NO844848L - HYBRIDIZATION ANALYSIS WITH IMMOBILIZATION OF HYBRIDS BY ANTI-HYBRID BINDING - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre hybridiserings-analysemetoder og reagenssystemer for detektering av spesifike polynukleotidesekvenser. Prinsippet for nukleinsyre-hybridiseringsanalyser ble utviklet ved arbeider innen feltet rekombinant DNA som et hjelpemiddel for å bestemme og iso-lere spesielle polynukleotide basesekvenser av interesse. The present invention relates to nucleic acid hybridization analysis methods and reagent systems for detecting specific polynucleotide sequences. The principle of nucleic acid hybridization assays was developed by work in the field of recombinant DNA as an aid in determining and isolating particular polynucleotide base sequences of interest.

Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNAIt was found that single-stranded nucleic acids, e.g. DNA

og RNA, slik som de oppnås ved denaturering av dobbeltkjedede former, hybridiserer eller rekombinerer under egnede betingelser med komplementære enkeltkjedede nukleinsyrer. and RNA, as obtained by denaturing double-stranded forms, hybridizes or recombines under appropriate conditions with complementary single-stranded nucleic acids.

Ved å merke slike komplementære probe nukleinsyrer med en lett detekterbar kjemisk gruppe, gjørs det mulig å detektere nærværet av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse i et forsøksmedium som inneholder prøve-nukleinsyrer i enkeltkjedet form. By labeling such complementary probe nucleic acids with an easily detectable chemical group, it is possible to detect the presence of any polynucleotide sequence of interest in an experimental medium containing probe nucleic acids in single-stranded form.

I tillegg til feltet rekombinant DNA forskning, kan den ana-lyttiske hybridiseringsteknikken anvendes til detektering av polynukleotider av betydning, bl.a. innen feltene human-og veterinærmedisin, jordbruk og næringsmiddelvitenskap. Spesielt kan teknikken anvendes til å detektere og identifi-sere etiologiske agenter som f.eks. bakterier og virus, til å lette diagnosen av genetiske forstyrrelser, som f.eks. sigdcelle-anemi og thalassemia, og til å detektere kreft-celler. En generell forsikt over teknikken og dens nåværende og fremtidige betydning, finnes i Biotechnology (August 1983), side 471-478. In addition to the field of recombinant DNA research, the analytical hybridization technique can be used to detect polynucleotides of importance, e.g. in the fields of human and veterinary medicine, agriculture and food science. In particular, the technique can be used to detect and identify etiological agents such as e.g. bacteria and viruses, to facilitate the diagnosis of genetic disorders, such as sickle cell anemia and thalassemia, and to detect cancer cells. A general overview of the technique and its present and future importance can be found in Biotechnology (August 1983), pages 471-478.

Følgende informasjon tilveiebringes for å gjøre kjent informasjon som antas å ha mulig relevans med hensyn til foreliggende oppfinnelse. Det bør bemerkes at følgende informasjon ikke er ment å utgjøre tidligere teknikk overfor foreliggende oppfinnelse. The following information is provided to make known information that is believed to have possible relevance with respect to the present invention. It should be noted that the following information is not intended to constitute prior art to the present invention.

Teknikkens stand år det gjelder nukleinsyre hybridiserings-analyseteknikker, innbefatter generelt immobilisering av prøve-nucleinsyren på en fast bærer. Hybridiserin mellom spesielle basesekvenser eller gener av interesse i prøve-nukleinsyrene og en merket form av probe nukleinsyren, bestemmes ved å separere den faste bæreren fra resten av reaksjonsblandingen som inneholder den ubundede, merkede proben, etterfulgt av detektering av merket på den faste bæreren. The state of the art in nucleic acid hybridization assay techniques generally involves immobilization of the sample nucleic acid on a solid support. Hybridization between particular base sequences or genes of interest in the sample nucleic acids and a labeled form of the probe nucleic acid is determined by separating the solid support from the rest of the reaction mixture containing the unbound, labeled probe, followed by detection of the label on the solid support.

Nødvendigheten av å immobilisere prøve-nukleinsyrene forThe necessity of immobilizing the sample nucleic acids for

å utføre hybridiseringsanalysen ifølge teknikkens stand,to perform the hybridization analysis according to the state of the art,

gir to betydelige problemer. For det første er fremgangsmåtene som kreves for å oppnå immobilisering generelt tid-krevende, og utgjør et ekstra trinn som er uønsket ved rutinemessig anvendelse av teknikken i et klinisk laboratorium. presents two significant problems. First, the procedures required to achieve immobilization are generally time-consuming and constitute an additional step that is undesirable in the routine application of the technique in a clinical laboratory.

For det andre kan proteiner og andre materialer i den hetero-gene prøven, spesielt i tilfelle med kliniske prøver, påvirke immobiliseringen av nukleinsyrene. Second, proteins and other materials in the heterogeneous sample, especially in the case of clinical samples, can affect the immobilization of the nucleic acids.

Som alternativer til immobilisering av prøve-nukleinsyrerAs alternatives to the immobilization of sample nucleic acids

og tilsats av merket probe, kan man benytte en immobilisert probe og merke prøve-nukleinsyrene in situ, eller man kan benytte en dual hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav den ene immobiliseres og den andre merkes /Methods in Enzymology 65:468(1968) og Gene 21:77-86(19 83/. Det første alternativet er imidlertid enda mindre ønskelig siden in situ merking av prøvenukleinsyrer krever en høy grad av tekniske ferdigheter som ikke rutinemessig kan forventes hos klinisk teknisk personell og der finnes ingen enkle, pålitelige fremgangsmåter for å styre merkeutbyttet, hvilket kan være et betydelig problem hvis merkemediet inneholder variable mengder av inhibitorer for merkereaksjonen. Den duale hybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et inkubasjonstrinn, og kinetikken for hybridiseringsreaksjonen kan være langsom og ineffektiv.Nøyaktigheten av analysen kan også være variabel dersom kom-plementariteten av de to probene med prøvesekvensen er variabel. and addition of the labeled probe, one can use an immobilized probe and label the sample nucleic acids in situ, or one can use a dual hybridization technique that requires two probes, one of which is immobilized and the other labeled /Methods in Enzymology 65:468(1968) and Gene 21:77-86(1983/. However, the first option is even less desirable since in situ labeling of sample nucleic acids requires a high degree of technical skill that cannot be routinely expected of clinical technical personnel and there are no simple, reliable methods to control the labeling yield, which can be a significant problem if the labeling medium contains variable amounts of inhibitors of the labeling reaction. The dual hybridization technique has the disadvantage that it requires an additional reagent and an incubation step, and the kinetics of the hybridization reaction can be slow and inefficient. The accuracy of the assay can also be variable if the complementarity of the two probes with the sample sequence is variable l.

Anvendelsen av immobiliserte RNA prober og deteksjon av resulterende immobiliserte DNA ' RNA eller RNA'RNA hybrider ved hjelp av merkede antistoffer som er selektive for de respektive hybrider, beskrives i US patentsøknad 616,132, inngitt 1. juni 1984. Dette eliminerer nødvendigheten av å immobilisere eller merke prøvenukleinsyrene, imidlertid er probe-kjeden innbefattet i hybridiseringen immobilisert, hvilket kan nedsette hastigheten hvorved proben og sekvensen av interesse kan rekombinere i betydelig grad. The use of immobilized RNA probes and detection of resulting immobilized DNA'RNA or RNA'RNA hybrids using labeled antibodies selective for the respective hybrids is described in US Patent Application 616,132, filed June 1, 1984. This eliminates the need to immobilize or label the sample nucleic acids, however, the probe strand included in the hybridization is immobilized, which can significantly slow down the rate at which the probe and sequence of interest can recombine.

Teknikker for direkte detektering av polynukleotide duplekser dannet som produkter ved hybridisering mellom prøven og probe nukleotidene, hvorved man unngår kjemisk merking og immobilisering av prøve eller probe-nukleotider, har generelt ikke virket tilfredsstillende. Forsøk på å generere antistoffer som selektivt vil binde dobbeltkjedede DNA'DNA hybrider fremfor enkelt-kjedet DNA, har ikke vær vellykket. /Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", red. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY (1969), side 18 et seqV Techniques for the direct detection of polynucleotide duplexes formed as products by hybridization between the sample and the probe nucleotides, thereby avoiding chemical labeling and immobilization of the sample or probe nucleotides, have generally not worked satisfactorily. Attempts to generate antibodies that will selectively bind double-stranded DNA-DNA hybrids over single-stranded DNA have not been successful. /Parker and Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", ed. Plescia and Braun, Springer-Verlag, NY (1969), pp. 18 et seqV

Man har til en viss grad lykkes med å generere antistoffer som vil binde RNA'DNA-blandede hybrider eller RNA'RNA-hybrider og som har lav affinitet for de enkeltkjedede polynukleotidene /se f.eks. Rudkin og Stollar, Nature 265 : 472 ( 1977 )_/. Metod-ene som er beskrevet krever imidlertid, på samme måte som hybridiseringsteknikkene beskrevet ovenfor hvor det anvendes merkede prober, immobilisering av prøve-nukleinsyrene. One has succeeded to some extent in generating antibodies which will bind RNA'DNA-mixed hybrids or RNA'RNA hybrids and which have a low affinity for the single-chain polynucleotides / see e.g. Rudkin and Stollar, Nature 265 : 472 ( 1977 )_/. However, the methods described require, in the same way as the hybridization techniques described above where labeled probes are used, immobilization of the sample nucleic acids.

Rudkin og Stollar fikserte hele celler på mikroskopplaterRudkin and Stollar fixed whole cells on microscope slides

og eksponerte DNA i kjernen. Det ble hybridisert med en RNA-probe og hybridet ble detektert ved fluorescensmikroskopi med fluorescein-merket antistoff til RNA1 DNA. and exposed DNA in the nucleus. It was hybridized with an RNA probe and the hybrid was detected by fluorescence microscopy with fluorescein-labeled antibody to RNA1 DNA.

Tidlige fremgangsmåter for detektering av spesifike DNA-sekvenser var oppløsningsutførelser hvor hybridiseringen innbefattet oppløselige former av både prøve-DNA og en radioaktivt-merket RNA-probe.Hybridet som ble dannet i oppløs-ningen ble isolert ved tetthetsgradient-sentrifugering /Hall og Spiegelmann (1961) Proe.Nati.Acad. Sei. 47:137/. Sen- trifugeringen var for langsom og upraktisk for analyse av et stort antall prøver. Denne oppløsningshybridiserings-fremgangsmåter ble gjort mer anvendelig ved den oppdagelse at nitrocellulosefiltere i sterk grad adsorberer enkeltkjedet DNA sammen med eventuelt hybridisert RNA /Nygaard og Hall (19 64) J. Mol. Biol. 9:125/. Den merkede RNA-proben bindes meget svakt til filterne og fremgangsmåten ble forbedret ved å eksponere filterne for ribonuklease som hydrolyserer den enkeltkjedede proben men ikke RNA<1>DNA hybridet. Fremgangsmåten er begrenset til hybridisering av DNA-prøver med RNA-prober, og nedbrytningen med ribonuklease må kontrolleres nøye; derfor ble hybridiseringsfremgangsmåter i fast. fase viktigere. Early methods for detecting specific DNA sequences were solution designs where the hybridization included soluble forms of both sample DNA and a radioactively labeled RNA probe. The hybrid that formed in the solution was isolated by density gradient centrifugation /Hall and Spiegelmann (1961 ) Proe.Nati.Acad. Pollock. 47:137/. The centrifugation was too slow and impractical for the analysis of a large number of samples. This solution hybridization procedure was made more applicable by the discovery that nitrocellulose filters strongly adsorb single-stranded DNA together with any hybridized RNA /Nygaard and Hall (1964) J. Mol. Biol. 9:125/. The labeled RNA probe binds very weakly to the filters and the method was improved by exposing the filters to ribonuclease which hydrolyzes the single-stranded probe but not the RNA<1>DNA hybrid. The procedure is limited to the hybridization of DNA samples with RNA probes, and the degradation by ribonuclease must be carefully controlled; therefore, hybridization procedures became established. phase more important.

Følgelig foreligger det et stort behov for en nukleinsyre-hybridiseringsanalyse som ikke krever immobilisering av hverken probe el]er prøve-nukleinsyrer og som overvinner de be-grensninger som er forbundet med de kjente oppløsnings-hybridiseringsteknikkene. Videre bør en slik teknikk tillate bruk av et antall forskjellige merker, spesielt av ikke-radioisotop type. En nukleinsyre hybridiserings-analysemetode og reagenssystem som har disse og andre fordeler, Consequently, there is a great need for a nucleic acid hybridization assay which does not require immobilization of either probe or sample nucleic acids and which overcomes the limitations associated with the known solution hybridization techniques. Furthermore, such a technique should allow the use of a number of different labels, especially of the non-radioisotope type. A nucleic acid hybridization assay method and reagent system having these and other advantages,

er hovedhensikten ved foreliggende oppfinnelse.is the main purpose of the present invention.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en nukleinsyre hybridiseringsanalyse hvor hybridet som dannes mellom den spesielle polynukleotide sekvensen som skal detekteres og en nukleinsyre-probe immobiliseres ved binding til en immobilisert eller immobiliserbar form av en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til slike hybrider. Ifølge de foretrukne utførelser, muliggjør dette separasjon av hybridisert og uhybridisert probe dersom er merket probe anvendes, eller separasjons av hybrid-bundet fra fri merket annen antistoff-reagens dersom en merket form av anti-hybridreagens benyttes. Ved foreliggende fremgangsmåte unngås således behovet for immobilisering av enten prøve eller probenukleinsyrer full-stendig, og hybridiseringen kan foregå i oppløsning hvor The present invention provides a nucleic acid hybridization analysis where the hybrid formed between the particular polynucleotide sequence to be detected and a nucleic acid probe is immobilized by binding to an immobilized or immobilizable form of an antibody reagent which is selective binding to such hybrids. According to the preferred embodiments, this enables separation of hybridized and unhybridized probe if labeled probe is used, or separation of hybrid-bound from free labeled other antibody reagent if a labeled form of anti-hybrid reagent is used. With the present method, the need for immobilization of either sample or probe nucleic acids is thus completely avoided, and the hybridization can take place in solution where

hybridiseringshastigheten er rask og mere effektiv.the hybridization speed is fast and more efficient.

Generelt innbefatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse at en forsøksprøve som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer bringes i kontakt med proben som har en enkelt-kjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres. Dette hybridiseringstrinnet vil foregå under betingelser som er fordelaktige for hybridisering mellom proben og sekvensen som skal detekteres. De resulterende hybridene kan så detekteres ved tilsats av anti-stof f -reagensen som er selektiv for binding av duplekser som dannes ved hybridisering mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres. På dette trinnet av analysen, vil antistoffreagensen normalt være i en immobilisert tilstand, f.eks. kjemisk- eller fysisk bundet til en fast bærer. Alternativt kan anti-hybrider bringes i kontakt med de dannede hybrider i en oppløselig form, og deretter gjøres immobil, f.eks. ved kontakt med en immobilisert form av et antistoff, dyrket mot anti-hybridet eller ved å anvende et ligand-modifisert anti-hybrid og tilsette en immobilisert form av en bindende del for liganden. In general, the method according to the present invention includes bringing a test sample containing single-stranded nucleic acids into contact with the probe which has a single-stranded base sequence which is essentially complementary to the sequence to be detected. This hybridization step will take place under conditions that are advantageous for hybridization between the probe and the sequence to be detected. The resulting hybrids can then be detected by the addition of the anti-substance f reagent which is selective for the binding of duplexes formed by hybridization between the complementary probe sequence and the sequence to be detected. At this stage of the assay, the antibody reagent will normally be in an immobilized state, e.g. chemically or physically bound to a solid carrier. Alternatively, anti-hybrids can be brought into contact with the formed hybrids in a soluble form, and then immobilized, e.g. by contact with an immobilized form of an antibody raised against the anti-hybrid or by using a ligand-modified anti-hybrid and adding an immobilized form of a binding moiety for the ligand.

De resulterende duplekser som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen kan bestemmes på forskjellige måter. Normalt vil man benytte en merket probe eller en merket form av en annen anti-hybrid reagens. I det første tilfellet, separeres den hybridiserte, merkede proben som blir forbundet med den immobiliserte fasen fra den uhybridiserte proben som blir igjen i oppløsningen, og man måler enten merke forbundet med den immobiliserte fasen eller merke i den gjenvær-ende uhybridiserte proben. Der hvor det anvendes et merket anti-hybrid, separeres det som blir forbundet med den immobiliserte fasen ved binding til dannede hybrider fra det som fremdeles finnes i oppløsningen og en måles enten merke som er blitt forbundet med den immobiliserte fasen, eller merke som gjenstår med ubundet merket anti-hybrid. En rekke forskjellige merker kan benyttes, innbefattet radioaktive merker, og fortrinnsvis ikke-radioisotope merker, som f.eks. enzymer, fluorescerende stoff, ligander o.l. The resulting duplexes that bind to the immobilized antibody reagent can be determined in various ways. Normally one would use a labeled probe or a labeled form of another anti-hybrid reagent. In the first case, the hybridized, labeled probe that becomes associated with the immobilized phase is separated from the unhybridized probe that remains in the solution, and one measures either label associated with the immobilized phase or label in the remaining unhybridized probe. Where a labeled anti-hybrid is used, that which becomes associated with the immobilized phase by binding to formed hybrids is separated from that which is still present in the solution and either label which has become associated with the immobilized phase, or label which remains with unbound labeled anti-hybrid. A number of different labels can be used, including radioactive labels, and preferably non-radioisotope labels, such as enzymes, fluorescent substance, ligands etc.

Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved en rekke betydelige fordeler. The present invention is characterized by a number of significant advantages.

For det første kan hybridiseringen av prøvenukleinsyrer med en probe utføres i oppløsning hvor reaksjonshastighetene er høyest. Hybridiseringshastighetene i fast fase begrenses typisk ved diffusjon av den merkede proben til prøve-nukleinsyrer immobilisert på den faste overflaten. Denne begrensnin-gen finnes ikke ved hybridisering i oppløsning. Firstly, the hybridization of sample nucleic acids with a probe can be carried out in solution where the reaction rates are highest. Hybridization rates in solid phase are typically limited by diffusion of the labeled probe to sample nucleic acids immobilized on the solid surface. This limitation does not exist with hybridization in solution.

For det andre, er ikke-spesifik binding av en merket probe til den faste fasen som benyttes for å immobilisere prøve-nukleinsyren et problem ved fremgangsmåter i fast fase. Typisk blir prøve-nukleinsyrene adsorbert på en fast fase; derfor må den faste fasen være et stoff som binder nukleinsyrer med høy affinitet, men denne egenskapen blir et problem i det etterfølgende hybridiseringstrinnet hvor ikke-spesifik adsorbsjon av den merkede proben bør være minst mulig. I foreliggende oppfinnelse kan den faste fasen for anti-hybrid immobilisering velges for materialer som ikke adsorberer nukleinsyrer. Videre krever de fleste hybridiseringsmetoder immobilisering av prøvenukleinsyrer ved adsorbsjon til en fast overflate, eller ved kovalent kobling til et fast stoff. Proteiner og andre materialer i prøven påvirker immobiliseringen; derfor må prøven renses ved fremgangsmåter som f.eks. fenolekstraksjon.Foreliggende oppløsnings-hybridiserings-metode immobiliserer hybridene med antistoffer som har høy affinitet og spesifisitet for hybridet, og som ikke er utsatt for påvirkning ved proteiner, karbohydrater og lipider i prøven. Second, non-specific binding of a labeled probe to the solid phase used to immobilize the sample nucleic acid is a problem with solid phase methods. Typically, the sample nucleic acids are adsorbed on a solid phase; therefore, the solid phase must be a substance that binds nucleic acids with high affinity, but this property becomes a problem in the subsequent hybridization step where non-specific adsorption of the labeled probe should be minimized. In the present invention, the solid phase for anti-hybrid immobilization can be chosen for materials that do not adsorb nucleic acids. Furthermore, most hybridization methods require immobilization of sample nucleic acids by adsorption to a solid surface, or by covalent coupling to a solid substance. Proteins and other materials in the sample affect the immobilization; therefore the sample must be cleaned by methods such as e.g. phenol extraction. The present solution-hybridization method immobilizes the hybrids with antibodies that have a high affinity and specificity for the hybrid, and which are not affected by proteins, carbohydrates and lipids in the sample.

Videre, i tilfeller hvor prøve-nukleinsyrer er immobilisert ved adsorbsjon eller kovalent kobling, finnes det ikke noen hensiktsmessig fremgangsmåte for å sikre at nukleinsyrene immobiliseres i høyt og reproduserbart utbytte. Videre gjør adsorbsjonsprosessen deler av den polynukleotide sekvense utilgjengelig for hybridisering. F.eks. er mindre enn halv-parten av DNA adsorbert på en nitrocellulosemembran tilgjengelig for hybridisering. Dette betyr at deteksjonsgrens-ene for analysen ikke er optimale, og utbyttet av hybrider kan være variabelt. Hybridisering i oppløsning som mulig-gjøres ved foreliggende oppfinnelse, tillater prøvenuklein-syrene å danne hybrider med maksimal effektivitet. Furthermore, in cases where sample nucleic acids are immobilized by adsorption or covalent coupling, there is no suitable method to ensure that the nucleic acids are immobilized in high and reproducible yield. Furthermore, the adsorption process makes parts of the polynucleotide sequence unavailable for hybridization. E.g. is less than half of the DNA adsorbed on a nitrocellulose membrane available for hybridization. This means that the detection limits for the analysis are not optimal, and the yield of hybrids can be variable. Hybridization in solution made possible by the present invention allows the sample nucleic acids to form hybrids with maximum efficiency.

Flg. 1 og 2 er skjematiske illustrasjoner av foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende oppfinnelse. Disse fremgangsmåtene beskrives i detalj nedenfor. Follow 1 and 2 are schematic illustrations of preferred methods for carrying out the present invention. These procedures are described in detail below.

Anvendelsen av nukleinsyre-hybridisering som et analyttisk verktøy er fundamentalt basert på den dobbeltkjedede dupleksstrukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyri-midin-basene av de respektive kjedene i dobbeltkjedet DNA, kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som resulterer ved denne "smeltingen", eller "denatu-reringen", vil reassosieres (ofte referert til som rekombi-nering eller hybridisering), slik at dupleksstrukturen igjen dannes. Det er nå velkjent at kontakt mellom en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens som er tilstrekkelig komplementær med (dvs. "homolog med") en annen enkeltkjedet nukleinsyre under egnede betingelser, vil gi dannelse av DNA1 DNA, RNA'DNA eller RNA'RNA hybrider, avhengig av utgangsstoffene. The application of nucleic acid hybridization as an analytical tool is fundamentally based on the double-stranded duplex structure of DNA. The hydrogen bonds between the purine and pyrimidine bases of the respective chains in double-stranded DNA can be reversibly broken. The two complementary single strands of DNA resulting from this "melting", or "denaturation", will reassociate (often referred to as recombination or hybridization), so that the duplex structure is once again formed. It is now well known that contact of a first single-stranded nucleic acid, either DNA or RNA, which includes a base sequence sufficiently complementary to (ie "homologous to") another single-stranded nucleic acid under suitable conditions will result in the formation of DNA1 DNA, RNA 'DNA or RNA'RNA hybrids, depending on the starting materials.

Proben vil innbefatte minst en enkeltkjedet basesekvens somThe probe will include at least one single-stranded base sequence which

i det vesentlige er komplementær med eller homolog med sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke å være et enkelt, kontinuerlig polynukleotid-segment, men kan bestå av to eller flere individuelle segmenter avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvsnene kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnålssløyfer. is substantially complementary to or homologous to the sequence to be detected. However, such a base sequence need not be a single, continuous polynucleotide segment, but may consist of two or more individual segments interrupted by non-homologous sequences. These non-homologous sequences can be linear, or they can be self-complementary and form hairpin loops.

I tillegg kan det homologe området av proben være flankertIn addition, the homologous region of the probe may be flanked

på 3'- og 5<1->terminalene av ikke homologe sekvenser, som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologe sekvensen er innført for propagering. I ethvert tilfelle, vil proben som en analyttisk reagens vise detekterbar hybridisering ved et eller flere punkter med prøve-nukleinsyrer av interesse. Lineære eller sirkulære enkelte kjedede polynukleotider kan benyttes som probeelementet, on the 3'- and 5<1->termini of non-homologous sequences, such as e.g. those containing the DNA or RNA of a vector into which the homologous sequence has been introduced for propagation. In any case, the probe as an analytical reagent will show detectable hybridization at one or more spots with sample nucleic acids of interest. Linear or circular single chain polynucleotides can be used as the probe element,

med hoveddeler eller mindre deler dupleksdannet med en komple-komplementær polynukleotidkjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segmentet eller segmentene er i enkeltkjedet form, og tilgjengelige for hybridisering med prøve-DNA eller RNA. Det foretrekkes generelt å anvende prober som i det vesentlige foreligger i enkeltkjedet form. Fremstillingen av en egnet probe for en spesiell analyse, with major parts or minor parts duplexed with a fully complementary polynucleotide chain or chains, provided that the critical homologous segment or segments are in single-stranded form, and available for hybridization with sample DNA or RNA. It is generally preferred to use probes which are essentially in single-chain form. The preparation of a suitable probe for a particular analysis,

er et spørsmål om rutinemessige ferdigheter innen teknikken. is a matter of routine skill in the technique.

Et kritisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er muligheten til å immobilisere selektive hybrider som dannes ved fordelaktige kinetiske vekselvirkninger mellom proben og sekvensen som skal detekteres i oppløsningen. I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse slik immobilisering binding av dannede hybrider til en antistoffreagens som tilsettes til reaksjonsmediet i en immobilisert tilstand, eller som kan gjøres immobilt i et etterfølgende trinn ved konvensjonelle fremgangsmåter. A critical feature of the present invention is the possibility to immobilize selective hybrids which are formed by advantageous kinetic interactions between the probe and the sequence to be detected in the solution. In contrast to previously known methods, the present invention provides such immobilization binding of formed hybrids to an antibody reagent which is added to the reaction medium in an immobilized state, or which can be made immobile in a subsequent step by conventional methods.

Slik betegnelse benyttes her, refererer antistoff-reagensThe term used here refers to antibody-reagent

til et immunologisk avledet bindende stoff som har antihybrid bindende aktivitet og som kan være hele antistoffer eller deler derav, eller aggregater eller konjugater derav, av konvensjonell polyklonal eller monoklonal type. Foretrukne antistoffreagenser er de som selektivt binder dobbeltkjedede nukleinsyrer fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, dvs. de som selektivt bindes (i) DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider eller (ii) interkaleringskomplekser. to an immunologically derived binding substance which has antihybrid binding activity and which may be whole antibodies or parts thereof, or aggregates or conjugates thereof, of conventional polyclonal or monoclonal type. Preferred antibody reagents are those that selectively bind double-stranded nucleic acids over single-stranded nucleic acids, i.e., those that selectively bind (i) DNA'RNA or RNA'RNA hybrids or (ii) intercalation complexes.

Det er nå kjent at antistoffer kan stimuleres slik at deIt is now known that antibodies can be stimulated so that they

er selektive for DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, det er imidlertid på det nåværende tidspunkt betraktet som ugjennomførlig å generere slik selektivitet i tilfellet av DNA'DNA hybrider. I den utstrek-ning selektivite DNA'DNA hybrider utvikles i fremtiden, vil de klart være anvendelige i foreliggende oppfinnelse. Antistoffer til DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider kan benyttes der hvor probene er RNA og prøvenukleinsyrene er DNA eller RNA eller der hvor proben er DNA og prøven RNA. are selective for DNA'RNA or RNA'RNA hybrids over single-stranded nucleic acids, however, it is currently considered infeasible to generate such selectivity in the case of DNA'DNA hybrids. To the extent that selectivity DNA'DNA hybrids are developed in the future, they will clearly be applicable in the present invention. Antibodies to DNA'RNA or RNA'RNA hybrids can be used where the probes are RNA and the sample nucleic acids are DNA or RNA or where the probe is DNA and the sample RNA.

Videre bør det bemerkes at når det refereres til en RNA-prøve som benyttes med en anti-DNA'RNA eller anti-RNA'RNA reagens, menes det her at ikke alle polynukleotidene som innbefattes i proben er ribonukleotider, dvs. inneholder en 2'-hydrok-sylgruppe. Det fundamentale trekket ved en RNA probe ifølge oppfinnelsen, er at den er tilstrekkelig ikke-DNA i karakter til å muliggjøre stimulering av antistoffer til DNA'RNA, eller RNA'RNA hybrider som innbefatter en RNA-probe som ikke kryssreagerer i en analyttisk betydelig grad, med de individuelle enkeltkjedene som utgjøre slike hybrider. Derfor kan en eller flere av 2<1->merket posisjonene av polynukleotidene som innbefattes i proben, være på deoksy-form. Forutsatt at bindingskarakteren for antistoffet som er nødvendig for utførelse av foreliggende analyse, opprettholdes i betydelig grad. På samme måte kan en RNA-probe i tillegg til eller alternativt til slik begrenset 2<1->deoksymodifika-sjon, innbefatte nukleotider som har andre 2'-modifikasjoner, eller generelt en hvilken som helst annen modifikasjon langs ribosefosfatryggraden, forutsatt at det ikke er betydelig interferens med spesifisiteten av antistoffet for det dobbeltkjedede hybridiseringsproduktet sammenlignet med de individuelle enkeltkjedene. Furthermore, it should be noted that when referring to an RNA sample that is used with an anti-DNA'RNA or anti-RNA'RNA reagent, it is meant here that not all the polynucleotides included in the probe are ribonucleotides, i.e. contain a 2' -hydroxyl group. The fundamental feature of an RNA probe according to the invention is that it is sufficiently non-DNA in character to enable the stimulation of antibodies to DNA'RNA, or RNA'RNA hybrids that include an RNA probe that does not cross-react to an analytically significant degree , with the individual single chains constituting such hybrids. Therefore, one or more of the 2<1->marked positions of the polynucleotides included in the probe may be in deoxy form. Provided that the binding character of the antibody, which is necessary for carrying out the present analysis, is maintained to a significant extent. Likewise, in addition to or alternatively to such limited 2<1->deoxy modification, an RNA probe may include nucleotides having other 2' modifications, or generally any other modification along the ribose phosphate backbone, provided that it does not is significant interference with the specificity of the antibody for the double-stranded hybridization product compared to the individual single chains.

Der hvor slike modifikasjoner eksisterer i en RNA-probe,Where such modifications exist in an RNA probe,

bør immunogene som benyttes for å dyrke antistoffreagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som har i det vesentlige the immunogen used to raise the antibody reagent should preferably include a chain having substantially

tilsvarende modifikasjoner og den andre kjeden bør være umo-difisert RNA eller DNA, avhengig av om prøve-RNA eller DNA skal detekteres. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogene være identisk med den modifiserte kjeden i en RNA-probe. Et eksempel på et immunogen er det hybride poly-(2'-O-metyladenylsyre)<1>poly(2'-deoksytymidylsyre). Et annet eksempel er poly(2<1->0-etyliosinsyre)'poly(ribocytidylsyre). corresponding modifications and the second chain should be unmodified RNA or DNA, depending on whether sample RNA or DNA is to be detected. Preferably, the modified chain in the immunogen should be identical to the modified chain in an RNA probe. An example of an immunogen is the hybrid poly-(2'-O-methyladenylic acid)<1>poly(2'-deoxythymidylic acid). Another example is poly(2<1->0-ethylisoic acid)'poly(ribocytidylic acid).

Følgende er ytterligere eksempler på modifiserte polynukleotider som kan innbefattes i en RNA-probe: 2'-O-metylribo-nukleotid, 2-0-etylribonukleotid, 2<1->acidodeoksyribonykleotid, 2<1->klorodeoksyribonukleotid, 2'-O-acetylribonukleotid, og metylfosfonatene eller fosfortiolatene av ribonukleotider eller deoksyribonukleotider. Modifiserte nukleotider kan finnes i RNA-prober som et resultat av innføring under enzym-zyntese av proben fra en sjablong. F.eks. er adenosin 5'-0-'('l—tiotrifosfat) (ATPaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA-avhengige RNA polymeraser og DNA-polymeraser. Alternativt kan den kjemiske modifikasjonen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA-probe 2<1->0-acetyle-res med eddiksyreanhydrid under milde betingelser i et vandig oppløsningsmiddel. The following are additional examples of modified polynucleotides that can be included in an RNA probe: 2'-O-methylribonucleotide, 2-O-ethylribonucleotide, 2<1->acidodeoxyribonucleotide, 2<1->chlorodeoxyribonucleotide, 2'-O- acetyl ribonucleotide, and the methylphosphonates or phosphorus thiolates of ribonucleotides or deoxyribonucleotides. Modified nucleotides can be found in RNA probes as a result of introduction during enzyme synthesis of the probe from a template. E.g. are adenosine 5'-0-'('l—thiotriphosphate) (ATPaS) and dATPaS substrates for DNA-dependent RNA polymerases and DNA polymerases, respectively. Alternatively, the chemical modification can be introduced after the probe has been prepared. E.g. an RNA probe can be 2<1->0-acetylated with acetic anhydride under mild conditions in an aqueous solvent.

Immunogener for stimulering av antistoffer spesifike for RNA'DNA hybrider, kan innbefatte homopolymere eller heteropolymere polynukleotide duplekser. Blant mulige homopolymere duplekser foretrekkes spesielt poly(rA)<1>poly(dT) (Kitagawa og Stoller (1982) Mol. Immunol. 19:413). Generelt foretrekkes imidlertid heteropolymere duplekser og disse kan fremstilles på en rekke forskjellige måter, innbefattet transkripsjon av 4>X174 virion DNA med RNA polymerase (Nakazato (1980) Biochem. 19:2835). De valgte RNA'DNA-dupleksene adsorberes Immunogens for stimulation of antibodies specific for RNA'DNA hybrids may include homopolymeric or heteropolymeric polynucleotide duplexes. Among possible homopolymeric duplexes, poly(rA)<1>poly(dT) is particularly preferred (Kitagawa and Stoller (1982) Mol. Immunol. 19:413). In general, however, heteropolymeric duplexes are preferred and these can be prepared in a number of different ways, including transcription of 4>X174 virion DNA with RNA polymerase (Nakazato (1980) Biochem. 19:2835). The selected RNA'DNA duplexes are adsorbed

på et metylert protein, eller bindes på annen måte til et konvensjonelt immunogent sperremateriale, som f.eks. bovin serumalbumin, og injiseres i det ønskede vertsdyr (se også Stollar (1980) Meth. Enzymol. 70 : 70). Antistoffer til RNA1 RNA duplekser kan dyrkes mot dobbeltkjedet RNA fra virus som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer sukker- on a methylated protein, or is otherwise bound to a conventional immunogenic barrier material, such as e.g. bovine serum albumin, and injected into the desired host animal (see also Stollar (1980) Meth. Enzymol. 70 : 70). Antibodies to RNA1 RNA duplexes can be raised against double-stranded RNA from viruses such as e.g. reovirus or Fiji disease virus that infects sugar-

rør, bl.a. Også homopolymere duplekser som f.eks. poly(ri)' poly(rC) eller poly(rA)'poly(rU), blant andre, kan benyttes for immunisering som angitt ovenfor. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til RNA'DNA og RNA1 RNA hybrider, er tilveiebragt i US patentsøknad 616.132, inngitt 1. juni 1984. pipe, i.a. Also homopolymeric duplexes such as e.g. poly(ri)' poly(rC) or poly(rA)'poly(rU), among others, can be used for immunization as indicated above. Additional information regarding antibodies to RNA'DNA and RNA1 RNA hybrids is provided in US patent application 616,132, filed June 1, 1984.

