ansett som positive indikatorer på den vaskulære komponent av sårhelingen, eller angiogenese. 3) KOLLAGENORGANISERING: Ved kanten av infarktene syntes det regenererende vev meget cellulært; etter hvert som cellene produserer kollagen blir disse arealer med fibrillære enn cellulære og oppnår strekkstyrke på denne måte. Predominans av sterkt organiserte fibrillære områder i forhold til de cellulære i periferien av infarktet ble bedømt som en indikator på en avansert komponent av sårhelingsprosessen.

Disse kriterier ble benyttet kun i denne kontekst og som en del av en total patologisk-anatomisk bedømmelse av helingsprosessen av to erfarne kardiovaskulærspesialister.

De ikke-utgitte transkripter av de opprinnelige patologi-rapporter er som følger, inkludert en generell beskrivelse av disse med en viss beskrivelse av generelle foto av hjerter, sammen med en serie av mikroskopi-beskrivelser som henviser til en serie mikrofotografler (hundene 1-8), og mikroskopi-beskrivelser (hundene 9-24).

Hvert individuelle avsnitt og så det generelle inntrykk for hele hjertet ble bedømt som følger, basert på graden av perfusjon, neovaskularisering og kollagenisering:

(1) dårligst heling, må være ubehandlet

(2) ingen overbevisende endring, høyst sannlig ubehandlet (3) - en viss endring, men kunne like gjerne være vanlig variasjon, sannsynligvis ubehandlet (3) helt usikkert, det kan ikke sies noe om behandling eller ikke behandling (3) + endringer tillater fagmannen kunn å gjette, kan være behandlet (4) avansert heling basert på flere kriterier, sannsynligvis behandlet

(5) imponerende akselerering, må være behandlet.

Hund 1 9638 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 1

Generell beskrivelse:

Nytt hjerte med ballong In situ i LAD.

Overflate glatt og glitterende.

Blekt areal 1 anterlør LV og apeks.

Ved kutt er det et godt avgrenset anteriørt-lateralt infarkt-område som vanligvis er rødt, som ikke flekker med nitro-blått tetrazolium (NTB), og antyder 19$ av muskulærvolumet (dvs. 19$ av de totale tverrsnittsarealer på alle seks 1 cm kutt gjennom begge ventrikler var ikke-blå = ikke levende).

Generelle foto:

1. Frontsikt, nytt hjerte

2. Friske kutt gjennom begge ventrikler

3. Det samme etter NTB-reaksjon (blått = ikke-infarktert, brunaktig-rødt = infarktert) 4. Det samme etter fiksering og fjerning av prøver for histologi:

P = ikke-infarktert areal (posteriørt)

L = grensesone (lateralt)

A = middel av infarkt (anteriørt)

Mikroskopisk beskrivelse:

Prøve P (posteriørt)

Foto 5: Lengdesnitt viser lett kongestert, men ellers

normalt myokardium.

Foto 6: Tverrsnitt viser det samme.

Foto 7: Høykraft av NTB positivt levnede myokardium.

NTB-flekker kun de mest overfladisk liggende celler.

Prøve L (lateralt)

Foto 8: Få fibrocellulære flekker tilstede.

Prøve A (anterlør)

Foto 9: Lav kraft, nekrotisk myokardium, hemoragisk infarktgrense og periferal fibrocellulær organisering.

Foto 10: Senter av infarkt viste nekrotisk muskel med ekstensiv hemoragi, ingen cellulær organisering.

Foto 11: Hemoragisk og kongestert grenseflate mellom død

muskel og organiserende fibroblaster

Foto 12: Detalj, senter av Infarkt, intet levende vev,

inten organisering, meget hemoragi og hemolyse.

Foto 13: Detalj av fibroblastisk organisasjon.

Foto 14: Arterioler, mikrohemoragi, nekrotisk myokardium

og organiserende fibroblaster.

Foto 15: Lengdesnitt gjennom partielt bølgede, nekrotisk myokardiale celler med inflammatoriske celler, ekstravasert blod og leilighetsvis fibroblaster, nær sentrum av infarktet.

Hund 2 10585 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 2

Generell beskrivelse:

Nytt hjerte med ballong in situ i LAD.

Ingen signifikante epikardiale endringer.

Snitt viser små flekkede arealer som kun er partielt NTB negative i et sirkulært, midtmuskulært mønster og på en papillærmuskel. Anslagsvis er 4$ av alle tverrsnittsarealer NTB negative (dvs. ikke-levende).

Generelle foto:

1. Frontal blikk av friskt hjerte.

2. Nye kutt, homogent brune (hvitaktige flekker på den største skive er en del av ventilringen ved hjertebasen). 3. Det samme etter NTB-flekking, ikke-flekkede arealer knapt synlig. 4. Det samme etter fiksering og fjerning av prøver for histologi (fra kutt akkurat over blåmerkelappene). Svakere NTB-flekking synlig noen steder.

Mikroskopisk beskrivelse

Prøve P (posteriør)

Foto 5: Kuttoverflate av i det vesentlige normalt myokardium som viser positiv NTB-reaksjon (levende celler, blåaktige reaksjonsprodukter) i det øverste cellesjikt.

Foto 6: Tverrsnitt gjennom i det vesentlige normalt myokardium. Røde "flekker" representerer kapillærer som er fylt og leilighetsvis overfylt med røde legemer, noe som indikerer mild kongestering.

Foto 7: Det samme som 6, I lengdesnitt.

Prøve L (lateral)

Foto 8: Lavenergioverblikk som viser store arealer av lett kongestert, men ellers normalt myokardium.

Prøve A (anterlør)

Foto 9: Lavere energioverblikk av i det vesentlige

normalt myokardium.

Foto 10: Høyenergi viser leilighetsvis eosinofile ("pinkers") myokardialceller som antyder indi-viduell celleskade.

Hund 5 10597 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 5 (7$ NTB)

Generell beskrivelse:

Friskt hundehjerte med ligert LAD.

Lite arr ved ligeringssetet.

Flekket blekhet av anterlør apikaloverflate med mørke overflatearealer.

Generelle foto:

1. Nytt hjerte, frontblikk, ligaturarr synlig i LAD, ikke- bleke, mørke flekker på anterlør- eller apikalventrikkel-overflaten.

2. Friskt hjerte sett bakfra.

3. Friske snitt gjennom myokardium. Bemerk at anterlør- A og posteriør- P sidene ikke alltid er orientert i samme

retning.

4. NTB-reaksjon på friske snitt.

A=front anterlør;

P = posteriør.

5. Samme etter fiksering og fjerning av histologiske prøver.

P = posteriør

L = lateral

A = anterlør

Mikroskopisk beskrivelse;

Prøve P (posteriør)

Foto 6: I det vesentlig normal myokardium som longitudi-nelt er seksjonert med arterioler og kapil-larler.

Foto 7: Høyenergitverrsnitt.

Foto 8: Høyenergitverrsnittssnitt av den samme. Bemerk mitose (? endotelialt) ved pilen.

Prøve L (lateral)

Foto 9: Akutt og kronisk perikarditis, epikardialt fett,

nerve og kar, ikke påvirket subepikardialt myokardium.

Foto 10: Oblikt snitt gjennom i det vesentlige normalt

myokardium. Bemerk kapi1larmønsteret.

Foto 11: I det vesentlige normalt myokardium i lengdesnitt .

Prøve A (anterlør)

Foto 12: Akutt og kroniske perkardititt med utstrakt vaskularisering. Vanlig koronar-arterie. Organisering av myokardialinfarkt.

Foto 13: Nekrotiske myokardium (røde flekker), cellulær-organisasjon med fibroblaster, blodkar, og noe kollagen (rosa). KalsifIkering (blå flekker). Endokardium ved pilen.

