NO834220L - Fremgangsmaate for frembringelse av en forbedret stamme av clostridium acetobutylicum - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret stamme av Clostridium acetobutylicum som er effektiv til å fermentere karbohydrater til- butanol og aceton, samt en fremgangsmåte for dens fremstilling.

Fermenteringen av karbohydrater til butanol og aceton med Clostridium acetobutylicum (heretter forkortet C. acetobutylicum) ble åpenbart av Weizmann i U.S. patent 1.315.585. I mange år ble denne fremgangsmåten brukt ved fremstillingen av aceton og butanol, og man fikk en viss mengde etylalkohol som et bi-produkt .

Senere ble den mikrobielle fremgangsmåten byttet ut med kjemiske fremgangsmåter som gir de samme produktene under an-vendelse av billige fossile brensels-råstoffer. Den gradvise uttømming av fossilt jordoljebrennstoff med den resulterende økning i priser på petrokjemiske råstoffer har imidlertid gjen-opplivet interessen for denne fermenteringsreaksjonen som bruk-er karbohydrater som er fornybare råstoffer.

Et problem som man støter på ved fremstilling av butanol ved fermenterings-fremgangsmåten, er den lange tiden før mikro-organismen begynner å produsere vesentlige mengder oppløsnings-middel. Dette er spesielt tilfellet dersom det gjøres forsøk på å utføre omsetningen i en kontinuerlig fermenter. Det ville derfor være av betydelig interesse dersom det kunne utvikles en mikro-organismestamme som ville gi hurtigere satsvise fermenteringer, eller som ville redusere den nødvendige tiden for etab-leringen av en stabil tilstand med oppløsningsmiddel-produksjon i en kontinuerlig fermentering.

Forskere som tidligere har arbeidet med problemet, har trodd at sporuleringen til C. acetobutylicum er nødvendig for å holde organismen i en aktiv oppløsningsmiddel-produserende tilstand. Se f.eks. Bahl, et al, European J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 14, 17-20 (1982). Nylig rapporterte Jones, et al, Applied and Environmental Microbiology, 43, 1434-1439 (1982),

at visse asporogene mutanter av C. acetobutylicum ville produsere oppløsningsmidler. Disse må imidlertid være mutanter som fremdeles er aktive produsenter av clostridiale former av celler.

Det er nå utviklet en stamme av C. acetobutylicum som er

en god produsent av butanol selv om den oppviser liten tilbøye-lighet til å danne sporer eller til å endre seg til clostridiale

former. Videre genererer denne stammen butylalkohol i en økt hastighet i en satsvis fermentering og når en stabil tilstand med oppløsningsmiddel-produksjon i en kontinuerlig fermentering på en langt kortere tid enn det som opphavs-stammen gjør.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveie-bragt en fremgangsmåte for å fremstille en forbedret stamme av C. acetobutylicum som omfatter trinnene å dyrke opp en forkultur fra en sporedannende stamme av C. acetobutylicum, inokulere et dyrkingsmedium i en kontinuerlig dyrkingsreaktor med forkulturen og operere den kontinuerlige dyrkingsreaktoren under betingelser med hensyn til temperatur og pH som er passende for vekst av mikro-organismen ved en fortynningshastighet som forhindrer akkumulering av oppløsningsmidler i mediet i en tilstrekkelig lang tid til å danne en stamme som produserer mer oppløsningsmidler på en kortere tid enn det som opphavsstammen gjør.

Videre tilveiebringes det i henhold til den foreliggende oppfinnelse en biologisk ren kultur av C. acetobutylicum,

ATCC 39236 som er velegnet for produksjonen av aceton og butanol ved fermentering av karbohydrater, kjennetegnet ved at den har en tilbakevendingsfrekvens til sporedannere som er mindre enn ca. 1 x 10 ^ når den dyrkes i 96 timer ved en satsvis prosess ved 35°C i et medium bestående i det vesentlige av en vandig oppløsning av et 10 D. E. stivelsehydrolysat og mais-støpevæske.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter omdannelse av en sporedannende stamme av en oppløsningsmiddel-produserende C. acetobutylicum til en asporogen stamme som er en bedre opp-løsningsmiddel-produsent enn det sporedannende opphavet. Denne omdannelse utføres ved å dyrke den sporedannende stamme på en kontinuerlig måte ved en fortynningshastighet som forhindrer opphopingen av oppløsningsmidler i mediet.

