NO340576B1 - Recombinant humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use with a second, various growth inhibitory anti-ErbB2 antibody in a method of treating cancer in a patient and use thereof for the manufacture of a drug - Google Patents

Recombinant humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use with a second, various growth inhibitory anti-ErbB2 antibody in a method of treating cancer in a patient and use thereof for the manufacture of a drug Download PDF

Info

Publication number
NO340576B1
NO340576B1 NO20151725A NO20151725A NO340576B1 NO 340576 B1 NO340576 B1 NO 340576B1 NO 20151725 A NO20151725 A NO 20151725A NO 20151725 A NO20151725 A NO 20151725A NO 340576 B1 NO340576 B1 NO 340576B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
erbb2
cancer
cells
rhumab
Prior art date
Application number
NO20151725A
Other languages
Norwegian (no)
Other versions
NO20151725L (en
Inventor
Mark Sliwkowski
Hans Koll
Birgit Bossenmaier
Hans-Joachim Müller
Stephen Michael Kelsey
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2003/021590 external-priority patent/WO2004008099A2/en
Publication of NO20151725L publication Critical patent/NO20151725L/en
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of NO340576B1 publication Critical patent/NO340576B1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL

Description

Oppfinnelsens område Field of the invention

Foreliggende oppfinnelse gjelder det rekombinante humaniserte anti-HER2-antistoffet 2C4 (rhu Mab 2C4) for anvendelse i en metode for behandling av pasienter som lider av tumorer. The present invention relates to the recombinant humanized anti-HER2 antibody 2C4 (rhu Mab 2C4) for use in a method for the treatment of patients suffering from tumors.

Oppfinnelsens bakgrunn The background of the invention

ErbB-familien av reseptor tyrosinkinaser er viktige mediatorer av cellevekst, differensiering og overlevelse. Reseptorfamilien omfatter fire forskjellige medlemmer, inkludert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR eller ErbBl), HER2 (ErbB2 eller pl85<neu>), HER3 (ErbB3) og HER4 (ErbB4 eller tyro2). The ErbB family of receptor tyrosine kinases are important mediators of cell growth, differentiation and survival. The receptor family comprises four different members, including epidermal growth factor receptor (EGFR or ErbBl), HER2 (ErbB2 or pl85<neu>), HER3 (ErbB3) and HER4 (ErbB4 or tyro2).

EGFR, kodet av erbBl-genet, har blitt implisert i årsaken til ondartede tilstander hos mennesker. Spesielt har forhøyet ekspresjon av EGFR blitt observert i bryst-, blære-, lunge-, hode-, hals- og magekreft, så vel som i glioblastomer. Forhøyet EGFR-reseptor-ekspresjon er ofte forbundet med en forhøyet produksjon av EGFR-liganden, transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a) av de samme tumorcellene, noe som fører til reseptoraktivering ved en autokrin, stimulerende reaksjonsvei. Baselga og Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). I tillegg har et epidermal vekstfaktor-reseptor beslektet protein (ERRP), hvor en cDNA-fragmentklon på 1583 basepar med 90-95 % sekvenshomologi med EGFR fra mus, og en avkortet EGFR fra rotte blitt beskrevet (US patentskrift nr. 6 399 743, og US publikasjon nr. 2003/0096373). Monoklonale antistoffer rettet mot EGFR eller dens ligander, TGF-a og EGF, har blitt evaluert som terapeutiske midler ved en behandling av slike ondartede tilstander. Se for eksempel Baselga og Mendelsohn, supra; Masui et al., Cancer Research, 33:1002-1007 (1984); og Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995). EGFR, encoded by the erbBl gene, has been implicated in the causation of human malignancies. In particular, elevated expression of EGFR has been observed in breast, bladder, lung, head, neck and stomach cancers, as well as in glioblastomas. Elevated EGFR receptor expression is often associated with an increased production of the EGFR ligand, transforming growth factor alpha (TGF-α) by the same tumor cells, leading to receptor activation by an autocrine, stimulatory pathway. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther., 64:127-154 (1994). In addition, an epidermal growth factor receptor related protein (ERRP), in which a cDNA fragment clone of 1583 base pairs with 90-95% sequence homology to mouse EGFR, and a truncated rat EGFR has been described (US Patent No. 6,399,743, and US Publication No. 2003/0096373). Monoclonal antibodies directed against EGFR or its ligands, TGF-α and EGF, have been evaluated as therapeutic agents in the treatment of such malignant conditions. See, for example, Baselga and Mendelsohn, supra; Masui et al., Cancer Research, 33:1002-1007 (1984); and Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995).

