NO346254B1

NO346254B1 - Isolated salmonid alphavirus and its use

Info

Publication number: NO346254B1
Application number: NO20191081A
Authority: NO
Inventors: Trygve Meum Eliassen; Marit Rode; Anne Aas-Eng; Bernt Martinsen; Svein Aleksandersen; Inge-Tom Solbakk
Original assignee: Pharmaq As
Priority date: 2008-02-08
Filing date: 2019-09-09
Publication date: 2022-05-16
Also published as: NO346489B1; NO2022047I1; NO20130833L; NO20191081A1

Description

Oppfinnelsens tekniske område Technical field of the invention

Foreliggende oppfinnelse vedrører veterinærimmunologi og spesielt isolert salmonid alfavirus av undertpe SAV3 samt måter for å forebygge eller kontrollere infeksjoner av salmonid alfavirus og utbrudd av fiskepankreatisk sykdom (fish pancreatic disease) eller sovesyke (sleeping disease) ved anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertpe SAV3. The present invention relates to veterinary immunology and in particular to isolated salmonid alphavirus of subtpe SAV3 as well as ways to prevent or control infections of salmonid alphavirus and outbreaks of fish pancreatic disease (fish pancreatic disease) or sleeping sickness by using an inactivated salmonid alphavirus of subtpe SAV3.

Oppfinnelsens bakgrunn The background of the invention

Pankreassykdom (pancreas disease) har blitt en alvorlig sykdom i lakseoppdrett i flere geografiske områder. Sykdommen ble først rapportert fra Skottland og har senere blitt rapportert fra Irland, Norge og Nord-Amerika. Siden 2007 har pankreassykdommen blitt endemisk i de fleste oppdrettsanlegg i Irland og det har blitt rapportert om isolerte utbrudd av pankreassykdom i Nord-Amerika. En annen diagnose, sovesyke, er endemisk i deler av Frankrike og har også blitt rapportert i Italia og Spania (McLoughlin & Graham, 2007). Nylig har det kommet uoffisielle rapporter om at pankreassykdom også er observert i Chile. Pancreas disease has become a serious disease in salmon farming in several geographical areas. The disease was first reported from Scotland and has subsequently been reported from Ireland, Norway and North America. Since 2007, pancreatic disease has become endemic in most farms in Ireland and isolated outbreaks of pancreatic disease have been reported in North America. Another diagnosis, sleeping sickness, is endemic in parts of France and has also been reported in Italy and Spain (McLoughlin & Graham, 2007). Recently, there have been unofficial reports that pancreatic disease has also been observed in Chile.

I Norge har sykdommen spredt seg i løpet av de siste 10 årene med 58 bekreftede infiserte områder i 2006 og 98 bekreftede infiserte områder i 2007. I 2006 spredte sykdommen seg også til Møre og Romsdal, som ligger nord for det tidligere definerte geografiske området som var berørt av salmonid pankreassykdom. Pankreassykdom er nå det største helseproblemet for akvakulturindustrien i den vestlige delen av Norge. Pankreassykdom (PD) og den beslektede sovesyken forårsakes begge av alfavirus og kan ikke behandles med noen terapeutika. In Norway, the disease has spread over the past 10 years, with 58 confirmed infected areas in 2006 and 98 confirmed infected areas in 2007. In 2006, the disease also spread to Møre og Romsdal, which is north of the previously defined geographical area that was affected by salmonid pancreatic disease. Pancreatic disease is now the biggest health problem for the aquaculture industry in the western part of Norway. Pancreatic disease (PD) and the related sleeping sickness are both caused by alphaviruses and cannot be treated with any therapeutics.

Det første alfaviruset ble isolert fra fisk i 1995 (Nelson m.fl. 1995). I dag har alfavirus blitt isolert fra både atlantisk laks som lider av pankreassykdom og regnbueørret som lider av sovesyke (McLoughlin og Graham 2007). The first alphavirus was isolated from fish in 1995 (Nelson et al. 1995). Today, alphaviruses have been isolated from both Atlantic salmon suffering from pancreatic disease and rainbow trout suffering from sleeping sickness (McLoughlin and Graham 2007).

Salmonis alfavirusene (SAV) er sfæriske (omtrent 65 nm i diameter) innhyllede RNA-virus. De inneholder et enkelttrådet positiv-sense-RNA-genom på 11–12 kB (McLoughlin og Graham 2007). I europeisk patent EP 712 926 er det beskrevet å være sensitivt for kloroform, raskt inaktivert ved pH=3 og ved 50 <o>C og med en flytende tetthet på 1,20 g/ml. Nukleotidsekvenseringsstudier tilordner salmonide alfavirus i tre genetisk forskjellige undertyper (Powers m.fl. 2001, Hodneland m.fl. 2005, Weston m.fl. 2005). Salmonid alfavirus 2 (SAV2) forårsaker sovesyke hos regnbueørret, salmonid alfavirus 1 (SAV1) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks i Irland og Skottland, mens salmonid alfavirus 3 (SAV3) forårsaker pankreassykdom i atlantisk laks og sjøoppdrettet regnbueørret i Norge. Dette er videre understøttet av Karlsen et al. (2006) som fant at SAV3 undertypene som forårsaker pankreassykdom i Norge er genetisk homogene, men forskjellig fra SAV1 og SAV2. Nylig har SAV4, SAV5 og SAV6 blitt identifisert som undertyper beslektet med SAV1. Andersen et al. (2007) har videre identifisert at pseudobrankiene og hjertet er de mest egnede vevene for RT-PCR diagnostikk ved eksponeringsforsøk med SAV1 og SAV3. The Salmonis alphaviruses (SAV) are spherical (approximately 65 nm in diameter) enveloped RNA viruses. They contain a single-stranded positive-sense RNA genome of 11–12 kB (McLoughlin and Graham 2007). In European patent EP 712 926 it is described to be sensitive to chloroform, quickly inactivated at pH=3 and at 50 <o>C and with a liquid density of 1.20 g/ml. Nucleotide sequencing studies assign salmonid alphaviruses to three genetically distinct subtypes (Powers et al. 2001, Hodneland et al. 2005, Weston et al. 2005). Salmonid alphavirus 2 (SAV2) causes sleeping sickness in rainbow trout, salmonid alphavirus 1 (SAV1) causes pancreatic disease in Atlantic salmon in Ireland and Scotland, while salmonid alphavirus 3 (SAV3) causes pancreatic disease in Atlantic salmon and sea-farmed rainbow trout in Norway. This is further supported by Karlsen et al. (2006) who found that the SAV3 subtypes that cause pancreatic disease in Norway are genetically homogeneous, but different from SAV1 and SAV2. Recently, SAV4, SAV5 and SAV6 have been identified as subtypes related to SAV1. Andersen et al. (2007) have further identified that the pseudobranches and the heart are the most suitable tissues for RT-PCR diagnostics in exposure experiments with SAV1 and SAV3.

I Norge er all oppdrettet atlantisk laks vaksinert mot de vanligste bakterielle sykdommene og svært ofte mot pancreatic necrosis virus (IPNV) før de forflyttes til sjøen. Selv om omfattende vaksinasjonsprogrammer absolutt er ønsket for å unngå økonomiske tap og ytterligere spredning av smittsomme sykdommer er slike program også forbundet med tekniske utfordringer. Administrasjon av vaksiner krever omfattende behandling av fisken, noe som forårsaker stress og dødelighet fordi fisken må pumpes inn i oppbevaringstanker, overføres til en tank med anestesi, injiseres med vaksine og pumpes tilbake til oppbevaringstanker. På grunn av den store målestokken i moderne akvakultur er slike vaksinasjonsprogrammer dyre og arbeidskrevende og forårsaker stress hos fisken. Av disse grunnene administreres vaksiner mot de forskjellige smittsomme sykdommene fortrinnsvis i kombinerte, polyvalente vaksiner som inneholder flere antigener. In Norway, all farmed Atlantic salmon are vaccinated against the most common bacterial diseases and very often against pancreatic necrosis virus (IPNV) before they are transferred to the sea. Although comprehensive vaccination programs are certainly desired to avoid economic losses and further spread of infectious diseases, such programs are also associated with technical challenges. Administering vaccines requires extensive handling of the fish, which causes stress and mortality because the fish must be pumped into holding tanks, transferred to an anesthetized tank, injected with vaccine, and pumped back into holding tanks. Due to the large scale of modern aquaculture, such vaccination programs are expensive and labor intensive and cause stress to the fish. For these reasons, vaccines against the various infectious diseases are preferably administered in combined, polyvalent vaccines containing several antigens.

Teoretisk skal kombinasjon av vaksiner være ukomplisert. I praksis fører imidlertid kombinasjon av flere vaksineantigener ofte til redusert virkning av hvert enkelt antigen. Slike problemer forbundet med polyvalente vaksiner, diskuteres for eksempel i André, E.F. (1999), som gir en oversikt over strategier for humane pediatriske vaksinasjonsprogrammer. Lignende problemer vekker bekymring i vaksinasjonsprogrammer for dyr, for eksempel når det gjelder vaksiner mot klovsyke hos sau, som gjennomgått av O’Meara m.fl. (1993). Theoretically, combining vaccines should be uncomplicated. In practice, however, combining several vaccine antigens often leads to a reduced effect of each individual antigen. Such problems associated with polyvalent vaccines are discussed, for example, in André, E.F. (1999), which provides an overview of strategies for human pediatric vaccination programs. Similar problems raise concerns in animal vaccination programmes, for example in the case of vaccines against foot-and-mouth disease in sheep, as reviewed by O'Meara et al. (1993).

Tross det faktum at salmonid alfavirus ble isolert og karakterisert for mer enn et tiår siden er vaksinering mot pankreassykdom fremdeles en utfordring. I europeisk patent EP 712 926 fremviser eksempel 11 data som viser at en sammensetning ment for vaksinasjonsformål basert på pankreassykdomsvirus SAV1, inaktivert ved tilsetting av beta-propiolakton og NaOH, er ineffektiv for beskyttelse mot etterfølgende infeksjon. I det samme eksperimentet synes en sammensetning basert på PDV behandlet med 0,1 % formalin (35–38 %) å fremkalle en beskyttende immunrespons i eksperimentelle omgivelser. Siden behandling med 0,1 % formalin er utilstrekkelig for å inaktivere PDV må man imidlertid konkludere med at den sistnevnte sammensetningen er en med levende virus. Begge sammensetningene inneholdt PD-virus av SAV1-undertypen med en titer på 10<7,5>TCID50ml<-1>. Despite the fact that salmonid alphavirus was isolated and characterized more than a decade ago, vaccination against pancreatic disease is still a challenge. In European patent EP 712 926, example 11 presents data showing that a composition intended for vaccination purposes based on pancreatic disease virus SAV1, inactivated by the addition of beta-propiolactone and NaOH, is ineffective for protection against subsequent infection. In the same experiment, a composition based on PDV treated with 0.1% formalin (35–38%) appears to elicit a protective immune response in an experimental setting. However, since treatment with 0.1% formalin is insufficient to inactivate PDV, one must conclude that the latter composition is one with live virus. Both compositions contained PD virus of the SAV1 subtype with a titer of 10<7.5>TCID50ml<-1>.

Per februar 2008 var kun én PD-vaksine, solgt under navnet Norvac compact PD, kommersielt tilgjengelig. Vaksinen er basert på inaktivert PD-virus av SAV1-undertypen: Et førstegenerasjonsprodukt inneholdt antigen i mengder på 10<7,2>TCID50/dose med et doseringsvolum på 100 μl. Et andregenerasjonsprodukt har blitt utviklet som inneholder 10<7,5>TCID50/dose. Rodger & Mitchell (2005) undersøkte effekten av denne vaksinen: I 2003 fant de at vaksinering ikke reduserte risikoen for utbrudd av pankreassykdom; i 2004 virket det som om vaksinerte fisk hadde en noe mindre risiko for infeksjon, men resultatet var imidlertid ikke statistisk signifikant. Videre var det i blandede populasjoner med vaksinerte og ikke-vaksinerte fisk en tendens til lavere dødelighet hos vaksinerte fisk. As of February 2008, only one PD vaccine, sold under the name Norvac compact PD, was commercially available. The vaccine is based on inactivated PD virus of the SAV1 subtype: A first-generation product contained antigen in amounts of 10<7.2>TCID50/dose with a dosing volume of 100 μl. A second generation product has been developed that contains 10<7.5>TCID50/dose. Rodger & Mitchell (2005) investigated the effect of this vaccine: in 2003 they found that vaccination did not reduce the risk of outbreaks of pancreatic disease; in 2004 it seemed that vaccinated fish had a slightly lower risk of infection, but the result was not statistically significant. Furthermore, in mixed populations with vaccinated and non-vaccinated fish, there was a tendency for lower mortality in vaccinated fish.

I sammendraget over produktkjennetegn beskrives Norvac compact PD som inkompatibel med andre vaksiner og immunologiske produkter. Følgelig anbefales denne monovalente PD-vaksinen kun for injeksjon minst 210 graddager før injeksjon av andre multivalente vaksiner som beskytter mot vanlige bakterielle sykdommer og IPNV i oppdrettsfisk (graddager beregnes som produktet av dager og temperatur: 10 dager med en temperatur på 10 ºC er det samme som 100 graddager). Under normale forhold må Norvac compact PD administreres 2–3 uker før administrasjon av en polyvalent vaksine. In the summary of product characteristics, Norvac compact PD is described as incompatible with other vaccines and immunological products. Consequently, this monovalent PD vaccine is only recommended for injection at least 210 degree days before injection of other multivalent vaccines that protect against common bacterial diseases and IPNV in farmed fish (degree days are calculated as the product of days and temperature: 10 days with a temperature of 10 ºC is the same like 100 degree days). Under normal conditions, Norvac compact PD must be administered 2-3 weeks before the administration of a polyvalent vaccine.

Ifølge sammendraget over produktkjennetegn er ingen informasjon tilgjengelig om sikkerhet og virkning for den samtidige anvendelsen av denne vaksinen sammen med noen andre immunologiske produkter. Den angitte mangelen på kompatibilitet med andre vaksiner er imidlertid konsistent med tidligere rapporter om multivalente PD-vaksiner som ikke lykkes i å fremkalle god beskyttelse mot pankreassykdom (Christie m.fl. 1999 A, Intervet newsletter 2002, Christie m.fl. According to the Summary of Product Characteristics, no information is available on the safety and efficacy of the simultaneous use of this vaccine with any other immunological products. However, the stated lack of compatibility with other vaccines is consistent with previous reports of multivalent PD vaccines failing to induce good protection against pancreatic disease (Christie et al. 1999 A, Intervet newsletter 2002, Christie et al.

1999 B). Christie rapporterte induksjon av nøytraliserende antistoffer i 60 % av individene vaksinert med en monovalent PD-vaksine. Den beskjedne virkningen ble kraftig kompromittert da vaksinen ble kombinert med andre immunologiske produkter siden den resulterende polyvalente vaksinen induserte nøytraliserende antistoffer i kun 20 % av de vaksinerte individene. 1999B). Christie reported the induction of neutralizing antibodies in 60% of subjects vaccinated with a monovalent PD vaccine. The modest efficacy was greatly compromised when the vaccine was combined with other immunological products since the resulting polyvalent vaccine induced neutralizing antibodies in only 20% of vaccinated individuals.

I EP 1 075 523 er oppfinnerne også bekymret over problemet med at PD-vaksiner er inkompatible med andre vaksiner. I avsnitt [0004] heter det: “En ulempe i produksjonen av inaktiverte vaksiner fra PD-viruset beskrevet i EP-A-712 926, er den langsomme veksten av viruset, spesielt i cellekulturer, noe som gjør fremstillingen av vaksinene til en relativ ineffektiv prosess. En ytterligere ulempe med de inaktiverte vaksinene er ustabiliteten til det inaktiverte viruset i nærvær av andre inaktiverte patogener hvilket fører til potenstap. Fiskevaksiner fremstilles generelt som multivalente vaksiner, og det kreves betydelig høyere mengder inaktiverte virus i de multivalente vaksinene enn det som ville være nødvendig i en monovalent vaksine for å kompensere for potenstapet.” Oppfinnerne viser til rekombinante proteinvaksiner som en løsning, men slike rekombinante vaksiner har aldri blitt implementert i behandlingen av pankreassykdom. I WO2007031572 A1 identifiserte oppfinnerene en epitop for SAV E2 med evne til å indusere en virus-nøytraliserende immunrespons til bruk for vaksineutvikling og diagnostikk. In EP 1 075 523 the inventors are also concerned about the problem of PD vaccines being incompatible with other vaccines. In paragraph [0004] it is stated: “A disadvantage in the production of inactivated vaccines from the PD virus described in EP-A-712 926 is the slow growth of the virus, especially in cell cultures, which makes the production of the vaccines relatively inefficient process. A further disadvantage of the inactivated vaccines is the instability of the inactivated virus in the presence of other inactivated pathogens which leads to loss of potency. Fish vaccines are generally produced as multivalent vaccines, and significantly higher amounts of inactivated virus are required in the multivalent vaccines than would be required in a monovalent vaccine to compensate for the loss of potency." The inventors refer to recombinant protein vaccines as a solution, but such recombinant vaccines have never been implemented in the treatment of pancreatic disease. In WO2007031572 A1, the inventors identified an epitope for SAV E2 capable of inducing a virus-neutralizing immune response for use in vaccine development and diagnostics.

Som en konklusjon er eksisterende vaksinasjonsprogrammer mot fiskepankreatisk sykdom fremdeles ineffektive og har ikke vært i stand til å stoppe spredning av sykdommen. I tillegg er, ifølge den generelle oppfatningen på området, PD-vaksiner basert på inaktiverte virus kun tilgjengelig til høy produksjonskostnader og de er inkompatible med vaksiner mot andre smittsomme sykdommer som er utbredt i oppdrettsfisk. In conclusion, existing vaccination programs against fish pancreatic disease are still ineffective and have not been able to stop the spread of the disease. In addition, according to the general opinion in the field, PD vaccines based on inactivated viruses are only available at high production costs and they are incompatible with vaccines against other infectious diseases prevalent in farmed fish.

Det er derfor fremdeles et akutt behov for effektive tiltak som kan kontrollere fiskepankreatisk sykdom, både av etiske og økonomiske grunner. There is therefore still an urgent need for effective measures that can control fish pancreatic disease, both for ethical and economic reasons.

Oppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention

Et formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe i) et isolert alfavirus av undertpe SAV 3; samt måter for å forebygge eller kontrollere infeksjoner av salmonid alfavirus og utbrudd av fiskepankreatisk sykdom (fish pancreatic disease) eller sovesyke (sleeping disease) ved anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertpe SAV3. An object of the present invention is to provide i) an isolated alpha virus of subtype SAV 3; as well as ways to prevent or control salmonid alphavirus infections and outbreaks of fish pancreatic disease (fish pancreatic disease) or sleeping sickness (sleeping disease) using an inactivated salmonid alphavirus of subtpe SAV3.

Spesielt vedrører ett aspekt av oppfinnelsen et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved In particular, one aspect of the invention relates to an isolated salmonid alphavirus of subtype SAV3 which comprises a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 1 and is further characterized by

a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og a. a visible cytopathogenic effect during early passage in cell culture, and

b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og b. the ability to induce mortality of at least 30% in a laboratory infection model, the model includes smoltification of Atlantic salmon according to standard procedures and post-smolt challenge by intraperitoneal injection with a SAV3 dose of at least 10<8>TCID50 per fish, such as at least 10<9>TCID50, at least 10<10>TCID50 or preferably at least 3.5 x 10<8>TCID50 per fish within one day of transfer to seawater at 12 <o>C, and

c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler. c. the ability to grow in vitro to a titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml in the supernatant/growth medium cultures of CHH-1 cells or CHSE-214 cells.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor virus har en synlig cytopatogen effekt under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler. The invention also provides isolated virus as defined above, wherein the virus has a detectable cytopathogenic effect during the first, second, third or fourth passage on a culture of CHSE cells.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor nevnte titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml oppnås når: The invention also provides isolated virus as defined above, wherein said titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml is achieved when:

i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet på 0,1-1x10<5 >celler cm<-2>; i) Cells are cultured using host cells that have been seeded at a density of 0.1-1x10<5 >cells cm<-2>;

ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon; ii) The host cells are cultured for 4-6 days prior to virus infection;

iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 x10<6 >celler cm<-2 >på infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat; iii) The host cells are cultured to a density of 0.1-1.0 x10<6 >cells cm<-2 >at the time of infection with said virus isolate;

iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin og iv) The host cells are cultured in a growth medium comprising EMEM (EBSS) + 10% fetal bovine serum (FBS) 2 mM L-glutamine 1% non-essential amino acids (NEAA) 0.1% gentamicin and

v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 ºC i en periode på 10-14 dager. v) The infected cells are cultured at a temperature of 15 ºC for a period of 10-14 days.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 80 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 4. The invention also provides isolated virus as defined above, wherein the virus comprises a nucleic acid sequence that is at least 80% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 4.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1. The invention also provides isolated virus as defined above, wherein the virus comprises a nucleic acid sequence that is at least 98% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor virus er positive i en SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR-identitetstest ved anvendelse et sett primere slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8 og betingelsene 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40. The invention also provides isolated virus as defined above, which virus is positive in a SAV reverse transcriptase quantitative PCR identity test using a set of primers such as the primers set forth in SEQ ID NO: 7 and 8 and the conditions 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sec - 57 <o>C, 60 sec -72 <o>C, 30 sec)*40.

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolert virus som definert ovenfor, hvor viruset er en genetisk variant av en enkelt av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201 og 07121202. The invention also provides isolated virus as defined above, wherein the virus is a genetic variant of a single of the virus strains deposited under the Budapest Convention at the European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12 December 2007 under deposit numbers 07121201 and 07121202.

Et annet aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertype SAV3, hvor virus omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved Another aspect of the invention provides a use of an inactivated salmonid alpha virus of subtype SAV3, wherein the virus comprises a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and is further characterized by

a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, og c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler; i fremstillingen av en vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus. a. a visible cytopathogenic effect during early passage in cell culture, and b. the ability to induce mortality of at least 30% in a laboratory infection model, the model includes smoltification of Atlantic salmon according to standard procedures and post-smolt challenge by intraperitoneal injection with a dose of SAV3 of at least 10<8>TCID50 per fish, such as at least 10<9>TCID50, at least 10<10>TCID50 or preferably at least 3.5 x 10<8>TCID50 per fish within one day of transfer to seawater at 12 <o>C, and c. the ability to grow in vitro to a titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml in the supernatant/growth medium cultures of CHH-1 cells or CHSE- 214 cells; in the manufacture of a vaccine to prevent or reduce the incidence of infection with salmonid alphavirus.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en anvendelse som definert ovenfor, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved tilsetting av formaldehyd. The invention also provides a use as defined above, in which the salmonid alphavirus is inactivated by the addition of formaldehyde.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en anvendelse som definert ovenfor, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 1,5-2,5 g/kg, formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 48–96 timer ved en temperatur fra 14–17 <º>C. The invention also provides a use as defined above, in which the salmonid alphavirus is inactivated using a procedure comprising the addition of 1.5-2.5 g/kg, formaldehyde and subsequent incubation for 48-96 hours at a temperature of 14-17 <º>C.

Kort beskrivelse av figurene Brief description of the figures

Figur 1 viser SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra CHH-1-cellekulturer inokulert med forskjellige SAV3-isolater eller passasjer av isolater. Figure 1 shows SAV3 titers in crude supernatants from CHH-1 cell cultures inoculated with different SAV3 isolates or passages of isolates.

Figur 2 er en fremstilling av SAV3-titre i ubearbeidede supernatanter fra SAV3-infiserte CHSE-214-cellekulturer. Figure 2 is a representation of SAV3 titers in crude supernatants from SAV3-infected CHSE-214 cell cultures.

Figur 3 A og B viser % akkumulert dødelighet etter utfordring av atlantisk laksesmolt med salmonid alfavirus type 3 (SAV3). Figuren viser enn videre effekten av å vaksinere fisk i parrstadiet mot salmonid pankreassykdom ved anvendelse av en polyvalent vaksine ifølge oppfinnelsen. To parallelle eksperimenter ble utført i separate utfordringstanker (A og B). Figure 3 A and B shows % accumulated mortality after challenge of Atlantic salmon smolt with salmonid alphavirus type 3 (SAV3). The figure further shows the effect of vaccinating fish in the mating stage against salmonid pancreatic disease using a polyvalent vaccine according to the invention. Two parallel experiments were conducted in separate challenge tanks (A and B).

Foreliggende oppfinnelse vil i det følgende bli beskrevet mer detaljert. The present invention will be described in more detail below.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Detailed description of the invention

Foreliggende oppfinnelse er basert på observasjonen at til tross for tidligere rapporter om det motsatte, er utvikling av polyvalente vaksiner som kombinerer inaktivert salmonid alfavirus med vaksiner mot andre fiskepatogener faktisk den mest effektive måten for å beskytte oppdrettslaks mot pankreassykdom. The present invention is based on the observation that, despite previous reports to the contrary, the development of polyvalent vaccines combining inactivated salmonid alpha virus with vaccines against other fish pathogens is actually the most effective way to protect farmed salmon against pancreatic disease.

Oppfinnerne gjorde spesielt følgende observasjoner: In particular, the inventors made the following observations:

i) Til tross for testing av forskjellige vaksineformuleringer var det ikke mulig å etablere noen ugunstig effekt av andre vaksinekomponenter på stabiliteten av pankreassykdomsantigenet. Med andre ord: PD-vaksiner basert på inaktiverte virus er høyst kompatible med vaksiner mot for tiden utbredte fiksepatogener; i) Despite testing different vaccine formulations, it was not possible to establish any adverse effect of other vaccine components on the stability of the pancreatic disease antigen. In other words: PD vaccines based on inactivated viruses are highly compatible with vaccines against currently widespread fixed pathogens;

ii) I vaksiner basert på inaktivert virus synes en minste antigentiter i området 3,75 x 10<7 >TCID50/dose å være ønskelig for å effektivt indusere beskyttende immunitet, noe som indikerer at tidligere vaksinasjonsprogrammer har vært basert på vaksiner som inneholdt utilstrekkelige mengder antigen; ii) In vaccines based on inactivated virus, a minimum antigen titer in the range of 3.75 x 10<7 >TCID50/dose seems desirable to effectively induce protective immunity, indicating that previous vaccination programs have been based on vaccines containing insufficient amounts antigen;

iii) Titre av salmonid alfavirus som er tilstrekkelige for fremstilling i stor skala av vaksiner med god virkning, kan visselig oppnås ved å anvende konvensjonell teknologi for viruspropagering og til en rimelig pris. iii) Titers of salmonid alpha virus sufficient for the large-scale production of vaccines with good efficacy can certainly be obtained using conventional virus propagation technology and at a reasonable cost.