I beskrivelsen av oppfinnelsen betegner ordene "fortynningshastighet" en verdi som fåes ved å dividere strømningshastighet-en til mediet gjennom reaktoren i volumenheter pr. time med driftsvolumet til reaktoren målt i de samme enheter. Den har måleverdi "pr. time".

Det kan anvendes en hvilken som helst sporedannende stamme av C. acetobutylicum som hovedsakelig danner butanol og aceton ved fermentering av karbohydrater. En særlig brukbar stamme for praktiseringen av oppfinnelsen er den sporedannende stammen C. acetobutylicum ATCC 4259 som er tilgjengelig fra American Type Culture Eollection, Rockville, Maryland.

Den kontinuerlige dyrkingsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres i et medium som omfatter en vandig oppløsning inneholdende oppløste karbohydrater og andre næringsstoffer egnet for dyrking av mikro-organismer. Mediet steriliseres før bruk ved hjelp av varme eller andre midler som er velkjent inn-en teknikken.

Ved utøvelsen av oppfinnelsen utgjør en vandig oppløsning av et stivelsehydrolysat med lav D.E. (dekstrose-ekvivalent) hvortil det er blitt tilsatt en liten mengde (fra ca. 0,5 vekt-as til ca. 2 vekt-%, på tørrbasis) med mais-støpevæske, et passende medium. Stivelsehydrolysater med lav D.E. (ca. 5 D.E. til ca. 20 D.E.) fremstilt ved den delvise hydrolyse av stivelse er lett tilgjengelig fra maismølle-industrien. På samme måte er mais-støpevæske, som fremstilles når mais bløtes opp i en for-tynnet oppløsning av svoveldioksyd, tilgjengelig fra våtmølle-industrien.

Kontinuerlig dyrking startes opp ved å inokulere det sterile mediet i en kontinuerlig reaktor med en forkultur av den sporedannende stamme. En passende fortynningshastighet for den kontinuerlige dyrkingen er fra ca. 0,1 til ca. 0,5 pr. time.

Betingelsene med hensyn til pH og temperatur som brukes ved kontinuerlig dyrking, er de som er egnet for veksten av den an-vendte, sporedannende mikro-organismen. Når mikro-organismen er en stamme av C. acetobutylicum, er et passende temperatur-område fra ca. 34°C til ca. 40°C, og en passende pH er fra ca. 4,5 til ca. 5,5.

Den kontinuerlige dyrkingen utføres ved den angitte for-tynningshastigheten i fra ca. 1 til ca. 2 uker inntil kulturen opptrer asporogent. Dette kan bestemmes ved å utplate cellene fra kulturen på agar-plater som inneholder et passende vekst-medium. Celler som vokser på disse platene i en anaerob beholder brukes til å inokulere et flytende dyrkingsmedium. Cellene som der dannes undersøkes mikroskopisk etter nærvær av sporer.

Det ble erholdt en stamme av C. acetobutylicum ATCC 3 9236, ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Den ble iso lert fra en kontinuerlig kultur som var blitt kjørt i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved å bruke et inokulum fremstilt fra den velkjente sporedannende stammen C. acetobutylicum ATCC 4259.

Stamme ATCC 39236 betegnes som en asporogen stamme. Ordene "asporogen stamme" slik de her er brukt, betegner en stamme som har en tilbakedannelsesfrekvens til sporedannere på mindre enn ca. 1 x 10 ^ når den dyrkes i 96 timer ved en satsvis prosess ved 35°C i et medium bestående i det vesentlige av en vandig oppløsning av et 10 D.E. stivelsehydrolysat og mais-støpevæske .