Det andre medlemmet av ErbB-familien, pl85neu, ble opprinnelig identifisert som produktet fra det transformerende genet fra neuroblastomer hos kjemisk behandlede rotter. Den aktiverte form av neu-proto-onkogenet er et resultat av en punktmutasjon (valin til glutaminsyre) i transmembranområdet i det kodede proteinet. Amplifisering av den humane homologen av neu (HER2) er observert i bryst- og ovariekreft og korrelerer med dårlig prognose (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); og US patentskrift nr. 4 968 603). Til nå har ingen punktmutasjon analog til den i neu-proto-onkogenet blitt rapportert for humane tumorer. Overekspresjon av ErbB2 (som ofte, men ikke alltid, skyldes genamplifisering) har også blitt observert i andre karsinomer, inkludert karsinorner fra mage, endometrium, spyttkjertel, lunge, nyre, kolon, skjoldkjertel, bukspyttkjertel og urinblære. Se blant annet King et al., Science, 229:974 (1985)M Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res. 49:6605 (1989); Zhau et al., Mol. Carcinog. 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52 The second member of the ErbB family, pl85neu, was originally identified as the product of the transforming gene from neuroblastomas in chemically treated rats. The activated form of the neu-proto-oncogene is the result of a point mutation (valine to glutamic acid) in the transmembrane region of the encoded protein. Amplification of the human homologue of neu (HER2) has been observed in breast and ovarian cancer and correlates with poor prognosis (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707- 712 (1989); and US Patent No. 4,968,603). Until now, no point mutation analogous to that in the neu-proto-oncogene has been reported for human tumors. Overexpression of ErbB2 (often, but not always, due to gene amplification) has also been observed in other carcinomas, including carcinomas of the stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas, and bladder. See, among others, King et al., Science, 229:974 (1985)M Yokota et al., Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigi et al., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Geurin et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res. 49:6605 (1989); Zhao et al., Mol. Carcinog. 3:354-357 (1990); Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology, 59:46-52

(1991); og McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 kan være overuttrykt i prostatakreft (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer, 79:2162-70 (1997); og Sadasivan et al., J. Uroi., 150:126-31 (1993)). Overekspresjon av ErbB2 kan føre til tumorvekst via liganduavhengig aktivering av ErbB2 eller ErbB2-homodimerer. (1991); and McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). ErbB2 may be overexpressed in prostate cancer (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer , 79:2162-70 (1997); and Sadasivan et al., J. Uroi., 150:126-31 (1993)). Overexpression of ErbB2 can lead to tumor growth via ligand-independent activation of ErbB2 or ErbB2 homodimers.

Antistoffer rettet mot proteinproduktene fra pl85neu hos rotte og human ErbB2 har blitt beskrevet. Drebin og medarbeidere har fremstilt antistoffer mot neu-gen-produktet fra rotte, pl85neu. Se for eksempel Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991); og WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) rapporterer at blandinger av antistoffer som reagerer med to adskilte områder i pl85neu fører til synergistiske anti-tumor virkninger på neu-transformerte NIH-3T3-celler implantert i naken mus. Se også US patentskrift nr. Antibodies directed against the protein products of pl85neu in rat and human ErbB2 have been described. Drebin and colleagues have produced antibodies against the rat neu gene product, pl85neu. See, for example, Drebin et al., Cell, 41:695-706 (1985); Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290 (1991); and WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277 (1988) report that mixtures of antibodies reacting with two distinct regions in pl85neu lead to synergistic anti-tumor effects on neu-transformed NIH-3T3 cells implanted in nude mice. See also US patent document no.

