NO832407L - Preparat for anvendelse ved diagnose av chlamydiale infeksjoner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt preparat for påvisning av chlamydiale infeksjoner ved å bruke lipopolysakarider fra re-lipopolysaccharid mutanter av Gram negative bakterier.

Chlamydier er svært små, obligat intracellular bakterier som infiserer fugler, menneske og andre pattedyr. Chlamydiene klassifiseres i to arter, Chlamydia trachomatis og Chlamydia psittaci. Chlamydia trachomatis har en høy grad av vert-spesifisitet, idet den nesten fullstendig er begrenset til mennesket; den forårsaker infeksjoner av varierende hardhet i øyne og i kjønns- og urinveis-organer. Chlamydia psittaci-stammer er derimot sjeldne hos mennesker, men finnes i fugler og i ville dyr og husdyr. C. psittaci er en årsak til abort og diaré-epidemier hos dyr.

Selv om det finnes antichlamydiale behandlingsmåter med legemidler, passerer mange chlamydiale infeksjoner ubehandlet p.g.a. begrensningene som er forbundet med de tilgjengelige diagnostiseringsfremgangsmåtene. De best kjente serologiske fremgangsmåtene som brukes til diagnose av chlamydia, er komplement fikseringsprøver, anvendelse av chlamydialt glycolipid (også kalt en gruppe antigen), motvirkende immunologiske elektrophorese analyser og immunofluorescens-analyser. Disse fremgangsmåtene er beskrevet i U.S.-patentskrift hr. 4.118.469, E.P.-patentskrift No. 17.460 og GB-patentskrift hr. 2.047.889. Isoleringen av chlamydiale antigener og deres anvendelse som vaksiner er beskrevet i U.S.-patentskrift nr^4.118.469, 4.039.657, 4.096.035, 4.271.146 og 4.267.170.

Et hovedproblem ved diagnostisering av chlamydiale infeksjoner ligger i dyrkingen av chlamydiaen. I egenskap av obligat intracellulære bakterier, må chlamydier dyrkes i levende celler,

f. eks. vevkultur eller eggpreparat, noe som nødvendiggjør laboratorier som har spesialisert seg på cellekultur. Fremgangsmåtene for å dyrke chlamydier er kjennetegnet ved lave utbytter og uunngåelig forurensing med fremmedstoffer, slik som ikke

-chlamydiale proteiner, fra de tilknyttede levende cellene.

Selv om nærværet av forurensende stoffer generelt sett er uten betydning, er slike forurensende stoffer viktige i serologiske fremgangsmåter eftersom selv spornivåer av forurensende stoffer kan frembringe dannelsen av påvisbare mengder antistoff.

Dette problemet har nødvendiggjort behovet for kontroll-anti-

gener til å fastslå ikke spesifikke reaksjoner i chlamydiale serologiske fremgangsmåter.

Fremstillingen av chlamydialt antigen, selv om det er forurenset med fremmedstoffer er tidkrevende, kostbart og til og med muligens risikabelt for helsen til forskeren.

Dersom to forskjellige antigenmolekyler tilfeldigvis har

en eller flere funksjonelle grupper tilfelles, ser man at disse antigenene kryssreagerer. Kryssreaksjonen er et redskap som har vært utnyttet for å klassifisere grupper av nært beslektede bakterier. F.eks. er de 1500 eller flere variantene av salmonella ordnet i serologiske grupper ved hjelp av kryssreaksjoner, det vil si at antiserumet fra en stamme i en bestemt gruppe reagerer på andre stammer i denne gruppen. De felles gruppene^éller antigeniske determinantene som er ansvarlige for disse gruppespesifikke reaksjonene, er korte sekvenser av et bestemt sukker-rester. De kryssreagerende grupper behøver ikke å være identiske, de behøver bare å være tilstrekkelig like. Hvis man for eks. kryssreagerer antistoffer mot m-azobenzensulfonat med m-azobenzenarsonat.

"Røff" (R)-mutanter er en velkjent klasse bakterielle mutanter (Luderitz et al., Comprehensive Biochemistry, Vol. 26A, pp. 105-228, M. Florkin & E.H. Stotz, Eds., Elsevier, Amster-

dam (1968); Makela & Stocker, Annu. Rev. Genetics, Vol.3,

pp. 291-322 (1969); Makela & Stocker in Genetics As a Tool in Microbiology, Glower & Hopwood, Eds.; Soc. Gen. Microbiol.

