NO830732L - Fremgangsmaate for detektering eller bestemmelse av histamin i histaminholdige materialer, spesielt legemsvaesker og et analytisk middel for bruk i en slik fremgangsmaate - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av histamin i histaminholdige materialer, .spesielt blod eller blodfraksjoner. Oppfinnelsen angår også et analytisk middel for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten.

Et av problemene ved behandling av allergiske sykdommer er mangelen på diagnostiske teknikker som er tilstrekkelig spesifikke og følsomme og som ikke innebærer noen risiko for pasienten. Det er videre et behov for en hurtig, enkel og billig diagnostisk teknikk som vil sikre en minsking i det antall pasienter som nå venter på adekvat behandling.

I menneskeblod og- vev eksisterer spesifikke celler ( basofile leukosytter og mastceller) som er involvert i den allergiske reaksjon. På overflaten av disse celler foreligger en dis-tinkt klasse antistoffer (IgE-antistoffer). Når f.eks. en pasient er allergisk overfor katt forårsakes denne allergiske reaksjon av antistoffene på overflaten av disse celler som spesifikt gjenkjenner proteinstrukturen i håravfall fra katt. Når katteprotein inhaleres kommer det i kontakt med mast-cellene og de basofile leukosyttene i lungevevet. Antistoffene på celleoverflaten vil reagere med katteprotein og herved igangsette en reaksjon i cellen som igjen bevirker frigjøring av en rekke stoffer (allergiske mediatorer). Disse allergiske mediatorer er ansvarlige for symptomene hos pasienten.

I mange år har det vært mulig å imitere 'den allergiske reakr sjon (in vitro). Dette foretas ved å ta en blodprøve fra den allergiske pasient. Ved å eksponere blodprøven for f.eks. katteprotein, vil de allergiske mediatorene bli frigjort fra de basofile leukosyttene i blodprøven. Fra disse mediatorene har det vært mulig å bestemme et stoff, dvs. histamin. Dersom pasienten er allergisk overfor katt er det derfor mulig å bestemme frigjøringen av histamin fra cellene. Metoder basert på dette prinsipp representerer den beste prøving for oppnåelse

av en korrekt diagnose, og er forklart i detalj nedenfor.

Ved hjelp av denne teknikk er det mulig å diagnostiere de ansvarlige antigenene (f.eks. gresspollen, håravfall fra dyr, legemidler, matvarer, muggsopp og bakterier) hos pasienter med allergiske sykdommer (astma, urticaria og høyfeber).

Et generelt problem med denne test er at den er vanskelig

å foreta i laboratoriet. Her kan bare noen tester utføres daglig og etterspørselen etter laboratorieteknikker er høy. Det er derfor et sterkt behov for en forenkling av testen slik at den kan introduseres i den daglige diagnostiske rutine i klinikken.

Som nevnt foreligger det en rekke analysemetoder for detektering av histamin i væsker. Den opprinnelige histaminbestemmelse ble således beskrevet av Shore et al. og var basert på en fluorometrisk analyse (ref. 1).

Prinsippet for denne analyse er en kopling av histamin til en fluorofor (o-ftalaldehyd), hvorved det dannes en ringstruktur. Omfanget av denne ringstruktur som kan bestemmes spektrofotometrisk, avhenger av mengden av histamin. Metoden har senere blitt modifisert for å øke spesifisitet og følsom-het. Stahl Skov&Norn (ref. 2) har således forenklet analysen ved allergen-provokasjon av Ficoll-Hypaque-isolerte cellesuspensjoner inneholdende h~ 2% basofile leukosytter istedenfor helt blod. Ved fraksjonering^ av blodet fjernes forstyrrende stoffer slik at histamininnholdet i de basofile leukosyttene kan bestemmes direkte, hvorved man unngår en langs ekstraksjonsprosedyre. Fraksjoneringsprosedyrene (gradient-sentrifugering) som er nødvendig for å fjerne forstyrrende stoffer er imidlertid tidskrevende og vanskelig å foreta, og Siraganian utviklet derfor en autoanalyttisk fluorometrisk metode (ref. 3). Denne metode anvendes i klinikken, men har bare funnet begrenset anvendelse på grunn av at den krever teknisk erfaring, konstant overvåking og kost-bart apparatur.