Mikrobiologisk materiale Microbiological material

I forbindelse med foreliggende oppfinnelse har isolater av salmonide alfavirus blitt deponert under Budapestkonvensjonen hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under følgende aksesjonsnumre: 07121201, som svarer til isolat ALV 405 i eksemplene; 07121202, som svarer til isolat ALV 407 i eksemplene; og 07121203 som svarer til isolat ALV 409 i eksemplene. In connection with the present invention, isolates of salmonid alphavirus have been deposited under the Budapest Convention at the European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK on 12 December 2007 under the following accession numbers: 07121201 , which corresponds to isolate ALV 405 in the examples; 07121202, which corresponds to isolate ALV 407 in the examples; and 07121203 which corresponds to isolate ALV 409 in the examples.

Polyvalente vaksiner som inneholder antigener fra typiske fiskepatogener bortsett fra salmonide alfavirus, er velkjente i faget og er allerede kommersielt tilgjengelige. Identifikasjonen og isoleringen av passende antigener som skal anvendes i slike vaksiner er beskrevet i litteraturen og gir således fagmannen mulighet til å generere og fremstille slike polyvalente vaksiner. I tillegg er representative isolater av relevante fiskepatogener tilgjengelige uten restriksjoner fra forskjellige kilder. For eksempel er følgende bakteriearter tilgjengelige fra LGCPromochem/American Type Culture Collection ATCC oppbevarings- og distribusjonssenter (ATCC): A. salmonicida (ATCC 33658<TM >opphavsland: ikke oppgitt), Aeromonas hydrophila, V. salmonicida (ATCC 43839<TM>, opphavsland: Norge), V. anguillarum serotype O1(ATCC 43305<TM>, opphavsland: Danmark) og O2(ATCC 19264)<TM>, opphavsland: ikke oppgitt) og Moritella viscosa (ATCC BAA-105<TM>, opphavsland: Norge). Flavobacterium columnaris (deponert som Cytophaga columnaris) er tilgjengelig under ATCC-nummer 23463™ (Opphavsland: USA). Polyvalent vaccines containing antigens from typical fish pathogens except salmonid alphaviruses are well known in the art and are already commercially available. The identification and isolation of suitable antigens to be used in such vaccines is described in the literature and thus enables the person skilled in the art to generate and prepare such polyvalent vaccines. In addition, representative isolates of relevant fish pathogens are available without restriction from different sources. For example, the following bacterial species are available from the LGCPromochem/American Type Culture Collection ATCC Storage and Distribution Center (ATCC): A. salmonicida (ATCC 33658<TM >country of origin: not stated), Aeromonas hydrophila, V. salmonicida (ATCC 43839<TM>, country of origin: Norway), V. anguillarum serotype O1(ATCC 43305<TM>, country of origin: Denmark) and O2(ATCC 19264)<TM>, country of origin: not stated) and Moritella viscosa (ATCC BAA-105<TM>, country of origin: Norway). Flavobacterium columnaris (deposited as Cytophaga columnaris) is available under ATCC number 23463™ (Country of origin: USA).

Når det gjelder Piscirickettsia salmonis, har nåværende søker deponert flere nyttige isolater under Budapesttraktaten hos European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK: tre isolater ble deponert 9. juni 2006 under aksesjonsnumrene 06050901, 06050902 og 06050903 (isolat AL10005, AL10007 og AL10008). Et enkelt isolat ble deponert 21. mars 2007 under aksesjonsnummer 07032110 (opphavsland: Chile). På en lignende måte er representative isolater av relevante virusarter tilgjengelige inklusive infectious pancreatic necrosis virus (IPNV, ATCC VR-1318, opprinnelsesland: ikke oppgitt), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV, ATCC VR_1389, opprinnelsesland: Danmark); Infectious Hematopoietic Nerosis Virus (IHNV, ATCC VR-1392, opprinnelsesland: USA)); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC, ATCC VR-1390, opprinnelsesland: Danmark); Channel Catfish Virus (CCV) (ATCC VR-665, opprinnelsesland: USA); Infectious Salmon Anaemia (ISA) virus (ATCC VR-1554, opprinnelsesland: Regarding Piscirickettsia salmonis, the present applicant has deposited several useful isolates under the Budapest Treaty with the European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK: three isolates were deposited on 9 June 2006 under accession numbers 06050901, 06050902 and 06050903 (isolate AL10005, AL10007 and AL10008). A single isolate was deposited on 21 March 2007 under accession number 07032110 (country of origin: Chile). Similarly, representative isolates of relevant virus species are available including infectious pancreatic necrosis virus (IPNV, ATCC VR-1318, country of origin: not stated), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV, ATCC VR_1389, country of origin: Denmark); Infectious Hematopoietic Nerosis Virus (IHNV, ATCC VR-1392, Country of Origin: USA)); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC, ATCC VR-1390, country of origin: Denmark); Channel Catfish Virus (CCV) (ATCC VR-665, Country of Origin: USA); Infectious Salmon Anemia (ISA) virus (ATCC VR-1554, country of origin:

Canada). Canada).

Patentdeponeringer har tidligere blitt gjort av nåværende søker av følgende virusarter: Heart and Skeletal Muscle Infection Virus (HSMIV, patentdeponeringsnr. ECACC 04050401, opprinnelsesland: Norge); Cardiomyopathic syndrome virus (CMSV, patentdeponeringsnr. ECACC 07032902, opprinnelsesland: Norge). Patent filings have previously been made by the current applicant for the following virus species: Heart and Skeletal Muscle Infection Virus (HSMIV, patent filing no. ECACC 04050401, country of origin: Norway); Cardiomyopathic syndrome virus (CMSV, patent deposit no. ECACC 07032902, country of origin: Norway).

Definisjoner Definitions

Før foreliggende oppfinnelse diskuteres i videre detaljer vil de følgende uttrykkene og konvensjonene bli definert: Before the present invention is discussed in further detail, the following terms and conventions will be defined:

“Et antigent og/eller immunogent materiale” i foreliggende kontekst refererer til et materiale som inneholder én eller flere beskyttende epitoper. En epitop er beskyttende hvis den kan indusere en immunrespons som er i stand til å effektivt interferere med omfanget eller utviklingen av infeksjon med salmonid alfavirus, inklusive SAV1, SAV2 og spesielt SAV3. Uttrykket innbefatter polypeptider, inklusive polypeptider som er fremstilt ved bruk av rekombinante teknikker og deler av slike polypeptider. "An antigenic and/or immunogenic material" in the present context refers to a material containing one or more protective epitopes. An epitope is protective if it can induce an immune response capable of effectively interfering with the extent or progression of infection with salmonid alphaviruses, including SAV1, SAV2 and especially SAV3. The term includes polypeptides, including polypeptides produced using recombinant techniques and parts of such polypeptides.

Uttrykket “genotypiske karakteristika” viser i store trekk til sammensetningen av én eller flere deler av et individs genom som bidrar til å bestemme en spesifikk egenskap. The term "genotypic characteristics" broadly refers to the composition of one or more parts of an individual's genome that contribute to determining a specific characteristic.

Med hensyn til viruset ifølge oppfinnelsen brukes uttrykket “relaterte genotypiske karakteristika” i relasjon til virus som innehar nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med kjente nukleinsyresekvenser fra tidligere isolerte salmonide alfavirus. Sammenligning kan gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for en enkelt av de nsP1, nsP2, nsP3 og nsP4 ikkestrukturelle proteinene. Sammenligning kan videre gjøres med nukleinsyresekvensene som koder for kapsid, glykoprotein E2, glykoprotein E3 eller 6K- og gpE1-proteiner. Uttrykket anvendes spesielt for å definere virus som har nukleinsyresekvenser med en høy grad av sekvensidentitet sammenlignet med alle slike kjente aminosyresekvenser av deponerte isolater ALV 405, ALV 407 og/eller ALV 409. Med sikte på å definere de virale isolatene anvendt i forbindelse med foreliggende oppfinnelse vises det spesielt til nukleinsyresekvenser av glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1-6. Det skal derfor forstås at viruset ifølge oppfinnelsen innehar nukleinsyresekvenser som er minst 80 % identiske, slik som minst 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % eller 99,9 % identiske med nukleinsyresekvensene i glykoprotein E2 og det ikke-strukturelle proteinet nsP3 som tilveiebrakt heri og identifisert ved SEQ ID NOs: 1–6. With regard to the virus according to the invention, the expression "related genotypic characteristics" is used in relation to viruses that contain nucleic acid sequences with a high degree of sequence identity compared to known nucleic acid sequences from previously isolated salmonid alphaviruses. Comparison can be made with the nucleic acid sequences encoding a single one of the nsP1, nsP2, nsP3 and nsP4 nonstructural proteins. Comparison can further be made with the nucleic acid sequences that code for capsid, glycoprotein E2, glycoprotein E3 or 6K and gpE1 proteins. The term is used in particular to define viruses that have nucleic acid sequences with a high degree of sequence identity compared to all such known amino acid sequences of deposited isolates ALV 405, ALV 407 and/or ALV 409. With the aim of defining the viral isolates used in connection with the present invention reference is made in particular to nucleic acid sequences of glycoprotein E2 and the non-structural protein nsP3 as provided herein and identified by SEQ ID NOs: 1-6. It should therefore be understood that the virus according to the invention contains nucleic acid sequences that are at least 80% identical, such as at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8% or 99.9% identical to the nucleic acid sequences of glycoprotein E2 and the non-structural protein nsP3 as provided herein and identified by SEQ ID NOs: 1-6.

Uttrykket “sekvensidentitet” indikerer et kvantitativt mål på graden av homologi mellom to aminosyresekvenser eller mellom to nukleinsyresekvenser med lik lengde. Hvis de to sekvensene som skal sammenlignes ikke har lik lengde, må de justeres for å gi best mulig tilpassing, som tillater innsettingen av hull (gaps) eller alternativt trunkering ved endene av polypeptidsekvensene eller The term "sequence identity" indicates a quantitative measure of the degree of homology between two amino acid sequences or between two nucleic acid sequences of equal length. If the two sequences to be compared are not of equal length, they must be aligned to provide the best possible match, allowing the insertion of gaps or alternatively truncation at the ends of the polypeptide sequences or

nukleotidsekvensene. Sekvensidentiteten kan beregnes som der Ndif er det totale antall ikke-identiske rester i de to sekvensene når de er justert, og hvori Nref er antall rester i én av sekvensene. Derfor vil DNA-sekvensen AGTCAGTC ha en sekvensidentitet på 75 % med sekvensen AATCAATC (Ndif=2 og Nref=8). Et hull regnes som ikke-identitet av de(n) spesifikke resten(e), dvs. DNA-sekvensen AGTGTC vil ha en sekvensidentitet på 75 % med DNA-sekvensen AGTCAGTC (Ndif=2 og Nref=8). the nucleotide sequences. The sequence identity can be calculated as where Ndif is the total number of non-identical residues in the two sequences when aligned, and where Nref is the number of residues in one of the sequences. Therefore, the DNA sequence AGTCAGTC will have a sequence identity of 75% with the sequence AATCAATC (Ndif=2 and Nref=8). A gap is considered non-identity of the specific residue(s), i.e. the DNA sequence AGTGTC will have a sequence identity of 75% with the DNA sequence AGTCAGTC (Ndif=2 and Nref=8).

Med hensyn til alle oppfinnelsens utførelsesformer som vedrører nukleotidsekvenser, kan også prosenten av sekvensidentitet mellom én eller flere sekvenser være basert på tilpasning ved bruk av clustalW software (http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html) med standardinnstillinger. For nukleotidsekvenstilpasninger er disse innstillingene: Tilpasning=3Dfull, Gap Open 10,00, Gap Ext. 0,20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB). With respect to all embodiments of the invention that relate to nucleotide sequences, the percentage of sequence identity between one or more sequences can also be based on alignment using clustalW software (http:/www.ebi.ac.uk/clustalW/index.html) with default settings. For nucleotide sequence alignments, these settings are: Alignment=3Dfull, Gap Open 10.00, Gap Ext. 0.20, Gap separation Dist. 4, DNA weight matrix: identity (IUB).

Alternativt kan nukleotidsekvenser analyseres ved å bruke programmet DNASIS Max, og sammenligningen av sekvensene kan gjøres ved http://www.paralign.org/. Denne servicen er basert på de to sammenligningsalgoritmene kalt Smith-Waterman (SW) og ParAlign. Den første algoritmen ble publisert av Smith og Waterman (1981) og er en veletablert metode som finner den optimale lokale tilpasningen for to sekvenser. Den andre algoritmen, ParAlign, er en heuristisk metode for sekvenstilpasning; detaljer om metoden er publisert i Rognes (2001). Standardinnstillinger for score matrix og Gap-handikap samt E-verdier ble brukt. Alternatively, nucleotide sequences can be analyzed using the program DNASIS Max, and the comparison of the sequences can be done at http://www.paralign.org/. This service is based on the two comparison algorithms called Smith-Waterman (SW) and ParAlign. The first algorithm was published by Smith and Waterman (1981) and is a well-established method that finds the optimal local fit for two sequences. The second algorithm, ParAlign, is a heuristic method of sequence alignment; details of the method are published in Rognes (2001). Default settings for score matrix and Gap handicap as well as E-values were used.

Uttrykket “fenotypiske karakteristika” viser like generelt til én eller flere observerbare egenskaper hos en organisme som frembringes ved interaksjon av den arvede genotypen til individet med overførte epigenetiske faktorer og/eller ikke-nedarvet miljømessig variasjon. I sammenheng med foreliggende oppfinnelse inkluderer uttrykket “relaterte fenotypiske karakteristika” enhver av de følgende karakteristika: størrelse, fasong, pH-stabilitet, temperaturstabilitet, kloroformsensitivitet og hemagglutinasjon. The term "phenotypic characteristics" refers just as generally to one or more observable characteristics of an organism that are produced by the interaction of the inherited genotype of the individual with transmitted epigenetic factors and/or non-inherited environmental variation. In the context of the present invention, the term "related phenotypic characteristics" includes any of the following characteristics: size, shape, pH stability, temperature stability, chloroform sensitivity and hemagglutination.

“Fenotypiske karakteristika” inkluderer videre evnen til å fremkalle ethvert av de kliniske tegnene på pankreatisk sykdom og sovesyke, inklusive store patologiske tegn og histopatologiske tegn som beskrevet i foreliggende søknad. “Fenotypiske karakteristika” inkluderer også virusets evne til å introdusere slike kliniske tegn i et laboratorieutfordringseksperiment som beskrevet heri. Enn videre refererer uttrykket til virusets opptreden når det vokser på cellekulturer, inklusive vekstkinetikk og evnen til å fremkalle en cytopatogen effekt. "Phenotypic characteristics" further includes the ability to elicit any of the clinical signs of pancreatic disease and sleeping sickness, including gross pathological signs and histopathological signs as described in the present application. "Phenotypic characteristics" also includes the ability of the virus to introduce such clinical signs in a laboratory challenge experiment as described herein. Furthermore, the expression refers to the behavior of the virus when it grows on cell cultures, including growth kinetics and the ability to induce a cytopathogenic effect.

Uttrykkene SAV1, SAV2 og SAV3 definerer undertyper av salmonide alfavirus: SAV1-undertypen er definert og karakterisert i Nelson m.fl. Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995 og et representativt isolat har blitt deponert ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. SAV2-undertypen er på den annen side utløsende for “sovesyke” og ble først isolert og karakterisert av Castric m.fl. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997. SAV3-undertypen ble først isolert og karakterisert av Hodneland m.fl. som beskrevet i Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5; 66(2):113-20 (Erratum i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181). Uttrykkene SAV4, SAV5 og SAV6 definerer nye undertyper av salmonide alfavirus funnet nær Skottland og Irland. The terms SAV1, SAV2 and SAV3 define subtypes of salmonid alphaviruses: the SAV1 subtype is defined and characterized in Nelson et al. Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995 and a representative isolate has been deposited at ECACC under accession number V94090731. The SAV2 subtype, on the other hand, is the trigger for "sleeping sickness" and was first isolated and characterized by Castric et al. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997. The SAV3 subtype was first isolated and characterized by Hodneland et al. as described in Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5; 66(2):113-20 (Erratum in: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181). The terms SAV4, SAV5 and SAV6 define new subtypes of salmonid alphavirus found near Scotland and Ireland.

Som fagmannen vil forstå, viser “cytopatogen effekt” til synlige morfologiske endringer i celler infisert med virus. Den kan spesielt inkludere avstenging av cellulært RNA og proteinsyntese, cellefusjon, frigjøring av lysosomale enzymer, endringer i cellemembranpermeabilitet, diffuse endringer i intracellulære strukturer, tilstedeværelse av virale inklusjonslegemer og kromosomale aberrasjoner. As those skilled in the art will understand, "cytopathogenic effect" refers to visible morphological changes in cells infected with virus. In particular, it may include shutdown of cellular RNA and protein synthesis, cell fusion, release of lysosomal enzymes, changes in cell membrane permeability, diffuse changes in intracellular structures, presence of viral inclusion bodies and chromosomal aberrations.

Uttrykket “komponent eller del av nevnte virus” viser til en komponent eller del av nukleinsyrekjernen til viruset eller den omliggende proteinkappen. The expression "component or part of said virus" refers to a component or part of the nucleic acid core of the virus or the surrounding protein coat.

“Cellekultur” viser til kulturer av celler slik som omdannede celler etablert in vitro. Spesielt, som anvendt heri, viser "cellelinje" til en populasjon av celler som er i stand til kontinuerlig eller langvarig vekst og deling in vitro. Ofte er cellelinjer klonale populasjoner avledet fra en enkelt stamcelle. Det er videre kjent i faget at spontane eller induserte endringer kan forekomme i karyotyp under lagring eller overføring av slike klonale populasjoner. Celler avledet fra cellelinjen det vises til kan derfor ikke være helt identiske med stamcellene eller -kulturene, og cellelinjen det vises til inkluderer slike varianter. Uttrykket “cellelinjer" inkluderer også immortaliserte celler. "Cell culture" refers to cultures of cells such as transformed cells established in vitro. In particular, as used herein, "cell line" refers to a population of cells capable of continuous or prolonged growth and division in vitro. Often, cell lines are clonal populations derived from a single stem cell. It is further known in the art that spontaneous or induced changes can occur in karyotype during storage or transfer of such clonal populations. Therefore, cells derived from the cell line referred to may not be completely identical to the stem cells or cultures, and the cell line referred to includes such variants. The term "cell lines" also includes immortalized cells.

Uttrykket “adjuvans” brukes i sin normale betydning og definerer et middel som kan stimulere immunsystemet og øke responsen på en vaksine uten å ha noen spesifikk antigen effekt i seg selv. The term "adjuvant" is used in its normal sense and defines an agent that can stimulate the immune system and increase the response to a vaccine without having any specific antigenic effect in itself.

På samme måte brukes uttrykket “emulgator” vanligvis for å definere en substans som stabiliserer en emulsjon, ofte en surfaktant. Similarly, the term "emulsifier" is usually used to define a substance that stabilizes an emulsion, often a surfactant.

Uttrykket “detergent” definerer en annen surfaktantklasse som vil interagere kjemisk med både olje og vann og dermed stabilisere grenseflaten mellom oljeeller vanndråper i en suspensjon. The term "detergent" defines another surfactant class that will interact chemically with both oil and water and thus stabilize the interface between oil or water droplets in a suspension.

Emulsjoner omfattende vann og olje omtales generelt enten som vann-i-olje emulsjoner, olje-i-vann emulsjoner eller vann-i-olje-i vann emulsjoner. Hvorvidt en emulsjon blir en vann-i-olje emulsjon eller en olje-i-vann emulsjon avhenger av volumfraksjonen av begge faser og av emulgatortypen. Generelt tenderer emulgatorer og emulgerende partikler til å fremme dispersjon av fasen de ikke løses særlig godt i. Proteiner løses f.eks. bedre i vann enn i olje og tenderer dermed til å danne olje-i-vann emulsjoner (dvs., de fremmer spredningen av oljedråper gjennom en kontinuerlig vannfase). Emulsions comprising water and oil are generally referred to either as water-in-oil emulsions, oil-in-water emulsions or water-in-oil-in-water emulsions. Whether an emulsion becomes a water-in-oil emulsion or an oil-in-water emulsion depends on the volume fraction of both phases and on the type of emulsifier. In general, emulsifiers and emulsifying particles tend to promote dispersion of the phase in which they do not dissolve very well. Proteins are dissolved, e.g. better in water than in oil and thus tend to form oil-in-water emulsions (ie, they promote the spreading of oil droplets through a continuous water phase).

I den foreliggende sammenhengen er en “surfaktant”, også kjent som “et tensid”, et fuktemiddel som senker overflatespenningen i en væske, tillater lettere spredning og senker grenseflatespenningen mellom to væsker. In the present context, a "surfactant", also known as "a surfactant", is a wetting agent that lowers the surface tension in a liquid, allows easier spreading and lowers the interfacial tension between two liquids.

Til sist, i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, anvendes en ”polyvalent vaksine” (også kjent som multivalent vaksine) for å definere en kombinasjon av flere antigener i én vaksine. Derfor kan en polyvalent vaksine beskytte mot mer enn én sykdom. I motsetning til en polyvalent vaksine er en “monovalent vaksine” en vaksine som inneholder vaksinekomponenter rettet mot bare ett patogen. Spesielt kan en monovalent vaksine inneholde bare ett antigen som beskytter mot én spesiell sykdom. Finally, in the context of the present invention, a "polyvalent vaccine" (also known as multivalent vaccine) is used to define a combination of several antigens in one vaccine. Therefore, a polyvalent vaccine can protect against more than one disease. In contrast to a polyvalent vaccine, a "monovalent vaccine" is a vaccine that contains vaccine components directed against only one pathogen. In particular, a monovalent vaccine may contain only one antigen that protects against one particular disease.

Ifølge et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved According to a first aspect, the present invention provides an isolated salmonid alphavirus of subtype SAV3 which comprises a nucleic acid sequence which is at least 90% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 1 and is further characterized by

Det er også beskrevet en sammensetning som omfatter et salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav, kombinert med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: Also described is a composition comprising a salmonid alphavirus or an antigenic and/or immunogenic material derived therefrom, combined with one or more components selected from the group consisting of:

a. en levende, svekket, drept eller inaktivert bakterie, a. a live, weakened, killed or inactivated bacterium,

b. et virus som ikke er salmonid alfavirus, nevnte virus er fortrinnsvis svekket eller inaktivert, b. a virus that is not salmonid alphavirus, said virus is preferably weakened or inactivated,

c. en sopp, c. a mushroom,

d. en parasitt og d. a parasite and

e. et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d). e. an antigenic and/or immunogenic material derived from said bacterium in a), from said virus in b), from said fungus in c) or from said parasite in d).

Selv om sammensetninger basert på underenheter av viruset, for eksempel sammensetninger omfattende rekombinante antigener, kan overveies, foretrekkes det at sammensetningen fremstilles på grunnlag av kulturer av viruset. For det formål er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5x10<8 >TCID50/ml. Although compositions based on subunits of the virus, for example compositions comprising recombinant antigens, may be contemplated, it is preferred that the composition be prepared on the basis of cultures of the virus. For that purpose, it is desirable that the composition contains salmonid alphavirus at a titer of at least 7.5x10<8>TCID50/ml.

Selv om naturlig forekommende ikke-virulente stammer av salmonide alfavirus og stammer av viruset som har blitt svekket i laboratoriet kan overveies, inneholder sammensetningen fortrinnsvis et salmonid alfavirus som enten er drept eller inaktivert. Although naturally occurring non-virulent strains of salmonid alphavirus and strains of the virus that have been attenuated in the laboratory may be contemplated, the composition preferably contains a salmonid alphavirus that has been either killed or inactivated.

På lignende vis er bakterie-, sopp- og parasittkomponentene i vaksinen fortrinnsvis drept eller på annen måte gjort ute av stand til å infisere/angripe fisken. In a similar way, the bacterial, fungal and parasite components of the vaccine are preferably killed or otherwise rendered incapable of infecting/attacking the fish.

Inaktivering av viruset kan oppnås med kjemiske eller fysiske metoder. Inactivation of the virus can be achieved by chemical or physical methods.

Kjemisk inaktivering kan utføres ved behandling av virusene med for eksempel, men ikke begrenset til, behandling med enzymer, med formaldehyd, βpropiolakton eller etylenimin eller et derivat derav, med organisk løsningsmiddel (f.eks. 30 halogenert hydrokarbon) og/eller detergent, f.eks. Triton<® >eller Tween<®>. Fysiologisk inaktivering kan fordelaktig utføres ved å underkaste virusene energirik stråling slik som UV-lys, gammabestråling eller røntgenstråler. Om nødvendig kan inaktiveringsmidlet nøytraliseres med tiosulfat. Om nødvendig returneres pH deretter til ca pH 7. Chemical inactivation can be carried out by treating the viruses with, for example, but not limited to, treatment with enzymes, with formaldehyde, βpropiolactone or ethyleneimine or a derivative thereof, with organic solvent (e.g. halogenated hydrocarbon) and/or detergent, f .ex. Triton<® >or Tween<®>. Physiological inactivation can advantageously be carried out by subjecting the viruses to high-energy radiation such as UV light, gamma irradiation or X-rays. If necessary, the inactivating agent can be neutralized with thiosulphate. If necessary, the pH is then returned to about pH 7.