Antistoffer til interkolleringskomplekser kan fremstilles mot et immunogen som vanligvis innbefatter et ionisk kompleks mellom et kationisk protein eller proteinderivat (f.eks. metylert bovinserumalbumin) og det anioniske interkollator-nukleinsyrekomplekset. Ideelt er interkollatoren kovalent koblet til den dobbeltkjedede nukleinsyren. Alternativt kan interkollator-nukleinsyrekonjugatet være kovalent koblet til et bærerprotein. Nukleinsyredelen av immunogenet kan innbefatte de spesifikt parede sekvensene som finnes i ana-lysehybridet, eller kan innbefatte andre ønskede sekvenser siden spesifisiteten av antistoffet generelt ikke vil avhenge av den spesielle basesekvensen som er involvert. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til interkalleringskomplekser er tilveiebragt i US patentsøknad 560.429, inngitt 12 desember 1983. Antibodies to intercollating complexes can be raised against an immunogen that usually includes an ionic complex between a cationic protein or protein derivative (eg, methylated bovine serum albumin) and the anionic intercollating nucleic acid complex. Ideally, the intercollator is covalently linked to the double-stranded nucleic acid. Alternatively, the intercollator nucleic acid conjugate may be covalently linked to a carrier protein. The nucleic acid portion of the immunogen may include the specifically paired sequences found in the assay hybrid, or may include other desired sequences since the specificity of the antibody will generally not depend on the particular base sequence involved. Additional information regarding antibodies to intercalation complexes is provided in US Patent Application 560,429, filed December 12, 1983.

Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, antistoff-fragmenter, polyfunksjonelle anti-stof f aggreagater , eller generelt av et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifike bindingsposisjoner for et antistoff. Når det foreligger i form av hele antistoff, kan de tilhøre en hvilken som helst av klassene eller underklassene av kjente immungolbuliner, f.eks. IgG, IgM, osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slikt antistoff, som beholder spesifik bindingsaffini-tet for den hybridiserte proben kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG, konvensjonelt kjent som Fab, F(ab'), As indicated above, the antibody reagent can consist of whole antibodies, antibody fragments, polyfunctional antibody-substance aggregates, or generally of any substance that includes one or more specific binding positions for an antibody. When present in whole antibody form, they may belong to any of the classes or subclasses of known immunoglobulins, e.g. IgG, IgM, etc. Any fragment of any such antibody, which retains specific binding affinity for the hybridized probe may also be used, e.g. the fragments of IgG, conventionally known as Fab, F(ab'),

og F(ab')2. I tillegg kan aggregater, polymere, derivater og konjugater av immunogolbuliner eller fragmenter av disse, benyttes der hvor det er hensiktsmessig. and F(ab')2. In addition, aggregates, polymers, derivatives and conjugates of immunoglobulins or fragments thereof can be used where appropriate.

Immunoglobulinkilden for antistoff-reagensen kan oppnås på en hvilken som helst tilgjengelig måte som f.eks. ved konvensjonelle antiserum og monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av et dyr, som f.eks. en mus, kanin, marsvin eller geit, The immunoglobulin source for the antibody reagent can be obtained by any available means such as by conventional antiserum and monoclonal techniques. Antiserum can be obtained by well-known techniques involving immunization of an animal, such as a mouse, rabbit, guinea pig or goat,

med et egnet immunogen. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatiske cellehybridiserings-teknikker, og resulterer i det som vanligvis betegnes som monoklonale antistoffer, with a suitable immunogen. The immunoglobulins can also be obtained by somatic cell hybridization techniques, and result in what are commonly referred to as monoclonal antibodies,

og som også innbefatter anvendelse av et egnet immunogen.and which also includes the use of a suitable immunogen.

I de tilfeller hvor det anvendes en antistoff-reagens somIn cases where an antibody reagent is used which

er selektiv for interkolleringskomplekser, som anti-hybrid, kan en rekke forskjellige interkollatorforbindelser være innbefattet. Generelt kan man si at interkollatorforbindel-sen fortrinnsvis er et molekyl med lav molekylvekt, plant, vanligvis aromatisk men noen ganger polycyklisk, som er istand til binding med dobbeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA'DNA, DNA'RNA, eller RNA'RNA duplekser, vanligvis ved innføring mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen er vanligvis ikke-kovalent, mens kovalent binding finner sted som et andre trinn der hvor interkollatoren har reaktive eller aktivbare kjemiske grupper som kan danne kovalente bindinger med nabo-kjemiske grupper på en eller begge av de interkollerte duplekskjedene. Resultatet av interkolleringen er at nabo-basepar spres til ca. det dobbelte av den normale separa-sjonsavstanden, dette fører til en økning av molekyllengden for dupleksen. Videre må det skje en oppvikling av dobbelt-spiralen på ca. 12-36° for å gi plass til interkollatoren. Generelle oversikter og ytterligere opplysninger kan finnes is selective for intercollating complexes, such as anti-hybrid, a number of different intercollating compounds may be included. In general, it can be said that the intercollator compound is preferably a molecule with a low molecular weight, planar, usually aromatic but sometimes polycyclic, which is capable of binding with double-stranded nucleic acids, e.g. DNA'DNA, DNA'RNA, or RNA'RNA duplexes, usually by insertion between base pairs. The primary binding mechanism is usually non-covalent, while covalent binding takes place as a second step where the intercollator has reactive or activatable chemical groups that can form covalent bonds with neighboring chemical groups on one or both of the intercollated duplex chains. The result of the intercollation is that neighboring base pairs are spread to approx. twice the normal separation distance, this leads to an increase in the molecular length of the duplex. Furthermore, the double spiral must be wound by approx. 12-36° to accommodate the intercollator. General overviews and further information can be found

i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961); Bloomfield et al., "Physical Chemistry of NucleicAcids", kap. 7, side 429-479,Harper og Rowe, NY(1974); Waring, Nature 219:1320(1968); Hartmann et al., Angew. Chem.,Engl. Ed. 7:693 (1968);Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211 (1978); Wilson, Intercala-tion Chemistry (1982), 445; ogBerman et al., Ann. Rev.Bio-phys.Bioeng. 20:87(1981); såvel som fra den tidligere nevnte US patentsøknad nr. 560.429. Eksempler på interkollatorer in Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961); Bloomfield et al., "Physical Chemistry of Nucleic Acids", ch. 7, pp. 429-479, Harper and Rowe, NY (1974); Waring, Nature 219:1320(1968); Hartmann et al., Angew. Chem., Engl. Oath. 7:693 (1968); Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211 (1978); Wilson, Intercalation Chemistry (1982), 445; and Berman et al., Ann. Rev.Bio-phys.Bioeng. 20:87(1981); as well as from the previously mentioned US patent application No. 560,429. Examples of intercollators

er akridinfargestoffer, f.eks. akridinorange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furocoumariner, fenotiaziner, are acridine dyes, e.g. acridine orange, phenanthridines, e.g. ethidium, phenazines, furocoumarins, phenothiazines,

og kinoliner.and quinolines.

Interkolleringskompleksene dannes i analysemediet under hybridiseringen ved bruk av en probe som er modifisert i det komplementære, enkeltkjedede området, slik at en har interkollatoren kjemisk bundet til dette på en slik måte at det ved hybridisering dannes interkolleringskomplekser. The intercollation complexes are formed in the analysis medium during the hybridization using a probe that has been modified in the complementary, single-chain region, so that the intercollator is chemically bound to it in such a way that intercollation complexes are formed upon hybridization.

En hvilken som helst velegnet metode kan benyttes for å oppnå slik binding. Vanligvis dannes bindingen ved å bevirke interkollering med en reaktiv, fortrinnsvis fotoreaktiv, interkollator etterfulgt av bindingsreaksjonen. En spesielt nyttig fremgangsmåte innbefatter acidointerkollatorene. Any suitable method can be used to achieve such bonding. Typically, the bond is formed by effecting intercollation with a reactive, preferably photoreactive, intercollator followed by the binding reaction. A particularly useful method involves the acid intercollators.

Ved eksponering for ultrafiolett eller synlig lys, dannesUpon exposure to ultraviolet or visible light, is formed

de reaktive nitrenene likt. Nitrenene av akrylacider fore-trekker innføringsreaksjoner fremfor dannelse av omvandlings-produkter /se White et al., Methods in Enzymol. 46 : 644 ( 1977 )_/. Representative acidointerkollatorer er 3-azidoacridin, 9-azidoacridin, etidiummonoazid, etidiumdiazid, etidiumdimer-azid /Mitchell et a., JACS 104:4265 (1982 J), 4-azido-7-klor-kinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige fotoreagerbare interkollatorer er furocoumarinene som danner /2+2/ cyklo-addisjonsprodukter med pyrimidinresiduene. Alkylerings-midler kan også benyttes som f.eks. biskloroetylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner, the reactive nitrenes equally. The nitrenes of acrylic acids prefer introduction reactions to the formation of transformation products / see White et al., Methods in Enzymol. 46 : 644 ( 1977 )_/. Representative acid intercollators are 3-azidoacridine, 9-azidoacridine, ethidium monoazide, ethidium diazide, ethidium dimer-azide /Mitchell et al., JACS 104:4265 (1982 J), 4-azido-7-chloro-quinoline, and 2-azidofluorene. Other useful photoreactive intercollators are the furocoumarins which form /2+2/ cycloaddition products with the pyrimidine residues. Alkylating agents can also be used as e.g. bischloroethylamines and epoxides or aziridines, e.g. aflatoxins,

polycykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin, og norphyllin A. Den interkollator-modifiserte dupleksen denatureres så slik at den gir den modifiserte enkeltkjedede proben. polycyclic hydrocarbon epoxides, mitomycin, and norphyllin A. The intercollator-modified duplex is then denatured to yield the modified single-stranded probe.

Mens foretrukne anti-hybrider for bruk i foreliggende oppfinnelse, som angitt ovenfor, vil diskriminere ved binding mellom dobbeltkjedede og enkeltkjedede nukleinsyrer, er det ikke kritisk å ha slik selektivitet i alle utførelser. Der hvor slik selektivitet ikke er kritisk, blir et antall ekstra fremgangsmåter for å oppnå anti-hybrid tilgjengelige. While preferred anti-hybrids for use in the present invention, as indicated above, will discriminate upon binding between double-stranded and single-stranded nucleic acids, it is not critical to have such selectivity in all embodiments. Where such selectivity is not critical, a number of additional methods of achieving anti-hybrid become available.

Disse innbefatter anti-DNA'DNA antistoffer som er hovedsake lig ikke-spesifike overfor DNA både i enkelt- og dobbeltkjedet form, antistoffer dyrket mot kjemisk modifiserte nukleinsyrer som f.eks. cis-diamindikloroplatina-DNA addisjonsprodukter, antistoffer til Os04~oksydert DNA som f.eks. anti-tymin glykol, antistoffer til antibiotika-DNA komplekser som f.eks. anti-distamycin A-DNA kompleks eller anti-netropsin-DNA kompleks og antistoffer til modifiserte baser som f.eks. anti-5-bromouracil og anti-6-metyladenosin. Betydningen av dobbeltkjedet selektivitet er tilstede under utførelsen av analysen innbefatter merking av enkeltkjedet nukleinsyre, og derfor krever diskriminering mellom hybridisert og uhybridisert merket nukleinsyre. En slik situasjon er tilstede når enten en probe eller enkeltkjedede prøve-nukleinsyrer er merkede. Når på den annen side en merket form av en annen anti-hybrid reagens anvendes, er det bare nødvendig at en av det endelig immobiliserte anti-hybrid og det merkede anti-hybrid har selektivitet for dobbeltkjedede nukleinsyrer fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer. These include anti-DNA'DNA antibodies which are essentially non-specific towards DNA in both single and double chain form, antibodies raised against chemically modified nucleic acids such as e.g. cis-diaminedichloroplatinum-DNA addition products, antibodies to Os04~oxidized DNA such as e.g. anti-thymine glycol, antibodies to antibiotic-DNA complexes such as e.g. anti-distamycin A-DNA complex or anti-netropsin-DNA complex and antibodies to modified bases such as e.g. anti-5-bromouracil and anti-6-methyladenosine. The importance of double-stranded selectivity is present during the performance of the assay involving labeling of single-stranded nucleic acid, and therefore requires discrimination between hybridized and unhybridized labeled nucleic acid. Such a situation is present when either a probe or single-stranded sample nucleic acids are labeled. When, on the other hand, a labeled form of another anti-hybrid reagent is used, it is only necessary that one of the finally immobilized anti-hybrid and the labeled anti-hybrid have selectivity for double-stranded nucleic acids over single-stranded nucleic acids.

Selv om foreliggende fremgangsmåte spesielt er beskrevetAlthough the present method is specifically described

med anvendelse av immobilisering av hybrider ved binding til antistoffreagenser, bør det bemerkes at tilnærmet hvilket som helst stoff som har evnen til selektivt å binde nuklein-syrehybrider som dannes under analysen, på samme måte kan benyttes. Dette gjelder både de analyseutførelser som krever selektivitet for dobbeltkjedede nukleinsyrer såvel som hvor dobbeltkjedet versus enkeltkjedet selektivitet ikke er kritisk som diskutert ovenfor. Ekvivalenter for antistoffreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan benyttes uten å avvike fra foreliggende oppfinnelsesmessige konsept, vil normalt vise en meget spesifik ikke-kovalent binding, som f.eks. i ligand-reseptor og immunoglobulinbinding. Materialer som er tilgjengelige nå eller i fremtiden og som har slike karakteristiske bindingsegenskaper, betraktes som ekvi-valente med den foreliggende antistoffreagensen. with the use of immobilization of hybrids by binding to antibody reagents, it should be noted that virtually any substance capable of selectively binding nucleic acid hybrids formed during the assay can be similarly used. This applies both to those analysis designs that require selectivity for double-stranded nucleic acids as well as where double-stranded versus single-stranded selectivity is not critical as discussed above. Equivalents for the antibody reagent according to the present invention, which can be used without deviating from the present inventive concept, will normally show a very specific non-covalent bond, which e.g. in ligand-receptor and immunoglobulin binding. Materials available now or in the future which have such characteristic binding properties are considered equivalent to the present antibody reagent.

Antistoffreagensen bringes i kontakt med de dannede hybrider, enten i en immobilisert form eller en immobiliserbar form, dvs. at den deretter kan gjøres immobil ved konvensjonelle fremgangsmåter. Det foretrekkes generelt å anvende immobiliserte former av anti-hybridet. Et stort antall fremgangsmåter er kjente for immobilisering av proteiner for faste bærere, og de fleste av fremgangsmåtene kan anvendes på antistoffer /se Methods in Anzymology, vol. 44 (1976]_/. Antistoffer immobiliseres vanligvis enten ved kovalent kobling eller ved ikke-kovalent adsorbsjon. Ikke-kovalente fremgangsmåter som ofte anvendes, er ikke-spesifik adsorbsjon på polystyren-perler eller mikropartikler, og på polyvinylkloridoverflater. Mange kovalente fremgangsmåter benyttes og noen innbefatter cyanogenbromid aktiverte agaroser og dekstraner; glutaraldehyd aktiverte nyloner og polyakrylamider; og epoksyder på akryl- eller andre bærere. Antistoffer av IgG-klassen kan også immobiliseres ved binding til immobiliserte former av protein A. Der hvor protein A benyttes for denne immobilisering og merket anti-hybrid skal brukes i analysen, må man omhyggelig unngå at det merkede anti-hybridet også bindes ved det immobiliserte protein A, som f.eks. ved metning av bindingsposisjonene på protein A eller ved benyttelse av et merket anti-hybrid som ikke innbefatter protein A reseptor posisjonen, f.eks. ved å benytte Fab eller Fab' eller et anti-hybrid fra en annen immunogøibulinklasse enn IgG. The antibody reagent is brought into contact with the hybrids formed, either in an immobilized form or an immobilizable form, i.e. it can then be made immobilized by conventional methods. It is generally preferred to use immobilized forms of the anti-hybrid. A large number of methods are known for the immobilization of proteins to solid supports, and most of the methods can be applied to antibodies / see Methods in Anzymology, vol. 44 (1976]_/. Antibodies are usually immobilized either by covalent coupling or by non-covalent adsorption. Non-covalent methods that are often used are non-specific adsorption on polystyrene beads or microparticles, and on polyvinyl chloride surfaces. Many covalent methods are used and some include cyanogen bromide activated agaroses and dextrans; glutaraldehyde activated nylons and polyacrylamides; and epoxides on acrylic or other supports. Antibodies of the IgG class can also be immobilized by binding to immobilized forms of protein A. Where protein A is used for this immobilization and labeled anti-hybrid is to be used in the analysis, one must carefully avoid that the labeled anti-hybrid also binds to the immobilized protein A, such as by saturating the binding positions on protein A or by using a labeled anti-hybrid that does not include the protein A receptor position, for example by using Fab or Fab' or an anti-hybrid from another immuno göibulin class than IgG.