5 824 311, tildelt 20. oktober 1998. 5,824,311, issued October 20, 1998.

Hudziak et al., Mol. Cell, Biol., 9(3):1165-1172 (1989) beskriver fremstillingen av et sett av anti-ErbB2-antistoffer som blekarakterisert vedanvendelse av den humane brysttumor cellelinje SK-BR-3. Relative celleproliferasjon av SK-BR-3-cellene etter eksponering for antistoffene ble bestemt ved krystall fiolett farging av monolagene etter 72 timer. Ved anvendelse av denne analysen ble maksimal inhibering oppnådd med antistoffet som kaltes 4D5, som inhiberer celleproliferasjonen med 56 %. Andre antistoffer i settet reduserte celleproliferasjonen i mindre grad i denne analysen. Antistoff 4D5 ble videre funnet å sensibilisere ErbB2-overuttrykkende brysttumor cellelinjer overfor de cytotoksiske virkningene av TNF-a. Se også US patentskrift nr. 5 677 171, tildelt 14. oktober 1997. Anti-ErbB2-antistoffene som diskuteres i Hudziak et al. erkarakterisertvidere i Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2:979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Reserach, 56:1457-1465 (1996); og Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997). Hudziak et al., Mol. Cell, Biol., 9(3):1165-1172 (1989) describes the production of a set of anti-ErbB2 antibodies that were characterized using the human breast tumor cell line SK-BR-3. Relative cell proliferation of the SK-BR-3 cells after exposure to the antibodies was determined by crystal violet staining of the monolayers after 72 hours. Using this assay, maximum inhibition was achieved with the antibody called 4D5, which inhibits cell proliferation by 56%. Other antibodies in the kit reduced cell proliferation to a lesser extent in this assay. Antibody 4D5 was further found to sensitize ErbB2-overexpressing breast tumor cell lines to the cytotoxic effects of TNF-α. See also US Patent No. 5,677,171, assigned October 14, 1997. The anti-ErbB2 antibodies discussed in Hudziak et al. are further characterized in Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558 (1990); Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A (1990); Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82 (1991); Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127 (1991); Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2:979-986 (1991); Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255-263 (1993); Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al., Cancer Research, 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al., J. Biol. Chem. ., 266:14300-5 (1991); D'souza et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 91:7202-7206 (1994); Lewis et al., Cancer Reserach, 56:1457-1465 ( 1996); and Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997).

En rekombinant, humanisert versjon av muse-anti-ErbB2-antistoffet 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 eller HERCEPTIN<®>; US patentskrift nr. 5 821 337) er klinisk aktiv i pasienter med ErbB2-overuttrykkende metastatisk brystkreft som på forhånd har mottatt omfattende anti-kreftbehandling (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744 A recombinant, humanized version of the mouse anti-ErbB2 antibody 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 or HERCEPTIN<®>; US Patent No. 5,821,337) is clinically active in patients with ErbB2-overexpressing metastatic breast cancer who have previously received extensive anti-cancer therapy (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744