Foto 14: Detalj av en i det vesentlige cellulær (fibroblastisk) organisering. Tilbakeblivelse av nekrotiske myokardium ved pilen. Mikrohemori i sentrum (individuelle ekstravaskulære røde legemer ).

Hund 6 10594 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 6 (9$ NTB)

Generell beskrivelse:

Friskt, relativt lite hundehjerte, ligatur in situ ved LAD, petedinal epikardial hemoragu@I langs LAD.

Bleke, mørke flekker på den fremre overflate mot apeks.

Generelle foto:

1. Frontblikk av frisktsikt hjerte med LAD ligert.

2. Bakblikk av samme.

3. Friske myokardialsnitt

A = anterlør, P = posteriør

4. NTB-reaksjon på friske snitt.

Bemerk klar påvisning av infarkt.

Mikroskopisk beskrivelse:

Prøve P (posteriør)

Foto 5: I det vesentlige normalt myokardium i

lengdesnitt.

Foto 6: Enkel liten fokus av fibrose og nekrotiske myokardialceller.

Prøve L (lateral)

Foto 7: Tverrsnitt gjennom levende myokardium av lateral ventstre ventrikulærcelle. Positiv NTB-reaksjon

synlig som "blå cellulærflekk I hjørnet. Kapillarene er prominente og fylt eller overfylt med røde legemer (røde flekker). Arterioler viser fortykkede eller hyperplastiske vegger.

Foto 8: Markert fortykkede arteriolare vegger og

kapillær kongesjon.

Foto 9: Utstrakt glattmuskel-hyperplasi av arterieveggen og kongesterte kapillarier. Tverrsnitt av muskelceler i det vesentlig normalt.

Prøve A (anterlør)

Foto 10: Akutt og kronisk perikaditt, normal koronar-arterie, total infarktert myokardium.

Foto 11: Sentrum av infarkt, tynne, nekrotiske myo-kardialfibre (uten nukleær flekking), minimal reaksjon bortsett fra få disintegrerte poly-morfonukleære leukocytter i blå periferi. Ingen vaskularisering i dette kontrollareal.

Foto 12: Perifert areal av infarkt med nekrotisk myokardium, partielt innfiltert av polymorfer. Organiserende granuleringsvev er for det meste cellulært (fibroblaster) med noe tidlig kollagen og vanlig grad av vaskularisering.

Foto 13: Nekrotisk myokardium nær sentrum av infarkt, og disintegrerende polymorfer, noen ekstravaskulære røde celler, ingen nye kar.

Foto 14: Meget aktivt og cellulært organiserende areal ved infarkt periferien. Få nekrotiske muskelceller, predominans av aktiverte fibroblaster, røde celler inne i og utenfor kapillarene, få polymorfer.

Foto 15: Meget fibrøst areal av organisering, hovedsakelig kollagen. Predominante celler er aktiverte fibroblaster. Karene er tykkveggede arterioler og venuler uten meget kongesjon og uten prominente kapillarer.

Hund 7 10598 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 7 (23$ NTB)

Generell beskrivelse:

Friskt hundehjerte med ligert LAD. Mikrohemorager, overflate-blekhet og mørkhet langs LAD. Apikalgult areal demarkert med rød, hemoragisk kantsone.

Generelle foto:

1. Frontblikk, ny prøve med ligatur av LAD og epikardiale, apikale og anteriøre endringer. 2. Sett bakfra, noe lateral apikal blekhet. Hvitaktig uklarhet i perikardium. 3. Frisk myokardialsnitt. Bemerk graden av mottlede gul-røde infarkterte arealer. 4. NTB-reaksjon. Bemerk den totale infarktering (gulaktig rød), mildt ischemiske (?) soner (brunaktig blåe) og

normal sone (blå). Kun total infarkt ble mål.

5. Det samme etter fiksering og fjerning av histologie prøver.

Mikroskopisk beskrivelse:

Prøve P (posteriør)

Foto 6: Ikke påvirket myokardium, lengdesnitt.

Prøve L (lateral)

Foto 7: Akutt og mild kronisk perikonditis, normalt koronarvev, fibrøs og cellulær organisering, hemoragisk kantsone, få polymorfer og nekrotisk myokardium i typisk sjiktdannelse.

Foto 8: Typisk blikk av en kantsone mellom død muskel (rød) og et reaktivt organiserende granuleringsvev. Noen kar penetrerer inn i det døde vev (pilen), men ikke i full dypde. Det er lite polymorf reaksjon (dvs. ingen merkbar blåaktig kantsone) og på dette sted er vaskulariseringen av granuleringsvevet ikke overveldende. Det er liten ekstravasering av røde celler og ingen hemoragi eller kongestert randsone.

Foto 9: Forskjellige organiserende arealer viser mindre nekrotisk muskel, mer vaskularisering, mer hemoragi enn arealet på foto 8; det er også en fokus på kalsifikeringen (blått).

Foto 10: Totalt nekrotisk myokardium, nær senter av infarktet med noen disintegrerende polymorfer, sparsommelig rundt cellene, ekstravaskulære røde celler, og de mest avanserte levedyktige blodkar.

Foto 11: Nekrotisk muskel ved organiserende sone,

partiell fibroblastisk organisering, partiell hemoragi i dødt vev.

Foto 12: Tilsvarende foto 11 med fokus på kalsifikering.

Røde celler er Inne i og utenfor blodkarene.

Foto 13: Typisk aktiv cellulær organisasjon ved randen av nekrotisk myokardium. Ekstravasering av individuelle røde celler er klart synlig. Gjenværende nekrotiske muskelceller omgis av aktive fibroblaster .

Foto 14: Detalj av kalsifIkering og blødning i organiserende vev.

Foto 15: Typisk organiserende mønster med fibroblaster.

Hund 8 10595 Patologisk-anatomisk bedømmelse av hundehjerter

Hund 8 (16$ NTB)

Generell beskrivelse:

Frisk hundehjerte med LAD-ligatur. Epikardial hemoragi; blek og mørk overflate anteriørt og apikalt.

Generelle foto:

1. Frontblikk, frisk prøve, med LAD-ligatur, mørk, blek overflate anteriørt-apikalt og rød subepikardial blødning.

2. Sett bakfra, blek lateral apeks.

3. Friske myokardiale snitt. A = anteriørsiden (med infarkt). 4. NTB-reaksjon på friskt myokardium. A=antiriørsiden (med infarkt). 5. Samme etter fiksering og fjerning av histologiske prøver:

A = anteriørt

L = lateralt

P = posteriørt

Mikroskopisk beskrivelse:

Prøve P (posteriørt)

Foto 6: I det vesentlige normalt myokardium, skåret i tverrsnitt.

Prøve L (lateralt)

Foto 7: I det vesentlige normalt myokardium, lavener-getisk, med penetrerende arterier, arterioler og kapillarer.

Prøve A (anteriørt)

Foto 8: Kant av nekrotisk og organiserende vev i det infarkterte areal. Typisk fibrocellulær organisering, moderat vaskulær, ingen blødning; meget få polymorfer.

Foto 9: Perikardium med akutt og kronisk perikarditt.

Bemerk markert vaskularitet rundt celleinfil-tratet og underliggende nekrotiske myokardium.

Foto 10: Organiserende vev med uvanlig prominens av arterioler og andre blodkar.

Foto 11: Fokus av kalsifikering i avanserte, kollagene og cellulære fibrotiske organiserende vev, konsistent med tidlig arrdannelse.

Hund 514 Hund 9

Slide 993: Posteriør kontrollsegment

Ikke bemerkbart myokardium

Intet spesielt vaskulært mønster.

Slide 932: Anterlør, senter infarkt

Totalt Infarkt med god perfusjon av gamle kanaler med et typisk mønster og ingen reaksjon av levende celler.

Bedømmelse: Ekvivokal

Slide 934: Lateral kant

Meget cellulær reaksjon med god innvekst av levedyktige celler i dødt areal. Perivaskulære arealer viser maturkollagen. Mange polyer tilstede.