Hovedhensikten med immobiliseringen er å muliggjøre fysisk mannipulering og isolering eller separering av hybrider som er dannet i analysen, for å bestemme mengden av disse ved hjelp av responsen eller signalet som produseres av merket. Det vil si at immobiliseringen kan finne sted etter bindingen av anti-hybrid til hybrider som er dannet i analysen. The main purpose of the immobilization is to enable physical manipulation and isolation or separation of hybrids formed in the assay, to determine their quantity by means of the response or signal produced by the label. That is to say, the immobilization can take place after the binding of anti-hybrid to hybrids formed in the analysis.

En rekke fremgangsmåter for å oppnå dette, er nærliggende. A number of methods to achieve this are obvious.

Man kan anvende immobiliserte anti-(anti-hybrid)-antistoffer, ved å sørge for at dersom merkede anti-hybrider skal benyttes i analysen, må de immobiliserte antistoffene ikke ha betydelig affinitet for den merkede reagensen. Dette kan oppnås ved å anvende antigenetisk adskillbare immunoglobuliner som de to anti-hybrid-reagensene, f.eks. ved å benytte anti-hybrider fra forskjellige immunoglobulinklasser.Immobilisert protein A kan også anvendes med de samme forsiktighetsregler som beskrevet ovenfor, angående bruken av protein A og merket anti-hybrid. Spesielt nyttig er utførelser som innbefatter kjemisk modifisering av anti-hybridet ved konjugering til en del av et spesifikt bindende par, og anvendelse av en immobilisert form av den andre delen av paret. Nyttige bindende par som de kan velges fra, innbefatter biotin/avidin, haptener og antigener/antistoffer, karbohydrater/lectiner, enzymer/inhibitorer, o.l. Det er foretrukket å modifisere anti-hybridet med biotin eller en hapten, og anvende henholdsvis : en immobilisert for av avidin- eller anti-hapten antistoff. Immobilized anti-(anti-hybrid) antibodies can be used, by ensuring that if labeled anti-hybrids are to be used in the analysis, the immobilized antibodies must not have significant affinity for the labeled reagent. This can be achieved by using antigenetically separable immunoglobulins as the two anti-hybrid reagents, e.g. by using anti-hybrids from different immunoglobulin classes. Immobilized protein A can also be used with the same precautions as described above, regarding the use of protein A and labeled anti-hybrid. Particularly useful are embodiments that involve chemical modification of the anti-hybrid by conjugation to one part of a specific binding pair, and use of an immobilized form of the other part of the pair. Useful binding pairs from which to choose include biotin/avidin, haptens and antigens/antibodies, carbohydrates/lectins, enzymes/inhibitors, and the like. It is preferred to modify the anti-hybrid with biotin or a hapten, and use respectively: an immobilized for of avidin or anti-hapten antibody.

De hybridene av interesse som til sist blir assosiert medThose hybrids of interest that are eventually associated with

den immobiliserte antistoffreagensen, kan bestemmes på en rekke forskjellige måter. Det foretrekkes generelt å anvende en merket probe eller en merket form av en annen antistoff-reagens som er istand til binding til det dannede hybridet. Den sistnevnte fremgangsmåten er spesielt foretrukket fordi hverken proben eller prøvenukleinsyrene må modifiseres kjemisk, f.eks. ved merking, for å utføre analysen. Man kan enkel bringe hybridene i kontakt med den immobiliserte eller immobiliserbare første antistoff-reagensen, og med den merkede andre antistoffreagensen, og bestemme merket som assosieres med den immobiliserte fasen, eller alternativt måle merket som er igjen som ubundet merket annen antistoffreagens. the immobilized antibody reagent, can be determined in a number of different ways. It is generally preferred to use a labeled probe or a labeled form of another antibody reagent capable of binding to the hybrid formed. The latter method is particularly preferred because neither the probe nor the test nucleic acids have to be chemically modified, e.g. when labeling, to perform the analysis. One can simply bring the hybrids into contact with the immobilized or immobilizable first antibody reagent, and with the labeled second antibody reagent, and determine the label associated with the immobilized phase, or alternatively measure the label that remains as unbound labeled second antibody reagent.

Det er mulig å anvende samme stoffer som første og andre antistoffreagens. F.eks. kan man benytte anti-DNA'RNA der hvor det dannes DNA1 RNA hybrider, og en fraksjon av slike anti-hybrider kan immobiliseres og en annen fraksjon merkes.Hybridene vil ha multiple epitoper for anti-DNA'RNA, som muliggjør binding av både merket og immobilisert anti-hybrid. Alternativt kan forskjellige anti-hybrider benyttes, der hvor f.eks. monoklonale antistoffer benyttes, kan man anvende forskjellige hybridomas for forskjellige bindings-spesifisiteter og/eller affiniteter. It is possible to use the same substances as first and second antibody reagents. E.g. anti-DNA'RNA can be used where DNA1 RNA hybrids are formed, and a fraction of such anti-hybrids can be immobilized and another fraction labeled. The hybrids will have multiple epitopes for anti-DNA'RNA, which enables binding of both the labeled and immobilized anti-hybrid. Alternatively, different anti-hybrids can be used, where e.g. monoclonal antibodies are used, different hybridomas can be used for different binding specificities and/or affinities.

Merkede prober kan benyttes i foreliggende oppfinnelse på flere måter. I et tilfelle, benyttes en enkelt merket probe og de resulterende merkede hybrider separeres fra den frie merkede proben for detektering ved binding til immobilisert eller immobiliserbart anti-hybrid. Alternativt kan man benytte en dual hybridiseringsfremgangsmåte som innbefatter to probesegmenter som er komplementære til ensidig eksklusive segmenter av sekvensen som skal detekteres. Et av probeseg-mentene vil være merket og det andre vil danne pitoper for anti-hybrid ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres . Labeled probes can be used in the present invention in several ways. In one case, a single labeled probe is used and the resulting labeled hybrids are separated from the free labeled probe for detection by binding to immobilized or immobilizable anti-hybrid. Alternatively, a dual hybridization method can be used which includes two probe segments which are complementary to unilaterally exclusive segments of the sequence to be detected. One of the probe segments will be labeled and the other will form pit peaks for anti-hybrid when hybridizing with the sequence to be detected.

En rekke andre merke-fremgangsmåter vil være innlysende. F.eks. kan man, selv om det er betydelig mindre ønskelig, innføre merke ved å merke enkeltkjedede prøvenukleinsyrer A number of other marking procedures will be obvious. E.g. one can, although it is considerably less desirable, introduce a label by labeling single-stranded sample nucleic acids

in situ, man oppnår derved merkede hybrider ved hybridisering med den umerkede proben. Videre kan, som diskutert nedenfor, komponenten som skal merkes, direkte bindes, f.eks. ved kovalente bindinger, til stoffer som tilveiebringer det endelige detekterbare signalet, eller ved indirekte binding som f.eks. ved konkorporering av det endelige detekterbare stoffet i en mikrokapsel eller liposom, som i sin tur forbindes med komponenten som skal merkes. Videre kan man merke med en spesifik bindbar ligand, f.eks. en hapten eller biotin, og bringe det endelige detekterbare stoffet ved et hvilket som helst ønsket tidspunkt, inn i analysen, ved tilsats av en bindende partner for liganden, f.eks. et antistoff eller avidin, hvortil det detekterbare spcies forbindes. Når man anvender immobiliserte og merkede anti-hybrider, kan de tilsettes til reaksjonsblandingen samtidig; imidlertid kan virkningen optimaliseres, avhengig av det spesielle sys-tem, ved å tilsette en av komponentene et bestemt tidsrom før den andre. in situ, thereby obtaining labeled hybrids by hybridization with the unlabeled probe. Furthermore, as discussed below, the component to be labeled can be directly bound, e.g. by covalent bonds, to substances that provide the final detectable signal, or by indirect binding such as e.g. by incorporating the final detectable substance into a microcapsule or liposome, which in turn is associated with the component to be labeled. Furthermore, one can label with a specific bindable ligand, e.g. a hapten or biotin, and bring the final detectable substance at any desired time into the assay, by addition of a binding partner for the ligand, e.g. an antibody or avidin, to which the detectable species binds. When using immobilized and labeled anti-hybrids, they can be added to the reaction mixture simultaneously; however, the effect can be optimized, depending on the particular system, by adding one of the components a certain time before the other.

Merker av forskjellige typer kan anvendes til å merke prober, annen anti-hybrid, osv., som beskrevet ovenfor. Merket vil være et stoff som har en detekterbar fysisk, kjemisk, eller elektrisk egenskap. Slike materialer er velutviklede innen feltet immunoanalyser og generelt kan et hvilket som helst merke som er nyttige ved slike fremgangsmåter, anvendes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige er enzymatisk aktive grupper, som f.eks. enzymer (se Clin. Chem (1976) 22:1232, US Reissue Pat. 31.006, og UK pat. 2.019.408), enzymsubstrater (se britisk pat. 1.548.741), koenzymer (se US pat. nr. 4.230.797 og 4.238.565), og enzyminhibitorer (se US patent 4.134.792); flourescerende stoff (se Clin. Chem. (1979) 25:353); kromoforerende stoff; luminescerende stoff som f.eks. kjemiluminiscerende og bioluminiscerende stoff (se Clin. Chem. (1979) 25:512, og ibid, 1531); spesifikt bindbare ligander som f.eks. biotin, (se Eur. Pat. 63.879) eller et hapten (se PCT Publ. 83-2286); og radioisotoper som f.eks.<3>H,<35>S,<32>P,<125>I og 14C. Slike merker detekteres på basis av deres fysiske egenskaper (f.eks. fluore-scens, kromoforese og radioisotoper), eller deres reaktive og bindende egenskaper (f.eks. enzymer, substrater, koenzymer og inhibitorer). F.eks. kan et kofaktor-merket species detekteres ved tilsats av enzymet (eller enzymer hvor et ringslutningssystem benyttes) som merket er en kofaktor for, og et substrat eller substrater for enzymet. En hapten eller ligand (f.eks. biotin) merket species, kan detekteres ved tilsats av et antistoff til haptenen eller et protein (f.eks. avidin), som binder liganden, merket med et detekterbart molekyl. Slike detekterbare molekyler kan være molekyler med en målbar fysisk egenskap (f.eks. fluorescerende eller absorberende molekyler), eller en deltager i en enzymreaksjon (se liten ovenfor). F.eks. kan man benytte et enzym som virker på et substrat, slik at det genereres et produkt med en målbar fysisk egenskap. Eksempler på sistnevnte innbefatter, men er ikke begrenset til, B -galaktosidase, alkalisk fosfatase og peroksydase. Labels of various types can be used to label probes, other anti-hybrid, etc., as described above. The mark will be a substance that has a detectable physical, chemical or electrical property. Such materials are well developed in the field of immunoassays and generally any brand useful in such methods can be used in the present invention. Particularly useful are enzymatically active groups, such as e.g. enzymes (see Clin. Chem (1976) 22:1232, US Reissue Pat. 31,006, and UK Pat. 2,019,408), enzyme substrates (see UK Pat. 1,548,741), coenzymes (see US Pat. No. 4,230,797 and 4,238,565), and enzyme inhibitors (see US Patent 4,134,792); fluorescent substance (see Clin. Chem. (1979) 25:353); chromophoric substance; luminescent substance such as e.g. chemiluminescent and bioluminescent substance (see Clin. Chem. (1979) 25:512, and ibid, 1531); specifically bindable ligands such as e.g. biotin, (see Eur. Pat. 63,879) or a hapten (see PCT Publ. 83-2286); and radioisotopes such as <3>H, <35>S, <32>P, <125>I and 14C. Such labels are detected on the basis of their physical properties (eg, fluorescence, chromophoresis, and radioisotopes), or their reactive and binding properties (eg, enzymes, substrates, coenzymes, and inhibitors). E.g. a cofactor-labeled species can be detected by adding the enzyme (or enzymes where a ring closure system is used) for which the label is a cofactor, and a substrate or substrates for the enzyme. A hapten or ligand (eg biotin) labeled species can be detected by adding an antibody to the hapten or a protein (eg avidin), which binds the ligand, labeled with a detectable molecule. Such detectable molecules can be molecules with a measurable physical property (eg fluorescent or absorbing molecules), or a participant in an enzyme reaction (see small above). E.g. you can use an enzyme that acts on a substrate, so that a product with a measurable physical property is generated. Examples of the latter include, but are not limited to, β-galactosidase, alkaline phosphatase and peroxidase.

Der hvor en andre antistoffreagens benyttes for å måle dupleksen som assosieres med den immobiliserte første antaistoffreagensen, kan et slikt andre antistoff detekteres på basis av en iboende egenskap, som f.eks. dets antigenisi-tet. Et merket anti-(antistoff) antistoff vil bindes til den andre antistoffreagensen hvor merket for det andre antistoffet er et hvilket som helst konvensjonelt merke som ovenfor. Videre kan antistoffet detekteres ved komplement-fiksering, eller ved bruk av det merkede protein A, såvel som ved andre teknikker kjent for detektering av antistoffer. Der hvor merket protein A benyttes, vil den immobiliserte antistoffreagensen være i en form som mangler protein A bindingsposisjonen (f.eks. kan man anvende immobilisert Fab elelr Fab'). Where a second antibody reagent is used to measure the duplex associated with the immobilized first antibody reagent, such second antibody can be detected on the basis of an intrinsic property, such as its antigenicity. A labeled anti-(antibody) antibody will bind to the second antibody reagent where the label for the second antibody is any conventional label as above. Furthermore, the antibody can be detected by complement fixation, or by using the labeled protein A, as well as by other techniques known for detecting antibodies. Where labeled protein A is used, the immobilized antibody reagent will be in a form that lacks the protein A binding position (eg immobilized Fab or Fab' can be used).

Fremgangsmåter for fremstilling av merkede komponenter benyt-tet i de foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse, er lett tilgjengelige fra tidligere kjent teknikk. Mest foretrukket er de analyseutførelsene som innbefatter merkede prober eller merket andre anti-hybrid. Merkene som er beskrevet ovenfor kan benyttes ved disse utførelsene. Ved merking av prober anvender man syntetiske fremgangsmåter som er effektive for modifisering av nukleinsyrer uten at det i stor grad interfererer med den merkede probens evne til å delta i hybridiseringen, og man velger merke som er tilstrekkelig stabile ved de betingelsene som benyttes for hybridiseringen til å muliggjøre etterfølgende detektering. Methods for producing labeled components used in the preferred embodiments of the present invention are readily available from prior art. Most preferred are those assays which include labeled probes or labeled other anti-hybrid. The marks described above can be used for these designs. When labeling probes, synthetic methods are used that are effective for modifying nucleic acids without interfering to a large extent with the ability of the labeled probe to participate in the hybridization, and a label is chosen that is sufficiently stable under the conditions used for the hybridization to enable subsequent detection.