(1996)). "HERCEPTIN<®>" mottok markedsføringstillatelse av Food and Drug Administration, 25. september 1988 for behandling av pasienter med metastatisk brystkreft hvis tumorer overuttrykker ErbB2-proteinet. Imidlertid responderer ikke alle ErbB2-overuttrykkende tumorer på "HERCEPTIN<®>". (Brockhoff et al., Cytomery, 44:338-48 (2001)). I tillegg tyder prekliniske data på at "HERCEPTIN<®>" kan være terapeutisk effektiv for behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). HER2-proteinet overuttrykkes i 20-66 % av reseksjonerte NSCLC-tumorer og har vist seg å predikere et dårlig utfall for pasienten i multiple serier (Azzoli, C.G. et al., Semin. Oncol., 29(Suppl 4):59-65 (2002)). (1996)). "HERCEPTIN<®>" received marketing authorization by the Food and Drug Administration on September 25, 1988 for the treatment of patients with metastatic breast cancer whose tumors overexpress the ErbB2 protein. However, not all ErbB2-overexpressing tumors respond to "HERCEPTIN<®>". (Brockhoff et al., Cytomery, 44:338-48 (2001)). In addition, preclinical data suggest that "HERCEPTIN<®>" may be therapeutically effective for the treatment of non-small cell lung cancer (NSCLC). The HER2 protein is overexpressed in 20-66% of resected NSCLC tumors and has been shown to predict poor patient outcome in multiple series (Azzoli, C.G. et al., Semin. Oncol., 29(Suppl 4):59-65 (2002)).

Andre anti-ErbB2-antistoffer med forskjellige egenskaper har blitt beskrevet i Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695 Other anti-ErbB2 antibodies with different properties have been described in Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937 (1991); McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548 (1989); Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369 (1991); Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362 (1990); Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695

(1991) ; Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Casprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776 (1991) ; Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589 (1992); Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408 (1993); WO 94/00136; Casprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776

(1992) ; Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. CHej., 26Z: 15160-15167 (1992); US patentskrift nr. 5 783 186; og Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). Monoklonale antistoff 2C4 er beskrevet i WO 01/00245. 2C4 har blitt vist å bryte dimerisering av HER2 med andre medlemmer av ErbB-reseptorfamilien (WO 01/00245). (1992) ; Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580 (1991); Shawver et al., Cancer Res., 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al., J. Biol. CHej., 26Z: 15160-15167 (1992); US Patent No. 5,783,186; and Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997). Monoclonal antibody 2C4 is described in WO 01/00245. 2C4 has been shown to break dimerization of HER2 with other members of the ErbB receptor family (WO 01/00245).

Homologiscreening har resultert i identifisering av to andre medlemmer av ErbB-reseptorfamilien; ErbB3 (US patentskrift nr. 5 183 884 og 5 480 968 samt Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) og ErbB4 (EP patentsøknad nr. 599 274; Plowman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993) og Plowman et al., Nature, 366:476-475 (1993)). Begge disse reseptorene viser forhøyet ekspresjon i det minste i noen brystkreft cellelinjer. Homology screening has resulted in the identification of two other members of the ErbB receptor family; ErbB3 (US Patent Nos. 5,183,884 and 5,480,968 and Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989)) and ErbB4 (EP Patent Application No. 599,274; Plowman et al., Proe. Nat. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) and Plowman et al., Nature, 366:476-475 (1993)). Both of these receptors show elevated expression at least in some breast cancer cell lines.

ErbB-reseptorene finnes vanligvis i forskjellige kombinasjoner i celler, og heterodimerisering antas å øke diversiteten av cellulære responser på en rekke ErbB-ligander (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132 (1995)). Imidlertid er mekanismen ved hvilken disse reseptorene aggregerer og hvordan dette bidrar til signaliseringen ikke fult ut forstått (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 19:6093-6101 The ErbB receptors are usually found in different combinations in cells, and heterodimerization is believed to increase the diversity of cellular responses to a variety of ErbB ligands (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132 (1995)). However, the mechanism by which these receptors aggregate and how this contributes to signaling is not fully understood (Brennan, P.J. et al., Oncogene, 19:6093-6101

(2000)). EGFR bindes til seks forskjellige ligander, epidermal vekstfaktor (EGF), transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a), amfiregulin, heparinbindende epidermal vekstfaktor (HB-EGF), betacellulin og epiregulin (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). En familie av heregulinproteiner som oppstår ved alternativ spleising av et enkelt gen er ligander for ErbB3 og ErbB4. Heregulinfamilien inkludere alfa-, beta- og gamma-hereguliner (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); US patentskrift nr. (2000)). EGFR binds to six different ligands, epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGF-α), amphiregulin, heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), betacellulin and epiregulin (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994)). A family of heregulin proteins that arise from alternative splicing of a single gene are ligands for ErbB3 and ErbB4. The heregulin family includes alpha, beta and gamma heregulins (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); US Patent No.

