NO760873L - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling'av et nytt naftacenderivat med formelen; The present invention relates to methods for the production of a new naphthacene derivative with the formula;

samt salter derav. as well as salts thereof.

Forbindelsen med formel I som betegnes- med .nr. The compound with formula I which is denoted by .no.

32 999 RP, er av meget stor interesse•på grunn av sin virkning mot tumorer. 32,999 RP, is of very great interest•because of its action against tumors.

Forbindelsen 32 999 RP er en mørkerød basisk forbindelse som salter med syrer. Compound 32,999 RP is a dark red basic compound which salts with acids.

Hydrokloridet av 32 999 RP er oppløselig i metanol, pyridin, dimetylformamid og vann i en mengde på ca. 100'mg/cm-<5>, oppløselig i n-butanol, mettet med vann ved 20°C, i en mengde på ca. 10 mg/cm^, uoppløselig i metanol i en mengde på 5 rhg/cm^ og praktisk talt uoppløselig (oppløselighet mindre enn 0,1 mg/crr.^) i aceton, kloroform, metylenklorid, etylacetat, benzen, metyl-isobutylketon, dioksan og heksar.. The hydrochloride of 32,999 RP is soluble in methanol, pyridine, dimethylformamide and water in an amount of approx. 100'mg/cm-<5>, soluble in n-butanol, saturated with water at 20°C, in an amount of approx. 10 mg/cm^, insoluble in methanol in an amount of 5 rhg/cm^ and practically insoluble (solubility less than 0.1 mg/crr.^) in acetone, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, benzene, methyl isobutyl ketone, dioxane and hexar..

Hydrokloridet av 32 999 RP inneholder karbon, hydrogen, oksygen, nitrogen og klor og har følgende elementanalyse : C% = 56,6 E% = 5,7 0% = 29,41 Mf, = 2,39 Cl% = 6,0 The hydrochloride of 32,999 RP contains carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen and chlorine and has the following elemental analysis: C% = 56.6 E% = 5.7 0% = 29.41 Mf, = 2.39 Cl% = 6.0

Hydrokloridet har dessuten følgende fysikalsk-kjemiske egenskaper: The hydrochloride also has the following physico-chemical properties:

Utseende: oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver. Appearance: orange-red, microcrystalline powder.

Smeltepunkt: ca. 200°C (spalting). Melting point: approx. 200°C (splitting).

Spesifikk vridingsevne (bestemt i en 0, 09%- ±g etanoloppløshing Specific twistability (determined in a 0.09% ± g ethanol solution

inneholdende 0, 1%- 1 N HC1): containing 0.1%- 1 N HC1):

UV-spektrum (bestemt i en konsentrasjon av 10365 mg/l i etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1): Dette spektrum gjengis i fig. 1 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell. Synlig spektrum (bestemt i en konsentrasjon av 10,65 mg/l i etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1): Dette spektrum gjengis i fig. 2 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell. UV spectrum (determined at a concentration of 10365 mg/l in ethanol containing 0.1% 1 N HC1): This spectrum is reproduced in fig. 1 in the accompanying drawings and absorption maxima are indicated in the following table below. Visible spectrum (determined at a concentration of 10.65 mg/l i ethanol containing 0.1% 1 N HC1): This spectrum is reproduced in fig. 2 in the accompanying drawings and absorption maxima are indicated in the table below.

IR-spektrum (bestemt i blanding m.ed KEr) : dette spektrum gj engis i fig. 3 i de ledsagende tegninger, der det på abscissen angis bølgelengden i ym (den øvre skala) og IR spectrum (determined in a mixture with KEr): this spectrum is shown in fig. 3 in the accompanying drawings, where the abscissa indicates the wavelength in ym (the upper scale) and

bølgetallet i cm ^ (den nedre skala) og på ordinaten den optiske tetthet. the wave number in cm ^ (the lower scale) and on the ordinate the optical density.

I'nedenfor følgende tabell angis de viktigste ab-sorbs j onssignaler (sifferverdiene angår bølgetallet i cm 1). The following table shows the most important absorption signals (the numerical values refer to the wave number in cm 1).

Ved'tynnsjiktskromatografi på silikagel oppviser hydrokloridet av 32 999 RP en Rf-verdi på ca. 0,2 når man ved 24°C som fremkallende oppløsningsmiddel anvender'en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i et volumforhold på 80:17:'3-Ved sur hydrolyse av 32 999 RP eller av et av dettes salter oppnås en forbindelse med formelen: By thin-layer chromatography on silica gel, the hydrochloride of 32,999 RP shows an Rf value of approx. 0.2 when, at 24°C, a mixture of methylene chloride, formic acid and methanol is used as the developing solvent in a volume ratio of 80:17:3-By acid hydrolysis of 32,999 RP or one of its salts, a compound is obtained with the formula:

som er aglykorte av 32 999 RP.. which is short of 32,999 RP..

.Aglykonet av 32 999 RP er oppløselig i pyridin i .The aglycone of 32,999 RP is soluble in pyridine i

en mengde på 20 mg/cm^, oppløselig i metanol, dioksan, kloroform og metylenklorid i en mengde på 5 mg/cm^ og oppløselig i aceton, etylacetat, heksan og vann i en mengde på under. 0,1 mg/cm'<5>. an amount of 20 mg/cm^, soluble in methanol, dioxane, chloroform and methylene chloride in an amount of 5 mg/cm^ and soluble in acetone, ethyl acetate, hexane and water in an amount of less. 0.1 mg/cm'<5>.

'Denne forbindelse oppviser dessuten følgende fysi-■kalsk-kj emiske egenskaper. This compound also exhibits the following physicochemical properties.

Utseende: oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver. Appearance: orange-red, microcrystalline powder.

Smeltepunkt: ca. l85°C (spalting)-. Melting point: approx. l85°C (cleavage)-.

Elementanalyse:' C% - 6l,37 M 5,31' 0% = 30,16. Elemental analysis:' C% - 61.37 M 5.31' 0% = 30.16.

Spesifikk vridningsevne (bestemt i en 0,1%-ig dioksanoppløsning): Specific twistability (determined in a 0.1% dioxane solution):

UV-spektrum (bestemt i konsentrasjonene 50 henholdsvis 5 mg/l i UV spectrum (determined in the concentrations 50 and 5 mg/l respectively in

•etanol inneholdende 0, 1% 1 N HC1): • ethanol containing 0.1% 1 N HC1):

Dette spektrum' gjengis i fig. 4 i de ledsagende tegninger der kurvene I og II tilsvarer.konsentrasjonene 50 henholdsvis 5 mg/r. Absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell. This spectrum is reproduced in fig. 4 in the accompanying drawings where curves I and II correspond to the concentrations 50 and 5 mg/r respectively. Absorption maxima are indicated in the table below.

Synlig spektrum (bestemt i en konsentrasjon på 10 mg/l i etanol inneholdende 0,1% 1 M HC1): dette spektrum gjengis i fig. 5 i de ledsagende tegninger og absorbsjonsmaksima angis i nedenfor følgende tabell. Visible spectrum (determined at a concentration of 10 mg/l in ethanol containing 0.1% 1 M HCl): this spectrum is reproduced in fig. 5 in the accompanying drawings and absorption maxima are indicated in the table below.

IR-spektrum (bestemt i blanding med KBr): dette spektrum gjengis i'fig. 6 i de ledsagende tegninger der'det på abscissen er angitt bølgelengden i ym (den øvre skala) og bølgetallet i cm 1 (den nedre skala) og på ordi-' naten den optiske tetthet. IR spectrum (determined in mixture with KBr): this spectrum is reproduced in fig. 6 in the accompanying drawings where the wavelength in ym (the upper scale) and the wave number in cm 1 (the lower scale) are indicated on the abscissa and the optical density on the ordinate.

I nedenfor følgende tabell angis'de viktigste ab-sorbs j onssignaler (sifferverdiene angir, bølgetallet i cm 1), The following table shows the most important absorption signals (the numerical values indicate the wave number in cm 1),

Ved tynnsjiktkromatografi på silikagel oppviser aglykonen av 32 999 RP en Rf-verdi på ca. 0,7 når man ved 24°C som fremkallende oppløsningsmiddel anvender en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i et volumforhold på 80:17:3-Den nye forbindelse 32 999 RP med formelen I kan ifølge oppfinnelsen fremstilles ifølge en hvilken som helst av de følgende fremgangsmåter.. By thin-layer chromatography on silica gel, the aglycone of 32,999 RP shows an Rf value of approx. 0.7 when at 24°C a mixture of methylene chloride, formic acid and methanol is used as a developing solvent in a volume ratio of 80:17:3 - The new compound 32 999 RP with the formula I can according to the invention be prepared according to any of the following procedures..

(1) Gjennom mikrobiologisk reduksjon av antibiotikumet karminomycin med formelen: (1) Through microbiological reduction of the antibiotic carminomycin with the formula:

Karminomycin og dettes fremstilling ved dyrking av Actionomadura carminata Sp..nov. er beskrevet i den franske patentsøknad nr. 74.00349, som er publisert under nr. 2.235-700. Strukturen av karminomycin er angitt av M.G. Brazhnikova et al., "J. of Antibiotics", XXVII, nr. 4, 254-259 (1974).. Carminomycin and its production by cultivation of Actionomadura carminata Sp..nov. is described in the French patent application No. 74.00349, which is published under No. 2.235-700. The structure of carminomycin has been reported by M.G. Brazhnikova et al., "J. of Antibiotics", XXVII, No. 4, 254-259 (1974).

Den mikrobiologiske reduksjon av karminomycin gjen-nomføres vanligvis i vannholdig medium, enten.ved hjelp av mikro- organismekulturer som har nådd et egnet utviklingsstadium, eller ved hjelp av celler som er isolert fra den slags kulturer, eller ved hjelp av .enzymatiske ekstrakter oppnådd fra disse mikroorganismer. The microbiological reduction of carminomycin is usually carried out in an aqueous medium, either by means of cultures of micro-organisms which have reached a suitable stage of development, or by means of cells isolated from such cultures, or by means of enzymatic extracts obtained from these microorganisms.

De mikroorganismer som kan anvendes ved' fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilhøre slektene Streptomyces eller Bacterium. Som eksempel på spesielt egnede mikroorganismer skal nevnes Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) og Bacterium cykloxydans (ATCC 12.673-)..De beste resultater oppnås ved hjelp av Corynebacterium-simplex (ATCC 6946). The microorganisms that can be used in the method according to the present invention can belong to the genera Streptomyces or Bacterium. Examples of particularly suitable microorganisms are Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), Streptomyces roseochromogenes (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946) and Bacterium cykloxydans (ATCC 12.673-). The best results are obtained with Corynebacterium simplex (ATCC 6946).

Dyrkingen'av den mikroorganisme■som produserer det enzymatiske systen som kan redusere karminomycin til 32 999 RP, kan skje ifølge enhver fremgangsmåte for aerob dyrking på. overflaten eller i.dypet, men det sistnevnte er å foretrekke, av bekvemlighetsgrunner. Man anvender for dette formål de podings-og gjæringsmetoder og de forskjellige typer apparater som generelt er i bruk innen gjærindustrien. The cultivation of the microorganism producing the enzymatic system capable of reducing carminomycin to 32,999 RP can be carried out according to any aerobic cultivation method. the surface or in.depth, but the latter is preferable, for reasons of convenience. For this purpose, the grafting and fermentation methods and the various types of apparatus that are generally used in the yeast industry are used.

Dyrkingsmediet bør i -hovedsaken inneholde kiler for assimilerbart karbon og assimilerbart nitrogen, uorganiske stoffer og tilvektsfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av veldefinerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger slik som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse. The growing medium should mainly contain wedges for assimilable carbon and assimilable nitrogen, inorganic substances and weighting factors. All these substances can be used in the form of well-defined compounds or in the form of complex mixtures such as are encountered in biological products of different origins.

Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbohydrater slik som glukose eller andre karbonholdige forbindelser slik som sukkeralkoholer eller visse organiske syrer. As sources of assimilable carbon, carbohydrates such as glucose or other carbon-containing compounds such as sugar alcohols or certain organic acids can be used.

Visse animalske eller vegetabilske oljer slik som spekkolje eller-soyaolje kan med fordel erstatte disse forskj.ellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til dem. Certain animal or vegetable oils such as lard oil or soya oil can advantageously replace these various carbonaceous compounds or be used as an addition to them.

De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. De kan være meget enkle kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, karbamid, visse, aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform slik som kasein, laktalbumin,. gluten og hydrolysat derav, soyamel, jordnøttmel, fiskemel, pepton, kjøttekstrakt, jernekstrakt, drank, maisstøpevæske. The suitable sources for assimilable nitrogen are extremely variable. They can be very simple chemical compounds such as inorganic or organic ammonium salts, carbamide, certain amino acids. They can also be made up of complex substances that mainly contain nitrogen in protein form, such as casein, lactalbumin. gluten and hydrolyzate thereof, soya flour, peanut flour, fish meal, peptone, meat extract, iron extract, liquor, corn casting liquid.

Blant de tilsatte uorganiske stoffer kan visse ha en pufrende eller nøytraliserende virkning slik som alkalimetall-eller joralkalimetallfosfater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelikevekt for utviklingen av mikroorganismen, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og alkaliske 'j-ord-'alkalimetaller. Among the added inorganic substances, certain can have a buffering or neutralizing effect, such as alkali metal or non-alkali metal phosphates. Other inorganic substances provide the necessary ionic equilibrium for the development of the microorganism, such as chlorides and sulfates of alkali metals and alkaline 'j-word' alkali metals.

Tilvektsfaktorene er stoffer av vitaminnatur slik The weight gain factors are substances of a vitamin nature such as

. som riboflavin, folinsyre og pantotensyre. . such as riboflavin, folic acid and pantothenic acid.

p.H-verdien. i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse ligge mellom 6,0 og 7,8, fortrinnsvis mellom 6,5 og 7,5'. Den for gjæring opptimale temperatur er 29-31°C, men en tilfredsstillende utvikling oppnås ved temperaturer mellom. 26 og .37°C. the p.H value. in the fermentation medium should be between 6.0 and 7.8 at the beginning of cultivation, preferably between 6.5 and 7.5'. The optimum temperature for fermentation is 29-31°C, but satisfactory development is achieved at temperatures between. 26 and .37°C.

Lufttilførselen ved gjæringen kan variere innen ganske vide grenser. Man har imidlertid funnet at en.lufttil^førsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og .minutt er spesielt-egnet. For å oppnå en kultur med god reduserende virkning er det dessuten egnet å omrøre dyrkingsmediet, f.eks. ved hjelp av et røre-verk hvis rotasjonshastighet kan variere mellom 100 .og 250 omdreininger pr. minutt. The air supply during fermentation can vary within fairly wide limits. However, it has been found that an air supply of 0.3-3 1/1 culture broth per minute is particularly suitable. In order to achieve a culture with a good reducing effect, it is also suitable to stir the culture medium, e.g. using a stirrer whose rotation speed can vary between 100 and 250 revolutions per minute.

Mikrodrganismekulturen oppnår vanligvis en tilfredsstillende utviklingsgrad etter et tidsrom på 24-48 timer. The microorganism culture usually achieves a satisfactory degree of development after a period of 24-48 hours.

Den reduserende virkning beror hovedsakelig på den mengde celler som dannes under dyrkingen.- Når man anvender iso-lerte celler, f.eks. oppnådd ved sentrifugering av dyrkingsmediet, står den dannede mengde 32 999 R? i direkte forhold til konsentrasjonen av celler i reaksjonsmediet. Reaksjonsmedier med et høyt innhold av.celler har en utmerket reduksjonsevne. The reducing effect mainly depends on the amount of cells that are formed during cultivation. - When using isolated cells, e.g. obtained by centrifuging the culture medium, the amount formed stands at 32,999 R? in direct proportion to the concentration of cells in the reaction medium. Reaction media with a high content of cells have excellent reducing power.

Reduksjonen av karminomycin til 32 999 RP skjer ved at en vannoppløsning av karminomycin eller av et salt derav bringes i kontakt med en mikroorganismekultur som har oppnådd-tilfredsstillende utviklingsgrad og tilfredsstillende reaksjons-.evne, eller med celler isolert fra en slik kultur, eller med enzymatiske ekstrakter oppnådd fra slike celler. The reduction of carminomycin to 32,999 RP takes place by bringing an aqueous solution of carminomycin or a salt thereof into contact with a microorganism culture which has achieved a satisfactory degree of development and satisfactory reaction capacity, or with cells isolated from such a culture, or with enzymatic extracts obtained from such cells.

Enzymatiske celleékstrakter kan oppnås etter øde-leggelse av celleveggene, enten ved kjemiske eller biokjemiske metoder eller ved fysikalske metoder.- ødeleggelsen av celleveggene skjer fortrinnsvis ved at en vannsuspensjon-av en mikroorganismekultur eller av celler ioslert fra en slik kultur behandles med et enzym som kan lysere celleveggen, slik som lyso zym, eller ved at suspensjonen underkastes ultralydbehandling. Den etter sentrifugering oppnådde overstående væske, inneholder de enzymatiske ekstrakter i oppløsning. Oppløsningen av de enzymatiske.ekstrakter anvendes vanligvis i 'reduks j onstrinnet uten ytterligere behandling. Enzymatic cell extracts can be obtained after destruction of the cell walls, either by chemical or biochemical methods or by physical methods. lighten the cell wall, such as lysozyme, or by subjecting the suspension to ultrasound treatment. The supernatant liquid obtained after centrifugation contains enzymatic extracts in solution. The solution of the enzymatic extracts is usually used in the reduction step without further treatment.

Reduksjonen gjennomføres vanligvis under omrøring ved en temperatur mellom 32 og 37°C, fortrinnsvis mellom 2'6 og 30°C, og reduksjonen er vanligvis avsluttet etter 1-4 døgn. The reduction is usually carried out with stirring at a temperature between 32 and 37°C, preferably between 2.6 and 30°C, and the reduction is usually finished after 1-4 days.

Reduksjonen kan gjennomføres ved en pH-verdi mellom 5 og 10, men man foretrekker å arbeide ved en pH-verdi mellom 7 og 8. The reduction can be carried out at a pH value between 5 and 10, but it is preferred to work at a pH value between 7 and 8.

Reaksjonsmediet kan omrøres.f.eks. ved hjelp av The reaction medium can be stirred, e.g. using

et røreverk hvis rotasjonshastighet kan variere mellom 1.00 og 250 omdreininger/minutt. a stirrer whose rotation speed can vary between 1.00 and 250 revolutions/minute.

Man kan redusere enten rent karminomycin eller et' One can reduce either pure carminomycin or a

av disses rene salter, eller et urent produkt, eller det .sure filtrat som oppnås fra et dyrkingsmedium i hvilket karmino- of their pure salts, or an impure product, or the acid filtrate obtained from a culture medium in which carmin-

mycin er fremstilt ved dyrking. Por at man skal oppnå gode utbytter bør konsentrasjonen av karminomycin i reaksjonsmediet hensiktsmessig være mellom 0,1 og 1 g/l -ved reduksjonens begynnelse. (2) Ved,aerob dyrking av mikroorganismer tilhørene slekten Streptomyces, nærmere bestemt noen av de følgende mikroorganismer: Streptomyces coeruleorubidus .DS 8899 (NRRL 3046), Streptomyces coeruleorubidus DS 31- 723 (NRRL 3045), Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8090), .Streptomyces bifurcus DS 23. 219 (NRRL 3539)• mycin is produced by cultivation. In order to achieve good yields, the concentration of carminomycin in the reaction medium should ideally be between 0.1 and 1 g/l - at the beginning of the reduction. (2) By aerobic cultivation of microorganisms belonging to the genus Streptomyces, more specifically any of the following microorganisms: Streptomyces coeruleorubidus .DS 8899 (NRRL 3046), Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045), Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8090) , .Streptomyces bifurcus DS 23. 219 (NRRL 3539)•

Dyrkingen gjennomføres i for Streptomyces-stammer egnede næringsmedier i nærvær av tilsetningsstoffer valgt blant følgende: ametopterin, sulfanilamid, sulfatiazol, sulfapyridazin, barbital, fenobarbital, butobarbital og pentiobarbital. Cultivation is carried out in nutrient media suitable for Streptomyces strains in the presence of additives selected from the following: amethopterin, sulphanilamide, sulphathiazole, sulphapyridazine, barbital, phenobarbital, butobarbital and pentobarbital.