Taylor et al. (ref. 4) har utviklet en annen prøvemetode for bestemmelse av histamin i biologisk materiale. Denne meget følsomme og spesifikke metode er en enzymatisk isotopteknikk 'basert på metylering av histamin ved hjelp av N-metyltrans-ferase. Det har således blitt mulig å bestemme små mengder av histamin i vev, blod og urin. Behovet for en rutine-

metode for anvendelse i klinikken tilfredsstilles imidlertid ikke ved denne metode, fordi antallet av analyseprøver pr.

dag er lavt (omtrent 30) og analysetiden er lang.

Stahl Skov et al. (ref. 5) har utviklet en annen metode basert på in vitro inkorporering av radioaktivt merket histamin i pasientens basofile celler, hvor frigjøringen av merket histamin bestemmes etter provokasjon med de mistenkte aller-genene .

Som illustrert nedenfor ble imidlertid en dårlig korrelasjon med frigjøringen av histamin bestemt fluorometrisk oppnådd ved denne metode.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for dtektering eller bestemmelse av histamin,

som ikke er beheftet med ulempene til de kjente metodene slik som apparatbehov, tidkrevende, og forbehandling av blodprøvene.

Spesielt er det et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe

en enkel og mer spesifikk metode for detektering og bestemmelse av histamin i histaminholdige materialer, som er hurtig og lett å utføre, som bare krever en liten mengde materiale, og som ikke stiller store krav til personellets opplæring.

Dette er oppnådd ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som omfatter: anbringelse av en prøve av materialet i kontakt med glassmikrofibre i slike kvantitative mengdeforhold mellom glassmikrofibrene og materialet som vil tillate histaminmengden å

bli detektert eller bestemt eller å bli bundet til mikrofibrene; og registrering eller måling av den bundede mengden av histamin. Som nevnt angår oppfinnelsen også et middel for bruk ved utfør-else av fremgangsmåten, og dette middel erkarakterisert vedat det omfatter glassmikrofibre anbragt på en bærer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utnytter det funn at histamin er fast og temmelig selektivt bundet til glassmikrofibre selv etter gjentatte vaskinger. Glassmikrofibre er utbredt benyttet som filtre og beskrives i detalj, f.eks. i brosjyren "Glass Microfibre Filters", Publication no. 630, Whatman, Sprinfield Mill, Maidstone, Kent, England. I denne brosjyren fremheves det at de utviser meget lav adsorbsjonskapasitet,

men har i noen tilfeller blitt benyttet som et middel for å adsorbere høymolekylære stoffer, spesielt proteiner, slik som albumin og poly U i RNA-analyser. Ingen henvisning til histaminabsorbsjon er gitt.

Adsorbsjonen av histamin til glassoverflater har blitt under-søkt av Bosse&Wassermann (ref. 6). Med erkjennelse av visse unøyaktigheter i den velkjente tungvinte detektering av histamin ved måling av kontraksjonsreaksjonen i ileum hos marsvin undersøkte de om unøyaktighetene kunne skyldes en partiell binding av histamin til glassoverflater i testutstyret.

For dette formål tilsatte de et grovkornet pulver av forskjellige glasstyper til histaminoppløsninger av forskjellige kjente konsentrasjoner. Etter rysting ble det frie resterende histamininnhold i oppløsningen målt ved hjelp av marsvin ileum-testen og sammenlignet med testoppløsninger uten glasspulver. Det ble ikke foretatt noen undersøkelse av en mulig frigjøring av det bundne histamin fra glassover-flaten.

Bosse&Wassermann fant at ved lave histamin-konsentrasjoner (10 m) ble ca. 75% av det tilstedeværende histamin bundet til gl^sspulveret. Basert på dette resultat konkluderte de med at ved kvantitative studier med histamin (kurver for konsentrasjon-respons) anses det at ved lavere konsentrasjoner (<10 ^ m) tapes en stor andel histamin ved adsorbsjon på glass-overf late .

En slik negativ angivelse ville ganske visst ikke friste en fagmann innen teknikken histamin-deteksjon til å utnytte de erkjent uønskede bindingsegenskapene i en kvantitativ og reproduserbar metode for deteksjon eller bestemmelse av histamin. Den etablerte fordom ville tvert i mot lære fag-mannen å unngå kontakt med en hver glassoverflate overhode, spesielt ved lave histaminkonsentrasjoner slik som de som resulterer fra allergiske reaksjoner.