Overraskende produserer stamme ATCC 39236 butanol hurtigere og i mye bedre utbytte enn hva opphavskulturen gjør selv om den asporogene stammen ikke frembringer clostridiale former som har vært ansett som nødvendige for fremstillingen av oppløs-ningsmidler. Videre når denne asporogene stammen en stabil tilstand med hensyn til oppløsningsmiddel-produksjon i løpet av omtrent 1/4 av den tiden som trengs til dette hos opphavsstammen når de brukes til å fremstille oppløsningsmidler i en kontinuerlig fermenteringsprosess.

Eksemplene nedenunder beskriver ytterligere utførelses-former ifølge oppfinnelsen. Alle deler er basert på vekt og alle prosenter er basert på vekt med mindre det er uttrykkelig fastslått at det er annerledes.

Oppløsningsmiddel-konsentrasjoner ble bestemt ved å bruke væske-kromatografi med høy yte-evne (HPLC). Bestand-deler ble analysert kromatografisk ved eluering med 0,006 N r^SO^fra en kationbytter-harpiks i hydrogenformen. De eluerte bestand-delene ble påvist ved hjelp av et differensial-refraktometer, plottet på en skriver og kvantifisert ved å bruke en elektro-nisk integrator. Arealet under kurven som representerer kon-sentrasjonen av hver bestand-del, angis som en prosent av det totale arealet. Den generelle fremgangsmåten er den som er an-gitt i "Analysis of Carbohydrate Mixtures by Liquid Chromo-tography", Am. Soc. Brew. Chem. Proe, 1973, sidene 43-46. Separasjonene ble gjort på en 1 fot stor HPX-87-kolonne i hydro-genf ormen som er tilgjengelig fra Bio-Rad Laboratories, Rich-mond, California.

Eksempel 1

En kultur av C. acetobutylicum, ATCC 4259, ble erholdt fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, og opp-rettholdt i en sporulerende tilstand på en blanding av jord, sand og kalsiumkarbonat. Inokulum for oppstarting av en kontinuerlig dyrking ble utviklet i en 125 ml Erlenmeyer-forkultur-kolbe inneholdende 100 ml av et vandig medium bestående av 10% på tørr basis av et 10 D.E. stivelsehydrolysat (tilgjengelig fra Grain Processing Company, Muscatine, Iowa, som Maltrin M-100)

og 1% på tørr basis av mais-støpevæske (tilgjengelig fra Corn Products Unit of CPC International Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, som Code E801. pH i mediet ble justert til 6,2 med konsentrert NH4OH-oppløsning før det ble sterilisert ved oppvarm-ing i en autoklav ved 121°C i 20 minutter. Det avkjølte, sterile mediet i forkultur-kolben ble inokulert med 5 ml av en varme-behandlet suspensjon fra kulturen i det samme mediet. Varmebehandling ble utført ved først å suspendere ca. 0,5 g av en jord-spore-suspensjon i 10 ml av så-mediet. Suspensjonen ble deretter plassert i kokende vann i 90 sekunder og avkjølt hurtig til værelsestemperatur. Forkultur-kolben med inokulert medium ble inkubert i en anaerob beholder i 21 timer ved 3 5°C.

En kontinuerlig dyrkingsfremgangsmåte ble utført i en 2 liter stor New Brunswick Bioflow, Model C-30 fermenter (New Brunswick Scientific Company, New Brunswick, New Jersey) som inneholdt en pH-regulator og et bunn-drevet magnetisk røreverk. Driftsvolumet i kolben var 1,3 liter. Fermenteren ble fylt med 1200 ml sterilt medium med den samme sammensetningen som det som ble brukt til å fremstille så-kulturen med unntak av at det ble justert til pH 5,0 med konsentrert NH^OH. Mediet ble gjennom-blåst med CC^(anaerob grad) i 30 minutter før det ble inokulert med den 100 ml store forkulturen. Strømningshastigheten for friskt medium inn i fermenteren ble justert til å gi en for-tynnings-hastighet på 0,1 pr. time. Blandingen ble omrørt med 200 omdreininger pr. minutt (rpm). Temperaturen ble holdt på 37°C og pH ble regulert til 5+0,1 ved tilsetningen av NH^OH etter behov. Etter at den kontinuerlige dyrkingsprosessen var blitt kjørt i 2 uker, ble celler fra kulturen platet ut på Bacto MRS-agarplater (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) og platene ble inkubert ved 3 5°C i en anaerob beholder. I løpet av 2 dager kom kolonier av celler tilsyne. Disse cellene ble lagret ved nedfrysing i glyserol eller ved lyofilisering.