Symp. 31, Cambridge University Press (1981)) hvor et trinn i biosyntesen av LPS er mangelfull, og derved blokkerer full-førelsen av molekylet. R mutantene klassifiseres i kjemotyper efter deres LPS struktur (Fig. 4 og sidene 156-171 i Luderitz et al. 1968, og Fig. 4 i Luderitz et al., Current Topics In Membranes and Transport, Vol. 17, pp. 79-151 (1982). Idenne klassifiseringen defineres en kjemotype av Re eller en "Re-mutant" som en mutant hvis LPS består av lipid A og KDO (3-deoxy-D-manno-octuloson syre, tidligere kalt 2-keto-3-deoxy-octonat) uten andre monosakkarid substituenter. An denne grunn refereres ofte re-mutanter til som "hepfeosemanglende" eftersom de til og med mangler heptose, monosakkaridet som i de fleste LPS er den neste enheten som er knyttet distalt til KDO. Slike re-mutanter ble først beskrevet i slekten salmonella (både S. typhimurium og S. minnesota) men har senere blitt funnet i andre arter (Escherichia coli og Proteus mirabilis), og kan sannsynligvis isoleres fra mange andre eftersom LPS strukturen i den umiddelbare nærheten av lipid A varierer svært lite blant de gram-negative bakteriene (Luderitz et al. 1982).

Det er et formål ved foreliggende oppfinnelse å påvise antistoffer mot Chlamydier ved å bruke Re-lipopolysakkarid (Re-LPS) fra re-mutanter av gram-negative bakterier.

Et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å påvise chlamydier ved å bruke antistoffer mot Re-LPS fra re-mutanter av gram-negative bakterier.

Det er også et formål ved foreliggende oppfinnelse å eliminere ulempene og problemene beskrevet ovenfor som er forbundet med dyrkingen av chlamydier.

Det er et ytterligere formål ved foreliggende oppfinnelse

å eliminere behovet for kontroll antigener.

Det er funnet at antistoffer mot chlamydiat glycolipid kryss-reagerer med re-lipopolysakkaridet fra re-lipopolysakkarid (Re-LPS) mutanter av gram-negative bakterier og at chlamydialt glycolopid antigen kryssreagerer med anti-re-lipopolysakkarid anti-stoffene. Et preparat ifølge oppfinnelsen ,det såkalte re-LPS, kan brukes ved fremstillingen av gruppespesifikke antistoffer fra chlamydia for diagnostiske formål eller for å påvise antistoffer mot chlamydialt gruppe-anti-gen iprøver, slik som serum, avføring eller slim fra nese, strupehode eller urinveier. Preparatet kan brukes som anti-gen i serologiske fremgangsmåter som vanligvis brukes ved diagnose av chlamydiale infeksjoner, slik som komplement fikseringsprøver,motvirkende immunologiske elektrophorese fremgangsmåter, fremgangsmåter med passiv hemma-glutinering, fremgangsmåter med hemolyser i gel (HIG), fremgangsmåte med enzym immunologisk analyse (EIA), fremgangsmåte med immunologisk fluorisence (FIA) og fremgangsmåte med radioaktiv immunologisk analyse. Bruken av preparatet er ikke begrenset til de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene, men•kan i prinsippet brukes ved alle serologiske eller immunologiske fremgangsmåter hvor antistoffer mot gruppespesifikt antigen fra chlamydia skal påvises. Antiserum mot gruppespesifikt chlamydialt antigen kan fremstilles direkte ved immunisering med en re-mutant fra en gram-negativ bakterie uten isolering av re-lipopolysakkaridet.

Re-LPS ifølge foreliggende oppfinnelse er lett og billig

å fremstille. Det egner seg for masseproduksjon og kan brukes ved diagnose og i immunologiske og serologiske fremgangsmåter

på mange forskjellige måter. Eftersom re-LPS ifølge oppfinnelsen er kjemisk rent, trenges ikke kontroll antigener for å bestemme invirkningen av fremmedmateriale fra vevkulturene eller egg-pre-paratene.

Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder et re-lipopolysakkarid isolert fra re-lipopolysakkarid mutanter av gram-negative bakterier.

Gram-negative bakterier inneholder et lipopolysakkarid med den følgende generelle strukturen:

Lipid A bestanddelene som er inntegnet i (I), inneholder glucosamin disakkarid som er substituert i hydroxyl-gruppen med fettsyrer, 4-aminoarabinosefosfat og diphosphorylethanolamine som er substituert i aminogruppen med fettsyrer. Kjærnebestanddelen er et polysakkarid som er knyttet til lipidet A over en KDO-oligosakkarid bestanddel satt sammen av to eller tre KDO-molekyler, hvorav den ene kan være substituert med en R bestanddel. R er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en phosphat gruppe og en diphosphorylalkanolamin gruppe, og er fortrinnsvis en diphos-phorylethanolamin gruppe. O-polysakkridbestanddelen er et (monosakkarid)n hvor n er et helt tall fra null til uendelig stort. Mens strukturene for lipid A-, kjerne og o-polysakkarid-bestanddelene varierer i forskjellige bakteriestammer, forblir strukturen av KDO-oligosakkarid-bestanddelen som inneholder to eller tre KDO-molekyler, vanligvis ganske konstant. KDO er 3-deoxy-D-manno-octulosonsyre som har følgende struktur:

Representative gram-negative bakterier, f.eks. salmonella-gruppen, inneholder en kjerne med minst bestanddelene glucosamin, glucose, galactose og heptose. Re-LPS-mutanter av slike gram-negative bakterier produserer et re-LPS som mangler kjerne - og o-oligosakkrid-bestanddelene. Re-LPS-N, som har formelen:

hvor lipid A, KDO-oligosakkrid og R har de samme betydningene som ovenfor, kryssreagerer med chlamydiale antistoffer.