Mens inaktivering med formaldehyd tidligere har blitt ansett suboptimalt som en metode for inaktivering av salmonid alfavirus, har nåværende oppfinnere erfart at formaldehydinaktivering virkelig er en nyttig tilnærming. I en fortrukket utførelsesform inaktiveres viruset ved tilsetting av formaldehyd. I en fortrukket utførelsesform inaktiveres viruset ved tilsetting av 1,5-2,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 12-96 timer, slik som i 48-84 timer ved en temperatur fra 13-17 ºC, slik som fra 14-16 ºC. While formaldehyde inactivation has previously been considered suboptimal as a method of salmonid alphavirus inactivation, the present inventors have learned that formaldehyde inactivation is indeed a useful approach. In a preferred embodiment, the virus is inactivated by the addition of formaldehyde. In a preferred embodiment, the virus is inactivated by the addition of 1.5-2.5 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 12-96 hours, such as for 48-84 hours at a temperature from 13-17 ºC, such as from 14- 16 ºC.

Viruset inkuberes med formaldehyd i en periode på 12 – 96 timer, slik som fra 24 - 96 timer, fra 36 - 96 timer, fra 36 - 72 timer, fra 36 - 60 timer eller slik som fra 48 - 96 timer, fra 48 - 72 timer eller slik som fra 48 - 60 timer. Oppfinnerne har funnet at når det brukes 2,0 g/kg formaldehyd, er en 48-timers inkubasjon vanligvis tilstrekkelig for å sikre tilfredsstillende inaktivering av viruset. For å tilfredsstille spesifikke regulatoriske krav kan imidlertid lengre inkubasjonsperioder være foretrukket, slik som en inkubasjonsperiode på minst 72 timer. Viruset inkuberes fortrinnsvis med formaldehyd ved en temperatur på 13-17 <º>C, slik som en temperatur på 14-17 <º>C, 15-17 <º>C, 16-17 <º>C, 13-16 <º>C, 13-15 <º>C, 14-16 <º>C eller slik som en temperatur på 14-15 <º>C. The virus is incubated with formaldehyde for a period of 12 - 96 hours, such as from 24 - 96 hours, from 36 - 96 hours, from 36 - 72 hours, from 36 - 60 hours or such as from 48 - 96 hours, from 48 - 72 hours or something like from 48 - 60 hours. The inventors have found that when 2.0 g/kg of formaldehyde is used, a 48-hour incubation is usually sufficient to ensure satisfactory inactivation of the virus. However, to satisfy specific regulatory requirements, longer incubation periods may be preferred, such as an incubation period of at least 72 hours. The virus is preferably incubated with formaldehyde at a temperature of 13-17 <º>C, such as a temperature of 14-17 <º>C, 15-17 <º>C, 16-17 <º>C, 13-16 < º>C, 13-15 <º>C, 14-16 <º>C or such as a temperature of 14-15 <º>C.

Når det gjelder sammensetningens bakterielle komponenter, skal det likeledes forstås at flere anvendelige metoder for inaktivering er tilgjengelige for fagmannen. Bakterien kan inaktiveres ved å anvende en prosedyre som omfatter tilsetting av 3,5 – 4,5 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1-2 timer ved en temperatur på 20 <º>C. When it comes to the composition's bacterial components, it should likewise be understood that several applicable methods of inactivation are available to the person skilled in the art. The bacteria can be inactivated by using a procedure that includes the addition of 3.5 - 4.5 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 1-2 hours at a temperature of 20 <º>C.

Selv om hver av de virale, bakterielle, fungale og parasittiske komponentene i vaksinen kan drepes eller inaktiveres før de kombineres med de andre komponentene, kan de også inaktiveres eller drepes etter at de har blitt satt til vaksinen. Although each of the viral, bacterial, fungal and parasitic components of the vaccine can be killed or inactivated before being combined with the other components, they can also be inactivated or killed after they have been added to the vaccine.

Nevnte levende svekkede, drepte eller inaktiverte bakterie kan være av en art som er et anerkjent fiskepatogen. Følgelig velges bakterien fortrinnsvis fra gruppen bestående av bakterier av artene Piscirickettsias spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Listonella spp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium spp., Yersinia spp., Renibacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Edwarsiella spp., Francisella spp., Pseudomonas spp., Cytophaga spp., Nocardia spp., Haphnia spp. og Mycobacerium spp. Said live weakened, killed or inactivated bacterium may be of a species which is a recognized fish pathogen. Accordingly, the bacterium is preferably selected from the group consisting of bacteria of the species Piscirickettsias spp., Aeromonas spp., Vibrio spp., Listonella spp., Moritella viscosa, Photobacterium damsela, Flavobacterium spp., Yersinia spp., Renibacterium spp., Streptococcus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Bifidobacterium spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Edwarsiella spp., Francisella spp., Pseudomonas spp., Cytophaga spp., Nocardia spp., Haphnia spp. and Mycobacerium spp.

Bakterien kan videre velges fra gruppen bestående av Aeromonas spp., Vibrio spp., Flavobacterium spp., Haphnia spp., Piscirickettsia spp. og Moritella viscosa. Enda mer spesielt velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum, Vibrio ordali, Flavobacterium columnaris, Haphnia sp., Piscirickettsia salmonis og Moritella viscosa. The bacteria can further be selected from the group consisting of Aeromonas spp., Vibrio spp., Flavobacterium spp., Haphnia spp., Piscirickettsia spp. and Moritella viscosa. Even more specifically, the bacterium is selected from the group consisting of Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio salmonicida, Vibrio anguillarum, Vibrio ordali, Flavobacterium columnaris, Haphnia sp., Piscirickettsia salmonis and Moritella viscosa.

Sammensetningen kan videre omfatte drepte eller inaktiverte bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av A. salmonicida, V. salmonicida, V. anguillarum og M. viscosa. The composition may further comprise killed or inactivated bacteria of one or more species selected from the group consisting of A. salmonicida, V. salmonicida, V. anguillarum and M. viscosa.

Sammensetningen kan videre omfatte nevnte bakterier av artene Vibrio ordali og/eller Piscirickettsia salmonis. The composition can further comprise said bacteria of the species Vibrio ordali and/or Piscirickettsia salmonis.

Sammensetningen kan også omfatte bakterier av én eller flere arter valgt fra gruppen bestående av Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnaris og Haphnia sp. The composition may also comprise bacteria of one or more species selected from the group consisting of Aeromonas hydrophila, Flavobacterium columnaris and Haphnia sp.

Sammensetningen er i visse tilfeller beregnet primært for anvendelse i forbindelse med fiskeoppdrett av atlantisk laks, spesielt i Nord-Atlanterhavet. Bakterier av artene Aeromonas sp. spesielt A. salmonicida; Vibrio sp., spesielt V. salmonicida og V. anguillarum serotyp O1 og O2; og Moritella viscosa gir en utfordring for fiskeoppdrett i norske farvann, og derfor kan det være foretrukket at den levende svekkede, drepte eller inaktiverte bakterien i sammensetningen velges fra denne spesielle gruppen av bakteriearter. In certain cases, the composition is intended primarily for use in connection with fish farming of Atlantic salmon, especially in the North Atlantic. Bacteria of the species Aeromonas sp. especially A. salmonicida; Vibrio sp., especially V. salmonicida and V. anguillarum serotype O1 and O2; and Moritella viscosa present a challenge for fish farming in Norwegian waters, and therefore it may be preferred that the live weakened, killed or inactivated bacteria in the composition is selected from this special group of bacterial species.

I andre tilfeller er sammensetningen tiltenkt bruk i Sør-Amerika, inkludert Chile, og i disse tilfellene velges bakterien fra gruppen av bakteriearter bestående av Vibrio sp, spesielt Vibrio ordali og Piscirickettsia sp., spesielt Piscirickettsia salmonis. In other cases, the composition is intended for use in South America, including Chile, and in these cases the bacterium is selected from the group of bacterial species consisting of Vibrio sp, especially Vibrio ordali and Piscirickettsia sp., especially Piscirickettsia salmonis.

I ytterligere andre tilfeller som hovedsakelig er tiltenkt for anvendelse i Sørøst-Asia, velges bakterien fra gruppen bestående av Aeromonas sp., spesielt Aeromonas hydrophila, Flavobacterium sp., spesielt Flavobacterium columnaris og Haphnia sp. In still other cases mainly intended for use in Southeast Asia, the bacterium is selected from the group consisting of Aeromonas sp., especially Aeromonas hydrophila, Flavobacterium sp., especially Flavobacterium columnaris and Haphnia sp.

På en lignende måte er nevnte virus som ikke er salmonid alfavirus et anerkjente fiskepatogen. Følgelig velges det fortrinnsvis fra gruppen bestående av: infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Infectious Hematopoetic Necrosis virus (IHNV); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC); Channel Catfish Virus (CCV); Infectious Salmon Anaemia (ISA)-virus; nodavirus; iridovirus, koi herpes-virus; Heart and Skeletal Muscle Inflammation Virus (HSMV) og Cardiomyopathy Syndrome Virus. In a similar way, said non-salmonid alpha virus is a recognized fish pathogen. Accordingly, it is preferably selected from the group consisting of: infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV); Infectious Hematopoietic Necrosis virus (IHNV); Pancreatic Necrosis Virus; Spring Viremia of Carp (SVC); Channel Catfish Virus (CCV); Infectious Salmon Anemia (ISA) virus; nodavirus; iridovirus, koi herpes virus; Heart and Skeletal Muscle Inflammation Virus (HSMV) and Cardiomyopathy Syndrome Virus.

Av disse virusene er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) særlig relevant i forbindelse med norsk oppdrett av laks. Det er derfor foretrukket i visse tilfeller at nevnte virus, bortsett fra salmonid alfavirus, er infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Of these viruses, infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) is particularly relevant in connection with Norwegian salmon farming. It is therefore preferred in certain cases that said virus, apart from salmonid alpha virus, is infectious pancreatic necrosis virus (IPNV).

Soppen velges fortrinnsvis fra gruppen bestående av: Saprolegnia Sp., Branchiomyces sanguinis, Branchiomyces demigrans og Icthyophonus hoferi. The fungus is preferably selected from the group consisting of: Saprolegnia Sp., Branchiomyces sanguinis, Branchiomyces demigrans and Icthyophonus hoferi.

Videre kan parasitten spesielt velges fra gruppen bestående av: Lepeophtheirus Sp., Caligus Sp.og Ichthyophthirius Sp. Furthermore, the parasite can be particularly selected from the group consisting of: Lepeophtheirus Sp., Caligus Sp. and Ichthyophthirius Sp.

Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det ofte at tilnærminger for å kontrollere infeksjoner i fiskepopulasjoner rettes mot alle eller i det minste de fleste av de potensielt relevante patogenene. Det kan derfor være foretrukket at sammensetningen omfatter to eller flere virus-, bakterie-, sopp- og/eller parasittkomponenter som definert ovenfor, slik som 3 eller flere, 4 eller flere, 5 eller flere, 6 eller flere, 7 eller flere, 8 eller flere, 9 eller flere eller 10 eller flere komponenter som definert over. Spesielt kan sammensetninger omfatte 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 eller 10 virus-, bakterie-, sopp- og/eller parasittkomponenter valgt blant de ovennevnte. For reasons of convenience, it is often preferred that approaches to control infections in fish populations target all or at least most of the potentially relevant pathogens. It may therefore be preferred that the composition comprises two or more viral, bacterial, fungal and/or parasitic components as defined above, such as 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more or 10 or more components as defined above. In particular, compositions may comprise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 10 viral, bacterial, fungal and/or parasitic components selected from the above.

Det vil bli forstått at sammensetningen bør inneholde antigener i mengder som er tilstrekkelige til å fremkalle en immunrespons, fortrinnsvis en beskyttende respons, etter injeksjon av sammensetningen i en fisk. Generelt er det foretrukket at sammensetningen har et relativt høyt innhold av salmonid alfavirus siden dette antas å forbedre den beskyttende immunresponsen når sammensetningen anvendes til vaksinasjonsformål. De nåværende oppfinnerne har observert at det generelt er mulig å dyrke salmonid alfavirus for å oppnå en tilfredsstillende titer i cellekultur, og at produksjonskostnadene ikke hindrer utviklingen av multivalente vaksiner. Tilgjengeligheten av isolater med en spesiell SAV3-undertype som foreviser utmerket vekstkinetikk når de dyrkes på cellekulturer, har videre tillatt de nåværende oppfinnerne å utvikle en ekstremt kostnadseffektiv virusvaksinekomponent for pankreatisk sykdom. It will be understood that the composition should contain antigens in amounts sufficient to elicit an immune response, preferably a protective response, upon injection of the composition into a fish. In general, it is preferred that the composition has a relatively high content of salmonid alphavirus since this is believed to improve the protective immune response when the composition is used for vaccination purposes. The present inventors have observed that it is generally possible to grow salmonid alphavirus to a satisfactory titer in cell culture and that the cost of production does not hinder the development of multivalent vaccines. Furthermore, the availability of isolates with a particular SAV3 subtype that exhibit excellent growth kinetics when grown in cell culture has allowed the present inventors to develop an extremely cost-effective viral vaccine component for pancreatic disease.

Vaksinen kan spesielt omfatte en mengde salmonid alfavirusantigen, slik som en mengde av SAV3-antigen, som tilsvarer 1,5x10<8>-1x10<11 >TCID50/ml vaksine, slik som fra 1,5x10<8>-5x10<10>, fra 1,5x10<8>-1x10<10>, fra 1,5x10<8>-5x10<9>, fra 1,5x10<8>-2x10<9>, fra 1,5x10<8>-9x10<8>, fra 1,5x10<8>-8x10<8>, fra 1,5x10<8>-7x10<8>, 1,5x10<8>-6x10<8>, 2,5x10<8>-1x10<11>, 5x10<8>-1x10<11>, 7,5x10<9>-1x10<11>, 1x10<10>-1x10<11>, 2,5x10<10>-1x10<11>, 5x10<10>-1x10<11>, 7,5x10<10>-1x10<11>, 2,5x10<8>-7,5x10<10>, 5x10<8>-5x10<10>, 5x10<8>-7x10<9>, 5x10<8>-6x10<9>, 5x10<8>-5x10<9>, 5x10<8>-4x10<9>, 5x10<8>-3x10<9>, 5x10<8>-2x10<9>, fra 5x10<8>-1x10<9>, 6x10<8>-7x10<9>, 6x10<8>-6x10<9>, 6x10<8>-5x10<9>, 6x10<8>-4x10<9>, 6x10<8>-3x10<9>, 6x10<8>-2x10<9>, 6x10<8>-1x10<9>, 7x10<8>-7x10<9>, 7x10<8>-6x10<9>, 7x10<8>-5x10<9>, 7x10<8>4x10<9>, 7x10<8>-3x10<9>, 7x10<8>-2x10<9>, 7x10<8>-1x10<9>, 8x10<8>-7x10<9>, 7,5x10<8>-1x10<10>, 8x10<8>-6x10<9>, 8x10<8>-5x10<9>, 8x10<8>-4x10<9>, 8x10<8>-3x10<9>, 8x10<8>-2x10<9>, 8x10<8>-1x10<9>, 9x10<8>-7x10<9>, 9x10<8>-6x10<9>, 9x10<8>-5x10<9>, 9x10<8>-4x10<9>, 9x10<8>-3x10<9>, eller fra 9x10<8>-2x10<9>, 1x10<9>-7,5x10<10>, 7,5x10<8>-5x10<10>, 1x10<9>-2,5x10<10>, 1x10<9>-1x10<10>, 1x10<9>-8x10<9>, 1x10<9>-5x10<9>, 1x10<9>-2,5x10<9>, 2,5x10<9>-1x10<10 >eller fra 5x10<9>-7,5x10<9 >TCID50/ml vaksine. The vaccine may in particular comprise an amount of salmonid alpha virus antigen, such as an amount of SAV3 antigen, which corresponds to 1.5x10<8>-1x10<11 >TCID50/ml vaccine, such as from 1.5x10<8>-5x10<10> , from 1.5x10<8>-1x10<10>, from 1.5x10<8>-5x10<9>, from 1.5x10<8>-2x10<9>, from 1.5x10<8>-9x10< 8>, from 1.5x10<8>-8x10<8>, from 1.5x10<8>-7x10<8>, 1.5x10<8>-6x10<8>, 2.5x10<8>-1x10< 11>, 5x10<8>-1x10<11>, 7.5x10<9>-1x10<11>, 1x10<10>-1x10<11>, 2.5x10<10>-1x10<11>, 5x10<10 >-1x10<11>, 7.5x10<10>-1x10<11>, 2.5x10<8>-7.5x10<10>, 5x10<8>-5x10<10>, 5x10<8>-7x10< 9>, 5x10<8>-6x10<9>, 5x10<8>-5x10<9>, 5x10<8>-4x10<9>, 5x10<8>-3x10<9>, 5x10<8>-2x10< 9>, from 5x10<8>-1x10<9>, 6x10<8>-7x10<9>, 6x10<8>-6x10<9>, 6x10<8>-5x10<9>, 6x10<8>-4x10 <9>, 6x10<8>-3x10<9>, 6x10<8>-2x10<9>, 6x10<8>-1x10<9>, 7x10<8>-7x10<9>, 7x10<8>-6x10 <9>, 7x10<8>-5x10<9>, 7x10<8>4x10<9>, 7x10<8>-3x10<9>, 7x10<8>-2x10<9>, 7x10<8>-1x10< 9>, 8x10<8>-7x10<9>, 7.5x10<8>-1x10<10>, 8x10<8>-6x10<9>, 8x10<8>-5x10<9>, 8x10<8>- 4x10<9>, 8x10<8>-3x10<9>, 8x10<8>-2x1 0<9>, 8x10<8>-1x10<9>, 9x10<8>-7x10<9>, 9x10<8>-6x10<9>, 9x10<8>-5x10<9>, 9x10<8>- 4x10<9>, 9x10<8>-3x10<9>, or from 9x10<8>-2x10<9>, 1x10<9>-7.5x10<10>, 7.5x10<8>-5x10<10> , 1x10<9>-2.5x10<10>, 1x10<9>-1x10<10>, 1x10<9>-8x10<9>, 1x10<9>-5x10<9>, 1x10<9>-2, 5x10<9>, 2.5x10<9>-1x10<10 >or from 5x10<9>-7.5x10<9 >TCID50/ml vaccine.

Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendelige i akvakulturen. Det skal derfor forstås at vaksinen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner av herav. As those skilled in the art will know, several methods and modes of administration of vaccines may be applicable in aquaculture. It is therefore to be understood that the vaccine may be formulated for administration by a route selected from the group consisting of: intraperitoneal injection, bath, immersion, intramuscular injection and oral administration or combinations thereof.

Når vaksiner skal administreres ved injeksjon, er generelt et relativt lite doseringsvolum nødvendig. Således er det ønskelig å formulere sammensetningen slik at hver dose har et volum på 25-200 μl. Mer foretrukket har hver dose et volum på 40-120 μl, slik som et volum på 90-110 μl eller 45-55 μl. For øyeblikket foretrekkes et doseringsvolum på 50 μl. When vaccines are to be administered by injection, a relatively small dosage volume is generally required. Thus, it is desirable to formulate the composition so that each dose has a volume of 25-200 μl. More preferably, each dose has a volume of 40-120 μl, such as a volume of 90-110 μl or 45-55 μl. Currently, a dosage volume of 50 μl is preferred.

Når sammensetningen er formulert for injeksjon, kan den spesielt være formulert for intraperitoneal injeksjon i en teleostei inkludert, men ikke begrenset til laksefisker, havabbor, brasme, torsk, snapper, flyndrefisk, steinbit, gulhale og tilapias. Fortrinnsvis er vaksinen formulert for injeksjon i en laksefisk. When the composition is formulated for injection, it may particularly be formulated for intraperitoneal injection into a teleostei including but not limited to salmonids, sea bass, bream, cod, snapper, flounder, catfish, yellowtail and tilapias. Preferably, the vaccine is formulated for injection into a salmonid fish.

Når sammensetningen er tiltenkt for injeksjon, kan den formuleres slik at en alikvot på 25-200 μl, fortrinnsvis en alikvot på 40-120 μl, slik som en alikvot på 90-110 μl eller 45-55 μl, og mest foretrukket en alikvot på 50 μl, inneholder salmonid alfavirus i mengder tilsvarende 0,75x10<7>-0,5x10<10 >TCID50, slik som fra 0,75x10<7>-2,5x10<9>, fra 0,75x10<7>-0,5x10<9>, fra 0,75x10<7>-2,5x10<8>, fra 0,75x10<7>-1x10<8>, fra 0,75x10<7>-4,5x10<7>, fra 0,75x10<7>-4x10<7>, fra 0,75x10<7>-3,5x10<7>, 0,75x10<7>-3x10<7>, 1,25x10<7>-0,5x10<10>, 2,5x10<7>-0,5x10<10>, 3,75x10<8>-0,5x10<10>, 0,5x10<9>-0,5x10<10>, 1,25x10<9>-0,5x10<10>, 2,5x10<9>-0,5x10<10>, 3,75x10<9>-0,5x10<10>, 1,25x10<7>-3,75x10<9>, 2,5x10<7>-2,5x10<19>, 2,5x10<7>-3,75x10<8>, 2,5x10<7>-3x10<8>, 2,5x10<7>-2,5x10<8>, 2,5x10<7>-2x10<8>, 2,5x10<7>-1,5x10<8>, 2,5x10<7>-1x10<8>, fra 2,5x10<7>-0,5x10<8>, 3x10<7>-3,5x10<8>, 3x10<7>-3x10<8>, 3x10<7>-2,5x10<8>, 3x10<7>-2x10<8>, 3x10<7>-1,5x10<8>, 3x10<7>-1x10<8>, 3x10<7>-0,5x10<8>, 3,5x10<7>-3,5x10<8>, 3,5x10<7>-3x10<8>, 3,5x10<7>-2,5x10<8>, 3,5x10<7>-2x10<8>, 3,5x10<7>-1,5x10<8>, 3,5x10<7>-1x10<8>, 3,5x10<7>-0,5x10<8>, 4x10<7>-3,5x10<8>, 3,75x10<7>-0,5x10<9>, 4x10<7>-3x10<8>, 4x10<7>-2,5x10<8>, 4x10<7>-2x10<8>, 4x10<7>-1,5x10<8>, 4x10<7>-1x10<8>, 4x10<7>-0,5x10<8>, 4,5x10<7>-3,5x10<8>, 4,5x10<7>-3x10<8>, 4,5x10<7>-2,5x10<8>, 4,5x10<7>-2x10<8>, 4,5x10<7>-1,5x10<8>, eller fra 4,5x10<7>-1x10<8>, 0,5x10<8>-3,75x10<9>, 3,73x10<7>-2,5x10<9>, 0,5x10<8>-1,25x10<9>, 0,5x10<8>-0,5x10<9>, 0,5x10<8>-4x10<8>, 0,5x10<8>-2,5x10<8>, 0,5x10<8>-1,25x10<9>,1,25x10<8>-0,5x10<9 >eller til 2,5x10<8>-3,75x10<8 >TCID50. When the composition is intended for injection, it may be formulated such that an aliquot of 25-200 μl, preferably an aliquot of 40-120 μl, such as an aliquot of 90-110 μl or 45-55 μl, and most preferably an aliquot of 50 μl, contains salmonid alphavirus in amounts corresponding to 0.75x10<7>-0.5x10<10 >TCID50, such as from 0.75x10<7>-2.5x10<9>, from 0.75x10<7>-0 .5x10<9>, from 0.75x10<7>-2.5x10<8>, from 0.75x10<7>-1x10<8>, from 0.75x10<7>-4.5x10<7>, from 0.75x10<7>-4x10<7>, from 0.75x10<7>-3.5x10<7>, 0.75x10<7>-3x10<7>, 1.25x10<7>-0.5x10< 10>, 2.5x10<7>-0.5x10<10>, 3.75x10<8>-0.5x10<10>, 0.5x10<9>-0.5x10<10>, 1.25x10<9 >-0.5x10<10>, 2.5x10<9>-0.5x10<10>, 3.75x10<9>-0.5x10<10>, 1.25x10<7>-3.75x10<9> , 2.5x10<7>-2.5x10<19>, 2.5x10<7>-3.75x10<8>, 2.5x10<7>-3x10<8>, 2.5x10<7>-2, 5x10<8>, 2.5x10<7>-2x10<8>, 2.5x10<7>-1.5x10<8>, 2.5x10<7>-1x10<8>, from 2.5x10<7> -0.5x10<8>, 3x10<7>-3.5x10<8>, 3x10<7>-3x10<8>, 3x10<7>-2.5x10<8>, 3x10<7>-2x10<8 >, 3x10<7>-1.5x10<8>, 3x10<7>-1x10<8>, 3x10<7>-0.5x10<8>, 3.5x10<7 >-3.5x10<8>, 3.5x10<7>-3x10<8>, 3.5x10<7>-2.5x10<8>, 3.5x10<7>-2x10<8>, 3.5x10 <7>-1.5x10<8>, 3.5x10<7>-1x10<8>, 3.5x10<7>-0.5x10<8>, 4x10<7>-3.5x10<8>, 3 ,75x10<7>-0.5x10<9>, 4x10<7>-3x10<8>, 4x10<7>-2.5x10<8>, 4x10<7>-2x10<8>, 4x10<7>- 1.5x10<8>, 4x10<7>-1x10<8>, 4x10<7>-0.5x10<8>, 4.5x10<7>-3.5x10<8>, 4.5x10<7>- 3x10<8>, 4.5x10<7>-2.5x10<8>, 4.5x10<7>-2x10<8>, 4.5x10<7>-1.5x10<8>, or from 4.5x10 <7>-1x10<8>, 0.5x10<8>-3.75x10<9>, 3.73x10<7>-2.5x10<9>, 0.5x10<8>-1.25x10<9> , 0.5x10<8>-0.5x10<9>, 0.5x10<8>-4x10<8>, 0.5x10<8>-2.5x10<8>, 0.5x10<8>-1, 25x10<9>,1.25x10<8>-0.5x10<9 >or to 2.5x10<8>-3.75x10<8 >TCID50.