5 641 869; og Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)); neu-differensierings- faktorer (NDF), glia vekstfaktorer (GGF), acetylkolin reseptorinduserende aktivitet (ARIA) og sanse- og motorneuron avledet faktor (SMDF). For en oversikt, se Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 7:247-262 5,641,869; and Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)); neu-differentiation factors (NDF), glial growth factors (GGF), acetylcholine receptor-inducing activity (ARIA) and sensory and motor neuron-derived factor (SMDF). For a review, see Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257 (1994); Lemke, G., Molec. & Cell. Neurosci., 7:247-262

(1996) og Lee et al., Pharm. Rev., 47:51-85 (1995). Nylig ble ytterligere tre ErbB-ligander påvist; neuregulin-2 (NRG-2), som rapporteres å bindes til enten ErbB3 eller ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); og Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 som bindes til ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18):9562-7 (1997)); og neuregulin-4, som bindes til ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacellulin og epiregulin bindes også til ErbB4. (1996) and Lee et al., Pharm. Rev., 47:51-85 (1995). Recently, three additional ErbB ligands were detected; neuregulin-2 (NRG-2), which is reported to bind to either ErbB3 or ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); and Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997 )); neuregulin-3 which binds to ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18):9562-7 (1997)); and neuregulin-4, which binds to ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacellulin and epiregulin also bind to ErbB4.

Mens EG F og TG Fa ikke bindes til ErbB2, stimulerer EG F EGFR og ErbB2 til å danne en heterodimer, som aktiverer EGFR og fører til transfosforylering av ErbB2 i heterodimeren. Dimerisering og/eller transfosforlyering ser ut til å aktivere tyrosin-kinasen i ErbB2. Se Earp et al., supra. Likeså bindes heregulin ikke til ErbB2, men når ErbB3 ko-uttrykkes med ErbB2 dannes et aktivt signalkompleks (Nagy et al., Cytomery, 32:120-31 (1998). Antistoffer rettet mot ErbB2 er istand til å bryte opp dette komplekset (Sliwkowski et al., J. Biol. CHem., 269(20^:14661-14665 (1994)). ErbB3 er tyrosinkinase-defekt og krever således heterodimerisering, fortrinnsvis med ErbB2, for å få signaloverføringsevner. (Graus-Porta et al., EMBO J., 16:1647-55 (1995)). I tillegg øker affiniteten av ErbB3 for heregulin (HRG) til en høyere affinitetstilstand ved ko-ekspresjon med ErbB2. Se også Levi et al., Journal of Neuroscience, 15:1329-1340 While EG F and TG Fa do not bind to ErbB2, EG F stimulates EGFR and ErbB2 to form a heterodimer, which activates EGFR and leads to transphosphorylation of ErbB2 in the heterodimer. Dimerization and/or transphosphorylation appear to activate the tyrosine kinase in ErbB2. See Earp et al., supra. Likewise, heregulin does not bind to ErbB2, but when ErbB3 is co-expressed with ErbB2 an active signaling complex is formed (Nagy et al., Cytomery, 32:120-31 (1998). Antibodies directed against ErbB2 are able to break up this complex (Sliwkowski et al., J. Biol. CHem., 269(20^:14661-14665 (1994)). ErbB3 is tyrosine kinase defective and thus requires heterodimerization, preferably with ErbB2, to gain signal transduction capabilities. (Graus-Porta et al. , EMBO J., 16:1647-55 (1995)). In addition, the affinity of ErbB3 for heregulin (HRG) increases to a higher affinity state upon co-expression with ErbB2. See also Levi et al., Journal of Neuroscience, 15: 1329-1340

(1995); Morrissey et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 92:1431-1435 (1995); og Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) med hensyn til ErbB2-ErbB3-proteinkomplekset. Faktisk er ErbB2 den foretrukne heterodimeriseringspartner for både EGFR og ErbB3. (1995); Morrissey et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA, 92:1431-1435 (1995); and Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) with respect to the ErbB2-ErbB3 protein complex. Indeed, ErbB2 is the preferred heterodimerization partner for both EGFR and ErbB3.