Store flekker av reaktive fibroblastiske celler også innleiret i nærliggende ikke-infarktert myokardium.

Bedømmelse: Øket aktivitet, vil kunne behandles.

Total bedømmelse: Kan sannsynligvis behandles. (Bemerk: mest basert på kantsonen; senter av infarktet mindre overbevisning ved nærmere studium.) Bedømmelse = 4.

Hund 333 Hund 10

Slide 935: Posteriør, kontroll segment uten infarkt

Normalt myokardium.

Slide 936: Lateral kant

Infarktert del Ikke på sliden.

Myokardium ikke bemerkbart.

Bedømmelse: Ikke anvendbart.

Slide 937: Senterinfarkt, anteriørt.

Dødt areal dårlig perfusert.

Cellulær innvekst ikke meget avansert. Arealer med kollagen sjeldent, lkke-modent.

Vaskularitet av granuleringsvevet varierte Bedømmelse: Må være kontroll.

Totalbedømmelse: Ikke-behandlet; må være kontroll

Bedømmelse = 1

Hund 683 Hund 11

Slide 938: Posteriørt kontroll segment ubemerkelig, intakt

myokardium. Intet spesielt vaskulært mønster.

Slide 939: Lateral vegg, randsone

Aktiv perfusjon

Død muskel helt penetrert av levende celler som følger kanaler.

Høy cellularitet og vaskularitet av regenererende vev.

Høyst avansert kollagen foreligger i tykke bunter med relativt få gjenværende celler, men arealet mellom er fremdeles meget cellulært;

liten fokus på kalsifikering

Bedømmelse: så avgjort behandlet.

Slide 940: Anteriørt, sentralt infarkt.

Utstrakt reperfuseringsmønster av gamle kanaler. Levende celler penetrerer dypt inn i dødt areal. "Bildebok" intensiv regenereringsmønster.

Noen men ikke regenereringsarealer med høy vaskularitet og mature kar.

Kollagen avansert kun i periferien; noe av den døde muskel hadde også en grønnaktig farge ved denne flekking.

Bedømmelse: Definitivt behandlet.

Slide 956: Rekutt; septal kantsone, slide #4

Meget aktiv regenerering, kvalitativt tilsvarende 939

Bedømmelse: behandlet

Slide 957: Kutt #5, senterinfarkt (anteriørt), kuttet omigj en.

Meget aktivt brytende mønster.

Har arealer til vaskularitet som minner om mønsteret av hemangiomer.

Bedømmelse: Behandlet

Slide 958: Ytterligere kutt av kutt #6, anterlør (senter-inf arkt )

Bedømmelse: Behandlet

Totalbedømmelse: Så avgjort behandlet (mest aktiv i denne gruppe av de fem hunder 9-13). Bedømmelse = 5.

Hund 633 Hund 12

Slide 941: Posteriør kontrollsegment: ikke merkbar.

Slide 943: Anteriørt, sentralt Infarkt.

Noen arealer med meget god perfusjon av gamle kanaler, men andre utilstrekkelig; mer polyer og uklart støv enn vanlig både i kanalene og periferien.

Regenererende celler tilstede, men ikke følgende kanaler vesentlig langt.

Nye kanaler tilstede.

Noen tykke strenger av kollagen nær dødt vev.

Bedømmelse: Ekvivokal

Slide 942: Lateral rand.

Lite areal med ekstensivt infiltrat av Inflammatoriske runde celler og høy vaskularitet, men ikke mye reparasjon.

Bedømmelse: Ikke typisk, diskuterbar. Betennelse?

Slide 959: Lateral rand av infarkt, kutt #4

Ekstensiv akutt og kronisk perikardititt. Avansert heling, meget cellulær og meget vaskulær.

Dog nekrotiske, partielt perfuserte arealer umiddelbart ved siden av.

Kollagen rimelig avansert, men grønt er overflekket på enkelte steder.

Bedømmelse: Kan behandles

Slide 960: Septal rand, kutt 4

Florid perikardititt.

Aktivt helingsmønster, men fremdeles relativt store nekrotiske områder.

Bedømmelse: Kan behandles, men betennelse gjør bildet uklart.

Slide 961: Senterinfarkt, anteriørt, kutt 2.

Stort dødt areal, ofte dårlig perfusert.

Mange polyer og uklart støv.

Regenerering kun i en liten kant, ikke meget aktiv.

Store tromboserte kar i sentrum.

Bedømmelse: Inflammatorisk, ingen behandlingsvirkning er kjent.

Slide 962: Senterinfarkt, anteriørt, snitt 1

Meget nekrotisk, liten erkjennbar aktivitet.

Bedømmelse: Sannsynligvis ikke behandlet.

Totalbedømmelse: Sannsynligvis ikke behandlet.

Bedømmelse = 2

Bemerkning: Ved tilbakeblikk på ytterligere snitt (etter opplysninger om koden) kan aktiviteten ha vært opprinnelig underbedømt; prøven er uvanlig og vanskelig å avlese på grunn av nærværet av mange flere akutte Inflammatoriske celler enn vanlig. Snittene 943 og 960 ville sannsynligvis bli bedømt til å ha vist behandlingsvirkninger, hvis de ble betraktet igjen som ukjente.

Hund 323 Hund 13

Slide 944: Posteriør venstre ventrikkel: ikke-infarktert kontrollsnitt

Ikke bemerkbar.

Slide 945: Lateral rand, venstre ventrikkel.

Flekket, ofte båndlignende avbrudd av nekrotiske arealer ved regenererende vev.

Perfusjon av gamle kanaler so-so

Maturitet av regenererende vev og kollagen-gj ennomsnitt.

Vaskulariteten høy

Bedømmelse: Kan være behandlet.

Slide 946: Anteriørt, sentrum av infarkt.

Relativt konsistent perfusjonsmønster I alle nekrotiske arealer, men ikke for overbevisende I detalj.

God oppfølging med sikkel-celler.

Vaskularitet og kollagenmatureringsgjennomsnitt.

Bedømmelse: Muligens behandlet, men liten virkning.

Slide 963: Lateral rand, snitt #4

Moderat, middels regenerativ reaksjon.

Bedømmelse: Ekvivokal

Slide 964: Septal rand, snitt 4

Intensiv cellulær og vaskulær reaksjon.

Kollagen ikke fremskreden, imidlertid

Perfusjon av dødt materiale i gjennomsnitt, men mange individuelle islett av levedyktige celler er tilstede.

Bedømmelse: Kanskje

Slide 965: Anteriørt, senterinfarkt, snitt 5

Noen arealer med overbevisende penetrering av levedyktige celler.

Ellers ekvivokal.

Bedømmelse: Gjennomsnitt.

Slide 966: Anterlør, infarktert, snitt #6

Meget god penetrering av levedyktige celler. Meget cellulær reparasjon uten meget maturt kollagen.

Vaskularitet gjennomsnitt.

Bedømmelse: Kan behandles.

Totalbedømmelse: Ansett som behandlet, men med svak virkning ("fagmannens gjetning").

Bedømmelse = 3+

A = anterlør og antall snitt

S = septal

SB = lateral rand

LB = lateral rand - x foto

Hund: 71098. 12$ infarkt Hund 14

1001 A3

Ikke alle seksjoner infarktert.

Intet dødt vev, ingen revitaliserte kanaler; lite polyer.

Løs tidlig fibrose, vaskularitet ikke impressiv.

1002 lateral L3

I det vesentlige vanlige myokardium; intet infarkt, ingen reaksjon.

-- Se LB lateral rand

1003 septal S3

Intet infarkt.

1004 A2

Små arealer av totalt, ikke-fjernet infarkt. Kanaler delvis benyttet.

For det meste cellulær reaksjon med makrofager. Vaskularisering av reaksjonen er moderat totalt. Kollagenisering moderat fremskreden.