Som et eksempel kan følgende fremgangsmåte benyttes til merking av prober. Radioaktivt merkede nukleotider kan innkorporeres i DNA prober ved fremgangsmåter som f.eks. nick-translatering, terminal merking med terminal deoksynukleotidy1 transferase, og in vivo merking. Radioaktivt merkede nukleotider kan innkorporeres i RNA prober under in vitro syntese med DNA-avhengige RNA polymerase, fra bakteriofag SP6 ved bruk av "Riboprobe TM " DNA sjablongsystem. Fremgangsmåoten etter Langer et al., /Tl981) Proe.Nati. Acad. Sei., 78:6633/ Iran horn;l-)-p<; t- i 1 å knhlp hi n-t-in t- i 1 H<=>+- nrimjprp aminpt f\\ t 5-(3-amino)allyluridin og deoksyuridintrifosfater. Disse biotinylerte nukleotidene kan inkorporeres i dobbeltkjedet DNA ved nick-translatering, eller tilsettes til 3'-0H terminalene med terminal deoksynukleotidyl transferase. Biotin kan også festes til 3<1->0H terminalene av RNA ved polyamin-/Broker, T.R., (1978)Nucl. Acids Res. 4:363/ og cytokrom C-broer /Sodja, A. og Davidson, N. (1978) Nucl. Acids Res. 5:385/. Direkte kobling av proteinmerker til prober kan utføres ved fremgangsmåten ifølge Renz /Tl983) EMBO Journal, As an example, the following procedure can be used for labeling probes. Radioactively labeled nucleotides can be incorporated into DNA probes by methods such as e.g. nick translation, terminal labeling with terminal deoxynucleotidy1 transferase, and in vivo labeling. Radioactively labeled nucleotides can be incorporated into RNA probes during in vitro synthesis with DNA-dependent RNA polymerase, from bacteriophage SP6 using the "Riboprobe TM" DNA template system. The procedure according to Langer et al., /Tl981) Proe.Nati. Acad. Sei., 78:6633/ Iran horn;l-)-p<; t- i 1 to knhlp hi n-t-in t- i 1 H<=>+- nrimjprp aminpt f\\ t 5-(3-amino)allyluridine and deoxyuridine triphosphates. These biotinylated nucleotides can be incorporated into double-stranded DNA by nick-translation, or added to the 3'-OH terminals by terminal deoxynucleotidyl transferase. Biotin can also be attached to the 3<1->0H termini of RNA by polyamine-/Broker, T.R., (1978)Nucl. Acids Res. 4:363/ and cytochrome C bridges /Sodja, A. and Davidson, N. (1978) Nucl. Acids Res. 5:385/. Direct coupling of protein labels to probes can be carried out by the method according to Renz /Tl983) EMBO Journal,

12 5 12 5

2:817/ som koblet I-histoner til denaturert DNA med glutaraldehyd. Enzymer som f.eks. peroksydase og alkalisk fosfatase kan bindes til DNA prober ved hjelp av tilsvarende kjemi /Renz og Kurz (1984) Nucl. Acids Res. 12.3435/. Andre kjemiske fremgangsmåter for ende-merking av DNA prober innbefatter den som er beskrevet av Eshaghpour et al., /(1979) Nucl. Acids Res. 7:1485/. Et eller flere 4-tiouridinrester kan innføres på 3'-0H endene av DNA og tiolene reageres med forskjellige elektrofile reagenser med lav molekylvekt. Dene kjemien kan benyttes for å forbinde forskjellige haptener til DNA-prober. Merking med hapten N-acetoksy-N-2-acetyla-aminofluoren, er beskrevet av Tchen et al., /Tl984) Proe. Nati. Acad. Sei. 81:3566/. DNA og RNA prober kan reageres med N-acetoksy-N-2-acetylaminofluoren og gir et addisjonspro-dukt som har N-2-acetylaminofluoren residuer forbundet med 8-karbonet av guanin. Det kovalent modifiserte DNA kan detekteres med antistoff opprettet mot N-acetoksy-N-2-acetyl-amino-fluoren-residu. Fremgangsmåten etter Hu og Messing /Tl982)^Gene, 17:271/ kan benyttes for tilsats av merker til prober som er klonet inn i enkeltkjedede M13 vektorer. En universal primer, komplementær til området 5' av kloneposisjonen, ini-tierer DNA syntese komplementært til M13 kjeden nedenfor probesekvensen. Siden DNA polymerasen vil inkorporere radioaktive nukleotide trifosfater og biotin 5-(3-aminoallyl) deoksyuridintrifosfat i den nye kjeden, kan disse merkene forbindes til vektoren borte fra probesekvensen. Den dobbeltkjedede delen kan også modifiseres ved reaksjon med 8-^azidoetidium. 2:817/ who linked I histones to denatured DNA with glutaraldehyde. Enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase can be bound to DNA probes using similar chemistry /Renz and Kurz (1984) Nucl. Acids Res. 12.3435/. Other chemical methods for end-labeling DNA probes include that described by Eshaghpour et al., (1979) Nucl. Acids Res. 7:1485/. One or more 4-thiouridine residues can be introduced on the 3'-OH ends of DNA and the thiols are reacted with various low molecular weight electrophilic reagents. This chemistry can be used to connect different haptens to DNA probes. Labeling with the hapten N-acetoxy-N-2-acetyl-aminofluorene is described by Tchen et al., (T1984) Proe. Nati. Acad. Pollock. 81:3566/. DNA and RNA probes can be reacted with N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene and give an addition product that has N-2-acetylaminofluorene residues connected to the 8-carbon of guanine. The covalently modified DNA can be detected with antibodies created against N-acetoxy-N-2-acetyl-amino-fluorene residues. The procedure according to Hu and Messing /Tl982)^Gene, 17:271/ can be used for adding tags to probes that have been cloned into single-chain M13 vectors. A universal primer, complementary to the region 5' of the clone position, initiates DNA synthesis complementary to the M13 strand below the probe sequence. Since the DNA polymerase will incorporate radioactive nucleotide triphosphates and biotin 5-(3-aminoallyl) deoxyuridine triphosphate into the new chain, these tags can be ligated into the vector away from the probe sequence. The double chain part can also be modified by reaction with 8-α-azidoethidium.

Fremstillingen av merkede antistoffer er grundig beskrevet The preparation of labeled antibodies is thoroughly described

125 125

i litteraturen. Inkorporering av I-merke kan utføres ved fremgangsmåten ifølge Balton og Hunter (1973) Biochem. in the literature. Incorporation of I label can be carried out by the method of Balton and Hunter (1973) Biochem.

J. 133:529. Ishikawa et al. (1983) J. Immunoassay 4:209J. 133:529. Ishikawa et al. (1983) J. Immunoassay 4:209

har angitt flere forskjellige fremgangsmåter for kobling av forskjellige enzymer til antistoffer. Yoshitake et al., have disclosed several different methods for linking different enzymes to antibodies. Yoshitake et al.,

(1979) Eur. J. Biochem. 101:395 har beskrevet en fremgangsmåte for bruk av maleimider til å koble glukoseoksydase til antistoff. Alkalisk fosfatase kan kobles til antistoff med glutaraldehyd /Voller et al., (1976) Bull. World Health Organ., 53:55/. Antistoffer kan merkes med fluorescein ved fremgangsmåten beskrevet av Blakeslee og Baines (1976) J. Immunol. Meth., 31:305. Kjemiluminiscente merker kan innføres ved fremgangsmåten ifølge Schroeder et al., (1981) Clin. Chem. 27:1378. (1979) Eur. J. Biochem. 101:395 has described a method for using maleimides to couple glucose oxidase to antibody. Alkaline phosphatase can be coupled to antibody with glutaraldehyde /Voller et al., (1976) Bull. World Health Organ., 53:55/. Antibodies can be labeled with fluorescein by the method described by Blakeslee and Baines (1976) J. Immunol. Meth., 31:305. Chemiluminescent labels can be introduced by the method of Schroeder et al., (1981) Clin. Chem. 27:1378.

Med referanse til tegningene og eksemplene som følger, kanWith reference to the drawings and examples that follow, can

nå få spesifike utførelser av foreliggende analyse beskrives. now few specific embodiments of the present analysis are described.

Fremgangsmåten vist i fig. 1 innbefatter bruk av en umerket polynukleotid probe som er enten RNA eller DNA når prøvese-kvensen av interesse er RNA elelr er RNA når prøvesekvensen er DNA. To populasjoner av anti-hybrid antistoffer (Ab) anvendes, disse kan innbefatte det samme eller forskjellige polyklonale eller monoklonale immunoglobuliner som er selektive for RNA'RNA eller RNA1 DNA hybrider, avhengig av utgangs-materialene. Den første anti-hybride reagensen er tilstede i en immobilisert form, og en andre er merket med et flourescerende stoff. Ved dannelse av hybrider mellom sekvensen av interesse og proben, dannes det bindingsposisjoner for anti-hybrid reagensene. De resulterende, immobiliserte og merkede hybrider separeres fra ubundet, merket anti-hybrid og fluorescensmengen som dannes av det immobiliserte species, måles og korreleres med nærværet eller mengden av sekvensen av interesse i prøven. The procedure shown in fig. 1 involves the use of an unlabelled polynucleotide probe which is either RNA or DNA when the sample sequence of interest is RNA or is RNA when the sample sequence is DNA. Two populations of anti-hybrid antibodies (Ab) are used, these may include the same or different polyclonal or monoclonal immunoglobulins which are selective for RNA'RNA or RNA1 DNA hybrids, depending on the starting materials. The first anti-hybrid reagent is present in an immobilized form, and a second is labeled with a fluorescent substance. Upon formation of hybrids between the sequence of interest and the probe, binding sites for the anti-hybrid reagents are formed. The resulting immobilized and labeled hybrids are separated from the unbound, labeled anti-hybrid and the amount of fluorescence produced by the immobilized species is measured and correlated with the presence or amount of the sequence of interest in the sample.

I fremgangsmåten vist i fig. 2, er proben dobbelt modifisert, både med et biotinmerke (bio) og en kjemisk bundet interkollator (I). Et antistoff (Ab) til interkolleringskompleksene tjener som den kritiske anti-hybrid reagensen og er tilstede i en immobilisert form. Biotin-merket detekteres ved bruk av avidin (Av) merket med et detekterbart enzym. Ved avslut-ningen av hybridiseringstrinnet, separeres de resulterende immobiliserte og merkede hybrider fra ubundet, merket avidin og enzymaktiviteten av det immobile species måles og relateres til nærværert av sekvensen av interesse. In the method shown in fig. 2, the probe is doubly modified, both with a biotin label (bio) and a chemically bound intercollator (I). An antibody (Ab) to the intercalation complexes serves as the critical anti-hybrid reagent and is present in an immobilized form. The biotin label is detected using avidin (Av) labeled with a detectable enzyme. At the conclusion of the hybridization step, the resulting immobilized and labeled hybrids are separated from unbound, labeled avidin and the enzyme activity of the immobile species is measured and related to the presence of the sequence of interest.

Prøvene som analyseres kan være et hvilket som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk, veterinærmedisinsk, miljømessig, ernæringsmessig, eller industriell betydning. Humane og animale prøver og legemsvæsker kan spesielt analyseres ved foreliggende fremgangsmåte, innbefattet urin, blod (serum eller plasma), melk, cerebrospinalvæske, spytt, avføring, lungeaspirater, hals-avstrykninger, genitale avstrykninger og exudater, rektal-avstrykninger og nasofarnygale aspirater. Der hvor prøvene som tas fra pasienten eller andre kilder for undersøkelse inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer, The samples analyzed can be any medium of interest, and will usually be a liquid sample of medical, veterinary, environmental, nutritional, or industrial importance. Human and animal samples and body fluids can in particular be analyzed by the present method, including urine, blood (serum or plasma), milk, cerebrospinal fluid, saliva, faeces, lung aspirates, throat swabs, genital swabs and exudates, rectal swabs and nasopharyngeal aspirates. Where the samples taken from the patient or other sources for examination mainly contain double-stranded nucleic acids,

slik de f.eks. inneholdes i celller, behandles prøvene slik at nukleinsyrene denatureres, og om nødvendig slik at nukleinsyrene først frigjøres fra cellene. Denaturering av nukleinsyrer oppnås fortrinnsvis ved opparming i kokende vann, eller alkalibehandling (f.eks. 0,1 N natriumhydroksyd), som, om ønsket, samtidig kan benyttes for å lyse cellene. Frigjøring av nukleinsyrer kan også f.eks. oppnås ved meka-nisk nedbrytning (frysing/opptining, abrasjon, ved hjelp av lydbølger), fysisk/kjemisk nedbrytning (rensemidler som f.eks. "Triton", "Tween", natriumdodecylsulfat, alkalibehandling, osmotisk sjokk, eller varme), eller enzymatisk lysing (lysozym, proteinase K, pepsin). Det resulterende forsøksmedium vil inneholde nukleinsyrer i enkeltkjedet form som så kan analyseres ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte. I tilfeller hvor RNA1 DNA hybrider skal detekteres med merkede antistoffreagenser, kan mRNA og rRNA i prøven fjernes fra deltagelse i hybridiseringsreaksjonen ved kon- as they e.g. are contained in cells, the samples are processed so that the nucleic acids are denatured and, if necessary, so that the nucleic acids are first released from the cells. Denaturation of nucleic acids is preferably achieved by enrichment in boiling water, or alkali treatment (e.g. 0.1 N sodium hydroxide), which, if desired, can be used at the same time to lyse the cells. Release of nucleic acids can also e.g. achieved by mechanical degradation (freezing/thawing, abrasion, using sound waves), physical/chemical degradation (cleaning agents such as "Triton", "Tween", sodium dodecyl sulfate, alkali treatment, osmotic shock, or heat), or enzymatic lysis (lysozyme, proteinase K, pepsin). The resulting test medium will contain nucleic acids in single-chain form which can then be analyzed according to the present hybridization method. In cases where RNA1 DNA hybrids are to be detected with labeled antibody reagents, mRNA and rRNA in the sample can be removed from participation in the hybridization reaction by con-

vensjonelle fremgangsmåter som f.eks. behandling under alka-liske betingelser, f.eks. de samme betingelser som ble benyt-tet for å denaturere nukleinsyrene i prøven. conventional methods such as treatment under alkaline conditions, e.g. the same conditions that were used to denature the nucleic acids in the sample.

Som kjent innen teknikken, kan forskjellige hybridiserings-betingelser benyttes ved analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved svakt forhøyede temperaturer, f.eks. mellom ca. 35 og 75°C, vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med egnet ionestyrke (f.eks. 5XSSC hvor 1XSSC = 0,15 M natriumklorid og 0,015 M natriumcitrat, pH 7,0) og eventuelt protein, som f.eks. bovinserumalbumin, og en denaturert fremmed DNA, f.eks. fra kalvetymus eller laksespermer. I tilfelle hvor lavere hybridiseringstemperaturer ønskes, kan hybrogenbindingsrea-genser som f.eks. dimetylsulfoksyd og formamid innbefattes. Graden av komplementaritet mellom prøven og probekjedene As is known in the art, different hybridization conditions can be used in the analysis. Typically, the hybridization will take place at slightly elevated temperatures, e.g. between approx. 35 and 75°C, usually around 65°C, in a solution including buffer at pH between approx. 6 and 8, and with suitable ionic strength (e.g. 5XSSC where 1XSSC = 0.15 M sodium chloride and 0.015 M sodium citrate, pH 7.0) and possibly protein, such as e.g. bovine serum albumin, and a denatured foreign DNA, e.g. from calf thymus or salmon sperm. In the case where lower hybridization temperatures are desired, hydrogen bonding reagents such as e.g. dimethylsulfoxide and formamide are included. The degree of complementarity between the sample and the probe chains

som kreves for at hybridiseringen skal finne sted, avhenger av stringensen ved betingelsene. Faktorer som bestemmer stringensen er vel kjente i teknikken. required for the hybridization to take place depends on the stringency of the conditions. Factors that determine the stringency are well known in the art.

Normalt vil de temperaturbetingelsene som velges for hybridiseringen være inkompatible med bindingen av antihybrid-reagensen til dannede hybrider og detektering av merke-responsen. Følgelig vil anti-hybrid bindingstrinnet og merke deteksjonstrinnet foregå etter avslutning av hybridiseringstrinnet. Reaksjonsblandingen vil vanligvis bringes til en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, og bindings-og deteksjonstrinnene utføres så. Fortynning av hybridiser-ingsblandingen før tilsats av antihybrider er ønskelig når salt- og/eller formamid-konsentrasjonene er høye nok til i betydelig grad å påvirke antistoff bindingsreaksjonen. Normally, the temperature conditions chosen for the hybridization will be incompatible with the binding of the antihybrid reagent to the hybrids formed and the detection of the label response. Consequently, the anti-hybrid binding step and the label detection step will take place after completion of the hybridization step. The reaction mixture will usually be brought to a temperature in the range from approx. 3°C to approx. 40°C, and the binding and detection steps are then performed. Dilution of the hybridization mixture before adding antihybrids is desirable when the salt and/or formamide concentrations are high enough to significantly affect the antibody binding reaction.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. en reagens-kombinasjon eller innretninger som innbefatter alle de essensielle elementene som kreves for å gjennomføre en ønsket analysemetode. Reagenssystemet er tilstede i en kommersielt pakket form, som en sammensetning eller tilsetning der hvor kompatibiliteten av reagensene vil tillate det, i en forsøksinnretningskonfigurasjon, eller vanligvis som er forsøkspakke, dvs. en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere, innretninger, e.l., som inneholder de nødvendige reagenser, vanligvis innbefattet skriftlig instruksjon for gjennomføring av analysene. Reagenssystemer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigura-sjoner og sammensetninger for utførelse av forskjellige hybri-diseringsanalyser som er beskrevet. The present invention additionally provides a reagent system, i.e. a reagent combination or devices which include all the essential elements required to carry out a desired analysis method. The reagent system is present in a commercially packaged form, as a composition or admixture where the compatibility of the reagents will permit, in an experimental device configuration, or usually which is an experimental package, i.e. a packaged combination of one or more containers, devices, etc., containing the necessary reagents, usually including written instructions for carrying out the analyses. Reagent systems according to the present invention include all configurations and compositions for performing various hybridization analyzes that have been described.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en nukleinsyreprobe som beskrevet, og (2) anti-hybrid reagensen. En forsøkspakke av systemet kan i tillegg innbefatte hjelpe-kjemikalier som f.eks. komponentene av hybridiseringsoppløs-ningen og denatureringsagentene som er istand til å overføre dobbeltkjedede nukleinsyrer i en prøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis er det innbefattet et kjemisk lysings- og de-natureringsmiddel, f.eks. alkali, for behandling av prøven slik at enkeltkjedet nukleinsyre frigjøres fra denne. In all cases, the reagent system will include (1) a nucleic acid probe as described, and (2) the anti-hybrid reagent. A trial package of the system can also include auxiliary chemicals such as e.g. the components of the hybridization solution and the denaturing agents capable of converting double-stranded nucleic acids in a sample into single-stranded form. Preferably, a chemical lightening and denaturing agent is included, e.g. alkali, for treating the sample so that single-stranded nucleic acid is released from it.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres, men ikke begrenses, ved hjelp av følgende eksempler. The present invention shall now be illustrated, but not limited, by means of the following examples.

Eksempel 1.Example 1.

Hybridiseringsanalyse ved bruk av immobiliserte og merkede anti-hybrider. Hybridization analysis using immobilized and labeled anti-hybrids.

A. Fremstilling av en RNA probe for cytomegalovirus.A. Preparation of an RNA probe for cytomegalovirus.

Et DNA fragment fra genomet av cytomegalovirus klones innA DNA fragment from the cytomegalovirus genome is cloned in

i en vektor som inneholder promotorer for DNA avhengig RNA-polymerase fra bakteriofag SP6 som infiserer Salmonella typhimurium LT2 celler. Den klonede sekvensen transkriberes ved hjelp av polymerase, slik at det dannes en RNA probe. in a vector containing promoters for DNA dependent RNA polymerase from bacteriophage SP6 infecting Salmonella typhimurium LT2 cells. The cloned sequence is transcribed using polymerase, so that an RNA probe is formed.