Den mengde antibiotikum 32 999 RP som dannes under' dyrkingen, varierer med dyrkingsmediets sammensetning, med mengden tilsatt tilsetningsstoff og med tidspunktet for til-setningen av dette, slik det skal' vises senere. The amount of antibiotic 32,999 RP that is formed during cultivation varies with the composition of the culture medium, with the amount of additive added and with the time of its addition, as will be shown later.

Mikroorganismene Streptomyces- coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) og Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 The microorganisms Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) and Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723

(NRRL 3045) .er beskrevet i fransk patent nr. I.38O.8IO, og Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) er beskrevet i det franske patent nr. 1.593-235. (NRRL 3045) is described in French Patent No. I.380.810, and Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) is described in French Patent No. 1,593-235.

Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 er en ny stamme som er isolert fra en jordprøve'. En prøve av denne organisme er deponert hos Norther Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinoi (USA), der den er registrert under betegnelsen NR 8098 . Prøver av mikroorganismen kan oppnås fra dette laboratorium. Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 is a new strain isolated from a soil sample'. A sample of this organism has been deposited at the Norther Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois (USA), where it is registered under the designation NR 8098. Samples of the microorganism can be obtained from this laboratory.

Isoleringen av denne stamme har skjedd ifølge en vanlig fremgangsmåte hvorved man suspenderer en liten mengde jord i sterilt destillert vann, fortynner suspensjonen til,forskjellige konsentrasjoner og utbrer et lite volum av hver fortynning på flaten av Petriskåler inneholdene et næringsagarmedium. Etter inkubering i noen døgn ved 26°C, hvorved mikroorganismen .utvikles, tas de koloiner ut som man ønsker å isloere for fortsatt studium og disse omplanteres på snedkulturer av næringsagar for'at man The isolation of this strain has taken place according to a common method whereby a small amount of soil is suspended in sterile distilled water, the suspension is diluted to different concentrations and a small volume of each dilution is spread on the surface of Petri dishes containing a nutrient agar medium. After incubation for a few days at 26°C, during which the microorganism develops, the colonies that you wish to isolate for further study are taken out and these are transplanted onto slant cultures of nutrient agar so that

skal oppnå mer rikelige kulturer. shall achieve more abundant cultures.

Stammen Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til-hører arten Streptomyces coeruleorubidus, som er beskrevet av G.F. Gauze et al. (Problems in the classif ication of.'Antagon-istic Actinomycetes - The American Institute of -Biological Scien-ces, Washington, 1959, s. 100) etter som den oppviser de samme-hovedegenskaper som denne art. Den nye stamme oppviser et blått til lyst grønn-blått spordannende luftmycelium, og på uorganisk medium nr. 1 ifølge Gauze utvikler den et vegetativt mycelium som har en rødaktig farge og som gir et oppløselig pigment av samme farge, hvilket pigment diffunderer inn i agaren. Alle disse egenskaper er karakteristiske for arten Streptomyces coeruleorubidus. Den nye stamme er derfor kalt Streptomyces ceoruleo-rubidus, stamme DS 7126. The strain Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 belongs to the species Streptomyces coeruleorubidus, which is described by G.F. Gauze et al. (Problems in the classification of.'Antagon-istic Actinomycetes - The American Institute of -Biological Sciences, Washington, 1959, p. 100) according to which it exhibits the same main characteristics as this species. The new strain exhibits a blue to light greenish-blue sporulating aerial mycelium, and on inorganic medium No. 1 according to Gauze it develops a vegetative mycelium which has a reddish color and which gives a soluble pigment of the same color, which pigment diffuses into the agar. All these properties are characteristic of the species Streptomyces coeruleorubidus. The new strain is therefore called Streptomyces ceoruleo-rubidus, strain DS 7126.

Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 danner korte, sfæriske til ovale sporer rned målene 0,7-0,9 ym/0,8-1,1 ym. Stammen utvikler enkle eller i form av knipper foreliggende sporoforer.. Sporekjeder som er ganske lange og som kan omfatte ■ opptil flere titals sporer, rulles sammen under dannelse av mer eller mindre åpne spiraler som oftps inneholder 2-5 eller 6 spiralviklinger. På grunn av sin spcredannelsesmåte klassifiseres Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 i Section Spira i Pridhams klassifikasjonssystem. Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 forms short, spherical to oval spores measuring 0.7-0.9 ym/0.8-1.1 ym. The stem develops simple or tufted sporophores. Chains of spores which are quite long and which can include ■ up to several tens of spores, are rolled together to form more or less open spirals which often contain 2-5 or 6 spiral windings. Because of its mode of spore formation, Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 is classified in Section Spira in Pridham's classification system.

Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 utvikles godt ved 25°C, noe mindre godt ved 57UC, og ikke i det hele tatt ved 50°C. Ved dyrkinger gjennomført ved 26°C oppviser stammen følg-ende biokjemiske egenskaper: Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 develops well at 25°C, somewhat less well at 57UC, and not at all at 50°C. When cultivated at 26°C, the strain exhibits the following biochemical properties:

I nedenfor angitte tabell angis .dyrkingskjennetegn for Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 på .et antall medier hvilke vanligvis anvendes for å bestemme de morfologiske egenskaper hos Streptomyces-stammer. Dyrkinger på agarmedier er gjennomført på snedkulturer. De angitte data er oppnådd ved studium av kulturer som har oppnådd et godt utviklingsstadium, dvs. etter dyrking i ca. 3 uker ved 26°C hvis ikke annet er angitt . De i tabellen angitte referanser er.følgende. The following table shows the cultivation characteristics of Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 on a number of media which are usually used to determine the morphological characteristics of Streptomyces strains. Cultivations on agar media have been carried out on slant cultures. The stated data has been obtained by studying cultures that have reached a good stage of development, i.e. after cultivation for approx. 3 weeks at 26°C unless otherwise stated. The references given in the table are as follows.

Gjennom den blå til grønnaktig blå fargingen av Through the blue to greenish blue coloring of

det spordannende luftmycelium tilfhører stammen Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til serien "Coerulescens", som er beskrevet av Gauze et al. På samme måte. som de i denne- serie be-' skrevne stammene S. coeruleorubidus og S. bicolor oppviser' stammen DS 7126 et rødfarget vegetativt mycelium. Stammen DS the spore-forming aerial mycelium belongs to the strain Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 of the series "Coerulescens", which is described by Gauze et al. Similarly. like the strains S. coeruleorubidus and S. bicolor described in this series, the strain DS 7126 exhibits a red-coloured vegetative mycelium. The strain DS

7126 skiller seg imidlertid fra S. bicolor ved at den i motset-ning til S. bicolor utnytter cellulose og ikke koagulerer melk og fremfor alt ved at den på syntetiske- medier kan danne et rødt oppløselig pigment som diffunderer inn i agaren, en egenskap som stammen DS 7126 deler kun med arten S. coeruleorubidus. Den sistnevnte egenskap i kombinasjon med de andre egenskaper viser at stammen DS 7126 tilhører arten S. coeruleorubidus. However, 7126 differs from S. bicolor in that, in contrast to S. bicolor, it utilizes cellulose and does not coagulate milk and, above all, in that it can form a red soluble pigment on synthetic media that diffuses into the agar, a property which strain DS 7126 shares only with the species S. coeruleorubidus. The latter characteristic in combination with the other characteristics shows that strain DS 7126 belongs to the species S. coeruleorubidus.

Evnen hos Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 til The ability of Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 to

å utnytte ulike karbonkilder o.g nitrogenkilder for å sikre sin utvikling, er bestemt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet av Pridham og Gottlieb i ('J. of Bact", 56, 107-114, 1948). to utilize various carbon sources and nitrogen sources to ensure their development, is determined according to the method described by Pridham and Gottlieb in ('J. of Bact', 56, 107-114, 1948).

Graden av utvikling er iakttatt på det av forfatterne angitte basismedium hvorved man enten har erstattet glukosen med forskjellige undersøkte karbonkilder eller erstattet (NH^)2 SO^med forskjellige undersøkte nitrogenkilder. Resultatene er angitt i nedenfor følgende tabell. The degree of development is observed on the base medium specified by the authors, whereby the glucose has either been replaced with various investigated carbon sources or (NH^)2 SO^ has been replaced with various investigated nitrogen sources. The results are indicated in the table below.

Fremgangsmåten for fremstilling av 32 999 R? består i det vesentlige i at man dyrker den ovenfor angitte Streptomyces-stammer på et dyrkingsmedium under egnede betingelser i' .nærvær av en tilstrekkelig, mengde tilsetningsmidler og at man deretter separerer det under dyrkingen dannede produkt. The procedure for making 32,999 R? essentially consists in growing the above-mentioned Streptomyces strains on a culture medium under suitable conditions in the presence of a sufficient amount of additives and then separating the product formed during the cultivation.

Dyrkingen av mikroorganismene kan skje ifølge en hvilken som helst fremgangsmåte for aerob dyrking på overflaten eller på dypet, men den sistnevnte er å foretrekke av bekvemlig-hetshensyn. Man anvender for dette formål forskjellige typer apparaturer som er i vanlig bruk innen gjærindustrien. The cultivation of the micro-organisms can take place according to any method of aerobic cultivation on the surface or in the depth, but the latter is preferable for reasons of convenience. For this purpose, different types of equipment are used which are in common use in the yeast industry.

Man kan spesielt anvende følgende oppdeling av arbeidstrinnene: In particular, the following breakdown of the work steps can be used:

Gjærmediet bør i det hovedsakelige inneholde en kilde for assimilerbart karbon og en kilde for assimilerbart nitrogen, uorganiske stoffer, spesielt klorider eller karbona-ter, og eventuelt tilvektsfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av godt definerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger,'slike som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse. The yeast medium should mainly contain a source of assimilable carbon and a source of assimilable nitrogen, inorganic substances, especially chlorides or carbonates, and possibly weighting factors. All these substances can be used in the form of well-defined compounds or in the form of complex mixtures, such as are encountered in biological products of different origins.

Som kilder for assimilerbart karbon kari man anvende karbohydrater slik som glukose, laktose, dextriner og stivelse,-eller andre karbonhodlige stoffer slik som sukkeralkoholer (gly-serol) eller visse organiske syrer, f.eks. melkesyre eller sitronsyre. Visse animalske eller vegetabilske oljer slik som spekkolje eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til dem. As sources of assimilable carbon, carbohydrates such as glucose, lactose, dextrins and starch can be used, or other carbonaceous substances such as sugar alcohols (glycerol) or certain organic acids, e.g. lactic acid or citric acid. Certain animal or vegetable oils such as lard or soya oil can advantageously replace these various carbonaceous compounds or be used as an addition to them.

.-De egnede kilder for assimilerbart nitrogen er .-The suitable sources for assimilable nitrogen are

ytterst vekselende'. De kan være meget enkle kjemiske forbindelser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, karbamid extremely variable'. They can be very simple chemical compounds such as inorganic or organic ammonium salts, carbamide

■og visse aminosyrer. De kan også utgjøres av komplekse stoffer som hovedsakelig inneholder nitrogen i proteinform, slik som ■and certain amino acids. They can also be made up of complex substances that mainly contain nitrogen in protein form, such as

kasein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jord-nøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt, gjærekstrakt, drank og mais-støpevæske. casein, lactalbumin, gluten and hydrolyzate thereof, soya flour, ground nut flour, fish meal, meat extract, yeast extract, liquor and corn-molding liquid.

Blant de -tilsatte uorganiske stoffer kan enkelte ha en puffrende eller nøytraliserende virkning slik.som alkali-metall- eller j ordalkalirnetallf osfater, eller kalsium- .og magnesiumkarbonater. Andre uorganiske stoffer gir den nødvendige ionelikevekt for utvikling av mikroorganismene og dannelsen av 32 999 RP, slik som klorider og sulfater av alkalimetaller og alkaliske j ordartsm.etaller. Til slutt virker visse stoffer mere spesielt som aktivatorer for de metabolske reaksjoner av mikroorganismene, slik som salter av sink, kobolt, jern, kobber og mangan. Among the added inorganic substances, some may have a buffering or neutralizing effect, such as alkali metal or alkaline earth phosphates, or calcium and magnesium carbonates. Other inorganic substances provide the necessary ionic equilibrium for the development of the microorganisms and the formation of 32,999 RP, such as chlorides and sulphates of alkali metals and alkaline earth metals. Finally, certain substances act more specifically as activators for the metabolic reactions of the microorganisms, such as salts of zinc, cobalt, iron, copper and manganese.

Tilvekstfatorene er vanligvis stoffer av vitaminna--tur slik som' tiamiri, riboflavin og pantotensyre. The growth factors are usually substances of a vitamin nature such as thiamiric acid, riboflavin and pantothenic acid.

Tilsetnings.midlene kan tilsettes under forskjellige stadier av dyrkingen., f.-eks. under podningsdyrkingen i ■omrystet kolbe' eller under produksjonsdyrkingen. ' De beste resultater oppnås imidlertid når tilsetningsmidlene tilsettes enten ved begynnelsen av produksjonsdyrkingen eller i løpet av denne. The additives can be added during different stages of cultivation, e.g. during the graft cultivation in a 'shaken flask' or during the production cultivation. ' However, the best results are obtained when the additives are added either at the beginning of the production cultivation or during this.

De aller beste tilsetningsmidler er sulfanilamid, sulfatiazol og sulfapyridazin. The very best additives are sulphanilamide, sulphathiazole and sulphapyridazine.

Konsentras j onen' av tilsetningsmidlet i gjørm.ediet Concentration of the additive in the mud

kan variere innen frie grenser avhengig av dyrkingsmediets sammensetning og tilsetningsmidlets natur. Konsentrasjoner på mellom 0,01 og 1 g/l dyrkingsmedium er vanligvis mest hensiktsmessig; can vary within free limits depending on the composition of the culture medium and the nature of the additive. Concentrations of between 0.01 and 1 g/l culture medium are usually most appropriate;

pH-verdien i gjæringsmeddet bør ved dyrkingens be-' gynnelse være mellom 5,6 og 7,4, fortrinnsvis mellom 5,8 og 7,2. Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25 og 30°C, men At the start of cultivation, the pH value in the fermentation medium should be between 5.6 and 7.4, preferably between 5.8 and 7.2. The optimum temperature for fermentation is between 25 and 30°C, but

en tilfredsstillende produksjon oppnås ved temperaturer mellom. 23 og 33°C. Lufttilførslen ved gjæringen kan variere innen vide grenser. Man har imidlertid funnet at eh lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og minutt er spesielt egnet. Det maksimale utbytte av 32 999 RP oppnås etter 2-10 døgns dyrking, hvorved tiden i det vesentlige beror- på det anvendte medium. satisfactory production is achieved at temperatures between 23 and 33°C. The air supply during fermentation can vary within wide limits. However, it has been found that an air supply of 0.3-3 1/1 culture broth per minute is particularly suitable. The maximum yield of 32,999 RP is achieved after 2-10 days of cultivation, whereby the time essentially depends on the medium used.

Av det ovenfor angitte fremgår det at. de generelle betingelser for dyrking av de angitte mikroorganismer i nærvær av de angitte tilsetningsmidler kan variere innen vide grenser og tilpasses til spesielle krav. (3) Ved'dyrking av en ny mikroorganisme som tilhører slekten Streptomyces og som er gitt.betegnelsen Streptomyces atroviolaceus DS 8938. En prøve av denne organisme er deponert hos United States Department of Agriculture, Peoria, 111., der den er registrert under betegnelsen NRRL 314 8. Prøver av mikroorganismer kan oppnås fra dette laboratorium. From the above it appears that. the general conditions for growing the specified microorganisms in the presence of the specified additives can vary within wide limits and be adapted to special requirements. (3) Cultivation of a new microorganism belonging to the genus Streptomyces and designated Streptomyces atroviolaceus DS 8938. A specimen of this organism has been deposited with the United States Department of Agriculture, Peoria, 111., where it is registered under the designation NRRL 314 8. Samples of microorganisms may be obtained from this laboratory.

Denne mikroorganisme som-er isolert fra en jord-prøve oppviser slike egenskaper at den ikke kan■identifiseres med noen tidligere beskreven art. Den bør altså betraktes som This microorganism which is isolated from a soil sample exhibits such characteristics that it cannot be identified with any previously described species. It should therefore be considered as

en ny art. a new species.

Isoleringen av denne mikroorganisme har skjedd ifølge en vanlig metode hvor man suspenderer en liten mengde jord i sterilt destillert vann, fortynner suspensjonen til ulike konsentrasjoner og sprer ut et lite volum av hver' fortynnelse på. flaten av Petri-skåler inneholdende et næringsagarmedium. Etter inkubering i noen døgn ved 26°C hvorved mikroorganismen utvikles, tas de kolonier ut som man ønsker å isolere for fortsatt studium, og disse omplanteres på snedkulturer av næringsågar for at man The isolation of this microorganism has taken place according to a common method where a small amount of soil is suspended in sterile distilled water, the suspension is diluted to various concentrations and a small volume of each dilution is spread on. surface of Petri dishes containing a nutrient agar medium. After incubation for a few days at 26°C during which the microorganism develops, the colonies that you wish to isolate for further study are taken out, and these are transplanted onto slant cultures of nutrient agar so that

skal oppnå mere rikelige kulturer. shall achieve more abundant cultures.

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 danner ovale sporer med målene 0,4-0,6 ym/0,6-0,9 yrn. Mikroorganismen utvikler ikke forgrende sporoforer på luftmyceliet-. Disse sporekjeder som er lange og vanligvis inneholder flere titall sporer .rulles sammen i flere, vanligvis tette spiralviklinger. -På grunn av sin måte å danne sporer på, klassifiseres stammen i Section Spira i Pridhams klassifiseringssystem. Streptomyces atroviolaceus DS 8938 forms oval spores measuring 0.4-0.6 ym/0.6-0.9 yrn. The microorganism does not develop branching sporophores on the aerial mycelium. These spore chains, which are long and usually contain dozens of spores, are rolled together in several, usually tight spiral windings. -Due to its mode of spore formation, the strain is classified in Section Spira in Pridham's classification system.

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 'utvikles godt ved 25°C' og ved 30°C, mindre godt ved 37°C og ikke i det hele tatt ved 50°C. På flertallet dyrkingsmedier danner'mikroorganismen et vegetativt 'mycelium som først er brungult til brunrødt og som hurtig antar en mørk farge, en farge som går fra meget mørkebrunt til b.runfiolett eller svartbrunt. Sporedannelsen • skjer kun på et begrenset antall medier og da kun langsomt., hvorved det dannes et meget lyst grått luftmycelium. På den armen side.kan man legge merke til. at luftmyceliet på et visst antall dyrkingsmedier kan farges lyst rosa eller lyst fiolett når kulturen danner rikelig med mørkt fiolett oppløselig pigment. Streptomyces atroviolaceus DS 8938 'develops well at 25°C' and at 30°C, less well at 37°C and not at all at 50°C. On the majority of culture media, the microorganism forms a vegetative mycelium which is at first brownish-yellow to brownish-red and which quickly assumes a dark colour, a color which goes from very dark brown to b.run violet or black-brown. The spore formation • only occurs on a limited number of media and then only slowly, whereby a very light gray aerial mycelium is formed. On the other hand, you can notice. that the aerial mycelium on a certain number of culture media can be colored light pink or light violet when the culture forms abundant dark violet soluble pigment.