Som nevnt ovenfor er det ønskelig at sammensetningen inneholder salmonid alfavirus ved en titer på minst 7,5x10<8 >TCID50/ml. Dette gir fortrinnsvis en mengde salmonid alfavirus på minst 3,75x10<7 >TCID50/dose. As mentioned above, it is desirable that the composition contains salmonid alpha virus at a titer of at least 7.5x10<8>TCID50/ml. This preferably gives an amount of salmonid alphavirus of at least 3.75x10<7>TCID50/dose.

Det skal forstås at for den foreliggende oppfinnelsens formål bestemmes de spesifiserte mengdene salmonid alfavirus ved titrering av CHH-celler som illustrert i eksemplene. En alternativ tilnærming er titrering av CHSE-celler. Som fastslått i eksempel 3, er CHH-celler omtrent dobbelt så sensitive for salmonid alfavirus som CHSE-cellene. Når man bestemmer virustitre for CHH-celler, er de oppnådde verdiene derfor omtrent dobbelte så høye som når de bestemmes ved titrering av CHSE-celler. It should be understood that for the purposes of the present invention, the specified amounts of salmonid alphavirus are determined by titration of CHH cells as illustrated in the examples. An alternative approach is the titration of CHSE cells. As established in Example 3, CHH cells are approximately twice as sensitive to salmonid alphavirus as CHSE cells. Therefore, when determining virus titers for CHH cells, the values obtained are approximately twice as high as when determined by titrating CHSE cells.

I europeisk patent EP 712,926 brukes CHSE-celler for titrering. Det er derfor rimelig å anta at virustitrene i PD-vaksinen, som er kommersielt tilgjengelig fra innehaveren av EP 712,926, også bestemmes ved titrering av CHSE-celler. Det angitte antigeninnholdet på 10<7,2>TCID50/dose i den første generasjonen monovalent vaksine fra patentinnehaveren ville derfor tilsvare 3,2x10<7>TCID50/dose hvis bestemt ved anvendelse av CHH-celler for titrering. Likeledes ville det angitte antigeninnholdet på 10<7,5>TCID50/dose i den andre generasjonen vaksine tilsvart 6,4x10<7 >TCID50/dose ved titrering med CHH-celler. In European patent EP 712,926 CHSE cells are used for titration. It is therefore reasonable to assume that the virus titers in the PD vaccine, which is commercially available from the holder of EP 712,926, are also determined by titration of CHSE cells. The stated antigen content of 10<7.2>TCID50/dose in the first generation monovalent vaccine from the patentee would therefore correspond to 3.2x10<7>TCID50/dose if determined using CHH cells for titration. Likewise, the stated antigen content of 10<7.5>TCID50/dose in the second generation vaccine would correspond to 6.4x10<7>TCID50/dose when titrated with CHH cells.

Sammensetningen omfatter gjerne inaktivert salminod alfavirus (SAV) ved en titer på 5x10<8 >- 5x10<10 >TCID50/ml (som gir et antigeninnhold på 2,5x10<7 >- 2,5x10<9 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl). The composition preferably comprises inactivated salmonid alpha virus (SAV) at a titer of 5x10<8 >- 5x10<10 >TCID50/ml (which gives an antigen content of 2.5x10<7 >- 2.5x10<9 >TCID50/dose at a dosage volume of 50 μl).

Videre er det foretrukket at nevnte levende svekkede eller drepte bakterie er til stede i mengder tilsvarende 0,2 x10<8>-2,5x10<9 >celler/ml (0,1 x10<7>-1,25x10<8 >celler/dose), slik som 0,5 x10<8>-2,5x10<9 >celler/ml (0,25 x10<7>-1,25x10<8>celler/dose), 0,5 x10<8>-1x10<9 >celler/ml (0,25x10<7>-0,5x10<8>celler/dose), 0,5 x10<8>-0,5x10<9 >celler/ml (0,25 x10<7>-0.25x10<8>celler/dose), 1x10<8>-5x10<9 >celler/ml (0,5x10<7>-0,25x10<8>celler/dose), 2,5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (1,25x10<7>-2,5x10<8 >celler/dose), 5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (2,5x10<7>-2,5x10<8>celler/dose), 7,5x10<8>-5x10<9 >celler/ml (3,75x10<7>-2,5x10<8>celler/dose), 1-5x10<9 >celler/ml (0,5-2,5x10<8>celler/ml), 2-5x10<9 >celler/ml (1-2,5x10<8>celler/dose), 3-5x10<9 >celler/ml (1,5-2,5x10<8>celler/dose) eller 4-5x10<9 >celler/ml (2-2,5x10<8>celler/dose). Det foretrekkes videre at det bakterielle antigenet tilsettes i mengder som fremkaller en beskyttelse som resulterer i en relativ overlevelsesprosent (RPS) over 70 for den relevante sykdommen ved bruk av en utfordringsmodell for sykdommen ved anvendelse av intraperitoneal injeksjon som utfordring. Furthermore, it is preferred that said living weakened or killed bacteria are present in amounts corresponding to 0.2 x10<8>-2.5x10<9 >cells/ml (0.1 x10<7>-1.25x10<8 >cells /dose), such as 0.5 x10<8>-2.5x10<9 >cells/ml (0.25 x10<7>-1.25x10<8>cells/dose), 0.5 x10<8> -1x10<9 >cells/ml (0.25x10<7>-0.5x10<8>cells/dose), 0.5 x10<8>-0.5x10<9 >cells/ml (0.25 x10< 7>-0.25x10<8>cells/dose), 1x10<8>-5x10<9>cells/ml (0.5x10<7>-0.25x10<8>cells/dose), 2.5x10<8> -5x10<9 >cells/ml (1.25x10<7>-2.5x10<8 >cells/dose), 5x10<8>-5x10<9 >cells/ml (2.5x10<7>-2.5x10 <8>cells/dose), 7.5x10<8>-5x10<9>cells/ml (3.75x10<7>-2.5x10<8>cells/dose), 1-5x10<9>cells/ml (0.5-2.5x10<8>cells/ml), 2-5x10<9>cells/ml (1-2.5x10<8>cells/dose), 3-5x10<9>cells/ml (1 ,5-2.5x10<8>cells/dose) or 4-5x10<9>cells/ml (2-2.5x10<8>cells/dose). It is further preferred that the bacterial antigen is added in amounts that elicit protection resulting in a relative survival rate (RPS) greater than 70 for the relevant disease using a challenge model for the disease using intraperitoneal injection as a challenge.

Bakterien er gjerne til stede i mengder som tilsvarer 1x10<8>-8x10<9 >celler/ml. Ved et doseringsvolum på 50 μl tilsvarer dette 5x10<6 >– 4x10<8 >celler/dose. Fortrinnsvis er bakterien til stede i mengder tilsvarende 0,9 - 5 x10<9 >celler/ml, tilsvarende 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl. The bacterium is usually present in amounts corresponding to 1x10<8>-8x10<9 >cells/ml. At a dosing volume of 50 μl, this corresponds to 5x10<6 >– 4x10<8 >cells/dose. Preferably, the bacterium is present in amounts corresponding to 0.9 - 5 x10<9 >cells/ml, corresponding to 0.45 - 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl.

I tilfeller hovedsakelig rettet mot det norske markedet, er den levende svekkede eller drepte bakterien til stede i mengder tilsvarende ≥2,9x10<8 >celler/ml (≥1,45x10<7 >celler/dose) Aeromonas salmonicida, ≥7,4x10<7 >celler/ml (≥3,7x10<6>celler/dose) Vibrio salmonicida, ≥ 4,3x10<8 >celler/ml (≥ 1.65x10<7>celler/dose) V. anguillarum serovar O2 α, ≥3,2x10<8 >celler/ml (≥1,6x10<7 >celler/dose) V. anguillarum serovar O1 og ≥ 2,7x10<7 >celler/ml (≥ 1.35x10<6 >celler/dose) Moritella viscosa. I ytterligere tilfeller tiltenkt samme formål omfatter sammensetningen inaktivert Aeromonas salmonicida, inaktivert Vibrio. In cases mainly aimed at the Norwegian market, the live weakened or killed bacterium is present in quantities corresponding to ≥2.9x10<8 >cells/ml (≥1.45x10<7 >cells/dose) Aeromonas salmonicida, ≥7.4x10 <7 >cells/ml (≥3.7x10<6>cells/dose) Vibrio salmonicida, ≥ 4.3x10<8 >cells/ml (≥ 1.65x10<7>cells/dose) V. anguillarum serovar O2 α, ≥ 3.2x10<8 >cells/ml (≥1.6x10<7 >cells/dose) V. anguillarum serovar O1 and ≥ 2.7x10<7 >cells/ml (≥ 1.35x10<6 >cells/dose) Moritella viscosa . In further cases intended for the same purpose, the composition includes inactivated Aeromonas salmonicida, inactivated Vibrio.

Salmonicida, inaktivert Vibrio anguillarum og inaktivert Moritella viscosa, og hvert bakterielle antigen er til stede i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml. Salmonicida, inactivated Vibrio anguillarum and inactivated Moritella viscosa, and each bacterial antigen is present in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml.

I tilfeller for øyeblikket tiltenkt det chilenske markedet, omfatter sammensetningen: inaktivert Vibrio ordali og inaktivert Piscirickettsia salmonis, begge i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml. In cases currently intended for the Chilean market, the composition comprises: inactivated Vibrio ordali and inactivated Piscirickettsia salmonis, both in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml.

I tilfeller for øyeblikket tiltenkt Øst-Asia omfatter sammensetningen inakrivert Aeromonas hydrophila, inaktivert Flavobacterium columnaris og inaktivert Haphnia sp., hver i en mengde som tilsvarer 0,9 -5x10<9 >celler/ml. In cases currently intended for East Asia, the composition comprises inactivated Aeromonas hydrophila, inactivated Flavobacterium columnaris and inactivated Haphnia sp., each in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml.

Viruset, bortsett fra salmonid alfavirus, kan fortrinnsvis være til stede i mengder tilsvarende ≥5x10<8 >PFU/ml. Disse mengdene er især relevante når viruset er infenctious pancreatic necrosis virus (IPNV). I spesifikke tilfeller er viruset til stede i mengder som tilsvarer 1,0 - 5x10<9 >PFU/ml eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml i tilfeller med infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). Ved doseringsstørrelser på 50 μl tilsvarer dette henholdsvis 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose og 0,2-0,8 antigenenheter/dose. The virus, except salmonid alpha virus, may preferably be present in amounts corresponding to ≥5x10<8 >PFU/ml. These amounts are particularly relevant when the virus is infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). In specific cases, the virus is present in amounts corresponding to 1.0 - 5x10<9 >PFU/ml or 2-8 antigen units (AU)/ml in cases of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). For dosage sizes of 50 μl, this corresponds respectively to 0.5 – 2.5x10<8 >PFU/dose and 0.2-0.8 antigen units/dose.

Som fagmannen vil innse, er det mulig å inkludere én eller flere rekombinant fremstilte antigener i vaksinene. Spesielt kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra det salmonide alfaviruset være et materiale som fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker. I tillegg kan det antigene og/eller immunogene materialet avledet fra nevnt bakterie i punkt a), fra nevnte virus i punkt b), fra nevnte sopp i punkt c) eller fra nevnte parasitt i punkt d) som definert over fremstilles ved bruk av rekombinante teknikker. As those skilled in the art will appreciate, it is possible to include one or more recombinantly produced antigens in the vaccines. In particular, the antigenic and/or immunogenic material derived from the salmonid alphavirus may be a material produced using recombinant techniques. In addition, the antigenic and/or immunogenic material derived from said bacteria in point a), from said virus in point b), from said fungus in point c) or from said parasite in point d) as defined above can be produced using recombinant techniques.

Slike teknikker, inkludert teknikker for kloning, ekspresjon, syntese og rensing av peptider og polypeptider, er selvfølgelig tilgjengelige og velkjente for fagmannen. Such techniques, including techniques for cloning, expression, synthesis and purification of peptides and polypeptides, are of course available and well known to those skilled in the art.

Egnede rekombinante antigener kan være polypeptider klonet fra fiskepatogener eller immunogene deler av slike polypeptider. En immunogen del av et polypeptid kan omfatte en T-celle- og/eller en B-celle-epitop. T-celle-epitoper, som er lineære, kan identifiseres ved å undersøke effekten av deletion-mutasjoner systematisk introdusert i polypeptidsekvensen. B-celle-epitoper kan identifiseres ved å analysere B-celleresponsene på overlappende peptider som dekker polypeptidsekvensen av interesse. Fagmannen vil være klar over at immunogene aminosyresekvenser generelt vil ha en minimumslengde på 6 aminosyrer i en etterfølgende sekvens. Lengre aminosyresekvenser kan naturligvis være foretrukket, inklusive aminosyresekvenser på minst 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 100, 150 eller 200 aminosyrer i en etterfølgende sekvens. Suitable recombinant antigens can be polypeptides cloned from fish pathogens or immunogenic parts of such polypeptides. An immunogenic portion of a polypeptide may comprise a T-cell and/or a B-cell epitope. T-cell epitopes, which are linear, can be identified by examining the effect of deletion mutations systematically introduced into the polypeptide sequence. B cell epitopes can be identified by analyzing the B cell responses to overlapping peptides covering the polypeptide sequence of interest. Those skilled in the art will be aware that immunogenic amino acid sequences will generally have a minimum length of 6 amino acids in a subsequent sequence. Longer amino acid sequences may of course be preferred, including amino acid sequences of at least 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 30, 50, 100, 150 or 200 amino acids in a subsequent sequence.

Når påtenkt for formålet å fremkalle en beskyttende immunrespons, vil fagmannen erkjenne at sammensetningen videre kan omfatte et organisk adjuvans og/eller et uorganisk adjuvans. When intended for the purpose of eliciting a protective immune response, the skilled person will recognize that the composition may further comprise an organic adjuvant and/or an inorganic adjuvant.

Det organiske adjuvanset velges fortrinnsvis fra gruppen som består av: mineralolje, squalen 2,6,10,15,19,23-heksametyl-2,6,10,14,18,22-tetracosaheksan), virosomer, Montanid og CpG-oligodeoksynukleotider. Andre eksempler på hyppig benyttede adjuvantia i fisk- og skalldyroppdrett er muramyldipeptider, lipopolysakkarider, flere glukaner og glykaner, mineralolje og Carbopol<®>. Også adjuvantia som interleukin og glykoproteiner kan anvendes. En omfattende oversikt over adjuvantia egnet for fisk- og skalldyrvaksiner er gitt i oversiktsartikkelen av Jan Raa (1996), hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet. The organic adjuvant is preferably selected from the group consisting of: mineral oil, squalene 2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexane), virosomes, Montanide and CpG oligodeoxynucleotides . Other examples of frequently used adjuvants in fish and shellfish farming are muramyl dipeptides, lipopolysaccharides, several glucans and glycans, mineral oil and Carbopol<®>. Adjuvants such as interleukin and glycoproteins can also be used. A comprehensive overview of adjuvants suitable for fish and shellfish vaccines is given in the review article by Jan Raa (1996), the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Nyttige uorganiske adjuvantia vil være kjent for den erfarne utøver og er beskrevet av JC Aguilar og EG Rodriguez, 2007, Vaccine 25, 3752 – 3762, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet. Useful inorganic adjuvants will be known to the skilled practitioner and are described by JC Aguilar and EG Rodriguez, 2007, Vaccine 25, 3752-3762, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

Spesielt velges det uorganiske adjuvanset som eventuelt er inkludert i sammensetningen fra gruppen som består av Al(OH)3 (aluminiumhydroksid), Ca3(PO4)2 (kalsiumfosfat) og vannuløselige salter av aluminium, kalsium, jern eller zirkonium. In particular, the inorganic adjuvant which is optionally included in the composition is selected from the group consisting of Al(OH)3 (aluminium hydroxide), Ca3(PO4)2 (calcium phosphate) and water-insoluble salts of aluminium, calcium, iron or zirconium.

Sammensetningen kan videre omfatte en passende farmasøytisk bærer. Vaksinen kan være formulert som en emulsjon av vann i olje. Vaksinen kan også omfatte et såkalt “vehikkel”. Et vehikkel er et middel som antigenet fester seg til uten å være kovalent bundet til det. Slike vehikler er bl.a. biodegraderbare nano-/mikropartikler eller -kapsler av PLGA (polylaktid-co-glykolsyre), alginat eller kitosan, liposomer, niosomer, miceller, multiple emulsjoner og makrosoler, alle kjent i faget. En spesiell form for et slikt vehikkel der antigenet er delvis kapslet inn i vehikkelet, er det såkalte ISCOM (europeiske patenter EP 109.942, EP 180.564 og EP 242.380, hvis innhold innlemmes heri ved referanse i sin helhet). The composition may further comprise a suitable pharmaceutical carrier. The vaccine may be formulated as a water-in-oil emulsion. The vaccine can also include a so-called "vehicle". A vehicle is an agent to which the antigen attaches without being covalently bound to it. Such vehicles are i.a. biodegradable nano/microparticles or capsules of PLGA (polylactide-co-glycolic acid), alginate or chitosan, liposomes, niosomes, micelles, multiple emulsions and macrosols, all known in the art. A special form of such a vehicle where the antigen is partially encapsulated in the vehicle is the so-called ISCOM (European patents EP 109,942, EP 180,564 and EP 242,380, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety).

I tillegg kan sammensetningen omfatte én eller flere passende overflateaktive forbindelser, detergenter og/eller emulgatorer. In addition, the composition may comprise one or more suitable surface-active compounds, detergents and/or emulsifiers.

Spesielt velges detergenten fra gruppen som består av ikke-ioniske detergenter, kationiske detergenter og anioniske detergenter. In particular, the detergent is selected from the group consisting of non-ionic detergents, cationic detergents and anionic detergents.

Fagmannen vil innse at estere av ikke-PEG-ylert eller PEG-ylert sorbitan med fettsyrer er eksempler på nyttige emulgatorer. Som det fremgår i eksemplene kan emulgatoren spesielt være polysorbat eller sorbitanoleat. Mer spesielt kan nevnte detergent og/eller emulgator velges fra gruppen som består av polyoksyetylen (20) sorbitanmonooleat (Tween<®>80), sorbitanmonooleat (Span<®>80), kremofor, Tween® og Span®. Those skilled in the art will recognize that esters of non-PEG-ylated or PEG-ylated sorbitan with fatty acids are examples of useful emulsifiers. As appears in the examples, the emulsifier can in particular be polysorbate or sorbitan oleate. More particularly, said detergent and/or emulsifier can be selected from the group consisting of polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (Tween<®>80), sorbitan monooleate (Span<®>80), cremophor, Tween® and Span®.

I visse tilfeller velges sammensetningen fra gruppen som består av en vann-i-oljeemulsjon, en vann-i-olje-i-vann-emulsjon og en olje-i-vann-emulsjon. For øyeblikket er den foretrukne sammensetningen en vann-i-olje-emulsjon. In certain cases, the composition is selected from the group consisting of a water-in-oil emulsion, a water-in-oil-in-water emulsion and an oil-in-water emulsion. Currently, the preferred formulation is a water-in-oil emulsion.

I spesifikke tilfeller omfatter sammensetningen en mineralolje. In specific cases, the composition comprises a mineral oil.

Visse tilfeller vedrører en vaksine som omfatter en oljefase og en vannfase, hver fase utgjør fra 20-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. Certain cases relate to a vaccine comprising an oil phase and a water phase, each phase constituting from 20-80% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I ytterligere tilfeller omfatter vaksinen en oljefase som utgjør fra 50-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som 55-75 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In further cases, the vaccine comprises an oil phase which constitutes from 50-80% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as 55-75% (vol/vol), from 45-62% (vol/vol), from 45-60 % (vol/vol), from 50-70% (vol/vol), from 55-70% (vol/vol), from 50-65% (vol/vol), from 50-60% (vol/vol) from 55-60% (vol/vol) or from 57-60% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I enda ytterligere tilfeller omfatter vaksinen en vannfase som utgjør fra 20-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som 20-50 % (vol/vol), fra 20-45 % (vol/vol), fra 20-40 % (vol/vol), fra 30-55 % (vol/vol), fra 30-52 % (vol/vol), fra 30-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In still further cases, the vaccine comprises an aqueous phase which constitutes from 20-55% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as 20-50% (vol/vol), from 20-45% (vol/vol), from 20- 40% (vol/vol), from 30-55% (vol/vol), from 30-52% (vol/vol), from 30-50% (vol/vol), from 37-55% (vol/vol ) from 37-50% (vol/vol) or from 37-45% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase og en vannfase, hvor hver fase utgjør fra 30-70 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In even further cases, the composition comprises an oil phase and a water phase, each phase constituting from 30-70% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase som utgjør fra 45-70 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 45-65 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In still further cases, the composition comprises an oil phase comprising from 45-70% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as from 45-65% (vol/vol), from 45-62% (vol/vol), from 45 -60% (vol/vol), from 50-70% (vol/vol), from 55-70% (vol/vol), from 50-65% (vol/vol), from 50-60% (vol/ vol) from 55-60% (vol/vol) or from 57-60% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en vannfase som utgjør fra 30-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 30-50 % (vol/vol), fra 30-45 % (vol/vol), fra 30-40 % (vol/vol), fra 35-55 % (vol/vol), fra 35-52 % (vol/vol), fra 35-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In still further cases, the composition comprises an aqueous phase comprising from 30-55% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as from 30-50% (vol/vol), from 30-45% (vol/vol), from 30 -40% (vol/vol), from 35-55% (vol/vol), from 35-52% (vol/vol), from 35-50% (vol/vol), from 37-55% (vol/ vol) from 37-50% (vol/vol) or from 37-45% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en oljefase som utgjør fra 50-80 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 55-75 % (vol/vol), fra 45-62 % (vol/vol), fra 45-60 % (vol/vol), fra 50-70 % (vol/vol), fra 55-70 % (vol/vol), fra 50-65 % (vol/vol), fra 50-60 % (vol/vol) fra 55-60 % (vol/vol) eller fra 57-60 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In further cases, the composition comprises an oil phase which constitutes from 50-80% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as from 55-75% (vol/vol), from 45-62% (vol/vol), from 45- 60% (vol/vol), from 50-70% (vol/vol), from 55-70% (vol/vol), from 50-65% (vol/vol), from 50-60% (vol/vol ) from 55-60% (vol/vol) or from 57-60% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

I enda ytterligere tilfeller omfatter sammensetningen en vannfase som utgjør fra 20-55 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen slik som fra 20-50 % (vol/vol), fra 30-45 % (vol/vol), fra 20-40 % (vol/vol), fra 30-55 % (vol/vol), fra 30-52 % (vol/vol), fra 30-50 % (vol/vol), fra 37-55 % (vol/vol) fra 37-50 % (vol/vol) eller fra 37-45 % (vol/vol) av totalvolumet av vaksinen. In still further cases, the composition comprises an aqueous phase comprising from 20-55% (vol/vol) of the total volume of the vaccine such as from 20-50% (vol/vol), from 30-45% (vol/vol), from 20 -40% (vol/vol), from 30-55% (vol/vol), from 30-52% (vol/vol), from 30-50% (vol/vol), from 37-55% (vol/ vol) from 37-50% (vol/vol) or from 37-45% (vol/vol) of the total volume of the vaccine.

Det skal forstås at salmonid alfavirus i sammensetningen kan være et virus av enhver av de for øyeblikket kjente SAV-undertyper, SAV1, SAV 2, SAV 3, SAV4, SAV5 og SAV6 som definert over. De nåværende oppfinnerne har observert at tidligere beskrevne stammer av salmonide alfavirus er effektive når de anvendes som en antigen komponent i polyvalente vaksiner og gir god beskyttelse mot senere infeksjon. It should be understood that the salmonid alphavirus in the composition may be a virus of any of the currently known SAV subtypes, SAV1, SAV 2, SAV 3, SAV4, SAV5 and SAV6 as defined above. The present inventors have observed that previously described strains of salmonid alphavirus are effective when used as an antigenic component in polyvalent vaccines and provide good protection against subsequent infection.

Representative isolater av SAV1- og SAV 2-undertyper er beskrevet i faget: En patentdeponering av SAV1 har tidligere blitt gjort under Budapestkonvensjonen ved ECACC under deponeringsnummer V94090731. Det deponerte SAV1-isolatet tilsvarer isolatet beskrevet i Nelson m.fl. 1995 og isolatet tilveiebrakt i EP 712,926. Representative isolates of SAV1 and SAV 2 subtypes are described in the subject: A patent deposit of SAV1 has previously been made under the Budapest Convention at ECACC under deposit number V94090731. The deposited SAV1 isolate corresponds to the isolate described in Nelson et al. 1995 and the isolate provided in EP 712,926.

Fortrinnsvis er det salmonide alfaviruset i sammensetningen et salmonid alfavirus undertype 3 (SAV3)-virus. Det er mest foretrukket at salmonide alfaviruset i sammensetningen velges fra gruppen bestående av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201, 07121202 og 07121203. Preferably, the salmonid alphavirus in the composition is a salmonid alphavirus subtype 3 (SAV3) virus. It is most preferred that the salmonid alphavirus in the composition is selected from the group consisting of the virus strains deposited under the Budapest Convention at the European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK on 12 December 2007 under deposit numbers 07121201, 07121202 and 07121203.

Relaterte genotypiske karakteristika: Related genotypic characteristics:

I videre utførelsesformer er viruset i følge første aspekt en stamme eller isolat med genotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene angitt over, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene. In further embodiments, the virus according to the first aspect is a strain or isolate with genotypic characteristics related to or similar to those in the deposited strains indicated above, in particular any of the deposited SAV3 strains.