For å bestemme tilbakedannelses-frekvensen til sporedannere, ble medium med den samme sammensetningen som det som ble brukt til å dyrke opphavskulturen i dette eksemplet, inokulert med celler fra den asporogene kulturen. Etter 48 timers dyrking ble det ikke observert noen sporer i dyrkings-mediet. Selv etter 96 timers dyrking inneholdt det mindre enn 1 av 10^ celle-sporer. Når derimot opphavskulturen ble dyrket i det samme mediet, utviklet det seg en høy konsentrasjon (>10 5/ml) av sporer etter 96 timer med dyrking. Denne prøven viser at stammen isolert ved fremgangsmåten ifølge dette eksemplet er asporogent.

Eksempel 2

Fremgangsmåten ifølge eksempel 1 ble fulgt med unntak av at den kontinuerlige dyrkingsprosessen ble utført ved en fortynningshastighet på 0,28 pr. time og ved en temperatur på 35°C. Den asporogene kulturen erholdt ved hjelp av denne fremgangsmåten ble brukt til å fermentere karbohydrater til aceton og butanol ved hjelp av den følgende satsvise prosess. En asporogen koloni ble plukket ut fra platen og plassert i 100 ml av mediet bestående av det stivelsehydrolysat/mais-støpevæske. Kulturen i denne forkulturkolben ble dyrket i 20 timer ved 35°C i en anaerob inkubator. Til en steril oppløsning som inneholdt 10% på tørrbasis av et 10 D.E. stivelsehydrolysat og 1% på tørr-basis av mais-støpevæske justert til pH 6,5 med NH^OH, ble det tilsatt 0,03% CaCO^på tørrbasis. Blandingen ble inokulert med 3 volum-% materiale fra forkultur-kolben med den asporogene kulturen og fermentering ble utført under anaerobe betingelser i 72 timer. Det ble gjort en kontroll-fermentering ved å bruke materialet fra den 21-timers forkulturen av den sporedannende opphavs-stammen C. acetobutylicum ATCC 4259 slik som beskrevet i eksempel 1. Prøver av fermenteringsvæsken ble analysert med hensyn på aceton og butanol etter 24,'48 og 72 timer ved hjelp av HPLC. Resultatene, uttrykt som gram oppløsningsmiddel pr. 100 ml dyrkingsvæske i tabell 1, indikerer at den asporogene kulturen produserer oppløsningsmidler hurtigere og i mye bedre utbytte enn det opphavskulturen gjør. Videre viser dette eksemplet at stammen kan produsere oppløsningsmidler ved å bruke bare bestanddeler som er lett tilgjengelige fra våt-malings-fremgangsmåten for mais.