Streptomyces atroviolaceus DS 8938 produserer ikke svart, oppløselig melaninpigment på tyrosin-gjærekstrakt-agarmedium ifølge Waksman (melanindannelsesmedium). Mikroorganismen kan imidlertid på tallrike medier, såvel syntetiske som organiske, danne oppløselig pigment som farger agaren mørk og som farger den samme fiolettbrun,' fiolettsvart, svartbrun eller svart.. Streptomyces atroviolaceus DS 8938 does not produce black soluble melanin pigment on Waksman tyrosine yeast extract agar medium (melanin formation medium). However, the micro-organism can, on numerous media, both synthetic and organic, form a soluble pigment which colors the agar dark and which colors the same violet-brown, violet-black, black-brown or black..

Ved dyrkinger gjennomført•ved 26°C oppviser mikroorganismen følgende biokjemiske egenskaper. When cultivated at 26°C, the microorganism exhibits the following biochemical properties.

Dyrkingskjennetegnene for Streptomyces atroviolaceus DS 8938 er satt sammen i nedenfor følgende tabell.'De angitte data er oppnådd ved studium av kulturer som har oppnådd et godt utviklingsstadium, dvs. etter dyrking i ca. 3 uker ved 26°C hvis intet annet er angitt. Egenskapene er observert på slike nær-ingsagarmedier og buljonger som vanligvis anvendes for å bestemme 'de morfologiske egenskaper hos Streptomyces-stammer. Dyrkingen på agarmedier er gjennomført på snedkulturer. Et visst antall av de anvendte dyrkingsmedier er fremstilt ifølge de formler som er angitt i "The Actinomycetes", S.A. Waksman, s. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950. I disse tilfeller betegnes mediene med bokstaven W fulgt av det nummer som mediene er tildelt i "The Actinomycetes". De andre dyrkingsmedier har følgende referanser eller sammensetninger. The cultivation characteristics for Streptomyces atroviolaceus DS 8938 are compiled in the following table below.' 3 weeks at 26°C unless otherwise stated. The properties have been observed on such nutrient agar media and broths as are usually used to determine the morphological properties of Streptomyces strains. Cultivation on agar media is carried out on slant cultures. A certain number of the culture media used are prepared according to the formulas given in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, pp. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950. In these cases, the media are designated by the letter W followed by the number assigned to the media in "The Actinomycetes". The other culture media have the following references or compositions.

Streptomyces. atroviolaceus DS '8938 oppviser et antall egenskaper som ikke nøyaktig stemmer overens med'de hos. tidligere beskrevne stammer,, og mikroorganismen bør derfor ansees å være'en ny art. Streptomyces. atroviolaceus DS '8938 exhibits a number of characteristics that do not exactly correspond to those of. previously described strains,, and the microorganism should therefore be considered to be a new species.

Med hensyn til de arter som er beskrevet 'i "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1961) og i Bergey's "Manual- of Determinative Bacteriology" (7- opplag, The Williams and Wlikins Company, Baltimore, 1957), så bør man nærmest jevnføre den nye- mikroorganismen med Streptomyces-violaceoniger, ettersom den.nye mikroorganismen på samme måte som Streptomyces violaceoniger ikke With regard to the species described 'in "The Actinomycetes" (vol. 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1961) and in Bergey's "Manual- of Determinative Bacteriology" (7- edition, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957), then one should almost equate the new microorganism with Streptomyces violaceoniger, since the new microorganism, in the same way as Streptomyces violaceoniger, does not

■ produserer svart, oppløselig melaninpigment, men derimot-på syntetisk agar ifølge Czapék med sakkarose (sakkarose-nit.rat-agar) produserer et brunfiolett oppløselig pigment' som meget hurtig blir sort. S. atroviolaceus DS 8938 gir dessuten -på tallrike medier brunfiolette til svartfiolette oppløselige pigmenter, i visse tilfelle til og med svarte pigmenter. På samme måte som S. -violaceoniger oppviser dessuten S. atroviolaceus DS 8938 et sporedannende luftmycelium som er gråfarget, og dettes sporkjeder rulles sammen til spiraler. S. atrioviolaceus DS 8938 og ,S. violaceoniger bør imidlertid ansees som to forskjellige arter. På tross av de ovenfor angitte likheter kan man nemlig bemerke at S. violaceoniger ikke gir noe oppløselig pigment på poteter, utvikler et grått vegetativt mycelium på gelatin og .fremfor alt ved aldring oppviser en svartfarging av luf tmyceliet-, noe som gjør at denne art inngår, i gruppen av S. hygroscopicus. Stammen av S. atroviolaceus DS 8938 gir derimot et brunt til mørkt brunfiolett oppløselig pigment på poteter og utvikler et brunaktig til fiolett vegetativit mycelium på gelatin, og heller ikke meget gamle kulturer oppviser noen gang noen svartfarging av luftmyceliet. Det kan også bemerkes at,, spesielt på syntetisk agar ifølge Czapek med sakkarose (sakkarose-nitratagar), det av S. violaceoniger dannede opp-løselige pigment ved begynnelsen av dyrkingen har en blåaktig fargetone, -noe som aldri er tilfelle med de av S.'atroviolaceus DS 8938 dannede oppløselige pigment som før formørkningen oppviser, en purpurfiolett farge og ikke en blåfiolett farge. ■ produces black, soluble melanin pigment, but on the other hand-on synthetic agar according to Czapék with sucrose (sucrose-nit.rat-agar) produces a brown-violet soluble pigment' which very quickly turns black. S. atroviolaceus DS 8938 also gives -on numerous media brown violet to black violet soluble pigments, in certain cases even black pigments. In the same way as S. -violaceoniger, S. atroviolaceus DS 8938 also exhibits a spore-forming aerial mycelium which is grey-coloured, and its spore chains are rolled up into spirals. S. atrioviolaceus DS 8938 and ,S. violaceoniger should, however, be considered two different species. In spite of the above-mentioned similarities, it can be noted that S. violaceoniger does not produce any soluble pigment on potatoes, develops a gray vegetative mycelium on gelatin and, above all, when aging shows a black coloring of the aerial mycelium, which means that this species included, in the group of S. hygroscopicus. The strain of S. atroviolaceus DS 8938, on the other hand, produces a brown to dark brown-violet soluble pigment on potatoes and develops a brownish to violet vegetative mycelium on gelatin, nor do very old cultures ever show any blackening of the aerial mycelium. It may also be noted that, especially on synthetic agar according to Czapek with sucrose (sucrose-nitrate agar), the soluble pigment formed by S. violaceoniger at the beginning of cultivation has a bluish tint, -which is never the case with those of S .'atroviolaceus DS 8938 formed soluble pigment which, before darkening, shows a purplish-violet color and not a blue-violet color.

Evnen.hos Streptomyces atroviolaceus DS 8938 til The ability of Streptomyces atroviolaceus DS 8938 to

å .utnytte forskjellige karbonkilder og nitrogenkildér for å to .use different carbon sources and nitrogen sources to

sikre sin utvikling er bestemt ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet av Pridham og Gottlieb (' U. of. Bact.", 56., 107-114, 1948). Graden'av utvikling er iakttatt på det av forfatterne angitte basismedium, hvorved man.enten har erstattet glukosen med forskjellige undersøkte karbonkilder eller erstattet ■(NH^^ SO^med forskjellige undersøkte nitrogenkilder. Resultatene er sammenstilt.i nedenfor følgende tabell. ensure its development is determined according to the method described by Pridham and Gottlieb (' U. of. Bact., 56., 107-114, 1948). The degree' of development is observed on the base medium specified by the authors, whereby .has either replaced the glucose with various investigated carbon sources or replaced ■(NH^^ SO^with various investigated nitrogen sources. The results are compiled in the following table.

Fremgangsmåten for fremstilling av 32 999 RP består i det vesentlige at man dyrker Streptomyces atroviolaceus DS 8938 eller dennes mutanter på et dyrkingsmedium under egnende betingelser.og at man deretter separerer det under dyrkingen dannede produkt. The method for producing 32,999 RP essentially consists of growing Streptomyces atroviolaceus DS 8938 or its mutants on a culture medium under suitable conditions, and then separating the product formed during cultivation.

Dyrkingen av Streptomyces atrovilaceus DS 8938 kan skje ifølge enhver fremgangsmåte for aerob dyrking på overflaten eller på dypet, men den sistnevnte er å foretrekke av bekvemlighetsgrunner. Man anvender for dette formål forskjellige typer apparaturer som vanligvis er i bruk innen gjærindustrien. The cultivation of Streptomyces atrovilaceus DS 8938 can be carried out according to any method of aerobic cultivation at the surface or at depth, but the latter is preferred for reasons of convenience. Different types of equipment are used for this purpose, which are usually used in the yeast industry.

Man kan spesielt anvende følgende oppdeling av arbeidstrinnene: In particular, the following breakdown of the work steps can be used:

Gjærmediet bør i hovedsaken.inneholde en kilde for assimilerbart karbon og en kilde for assimilerbart' nitrogen, uorganiske stoffer, spesielt klorider eller karbonater,'og eventuelt tilvekstfaktorer. Alle disse stoffer kan anvendes i form av godt definerte forbindelser eller i form av komplekse blandinger, slik som de som man støter på i biologiske produkter av forskjellig opprinnelse. The yeast medium should mainly contain a source of assimilable carbon and a source of assimilable nitrogen, inorganic substances, especially chlorides or carbonates, and possibly growth factors. All these substances can be used in the form of well-defined compounds or in the form of complex mixtures, such as those encountered in biological products of different origins.

Som kilder for assimilerbart karbon kan man anvende karbohydrater slik som glukose, laktose, dextriner og stivelse, eller andre karbonholdige forbindelser slik som sukkeralkoholer. As sources of assimilable carbon, one can use carbohydrates such as glucose, lactose, dextrins and starch, or other carbon-containing compounds such as sugar alcohols.

(glycerol) eller visse organiske syrer, f.eks. melkesyre eller sitronsyre. Visse animalske eller vegetabilske oljer, slik som spekkolje eller soyaolje kan med fordel erstatte disse forskjellige karbonholdige forbindelser eller anvendes som tilsetning til disse. (glycerol) or certain organic acids, e.g. lactic acid or citric acid. Certain animal or vegetable oils, such as lard or soya oil, can advantageously replace these various carbonaceous compounds or be used as an addition to them.

De. egnede kilder for assimilerbart nitrogen er ytterst vekslende. De kan være meget enkle kjemiske forbind- eiser slik som uorganiske eller organiske ammoniumsalter, kar-, The. suitable sources for assimilable nitrogen are extremely variable. They can be very simple chemical compounds such as inorganic or organic ammonium salts,

■bamid og visse-aminosyrer. De kan også' utgj øres av komplekse substanser som i hovedsaken inneholder nitrogen i proteinform, slik som ka'sein, laktalbumin, gluten og hydrolysat derav, soyamel, jordnøttmel, fiskemel, kjøttekstrakt,'gjærekstrakt, drank og maisstøpevæske-. ■bamide and certain amino acids. They can also be made from complex substances which mainly contain nitrogen in protein form, such as casein, lactalbumin, gluten and their hydrolysates, soya flour, groundnut flour, fish meal, meat extract, yeast extract, liquor and corn liquor.

Blant de- tilsatte uorganiske stoffer kan disse ha en puffrende eller nøytraliserende virkning, slik som alkali-metall- eller jordalkalimetallfosfater eller,kalsium- eller magnesiumkarbonater. Andre uorganiske stoffer i den nødvendige' ionelikevekt for utviklingen av Streptomyces atroviolaceus DS 8938 og dannelsen av 32 999.RP, slik som klorider -og sulfater av alkalimetaller og alkaliske j ordartsmetaller." Til slutt virker visse stoffer mere spesielt som aktivatorer for de metabolske reaksjoner av Streptomyces atroviolaceus DS 8938, 'slik som salter av sink^kobolt, jern, kobber og mangan." Among the added inorganic substances, these can have a buffering or neutralizing effect, such as alkali metal or alkaline earth metal phosphates or calcium or magnesium carbonates. Other inorganic substances in the necessary' ionic equilibrium for the development of Streptomyces atroviolaceus DS 8938 and the formation of 32 999.RP, such as chlorides and sulphates of alkali metals and alkaline earth metals." Finally, certain substances act more specifically as activators of the metabolic reactions of Streptomyces atroviolaceus DS 8938, 'such as salts of zinc^cobalt, iron, copper and manganese."

Tilvekstfaktorene er stoffer av vitaminnatur slik som riboflavin, folinsyre, pantotensyre og tiamin. ■ The growth factors are substances of a vitamin nature such as riboflavin, folic acid, pantothenic acid and thiamine. ■

pH-verdien i gjæringsmediet bør ved dyrkingens begynnelse være -mellom 5,8 og 7,3.- Den for gjæringen optimale temperatur er mellom 25°C og 30°C, men en tilfredsstillende produksjon er oppnådd ved temperaturer mellom 23 og 33°C.' Luft-tilførslen ved■gjæringen kan variere innen ganske vide grenser. .Man har imidlertid funnet at en lufttilførsel på 0,3-3 1/1 dyrkingsbuljong og minutt er spesielt egnet.- Det maksimale utbytte av 32 999 RP oppnås etter 2-8 døgns dyrking,- hvorved tiden i det vesentlige- avhenger av det anvendte medium. The pH value in the fermentation medium at the beginning of cultivation should be -between 5.8 and 7.3.- The optimum temperature for fermentation is between 25°C and 30°C, but satisfactory production is achieved at temperatures between 23 and 33°C .' The air supply during fermentation can vary within fairly wide limits. However, it has been found that an air supply of 0.3-3 1/1 culture broth per minute is particularly suitable. medium used.

Av det ovenfor angitte fremgår det at"de generelle betingelser for .dyrking av Streptomyces atroviolaceus DS -8938 i den hensikt å fremstille forbindelsen 32 999 RP kan variere innen vide grenser og tilpasses til spesielle krav. From the above, it appears that the general conditions for cultivation of Streptomyces atroviolaceus DS -8938 for the purpose of producing the compound 32 999 RP can vary within wide limits and can be adapted to special requirements.

Forbindelsen 32 999 RP kan separeres fra frernstil-lingsmediet ifølge fremgangsmåter som er vanlige ved isolering av antibiotika av denne type. The compound 32,999 RP can be separated from the isolation medium according to methods which are common for the isolation of antibiotics of this type.

Forbindelsen 32 999 RP kan f.eks. ekstraheres fra reaksjonsmediet eller gjæringsmediet ved en .pH-verdi nær 9 ved hj.elp av et organisk oppløsningsmiddel slik som kloroform, metylenklorid, n-butanol eller en blanding av disse oppløsni-ngs-midler i egnet forhold. The connection 32,999 RP can e.g. is extracted from the reaction medium or the fermentation medium at a pH value close to 9 with the help of an organic solvent such as chloroform, methylene chloride, n-butanol or a mixture of these solvents in a suitable ratio.

Gjæringsmediet kan også filtreres i nærvær av et filtreringshjelpemiddel ved en pH-verdi på -mellom 1,5 og 9- Det er hensiktsmessig å gjennomføre denne operasjon i surt medium, spesielt et medium som er surgjort til en pH-verdi mél-lom ,1,5 og 2 ved hjelp av pksalsyre. Det er- også mulig å gjennomføre filtreringen ved en pH-verdi på mellom 2 og 8 i nærvær av en alifatisk alkohol inneholdende 1-3 karbonatomer. 32 999 RP kan ekstraheres fra filtratet, etter konsentrering, ved hjelp av et organisk oppløsningsmiddel slik som kloroform, metylenklorid, n-butanol eller en blanding av disse oppløsningsmidler i egnede forhold. -32 999 RP. kan isoleres fra de organiske ekstrakter etter suksésive vaskinger og ekstraksjoner, ved utfelling etter konsentrering av ekstraktene til et lite.volum eller ved tilsetning av et blandbart oppløsningsmiddel i hvilket 32 999 RP praktisk talt er uoppløslig, slik som heksan, eventuelt etter omdanning av antibiotikumet til et syreaddisjonssalt , f.eks. hydrokloridet. The fermentation medium can also be filtered in the presence of a filtration aid at a pH value of -between 1.5 and 9- It is appropriate to carry out this operation in an acidic medium, especially a medium that is acidified to a pH value between .1 ,5 and 2 using pksalic acid. It is also possible to carry out the filtration at a pH value of between 2 and 8 in the presence of an aliphatic alcohol containing 1-3 carbon atoms. 32,999 RP can be extracted from the filtrate, after concentration, using an organic solvent such as chloroform, methylene chloride, n-butanol or a mixture of these solvents in suitable proportions. -32,999 RP. can be isolated from the organic extracts after successful washings and extractions, by precipitation after concentration of the extracts to a small volume or by the addition of a miscible solvent in which 32,999 RP is practically insoluble, such as hexane, possibly after conversion of the antibiotic to an acid addition salt, e.g. the hydrochloride.

Forbindelsen 32 999 R? kan eventuelt renses ved en tillemping av forskjellige klassiske rensemetoder slik som krystallisering eller kromatografi på forskjellige absorbsjons-midler. The connection 32 999 R? can possibly be purified by applying different classic purification methods such as crystallization or chromatography on different absorbents.

Forbindelsen 32 999 RP og dennes ugiftige, dvs. farmasøytisk akseptable, salter har vist seg meget virksomme mot tumorer. Forbindelsen og dennes salter har således hos mus vist seg virksomme mot leukemi' L 1210, leukemi P 388 og leukosearkomatose ved' intraperitoneal inngivelse i- doser på mellom 0,125 og 0,250 mg/kg. The compound 32 999 RP and its non-toxic, i.e. pharmaceutically acceptable, salts have been shown to be very effective against tumours. The compound and its salts have thus been shown to be effective in mice against leukemia L 1210, leukemia P 388 and leukosarcomatosis by intraperitoneal administration in doses of between 0.125 and 0.250 mg/kg.

Giftigheten av hydokloridet av 32 999 RP er studert i det vesentlige på mus. Den letale dose 50% (LD^Q) The toxicity of the hydrochloride of 32,999 RP has been studied mainly in mice. The lethal dose 50% (LD^Q)

eir nær 0,4 mg/kg ved intraperitoneal inngivelse i fire på hverandre følgende døgn. eir close to 0.4 mg/kg by intraperitoneal administration for four consecutive days.

Oppfinnelsen skal illustreres ved følgende ikke begrensende eksempler. I eksemplene er forbindelsen, 32 999 The invention shall be illustrated by the following non-limiting examples. In the examples, the compound is 32,999

RP identifisert ved.hjelp av tynnsjiktskromatografi pa silikagel, hvorved man har sammenlignet Rf-verdiene for de oppnådde produkter med Rf-verdiene for karminomycin eller 32 999 RP i samme oppløsningsmiddelsysten. Produktene av 32 999 RP er bestemt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi, enten ved sammen ligning av .entensiteten av den flekk som er oppnådd med ekstratet med den flekk som er oppnådd med ren 32 999 RP, eller ved sammenligning av .flatene av de t.opper som registreres ved hjelp av en Chromoscan-plate, eller ved kolorimetrisk bestemmelse av forbindelsen 32 999 RP, eluert fra produktflekken på den kroma-tografiske bærer. RP identified by means of thin-layer chromatography on silica gel, whereby the Rf values for the products obtained have been compared with the Rf values for carminomycin or 32,999 RP in the same solvent system. The products of 32,999 RP are determined by means of thin-layer chromatography, either by comparing the intensity of the spot obtained with the extract with the spot obtained with pure 32,999 RP, or by comparing the areas of the t.uppers which is recorded by means of a Chromoscan plate, or by colorimetric determination of the compound 32,999 RP, eluted from the product spot on the chromatographic carrier.

pH-verdien hos en oppløsning av de tre første bestanddeler i 1000 cm^ destillert vann innstilles til 6,9 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsriing, hvoretter oppløs-ningen fordeles i kolber på 300 cm 3 i en mengde pa .50 cm 3/kolbe. Disse kolber steriliseres ved 122 C i løpet av 20 minutter og avkjøles deretter. Man fullfører deretter dyrkingsmediet ved The pH value of a solution of the first three components in 1000 cm^ of distilled water is adjusted to 6.9 by adding 1N sodium hydroxide solution, after which the solution is distributed into flasks of 300 cm 3 in an amount of .50 cm 3/flask. These flasks are sterilized at 122 C for 20 minutes and then cooled. The cultivation medium is then completed with

at det til hver kolbe sterilt settes 1,5 cm^ av en steril glu-koseoppløsning inneholdende 500 g glukose pr. liter. Mediet har deretter en pH-verdi på 7,05. that 1.5 cm^ of a sterile glucose solution containing 500 g of glucose per litres. The medium then has a pH value of 7.05.