Cytomegalovirus DNA nedbrytes medEcoRI restriksjonsendo- nuklease og fragmentene klones inn i plasmidet pACYC 184 /Tamashiro et al., (1982) J. Virology 42:547-557/.Plas-midene progageres iE.coli stamme HB101 og EcoRI e fragmentet definert av Tamashiro, benyttes for fremstilling av proben. Det rensede plasmidet nedbrytes med EcoRI restriksjons endonuklease og innskuddet isoleres ved hjelp av agarosegel elektroforese /Maniatis et al., (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory/. Cytomegalovirus EcoRI e fragmentet klones inn i EcoRI posisjonen på pSP65 vektoren som er tilgjengelig fra Promega Biotec, Madison, WI. Cytomegalovirus DNA is digested with EcoRI restriction endonuclease and the fragments are cloned into the plasmid pACYC 184 /Tamashiro et al., (1982) J. Virology 42:547-557/. The plasmids are prophaged in E.coli strain HB101 and EcoRI e the fragment defined by Tamashiro , is used for the production of the probe. The purified plasmid is digested with EcoRI restriction endonuclease and the insert is isolated by means of agarose gel electrophoresis /Maniatis et al., (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory/. The cytomegalovirus EcoRI e fragment is cloned into the EcoRI site of the pSP65 vector available from Promega Biotec, Madison, WI.

pSP65 vektoren med EcoRI e innskuddet propageres i E.coli JM103 celler ved 37°C. Cellene lyses og den cellulare DNA isoleres ved hjelp av fenol/kloroform ekstraksjoner. Plasmidet separeres fra den kromosomale DNA ved hjelp av sentrifugering i en cesiumklorid-etidiumbromid-gradient /Maniatis et al., supra/. The pSP65 vector with the EcoRI e insert is propagated in E.coli JM103 cells at 37°C. The cells are lysed and the cellular DNA is isolated using phenol/chloroform extractions. The plasmid is separated from the chromosomal DNA by centrifugation in a cesium chloride-ethidium bromide gradient /Maniatis et al., supra/.

Cesiumkloridet og etidiumbromidet separeres fra plasmidetThe cesium chloride and ethidium bromide are separated from the plasmid

ved gelfiltrering på "Sephadex G-50" i 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 7,5, som inneholder 50 mM NaCl og 1 mM EDTA. Effluenten som inneholder DNA samles og DNA feilet ut med kald etanol. Bunnfallet oppløses i 10 mM Tris-hydroklord-buffer, pH 7,5, som inneholder 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2og 1 mM ditiotreitol og nedbrytes i 1 time ved 37°C med 1 enhet Hind III restriksjons endonuklease pr. mikrogram DNA. Blandingen ekstraheres en gang med fenol/kloroform og DNA utfelles med kald etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM Tris-hydro-klodirbuffer, pH 7,4, slik at man får 0,5 mgDNA/ml. by gel filtration on "Sephadex G-50" in 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 7.5, containing 50 mM NaCl and 1 mM EDTA. The effluent containing the DNA is collected and the DNA eluted with cold ethanol. The precipitate is dissolved in 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 7.5, which contains 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 and 1 mM dithiothreitol and digested for 1 hour at 37°C with 1 unit of Hind III restriction endonuclease per micrograms of DNA. The mixture is extracted once with phenol/chloroform and the DNA is precipitated with cold ethanol. The precipitate is dissolved in 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 7.4, so that 0.5 mgDNA/ml is obtained.

Denne pSP65 vektoren med EcoRI e innskuddet transkriberes medSP6 DNA avhengig RNA polymerase, ved start ved promotoren og slutt ved den posisjonen som skjæres ved Hind III resetrik-sjonsendonuklease. Det meste av DNA i det transkriberte området er EcoRI e innskuddet. This pSP65 vector with the EcoRI e insert is transcribed with SP6 DNA dependent RNA polymerase, starting at the promoter and ending at the position cut by Hind III restriction endonuclease. Most of the DNA in the transcribed region is the EcoRI e insert.

Transkripsjonsreaksjonsblandingen ( 550 (il) har følgende sammensetning: 50 |ag av Hind III nedbrutt DNA; 40 mMTris-hydrokloridbuf f er, pH 7,5; 6 mM MgC^; 2 mM spermin; 0,5 The transcription reaction mixture (550 µl) has the following composition: 50 µg of Hind III digested DNA; 40 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 7.5; 6 mM MgCl 2 ; 2 mM spermine; 0.5

mM ATP, CTP, UTP og GTP; 10 mM ditiotreitol; 500 enheter RNasin (Promega Biotec) og 50 enheter av SP6 RNA polymerase (Promega Biotec). Reaksjonen f.år forløpe i 1 time ved romtemperatur og deretter tilsettes ytterligere 50 enheter av RNA polymerase, og får reagere i 1 time. mM ATP, CTP, UTP and GTP; 10 mM dithiothreitol; 500 units of RNasin (Promega Biotec) and 50 units of SP6 RNA polymerase (Promega Biotec). The reaction takes place for 1 hour at room temperature and then a further 50 units of RNA polymerase are added and allowed to react for 1 hour.

DNA i blandingen ødelegges ved nedbrytning i 10 minutterDNA in the mixture is destroyed by digestion for 10 minutes

ved 37°C med 10 |ig av RNase-fri DNase. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol/kloroform, og kromatograferes på "Sephadex G-50" i 10 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 7,4, 0,1 M NaCl. RNA samles og utfelles med kald etanol. Utfellingen oppløses i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0, som inneholder 1 mM at 37°C with 10 µg of RNase-free DNase. The reaction mixture is extracted with phenol/chloroform and chromatographed on "Sephadex G-50" in 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 7.4, 0.1 M NaCl. RNA is collected and precipitated with cold ethanol. The precipitate is dissolved in 50 mM sodium acetate buffer, pH 6.0, containing 1 mM

EDTA.EDTA.

B. Fremstilling av monokolonalt antistoff til RNA1 DNA.B. Preparation of monoclonal antibody to RNA1 DNA.

1. Fremstilling av RNA1 DNA hybrid - Hybridet fremstilles ved transkripsjon av 4>X174 virion DNA med DNA-avhengig RNA polymerase fra E.coli. Fremgangsmåten er beskrevet av Nakazato (1980) Biochem. 19:2835. 2. Fremstilling av metylert tyroglobulin - Bovint tyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 mg blandes med 10 mg vannfri metanol og 400 |jL av 2,5 M HC1 i metanol. Blandingen får reagere i 5 dager på en rotasjonsblander ved romtemperatur. Utfellingen samles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Deretter tørkes den under vakuum over natten. 3. Immunisering av mus - 150 mikrogram av RNA1 DNA hybrid i 250 (iL av 20 mM Tr is-hydroklor idbuf f er, pH 7,4, 1 mM EDTAblandes med 150 (jg metylert tyroglobulin i 250 [ ih vann. 1. Production of RNA1 DNA hybrid - The hybrid is produced by transcription of 4>X174 virion DNA with DNA-dependent RNA polymerase from E.coli. The method is described by Nakazato (1980) Biochem. 19:2835. 2. Preparation of methylated thyroglobulin - Bovine thyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 mg is mixed with 10 mg of anhydrous methanol and 400 µL of 2.5 M HCl in methanol. The mixture is allowed to react for 5 days on a rotary mixer at room temperature. The precipitate is collected by centrifugation and washed twice with methanol and twice with ethanol. It is then dried under vacuum overnight. 3. Immunization of mice - 150 micrograms of RNA1 DNA hybrid in 250 (iL of 20 mM Tris-hydrochlorid buffer, pH 7.4, 1 mM EDTA is mixed with 150 (jg methylated thyroglobulin in 250 [ ih water.

Det dannes et bunnfall og 2,5 ml avTris-bufferen tilsettes. Hele blandingen emulgeres med et like stort volum av Freunds hjelpestoff. BALB/c mus immuniseres med 0,5 ml av suspen sjonen. Forsterkningsimmuniseringer gis 3 uker senere og deretter med 1 ukes intervaller. Blod tas med 2 ukers intervaller med begynnelse 1 uke etter den første forsterknings-immunisering. A precipitate forms and 2.5 ml of the Tris buffer is added. The entire mixture is emulsified with an equal volume of Freund's adjuvant. BALB/c mice are immunized with 0.5 ml of the suspension. Booster immunizations are given 3 weeks later and then at 1-week intervals. Blood is taken at 2-week intervals starting 1 week after the first booster immunization.

Antistoff titere i serumene måles ved hjelp av en enzymmerket immunosorbent analysemetode. "Immulon II" mikrotiterbrønner dekkes med RNA'DNA ved å plassere 50 uL av en 5 |ig/ml oppløs-ning i hver brønn. RNA'DNA er i 0,015 M natriumcitratbuffer, Ph 6,8, som inneholder 0,15 M NaCl. Når oppløsningene har stått ved romtemperatur i 2 timer, vaskes brønnene med 0,02 Antibody titers in the sera are measured using an enzyme-labelled immunosorbent assay method. "Immulon II" microtiter wells are coated with RNA'DNA by placing 50 µL of a 5 µg/ml solution in each well. RNA'DNA is in 0.015 M sodium citrate buffer, Ph 6.8, containing 0.15 M NaCl. When the solutions have stood at room temperature for 2 hours, the wells are washed with 0.02

M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 5 mg bovinsyre albumin/mL og 0,5% "Tween 20" vaskemiddel (vol/vol). Egnede oppløsninger av antiserum tilsettes til brønnene slik at antistoffene bindes til immobilisert RNA'DNA. Deretter kan de bundne antistoffene detekteres med enzymmerket anti-mus IgG ved velkjente fremgangsmåter. Miltceller fra en mus M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 5 mg bovine acid albumin/mL and 0.5% "Tween 20" detergent (vol/vol). Suitable solutions of antiserum are added to the wells so that the antibodies bind to immobilized RNA'DNA. The bound antibodies can then be detected with enzyme-labeled anti-mouse IgG by well-known methods. Spleen cells from a mouse

med en høy serum titer overfor RNA'DNA men lav titer overfor •enkeltkjedet DNA forbindes med myeloma celler slik at det dannes hybridomas /Stuart et al., (1981) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 78:3751; Galfre og Milstein (1981) Meth. in Enzymol. 73:1/. with a high serum titer against RNA'DNA but a low titer against single-stranded DNA is associated with myeloma cells so that hybridomas are formed /Stuart et al., (1981) Proe. Nati. Acad. Pollock. USA. 78:3751; Galfre and Milstein (1981) Meth. in Enzymol. 73:1/.

Klonede hybridomas gros intraperitonealt i mus slik at det dannes adekvate mengder av antistoff for videre arbeide. Albumin fjernes fra ascitites-væsken ved kromatografi på "Affigel-Blue" harpiks, bragt til likevekt med 10 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,15 M NaCl. Kolonneeffluenten som inneholder antistoffet kromatograferes på "DEAE-Sepharose" ved bruk av en lineær gradient av 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 8,0, til denne bufferen som inneholder 0,2 M NaCl.Hovedtoppen for eluert protein inneholder det monoklonale antistoffet fritt for transferrin og albumin. C.Immobilisering av monoklonalt antistoff til RNA'DNA. Cloned hybridomas are grown intraperitoneally in mice so that adequate amounts of antibody are formed for further work. Albumin is removed from the ascites fluid by chromatography on "Affigel-Blue" resin, equilibrated with 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, 0.15 M NaCl. The column effluent containing the antibody is chromatographed on "DEAE-Sepharose" using a linear gradient of 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, to this buffer containing 0.2 M NaCl. The major eluted protein peak contains the monoclonal antibody free of transferrin and albumin. C. Immobilization of monoclonal antibody to RNA'DNA.

Monoklonalt antistoff til RNA'DNA immobiliseres på magnetiser- bare mikropartikler. "Act-Magnogel AcA44". Partiklene er porøse polyakrylamid-agarose perler som inneholder 7% jernok-syd og denne harpiksen er aktivert med glutaraldehyd. Kobling av antistoffet til "Act-Mangnogel AcA44" utføres ifølge fabrikkantens instruksjoner. Monoclonal antibody to RNA'DNA is immobilized on magnetisable microparticles. "Act-Magnogel AcA44". The particles are porous polyacrylamide-agarose beads containing 7% iron oxide and this resin is activated with glutaraldehyde. Coupling of the antibody to "Act-Mangnogel AcA44" is carried out according to the manufacturer's instructions.

D. Fluorescein-merket antistoff til RNA1 DNA.D. Fluorescein-labeled antibody to RNA1 DNA.

Renset antistoff til RNA1 DNA dialyseres i 0,1 M natriumbo-rat-buffer, pH 9,0, og 0,5 ml som inneholder 5 mg antistoff blandes med 0,5 ml 5-(4,6-diklortriazin-2-yl)-aminofluores-cein (Molecular Probes, Inc., Junction City, OR) i boratbufferen. Blandingen får reagere i 1 time ved 25°C Purified antibody to RNA1 DNA is dialyzed in 0.1 M sodium borate buffer, pH 9.0, and 0.5 ml containing 5 mg of antibody is mixed with 0.5 ml of 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl )-aminofluorescein (Molecular Probes, Inc., Junction City, OR) in the borate buffer. The mixture is allowed to react for 1 hour at 25°C

og kromatograferes så på en 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" -kolonne med 0,1 M Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, som eluent. Absorbanser ved 280 nm av 1,0 ml fraksjoner bestemmes og and then chromatographed on a 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" column with 0.1 M Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, as eluent. Absorbances at 280 nm of 1.0 ml fractions are determined and

de som innbefatter den første toppen samles. Fluorescein/ protein-forholdet bestemmes ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18:865. those that include the first peak are collected. The fluorescein/protein ratio is determined by the method according to The and Feltkamp (1970) Immunology 18:865.

E. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin.E. Hybridization assay for cytomegalovirus in urine.

Denne analysen innbefatter separering av cytomegalovirusThis assay includes separation of cytomegalovirus

fra urin ved sentrifugering og hybridisering av viral DNAfrom urine by centrifugation and hybridization of viral DNA

med RNA-proben i oppløsning. Mengden av hybrid som dannes bestemmes immunokjemisk med det immibiliserte antistoffet til RNA'DNA, og de flouresceinmerkede antistoffet. with the RNA probe in solution. The amount of hybrid formed is determined immunochemically with the immobilized antibody to RNA'DNA and the fluorescein-labeled antibody.

Celler og cellulare bruddstykker fjernes fra urinen ved sentrifugering i en "SoevallGLC-3" sentrifuge ved 3000 rpm i 5 minutter. 10 ml av overvannet plasseres i et polyallomert ultrasentrifugerør og kjøres ved 25.000 rmp i en "BeckmanTi50" rotor i 75 minutter. Overvannet fjernes og pelletten oppløses i 0,05 ml av 0,1 M NaOH og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Cells and cellular fragments are removed from the urine by centrifugation in a "SoevallGLC-3" centrifuge at 3000 rpm for 5 minutes. 10 ml of the supernatant is placed in a polyalloyed ultracentrifuge tube and run at 25,000 rpm in a "BeckmanTi50" rotor for 75 minutes. The supernatant is removed and the pellet is dissolved in 0.05 ml of 0.1 M NaOH and incubated at 37°C for 30 minutes.

150 mikroliter av følgende oppløsning tilsettes:150 microliters of the following solution is added:

0,1 M natriumfosfat-buffer, pH 6,0; 1,8 M NaCl; 0,1% natriumdodecylsulfat (vekt/vol) og 1 mM EDTA. Deretter tilsettes 20 ul av RNA-proben (20 ng) og blandingen inkuberes ved 65°C 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0; 1.8 M NaCl; 0.1% sodium dodecyl sulfate (w/v) and 1 mM EDTA. Then 20 ul of the RNA probe (20 ng) is added and the mixture is incubated at 65°C

i 10 timer. Reaksjonen avkjøles til romtemperatur og 650for 10 hours. The reaction is cooled to room temperature and 650

ul av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 2µl of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 2

mM MgCl2og 5,0 mg bovinserumalbumin/ml tilsettes. Deretter tilsettes 50 ul av immobilisert antistoff og blandingen ristes i 30 minutter på en slik måte at det faste antistoffet holdes i suspensjonen. 50 mikroliter fluorescein merket antistoff tilsettes og ristingen fortsettes i 1 time. Konsentrasjonene av det immobiliserte antistoffet og de fluorescein-merkede antistoffreagensene optimaliseres i innledende forsøk for å tilveiebringe antistoff-konsentrasjoner som gir et stort overskudd sammenlignet med de mengder som kreves for å binde alt RNA'DNA hybridet som er tilstede i analysen. mM MgCl2 and 5.0 mg bovine serum albumin/ml are added. Then 50 ul of immobilized antibody is added and the mixture is shaken for 30 minutes in such a way that the fixed antibody is kept in suspension. 50 microliters of fluorescein labeled antibody is added and shaking is continued for 1 hour. The concentrations of the immobilized antibody and the fluorescein-labeled antibody reagents are optimized in initial experiments to provide antibody concentrations that provide a large excess compared to the amounts required to bind all of the RNA'DNA hybrid present in the assay.