På en måte bekreftes denne påstand av Murray % McGill (ref. 7), 1982. Etter å ha verifisert de ovenfor nevnte funn til Bosse&al., konkluderer Murray&McGill med at meget følsomme analyttiske teknikker slik som OPT-metoden for histamin ville medføre en potensielt større risiko for feil dersom adsorb-sjonseffekten skulle virke. Murray*&McGill anbefaler derfor bruken av polyetylenbeholdere og surgjøring, dersom glass benyttes, fordi dette hindrer adsorbsjon. ;Bruken av glassmikrofibre er fordelaktig fordi lavmolekylære forbindelser slik som serotonin og histidin samt histamin-metabolittene 1,4- og 1,5-metylimidazoleddiksyre ikke bindes til fibrene, hvilket demonstreres nedenfor. ;Glassmikrofibre er kommersielt tilgjengelige og er ikke-toksiske og ikke farlige å benytte. Et glassmikrofiber-filter markedsført under varebetegnelsen "Whatman GF/B" ;er blitt funnet meget egnet for utførelse av foreliggende;(r) ;fremgangsmåte. Også typen "Whatman ^GF/C" kan benyttes,;men har mer varierende bindingsegenskaper.;Det fremgår fra den ovenfor nevnte brosjyre at nevnte fibre er borsilikatfibre med følgende typiske oksydinnhold: ; Oppfinnelsen er naturligvis ikke begrenset til bruken av glass-mikrof ibre av de ovenfor nevnte typer, og en fagmann vil kunne finne fibre med optimale bindingsegenskaper blant de kommersielt tilgjengelige glassfibertyper ved enkle bindingstester, som beskrevet nedenfor i eksempel 1. ;Det antas imidlertid i øyeblikket at de mest egnede glassmikrofibrene er de av typen "Whatman GF/B"<q>g fibre med lignende egenskaper, spesielt bindingsegenskaper. For oppnåelse av den ønskede følsomhet blir glassmikrofibrene fordelaktig oppdelt i fine partikler så små som 2-20ym før de benyttes i foreliggende fremgangsmåte. Også her kan den mest hen-siktsmessige fiberdimensjon og disintegrasjonsgrad bestemmes ved hjelp av forsøk og avhenger også av bæreren på hvilke fibrene skal avsettes for tilveiebringelse av den mest for-målstjenlige analysemetode, i overensstemmelse med det materiale i hvilket et mulig histamininnhold skal bestemmes eller detekteres. ;Det kvantitative mengdeforhold mellom glassmikrofibrene og;det histaminholdige materiale kan likeledes bestemmes ved hjelp av forsøk avhengig av den forventede mengde histamin som vil bli bundet til fibrene. Mengden av histamin som fri- ;gjøres ved forskjellige grader av allergi er velkjent fra litteraturen slik at standardkurver for forutbestemte histamin-mengder; kan plottes og tjene som en basis for bestemmelse av mengden av histamin i en ukjent prøve, f.eks. ved en konkurrerende bestemmelse, som forklart i detalj nedenfor. ;En egnet bærertype er rør fortrinnsvis av plast i form av;et lite reagensrør, men også mikrotiter-plater, folier eller strimler kan benyttes. For allergidiagnostikk kan glassfibr-ene med fordel være avsatt på egnede bærere, slik som mikrotiter-plater som har et passende antall brønner, eventuelt sammen med test-allergener og gis form av egnede testanordning, er, f.eks. i form av diagnostiske utstyrsenheter. ;Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttig for detektering eller bestemmelse av histamin frigjort som en følge av en allergisk reaksjon, hvori en blodprøve skal anvendes som testmateriale. I tillegg til de generelle fordelene som er forklart i det foregående, gir dette aspekt ved fremgangsmåten den betydelige fordel i forhold til de kjente metodene at for å fjerne forstyrrende stoffer, f.eks. spermidin fra blodprøven, er det tilstrekkelig å fjerne blodplasmaet, f.eks. ved sentrifugering og vasking med en fysiologisk buffer. ;Om ønsket kan også de røde blodcellene (erytrosytter) fjernes, hvilket kan foretas på enkel måte f.eks. ved sedimentering ved tilsetning av dekstran før sentrifugeringen for fjerning av plasmaet. ;Fremgangsmåten kan også benyttes for detektering eller bestemmelse av histamin i andre legemsvæsker fra mennesker og dyr, slik som lymfe, cerebrospinalvæsker