Man poder 80 av disse kolber ved til hver kolbe å sette 2,5 cm^ av en ppdingskultur av en stammen Corynebacterium'. simplex (ATCC 6946). Kulturen utvikles på'et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C. Etter'48 timer er kulturen godt utviklet og pH-verdien er. 7,70. -Til hver kolbe setter man deretter 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinnydroklorid pr; cm^. Reduksjonen gjennomføres under de samme rotasjonsbetingelser ved 26°C. 80 of these flasks are inoculated by adding 2.5 cm^ of a seed culture of a strain of Corynebacterium' to each flask. simplex (ATCC 6946). The culture is developed on a table rotating at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 30°C. After 48 hours the culture is well developed and the pH is 7.70. -To each flask, 2.5 cm^ of a water solution containing 10 mg of carminomycin hydrochloride per; cm^. The reduction is carried out under the same rotation conditions at 26°C.

Etter 48 timer er reduksjonen avsluttet og dyrkingsmediets pH-verdi er 8,5- Innholdet i de -80 kolbene forenes. Man tar ut en homogen prøve på 50 cm<J>dyrkingsmedium og denne prøve behandles med 25 cmJ av en boratpuffer slik at pH-verdien forhøyes til 9,0. Man ekstraherer deretter med 2 x 50 cm<J>av en blanding av metylenklorid og n-butanol i volumforholdet 70:30. De organiske ekstrakter tørkes over vannfri- natriumsulfat. Produksjonen av 32 999 RP bestemmes ved tynnsjikts kromatografi av ekstrakten på s-ilikagel. De avsatte ekstraktvolumer er 10-20 yl. Man fremkaller med en blanding av metylenklorid, maursyre og metanol i volumforholdet 80:17:3 for å After 48 hours, the reduction is finished and the culture medium's pH value is 8.5 - The contents of the -80 flasks are combined. A homogeneous sample of 50 cm<J> of culture medium is taken out and this sample is treated with 25 cmJ of a borate buffer so that the pH value is raised to 9.0. It is then extracted with 2 x 50 cm<J> of a mixture of methylene chloride and n-butanol in the volume ratio 70:30. The organic extracts are dried over anhydrous sodium sulfate. The production of 32,999 RP is determined by thin-layer chromatography of the extract on silica gel. The deposited extract volumes are 10-20 yl. It is developed with a mixture of methylene chloride, formic acid and methanol in the volume ratio 80:17:3 in order to

kunne oppnå en god spearasjon av karminomycin og '32 999 RP. Rf-.verdiene for de oppnådde produkter sammenlignes med Rf-verdiene for referanseforbindelser under samme betingelser. could achieve a good spearation of carminomycin and '32,999 RP. The Rf values of the products obtained are compared with the Rf values of reference compounds under the same conditions.

Den kvantitative bestemmelse av fremstillingen av 32 999 RP viser at kulturen av Corynebacterium simplez (ATCC 6946) reduserer karminomycinet til'32 999 RP i et utbytte på 80%, beregnet på mengden.av tilsatt karminomycin. Eksempel 2 The quantitative determination of the production of 32,999 RP shows that the culture of Corynebacterium simplez (ATCC 6946) reduces the carminomycin to 32,999 RP in a yield of 80%, calculated on the amount of added carminomycin. Example 2

Man fremstiller et dyrkingsmedium A og fordeler dette i kolber på 300-cm^ på.samme måte som i eksempel 1. A culture medium A is prepared and distributed in flasks of 300 cm^ in the same way as in example 1.

Man fremstiller dessuten er dyrkingsmedium B og fordeler dette også i 300 cm kolber. Dyrkingsmediet B har følg-ende sammensetning: Cultivation medium B is also prepared and this is also distributed in 300 cm flasks. The cultivation medium B has the following composition:

Mediets pH-verdi innstilles på 7,2 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning, hvoretter mediet sterili-' seres ved 122°C i 20 minutter. The medium's pH value is set to 7.2 by adding 1N sodium hydroxide solution, after which the medium is sterilized at 122°C for 20 minutes.

Man poder en kolbe inneholdende 50 cm^ medium A med pH-verdi 7,05 og en kolbe inneholdende 50 cm^ medium'B med pH 6,5 med hver 2,5 cm^ av én podingskultur av stammen Corynebacterium simplex (ATCC 6946). A flask containing 50 cm^ of medium A with a pH value of 7.05 and a flask containing 50 cm^ of medium B with a pH of 6.5 are inoculated with each 2.5 cm^ of one inoculation culture of the strain Corynebacterium simplex (ATCC 6946) .

Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C. Etter en egnet dyrkingstid (48 timer for medium A og 72 timer for medium B) setter man til hver kolbe 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinhydrokiorid pr. cm'). Derved oppnår man en karminomycinkonsentrasjon på 0,5 g/l. The cultures are developed on a table rotating at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 30°C. After a suitable cultivation time (48 hours for medium A and 72 hours for medium B), 2.5 cm^ of a water solution containing 10 mg of carminomycin hydrochloride is added to each flask. cm'). This results in a carminomycin concentration of 0.5 g/l.

Etter disse tilsetninger inkuberes mediene A og B i to respektive fire døgn på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med en temperatur på 26°C. After these additions, media A and B are incubated for two and four days respectively on a table that rotates at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 26°C.

Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte s.om i eksempel 1. The contents of the flasks are then treated in the same way as in example 1.

I nedenfor angitte tabell angis utbyttene av 32 999 RP, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin. The table below shows the yields of 32,999 RP, calculated on the amount of added carminomycin.

Eksempel 3 Example 3

I 300 cm^ kolber fremstilles kulturer av Corynebacterium simplex (ATCC 6946) i dyrkingsmedium A på samme måte' som i eksempel -1. Kulturene utvikles på et-bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 30°C. In 300 cm^ flasks, cultures of Corynebacterium simplex (ATCC 6946) are prepared in culture medium A in the same way as in example -1. The cultures are developed on a table that rotates at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 30°C.

Etter 30 timers' inkubering forenes innholdet i 5 kolber (250 cm^ dyrkingsmedium), og de tilstedeværende celler separeres ved sentrifugering. Den oppnådde cellemengde suspenderes deretter-i en 300 cm^ kolbe inneholdende 50 c.m^ av en M/15 fosfatpuffer med pH 8,0. På samme måte fremstilles også en annen cellesuspensjon ved' suspensjon av cellene i 50. cm^ av en m/15 fosfatpuffer med pH 5,0. Til hver kolbe, setter man deretter 2,5 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 4 mg karminomycinhydroklorid pr. cm'<1>. Karminomycinkonsentrasjonen blir. herved 0,2 g/l. After 30 hours' incubation, the contents of 5 flasks (250 cm^ culture medium) are combined, and the cells present are separated by centrifugation. The amount of cells obtained is then suspended in a 300 cc flask containing 50 cc of a M/15 phosphate buffer of pH 8.0. In the same way, another cell suspension is also prepared by suspending the cells in 50 cm 2 of a m/15 phosphate buffer with pH 5.0. To each flask, 2.5 cm^ of a water solution containing 4 mg of carminomycin hydrochloride per cm'<1>. The carminomycin concentration becomes thereby 0.2 g/l.

Kolbene inkuberes i 48 timer -under de i eksempel 1 angitte betingelser, og inneholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som i eksempel 1. The flasks are incubated for 48 hours under the conditions specified in example 1, and the contents of the flasks are then treated in the same way as in example 1.

I nedenfor følgende tabell angis utbyttene av antibiotikumet 32 999 RP, beregnet på mengden tilsatt karminomycin. The following table shows the yields of the antibiotic 32,999 RP, calculated on the amount of carminomycin added.

Eksempel 4 Example 4

. Man fremstiller et dyrkingsmedium A med pH-verd'ien 6,8 og fordeler- dette i 300 cm 3 kolber i en mengde på 50 cm -z pr. . A culture medium A with a pH value of 6.8 is prepared and this is distributed in 300 cm 3 flasks in an amount of 50 cm -z per

kolbe på samme måte som i eksempel 1. flask in the same way as in example 1.

Til flere kolber setter man'2,5 cm^ av en podingskultur av stammen Bacillus cyciooxydans (ATCC 12.673)- -Kulturen utvikles i 48 timer på et bord som roterer med 220 'omdreininger/ minutt i et rom med temperaturen 30°C. Into several flasks, 2.5 cm^ of an inoculum culture of the strain Bacillus cyciooxydans (ATCC 12,673) is added - The culture is developed for 48 hours on a table rotating at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 30°C.

Reduksjonen av- karminomycin gjennomføres deretter enten ved anvendelse av hele dyrkingsmediet hvis pH-verdi er 7,65- eller ved anvendelse av en cellesuspensjon i en puffer med pH 8,0, fremstilt på samme måte som i eksempel 3- The reduction of carminomycin is then carried out either by using the entire culture medium whose pH value is 7.65- or by using a cell suspension in a buffer with pH 8.0, prepared in the same way as in example 3-

Til hver kolbe setter man 1 cm 3 av en- vannoppløsning - inneholdende 10 mg karminomycin pr. cm^. Herved oppnås en karminomycinkonsentrasjon på 0,2 g/l. To each flask, add 1 cm 3 of a water solution - containing 10 mg of carminomycin per cm^. This results in a carminomycin concentration of 0.2 g/l.

Reduksjonen av karminomycinet gjennomføres i løpet av fire døgn-på et bord som roterer med 220 omdreininger/minutt i et rom med temperaturen 26°C. Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som i'eksempel 1. T nedenfor følgende tabell angis de oppnådde utbytter av 32 999 RP, beregnet på mengden tilsatt karminomycin. The reduction of the carminomycin is carried out over four days on a table rotating at 220 revolutions/minute in a room with a temperature of 26°C. The contents of the flasks are then treated in the same way as in example 1. The following table shows the obtained yields of 32,999 RP, calculated on the amount of carminomycin added.

Eksempel 5 Example 5

På samme måte -som i eksempel 4, fremstiller man kulturerav Bacillus cyciooxydans (ATCC 12.673) i dyrkingsmedium .A. Etter inkubering av kulturene i 48 timer setter man -karminomycin til dyrkingsmediene hvis pH-verdi er 7,65- Til hver kolbe setter man enten 1 cm^ av en vannoppløsning inneholdende 10 mg ren forbindelse/cm^(0,2 g karminomycin/1) eller 4 cm^ av en vannoppløsning inneholdende ' 10 mg/cm"<3>av et urent produkt inneholdende ±6% karminomycin' (0y13 g karmiriomycin/1)■ In the same way - as in example 4, cultures of Bacillus cyciooxydans (ATCC 12.673) are prepared in culture medium .A. After incubation of the cultures for 48 hours, -carminomycin is added to the culture media whose pH value is 7.65- To each flask, either 1 cm^ of a water solution containing 10 mg of pure compound/cm^ (0.2 g carminomycin/1 ) or 4 cm^ of an aqueous solution containing '10 mg/cm"<3>of an impure product containing ±6% carminomycin' (0y13 g carmiriomycin/1)■

Kolbene inkuberes deretter i fire døgn under de i eksempel 1 beskrevne betingelser, og innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte som. i eksempel 1. I nedenfor følg-ende tabell angis utbyttene av 32 999 RP, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin. The flasks are then incubated for four days under the conditions described in example 1, and the contents of the flasks are then treated in the same way as in example 1. The following table shows the yields of 32,999 RP, calculated on the amount of added carminomycin.

Eksempel 6 Example 6

Man fremstiller et dyrkingsmedium C med -følgende sammensetning: A cultivation medium C is prepared with the following composition:

De ovenfor angitte bestanddeler bortsett fra glukosen oppløses eller suspenderes i 900 cm^ destillert vann. The above-mentioned ingredients except the glucose are dissolved or suspended in 900 cm^ of distilled water.

Etter innstilling av pH-verdien til 7,20 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning fordeles oppløsningen i 300 cm^ kolber i en mengde på 45 cm^/kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. og avkjøles deretter. Man gjør dyrkingsmediet ferdig ved til hver kolbe sterilt å sette 5 cm^ av-en steril glukoseoppløsning inneholdende 500 g glukose/l. Det for poding ferdige medium har en pH-verdi på 7,0. After setting the pH value to 7.20 by adding 1N sodium hydroxide solution, the solution is distributed into 300 cm^ flasks in an amount of 45 cm^/flask. The flasks are sterilized at 122°C for 20 min. and then cooled. The culture medium is completed by sterilely adding 5 cm^ of a sterile glucose solution containing 500 g glucose/l to each flask. The medium ready for grafting has a pH value of 7.0.

En 300 cm^ koble inneholdende 50 cm') av det ovenfor beskrevne dyrkingsmedium .med pH 7,0 podes med 2,5 cm<J>av en podingskultur av stammen Streptomyces roseochrompgenes.(ATCC 13-400). Kulturen utvikles i 48 timer på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 30°C. De ved dyrkingen frem-stile celler samles deretter. Reduksjonen av karminomycin til antibiotikumet 32 999 RP gjennomføres med- en suspensjon av cellene i- 50-cm;> av en M/15 fosfatpuffer med pH 8,0 inneholdende 1 cm^ av en .vannoppløsning■inneholdende 10 mg karminomycinhydroklorid pr. cm^. Den opprinnelige karminomycinkonsentrasjon er altså 0,2 g/l. Reduksjonen gjennomføres i 48 timer på ét bord som roterer med 220- omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. Suspensjonen behandles på samme måte som beskrevet i eksempel 1. Utbyttet av 32 999 RP er 57%, beregnet.på mengden tilsatt karminomycin . A 300 cc tube containing 50 cc of the above-described culture medium at pH 7.0 is inoculated with 2.5 cc of a seed culture of the strain Streptomyces roseochrompgenes (ATCC 13-400). The culture is developed for 48 hours on a table rotating at 220 rpm. in a room with a temperature of 30°C. The cells produced during the cultivation are then collected. The reduction of carminomycin to the antibiotic 32,999 RP is carried out with a suspension of the cells in 50 cm of an M/15 phosphate buffer with pH 8.0 containing 1 cm of an aqueous solution containing 10 mg of carminomycin hydrochloride per cm^. The original carminomycin concentration is therefore 0.2 g/l. The reduction is carried out for 48 hours on one table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. The suspension is treated in the same way as described in example 1. The yield of 32,999 RP is 57%, calculated on the amount of carminomycin added.

Eksempel 7' Example 7'

Et dyrkingsmedium C fremstilt på samme måte som- i eksempel 6 fordeles i 300 cm^ kolber. A culture medium C prepared in the same way as in example 6 is distributed in 300 cm^ flasks.

Kolber inneholdende 50 cm'' av dette medium med en pH-verdi på 6,90 podes med 2,5 cm"<5>av en podingskultur'av' : stammen Streptomyces lavendulae (ATCC 8664). Kulturen utvikles i 40 timer på et bord som roterer med 220 omdr.Vmin. i et rom med temperaturen 26°C. Til hver kolbes dyrkingsmedium, hvis pH-'. verdi er 7,50, setter man deretter 1 cm"' av en ■ vannoppløsning inneholdende 10 mg karminomycinhydroklorid pr. cm^. Man oppnår-herved en karminomycinkonsent-ras j on på 0,2 g/l. KarminomyCinet reduseres deretter i fire timer under de samme omrørings.betingelser og ved samme temperatur som angitt, ovenfor. Innholdet i kolbene behandles deretter på samme måte- som i eks. 1. Utbyttet av 32 999 RP er 6l%, beregnet på mengden av tilsatt karminomycin. Flasks containing 50 cm" of this medium with a pH value of 6.90 are inoculated with 2.5 cm"<5> of an inoculum culture of the strain Streptomyces lavendulae (ATCC 8664). The culture is developed for 40 hours on a table rotating at 220 rpm in a room with a temperature of 26° C. To each flask's culture medium, whose pH value is 7.50, 1 cm"' of a ■ water solution containing 10 mg of carminomycin hydrochloride per . cm^. This results in a carminomycin concentration ratio of 0.2 g/l. Karminomycin is then reduced for four hours under the same stirring conditions and at the same temperature as indicated above. The contents of the flasks are then treated in the same way - as in ex. 1. The yield of 32,999 RP is 61%, calculated on the amount of carminomycin added.

Eksempel 8 (A) Gjæring. Example 8 (A) Fermentation.

I en gjæringsbeholder med volumet 170 liter tilsettes følgende stoffer: In a fermentation container with a volume of 170 litres, the following substances are added:

Etter innstilling av pH-verdien på 6,8 med 40 cm^ 10N natriumhydroksydoppløsning tilsetter man 300 g kalsiumkarbonat. After setting the pH value to 6.8 with 40 cm^ 10N sodium hydroxide solution, 300 g of calcium carbonate are added.

Mediets pH-verdi er deretter ca. 6,8. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min..Etter avkjøling er buljongens volum 120 1 og pH-verdien 8,3 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen'. The medium's pH value is then approx. 6.8. The medium is sterilized by bubbling through water vapor at 122°C for 40 min. After cooling, the volume of the broth is 120 1 and the pH value is 8.3 as a result of condensation of water vapor during the sterilization'.

Man poder med 250 cm" av en podingskultur'av stammen Corynebacterium simplex (ATCC 6946), hvilken podingskultur er fremstilt ved dyrking i en rystet kolbe. Kulturen • utvikles i 32 timer ved 30°C under omrøring dg under lufting med steril luft. Den er deretter egnet til å anvendes for poding av produksjonsmediet. One inoculates with 250 cm" of an inoculum culture of the strain Corynebacterium simplex (ATCC 6946), which inoculum culture is prepared by cultivation in a shaken flask. The culture • is developed for 32 hours at 30°C with stirring and aeration with sterile air. is then suitable to be used for inoculation of the production medium.

Produksjonsdyrkingen gjennomføres i en gjæringsbe holder med volumet 800 1 hvortil følgende stoffer settes: The production cultivation is carried out in a fermentation container with a volume of 800 1 to which the following substances are added:

Etter innstilling av -pH-verdien-til 7, 0 ved tilsetning av 460 cm ION -natriumhydroksydoppløsning steriliseres mediet ved gj ennomb.obling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling har bulj ongen- et- volum på 385 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen. Mediets volum innstilles deretter til 400 1 ved tilsetning av 15 1 av en steril vannopp-løsning inneholdende 6 kg glukosemonohydrat. After setting the -pH-value-to 7.0 by adding 460 cm of ION sodium hydroxide solution, the medium is sterilized by recirculation of steam at 122°C for 40 min. After cooling, the broth has a volume of 385 1 as a result of condensation of water vapor during sterilization. The volume of the medium is then adjusted to 400 1 by adding 15 1 of a sterile water solution containing 6 kg of glucose monohydrate.