Ved slutten av reaksjonsperioden trekkes den fase bærerenAt the end of the reaction period, the phase carrier is withdrawn

til en vegg av reaksjonsrøret ved hjelp av en magnet og væsken fjernes ved avsugning. Den faste fasen vaskes to ganger hver gang med 1 ml av 0,1>M natriumfosfat-buffer, pH 7,4, to a wall of the reaction tube by means of a magnet and the liquid is removed by suction. The solid phase is washed twice each time with 1 ml of 0.1>M sodium phosphate buffer, pH 7.4,

som inneholder 2,0 nm MgCl2og 0,1% "Tween 20" (vol/vol).containing 2.0 nm MgCl2 and 0.1% "Tween 20" (vol/vol).

Det fluorescein-merkede antistoffet som er bundet til den faste fasen dissosieres ved tilsats av 1,0 ml 0,1 M NaOH. Suspensjonen ristes i 5 minutter og den faste fasen trekkes til bunnen av røret ved hjelp av en magnet. Fluorescensen av oppløsningen måles med 495 nm lys for eksitering og 520 The fluorescein-labeled antibody bound to the solid phase is dissociated by the addition of 1.0 ml of 0.1 M NaOH. The suspension is shaken for 5 minutes and the solid phase is drawn to the bottom of the tube using a magnet. The fluorescence of the solution is measured with 495 nm light for excitation and 520

nm for emmisjon.nm for emission.

En kontrollanalyse kjøres parallelt med en urinprøve somA control analysis is run in parallel with a urine sample which

man vet er fri for cytomegalovirus. Flourescens-signalene som genereres med de fiinfiserte urinprøvene, vil være høyere enn signalene for kontrollprøvene. one is known to be free of cytomegalovirus. The fluorescence signals generated with the infected urine samples will be higher than the signals for the control samples.

Eksempel II.Example II.

Hybridiseringsanalyse ved bruk av immobilisert anti-hybridHybridization assay using immobilized anti-hybrid

og merket probe.and labeled probe.

A. Fremstilling av en merket probe for cytomegalovirus DNA. A. Preparation of a labeled probe for cytomegalovirus DNA.

EcoRI e fragmentet fra cytometalovirus beskrevet i eksempelEcoRI is the fragment from cytometallovirus described in example

I ovenfor klones inn i M13mp8 vektoren som er tilgjengelig fra New England Biolabs, Beverly, MA. De rekombinante virus propageres i E.coli K12JM101 verten. Viruset separeres fra kulturvæsken ved utfelling med polyetylenglykol, og det enkeltkjedede virion DNA isoleres ved hjelp av fenol/kloroform ekstraksj on. The above is cloned into the M13mp8 vector available from New England Biolabs, Beverly, MA. The recombinant viruses are propagated in the E.coli K12JM101 host. The virus is separated from the culture liquid by precipitation with polyethylene glycol, and the single-chain virion DNA is isolated using phenol/chloroform extraction.

En 17 base oligodeoksynukleotid primer med sekvensen GTAAACGACGGCCAGT er komplementær til et segment av M13mp8 A 17 base oligodeoxynucleotide primer with the sequence GTAAACGACGGCCAGT is complementary to a segment of M13mp8

nær 3<1->OH-enden av EcoRI e innskuddet. Denne primeren vil initiere DNA-syntese ve Klenow fragmentet av DNA polymerase I fra E.coli og replikeringen rettes gjennom EcoRI e innskuddet. Den nye DNA-proben merkes med biotin ved at "Bio-11-dUTP" tilsettes i reaksjonsblandingen istedet for den van-lige dTTP /Leary et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. 80: 4045/. near the 3<1->OH end of the EcoRI e insert. This primer will initiate DNA synthesis with the Klenow fragment of DNA polymerase I from E.coli and replication is directed through the EcoRI e insert. The new DNA probe is labeled with biotin by adding "Bio-11-dUTP" to the reaction mixture instead of the usual dTTP /Leary et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Pollock. 80: 4045/.

Den rensede M13mp8 DNA med EcoRI e innskuddet blandes medThe purified M13mp8 DNA with the EcoRI e insert is mixed with

et moplart overskudd av 17 baseprimeren (New England Biolabs) i 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0, som inneholder 10 mM MgCl2(endelige konsentrasjoner) /Bankier og Barrell, Techniques in Nucleic Acid Biochemistry,Elsevier, Ireland/. Blandingen inkuberes ved 55°C i 45 minutter slik at primeren rekombine-res til Ml3mp8 DNA. Reaksjonsblandingen gjøres 15 mM med hensyn på dATP, dGTP, dCTP og "Bio-ll-dUTP", og til sist tilsettes Klenow-fragmentet av DNA polymerase I. Denne reaksjonen inkuberes ved 25°C i et tidsrom som bestemmes for hver kombinasjon av reagenser. Reaksjonstiden optimaliseres slik at man oppnår ny syntetiserte DNA fragmenter som er a molar excess of the 17 base primer (New England Biolabs) in 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 10 mM MgCl2 (final concentrations) /Bankier and Barrell, Techniques in Nucleic Acid Biochemistry, Elsevier, Ireland/. The mixture is incubated at 55°C for 45 minutes so that the primer recombines into M13mp8 DNA. The reaction mixture is made 15 mM with respect to dATP, dGTP, dCTP and "Bio-ll-dUTP", and finally the Klenow fragment of DNA polymerase I is added. This reaction is incubated at 25°C for a period of time determined for each combination of reagents . The reaction time is optimized so that newly synthesized DNA fragments are obtained which are

noe større enn EcoRI e innskuddet. For å bestemme den optimale tiden tas prøver reaksjonsblandingen ved forskjellige tider, og elektroforeres i denaturerende alkalisk agarosegel. /Maniatis et al., supre/. Denne fremgangsmåten vil gi giotin merket DNA med noen variasjoner i lengde; forleng-else av den merkede DNA ut over EcoRI e innskuddet inn i M13 sekvensen er imidlertid akseptabelt for det foreliggende formål. somewhat larger than the EcoRI e deposit. To determine the optimal time, the reaction mixture is sampled at different times and electrophoresed in denaturing alkaline agarose gel. /Maniatis et al., supra/. This procedure will yield guillotine labeled DNA with some variation in length; extension of the labeled DNA beyond the EcoRI e insert into the M13 sequence is, however, acceptable for the present purpose.

DNA renses ved fenol/kloroform-ekstraksjon og utfelles med etanol. Det oppløses i 20 mM Tris-hybrokloridbuffer, pH 8,0, og etidium-residuet innføres som kovalente interkaleringskomplekser. For dette formål fremstilles 8-azidoetidium og renses som beskrevet av Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta 479:98. (Foreliggende studier viser at denne fremgangsmåten gir en blanding av 3- og 8-azidoetidium isomere). DNA is purified by phenol/chloroform extraction and precipitated with ethanol. It is dissolved in 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, and the ethidium residue is introduced as covalent intercalation complexes. For this purpose, 8-azidoethidium is prepared and purified as described by Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta 479:98. (Current studies show that this method gives a mixture of 3- and 8-azidoethidium isomers).

En oppløsning av det biotin-merkede DNA kompleksbundet med M13 sjablongen (ca. 50 ug DNA/ml) gjøres 0,5 mM med hensyn til 8-azidoetidium og fotolyseres i 1 time ved en avstand på 10 til 20 cm fra en 150 watts utendørs lyskaster. DNA-oppløsningen omrøres under fotolysen i et glass reaktør-rør som befinner seg i et glass-vannbad. Glasset adsorberer ultrafiolett stråling og vannbadet benyttes for å holde reak-sjonstemperaturen mellom 20 og 30°C. A solution of the biotin-labeled DNA complexed with the M13 template (about 50 µg DNA/ml) is made 0.5 mM with respect to 8-azidoethidium and photolyzed for 1 hour at a distance of 10 to 20 cm from a 150 watt outdoor spotlight. The DNA solution is stirred under the photolight in a glass reactor tube located in a glass water bath. The glass adsorbs ultraviolet radiation and the water bath is used to keep the reaction temperature between 20 and 30°C.

Ved slutten av fotolysen fjernes de ikke-kovalent bundne etidium fotolyseproduktene ved 10 suksessive ekstraksjoner med vann mettet med n-butanol. Deretter utfelles DNA med etanol og oppløses i Tris-bufferen. Mengden av kovalent bundet DNA estimeres ved hjelp av optiske absorbsjonsmålinger At the end of the photolysis, the non-covalently bound ethidium photolysis products are removed by 10 successive extractions with water saturated with n-butanol. The DNA is then precipitated with ethanol and dissolved in the Tris buffer. The amount of covalently bound DNA is estimated using optical absorbance measurements

or~>3—1—1 or~>3—1—1

og ekstinksjonskoeffesientene på E. qn = 4 x 10 M cm for fotolysert etidiumazid, relasjonen mellom A2goog A490for fotolysert etidium bundet til DNA /& 266 =''^A490 X 2,3 ^ ~ 0,011/ og E25Q^ 1,3 x 10 M cm for DNA-baseparkon-sentrasjonen. and the extinction coefficients of E. qn = 4 x 10 M cm for photolysed ethidium azide, the relation between A2go and A490 for photolysed ethidium bound to DNA /& 266 =''^A490 X 2.3 ^ ~ 0.011/ and E25Q^ 1.3 x 10 M cm for the DNA base park concentration.

Etidiumet vil være kovalent bundet til DNA tilnærmet uteluk-kende i det dobbeltkjedede området hvor interkaleringskomplekser kan dannes. Målet er å introdusere et etdiumresidum pr. 10 til 50 basepar. Fotolysereaksjonen går tilnærmet til fullbyrdelse i løpet av 1 times reaksjonstid og inkorporeringen av etidium kan nedsettes ved å redusere fotolyse-tiden eller ved å redusere etidiumkonsentrasjonen. Inkorporeringen kan økes ved å gjenta fotolysen med nytt 8-azidoetidium. The ethidium will be covalently bound to DNA almost exclusively in the double-stranded area where intercalation complexes can form. The aim is to introduce an eddium residue per 10 to 50 base pairs. The photolysis reaction is approximately completed within 1 hour of reaction time and the incorporation of ethidium can be reduced by reducing the photolysis time or by reducing the ethidium concentration. The incorporation can be increased by repeating the photolysis with new 8-azidoethidium.

Det endelige trinn er separeringen av den biotinmerkede og interkollator-modifiserte proben fra Ml3mp8 sjablong DNA. Separasjonen utføres ved hjelp av elektroforese i alkalisk agarosegel /Maniatis et al., supra/. DNA båndene detekteres i gelen ved fluorescensfarging med etidiumbromid. Det biotin-merkede DNA er mindre enn M13mp8 sjablong-kjeden og migrerer derfor fortere. Gel som inneholder det biotinmerkede DNA, fjernes og DNA gjenvinnes ved elektroeluering som beskrevet av Maniatis. The final step is the separation of the biotin-labeled and intercollator-modified probe from the Ml3mp8 template DNA. The separation is carried out using electrophoresis in alkaline agarose gel /Maniatis et al., supra/. The DNA bands are detected in the gel by fluorescence staining with ethidium bromide. The biotin-labeled DNA is smaller than the M13mp8 template strand and therefore migrates faster. Gel containing the biotin-labeled DNA is removed and the DNA recovered by electroelution as described by Maniatis.

B. Fremstilling av monoklonalt antistoff til etidium-interkollert DNA. B. Preparation of monoclonal antibody to ethidium-intercalated DNA.

1. Fremstilling av kovalent etidium-DNA komplekser.1. Preparation of covalent ethidium-DNA complexes.

Ca. 250 g laksesperma DNA (Sigma Chemical Co., Ct. Louis,About. 250 g salmon sperm DNA (Sigma Chemical Co., Ct. Louis,

MO) oppløses i 40 ml av 50 mM NaCL og kappes ved fem passasjer gjennom en nål (23 gauge). Det kappede DNA plasseres i en 250 ml flaske og fortynnes med ytterligere 160 ml buffer. MO) is dissolved in 40 ml of 50 mM NaCl and cut at five passes through a needle (23 gauge). The sheared DNA is placed in a 250 ml bottle and diluted with a further 160 ml of buffer.

145 mikroliter (145ul) av S-^nuklease, 200.000 enheter pr.145 microliters (145ul) of S-^nuclease, 200,000 units per

ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ), tilsettes og blandingen inkuteres ved 27°C i 50 minutter. ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ), is added and the mixture is incubated at 27°C for 50 minutes.

Deretter ekstraheres reaksjonsblandingen to ganger med fenol: kloroform, en gang med kloroform og DNA utfelles to ganger med etanol /Maniatis et al., supra/. Den endelige utfellingen oppløses i 70 ml av 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0. Dette DNA reageres med 8-azidoetidium under følgende betingelser. Reaksjonsblandingen fremstilles med 33 ml av 2,7 mg DNA/ml, 13,5 ml av 4,95 mM 8-azidoetidium, 13,5 ml av 0,2 The reaction mixture is then extracted twice with phenol: chloroform, once with chloroform and the DNA is precipitated twice with ethanol /Maniatis et al., supra/. The final precipitate is dissolved in 70 ml of 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0. This DNA is reacted with 8-azidoethidium under the following conditions. The reaction mixture is prepared with 33 ml of 2.7 mg DNA/ml, 13.5 ml of 4.95 mM 8-azidoethidium, 13.5 ml of 0.2

M Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl, og 76 ml vann. Blandingen plasseres i et 250 ml begerglass med en vannmantel som holdes ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 minutter ved hjelp av en 150 watts lyskaster ved en avstand på 10 cm. Denne fotolysen gjentas med en identisk reaksjon sb landing . M Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, 0.2 M NaCl, and 76 ml water. The mixture is placed in a 250 ml beaker with a water jacket which is kept at 22°C. The mixture is stirred and illuminated for 60 minutes using a 150 watt spotlight at a distance of 10 cm. This photo light is repeated with an identical reaction sb landing.

De fotolyserte reaksjonsblandingene samles og ekstraheresThe photolysed reaction mixtures are collected and extracted

10 ganger, hver gang med et like stort volum av n-butanol mettet med 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Den ekstraherte DNA oppløsningen kombineres med 23 ml av 10 times, each time with an equal volume of n-butanol saturated with 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, 0.2 M NaCl. The extracted DNA solution is combined with 23 ml of

4,95 mM 8-azidoetidium og 77 ml av 20 mM Tris-hydroklorid-buf fer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Denne oppløsningen fotolyseres i 60 minutter som beskrevet ovenfor. Reaksjonsproduktene ekstraheres 10 ganger med buffer-mettet butanol som beskrevet ovenfor, og DNA utfelles med etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 8,0, 1 mM EDTA og absor-bansene ved 260 og 490 nm registreres. 2. Fremstilling av kovalent etidium-DNA metylert tyroglobulin kompleks. 4.95 mM 8-azidoethidium and 77 ml of 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, 0.2 M NaCl. This solution is photolyzed for 60 minutes as described above. The reaction products are extracted 10 times with buffer-saturated butanol as described above, and the DNA is precipitated with ethanol. The precipitate is dissolved in 10 mM Tris hydrochloride buffer, pH 8.0, 1 mM EDTA and the absorbances at 260 and 490 nm are recorded. 2. Preparation of covalent ethidium-DNA methylated thyroglobulin complex.

Metylert tyroglobulin (5 mg) fremstilt som beskrevet i eksempel I, del B-2 ovenfor, oppløses i 1,0 ml vann og 5,6 ml av en 2,2 mg/ml kovalent etidium DNA oppløsning tilsettes. Methylated thyroglobulin (5 mg) prepared as described in Example I, part B-2 above, is dissolved in 1.0 ml of water and 5.6 ml of a 2.2 mg/ml covalent ethidium DNA solution is added.

En utfelling dannes straks og suspensjonen fortynnes tilA precipitate forms immediately and the suspension is diluted to

62,5 ml med 0,15 M NaCl. Denne suspensjonen emulgeres med et like stort volum av Freunds hjelpestoff og hver BALB/c mus immuniseres subkutant med 0,5 ml av blandingen. Forsterkningsimmuniseringer gis med 2 ukers mellomrom med den samme blandingen. Blodprøver tas en uke etter hver immunisering med start etter den tredje forsterkningsimmuniseringen. 62.5 ml with 0.15 M NaCl. This suspension is emulsified with an equal volume of Freund's adjuvant and each BALB/c mouse is immunized subcutaneously with 0.5 ml of the mixture. Booster immunizations are given 2 weeks apart with the same mixture. Blood samples are taken one week after each immunization starting after the third booster immunization.

Antistoff titere analyseres ved standard enzym-merke immuno- adsorbant fremgangsmåter. Kovalent interkollert DNA, dobbeltkjedet DNA og enkeltkjedet DNA belegges på mikro-titerbrønner som beskrevet i eksempel I, del B-3 ovenfor. Fortynnet antiserum inkuberes i de belagte brønnene og antistoff bundet til de immobiliserte antigenene detekteres som beskrevet ovenfor. Antiserum sorteres slik at det benyttes serum som har lave titere for enkelt og dobbeltkjedet DNA, men høye titere for kovalent interkallert DNA. Antibody titers are analyzed by standard enzyme-labeled immuno-adsorbent methods. Covalently intercalated DNA, double-stranded DNA and single-stranded DNA are coated onto microtiter wells as described in Example I, Part B-3 above. Diluted antiserum is incubated in the coated wells and antibody bound to the immobilized antigens is detected as described above. Antiserum is sorted so that serum is used that has low titers for single and double-stranded DNA, but high titers for covalently intercalated DNA.