Ifølge vanlig brukte kjemiske "analyser er molekylvekten for et re-LPS ca. 3000. Når re-LPS utsettes for elektrophorøse 1 en 15% natrium dodecylsulfat-polyacrylamid gel (SDS-PAGE fremgangsmåten er beskrevet av Laemmli i Nature, Vol. 227, pp. 680-685 (1979)), er forflytningshastigheten for re-LPS (slik som angitt ved sluttstillingen til båndet efter electrophorese) likt med den til glycolipid gruppe antigenet fra chlamydia tracomatis. Forflytningshastigheten til re-LPS er også klart forskjellig

fra forflytningshastigheten til LPS av chemotype Rb2som har en molekylvekt på omtrent 4000 d og som har 6 monosakkarid-enheter i kjernen i tillegg til lipid A-KDO-oligosakkaridet (se LUderitz et al. 1982 som angitt ovenfor for Rb2strukturen). LPS båndene kan synliggjøres i gelen efter farging med sølv-nitrat (Tsai & Frasch, Anal. Biochem., Vol. 119, pp. 115-119 1982)) eller ved hjelp av immunologisk flekking (Towbin et al. Proe. National Acad. Sciences, Vol. 76, pp. 4350-4354 (1979)). En slik gel efter sølvnitrat-farging er vist i fig. 1 hvor felt 1 er Rb2~LPS fra S. typhimurium Rb2mutantstamme SH 5014 (Nurminen et al., J.Bact., Vol. 127, pp. 941-955, (1976)), felt 2 er re-LPS fra S. typhimurium re-mutant stammen SL 1102, og felt 3 er glycolipid fra chlamydia trachomatis. Mens prøvene ble tilført på toppen av gelen, er bare den nedre delen av gelen med båndet for LPS med lav molekylvekt vist.

Mens noen av fettsyrene og 4-aminoarabinosefosfåt kan fjernes fra re-LPS ved behandling med en svak base (0.16 N NaOH,

1 h, 56°C), forblir KDO-bestanddelen knyttet til re-LPS.

Når re-LPS fra (II) behandles med en svak base, beholder det sine immunigene egenskaper og kan derfor med fordel brukes til å påvise antistoffer mot chlamydialt gruppeantigen i forskjellige immunologiske og serologiske fremgangsmåter. Når re-lipopolysakkaridet kokes i svak syre (0.1 N HC1), frigjøres KDO-substitu-entene og ødelegger derved de immunologiske determinantene som

trengs til chlamydial diagnose.

Antiserumet som produseres mot re-lipopolysakkarider eller hele re-mutant bakterier i eksperimentdyr, kryssreagerer med glycolipid antigen isolert fra chlamydia arter.

Re-lipopolysakkaride mutanter (som mangler heptose) brukes til å syntetesere re-LPS angitt i (II). Re-mutantene fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter fra gram-negative forldrebakterier som er istand til å syntetisere LPS angitt i (I). Re-mutantene kan avledes fra forskjellige lett tilgjengelige gram-negative bakterier. Re-mutantene som brukes ved denne oppfinnelsen, er de følgende: Salmonella tyhpimurium (re-mutant)

(SL 110.2), Wilkinson et al., Journal of General Microbiol.,

Vol. 70, pp. 527-554 (1972); Salmonella minnesota (re-mutant R595) (SH 320), Luderitz et al., Annals of N.Y. Academy of Sciences, Vol. 133, pp. 374-394 (1966); Escherichia coli K-12 (re-mutant D21f2) (EH 237), Mayer et al., European Journal of Biochem., Vol. 66, pp. 357-368 (1976) og proteus mirabilis (re-mutant R45), Kotelko et al. Journal of Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol., Vol. 21, pp. 271-284 (1977). Disse re-mutantene er lett tilgjengelige fra forskningsgruppene nevnt i disse publikasjoner eller fra the National Public Health Institute i Helsingfors. Lipopolysakkarid-preparatet ifølge oppfinnelsen kan også fremstilles fra gram-negative bakterier som er forskjellige fra de som er nevnt ovenfor, forutsatt at både de gram-negative bakterier og deres remutanter produserer de ovenfor nevnte, spesifike lipopolysakkaridene.

De gram-negative bakteriene som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse, krever ikke spesielle næringsstoffer i kulturmediene. Eftersom bakteriene hvor det har skjedd re-muta-sjon er svært følsomme for detergenter, gallesyrer og giftstoffer utgjør re-mutanter små problemer utenfor laboratoriemiljøer.