Eksempel 3

Den generelle satsvise fermenteringsprosessen beskrevet i eksempel 2 ble fulgt med unntak av at det ble brukt et maismesk-medium. Dette mediet ble oppnådd ved å flytendegjøre en 10% på tørrbasis suspensjon av oppmalt mais i vann. Flytendegjøring ble utført ved å tilsette to enheter Thermamyl (et alfa-amylase-enzym tilgjengelig fra Novo Enzyme Corporation, Mamaroneck, New York) pr. gram mais, varme opp blandingen i 30 minutter ved 90°C, la den avkjøles til værelsestemperatur med leilighetsvis omrør-ing og deretter sterilisere den i en autoklav ved 121°C i 20 minutter. En asporogen koloni utplukket fra platen fremstilt i eksempel 1 ble brukt til å inokulere en forkultur-kolbe og forkulturen ble dyrket som beskrevet i eksempel 2. Til 3 88 ml med sterilt maismesk-medium ble det tilsatt 12 ml av suspensjonen av celler fra forkultur-kolben og blandingen fikk fermentere i en anaerob inkubator i 68 timer. Det ble utført en kontroll-fermentering ved å bruke som en forkultur en kultur av den sporedannende opphavs-stammen av C. acetobutylicum fremstilt slik som beskrevet i eksempel 1. Prøver av fermenteringsvæsken ble analysert med hensyn på aceton og butanol etter 20, 44 og 68 timer ved hjelp av HPLC. Resultatene, uttrykt som gram oppløsnings- middel pr. 100 ml dyrkingsvæske i tabell II, indikerer at den asporogene kulturen produserer oppløsningsmidler hurtigere og i mye bedre utbytte enn det som opphavskulturen gjør når begge dyrkes i et maismesk-medium.

Eksempel 4

Det ble utført to kontinuerlige fermenteringer ved å bruke mediet, fremgangsmåten for fremstilling av forkultur og den kontinuerlige fermenteren beskrevet i eksempel 1. Ved en av fer-menteringene var kulturen som ble brukt, den asporogene kulturen erholdt i eksempel 1. Ved den andre fermenteringen (kontrol-len) var kulturen som ble brukt, opphavkulturen av C. acetobutylicum ATCC 4259. Begge fermenterne ble kjørt ved en fortynningshastighet på 0,1 pr. time og prøver av avløpsvæsken ble analysert med hensyn på aceton og butanol ved jevne mellomrom ved hjelp av HPLC. Resultatene, uttrykt som gram oppløsnings-middel pr. 100 ml avløpsvæske i tabell III, indikerer at fermenteringen med den asporogene kulturen når en forholdsvis stabil tilstand med hensyn til oppløsningsmiddel-produksjon etter 4 8 timer. Opphavskulturen begynner derimot med en vesentlig oppløsningsmiddel-produksjon først etter 8 dager. Det ble fun-net at omtrent 10 dager krevdes før opphavsstammen nådde en stabil tilstand med oppløsningsmiddel-produksjon. Dette eksemplet viser en annen uventet egenskap hos mutantstammen ifølge oppfinnelsen, dvs. at den begynner å produsere oppløsningsmidler i en kontinuerlig fermentering mye snarere enn det som opphavs kulturen gjør.

Claims (6)

1. En fremgangsmåte for å fremstille en forbedret stamme av C. acetobutylicum, karakterisert ved trinnene å dyrke opp en forkultur fra en sporedannende stamme av C. acetobutylicum, inokulere et dyrkingsmedium i en kontinuerlig dyrkingsreaktor med forkulturen og gjennomføre den kontinuerlige dyrkingen under betingelser med hensyn til temperatur og pH som er egnet for dyrking av mikro-organismen ved en fortynningshastighet som forhindrer akkumulering av oppløsningsmidler i mediet i en tilstrekkelig lang tid til at det dannes en stamme som produserer mer oppløsningsmidler på en kortere tid enn det som opphavstammen gjør.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som sporedannende stamme av C. acetobutylicum anvendes stammen ATCC 4259.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den kontinuerlige dyrkingen utføres ved en temperatur fra ca. 34°C til ca. 40°C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den kontinuerlige dyrkingen utføres ved en pH fra ca.

4,5 til ca. 5,5.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den kontinuerlige dyrkingen utføres ved en fortynningshastighet fra ca. 0,1 til ca. 0,5 pr. time.

6. Biologisk ren kultur av C. acetobutylicum ATCC 3923 6 som kan brukes til fremstillingen av aceton og butanol ved fermentering av karbohydrater, karakterisert ved at den har en tilbakedannelsesfrekvens til sporedannere som er mindre enn ca. lx 10"^ når den dyrkes i 96 timer ved en satsvis prosess ved 35°C i et medium bestående i det vesentlige av en vandig oppløsning av et 10 D. E. stivelsehydrolysat og mais-støpevæske.