Perfusjon relativt dårlig.

1005 Lateral rand LB2

Meget lite dødt materiale tilbake.

Liten utnyttelse av kanaler 1 dødt materiale.

Godt cellulært granuleringsvev, men ikke impressivt vaskulært.

Dårlig oppfølging av kanaler av fibroblaster, men det er en viss sammenknytning i de levedyktige muskelarealer. Kollagenisering ikke langt borte.

1006 Apeks Al

Ikke infarktert

1007 Lever

KongesterIng

Mild fokal fettveksling eller glykogen.

1008 Muskelinjeksjonssete

Perfekt normal skjelettmuskel.

1009 Muskelkontroll

Vanlig skjelettmuskel, dårlig sekresjon

Totalt inntrykk av hund 14: må være en kontroll Bedømmelse = 1

Hund: 11024. 16$ Infarkt Hund 15

1010 Fremre A3

Målbart dødt areal med lett over middels bruk av gamle kanaler.

Fremskreden kollagen organisering fra epikardium (stort sett hvit kant) som interdigiterer med levende og døde muskelfibre.

Spredte foki av myksomatøse løse tidlige konnektive vevveier i dødt areal, med leilighetsvis mikrohemorager, svakt grønt tidlig kollagen.

Neovaskularisering i disse områder er prominent med kollagen rundt hver arteriol.

Bedømmelse: viser tegn på behandling.

1011 LB lateral rand

Smal kant av cellulær og løs kollagen organisering. Visse makrofager.

Vaskularisering ikke imponerende.

Nærliggende muskler ikke bemerkbar.

Meget få Individuelle døde fibre.

Bedømmelse: Ingen imponerende total "virkning", men området

var for lite.

1012 Septal rand 3, SB3

God sjiktdannelse fra død muskel til cellulær til fibrøs regenerering til normal muskel.

Kanal ny-benyttelse prominent i dødt areal.

Cellulær reaksjon er vigorøs, men ikke langtrekkende. Relativt godt dannet kollagen, men ikke overveldende totalt.

Vaskularitet ikke Imponerende, men over gjennomsnitt. Grønn er overflekket.

Bedømmelse: ekvlvokal

1013 Fremre A2

For det meste død muskel med små (hvit) kant peri-kardialt.

Prominent kanal-reperfusjon.

Vigorøs cellulær regenerering, men ikke for mye interdigitering.

Fremskreden matur kollagen organisering. Subepikardial prominent vaskularisering i et hjørne.

Bedømmelse: meget sannsynlig behandlet

1014 Anterlør Al

Få spredte døde fibre tilbake, ingen gamle kanaler. Meget tett cellularitet rundt dødt materiale. Fremskreden og sterkt organisert fibrocellular regenerering med maturt kollagen.

Liten rand med originalt levedyktig muskel. Vaskularitet i cellulære arealer er overveiende, men synes allerede å forsvinne de fleste kollagene deler. Epikardial avansert kollagent arr.

Bedømmelse: avansert helbredelse, sannsynligvis behandlet

1015 Lever

Enhetlig fettlever (eller glykogen?) med meget akutt kongestering.

1016 Muskel, injeksjonssete

Delvis skjelettmuskel, delvis fett

Ingen reaksjon.

1017 Muskel, kontroll

Identisk den ovenfor angitte, også med fett.

Totalbedømmelse hund 15: Sannsynligvis behandlet,

bedømmelse = 3+

Hund: 10824. 16$ infarkt Hund 16

1018 A3 anterlør

Meget dødt materiale.

Moderat kanal-reperfusjon.

InterdigisterIng av regenereringsceller langs kanaler som er tilstede, dog ikke overveldende,

idet regenereringsvev mere cellulært enn fibrøst. Vaskularitet middel på det høyeste.

Bedømmelse: kan eventuelt være behandlet

1019 LB3

Dårlige seksjoner, skåret opp igjen

Virkningen synes ikke ekstraordinære.

Lite dødt materiale.

Meget fibrose, relativt løst med midlere mengde av kar og celler.

Bedømmelse: utilstrekkelig

1020 SB3

Imponerende reperfusjon av et lite dødt areale. Løst til medium organiset regenererende vev.

Små foki av over midlere vaskularitet.

Maturasjon av kollagen er Ikke imponerende.

Bedømmelse: noen tegn på behandling, men svake.

1021 A2 anterlør

Store nekrotiske soner med god reperfusjon (av døde kanaler) av levende eller. Få polyer.

Cellulært organisert vev med lett øket vaskularitet;

noen meget prominente tykkveggede arterioler. Kollagenutvlkling moderat til fremskreden.

1022 Al anteriørt

Cellulært regenereringsvev interforbundet med normal-fibre. Intet dødt materiale.

Total organisering fremskreden med mange prominente tykkveggede arterioler.

Foki av meget maturt kollagen og reduserte cellula-ritetsbeholdere både for foto på "fibrin"-flekking og noe mindre på PTAH-foto.

Bedømmelse: Visse tegn på behandling.

1023 Lever

Utstrakt kongestering av både hemolytisk og friskt blod. Alle celler ballongerende (fett eller glykogen eller begge deler).

1024 Muskelinjeksjonssete

Negativt

1025 Muskelkontroll

Negativ. En stor arterie og en nerve er også helt og holdent normalt.

Total oval hund: Sannsynligvis behandlet, men ikke med maksimal effekt.

Bedømmelse 3+

Hund: 75356. 15% infarkt Hund 17

1026 A3 anterlør

Små områder av død muskel meget aktivt perfusert;

subinndelt i flekker ved aktivt voksende regenerativt vev; synes også løsnet.

Aktivt og meget vaskulært regenererende vev med langt fremskreden fibrøs organisering på diverse steder og meget cellulære og vaskulære punkter annensteds.

Et punkt synes som hemangiom.

x foto Bedømmelse: definitivt behandlet

1017 Lateral rand LB3 (tredje snitt)

Tilsvarende 1026, med noe Intakt muskel som ikke viser endret antall og fordeling av kar.

Det hele ligger i det regenererende vev ut fra de foreksisterende kar og epikardium.

Bedømmelse: definitivt behandlet

1028 SB3 septalrand

Interessant areal av fragmentering av dødt materiale ved perfusert og ikke-perfuserte kanaler.

Heftig aktiv vaskulær regenereringsvev med diverse kollageniserte arealer og meget prominente kar. Tykkveggede arterioler er prominente.

Igjen er ikke-involvert muskel absolutt helt ikke bemerkbar.

Hel HE-fibrin flekker godt

Bedømmelse: som ovenfor

1029 Posteriør P3

Visse subepikardiale flekker av fibroblaster (alder?, generelle ischemi?, aktivering av behandling av spontane ischemiske lesjoner?)

1030 A2

Stort infarktert areal 1 den aktive reperfusjon og god interdigitisering av levende regenererende celler. Mikrohemoragi tilstede.

Vaskularitet av omgivende fremskreden regenererende vev er øket.

Flekker av maturt kollagen er små, perifere.

Bedømmelse: definitivt behandlet.

1031 Al

Flekkede døde soner; perfusjon av kanaler tilstede, men ikke så regulære som andre snitt.

God interdigitering mellom stridende nekrotisk materiale og regenererende levende celler og kar.

Noe maturt kollagen, men hovedsakelig

Bedømmelse: behandlet

1032 Lever

Utpreget klaring og ballongering av celler

1033 Muskelinjeksjonssete

Ingen signifikant reaksjon

Total bedømmelse av hund 17: Definitivt behandlet med god virkning, Bedømmmelse = 5

Hund: 11378. 2% infarkt Hund 18

1034 A3

Perfusjon av gamle kanaler positiv

Nekrotisk materiale bryter opp

Aktivt, vaskulært regenereringsvev med avansert organisering.