Bakteriene som er egnet for bruk ved foreliggende oppfinnelse, kan dyrkes på en rekke medier, slik som anriket Salmonella-agar, beskrevet av Schlecht og Westphal iZentralblatt fxir Bakteriologie,Parasitenkunde, Infectionskrankenheiten und Hygiene, Vol. 1, Orig. 200, pp. 241-259 (1966). Re-mutantene ifølge oppfinnelsen dyrkes over natten på anriket salmonella-agar og samles derefter opp med vann. Derefter sentrifugeres cellene ved 5000 rpm i ca. 10 min. Celle pelleten vaskes med destillert vann og sentrifugeres på nytt ved 5000 rpm i ca. 10 min. Bruken av destillert vann i denne fasen er vesentlig for vellykket isolering av lipopolysakkarid. Selv om isoleringen av lipopolysakkarid fra re-mutanten med fordel kan utføres ifølge fremgangsmåten beskrevet av Galanos et al. i the European Journal of Biochem., Vol 9, pp. 245-249 (1969), kan det også brukes andre vel-kjente fremgangsmåter med gode utbytter, se f.eks. Westphal et al. i Methods in Carbohydrate Chemistry, Editors R.L. Whistler, J.N. BeMiller og M.L. Wolfram, Vol. 5, p. 83. Det isolerte LPS kan behandles med alkali slik som beskrevet i Handbook of Micromethods for the Biological Sciences, Keleti & Lederer, Eds.,

pp. 133-135 (1974).

Den følgende beskrivelse av bestemte prøvefremgangs-måter er illustrerende for oppfinnelsen: Re-mutant R595 av Salmonella minnesota bakteriet (Luderitz et al., 1966 referert til ovenfor)

A. Dyrking av Salmonella minnesota.

Re-mutanten av R 595 av Salmonella minnesota ble dyrket over natten ved 37°C på anriket Salmonella agar plater (Schlecht &.Westphal 1966 referert til ovenfor), fremstilt fra 10 1 anriket Salmonella agar. Bakteriene ble samlet opp med ca.

500 ml destillert vann, overført til en sentrifugeflaske og sentrifugert ved 5000 rpm i ca. 10 min. Celle pelleten ble på nytt suspendert i destillert vann og sentrifugert ved 5000 rpm i ca. 10 min., celle pelleten ble frysetørket. Utbyttet var ca. 30 g.

B. Isolasjon av re-lipopolysakkarid.

(Galanos et al. 1969 referert til ovenfor)

Lipopolysakkaridet ble ekstrahert frå den frysetørkede pellet ved å bruke en phenol:chloroform:petrolether-blanding (2:5:8) ved 0°C. Chloroformen og petroletheren ble fjernet ved fordamping og lipopolysakkaridet ble utfelt med destillert vann. Lipopolysakkaridet ble renset ved å oppløse bunnfallet i destillert vann ved 45°C og sentrifugering ved 100.000 g. Lipopolysakkaridet ble frysetørket og lagret ved værelsetemperatur. Utbyttet av lipopolysakkaridet var ca. 5% av bakterie-tørrvekten.

C. Alkalibehandling av Re-lipopolysakkarider.

10 mg av re-lipopolysakkaridet isolert i avsnitt B

ble opløst i 1 ml 0.25 M natrium hydroxid. Det oppløste re-LPS ble inkubert ved 56°C i 60 min. og hensatt for kjøling til

værelsetemperatur. Derefter ble dette materialet sentrifugert ved 2000 rpm i 15 min. ved 4°C. Den resulterende supernatant ble samlet opp og nøytralisert med 1 N ediksyre. Det nøytra-liserte materiale ble dialysert mot vann over natten og det dialyserte materiale ble frysetørket. D. Immunisering med det isolerte lipopolysakkarid.

Eftersom et rent lipopolysakkarid bringer for dagen svake immunologiske responser, ble lipopolysakkaridet brakt i kompleks med et bærermolekyl, slik som et rpotein, for å øke den immunologiske responsen. For eksempel ble 1 mg av Salmonella-porin-protein (bærer) og 0.1 mg av re-lipopolysakkarid blandet i 5 ml med 0.25%natrium lauryl sulfat (SDS).

Efter at kompleksdannelsen hadde oppstått, ble immunogenet dialysert for å fjerne SDS. Denne fremgangsmåte blebeskrevet av Kuusi et al. i Inf. Imm., Vol. 34, pp. 328-332 (1981).

Antistoffer mot re-lipopolysakkarid ble fremstilt ved hjelp av vanlig kjente immuniseringsfremgangsmåter. Kaniner ble inoculert^medPO.5 ml av det dialyserte immunogen på fire steder av hver kanin. Alle-: injeksjoner var subcutanøse. En hjelpe-innoculering på 0.5 ml av immunogenet ble gitt 14 dager efter den opprinnelige innoculeringen. Serum ble samlet opp fra kaninene 10 dager efter den siste injeksjonen.