Selv om de genome organiseringene av alle karakteriserte SAVer er like, er nukleotidsekvenslikheten mellom SAV3 og SAV1 bare 91,6 %, og mellom SAV3 og SAV2 92,9 % (Hodneland m.fl. 2005). Dersom sammenligningen begrenses til bestemte gener, for eksempel det ikke-strukturelle proteinet nsP3, er likheten mellom undertyper så lav som 81,5 % (Weston m.fl. 2005). Although the genome organizations of all characterized SAVs are similar, the nucleotide sequence similarity between SAV3 and SAV1 is only 91.6%, and between SAV3 and SAV2 92.9% (Hodneland et al. 2005). If the comparison is limited to specific genes, for example the non-structural protein nsP3, the similarity between subtypes is as low as 81.5% (Weston et al. 2005).

I spesielle utførelsesformer omfatter det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyresekvens som er minst 90 %, slik som 95 %, 97 % eller 99 % identisk med en enkelt av sekvensene angitt i SEQ ID NO: 1. In particular embodiments, the salmonid alphavirus used in connection with the present invention comprises a nucleic acid sequence that is at least 90%, such as 95%, 97% or 99% identical to a single one of the sequences indicated in SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1

aagaagtgca ccagattttc caccaccccg aagaagtccg ccccctacct cgttgacgtg tacgacgctc tgccgatttc tgtagagatt agcaccgttg taacatgcaa cgacaatcag tgcacagtga aggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagagcgct gcccaagcga ccgttacctt taccagcgac tcccagacgt ttacgtgtga ggagccggtt ctgacggccg ccagtatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcatctat gttgcccagc ggaggcaagg aagtgaaggc gaggatccca ttcccgttcc cgccagagac cgcgacc; aagaagtgca ccagattttc caccaccccg aagaagtccg ccccctacct cgttgacgtg tacgacgctc tgccgatttc tgtagagatt agcaccgttg taacatgcaa cgacaatcag tgcacagtga aggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagagcgct gcccaagcga ccgttacctt taccagcgac tcccagacgt ttacgtgtga ggagccggtt ctgacggccg ccagtatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcatctat gttgcccagc ggaggcaagg aagtgaaggc gaggatccca ttcccgttcc cgccagagac cgcgacc;

SEQ ID NO: 2: SEQ ID NO: 2:

aagaaatgta ccagattttc cactactcca aaaaagtccg cactatacct cgttgatgtg tacgacgctc tgccgatttc cgtagagatt agcaccgtcg taacatgcaa cgatagccag tgcacagtga gggtgccacc cggcaccaca gtgaaattcg acaaaaaatg caagagcgct gcctcggcga ccgtcacttt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggctg ccagtatcac ccagggcaag ccacacctca gatcggcaat gttgcctagt ggaggcaagg aagtgaaagc aaggatcccg ttcccgttcc cgccggaaac tgcaact; aagaaatgta ccagattttc cactactcca aaaaagtccg cactatacct cgttgatgtg tacgacgctc tgccgatttc cgtagagatt agcaccgtcg taacatgcaa cgatagccag tgcacagtga gggtgccacc cggcaccaca gtgaaattcg acaaaaaatg caagagcgct gcctcggcga ccgtcacttt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggctg ccagtatcac ccagggcaag ccacacctca gatcggcaat gttgcctagt ggaggcaagg aagtgaaagc aaggatcccg ttcccgttcc cgccggaaac tgcaact;

SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3

aagaaatgca ccaggttttc caccaccccg aagaagtccg cgctctatct cgttgatgtg tatgatgctc tgccgatttc tgtagagatc agcaccgtgg tgacatgcaa cgaaagacag tgcacagtga gggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagaacgtt gccaaagaga ccgtcacctt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggccg ccagcatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcgtcaat gttgcccagc ggaggcaaag aggtgaaagc gaggattcca ttcccgttcc cgccagagac tgcgact. aagaaatgca ccaggttttc caccaccccg aagaagtccg cgctctatct cgttgatgtg tatgatgctc tgccgatttc tgtagagatc agcaccgtgg tgacatgcaa cgaaagacag tgcacagtga gggtgccacc cggtaccaca gtgaaattcg ataagaagtg caagaacgtt gccaaagaga ccgtcacctt caccagcgac tcccagacgt ttacgtgcga ggagccggtc ctaacggccg ccagcatcac ccagggcaag ccgcacctta gatcgtcaat gttgcccagc ggaggcaaag aggtgaaagc gaggattcca ttcccgttcc cgccagagac tgcgact.

I ytterligere utførelsesformer omfatter det salmonide alfaviruset anvendt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen en nukleinsyresekvens som er minst 80 %, slik som 85 %, 90 %, 95 %, 98 % eller 99 % identisk med sekvensen angitt i en enkelt av SEQ ID NO: 4. In further embodiments, the salmonid alphavirus used in connection with the present invention comprises a nucleic acid sequence that is at least 80%, such as 85%, 90%, 95%, 98% or 99% identical to the sequence set forth in a single of SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4

gttacgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacggcc atagtgtacg cagcgcccct gccatgaggg ccgccagcac aggtgccaga agcgtgcgca gtgtccagtc cggttcagcc gggcatagaa ctgacgtcgc cagcgtcgcc ggctcagcgg ggctgcctag agggctaaca cgggaccagt tcggcgccgt gagagctagg gcccgcaggg acttagagct ggagggatca gagcatggca gtcagactag cttccgttcc ggctcgctga tggtggagag caccgctagt ggctacagcc aacgttctga cgatcaggac acgggctcc gttacgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacggcc atagtgtacg cagcgcccct gccatgaggg ccgccagcac aggtgccaga agcgtgcgca gtgtccagtc cggttcagcc gggcatagaa ctgacgtcgc cagcgtcgcc ggctcagcgg ggctgcctag agggctaaca cgggaccagt tcggcgccgt gagagctagg gcccgcaggg acttagagct ggagggatca gagcatggca gtcagactag cttccgttcc ggctcgctga tggtggagag caccgctagt ggctacagcc aacgttctga cgatcaggac acgggctcc

SEQ ID NO: 5: SEQ ID NO: 5:

gtcgcgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacagcc atagtgtgcg cagcgcccct gccattctga gggccgccag cacaggagcc agaagcgtgc gcagtgtcca gtccggctta accgggcaca gagatgatgc cgttagcgtc gccggttcgg tgagacagcc cagtgggccg cccagcagcg tgagcacgcc cgccgcgcct agagggctaa cacgggaaca gttcggcgcc gtaagagcta gggcccgcag ggacctagag ttggagggac cggagcatgg cagccaggcc agcttccgtt ccggctcgct ggtggtgggg agcaccgcca gtagctacag ccaacgtcct gacgaccagg acacgggctc t; gtcgcgccag cggcatcatt ggcgggcagc gtccacagcc atagtgtgcg cagcgcccct gccattctga gggccgccag cacaggagcc agaagcgtgc gcagtgtcca gtccggctta accgggcaca gagatgatgc cgttagcgtc gccggttcgg tgagacagcc cagtgggccg cccagcagcg tgagcacgcc cgccgcgcct agagggctaa cacgggaaca gttcggcgcc gtaagagcta gggcccgcag ggacctagag ttggagggac cggagcatgg cagccaggcc agcttccgtt ccggctcgct ggtggtgggg agcaccgcca gtagctacag ccaacgtcct gacgaccagg acacgggctc t;

SEQ ID NO: 6: SEQ ID NO: 6:

gttgtgccgg cgacatcgtc gacgggcagc gtccacagcc gcagtagcgc ccctgctatt ttgagggccg ccagcgcggg tgccagaagc gtgcgcagcg cccaacccgg ccccgccggg catagagcgg gcgccttcag cgtcgctggc tcggtgagac agcccagcgg gccgcctagt agcgtgagca cgcccgccgc gaccagaggg ctgacacggg accagtttga cgtcgtgaga gctagggccc gtaggaactt ggaaccggag gggtcggagc atggcagcca agccagcttc cgctccggct cgctgacggt ggggagctct gctagtagct acagccaacg ttccgacgat caggacacgg gcacc gttgtgccgg cgacatcgtc gacgggcagc gtccacagcc gcagtagcgc ccctgctatt ttgagggccg ccagcgcggg tgccagaagc gtgcgcagcg cccaacccgg ccccgccggg catagagcgg gcgccttcag cgtcgctggc tcggtgagac agcccagcgg gccgcctagt agcgtgagca cgcccgccgc gaccagaggg ctgacacggg accagtttga cgtcgtgaga gctagggccc gtaggaactt ggaaccggag gggtcggagc atggcagcca agccagcttc cgctccggct cgctgacggt ggggagctct gctagtagct acagccaacg ttccgacgat caggacacgg gcacc

I foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse som vedrører virus av SAV3-varianten, skal det forstås at viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 %, 99 % eller 99,5 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1. In preferred embodiments of the present invention which relate to viruses of the SAV3 variant, it shall be understood that the virus comprises a nucleic acid sequence which is at least 98%, 99% or 99.5% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 1.

For den foreliggende oppfinnelsens formål er en passende test for å avgjøre om et virusisolat har genotypiske karakteristikker som er beslektet med eller ligner på de deponerte stammene ovenfor, gitt i eksempel 2: fagmannen vil innse at i foretrukne utførelsesformer er salmonid alfavirus ifølge oppfinnelsen et virus, hvilket er positivt i den SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR (RT-QPCR)-identitetstesten som beskrevet i eksempel 2, spesielt når det anvendes et sett primere som er utviklet for å amplifisere del av en salmonid alfavirus glykoprotein E2 nukleotidsekvens, slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8. For the purposes of the present invention, a suitable test to determine whether a virus isolate has genotypic characteristics related to or similar to the deposited strains above is given in Example 2: one skilled in the art will appreciate that in preferred embodiments, the salmonid alphavirus of the invention is a virus, which is positive in the SAV reverse transcriptase quantitative PCR (RT-QPCR) identity test as described in Example 2, particularly when using a set of primers designed to amplify part of a salmonid alphavirus glycoprotein E2 nucleotide sequence, such as the primers indicated in SEQ ID NO: 7 and 8.

Relaterte fenotypiske karakteristika: Related phenotypic characteristics:

I enda ytterligere tilfeller er viruset en stamme eller isolat med fenotypiske karakteristika som er beslektet med eller lignende de i de deponerte stammene, spesielt enhver av de deponerte SAV3-stammene. In still further cases, the virus is a strain or isolate with phenotypic characteristics related to or similar to those of the deposited strains, particularly any of the deposited SAV3 strains.

Fenotypiske forskjeller eksisterer mellom isolater innenfor de tre SAV-gruppene, samt mellom grupper (Christie m.fl. Dis. Aquat. Org. 75: 13-22, 2007, Hodneland m.fl. 2005, Taksdal m.fl.): I en studie av Taksdal m.fl. hadde alle atlantiske laks og 76 % av regnbueørretene infisert med virus av SAV3-undertypen alvorlige pankreatiske lesjoner i sen/regenerativ fase. Dette var i motsetning til rapporter fra irske og skotske tilfeller der fisk infisert med SAV1 vanligvis hadde normalt, sannsynligvis legede, eksokrine pankreatiske vev. Et ytterligere karakteristisk trekk ved pankreatisk sykdom forårsaket av SAV3-undertypen er nærvær av tallrike celler i nyren som inneholder cytoplasmiske eosinofile granuler (EG). I Taksdals studier ble EG-inneholdende celler funnet i 40 % av regnbueørreten og i 64 % av atlantisk ørret. I tillegg er det karakteristisk at regnbueørreten og atlantisk laks er like følsomme for infeksjoner med SAV3, selv om regnbueørret synes å være litt resistent mot infeksjon med SAV1. Til slutt synes hjertet å friskne til tidligere etter infeksjoner med SAV3 sammenlignet med infeksjoner med SAV1. Phenotypic differences exist between isolates within the three SAV groups, as well as between groups (Christie et al. Dis. Aquat. Org. 75: 13-22, 2007, Hodneland et al. 2005, Taksdal et al.): I a study by Taksdal et al. all Atlantic salmon and 76% of rainbow trout infected with viruses of the SAV3 subtype had severe pancreatic lesions in the late/regenerative phase. This was in contrast to reports from Irish and Scottish cases where fish infected with SAV1 usually had normal, probably healed, exocrine pancreatic tissue. A further characteristic feature of pancreatic disease caused by the SAV3 subtype is the presence of numerous cells in the kidney containing cytoplasmic eosinophilic granules (EG). In Taksdal's studies, EG-containing cells were found in 40% of rainbow trout and in 64% of Atlantic trout. In addition, it is characteristic that rainbow trout and Atlantic salmon are equally sensitive to infection with SAV3, although rainbow trout appear to be slightly resistant to infection with SAV1. Finally, the heart appears to recover earlier after infections with SAV3 compared to infections with SAV1.

I henhold til ytterligere utførelsesformer er viruset som er inkludert i sammensetningen ifølge oppfinnelsen, i stand til å fremkalle dødelighet på minst slik som minst 30 %, minst 35 %, minst 40 %, minst 45 %, minst 50 %, minst 55 % eller fortrinnsvis minst 60 % i en laboratorieutfordringsmodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitoneal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann (25 ‰) på 12 <o>C. According to further embodiments, the virus included in the composition according to the invention is capable of inducing mortality of at least such as at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55% or preferably at least 60% in a laboratory challenge model, the model includes smoltification of Atlantic salmon according to standard procedures and challenge of post-smolt by intraperitoneal injection with a SAV3 dose of at least 10<8>TCID50 per fish, such as at least 10<9>TCID50, at least 10<10>TCID50 or preferably at least 3.5 x 10<8>TCID50 per fish within one day of transfer to seawater (25 ‰) at 12 <o>C.

Den nye varianten av salmonid alfavirus undertype SAV3 ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved evnen til å vokse til høye titre in vitro i kulturer av vertsceller. Således kan dette viruset ifølge oppfinnelsen være i stand til å vokse til en titer i supernantanten/vekstmediet på minst 1x10<8>, 5x10<8>, 1x10<9>, 5x10<9>, 1x10<10 >og 5x10<10 >eller slik som minst 1x10<11 >TCID50/ml når de dyrkes ved å anvende vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler. The new variant of salmonid alphavirus subtype SAV3 according to the invention is characterized by the ability to grow to high titers in vitro in cultures of host cells. Thus, according to the invention, this virus may be able to grow to a titer in the supernatant/growth medium of at least 1x10<8>, 5x10<8>, 1x10<9>, 5x10<9>, 1x10<10 > and 5x10<10 > or such as at least 1x10<11 >TCID50/ml when cultured using host cells selected from the group consisting of CHH-1 cells or CHSE-214 cells.

Spesielt kan slike høye virustitre i følge oppfinnelsen oppnås når: In particular, such high virus titres according to the invention can be achieved when:

iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikkeessensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin og v) De infiserte cellene dyrkes ved en temperatur på 15 ºC i en periode på 10-14 dager. iv) The host cells are grown in a growth medium comprising EMEM (EBSS) + 10% fetal bovine serum (FBS) 2 mM L-glutamine 1% non-essential amino acids (NEAA) 0.1% gentamicin and v) The infected cells are grown at a temperature of 15 ºC for a period of 10-14 days.

Det vil videre bli forstått at SAV1, SAV3, SAV4, SAV5 eller SAV6-viruset som er inkludert i sammensetningen, er et virus som hvis ikke det er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med fiskepankreatisk sykdom. Generelle symptomer på fiskepankreatisk sykdom har blitt gjennomgått i McLoughlin og Graham, Journal of Fish Disease 2007, 30, 511-531, hvis innhold er innlemmet her i sin helhet. Symptomene inkluderer: It will further be understood that the SAV1, SAV3, SAV4, SAV5 or SAV6 virus included in the composition is a virus which, if not attenuated or inactivated, is capable of causing the symptoms associated with fish pancreatic disease. General symptoms of fish pancreatic disease have been reviewed in McLoughlin and Graham, Journal of Fish Disease 2007, 30, 511-531, the contents of which are incorporated herein in their entirety. The symptoms include:

i) Død/dødelighet i) Death/mortality

ii) Mangel på appetitt ii) Lack of appetite

iii) Nedsatt svømmeferdighet iii) Impaired swimming skills

iv) Letargi iv) Lethargy

v) Pankreatisk nekrose v) Pancreatic necrosis

vi) Kardiomyopati og skjeletal myopati, inklusive øsofageale muskellesjoner vi) Cardiomyopathy and skeletal myopathy, including esophageal muscle lesions

vii) Nyrelesjoner, angrepne nyrer som inneholder tallrike interstitielle celler fylt med eosinofilt materiale vii) Renal lesions, affected kidneys containing numerous interstitial cells filled with eosinophilic material

viii) Fokal gliose i hjernen. viii) Focal gliosis in the brain.

Generelt kan sykdomsforløpet som følge av infeksjoner med fiskepankreatisk sykdomsvirus karakteriseres som å omfatte en akutt fase og en sen/kronisk fase, der hver fase er forbundet med forskjellige histopatologiske symptomer. Viruset tilveiebrakt kan særlig være i stand til å forårsake minst ett av følgende histopatologiske symptomer i akuttfasen: In general, the course of the disease as a result of infections with fish pancreatic disease virus can be characterized as comprising an acute phase and a late/chronic phase, where each phase is associated with different histopathological symptoms. In particular, the virus provided may be capable of causing at least one of the following histopathological symptoms in the acute phase:

i) ødeleggelse av hoveddelen av pankreatisk acinærvev og en variabel inflammatorisk respons som varierer fra ingen inflammasjon til moderat inflammasjon; i) destruction of the main part of pancreatic acinar tissue and a variable inflammatory response ranging from no inflammation to moderate inflammation;

ii) fibrose i periacinært vev. ii) fibrosis of periacinar tissue.

Viruset tilveiebrakt kan også være i stand til å forårsake minst ett av de følgende histopatologiske symptomene i den sene/kroniske fasen. The virus provided may also be capable of causing at least one of the following histopathological symptoms in the late/chronic phase.

i) signifikant tap av pankreatisk acinærvev med eller uten fibroplasi av periacinært vev; i) significant loss of pancreatic acinar tissue with or without fibroplasia of periacinar tissue;

ii) multifokal kardiomyocytisk nekrose, angrepne celler har et innskrumpet, dypt eosinofilt cytoplasma og pyknotiske kjerner. ii) multifocal cardiomyocytic necrosis, affected cells have a shrunken, deeply eosinophilic cytoplasm and pyknotic nuclei.

I motsetning til infeksjoner med SAV1 og -3 er infeksjoner med SAV2 i regnbueørret rapportert å forårsake lavere dødelighet, men en dødelighet på opptil 22 % har blitt rapportert (Boucher og Baudin 1994). Sovesyke kan imidlertid forårsake at fisken ligger på siden på bunnen av tanker eller vannrenner. Dersom den forstyrres, svømmer fisken litt og returnerer deretter til bunnen. Dette tegnet skyldes primært omfattende nekrose i røde skjelettmuskler. In contrast to infections with SAV1 and -3, infections with SAV2 in rainbow trout have been reported to cause lower mortality, but mortality of up to 22% has been reported (Boucher and Baudin 1994). However, sleeping sickness can cause the fish to lie on their side at the bottom of tanks or water channels. If disturbed, the fish swims a little and then returns to the bottom. This sign is primarily due to extensive necrosis in red skeletal muscle.

Makroskopiske lesjoner forekommer ikke, men av og til sekundære sår på skinnet eller petekkier på det pyloriske organ. Nekroser av røde skjelettmuskler kan forefinnes, og histopatologisk undersøkelse kan avsløre inflammasjon i eksokrin pankreas og hjerte. I den enkelte fisk kan disse lesjonene foreligge med eller uten noen atferdsendringer. Macroscopic lesions do not occur, but occasionally secondary ulcers on the skin or petechiae on the pyloric organ. Necrosis of red skeletal muscle can be found, and histopathological examination can reveal inflammation in the exocrine pancreas and heart. In the individual fish, these lesions can be present with or without any behavioral changes.

Det vil bli forstått at SAV2-viruset, som kan være inkludert i sammensetningen, er et virus som hvis det ikke er svekket eller inaktivert er i stand til å forårsake symptomene forbundet med sovesyke hos fisk. It will be understood that the SAV2 virus, which may be included in the composition, is a virus which, if not attenuated or inactivated, is capable of causing the symptoms associated with sleeping sickness in fish.

Det skal videre forstås at viruset ifølge oppfinnelsen kan ha en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, slik som under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler. Som nevnt har nåværende oppfinnere identifisert en ny variant av salmonid alfavirus undertype SAV3. Denne varianten av viruset viste synlig cytopatogen effekt under første passasje i cellekultur. Mens tidligere isolater av salmonid alfavirus ikke har hatt synlig cytopatogen effekt før de vente seg til in vitro dyrkingsbetingelsene, kan evnen til å forårsake en cytopatogen effekt uten å ha blitt passert på en cellelinje derfor brukes som enda et kjennetegn på viruset ifølge foreliggende oppfinnelse. It should further be understood that the virus according to the invention can have a visible cytopathogenic effect during early passage in cell culture, such as during the first, second, third or fourth passage on a culture with CHSE cells. As mentioned, the present inventors have identified a new variant of salmonid alphavirus subtype SAV3. This variant of the virus showed a visible cytopathogenic effect during the first passage in cell culture. While previous isolates of salmonid alphavirus have not had a visible cytopathogenic effect until they are exposed to the in vitro culture conditions, the ability to cause a cytopathogenic effect without having been passed on a cell line can therefore be used as a further characteristic of the virus according to the present invention.

Det skal også forstås at de deponerte virusene kan mutere eller på annen måte endre karakteristika, for eksempel når de passeres på vertsceller in vitro (JD Watson m.fl., 1987). Fagmannen vil innse at replikasjon av RNA-virusgenomer ledsages av svært høye mutasjonsrater (Watson et al., 1987). Dette skyldes mangel på korrekturlesingsaktivitet hos RNA-viruspolymeraser, noe som fører til en konstant generering av nye genetiske varianter for eksempel under viruspropagering (Elena og Sanjuán, 2005). Domingo og Holland (1997) konkluderer dessuten med at forskjellige konstellasjoner av mutasjoner kan assosieres med en lignende biologisk atferd. Salmonid alfavirus anvendt til den foreliggende oppfinnelsens formål kan derfor være en stamme som kan oppnås ved å introdusere én eller flere substitusjoner, utelatelser og/eller tilføyelser av nukleotider i genomet til en enkelt av de deponerte stammene nevnt over. Med andre ord kan salmonid alfavirus som anvendes til den foreliggende oppfinnelsens formål være en genetisk variant av en hvilken som helst av de ovennevnte deponerte stammene. It should also be understood that the deposited viruses can mutate or otherwise change their characteristics, for example when they are passed on host cells in vitro (JD Watson et al., 1987). Those skilled in the art will appreciate that replication of RNA virus genomes is accompanied by very high mutation rates (Watson et al., 1987). This is due to a lack of proofreading activity in RNA virus polymerases, which leads to a constant generation of new genetic variants, for example during virus propagation (Elena and Sanjuán, 2005). Domingo and Holland (1997) also conclude that different constellations of mutations can be associated with a similar biological behavior. Salmonid alphavirus used for the purpose of the present invention can therefore be a strain that can be obtained by introducing one or more substitutions, omissions and/or additions of nucleotides in the genome of a single one of the deposited strains mentioned above. In other words, the salmonid alphavirus used for the purposes of the present invention may be a genetic variant of any of the above-mentioned deposited strains.

Oppfinnerne har under screeningen av nye SAV 3-isolater fra utbrudd i norske lakseoppdrettsanlegg oppdaget en variant av viruset med egenskaper som avviker signifikant fra de som tidligere er beskrevet. Funnet av at denne varianten av SAV3-undertypen viste synlig cytopatogen effekt under dens første passasjen i cellekultur, og frembrakte dødelighet da den ble injisert i atlantisk laks, var derfor høyst overraskende. I tillegg er det meget oppmuntrende at vaksiner basert på antigent materiale fra denne varianten av viruset gir en utmerket beskyttelse mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus, også når vaksinen gis som en polyvalent vaksine omfattende ytterligere antigener. I tillegg har denne nylig oppdagede varianten av viruset gode vekstegenskaper ved vekst in vitro på kulturer av vertsceller. During the screening of new SAV 3 isolates from outbreaks in Norwegian salmon farms, the inventors have discovered a variant of the virus with characteristics that differ significantly from those previously described. The finding that this variant of the SAV3 subtype showed visible cytopathogenic effect during its first passage in cell culture, and produced lethality when injected into Atlantic salmon, was therefore highly surprising. In addition, it is very encouraging that vaccines based on antigenic material from this variant of the virus provide excellent protection against subsequent infection with salmonid alphavirus, also when the vaccine is given as a polyvalent vaccine comprising additional antigens. In addition, this newly discovered variant of the virus has good growth characteristics when grown in vitro on cultures of host cells.

Det vil forstås at kulturene med salmonid alfavirus som anvendes, hovedsakelig er fri for annet viralt eller mikrobielt materiale. Spesielt er kontaminering av virusisolater med IPNV en kilde til bekymring siden fisk infisert med salmonid alfavirus, ofte også er infisert med IPNV. I løpet av isoleringen av viruset kan det derfor være nødvendig å tilsette et antistoff rettet mot IPNV for å eliminere IPNV-viruset fra isolater eller kulturer av viruset. I kulturer av virus på vertsceller vil dette antistoffet hemme infeksjon av vertscellene med IPNV. It will be understood that the cultures of salmonid alpha virus used are essentially free of other viral or microbial material. In particular, contamination of virus isolates with IPNV is a source of concern since fish infected with salmonid alphavirus are often also infected with IPNV. During the isolation of the virus, it may therefore be necessary to add an antibody directed against IPNV to eliminate the IPNV virus from isolates or cultures of the virus. In cultures of virus on host cells, this antibody will inhibit infection of the host cells with IPNV.