Bedømmelse: behandlet

1035 Lateral rand tredje snitt LB3

Tilsvarende; lite dødt vev; kar ikke så overbevisende

Bedømmelse: behandlet (sannsynligvis)

1036 Septal rand

Ser ut som hemangiom, selv om noe kan være mikrohemoragi Et punkt (pil): tett akkumulering av kar uten blod

foto

1037 A2

Som i A3, alle kriterier på behandling er tilstede Bedømmelse: behandlet foto

1038 Al

Det ser virkelig ut som om karene bryter opp det gjenværende døde materiale; hverken polyer eller makrofager er prominente.

Enzymflekking en nødvendighet

Bedømmelse: behandlet, så avgjort

1039 Lever

Meget kongestert og partielt hemoragisk, men lite av det balllongdannende klare cellefenomen.

1040 Muskel, injeksjonssete

Noe utvidet interstitium, ellers vanlig

1041 Muskelkontroll samme

Totalbedømmelse hund 18: behandlet med god, men ikke stor virkning, bedømmelse = 5

Bemerk: Den generelle infarktstørrelse for liten, men kan det være en ytterligere effekt av behandlingen? (MÅ kjenne infarktstørrelsen ved begynnelsen av forsøket).

Hund: 11653. 31$ Infarkt! Hund 19

Al Anterlør. snitt en (sentrum av Infarkt)

Nekrotisk sone med subendikardialt og subepikardialt granuleringsvev

- Død: Store kanaler perfusert, men Ikke kapillærer.

- Granuleringsvev ikke fremskredet, ikke for mye vaskulært. - Fibroblaster penetrerer ikke langt inn i nekrosen langs kanalene

- Få polyer, subepikardialt, når ikke nekrosebrønnen

- Kollagen, rimelig godt utviklet, kun perivaskulær og subendokardial - Fibrin: (på PTAH) noe fibrinøst perikarditt, ikke meget intravaskulært.

Bedømmelse: et umerkbart helingsmønster, dårlig perfusjon

A2 Anterlør. snitt to (sentrum av infarkt)

- Meget tilsvarende Al, hovedsakelig nekrotisk med meget liten kant av granuleringsvev.

- Noe kalsifisering.

- Dårlig penetrering av dødt vev av cellene; hverken mange polyer eller mange fibroblaster. - Intet godt perfusjonsmønster; noe tilstedeværende intravaskulært fibrin

Bedømmelse: dårlig heling, utilstrekkelig reaksjon, må være

kontroll

A3 Anterlør, snitt tre

- Som Al og A2. Noe interstitielt fibrin.

Bedømmelse: Kontroll

SB3 Septal rand, tredje snitt

Utstrakt, lkke-perfusert nekrose, få polyer, noe dls-Integrerlng til "nukleært støv".

Flekker av granuleringsvev som inneholder heller tette

og relativt mature kar.

Skarp demarkasjon til totalt inert, normal muskel,

ingen øket vaskularisering eller perfusjon i levende del av randsonen (best på PTAH)

Kollagen ikke avansert; noe fibrin i døde sidekar av randen.

Bedømmelse: Dårlig heling på tross av noen tette, mature kar

B3 Lateral fri vegg med infarkt randsone

Et enkelt felt i dødt vev viste øket perfusjon, resten er dårlig perfusert og dårlig penetrert av levende celler; spesielt få polyer.

Det er en viss interdigitering mellom nekrotisk

materiale og granuleringsvev, men ikke overbevisende.

Vaskularitet av granuleringsvevet er moderat.

Kollagen er maturt kun rundt et stort på forhånd eksisterende kar, reaksjonen totalt er fremdeles meget cellulær med lite kollagen

Skarp rand mot levende muskel, som synes normal Bedømmelse: liten effekt

Totalt hund 19: kontroll (selv om man tar i betraktning at dette dyr hadde det største infarkt så langt). Bedømmelse = 1

Hund: 10852. infarkt Hund 10

Al Anterlør. snitt en

- Lite nekrotisk vev, totalt interdigiterende med levende celler, kar, men lite blod (god for foto av dette aspekt) - Heller granulært vaskuleringsvev, mer cellulært enn kollagent - En meget vaskulær flekk av løs fibrose, totalt omgitt av normalt vev (mikroinfarkt?) - Kollagen langt fremskredet og tett selv 1 nærhet av de få gjenværende døde fibre

foto

Bedømmelse: meget aktivitet og fremskreden heling

A2 Anterlør. snitt to

- Perfusert nekrotisk vev med god innvekst av individuelle levende celler, cellestrenger og kar.

- Avansert kollagenering

- Meget vaskulær med variert trinn av vaskulær vegg-maturering; imidlertid ingen uvanlig tette akkumu-ler ingsf lekker .

A3 Anterlør. snitt tre

(Dette nivå tilsvarer det ene som ble brukt ved tidligere bedømmelser. ) - Totalt døde arealer vanskelige å finne; så å si alt er enten perfusert eller avbrutt med regenererende celler

- Aktivt utseende granuleringsvev

- Kollagen er tett kun på subendokordiale og pervaskulære steder, men blekt positive flekker penetrerer gjennom nekrotisk areal - Leilighetsvis perivaskulært fibrin rundt vaskulære kanaler som går gjennom dødt materiale

Bedømmelse: sannsynligvis ikke behandlet

SB3 Septal rand

- Vidt areale av ekstensiv Interdigitering av dødt og regenererende vev, meget vaskulært - Det gjenværende av dødt vev synes perfusert, selv om det ikke kan erkjennes noe kapillærmønster. - Utvalgte arealer viser "opphoping" av vakr, tynn- og tykkveggede ("hemangiomatøse"?) - En meget usikker økning i perfusjon av levende muskel. - Arealer med maturt kollagen lett å finne.

Bedømmelse: behandlet

LB3 Lateral rand, snitt tre

- Tilsvarende SB3

- Ever kapillærprofilt i det levende vev har en lesecelle i seg; muligens øket perfusjon?

uten økede kar der?

- Kollagent heller maturt; omgir på steder Individuelle levende muskelfibre! Følger kar og celler langt inn i nekrosen

Bedømmelse: fremskreden respons

Totalt hund 20: meget sannsynlig behandlet

Bedømmelse = 4

Gavras 10557. 21$ infarkt Hund 21

Al Anterlør. snitt en

- Stor trombus (mural) med organiserende fibrin.

- Intet kapillærmønster i nekrotiske arealer.

- Midlere aktivitet av granuleringsvev.

- Kollagen ikke veldig tett.

- Vaskulariteten tett, men Ikke meget matur, i flere ormåder.

Bedømmelse: ekvlvokal

A2 Anterlør. infarkt senter

- Nekrotisk materiale partielt perfusert, men store arealer totalt avskåret. - Uvanlige mengder polyer penetrerer meget mer enn f ibroblastene gjør.

- Granuleringsvev aktivt, men ikke spesielt vaskulært.

- Perivaskulært fibrin i enkelte store døde kanaler i det nekrotiske vev.

A3 Anterlør. snitt tre, infarkt senter

- Stort nekrotisk areal, dårlig perfusert, med minimal rand av subendokardialt granuleringsvev - Vaskulariteten er dårlig; penetrering av kar, celler minimal. Ingen interdipiteringer. Kollagen svak. En klottet arteriol.

Bedømmelse: dårlig respons; ingen effekt i det hele tatt

SB3 Septal rand, snitt tre

- Dårlig perfusjon av nekrotisk materiale, meget nukleært støv fra polyer istedet. - Små renner av dårlig interdipiterende og dårlig vaskulært granuleringsvev

Bedømmelse: heling og organisering ikke avansert

LB3 Lateral rand, snitt tre

- Overbevisende cellularitet av granuleringsvev, men lite vaskulært og lite maturering. - Flere flekker av meget løs fibrose med meget små kapillarer.