E. Immunisering med hele bakterier.

Salmonella minnesota ble dyrket i næringsmedium intil bakteriene nådde den logaritmiske vekstfasen. Bakteriene ble samlet opp ved hjelp av sentrifugering og vasket en gang med physiologisk saltvannsoppløsning. Bakteriene ble suspendert i fysiologisk saltvannsoppløsning ved en konsentrasjon på 10^ bakterier/ml og ble inaktivert ved oppvarming i 1 time ved 100°C og ved å tilsette 0.5% formalin. Kaniner ble innoculert med 0.5 ml av de inaktiverte bakteriene på fire steder på hver kanin. Hjelpeinnoculeringer på 0.5 ml ble gitt 7 ganger med en ukes mellomrom efter den opprinnelige innoculeringen. Serumet ble samlet opp 10 dager efter den siste injeksjonen.

Fremgangsmåten beskrevet i avsnitt A kan anvendes til

å dyrke re-mutanter fremstilt fra andre gram-negative bakterier. Antisera mot disse re-mutanter kan fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i avsnitt E. Lipopolysakkaridet kan isoleres fra bakterien i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i avsnitt B, og antiseraene mot lipopolysakaridet kan

fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåten beskrevet i avsnitt D.

De følgende eksemplene viser anvendeligheten av preparatet ifølge oppfinnelsen ved påvisningen av chlamydier eller chlamydie-antistoffer.

Eksempel 1.

Kryssreaksjonene til antistoffer mot re-mutanter av gram-negative bakterier ble undersøkt ved å bruke den enzymatiske immunologiske analyse fremgangsmåten (EIA) beskrevet av Koskela og Leinonen i Ped. Inf. Dis., Vol. 1, pp. 245-252 (1982). Antigenet som ble anvendt i EIA-fremgangsmåten, var glykolipidet isolert fra chlamydiet. Antiserum mot chlamydialt glycolipid ble fremstilt ved hjelp av immuniseringen av kaniner med Salmonella re-mutant stammer (S.typhimurium, S. minnesota) og re-LPS-porin kompleks. Antistoff titern mot chlamydialt glycolipid i S. typhimurium og S. minnesota re-mutant antisera, slik de ble bestemt ved hjelp av EIA-fremgangsmåten, er vist i tabell 1.

Resultatene gjengitt i tabell 1 indikerer at antisera fremstilt ved hjelp av immuniseringen av kaniner med re-mutant stammer (S. typhimerium og S. minnesota) og re-LPS-porin kompleks inneholder store mengder antistoffer mot chlamydialt glycolipid. Det chlamydiale glycolipidet kryssreagerte ikke med normalt serum eller med antiserum mot S. typhimurium mutanten av chemotype Rd2»som har beholdt en sukker-rest fra LPS kjernen.