I et spesifikt og for tiden foretrukket tilfelle, som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Nord-Europa, inkludert Norge, omfatter sammensetningen: In a specific and currently preferred case, which is currently intended for use in Northern Europe, including Norway, the composition includes:

i) inaktivert Salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 3,75x10<7 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), fortrinnsvis 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5x10<8 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), i) inactivated Salmonid alphavirus, such as subtype SAV3 in an amount corresponding to 7.5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (to preferably give 3.75x10<7 >– 2.5x10<8 >TCID50/dose at a dosing volume of 50 μl), preferably 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (to preferably give 0.5x10<8 >– 2.5x10<8 >TCID50/dose at a dosing volume of 50 μl),

ii) inaktivert Aeromonas salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose), ii) inactivated Aeromonas salmonicida in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose),

iii) inaktivert Vibrio. salmonicida i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iii) inactivated Vibrio. salmonicida in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl),

iv) inaktivert Vibrio anguillarum i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iv) inactivated Vibrio anguillarum in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl),

v) inaktivert Moritella viscosa i en mengde tilsvarende 0,5 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), v) inactivated Moritella viscosa in an amount corresponding to 0.5 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosing volume of 50 μl),

vi) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), vi) inactivated infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in an amount corresponding to 1.0-5.0x10<9 >PFU/ml live virus (to preferably provide 0.5 – 2.5x10<8 >PFU/dose at a dosage volume of 50 μl) or 2-8 antigen units (AU)/ml (to preferably give 0.2-0.8 antigen units/dose at a dosing volume of 50 μl),

vii) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og vii) an adjuvant, preferably mineral oil; and

viii) en detergent og/eller emulgator. viii) a detergent and/or emulsifier.

I alternative tilfeller som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sør-Amerika, inkludert Chile, omfatter sammensetningen: In alternative cases currently intended for use in South America, including Chile, the composition includes:

ii) inaktivert Vibrio ordali i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), ii) inactivated Vibrio ordali in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl),

iii) inaktivert Piscirickettsia salmonis i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iii) inactivated Piscirickettsia salmonis in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosing volume of 50 μl),

iv) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml levende virus (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iv) inactivated infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in an amount corresponding to 1.0-5.0x10<9 >PFU/ml live virus (to preferably provide 0.5 – 2.5x10<8 >PFU/dose at a dosage volume of 50 μl) or 2-8 antigen units (AU)/ml (to preferably give 0.2-0.8 antigen units/dose at a dosing volume of 50 μl),

v) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og v) an adjuvant, preferably mineral oil; and

vi) en detergent og/eller emulgator. vi) a detergent and/or emulsifier.

I andre alternative tilfeller som for øyeblikket er tiltenkt for anvendelse i Sørøst-Asia, omfatter sammensetningen: In other alternative cases currently intended for use in Southeast Asia, the composition includes:

i) inaktivert salmonid alfavirus, slik som undertype SAV3 i en mengde tilsvarende 7,5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 2,5x10<7 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), fortrinnsvis 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5x10<8 >– 2,5x10<8 >TCID50/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), i) inactivated salmonid alphavirus, such as subtype SAV3 in an amount corresponding to 7.5x10<8 >- 5x10<9 >TCID50/ml (to preferably give 2.5x10<7 >– 2.5x10<8 >TCID50/dose at a dosing volume of 50 μl), preferably 1x10<9 >- 5x10<9 >TCID50/ml (to preferably give 0.5x10<8 >– 2.5x10<8 >TCID50/dose at a dosing volume of 50 μl),

ii) inaktivert Aeromonas hydrophila i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), ii) inactivated Aeromonas hydrophila in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosing volume of 50 μl),

iii) inaktivert Flavobacterium columnaris i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iii) inactivated Flavobacterium columnaris in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl),

iv) inaktivert Haphnia sp. i en mengde tilsvarende 0,9 -5x10<9 >celler/ml (for å fortrinnsvis gi 0,45 – 2,5x10<8 >celler/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), iv) inactivated Haphnia sp. in an amount corresponding to 0.9 -5x10<9 >cells/ml (to preferably give 0.45 – 2.5x10<8 >cells/dose at a dosage volume of 50 μl),

v) inaktivert infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) i en mengde tilsvarende 1,0-5,0x10<9 >PFU/ml (for å fortrinnsvis gi 0,5 – 2,5x10<8 >PFU/dose ved et doseringsvolum på 50 μl) eller 2-8 antigenenheter (AU)/ml (for å fortrinnsvis gi 0,2-0,8 antigenenheter/dose ved et doseringsvolum på 50 μl), v) inactivated infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in an amount corresponding to 1.0-5.0x10<9 >PFU/ml (to preferably give 0.5 – 2.5x10<8 >PFU/dose at a dosage volume of 50 μl) or 2-8 antigen units (AU)/ml (to preferably give 0.2-0.8 antigen units/dose at a dosing volume of 50 μl),

vi) en adjuvans, fortrinnsvis mineralolje; og vi) an adjuvant, preferably mineral oil; and

vii) en detergent og/eller emulgator. vii) a detergent and/or emulsifier.

Doseringsform Dosage form

Det er også besrkevet en doseringsform av en sammensetning. A dosage form of a composition is also described.

Selv om andre doseringsformer kan være overveid, inkludert faste doseringsformer basert på fiskefôr, er doseringsformen fortrinnsvis en flytende doseringsform, mer foretrukket en flytende doseringsform for injeksjon slik som intraperitoneal injeksjon. Når doseringsformen er beregnet for injeksjon, har den fortrinnsvis et volum på 25–200 μl, mer foretrukket et volum på 40–120 μl, slik som et volum på 90–110 μl eller 45–55 μl. For tiden er et doseringsvolum på 50 μl mest foretrukket av praktiske grunner. Although other dosage forms may be contemplated, including solid dosage forms based on fish feed, the dosage form is preferably a liquid dosage form, more preferably a liquid dosage form for injection such as intraperitoneal injection. When the dosage form is intended for injection, it preferably has a volume of 25-200 μl, more preferably a volume of 40-120 μl, such as a volume of 90-110 μl or 45-55 μl. Currently, a dosing volume of 50 μl is most preferred for practical reasons.

I forbindelse med doseringsformen gjelder de samme preferansene med hensyn til doseringsvolum og antigeninnhold som beskrevet i forbindelse med sammensetningen. In connection with the dosage form, the same preferences apply with regard to dosage volume and antigen content as described in connection with the composition.

Spesielt omfatter doseringsformen fortrinnsvis salmonid alfavirus i mengder tilsvarende 0,75 x 10<7>-0,5 x 10<10 >TCID50/dose, slik som fra 0,75 x 10<7>-2,5 x 10<9>, fra 0,75 x 10<7>-0,5 x 10<9>, fra 0,75 x 10<7>-2,5 x 10<8>, fra 0,75 x 10<7>-1 x 10<8>, fra 0,75 x 10<7>-4,5 x 10<7>, fra 0,75 x 10<7>-4 x 10<7>, fra 0,75 x 10<7>-3,5 x 10<7>, 0,75 x 10<7>-3 x 10<7>, 1,25 x 10<7>-0,5 x 10<10>, 2,5 x 10<7>-0,5 x 10<10>, 3,75 x 10<8>-0,5 x 10<10>, 0,5 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 1,25 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 2,5 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 3,75 x 10<9>-0,5 x 10<10>, 1,25 x 10<7>-3,75 x 10<9>, 2,5 x 10<7>-2,5 x 10<19>, 2,5 x 10<7>-3,75 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 2,5 x 10<7>-1 x 10<8>, fra 2,5 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3 x 10<8>, 3 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-2 x 10<8>, 3 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 3 x 10<7>-1 x 10<8>, 3 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-1 x 10<8>, 3,5 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 3,75 x 10<7>-0,5 x 10<9>, 4 x 10<7>-3 x 10<8>, 4 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-2 x 10<8>, 4 x 10<7>-1,5 x 10<8>, 4 x 10<7>-1 x 10<8>, 4 x 10<7>-0,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-3,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-3 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-2,5 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-2 x 10<8>, 4,5 x 10<7>-1,5 x 10<8>, eller fra 4,5 x 10<7>-1 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-3,75 x 10<9>, 3,73 x 10<7>-2,5 x 10<9>, 0,5 x 10<8>-0,5 x 10<9>, 0,5 x 10<8>-4 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-2,5 x 10<8>, 0,5 x 10<8>-1,25 x 10<9>, 1,25 x 10<8>-0,5 x 10<9 >eller fra 2,5 x 10<8>-3,75 x 10<8 >TCID50/dose. In particular, the dosage form preferably comprises salmonid alphavirus in amounts corresponding to 0.75 x 10<7>-0.5 x 10<10 >TCID50/dose, such as from 0.75 x 10<7>-2.5 x 10<9> , from 0.75 x 10<7>-0.5 x 10<9>, from 0.75 x 10<7>-2.5 x 10<8>, from 0.75 x 10<7>-1 x 10<8>, from 0.75 x 10<7>-4.5 x 10<7>, from 0.75 x 10<7>-4 x 10<7>, from 0.75 x 10<7 >-3.5 x 10<7>, 0.75 x 10<7>-3 x 10<7>, 1.25 x 10<7>-0.5 x 10<10>, 2.5 x 10 <7>-0.5 x 10<10>, 3.75 x 10<8>-0.5 x 10<10>, 0.5 x 10<9>-0.5 x 10<10>, 1 .25 x 10<9>-0.5 x 10<10>, 2.5 x 10<9>-0.5 x 10<10>, 3.75 x 10<9>-0.5 x 10< 10>, 1.25 x 10<7>-3.75 x 10<9>, 2.5 x 10<7>-2.5 x 10<19>, 2.5 x 10<7>-3, 75 x 10<8>, 2.5 x 10<7>-3 x 10<8>, 2.5 x 10<7>-2.5 x 10<8>, 2.5 x 10<7>- 2 x 10<8>, 2.5 x 10<7>-1.5 x 10<8>, 2.5 x 10<7>-1 x 10<8>, from 2.5 x 10<7> -0.5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3.5 x 10<8>, 3 x 10<7>-3 x 10<8>, 3 x 10<7>-2.5 x 10<8>, 3 x 10<7>-2 x 10<8>, 3 x 10<7>-1.5 x 10<8>, 3 x 10<7>-1 x 10<8>, 3 x 10<7>-0.5 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-3.5 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-3 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-2.5 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-2 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-1.5 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-1 x 10<8>, 3.5 x 10<7>-0.5 x 10<8>, 4 x 10<7>-3.5 x 10<8>, 3.75 x 10<7>-0, 5 x 10<9>, 4 x 10<7>-3 x 10<8>, 4 x 10<7>-2.5 x 10<8>, 4 x 10<7>-2 x 10<8> , 4 x 10<7>-1.5 x 10<8>, 4 x 10<7>-1 x 10<8>, 4 x 10<7>-0.5 x 10<8>, 4.5 x 10<7>-3.5 x 10<8>, 4.5 x 10<7>-3 x 10<8>, 4.5 x 10<7>-2.5 x 10<8>, 4 .5 x 10<7>-2 x 10<8>, 4.5 x 10<7>-1.5 x 10<8>, or from 4.5 x 10<7>-1 x 10<8> , 0.5 x 10<8>-3.75 x 10<9>, 3.73 x 10<7>-2.5 x 10<9>, 0.5 x 10<8>-0.5 x 10<9>, 0.5 x 10<8>-4 x 10<8>, 0.5 x 10<8>-2.5 x 10<8>, 0.5 x 10<8>-1, 25 x 10<9>, 1.25 x 10<8>-0.5 x 10<9 >or from 2.5 x 10<8>-3.75 x 10<8 >TCID50/dose.

Vaksine Vaccine

Det er ytterligere besrkevet en vaksine omfattende en sammensetning eller en doseringsform som definert over. Det skal forstås at alle trekk som beskrevet over også vil gjelde vaksinen. It is further described a vaccine comprising a composition or a dosage form as defined above. It should be understood that all features described above will also apply to the vaccine.

Som fagmannen vil vite, kan flere metoder og måter for administrasjon av vaksiner være anvendbare i akvakultur. Det skal derfor forstås at vaksinen kan formuleres for administrasjon ved en rute valgt fra gruppen bestående av: intraperitoneal injeksjon, bad, nedsenking, intramuskulær injeksjon og oral administrasjon eller kombinasjoner herav. As those skilled in the art will know, several methods and modes of administration of vaccines may be applicable in aquaculture. It is therefore to be understood that the vaccine may be formulated for administration by a route selected from the group consisting of: intraperitoneal injection, bath, immersion, intramuscular injection and oral administration or combinations thereof.

Av bekvemmelighetshensyn foretrekkes det at vaksinen administreres til parr laks, fortrinnsvis parr på 10-60 gram. Som fagmannen vil innse, kan vaksinen imidlertid også administreres til laks i andre stadier, inklusive alle saltvannsstadier. For reasons of convenience, it is preferred that the vaccine is administered to pairs of salmon, preferably pairs of 10-60 grams. As those skilled in the art will appreciate, however, the vaccine can also be administered to salmon in other stages, including all saltwater stages.

Som vist i eksemplene tilveiebringer sammensetningene ekstremt effektiv beskyttelse mot infeksjon av salmonid alfavirus ved testing i laboratorieutfordringsforsøk hvor de vaksinerte fiskene utfordres med høye titre av høyvirulente SAV3-isolater. I området hvor fisken eksponeres for mye lavere titre av viruset forventes det at beskyttende virkning av vaksinene tilveiebrakt er enda høyere enn det som er vist i foreliggende eksempler. As shown in the examples, the compositions provide extremely effective protection against salmonid alphavirus infection when tested in laboratory challenge experiments where the vaccinated fish are challenged with high titers of highly virulent SAV3 isolates. In the area where the fish are exposed to much lower titers of the virus, it is expected that the protective effect of the vaccines provided is even higher than that shown in the present examples.

Medisinsk anvendelse/fremgangsmåte for profylakse Medical application/procedure for prophylaxis

Det er også beskrevet en anvendelse av inaktivert salmonid alfavirus i fremstillingen av et medikament, f.eks. som en immunologisk sammensetning slik som en vaksine, og/eller doseringsform for administrasjon samtidig eller i kombinasjon med én eller flere antigene komponenter valgt fra gruppen bestående av: A use of inactivated salmonid alpha virus in the preparation of a drug has also been described, e.g. as an immunological composition such as a vaccine, and/or dosage form for administration simultaneously or in combination with one or more antigenic components selected from the group consisting of:

a) en drept bakterie, a) a killed bacterium,

b) et inaktivert virus som ikke er et salmonid alfavirus, (b) an inactivated virus other than a salmonid alphavirus;

c) en sopp, c) a mushroom,

d) en parasitt og d) a parasite and

e) et antigent og/eller immunogent materiale avledet fra nevnte bakterie i a), fra nevnte virus i b), fra nevnte sopp i c) eller fra nevnte parasitt i d). e) an antigenic and/or immunogenic material derived from said bacterium in a), from said virus in b), from said fungus in c) or from said parasite in d).

Det skal derfor forstås at den nevnte doseringsformen fortrinnsvis inneholder inaktiverte salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 3,75 x 10<7 >TCID50/dose. Likeledes foretrekkes det at nevnte vaksine / immunologiske sammensetning inneholder inaktivert salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml. It should therefore be understood that the aforementioned dosage form preferably contains inactivated salmonid alphaviruses in an amount corresponding to at least 3.75 x 10<7 >TCID50/dose. Likewise, it is preferred that said vaccine / immunological composition contains inactivated salmonid alphavirus in an amount corresponding to at least 7.5 x 10<8 >TCID50/ml.

Det er også beskrevet en anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus i fremstillingen av en vaksine eller en immunologisk sammensetning som er kompatibel med andre immunologiske produkter, hvori vaksinen omfatter inaktivert salmonid alfavirus i en mengde som tilsvarer minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml (tilsvarende 3,75 x 10<7 >TCID50/dose med et doseringsvolum på 50 μl). It is also described a use of an inactivated salmonid alphavirus in the preparation of a vaccine or an immunological composition compatible with other immunological products, in which the vaccine comprises inactivated salmonid alphavirus in an amount corresponding to at least 7.5 x 10<8 >TCID50/ ml (equivalent to 3.75 x 10<7 >TCID50/dose with a dosing volume of 50 μl).

Sammensetningen som beskrevet over er også for anvendelse i medisin. Spesielt kan sammensetningen være for anvendelse i forebygging, eller for å redusere forekomsten av fiskepankreatisk sykdom eller, sagt på en annen måte, for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus. Det er også beskrevet en vaksine i henhold til enhver av trekkene beskrevet over for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av fiskepankreatisk sykdom. The composition as described above is also for use in medicine. In particular, the composition may be for use in preventing or reducing the incidence of fish pancreatic disease or, in other words, for use in preventing or reducing the incidence of salmonid alphavirus infection. Also disclosed is a vaccine according to any of the features described above for use in preventing or reducing the incidence of fish pancreatic disease.

Andre aspekter av oppfinnelsen tilveiebringer en vaksine som beskrevet over for anvendelse i forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus. Det vurderes om en polyvalent vaksine basert på en sammensetning som omfatter en kombinasjon av virale, bakterielle, fungale og/eller parasittiske antigener som beskrevet over, kan gi en vellykket tilnærming for å kontrollere infeksjoner med en hvilken som helst av de for tiden kjente gruppene av salmonid alfavirus, SAV1, SAV2, SAV3, SAV4, SAV5 og SAV6. Other aspects of the invention provide a vaccine as described above for use in preventing or reducing the incidence of infection with salmonid alphavirus. It is being considered whether a polyvalent vaccine based on a composition comprising a combination of viral, bacterial, fungal and/or parasitic antigens as described above may provide a successful approach to control infections with any of the currently known groups of salmonid alphavirus, SAV1, SAV2, SAV3, SAV4, SAV5 and SAV6.

Ytterligere beskrivelser vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av infeksjon med salmonid alfavirus. Further descriptions relate to the use of a composition as described above for the preparation of a drug/vaccine to prevent or reduce the occurrence of infection with salmonid alphavirus.

Enda ytterligere beskrivelser vedrører anvendelsen av en sammensetning som beskrevet over for fremstillingen av et medikament/vaksine for å forebygge eller redusere forekomsten av fiskepankreatisk sykdom og/eller sovesyke. I enda en annen beskrivelse tilveiebringes en fremgangsmåte for å redusere forekomsten av og/eller behandle eller forebygge infeksjon med salmonid alfavirus i en fiskepopulasjon, der fremgangsmåten omfatter å administrere en sammensetning, vaksine eller doseringsform som definert over til fisken. Even further descriptions relate to the use of a composition as described above for the production of a drug/vaccine to prevent or reduce the occurrence of fish pancreatic disease and/or sleeping sickness. In yet another description, a method is provided for reducing the occurrence of and/or treating or preventing infection with salmonid alpha virus in a fish population, where the method comprises administering a composition, vaccine or dosage form as defined above to the fish.

Fremgangsmåte for å lage en vaksine Procedure for making a vaccine

Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning og/eller vaksine og/eller doseringsform som definert over. Fremgangmåten omfatter å kombinere et fortrinnsvis svekket eller inaktivert salmonid alfavirus eller et antigent og/eller immunogent materiale avledet derav med én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: A method for producing a composition and/or vaccine and/or dosage form as defined above is also described. The method comprises combining a preferably attenuated or inactivated salmonid alphavirus or an antigenic and/or immunogenic material derived therefrom with one or more components selected from the group consisting of:

c. en sopp, c. a mushroom,

d. en parasitt og d. a parasite and

Fortrinnsvis justeres mengden med salmonid alfavirus for å tilveiebringe en sammensetning eller vaksine som omfatter minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml inaktivert salmonid alfavirus eller en doseringsform som omfatter minst 2,5 x 10<7 >TCID50/dose. Preferably, the amount of salmonid alphavirus is adjusted to provide a composition or vaccine comprising at least 7.5 x 10<8 >TCID50/ml of inactivated salmonid alphavirus or a dosage form comprising at least 2.5 x 10<7 >TCID50/dose.

I denne sammenheng er fortrinnsvis de virale, bakterielle, fungale og parasittiske antigenkomponentene som spesifisert over, avhengig av fiskepatogenene som er utbredt i området hvor vaksinen skal anvendes. In this context, the viral, bacterial, fungal and parasitic antigen components as specified above are preferably dependent on the fish pathogens that are widespread in the area where the vaccine is to be used.

Siden det salmonide alfaviruset må dyrkes på kulturer av vertsceller kan fremgangsmåten i henhold til beskrivelsen videre omfatte Since the salmonid alphavirus must be grown on cultures of host cells, the method according to the description can further include

a. etablering av en kultur med vertsceller; a. establishment of a culture with host cells;

b. infisering av vertscellene med et isolat av et virus av salmonid alfavirus og c. dyrking av infiserte celler under betingelser som tillater nevnte virus å nå en titer i supernatanten/vekstmediet på minst 7,5 x 10<8 >TCID50/ml, slik som minst 1 x 10<9>, 5 x 10<9>, 1 x 10<10 >eller minst 5 x 10<10 >TCID50/ml. b. infecting the host cells with an isolate of a virus of salmonid alphavirus and c. culturing infected cells under conditions which allow said virus to reach a titer in the supernatant/growth medium of at least 7.5 x 10<8 >TCID50/ml, such as at least 1 x 10<9>, 5 x 10<9>, 1 x 10<10 >or at least 5 x 10<10 >TCID50/ml.

I fremgangsmåten dyrkes vertscellene enten på et fast medium eller som suspensjonskulturer. In the method, the host cells are grown either on a solid medium or as suspension cultures.

For å gi optimale vekstbetingelser dyrkes vertscellene fortrinnsvis ved en pH mellom 6,5 og 8,5, slik som mellom 7,0 og 8,0, mellom 7,2 og 8,0, mellom 7 og 7,5 eller mellom 7,2 og 7,5. To provide optimal growth conditions, the host cells are preferably grown at a pH between 6.5 and 8.5, such as between 7.0 and 8.0, between 7.2 and 8.0, between 7 and 7.5 or between 7, 2 and 7.5.

Fremgangsmåten er utviklet for det spesielle formålet å produsere den salmonid alfavirus vaksinekomponenten i store mengder. Derfor er prosessen i de for øyeblikket foretrukne trekkene tilpasset for å produsere salmonid alfavirusmateriale i batcher på 25–2000 liter, slik som 25–1000 liter, 50–2000 liter, 50–1000 liter eller 50–500 liter. The process has been developed for the specific purpose of producing the salmonid alphavirus vaccine component in large quantities. Therefore, the process in the currently preferred features is adapted to produce salmonid alphavirus material in batches of 25-2000 liters, such as 25-1000 liters, 50-2000 liters, 50-1000 liters or 50-500 liters.

Det er et videre særpreg ved fremgangsmåten i visse tilfeller at vertscellene sås med en tetthet på 0,1-1,5 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1,5 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1,25 x 10<5 >celler cm<-2>, 0,2-1 x 10<5 >celler cm<-2 >eller 0,2-1 x 10<5 >celler cm<-2 >når de dyrkes på en fast bærer. It is a further feature of the method that in certain cases the host cells are seeded at a density of 0.1-1.5 x 10<5 >cells cm<-2>, 0.2-1.5 x 10<5 >cells cm <-2>, 0.2-1.25 x 10<5 >cells cm<-2>, 0.2-1 x 10<5 >cells cm<-2 >or 0.2-1 x 10<5 >cells cm<-2 >when grown on a solid support.

I henhold til videre beskrivelse dyrkes vertscellene i 3–8 dager før virusinfisering, slik som fra 4–8 dager, 4–7 dager eller fra 4–6 dager. According to further description, the host cells are cultured for 3-8 days prior to virus infection, such as from 4-8 days, 4-7 days or from 4-6 days.

I enda videre beskrivelser dyrkes nevnte vertsceller til en tetthet på 8 x 10<5 >celler cm<-2 >på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat. In even further descriptions, said host cells are grown to a density of 8 x 10<5 >cells cm<-2 >at the time of infection with said virus isolate.

Spesielt kan vertscellene dyrkes til en tetthet på fra 5 x 10<5 >celler cm<-2 >til 5 x 10<6 >celler cm<-2 >på infiseringstidspunktet med nevnte virusisolat. In particular, the host cells can be cultured to a density of from 5 x 10<5 >cells cm<-2 >to 5 x 10<6 >cells cm<-2 >at the time of infection with said virus isolate.

Hva gjelder vekstmediet kan det være fortrukket at vertscellene dyrkes i et vekstmedium valgt fra gruppen bestående av EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin. As regards the growth medium, it may be preferred that the host cells are cultured in a growth medium selected from the group consisting of EMEM (EBSS) + 10% fetal bovine serum (FBS) 2 mM L-glutamine 1% non-essential amino acids (NEAA) 0.1% gentamicin .

Etter infisering av cellene dyrkes de infiserte cellene fortrinnsvis ved en temperatur fra 12-16 ºC, slik som ved en temperatur på 13-16 ºC, 13-15 ºC, 14-16º C eller 14-15 ºC, og i en periode på 6-20 dager, slik som en periode på 8-20 dager, 8-18 dager, 8-16 dager, 9-20 dager, 9-18 dager, 9-16 dager, 10-20 dager, 10-18 dager, 10-16 dager eller 10-14 dager. After infecting the cells, the infected cells are preferably cultured at a temperature of 12-16 ºC, such as at a temperature of 13-16 ºC, 13-15 ºC, 14-16º C or 14-15 ºC, and for a period of 6 -20 days, such as a period of 8-20 days, 8-18 days, 8-16 days, 9-20 days, 9-18 days, 9-16 days, 10-20 days, 10-18 days, 10 -16 days or 10-14 days.

Dessuten kan det være foretrukket at de infiserte cellene dyrkes inntil 30 % av vertscellene er lysert eller har løsnet, slik som inntil 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % eller 90 % av vertscellene er lysert eller har en cytopatogen effekt bestående av avrundede celler. Furthermore, it may be preferred that the infected cells are cultured until 30% of the host cells are lysed or detached, such as until 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the host cells are lysed or have a cytopathogenic effect consisting of rounded cells.

Som forklart over kan det være foretrukket at nevnte salmonide alfavirus er et virus av SAV3-undertypen. As explained above, it may be preferred that said salmonid alphavirus is a virus of the SAV3 subtype.