Bedømmelse: heling og organisering ikke avansert

Total hund 21: ikke overbevisende, sannsynligvis kontroll Bedømmelse = 2

Hund 10665. 19$ infarkt Hund 22

Al Anterlør. senter av infarkt, snitt en

- Liten prøve, ikke meget nekrotisk vev

- Ny anvendelse av gamle kanaler ikke overbevisende,

- men fibroblastisk penetrering langs gamle kanaler dypt inntil dødt vev er å erkjenne

Bedømmelse: kunne vært behandlet

A2 - Meget interstitialt blod, friskt, men ikke i kanaler

- Mere polyer enn vanlig

- Fibroblastisk innvekst kun fokalt

- Nogen større kar har polyer i veggene (vaskulitt)

Bedømmelse: ekvivokal

A3 - Relativt stor nekrotisk sone uten perfusjon

- Fibroblastisk innvekst ved randen er god

- Mange kar med vaskulitt og trombose, friske

- Granuleringsvev cellulært og rimelig vaskulært

- Kollagen moderat godt utviklet langs karene

- Subepikardial blødning tilstede

Bedømmelse: ekvivokal og forvrengt av ? infeksjon

SB3 - Døde arealer med god reperfusjon

- Aktiv interdigitering av reaktivt levende vev og dødt areal

- Granuleringsvev meget vaskulært på enkelte steder

- Arealer med avansert kollagenorganisasjon er tilstede, men ikke predominant

Bedømmelse: fremskreden; heling

LB3 - En viss gjenutnyttelse av tilstedeværende kanaler

- Fibroblastpenetrering ikke dyp

- Heling av vevorganisering moderat, med midlere vaskularisering - Kollagen ikke avansert; de fleste regenereringsarealer fremdeles meget cellulære

Bedømmelse: Liten forandring hvis noen

Totalt hund 22: Svak endring; behandlet med sannsynligvis med liten effekt

Bedømmelse = 3+

Hund 77745. 9% infarkt Hund 23

Al Anterlør. snitt en, senterinfarkt

- Meget få, små øyer av nekrotisk vev tilbake.

- Vaskulære kanaler i dødt vev har ikke reperfusjons-mønsteret, men infiltrerende levende celler istedet

(endotelium og fibroblaster, ingen polyer)

- Granuleringsvev meget vaskulært, med mange mature arterioltype kar - Nytt: Mellom granulært vev og tidligere eksisterende levende muskelceller, er det et sjikt av ballong-dannende muskelceller (hydropisk endring)

- Kollagen er meget maturt, høyt organisert

Bedømmelse: fremskreden heling (men lite infarkt!)

A2 - Vaskulære kanaler i nekrotisk areal godt gjenutnyttet;

levende celler følger nær, men det er fremdeles et dødt senter med kun få polyer - I to arealer er vaskulariseringen ved regenerering av vevet så å si hemangiomatøs, men også med mikrohemoragi. - Granuleringsvevaktiviteten er høy, meget cellulær, men også med arealer av maturt kollagen

Bedømmelse: meget avansert

A3 - Noe større nekrotiske øyer med utstrakte gammel-kanal-perfusjonsmønster, nær fulgt av levende regenererende celler - Penetreringen av dødt vev med levende regenererende vev er et av de beste som er sett hos alle hunder så langt (foto, omkutt HE fordi noen av disse penetrerings-arealer kunne kuttes bedre)

- Meget aktivt, meget vaskulært granuleringsvev

- En fokus av kalsifisering (A3)

- Vaskularitet er virkelig uvanlig!

Bedømmelse: definitivt behandlet

LB3 - Kun liten fokus av granuleringsvev synes aktivt

- Tvilsom økning i vaskularitet av nærliggende Intakt muskel.

Bedømmelse: Ikke nok infarktert areal (eller heling så

avansert at den reflekteres i den reduserte infarktstørrelse ?)

SB3 - Omkutt og foto! Kan ikke tenke en mer ønskelig virkning i avansert heling enn dette.

FOTO

Totalt hund 23: Hvis denne ikke var behandlet, må mine kriterier revideres.

Bedømmelse = 5

Gavras 11045: 19$ infarkt Hund 24

Al Anterlør. snitt en, infarktsenter

- Stor nekrotisk sone, dårlig perfusert

- Kun leilighetsvis polyer og nukleært støv

- Kun få rød blodlegemer mellom fibrene er friske, resten er gamle ("spøkelser")

- Cellulær innvekst meget begrenset

- Mange kar i granuleringsveven er tromboserte

- Nytt vev for det meste cellulært med dårlig kollagenorganisering og multippel foki av kalsifisering - Dårlig organiserende fibrinøse perikardititt også tilstede - Meget fibrin over alt i randsonen (nylig og foto)

(PTAH overflekket, gjenta)

Bedømmelse: forsinket heling, komplisering ved koagulering

A2 - Tilsvarende Al; rand med granuleringsvev liten og immatur; kun subepikardial - Cellulær innvekst kun 0,5 mm og kun langs større kar og ikke godt interdigiterende (foto)

- Meget fibrin i større kanaler

- PTAH viser sterk fibrinkoagulering i en større arterie Bedømmelse: forsinket heling; muligens perfusjonsblokkering A3 - Samme som Al og A2 eller verre med tidlig kalsifisering - God kvalitet HE for foto av epikardial kant av granuleringsvev og kalsium - Tromboserte kar tilstede, trombi mindre enn 10, men mer enn 2 dager gamle - Liten øy av vaskulære celler og fibroblaster nær sentrum av nekrosen, meget immatur

Bedømmelse: dårlig heling; trombotiske komplikasjoner

LB3 Lateral kant, tredje snitt

- Partiell frisk perfusjon av nekrotisk materiale

- Innvekst tilstede, men ikke overbevisende

- De mest avanserte arealer er mere cellulære enn kollagen; mye kalsifisering - Preservert muskel viser hydropiske endringer i randsonen og også subepikardial; ellers ubemerkbar og Ikke spesielt vaskularisert - Markert kronisk og akutt perikarditt med involvering av noen muskel sjikt nedenfor

Bedømmelse: Forsinket heling; komplikasjon muligens på grunn

av infeksjon

SB3 Septal rand, tredje snitt

- I det vesentlige lik de foregående snitt, men intet epikardium tilstede og ikke så mye fibrin. - Rand med granulering av vev og infiltrering av levende celler ligger mellom 0,3 mm og 0,7 mm, meget mindre enn i andre hunder.

Bedømmelse: forsinket, dårlig heling

Totalt hund 24: Kontroll med ytterligere komplikasjoner

(trombotisk og muligens infeksjon)

Bedømmelse = 1

De ovenfor gitte patologiske rapporter ble gradert 1 til 5, der gradering 1 og 2 indikerte mangel på eller minimal heling (dvs. suggestiv for kontrollbehandling), graderingene 4 og 5 indikerte avansert eller akselerert heling (dvs. antydende effektiv eksperimentell behandling) og graderingene 3, 3-eller 3+ indikerte ekvivokale resultater. Gradering ble gjort av en patolog (CH) (dr. Christian Haudenschild fra Boston University School of Medicine) uten å ha vært klar over den behandling hunden var gitt og ble etterpå avstemt på H. Gavros med den aktuelle behandling. Tilpasningen ble ansett "korrekt" hvis forsøkshundene ble gradert 4 eller 5 og kontrollhundene ble gradert 1 eller 2, og var "ikke-tilpasset" når det motsatte skjedde. De som ble gradert 2, 3-

eller 3+ fra begge grupper ble ansett "ekvlvokale". I henhold til denne prosedyre ble: Hundene #10, 19, 24 (kontroll) og hund #14 (eksperimentell) ble gradert 1.

Hundene #6, 7, 21 (kontroll) og hund #12 (eksperimentell) ble gradert 2.

Hundene #1, 13, 22 (eksperimentell) og hund #16 (kontroll) ble gradert 3.