Mediets pH-verdi er 6,8. Man poder-med. 40 1 podingskultur fra den ovenfor beskrevne dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 170<*>1. Kulturen utvikles ved 30°C under om-røring med et røreverk som roterer med loO omdr./min., og under lufting med 20 cm^ steril luft pr. time. Etter 30 timer er kulturen ferdig til anvendelse for den biokjemiske omdanning av karminomycin til 32 999 RP. ;I dyrkingsmediet innføres fire 1 av en vannoppløs-ning inneholdende 40 g karminomycinhydroklorid. ;Inkuberingen fortsettes i 17 timer ved 26°C under samme omrøring og lufting som beskrevet ovenfor. Karminomycinet reduseres til 32 999 RP i. et utbytte på nær 100%. ;(B) Utvinning. ;Til .420 1 av den ovenfor oppnådde reaksjonsoppløs-ning setter man 42 1 n-butanol og- 2,9 1 6N natriumhydroksydopp-løsning- den virksomme bestanddel ekstraheres i motstrøm med en butanol (60 volum-%) under anvendelse av to motstrømssentrifug-er. Ekstraktet som har et volum på 330 1 konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C til et volum på 20 1. ;Til det konsentrerte ekstraktet settes 20 1 metylenklorid, og den oppnådde blanding vaskes med 10 1 vann hvis pH-verdi er innstilt på 10 ved tilsetning av natriumhydroksyd-oppløsning. Vaskevannet som inneholder 32 999 RP ekstraheres 2 ganger' med 10 1 av en blanding av metylenklorid og n-butanol i et volumforhold på 80:20. ;De'tre organiske ekstraktene forenes og konsentre res deretter under et redusert trykk på 5-10 mm Hg til et volum på 15 1. Man tilsetter deretter under omrøring 0,2 1 av en blanding av n-butanol og 11N saltsyre i et ' volumforhold på 9,0:10, hvoretter man konsentrerer under et redusert trykk på 5-10 mm Hg til et volum på 5 1• ;Antibiotikumet 32 999 RP i form av hydrpklorid felles ut ved at konsentratet■tilsettes til 35 1 heksan. Utfel-lingen filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved"52 g urent 'hydroklorid av 3,2 999 RP. ;(C) Rensing. ;(a) 'Til en suspensjon av 50 g av den ovenfor oppnådde urene hydroklorid av 32 999 RP i 130 cm 3 vann setter man 520 cm^ dioksan. Den oppnådde oppløsning filtreres. ;Hydrokloridet av 32 999 RP krystalliseres deretter ved at man til filtratet setter 4 1 dioksan ved en temperatur nær 20°C. De dannede krystaller filtreres av, vaskes med diok- ;san og tørkes. Man oppnår herved 27 g halvrent hydroklorid av 32 999 RP. ;(b) 4,2 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid ;av 32 999 RP oppløses i" 0,2 1 vann. Den oppnådde'oppløsnings pH-verdi innstilles til 4,5 ved tilsetning av 10N natriumhydrok-sydoppløsning. ;Antibiotikumet i denne oppløsning fikseres på en kolonne av 0,4 1 "Amberlite .IRC 50" i syreform.' Kolonnen vaskes med 1 1 vann, med 2 1 50%-ig metanol, med 2 1 90;?-ig metanol og til slutt med 3 1 90%-ig metanol inneholdende 1% natriumklorid. Eluatet konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C til et volum på 0,5 1.. Konsentratet hvis pH-verdi innstilles til 10 ved tilsetning av 11N natriumhydrok-sydoppløsning ekstraheres med to ganger 0,5 1 kloroform og to ganger 0,5 1 av en" blanding av kloroform og n-butanol i et volumforhold på 80:20. De.organiske ekstrakter forenes og kon-, ;. sentreres 'under et redusert trykk på 5-10 mm Hg ved 40°C. Under konsentrasjonen tilsetter man 10 -cm^ n-butanol inneholdende 1 ;■volum% 11N saltsyre og 5 volurn-% vann. Konsentratet hvis volum innstilles til 30 crrP, settes langsomt til 500 cm^ heksan. -Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved' 1,26 g halvrent hydroklorid av 32 999 RP. ;Det under (a) ovenfor oppnådde halvrene "produktet ;i en mengde på 27 g oppløses i 300 cm"1 vann, og den oppnådde opp-løsning filtreres. ;Hydrokloridet av 32 999 RP krystalliseres ved at man til filtratet- setter 2,7 1 aceton ved en temperatur nær 20°C. De oppnådde krystaller filtreres av, vaskes og tørkes. 'Man-oppnår herved 17 g rent hydroklorid av 32 999 RP• ;Eksempel 9 ;50 cm^ av en kultur av Corynebacterium simplex (ATCC 6'946 ), utviklet i løpet av 30 timer under' de samme betingelser som beskrevet ovenfor i eks. 8 A, sentrifugeres sterilt ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugeringen suspenderes de oppnådde'celler i 50 cm^ M/15 fosfatpuffer med pH 7,5- Cellene underkastes deretter en ultralydbehandling ved 25 kHz.i . 15 min. ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugering tilsetter man- til den ovenstående væske 10 mg karminomycinhydroklorid. Den herved oppnådde'oppløsning inkuberes under de samme ;■betingelser som beskrevet i eks. 1. Etter 40 timer er karminomycinet redusert, til 32 999 RP i et utbytte på ca. 60%. ;Eksempel 10 ;50 cm 3 ■av en kultur av Corynebacterium simplex (ATCC 6946), utviklet i løpet'av 30 timer under de betingelser' som er angitt i eks'. 8 A, sentrifugeres sterilt ved en temperatur nær 0°C. Etter sentrifugeringen suspenderes de oppnådde celler i 50 crrr 3 tris (hydroksymetyl )aminometan-M/15 HCl-puffer med en pH på 8,1, hvoretter suspensjonen overføres til en 300 crn^ E-kolbe. Man tilsetter .deretter 25 mg'etylendiamintetra-eddiksyre, 25 mg cetyltrimetylamrnoniumbromid og 200 mg lysozym. Kolben holdes deretter i 1 time ved 37°C på et bord som roterer med 220 omdr./min. Etter sentrifugering tilsetter man til den overstående væske■5 mg karminomycinhydroklorid. Den herved oppnådde oppløsning inkuberes under de samme betingelser som beskrevet i eks. 1. Etter- 40 timer er karminomycinet redusert til 32 999 RP i et utbytte på ca. 30%. ;Eksempel 11 ;0,5 g rent hydroklorid av 32 999 RP hydrolyseres ved at det oppløses i 50 cm<:>>vann inneholdende 10 cnr<3>11N saltsyre. Den oppnådde oppløsning oppvarmes til koking i to timer. En krystallinsk utfelling av aglykonet dannes under denne hydrolyse. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår 0,3 g rent aglykon. ;Eksempel 12 ;Man fremstiller et■dyrkingsmedium A med følgende sammensetning: ; Den oppnådde suspensjonens pH-verdi innstilles til 6,5 ved tilsetning av 1 cm ION natriumhydroksydoppløsnmg. Man tilsetter deretter 19 g glycerol (d = 1,26), 2 g kaliumkarbonat og destillert vann til tilsammen • 1000 cm^. ;Det oppnådde dyrkingsmedium fordeles i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm'5 pr. kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling er mediets pH-verdi 5,9- Man fremstiller dessuten er steril oppløsning som inneholder 10 mg sulfanilamid pr. cm^ og har en pK-verdi .på 9,0, ved oppløsning av sulfanilamid i en blanding av 5N- natriumhydroksydoppløsning og destillert vann og etterfølgende filtrering gjennom "Milli-pore-membraner" (0,45 ym). ;Kolbene med det -sterile medium A fordeles i seks grupper på to kolber hver. ;Til kolbene i gruooe A-, settes intet sulfanilamid. Til kolbene i ele fem andre grupper settes sulfanilamid i følgende mengder: ;Gruppe A-: 1 cm^ av sulfanilamidoppløsningen (0,2 g/l) ;Gruppe A,: 2 cm av silfanilamidoppløsningen (0,4 g/l)- ;Gruppe A^:3 cm av sulfanilamidoppløsningen (0,6 g/l) ;.Gruppe A,5 -: 4 cm^ v av sulf anilamidoppløsningen (0,8 g/l) ;Gruppe Ag: 1 cm av sulf anilamidoppløsningen (0., 2 g/l) ;Samtlige kolber i de seks grupper podes med 2,5 cm^ av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruloe-rubidus DS 7126 (NRRL 8098). ;Kulturene utvikles på et bord som roterer med 2.20 omdr./min. i et rom med temperaturen 26 C. Til kolbene i gruppe Ag settes ytterligere 1 cm 3 su"lfanilamidoppløsning etter 48 henholdsvis 72 timers inkubering (den totale sulfanilamidkonsen-trasjon er-altså 0,6-g/l). Etter var og en av disse tilsetninger fortsettes inkuberingen av kolbene under de ovenfor angitte betingelser. ;Etter syv døgns inkubering behandles'samtidig en .kolbe fra hver gruppe for bestemmelse av mengden 32 999 RP. Denne- behandling skjer ved at man til hver kolbe setter 4 g oksalsyre (herved innstilles mediets pH-verdi til 1,5-) og 50 cm absolutt etanol. Kolben lukkes deretter hermetisk og plasseres i en time på et bord som roterer med 220 omdr./min. Blandingen filtreres deretter gjennom filterpapir, og filtratet dampes inn under redusert trykk ved 50°C til halvparten av sitt opprinnelige volum (50 cm ) . Konsentratets pH-verdi innstilles til 4.,5 ved tilsetning av 5N natriumhydroksydoppløsning og deretter tilsetter man i tur'og orden 50 cm^ av en blanding av metylenklorid'og n-butanol'i volumf orholdet 80:20 og 25 cm^ 0,5 M\ b.oratpuf f er med pH 9,0."Etter omrøring i en kolbe samles" ved dekantering den fargede oppløsningsmiddelsfase, og man gjentar behandlingen ved de vannholdige moderlut-ene, som ekstraheres med 50 cm 3 av samme oppløsningsmiddelblanding. De organiske fasene forenes og tørkes over vannfri natriumsulfat. D'en organiske fasens volum innstilles til slutt på 100 cm'' ved tilsetning av samme oppløsningsmiddelblanding. ;Produksjonen av 32 999 RP bestemmes ved tynnsjikts-' kromatografi av disse .ekstrakter: (1) Man foretar en kvalitativ bedømmelse av produksjonen ved på silikagelplater ("Merck 60" - glassunderlag uten fluoressensindikator) og avsette 100 pl ekstrakt og 2,5-10 ug rent 32 999 RP som referansemateriale. Platene fremkalles med en blanding av metylenklorid, etanol, eddiksyre og vann i et volumforhold på 80:20:10:4. Det eventuelle nærvær av 32 999 RP i ekstraktet påvises etter fremkalling ved at kromatogrammet undersøkes enten i dagslys eller i ultrafiolett lys med en bølgelengde på 254 nm. (2) Produksjonen av 32 999 R? måles kvantitativt ved at man på silikagelplater ("Merck 60 F 254" - glassunderlag med fluoressensindikator) avsetter ekstraktvolumer mellom 10 og 100 yl, hvorved det avsatte volum bestemmes på grunnlag av den kvali-tative tynnsjiktskromatografi. På andre slike plater .avsettes også ren 32 999 RP i en skala fra 0,5- 1,5 ug. Platene frem-' kalles med det ovenfor beskrevne oppløsningsmiddelsystem. Etter fremkallingen undersøkes platene ved'hjelp av en "Chromoscan"-plate, som registrerer topper tilsvarende mengden'32 999 RP■ -Man sammenligner flatene' av de topper som tilsvarer mengdene 32 999 ;RP i ekstraktene med flatene av de topper som tilsvarer de avsatte mengder ren 32 999 RP, og på denne måte -kan man bestemme den dannede mengde av 32 999 RP i dyrkingsoppløsningene. De oppnådde resultater er anført i nedenfor følgende tabell. ; Eksempel 13 ;Et dyrkingsmedium A fordeles- på samme måte som i ;3 3 ;eks. 12 i 300 cm kolber i en mengde av 50 cm pr. kolbe. Man fremstiller også en tilsvarende sulfanilamidoppløsning (10 mg/cm^) som i eksempel 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire ;■grupper (A-^, A' ^, A^ og A'^) på hver to kolber. Til hver kolbe i gruppene A^ og A'^setter man 4 c'm^ av sulf anilamidoppløsningen (0,8 g sulfanilamid-pr. 1). Til kolbene i'gruppene A-, og A'^settes ingen sulfanilamid. ;3Kolbene i gruppene A1 og Aq podes deretter med 2,5' cm av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleo- ■ rubidus DS 8899 (NRRL 3046), og kolbene i gruppene A^ og A'5podes med 2,5 cm^ av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045). ;Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr/min. i et rom med temperaturen 26°C. Etter 7 døgns inkubering under disse betingelser bestemmes mengden av dannet'32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er ; Eksempel 14 ;Et dyrkingsmedium A fordeles på samme måte spiri i ;3 o 3 ;eks. 12 i 300 cm kolber i en mengde pa 50 cm pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfanilamidoppløsning ;(10 mg/cm 3) på samme måte som i eks. 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i- fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i'gruppe A^. settes ingen sulfanilamid, men til kolbene i de øvrige grupper settes sulfanilamid i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe Ap: 1 cm 3sulfanilamidoppløsning. (0,2 g/l) ;Gruppe A^.: ' 2 cm 3sulf anilamidoppløsning (0,4 g/l) ;Gruppe A^: 3 cm sulfanilamidoppløsning (0,6 g/l) ;Etter disse tilsetninger podes alle kolbene i samtlige grupper A-^-A^ med 2,5 cm."5av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRL 3539). ;Kulturene.utvikles på et bord.som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. Etter inkubering i 7 døgn under disse betingelser bestemmes de dannede'mengder ;32 999 RP på samme måte som i eks'. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ; Eksempel 15 ;Man fremstiller et dyrkingsmedium B med følgende sammensetning: ; Dette medium hvis pH-verdi innstilles på 7,20 ved tilsetning av IN natriumhydroksydoppløsning, fordeles i' 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^-pr. kolbe og steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling har mediet en pH-verdi på 6,60. ;Man fremstiller en tilsvarende vannoppløsning av sulfanilamid som beskrevet i eks.. 12. ;Kolber inneholdende sterilt medium B fordeles' i ;to grupper B^og B~på hver to kolber.'Til hver -kolbe i gruppe B^setter man 2 cm3 av sulfanilamidoppløsningen (0,4 g sulfanilamid pr. liter). Til kolbene i gruppe B^settes ingen 'sulfanilamid . Man poder deretter samtlige kolber i gruppene Bn og B~med 2,5 cm av en 72 timer gammel, podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045).'Kulturen utvikles på ;et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom-med temperaturen 26°C. Etter 7 døgns poding under disse betingelser behandles innholdet i kolbene på samme måte som i eks. 12 for bestemmelse av de dannede mengder- 32 999 RP• De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ; ; Eksempel 16 ;På samme måte som i eks. 12 fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm 3 kolber i en mengde på 50 cm 3 pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfatiazoloppløsning (10 mg/cm^)under de samme betingelser som angitt i eks. 12 for ;fremstilling av sulfamilamidoppløsningen. ;Kolber inneholdende sterilt, medium A fordeles i fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^ settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre gruppene settes sulfatiazol i følgende mengder: ;Gruppe A7: 0,25 ctn^ sulfatiazoloppløsning (0,05 g/l) ;Gruppe Ag: 1 cm sulfatiazoloppløsning (0,2 g/l) ;Gruppe A^: 0,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,1 g/1) ;Man poder deretter samtlige kolber med -2,5 cm^ av en 73 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus ;■DS 7126 (NRRL 8098). Kulturene utvikles på et'-bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen'26°C. Til kolbene i gruppe Ag settes ytterligere 0,5 cmJ -sulfatiazoloppløsning etter 48 henholdsvis 72 timers inkubering-(den totale sulfatia-zolkonsentrasjon er altså 0,3 g/D- Etter hver og en av disse tilsetninger fortsettes inkuberingen under de ovenfor angitte betingelser.. ;Etter inkubering i 7 døgn bestemmes de dannede mengder 32 999'RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor angitte tabell. ; Eksempel 17 ;På samme måte som i eks. 12 fordeles et dyrkingsmedium A i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^ pr. kolbe. ;Man fremstiller også en sulfatiazoloppløsning ;(10 mg/cm^).<p>å samme måte som'i eks. l6. ;Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper, på hver to kolber."Til kolbene i gruppe A-^ settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre grupper settes sulfatiazol i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe A^Q: 0,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,1 g/l) ;Gruppe A-^: 2 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,4 g/l) ;Gruppe A12: 2,5 cm^ sulfatiazoloppløsning (0,5 g/l) ;Samtlige kolber podes deretter med 2,5 cm'1 av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. ;Etter syv døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følg-ende tabell.1 ; ; Eksempel 18 ;På samme måte som i eksempel 12- fordeles et dyrkingsmedium A' i 300 cm^ kolber i en mende på 50 cm^ pr. kolbe. ;Man fremstiller også'en sulfatiazoloppløsning ;(10 mg/cm"<1>) på samme måte som i eks. 16'. ;Kolber inneholdende sterilt medium.A ' fordeles i fire grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^settes ingen sulfatiazol, men til kolbene i de andre grupper settes sulfatiazol i nedenfor angitte mengder: ;Gruppe A1Q: 0,5 cm x sulfatiazoloppløsning (0,1 g/l) ;Gruppe Ag : 1 cm'5 sulf atiazoloppløsning- (0,2 g/l) ;Gruppe 2 cm^ sulf atiazoloppløsning (0,4 g/l) ;Samtlige kolber podes deretter med 2,5 cm; av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 23-219 (NRRL 3539). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr./min. i et rom med temperaturen 26°C. ;Etter syv døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP pa samme måte som i eks. ;12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. ; Eksempel 19 ;Man fremstiller et dyrkingsmedium C inneholdende følgende stoffer: ; Man fremstiller mediet på følgende måte. Man koker først bønnene i en autoklav med 50 cm'' destillert vann i 45 min." ved 122°C, hvoretter man fremstiller'en pure av. bønnene. Man tilsetter deretter dranken, soyaoljen og koboltkloridet samt destillert vann til et totalt volum på 900 cm"<*.> The medium's pH value is 6.8. One grafts with. 40 1 inoculum culture from the above-described cultivation in the fermentation vessel with a volume of 170<*>1. The culture is developed at 30°C under agitation with an agitator rotating at 100 rpm, and under aeration with 20 cm^ of sterile air per minute. hour. After 30 hours, the culture is ready for use for the biochemical conversion of carminomycin to 32,999 RP. Four 1 of a water solution containing 40 g of carminomycin hydrochloride are introduced into the culture medium. ;The incubation is continued for 17 hours at 26°C under the same stirring and aeration as described above. The carminomycin is reduced to 32,999 RP in. a yield of close to 100%. ;(B) Extraction. To .420 1 of the reaction solution obtained above, 42 1 n-butanol and 2.9 1 6N sodium hydroxide solution are added - the active ingredient is extracted countercurrently with a butanol (60% by volume) using two countercurrent centrifuges -is. The extract, which has a volume of 330 1, is concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg at 40°C to a volume of 20 1. To the concentrated extract is added 20 1 of methylene chloride, and the resulting mixture is washed with 10 1 of water if The pH value is set to 10 by adding sodium hydroxide solution. The wash water containing 32,999 RP is extracted twice with 10 1 of a mixture of methylene chloride and n-butanol in a volume ratio of 80:20. The three organic extracts are combined and then concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg to a volume of 15 1. 0.2 1 of a mixture of n-butanol and 11N hydrochloric acid is then added while stirring in a volume ratio of 9.0:10, after which one concentrates under a reduced pressure of 5-10 mm Hg to a volume of 5 1; The antibiotic 32,999 RP in the form of hydrochloride is precipitated by adding the concentrate to 35 1 of hexane. The precipitate is filtered off, washed and dried. 52 g of impure hydrochloride of 3.2 999 RP is thereby obtained. (C) Purification. ;(a) To a suspension of 50 g of the impure hydrochloride of 32 999 RP obtained above in 130 cm 3 of water is added 520 cm^ of dioxane. The solution obtained is filtered. The hydrochloride of 32,999 RP is then crystallized by adding 4 l of dioxane to the filtrate at a temperature close to 20° C. The crystals formed are filtered off, washed with dioxane and dried. 27 g of semi-pure hydrochloride of 32,999 RP is thereby obtained. (b) 4.2 g of the impure hydrochloride obtained above, of 32,999 RP, is dissolved in 0.2 1 of water. The pH value of the obtained solution is adjusted to 4.5 by adding 10N sodium hydroxide solution. The antibiotic in this solution is fixed on a column of 0.4 1 "Amberlite . IRC 50" in acid form.' The column is washed with 1 l of water, with 2 l of 50% methanol, with 2 l of 90% methanol and finally with 3 l of 90% methanol containing 1% sodium chloride. The eluate is concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg at 40°C to a volume of 0.5 1. The concentrate, whose pH value is adjusted to 10 by adding 11N sodium hydroxide solution, is extracted with twice 0.5 1 chloroform and twice 0.5 L of a mixture of chloroform and n-butanol in a volume ratio of 80:20. The organic extracts are combined and concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg at 40 °C. During the concentration, 10 cm^ of n-butanol containing 1% by volume of 11N hydrochloric acid and 5% by volume of water are added. The concentrate, whose volume is set to 30 crrP, is slowly added to 500 cm^ of hexane. -The precipitate obtained is filtered off , washed and dried. 1.26 g of semi-pure hydrochloride of 32,999 RP is obtained. solution is filtered. The hydrochloride of 32,999 RP is crystallized by adding 2.7 1 acetone to the filtrate at a temperature close to 20°C. The obtained NOK The whey is filtered off, washed and dried. 17 g of pure hydrochloride of 32,999 RP; Example 9; 50 cm^ of a culture of Corynebacterium simplex (ATCC 6'946), developed during 30 hours under the same conditions as described above in ex. 8 A, is sterile centrifuged at a temperature close to 0°C. After the centrifugation, the cells obtained are suspended in 50 cm 3 M/15 phosphate buffer with pH 7.5. The cells are then subjected to an ultrasound treatment at 25 kHz. 15 min. at a temperature close to 0°C. After centrifugation, add 10 mg of carminomycin hydrochloride to the supernatant liquid. The solution thus obtained is incubated under the same conditions; conditions as described in ex. 1. After 40 hours, the carminomycin has been reduced to 32,999 RP in a yield of approx. 60%. Example 10 50 cm 3 of a culture of Corynebacterium simplex (ATCC 6946), developed during 30 hours under the conditions indicated in ex. 8 A, is sterile centrifuged at a temperature close to 0°C. After the centrifugation, the cells obtained are suspended in 50 ml of tris(hydroxymethyl)aminomethane M/15 HCl buffer with a pH of 8.1, after which the suspension is transferred to a 300 ml E-flask. 25 mg of ethylenediaminetetraacetic acid, 25 mg of cetyltrimethylammonium bromide and 200 mg of lysozyme are then added. The flask is then kept for 1 hour at 37°C on a table rotating at 220 rpm. After centrifugation, 5 mg of carminomycin hydrochloride is added to the supernatant liquid. The solution thus obtained is incubated under the same conditions as described in ex. 1. After 40 hours, the carminomycin has been reduced to 32,999 RP in a yield of approx. 30%. ;Example 11 ;0.5 g of pure hydrochloride of 32,999 RP is hydrolysed by dissolving it in 50 cm<:>>water containing 10 cnr<3>11N hydrochloric acid. The obtained solution is heated to boiling for two hours. A crystalline precipitate of the aglycone is formed during this hydrolysis. The formed precipitate is filtered off, washed and dried. 0.3 g of pure aglycone is obtained. ;Example 12 ;A cultivation medium A is prepared with the following composition: ; The pH value of the obtained suspension is adjusted to 6.5 by adding 1 cm of ION sodium hydroxide solution. 19 g of glycerol (d = 1.26), 2 g of potassium carbonate and distilled water are then added to a total of 1000 cm^. ;The culture medium obtained is distributed in 300 cm^ flasks in an amount of 50 cm'5 per flask. The flasks are sterilized at 122°C for 20 min. After cooling, the medium's pH value is 5.9 - A sterile solution containing 10 mg of sulfanilamide per cm^ and has a pK value of 9.0, by dissolving sulfanilamide in a mixture of 5N sodium hydroxide solution and distilled water and subsequent filtration through "Milli-pore membranes" (0.45 µm). The flasks with the -sterile medium A are divided into six groups of two flasks each. No sulfanilamide is added to the flasks in group A-. Add sulfanilamide in the following quantities to the flasks in each of the other five groups: ;Group A-: 1 cm^ of the sulfanilamide solution (0.2 g/l); Group A,: 2 cm of the sulfanilamide solution (0.4 g/l)-; Group A^: 3 cm of the sulfanilamide solution (0.6 g/l);. Group A,5 -: 4 cm^ v of the sulf anilamide solution (0.8 g/l); Group Ag: 1 cm of the sulf anilamide solution (0.2 g/l); All flasks in the six groups are inoculated with 2, 5 cm^ of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruloe-rubidus DS 7126 (NRRL 8098). The cultures are developed on a table that rotates at 2.20 rpm. in a room with a temperature of 26 C. An additional 1 cm 3 of sulfanilamide solution is added to the flasks in group Ag after 48 and 72 hours of incubation respectively (the total sulfanilamide concentration is therefore 0.6 g/l). After each of these additions, the incubation of the flasks is continued under the conditions stated above. After seven days' incubation, one flask from each group is treated at the same time to determine the amount of 32,999 RP. This treatment takes place by adding 4 g of oxalic acid to each flask (thereby the pH of the medium is adjusted to 1.5-) and 50 cm absolute ethanol. The flask is then hermetically sealed and placed for one hour on a table rotating at 220 rpm. The mixture is then filtered through filter paper, and the filtrate is evaporated under reduced pressure at 50°C to half of its original volume (50 cm ). The pH value of the concentrate is adjusted to 4.5 by adding 5N sodium hydroxide solution and then 50 cm 3 of a mixture of methylene chloride and n-butanol'in the volume ratio 80:20 and 25 cm^ 0.5 M\ b.oratpuf f is with pH 9.0. "After stirring in a flask, the colored solvent phase is collected" by decantation, and the treatment is repeated with the aqueous mother liquors, which are extracted with 50 cm 3 of the same solvent mixture. The organic phases are combined and dried over anhydrous sodium sulfate. The volume of the organic phase is finally adjusted to 100 cm" by adding the same solvent mixture. The production of 32,999 RP is determined by thin-layer chromatography of these extracts: (1) A qualitative assessment of the production is carried out by placing on silica gel plates ("Merck 60" - glass substrate without fluorescence indicator) and depositing 100 pl of extract and 2.5- 10 ug pure 32,999 RP as reference material. The plates are developed with a mixture of methylene chloride, ethanol, acetic acid and water in a volume ratio of 80:20:10:4. The possible presence of 32,999 RP in the extract is detected after development by examining the chromatogram either in daylight or in ultraviolet light with a wavelength of 254 nm. (2) The production of 32,999 R? is measured quantitatively by depositing extract volumes between 10 and 100 µl on silica gel plates ("Merck 60 F 254" - glass substrate with fluorescence indicator), whereby the deposited volume is determined on the basis of qualitative thin-layer chromatography. On other such plates, a mere 32,999 RP is also deposited on a scale of 0.5-1.5 ug. The plates are developed with the solvent system described above. After development, the plates are examined with the aid of a "Chromoscan" plate, which registers peaks corresponding to the amount of 32,999 RP - One compares the areas of the peaks corresponding to the amounts of 32,999 RP in the extracts with the areas of the peaks corresponding to the deposits amounts of pure 32,999 RP, and in this way the amount of 32,999 RP formed in the culture solutions can be determined. The results obtained are listed in the following table. ; Example 13 ;A culture medium A is distributed in the same way as in ;3 3 ;ex. 12 in 300 cm flasks in a quantity of 50 cm per flask. A corresponding sulfanilamide solution (10 mg/cm^) is also prepared as in example 12. Flasks containing sterile medium A are divided into four; groups (A-^, A' ^, A^ and A'^) of two flasks each. To each flask in groups A^ and A'^ add 4 cm^ of the sulfanilamide solution (0.8 g of sulfanilamide per 1). No sulfanilamide is added to the flasks in groups A-, and A'. ;3 The flasks in groups A1 and Aq are then inoculated with 2.5' cm of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046), and the flasks in groups A^ and A'5 are inoculated with 2.5 cm^ of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045). The cultures are developed on a table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. After 7 days of incubation under these conditions, the amount of formed'32,999 RP is determined in the same way as in ex. 12. The results achieved are; Example 14: A cultivation medium A is distributed in the same way to germinate in ;3 o 3 ;ex. 12 in 300 cm flasks in a quantity of 50 cm per flask. A sulfanilamide solution (10 mg/cm 3 ) is also prepared in the same way as in ex. 12. Flasks containing sterile medium A are divided into four groups of two flasks each. To the flasks in'group A^. no sulfanilamide is added, but sulfanilamide is added to the flasks in the other groups in the quantities indicated below: Group Ap: 1 cm 3 sulfanilamide solution. (0.2 g/l) ;Group A^.: ' 2 cm 3sulfanilamide solution (0.4 g/l) ;Group A^: 3 cm sulfanilamide solution (0.6 g/l) ;After these additions, inoculate all the flasks in all groups A-^-A^ with 2.5 cm."5 of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces bifurcus DS 23.219 (NRRL 3539). ;The cultures.are.developed on a table.rotating at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. After incubation for 7 days under these conditions, the amounts formed are determined; 32,999 RP in the same way as in ex'. 12. The results obtained are compiled in the following table below. ; Example 15 ; Man prepares a culture medium B with the following composition: This medium whose pH value is adjusted to 7.20 by adding 1N sodium hydroxide solution, distributed in 300 cm^ flasks in an amount of 50 cm^ per flask and sterilized at 122°C for 20 min. After cooling, the medium has a pH value of 6.60. ;An equivalent aqueous solution of sulfanilamide is prepared as described in ex. 12. ;Flasks containing sterile medium B is divided into two groups B and B in two flasks each. To each flask in group B, 2 cm3 of the sulfanilamide solution (0.4 g sulfanilamide per liter) is added. No sulfanilamide is added to the flasks in group B. All flasks in groups Bn and B are then inoculated with 2, 5 cm of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 31-723 (NRRL 3045).' The culture is developed on a table rotating at 220 rpm in a room with a temperature of 26° C. After 7 days of inoculation under these conditions, the contents of the flasks are treated in the same way as in example 12 to determine the amounts formed - 32,999 RP The results obtained are compiled in the following table. ; ; Example 16 ;In the same way as in example 12, a cultivation medium A is distributed in 300 cm 3 flasks in an amount of 50 cm 3 per flask. ;Man also prepare a sulfathiazole solution (10 mg/cm^) under the same conditions as stated in ex. 12 for the preparation of the sulfamylamide solution. Flasks containing sterile, medium A are divided into four groups of two flasks each. To the flasks in group A^ are added no sulphathiazole, but sulphathiazole is added to the flasks in the other groups in the following amounts: ;Group A7: 0.25 ctn^ sulphathiazole solution (0.05 g/l) ;Group Ag: 1 cm sulphathiazole solution (0.2 g/l) ; Group A^: 0.5 cm^ sulfathiazole solution (0.1 g/1); All flasks are then inoculated with -2, 5 cm^ of a 73-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus; DS 7126 (NRRL 8098). The cultures are developed on a table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. An additional 0.5 cmJ of sulfathiazole solution is added to the flasks in group Ag after 48 or 72 hours of incubation (the total sulfathiazole concentration is therefore 0.3 g/D- After each of these additions, the incubation is continued under the conditions stated above. ;After incubation for 7 days, the formed amounts of 32,999'RP are determined in the same way as in example 12. The results obtained are compiled in the table below. ;Example 17 ;In the same way as in example 12, a culture medium A is distributed in 300 cm^ flasks in an amount of 50 cm^ per flask. A sulfathiazole solution (10 mg/cm^) is also prepared. <p>in the same way as in example 16. ; Flasks containing sterile medium A distributed into four groups, each with two flasks. "No sulfathiazole is added to the flasks in group A-^, but sulfathiazole is added to the flasks in the other groups in the quantities indicated below: ;Group A^Q: 0.5 cm^ sulfathiazole solution (0 .1 g/l) ;Group A-^: 2 cm^ sulfathiazole solution (0.4 g/l) ;Group A12: 2.5 cm^ sulfathiazole solution (0.5 g/l); All flasks are then inoculated with 2.5 cm'1 of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 31.723 (NRRL 3045). The cultures are developed on a table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. ;After seven days' incubation under these conditions, the formed amounts of 32,999 RP are determined in the same way as in ex. 12. The results obtained are compiled in the following table.1; ; Example 18: In the same way as in example 12, a culture medium A' is distributed in 300 cm^ flasks in a volume of 50 cm^ per flask. A sulfathiazole solution (10 mg/cm<1>) is also prepared in the same way as in example 16. Flasks containing sterile medium A are divided into four groups of two flasks each. No sulfathiazole is added to the flasks in group A^, but sulfathiazole is added to the flasks in the other groups in the following amounts: ;Group A1Q: 0.5 cm x sulfathiazole solution (0.1 g/l); ;Group Ag: 1 cm'5 sulf atiazole solution- (0.2 g/l) ;Group 2 cm^ sulf atiazole solution (0.4 g/l) ;All flasks are then inoculated with 2.5 cm; of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces bifurcus DS 23-219 (NRRL 3539). The cultures are developed on a table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. ;After seven days' incubation under these conditions, the formed amounts of 32,999 RP are determined in the same way as in ex. ;12. The results obtained are compiled in the table below. ; Example 19 A cultivation medium C containing the following substances is prepared: ; The medium is produced in the following way. The beans are first boiled in an autoclave with 50 cm of distilled water for 45 minutes at 122°C, after which a puree is made from the beans. The liquor, soy oil and cobalt chloride and distilled water are then added to a total volume of 900 cm"<*.>