eller urin, eller i vevsprøver eller vevsekstrakter. I denne sammenheng skal det bemerkes at histamin frigjøres ved sykdommer andre enn allergier, f.eks. mastocytosis. ;Endelig kan fremgangsmåten benyttes for detektering eller bestemmelse av histamin i matvarer, f.eks. fisk, slik som makrell og lignende. ;Som en generell forholdsregel bør forstyrrende stoffer som måtte være til stede avhengig av det materiale som skal analyseres for histamininnhold, fjernes før kontakt av prøven med glassmikrofibrene. ;Registreringen eller målingen av histaminet som er bundet til mikrofibrene kan foretas på grunnlag av to forskjellige prin-sipper, nemlig: 1. Konkurrerende bestemmelse inkludert bruk av merket histamin. ;2. Direkte bestemmelse.;1. Konkurrerende bestemmelse;Dette registreringsprinsipp er basert på en konkurranse;om bindingsstedene på glassmikrofibrene mellom histaminen som eventuelt er til stede i prøven og en forutbestemt mengde av tilsatt merket histamin. ;Ved plotting av en standard kurve for varierende kjente konsentrasjoner av umerket histamin sammen med en gitt mengde merket histamin, er det lett å bestemme mengden av histamin i en spesifikk prøve ved tilsetning av mengden av merket histamin benyttet for standard kurven. Dette er forklart mer fullstendig nedenfor i eksempel 1 under henvisning til fig. 3. ;I de følgende eksempler 1 og 2 anvendes en radioaktiv isotop ( H-tritium) for merkingen av histamin, men også andre radio-125 ;aktive isotoper kan benyttes, slik som I. Den bundede mengde radioaktivt merket histamin kan lett bestemmes på i og for seg kjent måte, f.eks. med en scintillasjon-deteksjon teller. ;På grunn av vanskeligheten med å håndtere radioaktive materialer har mange nye testsystemer blitt utviklet innen allergi-diagnoatikken hvilke omfatter bruk av materialer andre enn radioaktive isotoper som midler for merkning. Eksempler på dette er frie radikaler, fluoreserende molekyler (f.eks. fluor-escin isotiocyanat og rodamin-fargestoffer), luminiserende molekyler, bakteriofager, enzymer, koenzymer og enzym-inhibitorer. ;Det gjelder generelt at middelet for merking ikke er kritisk forutsatt at bindingsegenskapene for histaminet til fibrene ikke påvirkes på en ikke-reproduserbar måte,, og kan overføres til histaminet ifølge i og for seg kjente metoder. Det sen-trale ved foreliggende fremgangsmåte er utnyttelsen av den overraskende selektive binding av histamin til glassmikrofibrene. Når man i lys av dette har erkjent at en konkurrerende analysemetode er mulig og hensiktsmessig, skulle det være en rutinesak for en fagmann å utprøve de konvensjonelle merke-metodene for å finne de mest egnede metoder for den angjeldende analysen. Som et eksempel som virker godt kan nevnes bruken av isotop-merket histamin i form av 2,5-"^H-his tamindihydro-klorid, fordi denne metoden er hurtig og hensiktsmessig og gir god nøyaktighet og reproduserbarhet. ;2. Direkte bestemmelse;De selektive adsorbsjonsegenskapene til glassmikrofibrene;gjør dem naturligvis også egnet for direkte binding av histamin som er til stede og for etterfølgende bestemmelse av det bundede histamin på konvensjonell måte, f.eks. ved kopling med en fluorofor forbindelse og etterfølgende fluorometrisk måling. Denne metode er illustrert i eksempelene 3 og 4 nedenfor. ;Fremstillingen av plastrør inneholdende glassmikrofibre for bruk i foreliggende fremgangsmåte er lett og billig (5000 til 10.000 rør pr. dag). Fremgangsmåten har vist seg å være tids- besparende ettersom en laboratorietekniker kan fremstille ca. 400 prøver pr. dag, sammenlignet med det tidligere maksimum på 150. t Fremgangsmåten er også blodbesparende etter som den bare krever 10 ml blod for bestemmelse av 8-10 allergier pr. pasient, mens derimot de kjente metoder krever 50 ml blod. ;Siden fremgangsmåten både er reproduserbar og spesifikk og utviser god korrelasjon med fluorometrisk histaminbestemmelse, er den særlig egnet for tilveiebringelse av nøyaktig informa-sjon om mistenkte allergener slik som husstøv, håravfall fra dyr, pollen, muggsopp, legemidler, matvarer, bakterier og autoantigener. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er illustrert i detalj i de følgende eksempler under henvisning til tegningen, hvor: Fig. 1 viser en korrelasjon mellom histaminbestemmelser foretatt ifølge Stahl Skov et al. (ref. 5) og ved fluorometrisk analyse, ;fig. 2 viser den prosentvise binding av tritiert histamin, ;histidin og serotonin, respektivt, i ekvimolare konsentrasjoner til glassmikrofibre, ;fig. 3 viser bindingen av varierende konsentrasjoner av tritiert histamin til forskjellige glassmikrofiber-typer etter tilsetning av kjente mengder av umerket histamin og demonstrerer mangelen på fortrengning av tritiert histamin forårsaket av de to histamin-metabolittene 1,4- og 1,5-metylimidazoleddiksyre (MEIAA) og er forklart i forbindelse med eksempel \L, ;fig. 4 viser en korrelasjon mellom histaminbestemmelser foretatt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og fluorometrisk analyse, og er forklart i forbindelse med eksempel 2, og ;fig. 5 viser en tilpasset direkte fluorometrisk histaminbestemmelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med varierende vaskemetoder sammenlignet med konvensjonell bestemmelse i fravær av fibre (ref. 2), og er forklart i forbindelse med eksempel 3. ;Målingene i fig. 1 bekrefter klart mangelen på korrelasjon mellom metoden i ref. 5 og den konvensjonelle fluorometriske bestemmelse. Aksene viser minskende konsentrasjoner (fortynninger) av gresspollen-antigen. ;Det fremgår klart fra fig. 2 at histamin er bundet overraskende bedre enn de lavmolekylære forbindelsene histidin og serotonin (5-hydroksytryptamin). Dette er også av stor betydning for påliteligheten av histaminbestemmelsen, fordi i en rekke av de kjente metodene kan begge forbindelser forstyrre histamin. ;Det fremgår fra fig. 3, som er omtalt i større detalj nedenfor, at de to histamin-metabolittene 1,4-MEIAA og 1,5-MEIAA heller ikke er bundet til glassmikrofibre i det samme konsentrasjons-området som histamin, siden de ikke kan fortrenge bundet merket histamin fra fibrene i en konkurrerende bindingsprøve. ;Eksempel 1;Fremstilling av glassfiberfremstilte rør;"Whatman GF/B"-glassfiberfiltre oppdeles i lengder på ca. h nun. 3,4 g blandes med 500 ml redestillert vann og homogeniseres 2 minutter i en "Ultra Turrax"-blander. De knuste fibrene hensettes i 2 timer ved romtemperatur for sedimentering. De tunge fibrene (de lengste) utfelles og en ovenstående væske som klart skilles fra de tunge fibrene og inneholder suspenderte fibre av dimensjoner fra ca. 20 pm til 2 ym fjernes (et totale på ca. 100 ml) og 100 yl av denne ovenstående væske overføres til plastrør. Rørene tørkes i en ovn ved 150°C (i en uke) ;og tas deretter ut av ovnen og er klare for bruk når tempe-raturen er ca. 20°C. Med denne tørkemetode fikseres glass-fibrene til bunnen av rørene. De glassfiberpreparerte rør har ubegrenset holdbarhet. ;Plotting av standard kurve for histaminbestemmelse;Kjente fortynninger av umerket histamin fremstilles i Tris-AMC-buf*£er (tris-(hydroksymetyl)-aminometan 25 mM, pH 7,6, NaCl 0,12 M' KC1 5 mM, CaCl20,6 mM, MgCl21,1 mM, menneske-serum-albumin 0,3 mg/ml og glukose 1 mg/ml). Histamininnholdet var 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 400 ng og 800 ng/ml, respektivt, og den benyttede 0-prøve var histaminfri buffer. Disse konsentrasjoner anvendes for plotting av en standard kurve. 100 yl av disse fortynninger overføres til hvert glassfiber-reagensrør til hvilke er tilsatt 10 yl radioaktivt merket histamin (2,5- 3H-histamm-dihydroklorid: 500 rici/ml tilsvarende 5 nCi/prøve, spesifikk aktivitet ca. 5 3 Ci/mmol). Prøvene inkuberes i 40 minutter ved 37°C. For oppnåelse av ensartede resultater er det vesentlige å observere de samme tidsperioder for hver prøve. Prøvene vaskes i 15