Hundene #8 og 20 (eksperimentell) og hund #9 (kontroll) ble gradert 4.

Hundene #11, 17, 23 (eksperimentell) ble gradert 5.

Hundene #2, 5, 15 og 18 ble kassert fordi deres infarkter var for små (se tabell VII ovenfor). Hundene #3 og 4 døde før slutten av studiet.

Tilsammen ble det foretatt inngrep på 24 hunder. 2 døde og 4 ble kassert fordi Infarktet var for lite. Av de gjenværende 18, var 10 eksperimentelle og 8 var kontroller. Av disse 18 stemte 11 overens (5 eksperimentelle og 6 kontroller), 3 stemte ikke (2 eksperimentelle og 1 kontroll) og 4 var ekvlvokale (3 eksperimentelle og 1 kontroll).

Resultater ses også for en bedømmelse av en annen patolog, dr. Michael Klibaner (MK) fra Boston University på samme måte.

Disse forsøk er kun illustrerende og er ikke ment å begrense oppfinnelsen.

Eksempel III

VASKULARISERING AV HUMANT MYOKARDIKALINFARKT:

Fire hematoksilin/eosin-snitt fra forskjellige soner ved 40x av hjertet til en 78 år gammel human pasient som hadde flere infarkter (figurene 25a, b, c og d) viser at mekanismen med vaskularisering virkelig er en del av infarkthelingen hos mennesker og at områdene som mangler angiogenese også mangler alle tegn på derpå følgende helingsmekanismer slik som cellulær organisasjon og kollagenisering. Denne pasienten var ikke behandlet med omentalekstrakten (CMFr).

Figur 25A: Human myokardialInfarkt. Nekrotisk sentersone,

ikke vaskularisert.

Hos overlevende pasienter kan slike arealer være tilstede i lang tid. Uten vaskularisering av celler som ville oppløse eller fagocytisere disse døde muskelceller opptrer sent eller ikke i det hele tatt; regenereringsceller har også liten tilgang til ikke-vaskulariserte arealer.

Figur 25B; Human myokardialinfarkt. Nekrotisk sone,

vaskularisert.

I nærheten av blodkarene kan rikelig blodbårede runde celler ses som blå flekker mellom de døde hjertemuskelceller. Hos overlevende pasienter ville slike celler følges senere av regenereringsceller som legger av kollagen for å danne et arr med tilstrekkelig mekanisk styrke.

Figur 25C: Human myokardialinfarkt. Vaskulært reaktivt

epikardium.

Epikardium, et tynt dekksjikt av hjertemuskelen, reagerer til en underliggende infarkt med ny karvekst slik man ser i dette mikrofotografi: snirklede kanaler fylt med røde blodlegemer i løst vev representerer nye blodkar. Slike kar kan være kilden for revaskularisering av den infarkterte hjertemuskel. Epikardium som forer rommet rundt hjertet deler dette potensialet for vaskularisering med tilsvarende sjikt som forer andre rom rundt lunger og innvoller. I de sistnevnte, det peritoneale rom, reagerer omentum så vel som serosa-sjiktet rundt de peritoneale organer sterkt og hurtig med neovaskularisering.

Figur 25D: Spontan vaskularisering i human myokardial

infarkt av mikroskopisk størrelse.

I det runde området i senter av dette fotografi, er noen få hjertemuskelceller tapt. Denne fokus er smått nok til hurtig og helt å fylles med nye kar som Ikke hare er anordnet tettere, men også hedre perfusert. Bemerk at dette fokus til å begynne med er lokalisert under epikardium som også viser en vaskulær reaksjon. Vaskulariseringen er et normalt og vesentlig trinn ved den spontane helingsprosess. Store nekrotiske soner er imidlertid ofte dårlig vaskularisert og derfor ikke effektivt bebodd av levende celler som er nødvendige for denne heling.

Ved hjelp av oppfinnelsen tar man sikte på å redusere slike soner.

Eksempel IV

HUND MI

Figur 26: Generelle foto av alle standardsnitt gjennom hjerteventriklene av to hunder. Forskjellen mellom infarktert og normal muskel forsterkes av en enzymreaksjon som flekker levende muskler i blåaktig retning; ikke Infarkterte arealer forblir uflekket og viser sin hvitaktige farge med rød blodflekker. Noen arealer i det første snitt (øvre venstre) er hvite på grunn av begynnelsen av ventilarealet; disse er ikke Infarktert.

Mikroskopiske snitt tas vanligvis fra snitt #4 (nedre middel av disse fotoer) ved: A (anterlør, sentrum av infarkt, toppen av snittet i disse fotoer), P (posteriør, ikke-affektert kontrollmuskel) og L (lateral fri vegg av venstre ventrikkel, viktig randsone mellom infarkt- og normalt vev, trenger noen ganger flere snitt). Disse patologiske tolkninger ble tatt som en blindprøve.

Disse infarkter oppnås ved total ligering av venstre anterlør koronar-arterie. 10 dager senere på bedømmelsestidspunktet, skulle størrelsen av infarktene være tilsvarende for hundene "10 (ubehandlet kontroll), og #11 (behandlet), fordi størrelsen på dette tidspunkt i det vesentlige bestemmes av det areal som mates av den ligerte koronar-arterie og ikke ved graden eller effektiviteten av helingen. På grunn av anatomisk og teknisk variabilitet mellom individuelle dyr og ligeringer, er infarktstørrelsen på dette tidspunkt et dårlig bedømmelseskriterium for behandlingseffektene; den er kun målt for å sikre at rimelige prinsipielle betingelser foreligger for alle forsøk, noe som betyr at minst 9$ av ventrikulærmuskelmassen skulle vært infarktert. (Dette representerer minst halvparten av arealet som den ligerte koronar-arterie vanligvis supplerer, innen grensene for individuelle anatomiske variasjoner. Med en gang graden av denne variasjon er kjent, kan den morfometriske bestemmelse av arrstørrelsen være en brukbar måte for bedømmelse av helingsprosessen på et senere tidspunkt. Fra det første sett av hunder var 8 brukbare med adekvate infarkter: 5 eksperimentelle og 3 kontroller. I forsøket ble 8 erkjent og 1 var Indifferent, og av de 3 kontroller var 2 erkjent og 1 ansett eksperimentell. I minst et forsøk ble et dyr med 16$ MI kvalitativt uvanlig prominens av kar sett.

Figur 27: Nekrotisk areal (2A: hund #10 kontroll; 2B hund

#11 behandlet)

Lavforstørrelsesfotografler (16x) av sentrum av infarktet. All rosa bakgrunn er død muskel. De røde flekker og linjer betyr blod, noe av hvilket er friskt (dvs. ikke koagulert eller hemolysert). Mønsteret i den behandlede hund #11 følger tilsynelatende den opprinnelige kapillær og større karkanaler selv om, sammen med hjertemuskelcellene, de respektive vaskulære celler må ha dødd også i dette areal. Mønsteret er uvanlig og Ikke sett 1 denne grad i kontroller slik som hund #10. Diffus blødning Inne i infarktet er mer sannsynlig å forvente og på andre steder, både i kontroller og behandlede dyr, opptrådte virkelig små hemoragier.

Figur 28: Randen av infarkt.

Tilsvarende forskjeller mellom behandlede (hund #12) og ubehandlede (hund #10) prøver ses: vaskulariteten er mer Intens i prøven fra hund #12. Både friskt blod og fibrin (lys rød) ses i den vaskulære lumlna.

De rød linjer eller vaskulære kanaler ved periferien av infarktene representerer posisjonene der de første levende celler, enten hvite celler fra blod eller regenererende større vevceller kan ses. Det er lett å tenke seg at Jo hurtigere og mer tallrike cellene vokser, jo større er sjansen for at de kan følge og muligens forbindes med de gamle kanaler. Perfusjon er et ønsket helingstrinn, men blødningen behøver ikke være. Perfusjonen av gamle kanaler ses også i kontrollene (A) med så langt var de mer overbevisende i behandlede dyr.