<*>En heptoserest fra LPS kjernebestanddelen er tilstede i mutanten i tillegg til lipid A KDO-oligosakkaridet. ;Eksempel 2;Lipopolysakkarid preparater (re-LPS) ifølge oppfinnelsen ble anvendt som antigener for å påvise chlamydiale antistoffer. ;A. Enzymatisk Immunologisk Analysefremgangsmåte og ;andre fastfase-fremgangsmåter.;Microtitre enzymater for enzymatisk immunologisk analyse (A/S Nunc, Roskilde, Danmark) ble belagt ved å anvende de følgende re-LPS konsentrasjonene: 1, 5, 10 og 20 microg/1 ml phosphatbufret saltvannsoppløsning ved pH 7.4. Platene ble inocculert og inkubert ved 37°C over natten. EIA bestemmelsen ble utført og resultatene (EIA titrene) beregnet slik som beskrevet i detalj av Koskela et al. i Journal of Clinical Pathology, Vol. 34, pp. 93-98 (1981) og av Koskela et al., i ;Ped. Inf. Dis., Vol. 1, pp. 245-252 (1982). Alkaliske phosphatase-merkede anti-immunoglobulin conjugatene var kommersielle preparater av anti-menneske IgG, IgM og IgA, anti-kanin IgG og anti-mus IgG, alle levert av Orion Diagnostica, Helsingfors, Finland. ;De optimale konsentrasjonene av re-LPS eller alkali-behandlet re-LPS som gav den høyeste EIA-titer i kanin antiserum mot re-mutant og også et negativt resultat i ikke-immunisert kanin serum, var 10 microg/ml. Denne re-LPS konsentrasjonen ble brukt for å belegge platene i senere undersøkelser. ;Kaniner ble immunisert med chlamydier slik som beskrevet i avsnitt E. Antisera fra disse kaninene ble prøvet mot re-LPS isolert fra fire forskjellige bakterier ved å bruke EIA fremgangs måten. EIA-antistofftiterne mot re-LPS preparater i chlamydiale antisera, eller i kanin antiserum mot S.minnesota re-mutant eller i normalt kaninserum er gjengitt i tabell II. ; Monoclonale museantistoffer mot chlamydier ble frem-•stilt ved hjelp av hybridoma teknikken beskrevet av Kohler et al. i Nature, Vol. 256, pp. 495-497 (1975). Monoclonale antistoffer reagerer i EIA-prøven med det chlamydiale glycolipidet og reagerer også med re-LPS. EIA-reaktiviteten til monoclonale antistoffer mot chlamydialt glycolipid, mot re-LPS fra S.typhimurium og mot det samme re-LPS efter alkali behandling (slik som beskrevet i C ovenfor) er vist i tabell III. ; Eftersom monoclonale antistoffer er spesifikke for en antigene determinand, indikerer reaksjonene mellom de monoclonale anti-stoffene og chlamydialt glycolipid og re-LPS en felles antigen struktur i det chlamydiale glycolipidet og re-LPS. ;Immunologiske analyser basert på radioaktivitet og fluorisens (RIA og FIA) kan også brukes istedet for EIA eftersom disse analysene adskiller seg fra EIA bare ved markøren på det andre antistoffet (f.eks. radioisotop i RIA, fluorochrome i FIA ;og enzym i EIA).;B. Motvirkende immunologiske elektrophorese (CIE);Antiserumet fra en kanin immunisert med chlamydia (chlamydia 1 i tabell II) ble prøvet mot re.LPS (fra S. typhimurium SL 1102) og alkalibehandlet re-LPS ved å bruke CIE-fremgangsmåten (Leinonen, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 11, ;pp. 135-140 (1980)). Resultatene er vist i fig. 2. Re-LPS (A);og alkali-behandlet re-LPS (B) i tre forskjellige konsentrasjoner 100 microg/ml, 10 microg/ml og 1 microg/ml (1, 2 og 3) danner en tydelig avgrenset precipitin linje med chlamydialt antiserum (C). ;C. Dobbel immunodiffusjon.;Antiserumet fra en kanin immunisert med et chlamydia (chlamydia 1 i tabell II) ble prøvet mot re-LPS (fra S. typhimurium SL 1102) og alkalibehandlet re-LPS ved å bruke dobbel immunodiffusjon (fig. 3)'. Brønnene ble stanset ut i den 0.9% agarose gelen som inneholdt 0.15% deoxycholat (DOC). Brønnene inneholdt 100 microg/ml 0.15% DOC med chlamydialt glycolipid (1,4), re-LPS (2) og alkalibehandlet re-LPS (3). Midtbrønnen inneholdt chlamydialt antiserum. Utfellingslinjen mot re-LPS, alkalibehandlet re-LPS og chlamydialt glycolipid falt sammen hvilket viser ;-identitetsreaksjonen (ih.h.t. Ouchterlony og Nilsson, Handbook of ;I J ;Experimental Immunology, ed. D.M. Weir, Chapter 19, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)). ;D. Passiv Hemagglutinering.;Røde blodceller fra sauer ble gjort følsomme med re-LPS (fra S. typhimurium SL 1102) eller med det alkalibehandlede re-LPS slik som beskrevet (Handbook of Micromethods for the Biological Sciences, Keleti & Lederer, Eds., pp. 134-135 (1974)). De vaskede cellene ble suspendert i fosfatbufferet saltvannsopp-løsning til en 0.5% suspension. 25 microl av denne suspensionen ble blandet med 75 microl av seriefortynninger av antiseraene som skulle prøves i U-formede brønner på en microtiterplate. Agglutinationen ble avlest visuelt efter inkubering ved 37°C i ;30 min. Positive agglutinationer ble ikke observert med et normalt kaninserum, mens det antichlamydiale kaninserumet (chlamydial i tabell II) agglutinerte disse celler i stor grad (tabell IV). Ubehandlede røde blodceller fra sau ble ikke agglutinert. ; E. Hemolyse i gel.;Røde blodceller fra kyllinger ble gjort følsomme med det alkalibehandlete re-lipopolysakkaridet fra S. typhimurium SL1102 slik som beskrevet under D ovenfor. De re-LPS behandlete røde blodcellene ble blandet med smeltet agarose og komplement, helt over i plastskåler og hensatt for å størkne til en gelplate slik som beskrevet av Vaananen og Vaheri i the Journal of Medical Virology, Vol. 3, pp. 245-252 (1979) og av Vaananen i the Journal of Virol. Methods, Vol 4, pp. 117-126 (1982). Det ble derefter ;I H ;stanset ut brønner med en diameter på 2 mm i gelene. 6 microl av varme inaktiverte (56°C i 30 min.) menneskesera ble tilført ;brønnene. Platen ble inkubert over natten ved 37°C og dia-meteren til de hemolytiske sonene ble målt. Resultatene ble sammenlignet med resultatene målt ved den antichlamydiale in-direkte fluorisence antistoff prøven (IFAT), beskrevet av Weller og Coons i Proe. Soc. Exp. Biol. Med., Vol. 86, p.789 (1954) ;og i Rapid Virus Diagnosis, Application of Immunofluorescence, Gardner og McQuillan, Eds., Butterworths, London p. 60, som ;er rutinefremgangsmåten for å måle chlamydiale antistoffer i menneskesera. Resultatene som ble erholdt ved hjelp av disse fremgangsmåtene (HIG og IFAT), er i god overensstemmelse slik som det fremgår av tabell V. ; ; F. Latex-Agglutinering;Covalent fiksering av re-lipopolysakkaridet (fra S. typhimurium SL 1102) og det alkalibehandlete re-lipopolysakkaridet til latex partikler var basert på anvendelsen av vannopp-løselig carbodiimid (CDI) slik som beskrevete av Goodfriend et al. i Science, Vol. 144, pp. 1344-1346 (1964) : (a) 0.5 ml carboxylert polystyren latex partikler (0.8 microm diameter, 100 g/l, Estapor, Rhone-Poulence, Courbevoie, Frankrike) ble vasket to ganger i 5 ml isoton saltvannsoppløsning buffret med borat (20 mmol/1, BBS, pH 8.1), ;<*><16 betyr et negativt resultat