Blandingens pH-verdi innstilles til 7,2 ved tilsetning av 5N natriumhydroksydoppløsning. Blandingen fordeles i 300 cm"<i>kolber i en mengde på 4 5 cm'' pr., kolbe. Kolbene steriliseres ved 122°C i 20 min. Etter avkjøling tilsetter man sterilt til hver kolbe 5 crn^ av en steril oppløsning inneholdende 15% glukose. Det. oppnådde sterile mediums pH-verdi er 6,70. The pH value of the mixture is adjusted to 7.2 by adding 5N sodium hydroxide solution. The mixture is distributed in 300 cm"<i>flasks in an amount of 4 5 cm'' per flask. The flasks are sterilized at 122°C for 20 min. After cooling, 5 crn^ of a sterile solution containing 15% glucose The resulting sterile medium's pH value is 6.70.

Man fremstiller- også en vannoppløsning av sulfatiazol på samme måte som i eks. 16. A water solution of sulfathiazole is also prepared in the same way as in ex. 16.

Kolber inneholdende sterilt medium C fordeles i Flasks containing sterile medium C are dispensed into

to grupper C^og Cp på hver to kolber. Til kolbene i gruppe C^. settes intet sulfatiazol, men til hver- kolbe i gruppe C0settes 0,5 cm^. sulf atiazoloppløsning (0 ,• 1 g sulfatiazol pr. 1). two groups C^and Cp of two flasks each. For the flasks in group C^. no sulfathiazole is added, but 0.5 cm^ is added to each flask in group C0. sulfathiazole solution (0 .• 1 g sulfathiazole per 1).

Samtlige kolber podes deretter med 2,5 omJ av en All flasks are then inoculated with 2.5 omJ of one

72 timer gammel podingskultur av Streptomyces bifurcus DS 2-3. 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces bifurcus DS 2-3.

219 (NRRL 3539). Kulturene utvikles på et bord som roterer med 220 omdr.Vmin. i et rom med temperaturen 26°C. Etter 10" døgns inkubering under disse betingelser bestemmes de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater 219 (NRRL 3539). The cultures are developed on a table that rotates at 220 rpm. in a room with a temperature of 26°C. After 10 days of incubation under these conditions, the amounts formed 32,999 RP are determined in the same way as in example 12. The results obtained

er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. are compiled in the table below.

Eksempel 20 Example 20

På sammé måte som i eks. 12 fordeler man et.dyrkingsmedium A i 300 cm^ kolber i en mengde på 50 cm^ pr. kolbe. In the same way as in ex. 12 one distributes a culture medium A in 300 cm^ flasks in an amount of 50 cm^ per flask.

Man fremstiller deretter en sulfapyridazinoppløs-ning (10 mg/cm^) ved a oppløse sulfapyridazin i en blanding av destillert vann og 5N saltsyre. Den oppnådde'oppløsning hvis pH-verdi er 2,0, steriliseres ved filtrering gjennom "Millipore"-membraner (0,45 um). A sulfapyridazine solution (10 mg/cm^) is then prepared by dissolving sulfapyridazine in a mixture of distilled water and 5N hydrochloric acid. The obtained solution whose pH value is 2.0 is sterilized by filtration through "Millipore" membranes (0.45 µm).

Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i tre grupper på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A^.settes intet sulfapyridazin, men til kolbene i de øvrige grupper settes sterilt sulfapyridazin i følgende mengder: Flasks containing sterile medium A are divided into three groups of two flasks each. No sulfapyridazine is added to the flasks in group A, but sterile sulfapyridazine is added to the flasks in the other groups in the following amounts:

Gruppe A, • 0,5 cm'' sulfapyridazinoppløsning (0,1 g/l) Group A, • 0.5 cm'' sulfapyridazine solution (0.1 g/l)

Gruppe A-j^: 1 om<3>sulf apyridazinoppløsning (0,2 g/l) Group A-j^: 1 om<3>sulf apyridazine solution (0.2 g/l)

Samtlige kolber podes deret. t• er med 2,5 cm 3av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS All flasks are inoculated there. t• is with 2.5 cm 3 of a 72-hour-old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS

7126 (NRRL 8098) . 7126 (NRRL 8098) .

Kulturene inkuberes i syv døgn under de samme betingelser som er beskrevet i eksempel 12. Man bestemmer deretter de dannede mengder 32 999 RP på samme måte som i eks. 12. The cultures are incubated for seven days under the same conditions as described in example 12. The amounts formed, 32,999 RP, are then determined in the same way as in ex. 12.

De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. The results obtained are compiled in the table below.

Eksempel 21- Example 21-

På samme måte som i eksempel 12 fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm'' kolber i en.mengde på 50 cm^/kolbe. In the same way as in example 12, a cultivation medium A is distributed in 300 cm'' flasks in an amount of 50 cm^/flask.

Man fremstiller dessuten en ametopterinoppløsning (20 mg/cm^) ved å oppløse ametopterin i en blanding av destillert vann og 5N natriumhydroksydoppløsning. Den oppnådde opp-løsning hvis .pH-verdi er 10,0 steriliseres ved filtrering gjennom. "Millipore"-membraner (0o 4 5 ym). An amethopterin solution (20 mg/cm^) is also prepared by dissolving amethopterin in a mixture of distilled water and 5N sodium hydroxide solution. The obtained solution whose pH value is 10.0 is sterilized by filtration through. "Millipore" membranes (0o 4 5 ym).