Hva gjelder vertscellene velges disse fortrinnsvis fra gruppen bestående av celler avledet fra hjertevev fra unge chum-laks (Onchorhynchus keta), celler avledet fra Chinook-laks (Oncorhynchus tshawytscha)-embryo. As regards the host cells, these are preferably selected from the group consisting of cells derived from heart tissue from young chum salmon (Onchorhynchus keta), cells derived from Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) embryos.

Mer spesielt er det foretrukket å bruke vertsceller som velges fra gruppen bestående av CHH-1-celler og CHSE-214-celler, CHH-1-celler er tilgjengelige fra ATCC under deponeringsnummer CRL-1680, CHSE-214-celler er tilgjengelige fra ATCC, deponeringsnummer CRL 1681 og fra ECACC under deponeringsnummer 91041114. More particularly, it is preferred to use host cells selected from the group consisting of CHH-1 cells and CHSE-214 cells, CHH-1 cells are available from ATCC under accession number CRL-1680, CHSE-214 cells are available from ATCC , deposit number CRL 1681 and from ECACC under deposit number 91041114.

Bakterielle antigener til bruk i polyvalente vaksiner kan fremstilles ved å bruke konvensjonelle teknikker, f.eks. ved å dyrke bakteriene i tryptisk soyabuljong med 2 % NaCl ved 12-15 <o>C, eller i hjerne/hjerte-infusjonsbuljong med 3 % NaCl ved 12-15 <o>C (Atlas, RM,2004, Handbook of Microbiological Media, tredje utgave, CRC press, side 1820 og 246). Bacterial antigens for use in polyvalent vaccines can be prepared using conventional techniques, e.g. by growing the bacteria in tryptic soy broth with 2% NaCl at 12-15 <o>C, or in brain/heart infusion broth with 3% NaCl at 12-15 <o>C (Atlas, RM,2004, Handbook of Microbiological Media , third edition, CRC press, pages 1820 and 246).

Hva gjelder infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) kan dette viruset propageres i den hensikt å fremstille en vaksine i CHSE-214-celler i henhold til Dobos P og Roberts TE, 1982, Canadian Journal of Microbiology, 29, 377 – 384. As for infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), this virus can be propagated for the purpose of producing a vaccine in CHSE-214 cells according to Dobos P and Roberts TE, 1982, Canadian Journal of Microbiology, 29, 377 – 384.

Dyrkingen av disse representative patogenene er også beskrevet på http://www.lgcpromochem-atcc.com/. The cultivation of these representative pathogens is also described at http://www.lgcpromochem-atcc.com/.

Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for å forbedre en polyvalent vaksine. Fremgangsmåten omfatter å inkludere (en immunogen mengde av) et svekket eller inaktivert salmonid alfavirus i den polyvalente vaksinen. I en beskrivelse omfatter den polyvalente vaksine én eller flere komponenter valgt fra gruppen bestående av: A method for improving a polyvalent vaccine is also described. The method comprises including (an immunogenic amount of) an attenuated or inactivated salmonid alphavirus in the polyvalent vaccine. In one description, the polyvalent vaccine comprises one or more components selected from the group consisting of:

a. en levende, svekket, inaktivert eller drept bakterie, a. a live, weakened, inactivated or killed bacterium,

c. en sopp, c. a mushroom,

d. en parasitt og d. a parasite and

I forbindelse med denne fremgangsmåten gjelder samme preferanser i forhold til doseringsvolum og antigeninnhold som beskrevet i forbindelse med sammensetningen. In connection with this method, the same preferences apply in relation to dosage volume and antigen content as described in connection with the composition.

Et eksempel på en slik polyvalent vaksine som fordelaktig kunne forbedres ved å inkludere et antigenpreparat av salmonid alfavirus, er AJ 6-2 allerede markedsført av den nåværende søkeren. An example of such a polyvalent vaccine that could be advantageously improved by including an antigenic preparation of salmonid alphavirus is AJ 6-2 already marketed by the present applicant.

Det bør bemerkes at utførelsesformer og trekk beskrevet i sammenheng med ett av aspektene av foreliggende oppfinnelse også gjelder for de andre aspektene av oppfinnelsen. It should be noted that embodiments and features described in connection with one of the aspects of the present invention also apply to the other aspects of the invention.

Alle patent- og ikke-patentreferanser sitert i foreliggende søknad innlemmes herved ved referanse i sin helhet. All patent and non-patent references cited in the present application are hereby incorporated by reference in their entirety.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i ytterligere detaljer i de følgende ikkebegrensende eksemplene.ju The invention will now be described in further detail in the following non-limiting examples.ju

Eksempler Examples

Eksempel 1: Isolasjon av PD-virus fra fisk med klinisk PD-infeksjon (ALV-405, ALV 406 og ALV-407) Example 1: Isolation of PD virus from fish with clinical PD infection (ALV-405, ALV 406 and ALV-407)

Materialer Materials

Organmateriale Organ material

Hjerter ble tatt fra fisk med kliniske symptomer på pankreassykdom i kommersielle fiskeoppdrettsanlegg. Hjertene ble holdt kalde ved 4 <º>C. Hearts were taken from fish with clinical symptoms of pancreatic disease in commercial fish farms. The hearts were kept cold at 4<º>C.

Cellekulturer Cell cultures

● CHH-1, 145. passasje ● CHH-1, 145th passage

● CHSE-214, 36. passasje ● CHSE-214, 36th passage

● GF-1, 4. passasje ● GF-1, 4th passage

Celler ble sådd to – tre dager før bruk. Cells were seeded two to three days before use.

Vekstmedia Growth media

● CHH-1-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). ● CHH-1 growth medium: EMEM (Sigma M7278), 10% FBS (Sigma F-3885), 1% L-glutamine (Sigma G-7513), 1% NEAA (Sigma M-7145), 0.1% gentamicin (Sigma G1397).

● CHSE-214-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). ● GF-1 vekstmedium: L-15 (Sigma L-5520 lot), 10 % FBS (Sigma F-3885), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). ● CHSE-214 growth medium: EMEM (Sigma M7278), 10% FBS (Sigma F-3885), 1% L-glutamine (Sigma G-7513), 0.1% gentamicin (Sigma G1397). ● GF-1 growth medium: L-15 (Sigma L-5520 lot), 10% FBS (Sigma F-3885), 1% L-glutamine (Sigma G-7513), 0.1% gentamicin (Sigma G1397).

Filter: Filter:

Minisart plus (Sartorius #17829) Minisart plus (Sartorius #17829)

Anti-IPNV-antistoffer: Kanin-anti-IPNV-antiserum (CP54/1996) Anti-IPNV antibodies: Rabbit anti-IPNV antiserum (CP54/1996)

Hjerter fra atlantisk laks ble homogenisert ved bruk av en porselensmorter og kvartssand med noe tilsatt medium (ca 8-20 ml). Homogenatet ble sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 <o>C før filtrering gjennom et sprøytefilter på 0,45 μm. Homogenatene ble fordelt i kryoflasker og frosset ved –80 <o>C. Hearts from Atlantic salmon were homogenized using a porcelain mortar and quartz sand with some added medium (about 8-20 ml). The homogenate was centrifuged at 2000 x g for 10 min at 4<o>C before filtering through a 0.45 μm syringe filter. The homogenates were distributed in cryobottles and frozen at –80 <o>C.

Prøver av noen av organhomogenatene ble blandet 1:100 med anti-IPNV-antiserum og inkubert i to timer ved 15 °C. Deretter ble 50-200 μl homogenat med eller uten tilsatt anti-IPNV-antiserum inokulert i de forskjellige cellekulturene (50-90 % konfluent) i 75/175 cm<2 >Nunc-celleflasker med 15/50 ml av passende medium i henhold til tabell 1. Samples of some of the organ homogenates were mixed 1:100 with anti-IPNV antiserum and incubated for two hours at 15°C. Then 50-200 μl homogenate with or without added anti-IPNV antiserum was inoculated into the different cell cultures (50-90% confluent) in 75/175 cm<2 >Nunc cell flasks with 15/50 ml of appropriate medium according to table 1.

Ved passering av viruset i nye cellekulturer ble 1 ml supernatant overført til nye cellekulturflasker. When passing the virus in new cell cultures, 1 ml of supernatant was transferred to new cell culture bottles.

Tabell 1 Table 1

,++,+++ betegner gradene av cytopatogen effekt observert i cellene ,++,+++ denote the degrees of cytopathogenic effect observed in the cells

X X dpi; x x dager etter infisering når cytopatogen effekt ble observert i cellene X : X x 10 <x >TCID50 Titreringsresultat av supernatant fra den spesifikke flasken. X X dpi; x x days after infection when cytopathogenic effect was observed in the cells X : X x 10 <x >TCID50 Titration result of supernatant from the specific bottle.

Konklusjoner Conclusions

● SAV3 ble isolert fra hjerter samlet fra atlantisk laks med pankreassykdom ● Cytopatogen effekt var synlig i cellekulturene fra passasje 1 ● SAV3 was isolated from hearts collected from Atlantic salmon with pancreatic disease ● Cytopathogenic effect was visible in the cell cultures from passage 1

● Passasje 1-SAV3-isolatene hadde en titer på opptil 1,3 x 10<8 >TCID50 ● SAV3 kan isoleres i passasje 1 på flere forskjellige cellelinjer ● The passage 1 SAV3 isolates had a titer of up to 1.3 x 10<8 >TCID50 ● SAV3 can be isolated in passage 1 on several different cell lines

Eksempel 2: Identitetstest for SAV3, og test for fravær av IPNV i SAV3-isolater Example 2: Identity test for SAV3, and test for the absence of IPNV in SAV3 isolates

For å bekrefte identiteten til forskjellige isolater av SAV3 og for å teste dem for fravær av infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), ble en revers transkripsjonkvantitativ PCR (RTQPCR)-prosedyre som bruker primere spesifikke for SAV og IPNV anvendt. To confirm the identity of different isolates of SAV3 and to test them for the absence of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), a reverse transcription quantitative PCR (RTQPCR) procedure using primers specific for SAV and IPNV was applied.

Materialer Materials

Virusisolater: ALV-405 p5 og p6, ALV 407 p1, ALV 408 p1, ALV 4091pA og 1pB (to separate isolasjoner). Positiv kontroll: IPNV ALV 103. Virus isolates: ALV-405 p5 and p6, ALV 407 p1, ALV 408 p1, ALV 4091pA and 1pB (two separate isolates). Positive control: IPNV ALV 103.

RNA-isolasjon: QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol RNA Isolation: QIAamp Viral RNA Mini Spin Protocol

Revers transkripsjon og QPCR: Brilliant® II QPCR og QRT-PCR-reagenser fra Stratagene. Reverse transcription and QPCR: Brilliant® II QPCR and QRT-PCR reagents from Stratagene.

Tabell 2: Primere Table 2: Primers

RT-PCR-betingelser: RT-PCR conditions:

IPNV-test: 50 <o>C, 30 min – 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek - 72 <o>C, 30 sek)*40 IPNV test: 50 <o>C, 30 min – 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sec - 57 <o>C, 60 sec - 72 <o>C, 30 sec) *40

SAV3-test: 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40 SAV3 test: 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sec - 57 <o>C, 60 sec -72 <o>C, 30 sec) *40

Resultater: Alle SAV3-isolater var positive i SAV RT-QPCR og negative i IPNV RT-QPCR. Disse testene viser at alle SAV3-isolatene virkelig er SAV og ikke kontaminert med IPNV. Results: All SAV3 isolates were positive in SAV RT-QPCR and negative in IPNV RT-QPCR. These tests show that all the SAV3 isolates are indeed SAV and not contaminated with IPNV.

Eksempel 3: Titrering av salmon pancreas disease virus ved bruk av ulike cellelinjer. Example 3: Titration of salmon pancreas disease virus using different cell lines.

SAV3 ble titrert på to ulike cellelinjer; CHH og CHSE som beskrevet i henholdsvis eksempel 4 og 5. TCID50-verdiene oppnådd med de to cellelinjene vises i tabell 3. CHH-cellelinjen er ca. dobbelt så sensitiv for viruset som CHSE-cellelinjen. SAV3 was titrated on two different cell lines; CHH and CHSE as described in Examples 4 and 5 respectively. The TCID50 values obtained with the two cell lines are shown in Table 3. The CHH cell line is approx. twice as sensitive to the virus as the CHSE cell line.

Tabell 3: Table 3:

Eksempel 4: Dyrking av SAV3 i CHH-1-cellekulturflasker med høy celletetthet. Example 4: Cultivation of SAV3 in CHH-1 cell culture flasks at high cell density.

Intensjon Intention

Hensikten var å evaluere potensielle PD-utbytter for forskjellige virusisolater i CHH-1-cellekulturflasker med høy celletetthet. The aim was to evaluate potential PD yields for different virus isolates in CHH-1 cell culture flasks at high cell density.

Materialer og fremgangsmåter Materials and methods

Cellekulturer og vekstmedier Cell cultures and growth media

3 x 175 cm<2 >flasker, CHH-1, 160. passasje med 100 x 10<6 >celler pr. flaske (5,7 x 10<5 >C/cm<2>) 3 x 175 cm<2 >flasks, CHH-1, 160th passage with 100 x 10<6 >cells per bottle (5.7 x 10<5 >C/cm<2>)

CHH-1-vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 1 % NEAA (Sigma M-7145), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). CHH-1 growth medium: EMEM (Sigma M7278), 10% FBS (Invitrogen), 1% L-glutamine (Sigma G-7513), 1% NEAA (Sigma M-7145), 0.1% gentamicin (Sigma G1397) .

Virus/infeksjonsmateriale Virus/infectious material

ALV-405, p6, titer: 5,01 x 10<8 >TCID50/ml ALV-405, p6, titer: 5.01 x 10<8 >TCID50/ml

ALV-407, p1, titer: 3,41 x 10<7 >TCID50/ml ALV-407, p1, titer: 3.41 x 10<7 >TCID50/ml

ALV-407, p4, titer: 4,14 x 10<7 >TCID50/ml ALV-407, p4, titer: 4.14 x 10<7 >TCID50/ml

Tabell 4. Cellekulturer og eksperimentelle data. Table 4. Cell cultures and experimental data.

Rett før infisering ble vekstmediet i flaskene erstattet med 50 ml friskt vekstmedium, og deretter ble de respektive infeksjonsmaterialene tilsatt (tabell 1). Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker. Just before infection, the growth medium in the bottles was replaced with 50 ml of fresh growth medium, and then the respective infection materials were added (Table 1). All bottles were incubated at 15 °C with tightly closed caps.

Prøvetaking, titrering og mikroskopiske observasjoner Sampling, titration and microscopic observations

Mikroskopiske observasjoner og titrering av prøver ble utført 7, 10, 13 og Microscopic observations and titration of samples were carried out on 7, 10, 13 and

18 dager pi på CHH-1. 18 days pi on CHH-1.

Resultater/diskusjon Results/discussion

Mikroskopiske observasjoner Microscopic observations

Løsning og avrunding av celler viste seg ca. en uke pi i alle flasker. Ved slutten av observasjonsperioden (18 dager pi) hadde flaske 2 mest fremtredende CPE med 80 % av cellene løsnet mens flaske 1 og 3 hadde henholdsvis 20 % og 40 % løsnede celler. Loosening and rounding of cells appeared approx. a week pi in all bottles. At the end of the observation period (18 days pi), flask 2 had the most prominent CPE with 80% of cells detached while flasks 1 and 3 had 20% and 40% detached cells, respectively.

Titreringsresultater Titration results

De tre isolatene/passasjene hadde alle titre på 10<9 >TCID50/ml eller høyere. The three isolates/passages all had titres of 10<9 >TCID50/ml or higher.

Overraskende var utbyttene høyest i flasken infisert med den 1. passasjen av ALV-407 (figur 1, ALV-407 p2), men denne flasken hadde også den mest fremtredende CPE. Resultatene bekrefter at CHH-1-celler frembringer høye SAV3-utbytter også fra virusstammer med få passasjer. Resultater er vist i figur 1. Surprisingly, yields were highest in the bottle infected with the 1st passage of ALV-407 (Figure 1, ALV-407 p2), but this bottle also had the most prominent CPE. The results confirm that CHH-1 cells produce high SAV3 yields also from virus strains with few passages. Results are shown in Figure 1.

Konklusjoner Conclusions

● De høyeste utbyttene var 1,78 x 10<9 >TCID50/ml i en prøve oppnådd 13 dager etter inokulasjon med ALV-407 p1 ved MOI 0,2. ● The highest yields were 1.78 x 10<9 >TCID50/ml in a sample obtained 13 days after inoculation with ALV-407 p1 at MOI 0.2.

● Fremstilling av SAV3 med få passasjer i CHH-1-celler gir et godt utbytte av SAV3. ● Production of SAV3 with few passages in CHH-1 cells gives a good yield of SAV3.

Eksempel 5: Dyrking av SAV3 i CHSE-celler. Example 5: Cultivation of SAV3 in CHSE cells.

Intensjon Intention

Hensikten var å evaluere de potensielle SAV3-utbyttene for forskjellige virusstammer i CHSE-214-cellekulturer. The aim was to evaluate the potential SAV3 yields of different virus strains in CHSE-214 cell cultures.

Materialer og fremgangsmåter Materials and methods

Cellekultur og vekstmedium Cell culture and growth medium

● CHSE-214: 19. passasje med ca. 80 % konfluens. ● CHSE-214: 19th passage with approx. 80% confluence.

● CHSE-214 vekstmedium: EMEM (Sigma M7278), 10 % FBS (Invitrogen), 1 % L-glutamin (Sigma G-7513), 0,1 % gentamicin (Sigma G1397). ● CHSE-214 growth medium: EMEM (Sigma M7278), 10% FBS (Invitrogen), 1% L-glutamine (Sigma G-7513), 0.1% gentamicin (Sigma G1397).

Virusstamme Virus strain

● ALV-404, 8p. ● ALV-404, 8p.

Tabell 5. Cellekulturer og eksperimentelle data. Alle flasker var 75 cm<2>, hadde 20 ml vekstmedium og var inokulert med 100 µl av virusstammen. Table 5. Cell cultures and experimental data. All bottles were 75 cm<2>, had 20 ml of growth medium and were inoculated with 100 µl of the virus strain.

Flaskene ble avkjølt til 15 °C før de ble infisert uten endring av medium. Alle flasker ble inkubert ved 15 °C med tett lukkede korker. The bottles were cooled to 15 °C before being infected without changing the medium. All bottles were incubated at 15 °C with tightly closed caps.

Prøver av virussåmaterialene ble titrert på 96-brønns plater. Samples of the virus inoculums were titrated in 96-well plates.

Mikroskopisk observasjon og titrering av prøver fra alle flasker ble utført 6, 12, 15, 20 og 27 dager pi. Microscopic observation and titration of samples from all bottles were performed 6, 12, 15, 20 and 27 days pi.

Resultater/diskusjon Results/discussion

Mikroskopiske observasjoner Microscopic observations

Infeksjonen (lysering og løsning av celler) utviklet seg raskt i CHSE-kulturene, med mer enn 90 % lysering 12 dager pi. Prøver fra de to flaskene ble samlet og titrert på 96-brønns plater på dag 6, 12, 15, 20 og 27 dager etter infisering. The infection (lysis and detachment of cells) progressed rapidly in the CHSE cultures, with more than 90% lysis at 12 days pi. Samples from the two bottles were pooled and titrated in 96-well plates on days 6, 12, 15, 20 and 27 days post-infection.

Gjennomsnittsverdiene fra de to parallelle flaskene er vist i figur 2. The average values from the two parallel bottles are shown in Figure 2.

Dette eksperimentet viser at CHSE-214 er en passende cellelinje for produksjon av SAV3 siden høye virustitre produseres fra stammer av SAV3 med få passasjer. This experiment shows that CHSE-214 is a suitable cell line for the production of SAV3 since high virus titers are produced from low-passage strains of SAV3.

Eksempel 6: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3 Example 6: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine including SAV3

Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom basert på salmonid alfavirus undertype 3-antigent materiale og viser utmerket beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen. The present example presents a multivalent vaccine against pancreatic disease based on salmonid alphavirus subtype 3 antigenic material and shows excellent protection in an experimental challenge model with high mortality in the unvaccinated control group.

Tabell 6: Hovedtrekk ved eksperimentet Table 6: Main features of the experiment

Atlantisk unglaks (parr) med en gjennomsnittsvekt på 25,7 gram ble vaksinert med 0,1 ml av en polyvalent vann-i-olje vaksine. Vaksinen inneholdt inaktivert antigen fra følgende patogener: Atlantic juvenile salmon (parr) with an average weight of 25.7 grams were vaccinated with 0.1 ml of a polyvalent water-in-oil vaccine. The vaccine contained inactivated antigen from the following pathogens:

Tabell 7: Vaksinekomponenter Table 7: Vaccine components

Alle komponentene ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. All components were inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15 <º>C.

Tabell 8: Merking og vaksinasjon Table 8: Labeling and vaccination

Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Utfordringsdosen var 5,36 x 10<8 >TCID50 pr fisk. I utfordringstankene nådde dødeligheten 86 % i kontrollgruppen i tank 1 og 66 % i tank 2, mens ingen dødelighet ble registrert i gruppene vaksinert med den polyvalente vaksinen som beskytter mot salmonid pankreassykdom. Resultater vises i figur 3. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. After smoltification, the fish were divided into two tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of 2nd passage, recently produced ALV-407. The challenge dose was 5.36 x 10<8 >TCID50 per fish. In the challenge tanks, mortality reached 86% in the control group in tank 1 and 66% in tank 2, while no mortality was recorded in the groups vaccinated with the polyvalent vaccine that protects against salmonid pancreatic disease. Results are shown in Figure 3. This experiment shows that a polyvalent vaccine can indeed protect against salmonid pancreatic disease.

Eksempel 7: Dose/respons – vaksinasjon med monovalent og polyvalent SAV3-vaksine. Example 7: Dose/response – vaccination with monovalent and polyvalent SAV3 vaccine.

Foreliggende eksempel presenterer et dose–responseksperiment med monovalent og multivalent vaksine mot pankreassykdom. The present example presents a dose-response experiment with monovalent and multivalent vaccine against pancreatic disease.

Tabell 9: Hovedtrekk ved eksperimentet Table 9: Main features of the experiment

Tabell 10: Vaksinekomponenter, multivalente vaksiner. Table 10: Vaccine components, multivalent vaccines.

Tabell 11: Vaksinekomponenter, monovalente vaksiner. Table 11: Vaccine components, monovalent vaccines.

Merking og vaksinasjon Labeling and vaccination

For hver gruppe ble 40 fisk merket ved klipping av finnen og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering. Etter smoltifisering ble fisken fordelt i to tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt ALV-407. Utfordringsdosen var 6,5 x 10<8 >TCID50 pr fisk. For each group, 40 fish were tagged by clipping the fin and vaccinated with 0.05 ml vaccine or 0.05 ml PBS and left for immunization and smoltification. After smoltification, the fish were divided into two tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of 2nd passage, recently produced ALV-407. The challenge dose was 6.5 x 10<8 >TCID50 per fish.

Resultater: Results:

Tabell 12: Table 12:

I utfordringen ga den polyvalente vaksinen bedre beskyttelse enn den monovalente vaksinen ved de laveste antigendosene. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine med et PD-antigeninnhold på 1 x 10<9 >TCID50 /ml effektivt kan beskytte mot salmonid pankreassykdom når den gis i doser på 0,5 x 10<8 >TCID50 /dose. Ettersom vaksinen gir noe beskyttelse mot senere infeksjon, selv når den gis i doser på 10<6 >TCID50, er det rimelig å konkludere med at en tilfredsstillende grad av beskyttelse også kan oppnås når vaksinen administreres i doser som inneholder noe mindre enn 0,5 x 10<8 >TCID50 /dose. In the challenge, the polyvalent vaccine provided better protection than the monovalent vaccine at the lowest antigen doses. This experiment shows that a polyvalent vaccine with a PD antigen content of 1 x 10<9 >TCID50 /ml can effectively protect against salmonid pancreatic disease when given at doses of 0.5 x 10<8 >TCID50 /dose. Since the vaccine provides some protection against subsequent infection, even when given at doses of 10<6 >TCID50, it is reasonable to conclude that a satisfactory degree of protection can also be obtained when the vaccine is administered at doses containing somewhat less than 0.5 x 10<8 >TCID50 /dose.

Eksempel 8: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV1 Example 8: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine comprising SAV1

Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV1-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen. The present example presents a multivalent vaccine against pancreatic disease containing SAV1 antigenic material. The vaccine shows good protection in an experimental challenge model with high mortality in the unvaccinated control group.

Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV1-antigent materiale fremstilles fra en kultur med dette viruset, dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler. An isolate of salmonid alphavirus subtype 1 is isolated from an outbreak of pancreatic disease in Atlantic salmon in Scotland. SAV1 antigenic material is prepared from a culture of this virus grown on CHSE cells according to a similar procedure as described in previous examples.

En vaksine inneholdende de følgende komponentene fremstilles: A vaccine containing the following components is prepared:

Tabell 13: Vaksinekomponenter Table 13: Vaccine components

SAV1-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. The SAV1 virus was inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15<º>C.

Vaksinen administreres til atlantisk unglaks (parr). Fisken vaksineres og merkes, og vaksinert fisk og kontrollfisk smoltifiseres deretter som beskrevet i foregående eksempel. The vaccine is administered to juvenile Atlantic salmon (parr). The fish are vaccinated and marked, and vaccinated fish and control fish are then smoltified as described in the previous example.

Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom SAV3. After smoltification, the fish are distributed in tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of the 2nd passage, recently produced SAV3. The challenge dose is 3-6 x 10<8 >TCID50 per fish. This experiment shows that polyvalent vaccine comprising salmonid alphavirus type 1 antigenic material can indeed protect against salmonid pancreatic disease SAV3.