1 5

sentrifugert og pånytt suspendert i 1 ml av denne buffer;

(b) Latexsuspensjonen ble aktivert ved å bli omrørt

i 45 min ved værelsestemperatur med 25 mg 1-ethyl-3-dimethyl-aminopropyl-carbodiimide hydrochloride (Sigma Chemical Co.);

(c) Efter sentrifugering og resuspendering i 1 ml BBS, ble den aktiverte latexen aktivert over natten ved værelsetemperatur med forsiktig omrøring med forskjellige mengder (150 microg, 250 microg, 300 microg og 500 microg) re-LPS og alkalibehandlet re-LPS; (d) Efter inkubering ble 250 microl 1% serum albumin fra kveg i glycinbuffret saltvannsoppløsning (GBS-BSA, pH 8.2) tilsatt og latexen ble sentrifugert, vasket tre ganger med GBS-BSA, resuspendert i 5 ml GBS-BSA og lydbølgebehandlet noen få sekunder ; og (e) Latexreagensen ble lagret ved 4°C. Antichlamydiaserumet fra kanin (chlamydia 1 fra tabell II) ble prøvet for sin evne til å agglutinere latexpartikler. Et normalt kaninserum tjente som en kontroll. Latexprøvene ble utført ved å blande 25 microl av antiserumet eller dets fortynninger og 25 microl av latexreagensen på et objektglass. Efter vipping i 2 min. ble objektglassene undersøkt for agglutinering mot en mørk bakgrunn. Resultatene er vist i tabell VI.

Eksempel 3

Anvendelse av re-LPS preparat ved diagnose av chlamydial infeksjon

A. Urethritis som ikke er forårsaket av gonokokker (NGU)

Antistofftiterne ble bestemt i doble akutt- og rekon-valesent sera erholdt fra 17 pasienter med NGU under anvendelse av EIA fremgangsmåten (Eksempel 2A). Chlamydia isolering var positiv hos alle pasienter. Antistoffresponsen ble ansett som positiv dersom antistofftiteren viste en 2 ganger økning eller minsking mellom de doble seraene, eller dersom IgM og/eller IgA antistoffer ble funnet i serumet fra den akutte fasen, Resultatene for antistoffbestemmelsene i NGU pasientene ved anvendelse av EIA er vist i tabell VII.

Serologiske diagnoser ble utført på alle pasientene hvor chlamydia var blitt isolert, enten ved påvisning av endring i antistofftiter og/eller påvisning av akuttfase antistoffer av immunoglobulinklasse IgM og/eller IgA.

B. Betennelsessykdom i bekken (PID)

Doble serumprøver fra 8 PID pasienter og akutte sera fra 5 PID pasienter med positiv chlamydie dyrking ble prøvet under anvendelse av EIA fremgangsmåten med re-LPS fra S. typhirium SL 1102 som antigenet. I alle tilfellene var en serologisk diagnose mulig enten på basis av antistofftiter endring eller påvisning av akuttfase antistoffer av immunoglobelinklassene IgA og/eller IgM.