I et ekstra forsøk måles antistoff titere til ikke-kovalent etidium-DNA interkolleringskompleks. For dette formålet belegges dobbeltkjedet DNA på brønnene, og 100 um etidiumbromid innbefattes i det fortynnede antiserum, og alle etterfølgende binde- og vaske-oppløsninger, men det innbefattes ikke i substratoppløsningen som benyttes for måling av enzymaktiviteten. In an additional experiment, antibody titers to non-covalent ethidium-DNA intercalation complex are measured. For this purpose, double-stranded DNA is coated on the wells, and 100 µm ethidium bromide is included in the diluted antiserum, and all subsequent binding and washing solutions, but it is not included in the substrate solution used for measuring the enzyme activity.

Antiserum gir typisk høyere titere for kovalent interkallert DNA enn for de ikke-kovalente kompleksene. Denne forskjellen skyldes nærværet av antistoffer til etidium-residuet som blir kovalent bundet med lavt utbytte til fosfat-ribosestrukturen av dobbeltkjedet DNA. Derfor velges dyr med høye titere for ikke-kovalent interkallert DNA for fremstilling av hybridomas. Antiserum typically gives higher titers for covalently intercalated DNA than for the non-covalent complexes. This difference is due to the presence of antibodies to the ethidium residue which becomes covalently bound with low yield to the phosphate-ribose structure of double-stranded DNA. Therefore, animals with high titers for non-covalently intercalated DNA are selected for the production of hybridomas.

Miltceller fra utvalgte mus smeltes sammen med myelomaceller slik at det dannes hybridomas /Stuart et al., supra; Gilfre og Milstein, supra/. Hybridomacellene klones i selektive medier og de som produserer antistoffer til ikke-kovalent interkallert DNA, velges for antistoffproduksjon intraperitonealt i mus. Spleen cells from selected mice are fused with myeloma cells to form hybridomas /Stuart et al., supra; Gilfre and Milstein, supra/. The hybridoma cells are cloned in selective media and those that produce antibodies to non-covalently intercalated DNA are selected for antibody production intraperitoneally in mice.

Antistoffet isoleres fra ascites-væsken som beskrevet i eksempel I, del B-3 ovenfor. C. Fremstilling av B-galaktosidase-Straptavidin-konjugat. The antibody is isolated from the ascites fluid as described in Example I, Part B-3 above. C. Preparation of B-Galactosidase-Straptavidin Conjugate.

Sulfidryl-residuer på3-galaktosidase eksponeres ved reduk-sjon av med titiotreitol.6-galaktosidase (30.000 enheter, kvalitet VIII, Sigma Chemical Co.) i 2 ml 0,1 M N-2-hydroksy-etyl-piperazin-N<1->2-etansulfonat-buffer (HEPES), pH 7,0, Sulfidryl residues on 3-galactosidase are exposed by reduction with thithiothreitol. 6-galactosidase (30,000 units, grade VIII, Sigma Chemical Co.) in 2 ml of 0.1 M N-2-hydroxy-ethyl-piperazine-N<1 ->2-ethanesulfonate buffer (HEPES), pH 7.0,

0,09 M NaCl, blandes med 3,5 umol av ditiotreitol og får stå ved romtemperatur i 4 timer. Ditritreitolen fjernes ved kromatografering på en 2,8 x 8 cm kolonne av "Sepharose 6B Cl" i bufferen beskrevet ovenfor. Fraksjoner som inneholder proteiner samles i en beholder. Antall mol av sulfhydrylgruppper pr. mol av enzym måles ved fremgangsmåten angitt av Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70. 0.09 M NaCl, is mixed with 3.5 umol of dithiothreitol and allowed to stand at room temperature for 4 hours. The ditrithreitol is removed by chromatography on a 2.8 x 8 cm column of "Sepharose 6B Cl" in the buffer described above. Fractions containing proteins are collected in a container. Number of moles of sulfhydryl groups per moles of enzyme are measured by the method indicated by Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70.

Ravsyreimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksan-l-karboksylat (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 5,3 mg, oppløses i 250 ul av vannfriN,N-dimetylformamid og en 40ul del blandes med 3 ml 0,1 M HEPES-buffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl. En 25 Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-l-carboxylate (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 5.3 mg, is dissolved in 250 µl of anhydrous N,N-dimethylformamide and a 40 µl portion is mixed with 3 ml 0.1 M HEPES buffer, pH 7.0, 0.15 M NaCl. A 25

ul del av den vandige oppløsningen tilsettes til 825 ul av HEPES/NaCl buffer, og 100 ul av 1 mM glutation (redusert form). Når denne reaksjonsblandingen har stått ved romtemperatur i 15 minutter, bestemmes det ureagerte glutation ved Ellman's fremgangsmåte. Resultatene benyttes til å beregne SMCC-konsentrasj onen. 1 µl part of the aqueous solution is added to 825 µl of HEPES/NaCl buffer, and 100 µl of 1 mM glutathione (reduced form). When this reaction mixture has stood at room temperature for 15 minutes, the unreacted glutathione is determined by Ellman's method. The results are used to calculate the SMCC concentration.

Streptavidin fra Bethseda Research Laboratories, Gaithers-burg, MD, utveksles i 0,1 M HEPES buffer, pH 7,0, 0,15 M Streptavidin from Bethseda Research Laboratories, Gaithers-burg, MD, exchanged in 0.1 M HEPES buffer, pH 7.0, 0.15 M

NaCl ved gel eksklusjonskromatografi i "Biogel P-6DG".NaCl by gel exclusion chromatography in "Biogel P-6DG".

Etter utvekslingen blandes 1,75 ml av 3,7 mg/ml streptavidin med 17,6 ul av 61 mM SMCC og får reagere i 1 time ved 30°C.Reaksjonsblandingen kromatograferes på en 1 x 25 cm kolonne av "Biogel P6DG" i HEPES bufferen. Fraksjonene som tilsvarer den første effluent-toppen med absorbans ved 280 nm samles og analyseres for maleimid-innhold ved tilbaketitrering av glutation som beskrevet ovenfor. After the exchange, 1.75 ml of 3.7 mg/ml streptavidin is mixed with 17.6 ul of 61 mM SMCC and allowed to react for 1 hour at 30°C. The reaction mixture is chromatographed on a 1 x 25 cm column of "Biogel P6DG" in HEPES buffer. The fractions corresponding to the first effluent peak with absorbance at 280 nm are collected and analyzed for maleimide content by back titration of glutathione as described above.

Siden maleimidet er utsatt for hydrolyse, initieres kobling til B-galaktosidase så snart som mulig. Aktivert streptavidin, 3,9 mg, i 3,3 ml av HEPES bufferen tilsettes til 32 Since the maleimide is susceptible to hydrolysis, coupling to B-galactosidase is initiated as soon as possible. Activated streptavidin, 3.9 mg, in 3.3 ml of the HEPES buffer is added to 32

mg av redusert B-galaktosidase, slik at det gir reaksjons-volum på 9,3 ml. Etter 4 timer ved 25°C, slukkes reaksjonen ved tilsats av 800 ul av 1 mM glutation og inkuberes i ytterligere 30 minutter ved 25°C. Deretter kromatograferes reaksjonsblandingen på en 1,5 x 110 cm kolonne av "Biogel A-I,5 mg of reduced B-galactosidase, so that it gives a reaction volume of 9.3 ml. After 4 hours at 25°C, the reaction is quenched by the addition of 800 µl of 1 mM glutathione and incubated for a further 30 minutes at 25°C. The reaction mixture is then chromatographed on a 1.5 x 110 cm column of "Biogel A-I,5

m" og utvikles med 0,1 M HEPES buffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl.m" and developed with 0.1 M HEPES buffer, pH 7.0, 0.15 M NaCl.

2 ml fraksjoner samles og absorbansen ved 280 nm registreres. Den første toppen samles for videre studier. D. Immobilisering av antistoff til etidium interkollert DNA. 2 ml fractions are collected and the absorbance at 280 nm is recorded. The first peak is collected for further study. D. Immobilization of antibody to ethidium intercalated DNA.

Det monoklonale antistoffet til etidium interkollert DNA immobiliseres på "Act-Magnogel AcA44" som beskrevet i eksempel 1, del C ovenfor. The monoclonal antibody to ethidium intercalated DNA is immobilized on "Act-Magnogel AcA44" as described in Example 1, Part C above.

E. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin. E. Hybridization assay for cytomegalovirus in urine.

Bearbeidelse av urinprøver og hybridiseringsreaksjoner ut-føres som beskrevet i eksempel I, del E ovenfor, bortsett fra at biotinmerket DNA-probe (delA) benyttes istedet for RNA-proben. Etter hybridiseringsreaksjonen tilsettes 650 Processing of urine samples and hybridization reactions are carried out as described in example I, part E above, except that biotin-labeled DNA probe (delA) is used instead of the RNA probe. After the hybridization reaction, 650 is added

ul av 0,1 M natriumfosfat-buffer, pH 7,4, som inneholder 2 mM MgCl,,, 5,0 mg bovinserumalbumin/ml og det immobiliserte antistoffet til etidium interkollert DNA (del D ovenfor). Blandingen ristes i 30 minutter på en slik måte at det faste antistoffet holdes i suspensjon. Deretter tilsettes 50 ul av B-galaktosidase merket streptavidin og ristingen fortsettes i 1 time. µl of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 2 mM MgCl,,, 5.0 mg bovine serum albumin/ml and the immobilized antibody to ethidium intercalated DNA (part D above). The mixture is shaken for 30 minutes in such a way that the solid antibody is kept in suspension. Then 50 ul of B-galactosidase labeled streptavidin is added and shaking is continued for 1 hour.

Når inkuberingen er avsluttet, trekkes den faste fasen til den ene veggen av reaksjonsrøret med en magnet og væsken fjernes ved avsugning. Den faste fasen vaskes to ganger, hver gang med 1 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 2,0 mM MgCl2og 0,1%"Tween 20" (vol/vol). Enzymaktiviteten assosiert med den faste fasen måles ved tilsats av 1,0 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 800 um 7-B-galaktosyl-3-/6-aminoheksylkarboks-amid/ coumarin /Worah et al., (1981) Clin. Chem. 27:673/. Ved slutten av denne inkuberingen trekkes de fastes partiklene til bunnen av kyvetten med en magnet, og flourescensen av oppløsningen registreres ved bruk av 400 nanometer (nm) excitering og 450 nm emirisjon. When the incubation is finished, the solid phase is drawn to one wall of the reaction tube with a magnet and the liquid is removed by suction. The solid phase is washed twice, each time with 1 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 2.0 mM MgCl 2 and 0.1% "Tween 20" (vol/vol). The enzyme activity associated with the solid phase is measured by the addition of 1.0 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, containing 800 µm 7-B-galactosyl-3-(6-aminohexylcarboxamide/coumarin) /Worah et al ., (1981) Clin. Chem. 27:673/. At the end of this incubation, the solid particles are drawn to the bottom of the cuvette with a magnet, and the fluorescence of the solution is recorded using 400 nanometer (nm) excitation and 450 nm emission.

En kontrollanalyse kjøres parallelt med en urinprøve som man vet er fri for cytomegalovirus. Fluorescenssignalene som genereres i de infiserte urinprøvene, vil være høyere enn signalene fra kontrollprøvene. A control analysis is run in parallel with a urine sample known to be free of cytomegalovirus. The fluorescence signals generated in the infected urine samples will be higher than the signals from the control samples.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for detektering av en spesiell poly-nukleotidsekvense i en prøve som innbefatter enkeltkjedede nukleinsyrer, som innbefatter at prøven bringes i kontakt med en nukleinsyreprobe som innbefatter minst er. enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, under betingelser som er gunstige for hybridisering mellom prober: cg sekvensen som skal detekteres, og bestemmelse av det resulterende duplekset, karakterisert ved dupleksene som dannes ved hybridiseringen mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres, bringes i kontakt med en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til slike duplekser, hvor antistoff-reagensen er immobilisert eller deretter gjøres immobil, og dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes.1. Method for detecting a particular polynucleotide sequence in a sample that includes single-stranded nucleic acids, which includes bringing the sample into contact with a nucleic acid probe that includes at least single-stranded base sequence substantially complementary to the sequence to be detected, under conditions favorable for hybridization between probes: cg the sequence to be detected, and determination of the resulting duplex, characterized by the duplexes formed by the hybridization between the complementary probe sequence and the sequence to be detected is brought into contact with an antibody reagent which selectively binds to such duplexes, where the antibody reagent is immobilized or is subsequently made immobilized, and the duplexes which bind to the immobilized antibody reagent are determined. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoff-reagensen er selektiv forbinding til (i) DNA'RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og andre er RNA, (ii) RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) interkalleringskomplekser hvor dupleksene som dannes i analysen innbefatter en nukleinsyre interkallator bundet dertil i form av interkalleringskomplekser .2. Method according to claim 1, characterized in that the antibody reagent is selective binding to (i) DNA'RNA hybrids where either the probe or the sequence to be detected is DNA and the other is RNA, (ii) RNA'RNA hybrids where both the probe and the sequence to be detected is RNA, or (iii) intercalation complexes where the duplexes formed in the analysis include a nucleic acid intercalator bound thereto in the form of intercalation complexes. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes ved tilsats av en merket form av en andre antistoff-reagens som er istand til binding med dupleksen, hvor første og andre antistoff-reagens fortrinnsvis er samme stoff, og merket som assosieres med den immobiliserte reagensen måles.3. Method according to claim 1, characterized in that the duplexes that bind to the immobilized antibody reagent are determined by adding a labeled form of a second antibody reagent that is capable of binding to the duplex, where the first and second antibody reagents are preferably the same substance, and the label associated with the immobilized reagent is measured. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, k a r a k - terisert ved at proben er merket og dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes ved å måle merket som er blitt forbundet med den immobiliserte reagensen.4. Method according to claim 1, characterized in that the probe is labeled and the duplexes that bind to the immobilized antibody reagent are determined by measuring the label that has been associated with the immobilized reagent. 5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at antistoff-reagensen tilsettes en oppløselig form og bindes til en spesifik bindbar ligand, og ved at de resulterende duplekser i tillegg bringes i kontakt med immobilisert form av en bindende partner for denne ligand.5. Method according to any one of claims 1-4, characterized in that the antibody reagent is added to a soluble form and bound to a specific bindable ligand, and in that the resulting duplexes are additionally brought into contact with immobilized form by a binding partner for this ligand. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at liganden er biotin eller en hapten, og den bindende partner er henholdsvis avidin eller et anti-hapten antistoff.6. Method according to claim 5, characterized in that the ligand is biotin or a hapten, and the binding partner is respectively avidin or an anti-hapten antibody. 7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at merket er en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe, en kromoforerende gruppe, en luminiscerende gruppe, en spesifikt bindbar ligand, eller et radioisotop.7. Method according to any one of claims 1-4, characterized in that the label is an enzymatically active group, a fluorescent group, a chromophoric group, a luminescent group, a specifically bindable ligand, or a radioisotope. 8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven er en biologisk prøve som har vært utsatt for betingelser som frigjør og denaturer-er nukleinsyrer som er tilstede i prøven.8. Method according to claim 1, characterized in that the sample is a biological sample which has been exposed to conditions which release and denature nucleic acids present in the sample. 9. Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotid sekvens i en prøve, som innebefatter nukleinsyreprobe som inneholder minst en enkelt kjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til duplekser dannet vedh ybr idisering mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres, hvor antistoff-reagensen enten er immobilisert eller bindes til en spesifik bindbar ligand, og dersom den nevnte binding ikke er immobilisert, en immobilisert form av en bindende partner for den nevnte ligand.9. Reagent system for detecting a particular polynucleotide sequence in a sample, which includes a nucleic acid probe that contains at least a single chained base sequence that is essentially complementary to the sequence to be detected, characterized in that it also includes an antibody reagent that is selective binding to duplexes formed by hybridization between the complementary probe sequence and the sequence to be detected, where the antibody reagent is either immobilized or bound to a specific bindable ligand, and if said binding is not immobilized, an immobilized form of a binding partner for the said ligand. 10. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at antistoff-reagensen er selektiv forbinding til (i) DNA'RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, (ii) RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) inerkolleringskomplekser hvor dupleksene som er dannet i analysen innbefatter en nukleinsyre interkollator bundet dertil i form av interkolleringskomplekser.10. Reagent system according to claim 9, characterized in that the antibody reagent is selective binding to (i) DNA'RNA hybrids where either the probe or the sequence to be detected is DNA and the other is RNA, (ii) RNA'RNA hybrids where both the probe and the sequence to be detected are RNA, or (iii) intercollation complexes where the duplexes formed in the analysis include a nucleic acid intercollator bound thereto in the form of intercollation complexes. 11. Reagenssystem ifølge krav 9 som i tillegg innbefatter en merket form av en andre antistoff-reagens som selektiv forbinding til de nevnte duplekser, karakterisert ved at første og andre anti-stof f -reagens fortrinnsvis er samme stoff.11. Reagent system according to claim 9 which additionally includes a labeled form of a second antibody reagent as selective binding to the said duplexes, characterized in that the first and second antibody f reagents are preferably the same substance. 12. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at proben innbefatter et merke.12. Reagent system according to claim 9, characterized in that the probe includes a label. 13. Reagenssystem ifølge enten krav 11 eller 12, karakterisert ved at merket er en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe, en kromoforerende gruppe, en luminiscerende gruppe, en spesifikt bindbar ligand, eller et radioisotop.13. Reagent system according to either claim 11 or 12, characterized in that the label is an enzymatically active group, a fluorescent group, a chromophoric group, a luminescent group, a specifically bindable ligand, or a radioisotope. 14. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at liganden er biotin eller enh apten, og den nevnte bindende partner er henholdsvis avidin eller et anti-hapten antistoff.14. Reagent system according to claim 9, characterized in that the ligand is biotin or a hapten, and the said binding partner is respectively avidin or an anti-hapten antibody.