Figur 29: Kanten av infarkt.

Fotografier med 40x forstørrelse ved kanten av den mest aktive cellulære regenerering. Av interesse er de større purpurfargede flekker eller ellipsoider som representerer kjerner av levende regenererende celler. Disse celler følger maskenettet til gamle vaskulære kanaler som ses her i begge bilder. I kontrollfotografler (hund #10) er de fleste av de regenererende celler i det venstre nedre hjørne; i fotografiet av den behandlede hund #11, er de regenererende celler ut gjennom alle kanaler mellom de døde (grå) muskelceller, og er blandet med mindre runde celler og neeutro-filer. Bilder som dette illustrerer viktige detaljer, men er ikke tilstrekkelig egnet som påvisning av forskjeller fordi kun en millimeter fra denne posisjon kan det være mange flere levende celler i begge prøver som viser en slags cellula- ritetsgradient. Den totale bedømmelse av en eller flere erfarne patologer er derfor viktig.

Figur 30: Regenererende kant

Disse relativt bleke HE-fargede snitt er tatt fra en tidligere serie forsøk (hund 7 kontroll, hund 8 behandlet). De er valgt for å vise nøyaktig randlinjen av infarktet i 40x forstørrelse. I kontrollen er det infarkterte areal en liten kant av lett lysere rosa muskelceller ved toppen av bildet; i den behandlede prøve representerer infarktet av små rosa muskelceller i den høyre del av bildet. Resten av begge fotografier inneholder levende, regenererende celler. Sirkulære strukturer og noen langstrakte snitt representerer nye blodkar som er mer prominente i fotoet fra det behandlede dyr. Dette foto viser tilfeldigvis også en på forhånd eksisterende koronar-arteriegren i det øvre venstre hjørne.

Figur 31: Cellulær reaksjon.

Fotografier med middels forstørrelse på 16x for å vise at over store arealer kan det så å si ikke ses noen forskjeller. Den behandlede prøve kan vise litt mer kollagen (grønn) enn kontrollen. Kun de kombinerte inntrykk på mange felter i de tallrike snitt av en eller fortrinnsvis flere erfarne patologer, kan gi konklusive resultater.

Figur 32: Høyst avansert heling.

Leting etter arealet med den absolutt mest avanserte kollagene organisasjon i hvert snitt viste de mest impressive differanser (40x). Alle celler i disse bilder er levende regenererende celler; ingen hjertemuskelceller er tilstede. Kollagenflekker er grønne. Det grønneste arealet i snittet fra hund #10 er meget cellulært og kar kan også ses. I den behandlede hund #12 er de grønne arealer prominente, og innen disse arealer er cellulariteten redusert. Når organiseringen er ferdig, vil mesteparten av cellene som har produsert kollagen og også mesteparten av karene forsvinne. Således kan dette areal i den behandlede hund sikkert tolkes som avansert organisering. Slik sterkt organisert kollagen er tilstede, jo bedre er styrken i det utviklede arr og jo lavere er risikoen for brudd. Det er kun et formål ved behandlingen å oppnå slik strekkstyrke og avansert organisasjon meget tidlig og således å forhindre brudd. Relativt få Ml-pasienter dør av slikt brudd. Imidlertid indikerer denne avanserte heling og organisasjon på dette tidspunkt også at all foregående heling som førte til dette arr må ha vært akselerert og således er graden av kollagenisering en indikator for vellykketheten av tidligere ønskelig, men ikke så lett målbar heling, noe som bestemmer funksjonen og ytelsen til de overlevende hjerter så vel som en mulig reinfarktrisiko.

Figur 33: Avansert heling og aktiv heling (40x)

Disse fotografier er fra to forskjellige hunder, begge behandlet. Et viser et areal av relativt jevn fordeling av regenererende celler og kollagen A, den andre B, en gradient som går fra sterkt organisert kollagen (grønn, høyre) til død hjertemuskel (grå, venstre) med rikelige kar (over alt) og høy cellularitet. Begge mønstrene synes å representere ønskelige, aktive helingsprosesser.

Eksempel V

I en sluttanalyse av de to patologer dr. Christian Haudenschild (C.H.) og dr. Michael Klibaner (M.K.) fra the Cardiovascular Research Laboratory, Boston University School of Medicine, Boston, Mass. av hundemyokardial infarkt blindbedømmelser av eksperimentelle og kontrolldyr ble gjort av begge uavhengig som nevnt ovenfor. Se tabell VIII. For denne andre analyse ble hver ballongokkludert hund (1-5) Ikke inkludert, men alle følgende arealer (6-24) var, uansett størrelse av infarktet, noe som resulterte i 19 bedømmelser.

Overensstemmelse mellom CH og MK ble funnet i 12 av 19 dyr og av disse 12 var begge korrekt for 9 hunder og begge hadde feil på 3 hunder (#9, 13, 16). Uoverensstemmelse mellom CH og MK ble funnet 1 7 av 19 dyr og av disse 7 var CH korrekt på 4 og MK var korrekt på 3.

Derfor var de korrekte tall for analysen av 19 hunder 13/19 for CH bestående av 6/9 kontroller og 7/10 forsøksdyr og de korrekte for MK var 1 12 av 19 bestående av 4 av 9 kontroller og 8 av 10 forsøk. Ukorrekte bedømmelser for CH utgjorde 6, dvs. 3 av 9 kontrolldyr ble sagt behandlet og 3 av 10 behandlede dyr ble kalt kontroller. Ukorrekt angivelse for MK var tilsammen 7, nemlig 5 av 10 kontroller ble angitt behandlet og 2 av 10 behandlede ble kalt kontroller. Disse data er oppsummert i den følgende tabell IX, der disse 19 hunder er bedømt og sammenlignet. Videre inkludert i de følgende tabeller er hund #5 for hvilken en bedømmelse MK og en ikke-bedømmelse (dvs. 3 uten gjetning + eller -). Således omfatter tabellene tilsammen 20 hunder. Fra tabell IX ser man at de korrekte CH-angivelser var 14/20 og for MK 13/20 (Inkludert hund #5).

Under MK vises bedømmelsen til M.K. og

under CH vises bedømmelsen av CH.

E/C = eksperimentell eller kontroll

R eller W = ikke-tilpasning

Det var 9 tilpasning PM eller CM av hvilke 8 var riktige og 1 var gal.

Det var kun 1 total MMM.

1 & 5 er meget signifikant for både MK & CH. 2 & 4 synes tilfeldig for MK, men signifikant for CH.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for in vitro-behandling av myokardialvev eller organer fra pattedyr, karakterisert ved at den omfatter å bruke fysikalsk aktive mengder av omentum-avledede lipid- og gangliosidmaterialer i mengder tilstrekkelig til å tilveiebringe i det minste forsterket vaskulari-serings- og/eller forsterket organiserings- og/eller forsterket kolateraliserings- og/eller forsterket perfusjons-virkning i vevet eller organet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som fysiologisk aktiv ekstrakt anvendes en kloroform-metanol-ekstrakt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som fysiologisk aktiv ekstrakt anvendes en heksan-etanol-ekstrakt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det som fysiologisk aktiv ekstrakt anvendes en heksan-etanol-ekstrakt avledet fra kloroform-metanolekstrakten.

5 . Fremgangsmåte for å oppnå et angiogent aktivt 1ipidmateriale fra pattedyromentum for anvendelse for forsterket myo-kardinalinfarkt- eller ischemisk perfusjon og/eller kolatera-lisering og/eller myokardialinfarktheling, karakt er i sert ved at den omfatter å ekstrahere pattedyr-omentalvev med et oppløsningsmiddel som inneholder minst et organisk oppløsningsmiddel for å oppnå angigent aktivt lipid og/eller gangliosid.