Re-lipopolysakkaridmutantene er deponert med stame-numrene SL 1102, SH 320, EH 237 og EH 193 i National Public Health Institute, MAnnerheimin-tie 166, SF-00280 Helsingfors, Finland. S. typhimurium "røff" mutant av chemotyper re (SL 1102) erholdt fra B.A.D. Stocker og beskrevete av Wilkonson et al. i the Journal of General Microbiol., Vol 70, pp. 527-554 (1972),

ble deponert i NPHI i mai 1969. S. minnesotamutant mR595

(SH 320), erholdt fra Luderitz et al. og beskrevete av Luderitz et al. i Annals of N.Y. Academy of Sciences, Vol. 133, pp. 349-374 (1966), ble deponert i NPHI i november 1966. Escherichia coli mutant D21f2 (EH 237) erholdt fra K. Jann og beskrevet av Mayer et al. i the European Journal of Biochem., Vol. 66, pp. 357-368 (1976) ble deponert i NPHI i november 1981. Proteus mirabilis mutant R45 (EH 193) erholdt fra K. Kotelko og beskrevete av Kotelko et al. i the Journal of Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol., Vol. 21, pp. 271-284 (1977), ble deponert i NPHI i januar 1979.

Claims (20)

1 . Preparat for diagnostisering av chlamydieinfeksjoner, karakterisert ved at det omfatter et re-lipopolysaccharid eller et anti-re-lipopolysaccharid-antistoff idet re-lipopolysaccharidet er isolert fra en re-lipopolysaccharid-mutant av en gram-negativ bakterie, idet anti-re-lipopolysaccharid-antistoffet er produsert ved immunisering av dyr med re-lipopolysaccharid, og hvor re-lipopolysaccharidet er istand til å kryssreagere med chlamydialt gruppespesifikt antigen.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet omfatter et lipopolysaccharid med en lipid A bestanddel og en KDO-oligosaccharid-bestanddel som inneholder 2 eller 3 KDO-molekyler, idet re-lipopolysaccharidet har strukturen

hvor strukturene til lipid A og R varierer mellom bakteriestammer og hvor strukturen til KDO-oligosaccharidet er ganske konstant.

3. Preparat ifølge krav 2, karakterisert ved at produktet fremstilt som (I) behandles med en svak base og er i stand til å kryssreagere med chlamydialt glycolipid.

4. Fremgangsmåte for å påvise chlamydia infeksjoner, karakterisert ved følgende trinn: (a) å bringe en gitt mengde av re-lipopolysaccharid-mutant eller et antistoff fra en anti-re-lipopolysacc-haridmutant i kontakt med en prøve som analyseres, idet re-lipopolysaccharidmutanten er isolert fra gram-negativ bakterier, anti-re-lipopolysaccharid-mutant-antistoffet er produsert ved immunisering av dyr med re-lipopolysaccharid-mutant, og (b) analysere den blandede prøven for å bestemme hvorvidt prøven inneholder chlamydialt gruppespesifikt antistoff som kryssreagerer med re-lipopolysaccharidmutanten eller chlamydialt gruppespesifikt antigen som kryssreagerer med antistoff fra anti-re-lipopolysaccharid-mutant.

5. Fremgangsmåte for å påvise chlamydie-infeksjoner, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) å bringe en gitt mengde av et re-lipopolysaccharid eller et anti-re-lipopolysaccharid-antistoff i kontakt med en prøve som skal analyseres, idet re-lipopolysaccharidet er isolert fra en re-lipopolysaccharid-mutant av gram-negative bakterier og anti-re-lipopolysaccharid-antistoffet er produsert ved immunisering av dyr med re-lipopolysaccharid, og (b) analysere den blandede prøven for å bestemme hvorvidt prøven inneholder chlamydialt gruppespesifikt antistoff som kryssreagerer med re-lipopolysaccharidet eller chlamydialt gruppespesifikt antigen som kryss-reagerer med anti-re-lipopolysaccharid-antistoff.

6. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5 karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base.

7. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5 karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppe-spesifikt antistoff ved serologiske og immunologiske fremgangsmåter.

8. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5 karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved serologiske og immunologiske fremgangsmåter.

9. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5 karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved enzymatiske immunologiske analysefremgangsmåter.

10. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved enzymatisk immunologisk analysefremgangsmåter.

11. Fremgangsmåte for påvisning av chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen avchlamydialt gruppespesifikt antistoff ved motvirkende immunologiske eléctrophoresefremgangsmåter.

12. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved motvirkende immunologiske electrophorese fremgangsmåter.

13. Fremgangsmåte for påvisning av chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved doble immunodiffusjonsfremgangsmåter.

14. Fremgangsmåte for påvisning av chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved doble immunodiffusjonsfremgangsmåter.

15. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved passive hemmaglutineringsfremgangsmåter.

16. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved passive hemmaglutineringsfremgangsmåter.

17. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved fremgangsmåter med hemolyser i gel.

18. Fremgangsmåte for påvisning av chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved fremgangsmåter med hemolyser i gel.

19. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved latex agglutineringsfremgangsmåter.

20. Fremgangsmåte for å påvise chlamydieinfeksjoner ifølge krav 5, karakterisert ved at re-lipopolysaccharidet behandles med en svak base og brukes til påvisningen av chlamydialt gruppespesifikt antistoff ved latex agglutineringsfremgangsmåter.