sek. med redestillert vann i en celle-høster (Tech-Nunc, Roskilde, Danmark). Det resterende vann kasseres og 1,2 ml

Filter Count (Packard) tilsettes. Prøvene telles i 1 minutt

i en væske-scintillasjonsteller, idet emissjonen av B-stråling registreres i tellinger pr. minutter (cpm). Prøven uten merket histamin (0-binding) inneholder bundet merket histamin i en mengde på typisk 2000 cpm, hvilket utgjør ca. 60% av den totale mengde av merket histamin tilsatt til prøven. Prøven inneholdende 25 ng/ml umerket histamin bindes til fibrene i en mengde tilsvarende ca. 15% av 0-bindingen og gir således en telling på ca. 1700 cpm. Ved økende mengder histamin resulterer i ytterligere minsking i cpm-lineært opptil 100 yg histamin/ml.

t

■\

Standard kurven som er vist i fig. 3 med symbolet GF/B for to parallelle tester viser en semilogaritmisk lineær korrelasjon mellom % binding, uttrykt som cpm (y-aksen) og histamininnhold (x-aksen: logaritmisk). Analysens sensitivitet er ca. 25 ng histamin/ml. Figuren viser to tilsvarende tester med fibre av typen "Whatman GF/C" fremstilt på samme måte, og disse fibre utviser en noe dårligere korrelasjon.

Eksempel 2

Bestemmelse av spesifikk allergi overfor gresspollen hos 12 astmatiske pasienter ved in vitro-provokasjon av de basofile leukosyttene til pasienten med gresspollen.

10 ml blod trekkes fra hver pasient ved hjelp av venipunktur. Blodet blandes med 0,5 ml 0,2 M EDTA (pH 7,2). Prøven deles

i to deler, en som analyseres og beskrevet i ref. 2 for å dem-onstrere korrelasjonen mellom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og fluorometrisk bestemmelse. 5 ml blod blandes med 1 ml dekstran (molekylvekt 500.000 g/mol 45 mg oppløst i 1 ml 0,9% NaCl) for å fjerne erytrosyttene (de røde blodcellene). Prøven vendes forsiktig og hensettes i 30 minutter ved romtemperatur. Sedimenteringen av erytrosyttene er hurtigere enn for leukosyttene (de hvite blodcellene). Plasmalaget inneholdende leukosyttene overføres til et annet rør og suspenderes i 20 ml tris-AMC-buffer (kfr. eksempel 1). Leukosyttsuspensjonen sentrifugeres i 10 minutter ved 100 G

og 16°C. Det ovenstående plasma fjernes og kasseres og cellene suspenderes i 20 ml tris-AMC-buffer og sentrifugeres i 10 minutter ved 60 G og 16°C. Den ovenstående væske fjernes på nytt og cellene resuspenderes i 5 ml tris-AMC-buffer. Celle-suspensjonen inneholder 2-4% basofil-leukosytter.

100 yl av denne cellesuspensjon overføres til glassmikrofiber-rør fremstilt som i eksempel 1. 10 yl gresspollen tilsettes i en 10-gangers fortynningsserie (10 —<3>,10 —<4>,10 —<5>v/v) av et gresspollen-standardpreparat og 10 yl', isotop-merket (tritiert) histamin tilsettes til rørene, tilsvarende 5 nCi pr. prøve. Prøvene inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Prøvene vaskes i

15 sekunder med redestillert vann i en celle-høster (Tech-

Nunc, Roskilde, Danmark). Det resterende vann kasseres og

1,2 ml Filter Count (Packard) tilsettes. Prøvene telles i en væske-scintillasjonsteller. I tilfelle av allergi overfor gresspollen vil de basofile cellene i prøven frigjøre hista-

min iøkende mengder ved økende gresspollen-konsentrasjoner.