Kolber inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper (A-^A-^, A-^og A^) på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A-^settes intet ametopterin. Til kolbene i de tre andre grupper settes ametopterin i følgende mengder: Flasks containing sterile medium A are divided into four groups (A-^A-^, A-^and A^) of two flasks each. No amethopterin is added to the flasks in group A-^. Add amethopterin in the following amounts to the flasks in the other three groups:

Gruppe A,,-: 0,25 cm^ ametopterinoppløsning (0,1 g/l) Group A,,-: 0.25 cm^ amethopterin solution (0.1 g/l)

Gruppe A-^g: 0,6 cm 3 ametopterinoppløsning (0,24 g/l) Group A-^g: 0.6 cm 3 amethopterin solution (0.24 g/l)

Gruppe A1^: 1 cm^ ametopterino<p>pløsning (0,4 g/l) Group A1^: 1 cm^ amethopterin<p>solution (0.4 g/l)

3' Samtlige kolber podes deretter med 2,5' cm av en 72 timer gammel podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098). Kulturene inkuberes .i 7 døgn under omrør-ing på samme måte som i eks. 12. De dannede mengder 32 999 RP bestemmes deretter på samme måte som i eks. 12. De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor .følgende tabell. 3' All flasks are then inoculated with 2.5' cm of a 72 hour old inoculum culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098). The cultures are incubated for 7 days with stirring in the same way as in ex. 12. The formed amounts of 32,999 RP are then determined in the same way as in ex. 12. The results obtained are compiled in the following table.

Eksempel 22 . Example 22.

På samme måte som i eksempel 12, fordeler man et dyrkingsmedium A i 300 cm kolber i en mengde på 50 ■cm"' pr. kolbe. Man fremstiller dessuten en barbitaloppløsning (50 mg/ cm^) ved å oppløse barbital i en blanding av destillert vann In the same way as in example 12, a culture medium A is distributed in 300 cm flasks in an amount of 50 cm"' per flask. A barbital solution (50 mg/cm^) is also prepared by dissolving barbital in a mixture of distilled water

■og 5N natriumhydroksydoppløsning. Den oppnådde oppløsning hvis pH-verdi er 11,0 steriliseres ved filtrering gjennom "Millipore"-membraner (0,45 ym). ■and 5N sodium hydroxide solution. The obtained solution whose pH value is 11.0 is sterilized by filtration through "Millipore" membranes (0.45 µm).

Kolber ■ inneholdende sterilt medium A fordeles i fire grupper (A-^, A-^g,A^og A?Q) på hver to kolber. Til kolbene i gruppe A1 settes intet barbital. Til kolbene i gruppene A-j^q og A^ g settes barbital i følgende mengder: Flasks ■ containing sterile medium A are divided into four groups (A-^, A-^g, A^and A?Q) of two flasks each. No barbital is added to the flasks in group A1. Add barbital in the following quantities to the flasks in groups A-j^q and A^g:

Gruppe A-^g: 0,5 cm^ barbitaloppløsning (0,5'g/l) Group A-^g: 0.5 cm^ barbital solution (0.5'g/l)

Gruppe A-^: 2 cm^ .barbitaloppløsning (2 g/l) Group A-^: 2 cm^ .barbital solution (2 g/l)

Til kolbene i'gruppe A2q settes barbital under Barbital is added to the flasks in group A2q

■dyrkingen slik det angis nedenfor... ■the cultivation as indicated below...

Samtilge kolber podes med- 2,5 cm^ av en 72 timer' gammels podingskultur av Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 Simultaneous flasks are inoculated with 2.5 cm^ of a 72-hour-old inoculation culture of Streptomyces coeruleorubidus DS 7126

(NRRL 8098) (NRRL 8098)

Kolbene inkuberes i et rom med temperaturen 26°C på' et bord som roterer med 22 omdr./min. Etter.24 timers inkubering setter man til hver kolb.e i gruppe AgQ 1,5 cm^ barbitalopp-løsning (1,5 g/l), hvoretter inkuberingen av disse .kolber fortsettes under de ovenfor angitte betingelser. The flasks are incubated in a room with a temperature of 26°C on a table rotating at 22 rpm. After 24 hours of incubation, 1.5 cc of barbital solution (1.5 g/l) is added to each flask in group AgQ, after which the incubation of these flasks is continued under the conditions stated above.

Etter syv døgns inkubering behandles innholdet i kolbene på samme måte som i eks. 12 og de dannede mengder 32 999 RP bestemmes. De oppnådde resultater er angitt i nedenfor følgende tabell. After seven days' incubation, the contents of the flasks are treated in the same way as in ex. 12 and the formed quantities 32,999 RP are determined. The results obtained are indicated in the table below.

Man arbeider på samme måte som angitt ovenfor og fordeler kolber inneholdende dyrkingsmedium A i fem grupper (A-^,<A>21'<A>225A23°s A24^ P^ hver to k°lber- Til kolbene i' gruppe A-^tilsettes det intet. 'Til kolbene i gruppe A?1settes 0,5 g fenobarbitalnatrium pr. 1, til kolbene, i gruppe A^ settes 0,5 g butobarbitalnatrium (natriumsalt av 5-buty1-5-etylbarbitursyre), og til kolbene i'gruppene A?-, og A'^ h settes 0,5 g' henholdsvis 2 g pentiobarbital[5~etyl-5-(1-metyIbutyl)tiobarbitursyre] pr. 1. Etter poding på samme måte som ovenfor og inkubering i 9 døgn på samme måte som ovenfor, bestemmes de dannede mengder 32 999 RP • De oppnådde resultater er sammenstilt i nedenfor følgende tabell. One works in the same way as indicated above and distributes flasks containing culture medium A into five groups (A-^,<A>21'<A>225A23°s A24^ P^ each two flasks- To the flasks in' group A- nothing is added. To the flasks in group A?1 add 0.5 g of phenobarbital sodium per 1, to the flasks in group A^ add 0.5 g butobarbital sodium (sodium salt of 5-buty1-5-ethylbarbituric acid), and to the flasks in the groups A?- and A'^ h, 0.5 g' and 2 g respectively of pentobarbital [5~ethyl-5-(1-methylbutyl)thiobarbituric acid] are placed per 1. After inoculation in the same way as above and incubation in 9 days in the same way as above, the amounts formed are determined 32,999 RP • The results obtained are compiled in the table below.

Eksempel 23 (a) Gjæring. Example 23 (a) Fermentation.

Til en gjæringsbeholder med volumet 75 1 settes følgende stoffer: The following substances are added to a fermentation container with a volume of 75 1:

Soyamel 1500 g Soya flour 1500 g

Drank 250 g Delvis hydrolysert stivelse 1750 g Beverage 250 g Partially hydrolyzed starch 1750 g

Soyaolje 750 cn<r5>Soybean oil 750 cn<r5>

Natriumklorid 500 g Vanlig ledningsvann til Sodium chloride 500 g Ordinary tap water to

tilsammen 45 1 altogether 45 1

pH-verdien innstilles på 7,50 ved tilsetning av ■ The pH value is set to 7.50 by adding ■

"40 cm^ 10N natriumhydroksydoppløsning. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter av-kjøling er buljongens volum 50 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og p-H-verdien er 6,70. Man poder deretter med 200 cm"<5->av er. kultur av Streptomyces coerul-erorubidus DS 7126 (NRRL 8098), hvilken kultur er fremstilt ved dyrking i en omrystet kolbe. Kulturen utvikles ved 30°C i 25 timer under omrøring og under lufting ved steril luft. Den' er deretter egnet til anvendelse for poding av produksjonsmediet. "40 cm^ 10N sodium hydroxide solution. The medium is sterilized by bubbling through water vapor at 122°C for 40 min. After cooling, the volume of the broth is 50 1 as a result of condensation of water vapor during sterilization, and the pH value is 6.70. then graft with 200 cm"<5->of er. culture of Streptomyces coerul-erorubidus DS 7126 (NRRL 8098), which culture is prepared by cultivation in a shake flask. The culture is developed at 30°C for 25 hours with stirring and aeration with sterile air. It is then suitable for use for inoculation of the production medium.

Produksjonsdyrkingen gjennomføres i en gjæringsbeholder med et volum på 800 1, hvortil følgende stoffer settes.: The production cultivation is carried out in a fermentation container with a volume of 800 1, to which the following substances are added:

Etter innstilling av pK-verdien til 6,50 ved -til-setting av 210. cm^' ION natriumhydroksydoppløsning tilsettes. 7.,6 kg glycerol, 0,800 kg kalsiumkarbonat og vanlig ledningsvann til et totaltvolum på 360 1. After setting the pK value to 6.50 by adding 210 cm 2 ION sodium hydroxide solution is added. 7.6 kg glycerol, 0.800 kg calcium carbonate and ordinary tap water to a total volume of 360 1.

Mediets pH-verdi er deretter lik 6,45,. Man steriliserer mediet ved gjennombobling av - vanndamp av 122°C i 40 min.. Etter avkjøling har buljongen et volum på 4 00 1 som 'følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og, pH-verdien er 6,25. , The medium's pH value is then equal to 6.45. The medium is sterilized by bubbling through steam at 122°C for 40 min. After cooling, the broth has a volume of 400 1 as a result of condensation of steam during sterilization, and the pH value is 6.25. ,

Man tilsetter deretter 10 1 av en steril vannoppløs-ning inneholdende 308 g sulfanilamid. 10 1 of a sterile water solution containing 308 g of sulfanilamide is then added.

Medeiets pH-verdi er deretter lik 6,80. Man poder med 40 1 podingskultur fra den ovenfor beskrevne dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 75 1- Mediets temperatur holdes på 27°C. Mediet omrøres med et røreverk som roterer med 205-omdr./ min., og luftes med 20 m steril luft pr. time. Etter 24 timers dyrking tilsetter man 3 1 av en steril vannoppløsning inneholdende 4 4 g sulfanilamid, hvoretter man fortsetter gjæringen. The medium's pH value is then equal to 6.80. One inoculates with 40 1 of the inoculum culture from the cultivation described above in the fermentation vessel with a volume of 75 1 - The temperature of the medium is kept at 27°C. The medium is stirred with a stirrer that rotates at 205 rpm, and aerated with 20 m of sterile air per hour. After 24 hours of cultivation, 3 1 of a sterile water solution containing 4 4 g of sulfanilamide is added, after which the fermentation is continued.

Etter 140 timers dyrking har mediet en pH-verdi på 6,75 og volumet er 350 1. Dyrkingsmediet inneholder da 35 mg 32 999 RP pr. 1. After 140 hours of cultivation, the medium has a pH value of 6.75 and the volume is 350 1. The cultivation medium then contains 35 mg 32,999 RP per 1.

(b) Utvinning. (b) Extraction.

Til 350 1 av den ovenfor oppnådde dyrkingsbuljong setter man 350 1 metanol og 6N natriumhydroksydoppløsning inntil pH-verdien er 7,5. Det hele omrøres 1 time. Etter tilsetning av 25 kg filtreringshjelpemiddel filtreres suspensjonen i en filterpresse. Man samler opp filtratet. Filterkaken vaskes med 100 1 50$-ig metanol. Filtratet og vaskeoppløsningen forenes og konsentreres under et redusert trykk til et volum på 250 1. To 350 1 of the culture broth obtained above, 350 1 of methanol and 6N sodium hydroxide solution are added until the pH value is 7.5. The whole thing is stirred for 1 hour. After adding 25 kg of filtration aid, the suspension is filtered in a filter press. The filtrate is collected. The filter cake is washed with 100 1 50% methanol. The filtrate and washing solution are combined and concentrated under reduced pressure to a volume of 250 L.

Etter alkalisering ved tilsetning av 220 cm'' oN natriumhydrok-sydoppløsning ekstraheres antibiotikumet i konsentratet med 2 x' 150 1 av en blanding av metylenklorid og butanol i et volumforhold på 80:20. De forende organiske ekstrakter som har et volum på 238 1, konsentreres under redusert trykk til et volum på 30-1. Man tilsetter deretter 100 crP n-butanol mettet med 11N saltsyre. Etter konsentrering til et volum på 3 1 setter man langsomt det oppnådde konsentrat til 21 1 heksan. -Den -oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 137 g urent hydroklorid av 32 999 RP. After alkalization by the addition of 220 cm'' oN sodium hydroxide solution, the antibiotic in the concentrate is extracted with 2 x' 150 1 of a mixture of methylene chloride and butanol in a volume ratio of 80:20. The combined organic extracts, which have a volume of 238 1, are concentrated under reduced pressure to a volume of 30-1. 100 crP n-butanol saturated with 11N hydrochloric acid is then added. After concentrating to a volume of 3 1, the concentrate obtained is slowly added to 21 1 of hexane. -The precipitate obtained is filtered off, washed and dried. This gives 137 g of impure hydrochloride of 32,999 RP.

(c)"Rensing..'■''- (c)"Cleaning..'■''-

(1) 112 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid av (1) 112 g of the above obtained impure hydrochloride of

32 999 RP oppløses i 1-1- vann ved 50°C. Den oppnådde oppløsning hvis pH-verdi er 2,9, filtreres gjennom frittet glass... De far-, gede forurensninger i det oppnådde filtrat ekstraheres med 2 x 500 cm^ kloroform og deretter en gang med 1 1 kloroform. Etter-tilsetning av 75 g natriumklorid til vannfasen ekstraheres'antibiotikumet med 3 x 0,75 1 n-butanol. Vannfasens pH-verdi innstilles til 9,5 ved tilsetning av konsentrert- natriumhydroksyd-oppløsning, og det gjenværende antibiotikum ekstraheres med 0,5 1 n-butanol. 32,999 RP is dissolved in 1:1 water at 50°C. The obtained solution whose pH value is 2.9 is filtered through fritted glass... The colored impurities in the obtained filtrate are extracted with 2 x 500 cm^ of chloroform and then once with 1 1 of chloroform. After adding 75 g of sodium chloride to the aqueous phase, the antibiotic is extracted with 3 x 0.75 l of n-butanol. The pH value of the water phase is set to 9.5 by adding concentrated sodium hydroxide solution, and the remaining antibiotic is extracted with 0.5 1 n-butanol.

De oppnådde butanolekstrakter inneholdende antibiotikumet forenes og konsentres under redusert trykk til et volum på 1 1. Man setter deretter 1 1 kloroform til det oppnådde konsentrat. Den oppnåddeOppløsning vaskes med 2 x 500 cm^ vann som er alkalisert til pH 9,5- Vaskeoppløsningene ekstraheres med 2 x 500 cm 3av en blanding av kloroform og- n-butanol i et volumforhold på 80:20 ved pH 9,5. De organiske ekstrakter forenes og konsentreres under, ét redusert trykk. The obtained butanol extracts containing the antibiotic are combined and concentrated under reduced pressure to a volume of 1 1. One then adds 1 1 of chloroform to the obtained concentrate. The obtained solution is washed with 2 x 500 cm 3 of water that has been alkalized to pH 9.5. The washing solutions are extracted with 2 x 500 cm 3 of a mixture of chloroform and n-butanol in a volume ratio of 80:20 at pH 9.5. The organic extracts are combined and concentrated under reduced pressure.

Under konsentreringen tilsetter man 300 cm^ av en blanding av n-butanol, vann og 11N saltsyre i et volumforhold på 94:5:1-Konsentreringen fortsettes inntil volumet er 150 cm^ hvoretter - During the concentration, 300 cm^ of a mixture of n-butanol, water and 11N hydrochloric acid is added in a volume ratio of 94:5:1 - The concentration is continued until the volume is 150 cm^, after which -

den oppnådde oppløsning langsomt settes til 2 1 heksan. Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes. Herved oppnås 30 g av et produkt som inneholder hydrokloridet av 32 999 RP.- the obtained solution is slowly added to 2 1 hexane. The precipitate obtained is filtered off, washed and dried. This results in 30 g of a product containing the hydrochloride of 32,999 RP.-

(2) 13 g.av det. ovenfor oppnådde produkt oppløses i (2) 13 g. of it. product obtained above is dissolved in

26 cm^ av en blanding av vann og dioksan i et volumforhold på 20:80 ved 35°C. Antibiotikumet bringes til å krystallisere ved langsom tilsetning av 624 cm-<5>dioksan. Etter 3 timers omrøring filtreres krystallene av hvoretter de vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2 g av et krystallisert produkt som inneholder hydrokloridet av '32'999 RP. 26 cm^ of a mixture of water and dioxane in a volume ratio of 20:80 at 35°C. The antibiotic is brought to crystallize by slow addition of 624 cm-<5>dioxane. After stirring for 3 hours, the crystals are filtered off, after which they are washed and dried. This gives 2 g of a crystallized product containing the hydrochloride of '32'999 RP.

(3) - 4,47 g av et krystallisert produkt, oppnådd på (3) - 4.47 g of a crystallized product, obtained on

samme måte som beskrevet under (2) ovenfor oppløses i 40 cm^ the same way as described under (2) above is dissolved in 40 cm^

vann. Den oppnådde oppløsning filtreres. Det i filtratet til- water. The solution obtained is filtered. That in the filtrate to-

stedeværende hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP bringes til krystallisering ved tilsetning av 450 cm^ aceton under omrøring. De oppnådde krystallene filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2,47 g av et produkt.som inneholder krystallisert hydroklorid av 32 999 RP. (4) 2,84. g av et produkt, oppnådd på samme måte som beskrevet under (3) ovenfor, oppløses i 28,4 cm"5 av. en blanding av like volumdeler metanol og aceton. Til den oppnådde oppløsning settes 16,9 cm^ av en blanding av aceton og vann i et volumforhold på 84:16.- Hydrokloridet av' 3 2 999 RP bringes til krystallisering ved oppvarming til'30°C og.etterfølgende avkjøling. De oppnådde krystaller filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved 2,33 g krystallisert, halvrenset hydroklorid av 32. 999_.._RP... (5) 1,85 g av det ovenfor oppnådde halvrensede hydroklorid oppløses i 400 cm vann'med en pH-verdi på' 5,5- .De fargede forurensninger i den oppnådde oppløsning ekstraheres med 10 x- 400 cm^ av en blanding av n-butanol" og kloroform i et volumforhold på 20:80. Man konsentrerer vannfasen og tilsetter n-butanol under konsentreringen. Herved oppnås det en butanol-fase med et volum på 75 cm"5, hvilken langsomt tilsettes til 1,5 1 heksan-. Den oppnådde felling filtreres av, vaskes og tørkes: Man oppnår herved 1,4 g rent hydroklorid av 32 .999 RP, hvilket, er identisk med det i eksempel 8 beskrevne produkt. present hydrochloride of the antibiotic 32,999 RP is brought to crystallisation by adding 450 cc of acetone with stirring. The crystals obtained are filtered off, washed and dried. This results in 2.47 g of a product containing crystallized hydrochloride of 32,999 RP. (4) 2.84. g of a product, obtained in the same way as described under (3) above, is dissolved in 28.4 cm"5 of a mixture of equal volumes of methanol and acetone. To the obtained solution is added 16.9 cm^ of a mixture of acetone and water in a volume ratio of 84:16.- The hydrochloride of 3 2 999 RP is brought to crystallization by heating to 30°C and subsequent cooling. The crystals obtained are filtered off, washed and dried. This gives 2.33 g crystallized, semi-purified hydrochloride of 32. 999_.._RP... (5) 1.85 g of the semi-purified hydrochloride obtained above is dissolved in 400 cm of water'with a pH value of' 5.5-.The colored impurities in the solution obtained is extracted with 10 x 400 cm^ of a mixture of n-butanol" and chloroform in a volume ratio of 20:80. The water phase is concentrated and n-butanol is added during the concentration. A butanol phase with a volume of 75 cm"5 is thereby obtained, which is slowly added to 1.5 1 of hexane. The resulting precipitate is filtered off, washed and dried: 1.4 g of pure hydrochloride of 32,999 RP, which is identical to the product described in example 8.

Eksempel 24 (A)' Gjæring. Example 24 (A)' Fermentation.