Eksempel 9: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved anvendelse av en vaksine omfattende SAV1 Example 9: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a vaccine comprising SAV1

Et isolat av salmonid alfavirus undertype 1 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV1-antigent materiale ble fremstilt fra en kultur av dette viruset i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler. An isolate of salmonid alphavirus subtype 1 is isolated from an outbreak of pancreatic disease in Atlantic salmon in Scotland. SAV1 antigenic material was prepared from a culture of this virus according to a similar procedure as described in the previous examples.

En vaksine inneholdende de følgende komponentene ble fremstilt: A vaccine containing the following components was prepared:

Tabell 14: Vaksinekomponenter Table 14: Vaccine components

Vaksine A: Vaccine A:

Vaksine B og C: Vaccine B and C:

SAV1-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Vaksinene ble formulert som vann-i-olje-emulsjoner ved å anvende standardmetoder. The SAV1 virus was inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15<º>C. The vaccines were formulated as water-in-oil emulsions using standard methods.

60 fisk ble merket ved finneklipping og vaksinert med 0,05 ml vaksine eller 0,05 ml PBS og etterlatt for immunisering og smoltifisering som beskrevet i foregående eksempel. 60 fish were marked by fin clipping and vaccinated with 0.05 ml vaccine or 0.05 ml PBS and left for immunization and smoltification as described in the previous example.

Etter smoltifisering ble fisken fordelt i en tank inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordret ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen var 3,01 x 10<8 >TCID50 pr fisk. After smoltification, the fish were distributed in a tank containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of the 2nd passage, recently produced SAV3. The challenge dose was 3.01 x 10<8 >TCID50 per fish.

Tabell 15: Resultater. Table 15: Results.

Dødeligheten i kontrollgruppen nådde 70 %, mens dødeligheten i gruppen vaksinert med en polyvalent vaksine omfattende 2 x 10<9 >TCID50 /ml inaktivert SAV1, nådde 3,3 %, noe som gir en relativ overlevelsesprosent på 95,2. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 1-antigent materiale virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. I dette eksperimentet er SAV1-antigendosen doblet sammenlignet med den monovalente SAV1 vaksine C, og det er en økning i observert RPS. Dette antyder at den samme antigendosen kan anvendes i polyvalente PD-vaksiner som fremkaller den samme beskyttelsen som monovalente PD-vaksiner. Dette er i motsetning til konvensjonell kunnskap på området for fiskevaksinologi. Mortality in the control group reached 70%, while mortality in the group vaccinated with a polyvalent vaccine comprising 2 x 10<9 >TCID50 /ml inactivated SAV1 reached 3.3%, giving a relative survival rate of 95.2. This experiment shows that a polyvalent vaccine comprising salmonid alphavirus type 1 antigenic material can indeed protect against salmonid pancreatic disease. In this experiment, the SAV1 antigen dose is doubled compared to the monovalent SAV1 vaccine C, and there is an increase in observed RPS. This suggests that the same antigen dose can be used in polyvalent PD vaccines that elicit the same protection as monovalent PD vaccines. This is in contrast to conventional knowledge in the field of fish vaccinology.

Eksempel 10: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV2 Example 10: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine including SAV2

Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV2-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen. The present example presents a multivalent vaccine against pancreatic disease containing SAV2 antigenic material. The vaccine shows good protection in an experimental challenge model with high mortality in the unvaccinated control group.

Et isolat av salmonid alfavirus undertype 2 isoleres fra utbrudd av sovesyke hos regnbueørret oppdrettet i ferskvann i Frankrike. SAV2-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler. An isolate of salmonid alphavirus subtype 2 is isolated from an outbreak of sleeping sickness in rainbow trout reared in freshwater in France. SAV2 antigenic material is prepared from a culture of this virus grown on CHSE cells according to a similar procedure as described in previous examples.

Tabell 16: Vaksinekomponenter Table 16: Vaccine components

SAV2-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. The SAV2 virus is inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15 <º>C.

Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus type 2-antigent materiale virkelig kan beskytte mot etterfølgende infeksjon med salmonid alfavirus SAV3. After smoltification, the fish are distributed in tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of the 2nd passage, recently produced SAV3. The challenge dose is 3-6 x 10<8 >TCID50 per fish. This experiment shows that a polyvalent vaccine comprising salmonid alphavirus type 2 antigenic material can indeed protect against subsequent infection with salmonid alphavirus SAV3.

Eksempel 11: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3 Example 11: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine including SAV3

Foreliggende eksempel presenterer en multivalent vaksine mot pankreassykdom inneholdende SAV3-antigent materiale. Vaksinen viser god beskyttelse i en eksperimentell utfordringsmodell med høy dødelighet i den uvaksinerte kontrollgruppen. The present example presents a multivalent vaccine against pancreatic disease containing SAV3 antigenic material. The vaccine shows good protection in an experimental challenge model with high mortality in the unvaccinated control group.

Et isolat av salmonid alfavirus undertype 3 isoleres fra utbrudd av pankreatisk sykdom i atlantisk laks i Skottland. SAV3-antigent materiale fremstilles fra en kultur av dette viruset dyrket på CHSE-celler i henhold til en lignende prosedyre som beskrevet i foregående eksempler. An isolate of salmonid alphavirus subtype 3 is isolated from an outbreak of pancreatic disease in Atlantic salmon in Scotland. SAV3 antigenic material is prepared from a culture of this virus grown on CHSE cells according to a similar procedure as described in previous examples.

Tabell 17: Vaksinekomponenter Table 17: Vaccine components

SAV3-viruset ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C. The SAV3 virus was inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15<º>C. Bacterial antigens were inactivated by the addition of 4 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 1.5 hours at a temperature of 20 <º>C.

En vann-i-olje-emulsjon lages i henhold til standardmetoder. A water-in-oil emulsion is made according to standard methods.

Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og flere bakterielle antigener virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. After smoltification, the fish are distributed in tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of the 2nd passage, recently produced SAV3. The challenge dose is 3-6 x 10<8 >TCID50 per fish. This experiment shows that a polyvalent vaccine comprising salmonid alphavirus antigenic material and several bacterial antigens can indeed protect against salmonid pancreatic disease.

Eksempel 12: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3 Example 12: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine including SAV3

En vaksine inneholdende de følgende komponenter fremstilles: A vaccine containing the following components is produced:

Tabell 18: Vaksinekomponenter Table 18: Vaccine components

SAV3-virus ble inaktivert ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C. SAV3 virus was inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15<º>C. Bacterial antigens were inactivated by the addition of 4 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 1.5 hours at a temperature of 20 <º>C.

En vann i oljeemulsjon lages i henhold til standardmetoder. A water in oil emulsion is prepared according to standard methods.

Eksempel 13: Vaksinasjon av unglaks (parr) ved bruk av en polyvalent vaksine omfattende SAV3 Example 13: Vaccination of juvenile salmon (parr) using a polyvalent vaccine including SAV3

Tabell 19: Vaksinekomponenter Table 19: Vaccine components

SAV3-viruset inaktiveres ved tilsetting av 2,0 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 72 timer ved en temperatur på 15 <º>C. Bakterielle antigener ble inaktivert ved tilsetting av 4 g/kg formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 1,5 timer ved en temperatur på 20 <º>C. The SAV3 virus is inactivated by the addition of 2.0 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 72 hours at a temperature of 15 <º>C. Bacterial antigens were inactivated by the addition of 4 g/kg formaldehyde and subsequent incubation for 1.5 hours at a temperature of 20 <º>C.

Etter smoltifisering fordeles fisken i tanker inneholdende sjøvann (25 ‰) og utfordres ved injeksjon av 2. passasje, nylig fremstilt SAV3. Utfordringsdosen er 3-6 x 10<8 >TCID50 pr fisk. Dette eksperimentet viser at en polyvalent vaksine omfattende salmonid alfavirus antigent materiale og Montanid ISA 736 B virkelig kan beskytte mot salmonid pankreassykdom. After smoltification, the fish are distributed in tanks containing seawater (25 ‰) and challenged by injection of the 2nd passage, recently produced SAV3. The challenge dose is 3-6 x 10<8 >TCID50 per fish. This experiment shows that a polyvalent vaccine comprising salmonid alphavirus antigenic material and Montanid ISA 736 B can indeed protect against salmonid pancreatic disease.

Kvitteringer for deponeringer av mikroorganismer: Receipts for deposits of microorganisms:

Health Protection Agency, Porton Down and Health Protection Agency, Porton Down and

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Virus Salmon Alphavirus 3 ALV-407 Deposit Reference 07121202 Virus Salmon Alphavirus 3 ALV-407 Deposit Reference 07121202

has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977, has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977,

with the European Collection of Cell Cultures on with the European Collection of Cell Cultures on

12 December 2007 12 December 2007

European Collection of Ceil Cultures European Collection of Ceil Cultures

This document certifies that This document certifies that

Virus Salmon alphavirus 3 ALV-409 Deposit Reference 07121203 Virus Salmon alphavirus 3 ALV-409 Deposit Reference 07121203

12 December 2007 12 December 2007

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Virus HEART & SKELETAL MUSCLE INFLAMMATION VIRUS (HSMI) Deposit Reference 04050401 has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977, with the European Collection of Cell Cultures on Virus HEART & SKELETAL MUSCLE INFLAMMATION VIRUS (HSMI) Deposit Reference 04050401 has been accepted as a patent deposit, in accordance with The Budapest Treaty of 1977, with the European Collection of Cell Cultures on

04 May 2004 04 May 2004

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Virus Cardiomyopathy syndrome virus (CMS) Deposit Reference 07032902 Virus Cardiomyopathy syndrome virus (CMS) Deposit Reference 07032902

has been accepted as a patent deposit, in accordance with has been accepted as a patent deposit, in accordance with

The Budapest Treaty of 1977, The Budapest Treaty of 1977,

29 March 2007 29 March 2007

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Bacteria AL10005 Bacteria AL10005

Deposit Reference 06050901 Deposit Reference 06050901

with the European Collection of Cell Cultures on 09 May 2006 with the European Collection of Cell Cultures on 09 May 2006

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Bacteria AL10007 Bacteria AL10007

Deposit Reference 06050902 Deposit Reference 06050902

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Bacteria AL 10008 Bacteria AL 10008

Deposit Reference 06050903 Deposit Reference 06050903

European Collection of Cell Cultures European Collection of Cell Cultures

This document certifies that This document certifies that

Bacteria Piscirickettsia salmonis Deposit Reference 07032110 Bacteria Piscirickettsia salmonis Deposit Reference 07032110

with the European Collection of Cell Cultures on 21 March 2007 with the European Collection of Cell Cultures on 21 March 2007

Referanser References

Aguilar JC og Rodriguez EG (2007), Vaccine adjuvants revisited, Vaccine 2007, 25, 3752 - 3762, 2007. Aguilar JC and Rodriguez EG (2007), Vaccine adjuvants revisited, Vaccine 2007, 25, 3752 - 3762, 2007.

Alderborn G og Aulton M (2002) Pharmaceutics; The Science of Dosage Form Design, 2002, Elsevier Science Alderborn G and Aulton M (2002) Pharmaceutics; The Science of Dosage Form Design, 2002, Elsevier Science

Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, jeffroy J, Le Ven A og Bearzotti M (1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997. Castric J, baudin Laurencin F, Bremont M, Jeffroy J, Le Ven A and Bearzotti M (1997) Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 17, 27-30, 1997.

Boucher P og Baudin Laurencin F (1994) Sleeping disease (SD) of salmonids, Bull of the European Association of Fish Pathologists, 14, 179-180 Boucher P and Baudin Laurencin F (1994) Sleeping disease (SD) of salmonids, Bull of the European Association of Fish Pathologists, 14, 179-180

Christie KE, Koumans JTM, Fyrand K, Goovaerts D og Rødseth OM (1999A) Vaccination against pancreas disease in Atlantic salmon (Salmo salar L). IXth International Conference of the European Association of Fish Pathologists, Rohdes, September 1999, muntlig presentasjon med sammendrag Christie KE, Koumans JTM, Fyrand K, Goovaerts D and Rødseth OM (1999A) Vaccination against pancreas disease in Atlantic salmon (Salmo salar L). IXth International Conference of the European Association of Fish Pathologists, Rohdes, September 1999, oral presentation with abstract

Christie KE, Fyrand K og Rødseth OM (1999B) Vaksine mot pancreas disease hos laks og ørret, møte Frisk Fisk, Tromsø januar 1999, muntlig presentasjon med sammendrag. Christie KE, Fyrand K and Rødseth OM (1999B) Vaccine against pancreas disease in salmon and trout, meeting Frisk Fisk, Tromsø January 1999, oral presentation with summary.

Hodneland K, Bratland A, Christie KE, Endresen C, Nylund A. (2005), New subtype of salmonid alphavirus (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway, Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5;66(2):113-20 (Rettelser i: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181). Hodneland K, Bratland A, Christie KE, Endresen C, Nylund A. (2005), New subtype of salmonid alphavirus (SAV), Togaviridae, from Atlantic salmon Salmo salar and rainbow trout Oncorhynchus mykiss in Norway, Dis Aquat Organ. 2005 Sep 5;66(2):113-20 (Corrections in: Dis Aquat Organ. 2005 Nov 9; 67(1-2):181).

Intervet Newsletter, March 2002. Interview Newsletter, March 2002.

López-Dóriga MV, Smail DA, Smith RJ, Doménech A, Castric J, Smith PD, Ellis AE. Isolation of salmon pancreas disease virus (SPDV) in cell culture and its ability to protect against infection by the 'wild-type' agent. Fish Shellfish Immunol. 2001 Aug;11(6):505-22. López-Dóriga MV, Smail DA, Smith RJ, Doménech A, Castric J, Smith PD, Ellis AE. Isolation of salmon pancreas disease virus (SPDV) in cell culture and its ability to protect against infection by the 'wild-type' agent. Fish Shellfish Immunol. 2001 Aug;11(6):505-22.

McLoughlin MF og Graham DA (2007), Alphavirus infections in salmonids – a review, Journal of Fish Diseases 2007, 30, 511-531. McLoughlin MF and Graham DA (2007), Alphavirus infections in salmonids – a review, Journal of Fish Diseases 2007, 30, 511-531.

Nelson RT, McLoughlin MF, Rowley HM, Platten MA og McCormick JI (1995) Isolation of a toga-like virus from Atlantic salmon Salmo salar with pancreas disease (1995) Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995. Nelson RT, McLoughlin MF, Rowley HM, Platten MA and McCormick JI (1995) Isolation of a toga-like virus from Atlantic salmon Salmo salar with pancreas disease (1995) Diseases of Aquatic Organisms, 22, 25-32, 1995.

Powers AM, Brault AC, Shirako Y, Strauss EG, kang W, Strauss JH og Weaver SC (2001) Evolutionary relationships and systematics of the alphaviruses, Virology 75, 10118-10131 2001. Powers AM, Brault AC, Shirako Y, Strauss EG, kang W, Strauss JH and Weaver SC (2001) Evolutionary relationships and systematics of the alphaviruses, Virology 75, 10118-10131 2001.

Raa J (1996), Reviews in Fisheries Science 4(3):229-228 1996. Raa J (1996), Reviews in Fisheries Science 4(3):229-228 1996.

Rognes T ( 2001), ParAlign: a parallel sequence alignment algorithm for rapid and sensitive database searches, Nucleic Acids Research, 29, 1647-1652 2001. Rognes T (2001), ParAlign: a parallel sequence alignment algorithm for rapid and sensitive database searches, Nucleic Acids Research, 29, 1647-1652 2001.

Smith TF og Waterman MS (1981) Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology, 147, 195-197. Smith TF and Waterman MS (1981) Identification of common molecular subsequences. Journal of Molecular Biology, 147, 195-197.

Taksdal T, Olsen, A B, Bjerkås I, Hjortaas M J, Dannevig B H, Graham D A, McLoughlin M F (2007), Pancreas disease in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in Norway, Journal of Fish Disease 2007, 30, 545-558. Taksdal T, Olsen, A B, Bjerkås I, Hjortaas M J, Dannevig B H, Graham D A, McLoughlin M F (2007), Pancreas disease in farmed Atlantic salmon, Salmo salar L., and rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), in Norway, Journal of Fish Disease 2007, 30, 545-558.

Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987) Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987)

Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses (898-961) Molecular biology of the gene, chapter 24 The extraordinary diversity of eukaryotic viruses (898-961)

Rodger, H & Mitchell, S. Pancreas disease in Ireland: Epidemiological survey results for 2003 and 2004 in Ruane N, Rodger H, Graham D, Foyle L, Norris A, Ratcliff J, Murphy K, Mitchell S, Staples C, Jewherst H, Todd D, Geoghegan F og Cinneide MO: Marine Environment and health service No 222005 Research on Pancreas disease in Irish farmed Salmon 2004/2005 – Current and Future in initiatives. 2005. Rodger, H & Mitchell, S. Pancreas disease in Ireland: Epidemiological survey results for 2003 and 2004 in Ruane N, Rodger H, Graham D, Foyle L, Norris A, Ratcliff J, Murphy K, Mitchell S, Staples C, Jewherst H , Todd D, Geoghegan F and Cinneide MO: Marine Environment and health service No 222005 Research on Pancreas disease in Irish farmed Salmon 2004/2005 – Current and Future in initiatives. 2005.

André, E F: Development and clinical application of new polyvalent combined paediatric vaccines, Vaccine 17(1999), 1620-1627 André, E F: Development and clinical application of new polyvalent combined pediatric vaccines, Vaccine 17(1999), 1620-1627

O,Meara m.fl.: Recombinant vaccines against ovine footrot, Immunology and Cell Biology (1993) 71, 473-488. O, Meara et al.: Recombinant vaccines against ovine footrot, Immunology and Cell Biology (1993) 71, 473-488.

Elena, SF og Sanjuán, R m.fl.: Adaptive Value of High Mutation Rates of RNA viruses: Separating Causes from Consequences (2005), Journal of Virology, 79, 11555-11558. Elena, SF and Sanjuán, R et al.: Adaptive Value of High Mutation Rates of RNA viruses: Separating Causes from Consequences (2005), Journal of Virology, 79, 11555-11558.

Domingo, E og Holland, JJ m.fl.: RNA virus mutations and fitness for survival (1997), Annu. Rev. Microbiol., 51, 151-78. Domingo, E and Holland, JJ et al.: RNA virus mutations and fitness for survival (1997), Annu. Fox. Microbiol., 51, 151-78.

Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987), Molecular biology of the gene, kapittel 24 The extraordinary diversity of eucaryotic viruses (898-961) Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM (1987), Molecular biology of the gene, chapter 24 The extraordinary diversity of eukaryotic viruses (898-961)

Karlsen M. et al. Genetic stability within the Norwegian subtype of salmonid alphavirus (family Togaviridae). Arch Virol. 2006, vol. 151, no. 5, side 861-874. Karlsen M. et al. Genetic stability within the Norwegian subtype of salmonid alphavirus (family Togaviridae). Arch Virol. 2006, Vol. 151, no. 5, pages 861-874.

Andersen L. et al. Tissue tropism of salmonid alphaviruses (subtypes SAV1 and SAV3) in experimentally challenged Atlantic salmon (Salmo salar L.). Arch Virol. Andersen L. et al. Tissue tropism of salmonid alphaviruses (subtypes SAV1 and SAV3) in experimentally challenged Atlantic salmon (Salmo salar L.). Arch Virol.

2007, vol. 152, no. 10, side 1871-1883. 2007, Vol. 152, no. 10, page 1871-1883.

WO2007031572 A1 WO2007031572 A1

Claims

Nye patentkravNew patent requirements

1. Et isolert salmonid alfavirus av undertype SAV3 som omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved1. An isolated salmonid alphavirus of subtype SAV3 comprising a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and is further characterized by

a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, oga. a visible cytopathogenic effect during early passage in cell culture, and

b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, ogb. the ability to induce mortality of at least 30% in a laboratory infection model, the model includes smoltification of Atlantic salmon according to standard procedures and post-smolt challenge by intraperitoneal injection with a SAV3 dose of at least 10<8>TCID50 per fish, such as at least 10<9>TCID50, at least 10<10>TCID50 or preferably at least 3.5 x 10<8>TCID50 per fish within one day of transfer to seawater at 12 <o>C, and

c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler.c. the ability to grow in vitro to a titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml in the supernatant/growth medium cultures of CHH-1 cells or CHSE-214 cells.

2. Isolert virus ifølge krav 1, hvor virus har en synlig cytopatogen effekt under den første, andre, tredje eller fjerde passasjen på en kultur med CHSE-celler.2. Isolated virus according to claim 1, wherein the virus has a visible cytopathogenic effect during the first, second, third or fourth passage on a culture of CHSE cells.

3. Isolert virus ifølge krav 1 eller 2, hvor nevnte titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml oppnås når:3. Isolated virus according to claim 1 or 2, where said titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml is achieved when:

i) Celler dyrkes ved bruk av vertsceller som har blitt sådd med en tetthet på 0,1-1x10<5 >celler cm<-2>;i) Cells are cultured using host cells that have been seeded at a density of 0.1-1x10<5 >cells cm<-2>;

ii) Vertscellene dyrkes i 4-6 dager før virusinfeksjon;ii) The host cells are cultured for 4-6 days prior to virus infection;

iii) Vertscellene dyrkes til en tetthet fra 0,1-1,0 x10<6 >celler cm<-2 >på infeksjonstidspunktet med nevnte virusisolat;iii) The host cells are cultured to a density of 0.1-1.0 x10<6 >cells cm<-2 >at the time of infection with said virus isolate;

iv) Vertscellene dyrkes i et vekstmedium som omfatter EMEM (EBSS)+ 10 % føtalt bovint serum (FBS) 2 mM L-glutamin 1 % ikkeessensielle aminosyrer (NEAA) 0,1 % gentamicin ogiv) The host cells are cultured in a growth medium comprising EMEM (EBSS) + 10% fetal bovine serum (FBS) 2 mM L-glutamine 1% non-essential amino acids (NEAA) 0.1% gentamicin and

4. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 80 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 4.4. Isolated virus according to any one of claims 1-3, wherein the virus comprises a nucleic acid sequence which is at least 80% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 4.

5. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvor viruset omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 98 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1.5. Isolated virus according to any one of claims 1-4, wherein the virus comprises a nucleic acid sequence which is at least 98% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 1.

6. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvor virus er positive i en SAV reverse transkriptase kvantitativ PCR-identitetstest ved anvendelse et sett primere slik som primerne angitt i SEQ ID NO: 7 og 8 og betingelsene 50 <o>C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sek - 57 <o>C, 60 sek -72 <o>C,30 sek)*40.6. Isolated virus according to any one of claims 1-5, wherein viruses are positive in a SAV reverse transcriptase quantitative PCR identity test using a set of primers such as the primers set forth in SEQ ID NO: 7 and 8 and the conditions 50 <o >C, 30 min - 95 <o>C, 10 min –(95 <o>C, 30 sec - 57 <o>C, 60 sec -72 <o>C, 30 sec)*40.

7. Isolert virus ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, hvor viruset er en genetisk variant av en enkelt av virusstammene deponert under Budapestkonvensjonen ved European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire (UK), SP4 0JG UK 12. desember 2007 under deponeringsnumre 07121201 og 07121202. 7. Isolated virus according to any one of claims 1-6, wherein the virus is a genetic variant of a single of the virus strains deposited under the Budapest Convention at the European Collection of Cell Culture (ECACC), Health Protection Agency, Porton Down, Salisbury, Wiltshire ( UK), SP4 0JG UK 12 December 2007 under deposit numbers 07121201 and 07121202.

8. Anvendelse av et inaktivert salmonid alfavirus av undertype SAV3, hvor virus omfatter en nukleinsyresekvens som er minst 90 % identisk med sekvensen angitt i SEQ ID NO: 1 og er videre karakterisert ved8. Use of an inactivated salmonid alpha virus of subtype SAV3, where the virus comprises a nucleic acid sequence that is at least 90% identical to the sequence indicated in SEQ ID NO: 1 and is further characterized by

a. en synlig cytopatogen effekt under tidlig passasje i cellekultur, og b. evnen til å fremkalle dødelighet på minst 30 % i en laboratoriesmittemodell, modellen omfatter smoltifisering av atlantisk laks i henhold til standardfremgangsmåter og utfordring av postsmolt ved intraperitonal injeksjon med en SAV3-dose på minst 10<8>TCID50 pr. fisk, slik som minst 10<9>TCID50, minst 10<10>TCID50 eller fortrinnsvis minst 3,5 x 10<8 >TCID50 pr. fisk innen én dag etter overføring til sjøvann på 12 <o>C, oga. a visible cytopathogenic effect during early passage in cell culture, and b. the ability to induce mortality of at least 30% in a laboratory infection model, the model includes smoltification of Atlantic salmon according to standard procedures and post-smolt challenge by intraperitoneal injection with a dose of SAV3 of at least 10<8>TCID50 per fish, such as at least 10<9>TCID50, at least 10<10>TCID50 or preferably at least 3.5 x 10<8>TCID50 per fish within one day of transfer to seawater at 12 <o>C, and

c. evnen til å vokse in vitro til en titer på minst 1x10<8 >TCID50/ml i supernatanten/vekstmediet kulturer av CHH-1-celler eller CHSE-214-celler;c. the ability to grow in vitro to a titer of at least 1x10<8 >TCID50/ml in the supernatant/growth medium cultures of CHH-1 cells or CHSE-214 cells;

i fremstillingen av en vaksine som er for forebygging eller reduksjon av forekomsten av infeksjon av salmonid alfavirus.in the manufacture of a vaccine which is for the prevention or reduction of the incidence of infection by salmonid alphavirus.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved tilsetting av formaldehyd. 9. Use according to claim 8, in which the salmonid alpha virus is inactivated by the addition of formaldehyde.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori det salmonide alfaviruset er inaktivert ved anvendelse av en prosedyre omfattende tilsetting av 1,5-2,5 g/kg, formaldehyd og etterfølgende inkubasjon i 48–96 timer ved en temperatur fra 14–17 <º>C. 10. Use according to claim 9, in which the salmonid alphavirus is inactivated using a procedure comprising the addition of 1.5-2.5 g/kg, formaldehyde and subsequent incubation for 48-96 hours at a temperature of 14-17 <º >C.