De frigjorte histamin bindes til glassmikrofiber-rørene i konkurranse med det isotop-merkede histamin, og bindingen av det isotop-merkede histamin vil derfor avta. Et fall i bindingen av det isotop-merkede histamin på 10% i forhold til en celleprøve uten gresspollen anses som positiv allergi overfor gress.

Histamininnholdet i den ukjente prøven kan også beregnes

ved hjelp av standard kurven omtalt i eksempel 1.

Som det fremgår fra fig. 4 ble det funndet en meget korrelasjon mellom histaminfrigjøringen målt ved glassmikrofiber-metoden og fluorometrisk bestemmelse av histamin, fordi under-søkelsen av 12 pasienter viste identiske verdier for histamin-frigjøringen målt ved de to metodene. Det bemerkes at pasientens følsomhet overfor allergenet deles i to klasser hvor 0 betyr ingen reaksjon, mens 3 representerer den største reaksjonen. Korrelasjonen gjelder således både ikke-allergiske pasienter og alle tre allergiklassene.

Eksempel 3

I en modifikasjon av metoden ifølge foregående eksempel 2 bestemmes histamin direkte etter binding til glassmikrofiber-filteret.

Glassmikrofiber-skiver: Skiver med en diameter på 6 mm stanses ut av GF/B-filtere.

A: 10 yl umerket histamin oppløst i tris-AMC-buffer, kfr. eksempel 1 (800 ng - 400 ng - 200 ng - 100 ng - 50 ng og 0 histamin/ml tris-AMC), inkuberes i 40 minutter ved 37°C,

fulgt av vasking med K^ O i 15 sekunder i en celle-høster. Resterende H20 fjernes fra skivene. Histamin bundet til skivene bestemmes fluorometrisk. Kopling foretas med 400 yl NaOH/OPT (10 mg o-ftaldialdehyd (Fluka) oppløses i 5 ml meta-nol og blandes med 18 ml 0,05 M) i 4 minutter ved romtemperatur.

For å stabilisere fluoroforen tilsettes 400 yl 0,175 M H-^PO^. Prøvene sentrifugeres ved 2 800 g i 10 minutter. Avlesning av ekstingsjonen foretas ved hjelp av et Aminco-fluorometer (se kurve III i fig. 5) .

B: Følgende kontroll inkluderes: 10 yl histamin i den samme konsentrasjon som benyttet i A inkuberes med skiver i 40 minutter ved 37°C. Prøvene vaskes ikke i en celle-høster, men koples umiddelbart som angitt i A (se kurve II i fig. 5).

C: Følgende ytterligere kontroll inkluderes: 10 yl histamin

i de samme konsentrasjoner som benyttet i A inkuberes i 40 minutter ved 37°C i fravær av skiver. Prøvene vaskes ikke i en celle-høster, men koples umiddelbart som angitt i A

)se kurve I i fig. 3).

De tre kurvene viser således:

I: total mengde histamin tilsatt til reagensrørene.

II: total mengde histamin tilsatt til filerskivene i

reagensrørene.

III: histaminbinding til filerskivene etter vasking.

Selvom denne fremgangsmåte ikke er optimalisert i de ovenfor angitte eksempler, viser kurve III klart den fine lineære korrelasjon mellom de forskjellige histaminkonsentrasjonene og bindingen til fibrene.

Eksempel 4

I en foretrukken utførelse anvendes en mikrotiter-plate som et middel for utførelse av en direkte histaminbestemmelse ifølge oppfinnelsen.

5 ml blod frigjøres for plasma og erytrosytter ifølge eksempel 2. En glassmikrotiter-plate med 9 6 brønner som har blitt pre- parert med 100 yl glassmikrofiber-suspensjoner og tørket ifølge eksempell, ble benyttet for deteksjon av histamininnholdet som et resultat av allergiske reaksjoner. 10 yl prøver av test-allergenene i tre konsentrasjoner tilsettes til brønnene. 100 yl porsjoner av blodprøver tilsettes til brønnene og platen hensettes ved romtemperatur i 20 minutter. Under denne inkuba-sjon vil frigjort histamin bindes til glassmikrofibrene. Mikro-tit-platen vaskes med vann i 30 sekunder hvoretter platen er klar for fluorometrisk analyse.

100 y NaOH/o-ftalaldehyd tilsettes til hver brønn i mikrotiter-platen og platen hensettes ved romtemperatur i 10 minutter, hvoretter reaksjonen stoppes ved tilsetning av 10 0 yl H3P04til hver brønn.