I en gjæringsbeholder med et .volum på 170 1 tilsettes- følgende stoffer: In a fermentation container with a volume of 170 1, the following substances are added:

Det oppnådde medium hvis pH-verdi er '6,0 steriliseres ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling er buljongens volum 120 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen, og pH-verdien er 6,65. Man The resulting medium whose pH value is '6.0 is sterilized by bubbling through steam at 122°C for 40 min. After cooling, the volume of the broth is 120 1 due to condensation of water vapor during sterilization, and the pH value is 6.65. Mon

■ poder med 250 cm^ av en kultur av Streptomyces atroviolaceus ■ inoculate with 250 cm^ of a culture of Streptomyces atroviolaceus

DS 8938., hvilken kultur er fremstilt ved dyrking i en rystet E-kolbe. Kulturen utvikles i 35 timer ved 2o°C-under omrøring og under lutfting med steril'luft. Den er deretter egnet til 'an vendelse for poding av produksjonsmediet. DS 8938., which culture is prepared by cultivation in a shaken E-flask. The culture is developed for 35 hours at 20°C with stirring and aeration with sterile air. It is then suitable for inoculation of the production medium.

Produksj onsdyrkingen- gjennomføres i en' gj-æringsbe-holder med et volum på 800'1, hvortil følgende stoffer settes.: The production cultivation is carried out in a fermentation container with a volume of 800 l, to which the following substances are added:

Mediets pH-verdi innstilles til 7 ,5 ved tilsetning av 500 cm"' ION' natriumhydroksydoppløsning, hvoretter mediet steriliseres ved gjennombobling av vanndamp ved 122°C i 40 min. Etter avkjøling har■buljongen et volum på 550 1 som følge av kondensasjon av vanndamp under steriliseringen. Mediets pH-verdi er 6,60. Man'poder med 55 1 podingskultur fra, den ovenfor angitte dyrking i gjæringsbeholderen med volumet 170 1. Kulturen utvikles i 117 timer ved 26°C under omrøring med et røreverk som r.oterer 'med 205 omdr./min., og under lufting med 15 m"5 steril luft pr. time. Etter avsluttet dyrking har mediet en pH-verdi på '7,60. The medium's pH value is adjusted to 7.5 by adding 500 cm"' ION' sodium hydroxide solution, after which the medium is sterilized by bubbling through steam at 122°C for 40 min. After cooling, the broth has a volume of 550 1 as a result of condensation of water vapor during the sterilization. The pH value of the medium is 6.60. Man'pods with 55 1 of inoculation culture from, the above indicated cultivation in the fermentation container with the volume of 170 1. The culture is developed for 117 hours at 26°C while stirring with a stirrer that r. aerate at 205 rpm, and during aeration with 15 m"5 sterile air per hour. After completion of cultivation, the medium has a pH value of '7.60.

(B) Utvinning. (B) Recovery.

Til 560 1 av den ovenfor oppnådde dyrkingsoppløs-ning setter man 28 kg oksalsyre. Etter omrøring i en time ved 40°C og tilsetning av 25 kg filtreringshjelpemiddel filtreres oppløsningen i en filterpresse. Myceliekaken vaskes med 120 1 vann, som har en. temperatur på 50°C og som inneholder 3 kg oksalsyre. Filtratet og vaskeoppløsningen forenes til en opp-løsning hvis pH-verdi er lik 1. Denne oppløsning avkjøles til 10°C. pH-verdien- innstilles deretter på 4,5 ved tilsetning av 50 1 6N natriumhydroksydoppløsning. Det i den oppnådde opp-løsning tilstedeværende antibiotikum fikseres på en 'kolonne av 24 1 "Amberlite IRC 50" i H+<->form. lonebytteren vaskes med vann inntil effluatet er fargeløst, deretter med 100 1 av en blanding av like volumdeler metanol og vann og til slutt med 100 1 av en blanding av metanol og vann i et volumforhold på 90:10. Antibiotikumet elueres deretter med 250 1 av en blanding av metanol og vann i et volumforhold på 90:10, hvilken blanding inneholder 1 g natriumklorid pr'. 100 ml. Eluatet konsentreres 28 kg of oxalic acid is added to 560 1 of the culture solution obtained above. After stirring for one hour at 40°C and adding 25 kg of filtration aid, the solution is filtered in a filter press. The mycelium cake is washed with 120 1 water, which has a temperature of 50°C and which contains 3 kg of oxalic acid. The filtrate and the washing solution are combined to form a solution whose pH value is equal to 1. This solution is cooled to 10°C. The pH value is then adjusted to 4.5 by adding 50 1 6N sodium hydroxide solution. The antibiotic present in the solution obtained is fixed on a column of 24 1 "Amberlite IRC 50" in H+<-> form. the ion exchanger is washed with water until the effluent is colourless, then with 100 1 of a mixture of equal volumes of methanol and water and finally with 100 1 of a mixture of methanol and water in a volume ratio of 90:10. The antibiotic is then eluted with 250 1 of a mixture of methanol and water in a volume ratio of 90:10, which mixture contains 1 g of sodium chloride per 100 ml. The eluate is concentrated

under et redusert trykk på. 5-10 mm Hg ved kO°C til et volum på under a reduced pressure on. 5-10 mm Hg at kO°C to a volume of

20 1. Konsentrates pH-verdi innstilles til 9 ved tilsetning av 11N natriumhydroksydoppløsning, hvoretter konsentratet.ekstra heres en gang med 20 1 kloroform og deretter to ganger med 10 1 kloroform. Man oppnår tilsammen 35 1 ekstrakt som konsentreres under et redusert trykk på 5-10 mm 'Hg ved 40°C til et volum på 2.1. "Den resterende oppløsning gjøres sur ved tilsetning.av 50 c'm^ n-butanol mettet med 11N saltsyre og konsentreres deret- • ter til et volum på 1 1. Den herved oppnådde oppløsning helles . langsomt i 7 1 heksan. Den dannede utfelling filtreres av,-vaskes og tørkes. Man oppnår herved 13 g urent hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP.. 20 1. The concentrate's pH value is set to 9 by adding 11N sodium hydroxide solution, after which the concentrate.extra is washed once with 20 1 chloroform and then twice with 10 1 chloroform. A total of 35 1 of extract is obtained, which is concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg at 40°C to a volume of 2.1. "The remaining solution is made acidic by the addition of 50 c'm^ n-butanol saturated with 11N hydrochloric acid and then concentrated to a volume of 1 1. The solution thus obtained is poured slowly into 7 1 of hexane. The precipitate formed filtered off, washed and dried. This gives 13 g of impure hydrochloride of the antibiotic 32,999 RP..

(C) Rensing.. (C) Cleansing..

(a) Det urene hydrokloridet av 32 999 RP renses ved (a) The impure hydrochloride of 32,999 RP is purified by

motstrømsfordeling i tre kolber, A, B og G med et volum på 2 1. countercurrent distribution in three flasks, A, B and G with a volume of 2 1.

Man fremstiller en blanding av -metylenklorid, n-butanol og M/15 fosfatpuffer med pH 7,38 i et volumforhold på 8:2:10. Når blandingen er bragt i likevekt separerer man.de to faser. A mixture of -methylene chloride, n-butanol and M/15 phosphate buffer with pH 7.38 is prepared in a volume ratio of 8:2:10. When the mixture has been brought to equilibrium, the two phases are separated.

I kolben A heller man. 500 cm"' av en blanding av fosforsyre (85 vekt-%) og vann i et volumforhold på 1:125 samt 500 cm"<1>, av den ovenfor oppnådde tunge organiske fase. I denne faseblanding oppløser man 13 g av det ovenfor oppnådde urene hydroklorid av antibiotikumet 32 999 RP• Etter 15 minutters omrøring og fjerning av et uoppløselig stoff ved filtrering, innstilles pH-verdien til .7,5 ved tilsetning av IN natriumhyd-roksydoppløsning. In flask A pour one. 500 cm"' of a mixture of phosphoric acid (85% by weight) and water in a volume ratio of 1:125 as well as 500 cm"<1>, of the heavy organic phase obtained above. In this phase mixture, 13 g of the impure hydrochloride of the antibiotic 32,999 RP obtained above are dissolved. After 15 minutes of stirring and removal of an insoluble substance by filtration, the pH value is adjusted to .7.5 by adding 1N sodium hydroxide solution.

3 3

I hver av kolbene B og C tilsetter man 5.00 cm av. den ovenfor oppnådde lette væskefase, hvorved pH-verdien i kolbe B innstilles til 7 og pH-verdien i kolbe C innstilles til 6,5 ved hjelp av 85%-ig fosforsyre. In each of flasks B and C, add 5.00 cm of the light liquid phase obtained above, whereby the pH value in flask B is set to 7 and the pH value in flask C is set to 6.5 using 85% phosphoric acid.

I retning kolbe A-kolbe B-kolbe C gjennomfører man en motstandsfordeling med fem overføringer, hvorved man anvender den tunge fase (oppløsningsmidlet) som bevegelig fase, og de lette fasene (vannfasene) med pH 7,5, 7 og 6,5 som stasjonære faser. Man anvender hver gang 500 cm; bevegelig fase, og man holder pH-vérdien konstant i de stasjonære fasene. In the direction flask A-flask B-flask C, a resistance distribution is carried out with five transfers, whereby the heavy phase (solvent) is used as the mobile phase, and the light phases (water phases) with pH 7.5, 7 and 6.5 as stationary phases. 500 cm is used each time; mobile phase, and the pH value is kept constant in the stationary phases.

Antibiotikumet i vannfasen i kolbe C ekstraheres The antibiotic in the water phase in flask C is extracted

ved pH 9,5 med to ganger 500 cm'5 av en blanding av kloroform og at pH 9.5 with twice 500 cm'5 of a mixture of chloroform and

Claims (2)

n-butanol i volumforholdet 8; 2. De organiske ekstrakter forenes, og konsentreres.under et redusert trykk på .5-10 mm Hg ved 40°C. Under konsentreringen tilsetter man 300 cm'5 n-butanol innehold- .ende 6 volum-%-2N saltsyre. Konsentratets volum innstilles til. 5 cm'<5>, hvoretter konsentratet langsomt helles i 500 cm'5 heksan. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes.. Man oppnår herved 275 mg halvrenset hydroklorid av 32 999 RP. (b) 80 mg av det ovenfor oppnådde halvrensede hydroklorid av 32 999 RP oppløses i en blanding -av 1' cirr5 vann og •1 cm 3 metanol. Den .oppnåo dde oppløsning deles i • fire like deler, hvilke avsettes lineært på fire analytiske kromatografiplater utstyrt med et jevnt sjikt av.silikagel (Merck). Platene fremstilles i en time i en beholder hvis vegger er dekket med filterpapir inneholdende en blanding av metylenklorid, maursyre.og .metanol i et volumforhold på 80:17--3- Sonen inneholdende 32 999 RP fj.ernes etter tørking ved avskraping av silikagelet. Det oppnådde pulver suspenderes i 40 cm'5 vann og antibiotikumet .ekstraheres ved pH 9,5 med to ganger 20 cm"" kloroform. De organiske ekstrakter forenes og konsentreres under et redusert trykk på 5-10 -mm Hg ved 40°C. Under konsentreringen tilsetter man 1 cm-3 n-butanol inneholdende 6 volum-? 2N saltsyre. Konsentrates volum innstilles på 2 cm"<5>, hvoretter konsentratet langsomt helles i 50 cm^ heksan. Den dannede felling filtreres av, vaskes og tørkes. Man oppnår herved' 4 mg rent hydroklorid av 32 999 RP i form av et oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver som smelter ved en temperatur opp i mot 200°C under spalting. Det oppnådde produkt er identisk med det i eksempel 8.oppnådde produkt. Patentkrav 1..Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt naftacenderivat betegnet med-nr. 32 999 RP og med formelen: enten i form av fri base eller■i form av addisjonssalter med en syre, hvorved forbindelsens hydroklorid har følgende egenskaper: den er et oransjerødt, mikrokrystallinsk pulver som er oppløselig i metanol, pyridin, dimetylformamid og vann i en mengde på ca. 100 mg/cm 3 , oppløselig i butanol mettet m■ e' d ' va■nn ved 20°C i en mengde på 10 mg/cm-<3>, oppløselig i etanol i en mengde på 5 mg/cm^ og oppløselig i aceton, kloroform, metylenklorid, etylacetat, benzen, mentylisobutylketon, dioksan og heksan i en mengde på under 0,1 mg/cm^; den har følgende elementanalyse: C% = 56,6; E% = 5,7; 0% - 29,41; M = 2,39; Cl% = 6,0; den spesifikke dreiningsevne (bestemt i en 0,09%-ig oppløsning i etanol inneholdende 0,1% IN HCI) er: n-butanol in the volume ratio 8; 2. The organic extracts are combined and concentrated under a reduced pressure of .5-10 mm Hg at 40°C. During the concentration, 300 cm'5 of n-butanol containing 6% by volume of 2N hydrochloric acid is added. The volume of the concentrate is set to 5 cm'<5>, after which the concentrate is slowly poured into 500 cm'5 of hexane. The formed precipitate is filtered off, washed and dried. This gives 275 mg of semi-purified hydrochloride of 32,999 RP. (b) 80 mg of the semi-purified hydrochloride of 32,999 RP obtained above is dissolved in a mixture -of 1' cirr5 of water and •1 cm 3 of methanol. The solution obtained is divided into • four equal parts, which are deposited linearly on four analytical chromatography plates equipped with an even layer of silica gel (Merck). The plates are prepared for one hour in a container whose walls are covered with filter paper containing a mixture of methylene chloride, formic acid and methanol in a volume ratio of 80:17--3- The zone containing 32,999 RP is removed after drying by scraping off the silica gel . The powder obtained is suspended in 40 cc of water and the antibiotic is extracted at pH 9.5 with twice 20 cc of chloroform. The organic extracts are combined and concentrated under a reduced pressure of 5-10 mm Hg at 40°C. During the concentration, 1 cm-3 of n-butanol containing 6 volume-? 2N hydrochloric acid. The volume of the concentrate is set to 2 cm"<5>, after which the concentrate is slowly poured into 50 cm^ of hexane. The precipitate formed is filtered off, washed and dried. This gives 4 mg of pure hydrochloride of 32,999 RP in the form of an orange-red, microcrystalline powder which melts at a temperature of up to 200°C during cleavage. The product obtained is identical to the product obtained in example 8. Patent claim 1..Procedure for the production of a new naphthacene derivative designated with No. 32 999 RP and with the formula: either in the form of a free base or■in the form of addition salts with an acid, whereby the hydrochloride of the compound has the following properties: it is an orange-red, microcrystalline powder which is soluble in methanol, pyridine, dimethylformamide and water in an amount of about 100 mg/cm 3 , soluble in butanol saturated with water at 20°C in an amount of 10 mg/cm-<3>, soluble in ethanol in an amount of 5 mg/cm^ and soluble in acetone, chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, benzene, menthyl isobutyl ketone, diox an and hexane in an amount of less than 0.1 mg/cm^; it has the following elemental analysis: C% = 56.6; E% = 5.7; 0% - 29.41; M = 2.39; Cl% = 6.0; the specific rotatability (determined in a 0.09% solution in ethanol containing 0.1% IN HCI) is: dets UV-spektrum og dets synlige spektrum (bestemt i oppløsninger inneholdende 10,65 mg/l av hydrokloridet i etanol inneholdende 0, 1% IN HCI) oppviser absorbsjonsmaksima ved 233 nm, 254 nm, 292 nm, 493 nm, 512 nm og 527 nm; dets IR-spektrum oppviser absorbsjonssignaler ved 3410, 3250,. 3220, 3050, 2970, 2930, 2900, 2860, 2820, 2680, 2600-, 1980 , 1930, 1900, 1800,- 1735, I690, 1635, 1600, 1580, -1510, 1460, 1440, 1405, 1370, 1315, 1285, 1255, 1235 , 1195, 1165, 1115, 10.62, 1050, 1030, 1010, 985, 960, 930, 915, 885, 875, 845, 840, 820, 810, 780, 762, 750, 725, 708, 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565., 540, 530, 485, 475, 465, 450,- 438, 415, 390 og 320 cm<-1>; den oppviser en Rf-verdi på 0,2 ved tynnsjiktskromatografi på silikagel når man som fremkallende oppløsningsmiddel anvender en blanding av metylenklorid, maursyre og 'metanol i et volumforhold på. 80:17:3;. den er hos mus virksom mot leukemi L 1210, leukemi P 388 og leukoseaskromatose i intraperitoneale doser på mellom 0,12,5 og 0,250 mg/kg;karakterisertved at man (a) på mikrobiologisk måte reduserer karminomycin med formelen: its UV spectrum and its visible spectrum (determined in solutions containing 10.65 mg/l of the hydrochloride in ethanol containing 0.1% IN HCI) exhibit absorption maxima at 233 nm, 254 nm, 292 nm, 493 nm, 512 nm and 527 nm; its IR spectrum exhibits absorption signals at 3410, 3250, . 3220. . , 695, 665, 640, 625, 600, 580, 565., 540, 530, 485, 475, 465, 450,- 438, 415, 390 and 320 cm<-1>; it exhibits an Rf value of 0.2 by thin-layer chromatography on silica gel when a mixture of methylene chloride, formic acid and methanol in a volume ratio of 80:17:3; in mice, it is effective against leukemia L 1210, leukemia P 388 and leukosis chromatosis in intraperitoneal doses of between 0.12.5 and 0.250 mg/kg; characterized by (a) microbiologically reducing carminomycin with the formula: eller et salt derav; eller at man ;(b) dyrker en av de følgende mikroorganismer: Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098) Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045) Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) i et luftet næringsmedium egnet for Streptomyces-stammer og i nærvær av tilsetningsmidler valgt blant ametopterin, barbital, fenobarbital, butobarbital, pentiobarbital, sulfanilamid, sulfa- pyridazin og sulfatiazol, hvoretter man utvinner det ønskede sluttprodukt fra dyrkingsmediet; eller at .man' (c) dyrker Streptomyces atroviolaceus DS 89.38 (NRRL 8l48) eller dettes produserende mutanter i et luftet næringsmedium som inneholder kilder.for assimilerbart karbon og assimilerbart nitrogen og uorganiske salter ved en opprinnelig pH-verdi på 5,8-7,8 og ved en temperatur .på mellom 23 "til 33°C, hvoretter man utvinner det ønskede sluttprodukt fra dyrkingsmediet . or a salt thereof; or that one; (b) cultivates one of the following microorganisms: Streptomyces coeruleorubidus DS 7126 (NRRL 8098) Streptomyces coeruleorubidus DS 31 723 (NRRL 3045) Streptomyces coeruleorubidus DS 8899 (NRRL 3046) Streptomyces bifurcus DS 23 219 (NRRL 3539) in a aerated nutrient medium suitable for Streptomyces strains and in the presence of additives selected from amethopterin, barbital, phenobarbital, butobarbital, pentobarbital, sulfanilamide, sulfapyridazine and sulfathiazole, after which the desired end product is recovered from the culture medium; or that 'one' (c) grows Streptomyces atroviolaceus DS 89.38 (NRRL 8l48) or its producing mutants in an aerated nutrient medium containing sources of assimilable carbon and assimilable nitrogen and inorganic salts at an initial pH value of 5.8-7 ,8 and at a temperature of between 23" to 33°C, after which the desired end product is extracted from the culture medium. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, alternativ (a), kar, akte.rterisert ved.at den mikrobiologiske reduksjon gjennomføres ved hjelp av en kultur av en av følgende mikroorganismer: Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), , • Streptomyces rosecchromogen.es (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946), Bacterium cyciooxydans (ATCC 12.673), eller ved hjelp av celler' isolert fra en slik kultur, eller ved hjelp av enzymatiske ekstrakter oppnådd fra celler av disse mikroorganismer.2. Method according to claim 1, alternative (a), vessel, characterized in that the microbiological reduction is carried out using a culture of one of the following microorganisms: Streptomyces lavendulae (ATCC 8664), , • Streptomyces rosecchromogen.es (ATCC 13.400), Corynebacterium simplex (ATCC 6946), Bacterium cyciooxydans (ATCC 12.673), or by means of cells' isolated from such a culture, or by means of enzymatic extracts obtained from cells of these microorganisms.