De enkelte prøver blir deretter avlest i et fluorometer.

Referanser

1. W..Lorenz et al.: A sensitive and specific method for the determination of histamine in human whole blood and plasma. Hoppe-Seyler1s Z. Physiol. Chem 353: 911-920, 1972. 2. P. Stahl Skov&S.Norn: A simplified method for measuring basophil histamine rlease and blocking antibodies in hay fever patients. Basophil histamine content and cell preservation. Acta Allergol. 32: 170-182, 1977. 3. R.P. Siraganian: Automated histamine release. A method for in vitro allergy diagnosis. Int. Archs Allergy appl. Immun. 49: 108-110, 1975. 4. K.M. Taylor et al.: An enzymatic-isotopic microassay for measuring allergic release of histamine from blodd and mast cells in vitro. Int. Archs Allergy appl. Immun. 61: 19-27, 1980. 5. P. Stahl Skov et al.<3>H-histamine release from human leucocytes. Allergy 34: 261-263, 1979. 6. H.A. Bosse&0. Wassermann: Uber eine Adsorption von Histamin an Glas. Med.Pharmacol. exp. 16: 459-461

(1967), (Chem.Abstr. , Vol. 67 (1967)'' No. 62 . 688). 7. J. Murray&A.S. McGill:Effect of adsorption of histamine to glass surfaces on its estimation.

J. Assoc. Off.Anal.Chem., Vol. 65, No. 1 (1982).

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av histamin i materialer som muligens inneholder histamin, spesielt kroppsvæsker, vevsprøver eller matvarer, hvorved en prøve av materialet bringes i kontakt med bindemiddel for histamin og den bundne mengde registreres eller måles, karakterisert ved anvendelse av glassmikrofibre som bindemiddel og ved anvendelse av slike kvantitative mengdeforhold mellom glassmikrofibrene og materialet som vil tillate histaminmengden som skal detekteres eller bestemmes og bindes til mikrofibrene; og registrering eller måling av den bundne mengde histamin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 tilpasset som en konkurrerende histamin-detektering eller- bestemmelse, karakterisert ved tilsetning til en materialprøve som muligens inneholder histamin av en forutbestemt mengde av merket histamin, registrering av mengden av merket histamin bundet til glass-mikrof ibrene , og sammenligning av den registrerte mengde med en standard kurve basert på konkurranse med kjente mengder av umerket histamin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2 for detektering av histamin frigjort ved allergisk reaksjon, karakterisert ved tilsetning av et testallergen til en blodfraksjon hvorfra blodplasmaet og eventuelt erytrosyttene har blitt fjernet, og registrering eller måling av det mulig frigjorte histamin bundet til fibrene direkte eller konkurrerende med merket histamin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at glassmikrofibrene som benyttes er i form av fine partikler med dimensjoner varierende fra 2-20 ym.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at glassmikrofibrene som anvendes er av typen "Whatman ^GF/B" eller av en type med lignende egenskaper.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at det merkede histamin som benyttes er et radioaktivt merket, fluoresens-merket eller enzym-merket histamin eller histaminderivat.

7. Analyttisk middel for bruk i fremgangsmåten i krav 1, karakterisert ved at det omfatter glass-mikrof ibre avsatt på en bærer, fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av reagensrør, mikrotiter-plater, folier og strimler.

8. Analyttisk middel ifølge krav 7, karakterisert ved at de enkelte glassmikrofibrene er i form av partikler med dimensjoner varierende fra 20-20 ym.

9. Analyttisk middel ifølge krav 7, karakterisert ved atglassmikrofibrene som benyttes er av typen "Whatman (r) ^GF/B" eller av en type som har lignende egenskaper.

10. Analyttisk middel ifølge krav 7 tilpasset for bruk ved detektering eller bestemmelse av histamin frigjort ved allergisk reaksjon, karakterisert '1 ved at det ytterligere omfatter minst et test-allergen.

11. Diagnostisk testanordning for bruk i detekteringen eller bestemmelsen av histamin i kroppsvæsker omfattende et analyttisk middel ifølge krav 7, 8, 9 eller 10.

12. Diagnostisk testanordning ifølge krav 11, som ytterligere omfatter minst et test-allergen.