(Graus-Porta et al, supra). I likhet med ErbB3 danner ErbB4 et aktivt signalkompleks med ErbB2 (Carraway og Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Ligandavhengig heterodimerisering av ErbB2 med EGFR eller ERbB3 kan fremme veksten av tumorer som uttrykker ErbB2. (Graus-Porta et al, supra). Like ErbB3, ErbB4 forms an active signaling complex with ErbB2 (Carraway and Cantley, Cell, 78:5-8 (1994)). Ligand-dependent heterodimerization of ErbB2 with EGFR or ERbB3 can promote the growth of tumors expressing ErbB2.

Ekspresjonen av ErbB-reseptorene og heregulin og fosforyleringsstatusen av HER2 har blitt undersøkt i tumorprøver fra pasienter med primær brystkreft og i urinblære karsinom (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow et al., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001)). En korrelasjon mellom aktiv signalisering via Her2/neu og klinikopatologi og utfallet for pasienten ved brystkreft har blitt rapportert av Thor et al., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000) og DiGiovanna et al., Cancer Res., 62:6667-6673 (2002). The expression of the ErbB receptors and heregulin and the phosphorylation status of HER2 have been investigated in tumor samples from patients with primary breast cancer and in bladder carcinoma (Esteva et al., Pathol. Oncol. Res., 7:171-177 (2001); Chow et al. ., Clin. Cancer Res., 7:1957-1962 (2001)). A correlation between active signaling via Her2/neu and clinicopathology and patient outcome in breast cancer has been reported by Thor et al., J. Clin. Oncology, 18:3230-3239 (2000) and DiGiovanna et al., Cancer Res., 62:6667-6673 (2002).

Oppsummering av oppfinnelsen Summary of the invention

Den foreliggende oppfinnelsen er definert i kravene. The present invention is defined in the claims.

Et aspekt ved oppfinnelsen er et rekombinant, humanisert antistoff 2C4 (rhuMab 2C4) for anvendelse i en frem-gangsmåte for behandling av kreft i en pasient, hvor i fremgangsmåten rhuMAb 2C4 administreres som en fast dose på 420 mg hver tredje uke, og hvor rhuMAb 2C4 omfatter de variable lett og variable tunge aminosyre-sekvensene SEKV ID Nr. 3 og 4, henholdsvis, og human lett og tung IgGl (ikke-A allotype) konstant region sekvenser, og hvor fremgangsmåten også inkluderer administrering av et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff enten før eller etter administreringen av rhuMab 2C4 eller samtidig. One aspect of the invention is a recombinant, humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use in a method for treating cancer in a patient, where in the method rhuMAb 2C4 is administered as a fixed dose of 420 mg every three weeks, and where rhuMAb 2C4 comprises the variable light and variable heavy amino acid sequences SEQ ID NO. 3 and 4, respectively, and human light and heavy IgGl (non-A allotype) constant region sequences, and where the method also includes the administration of a second, different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody either before or after the administration of rhuMab 2C4 or at the same time.

Oppfinnelsen angir videre anvendelse av et rekombinant, humanisert antistoff 2C4(rhuMab 2C4) for fremstillingen av et medikament for behandling av ovarie-, bryst-, lunge- eller prostatakreft hos en kreftpasient, hvor rhuMAb 2C4 omfatter de variable lett og variable tunge aminosyre-sekvensene SEKV ID Nr. 3 og 4, henholdsvis, og human lett og tung IgGl (ikke-A allotype) konstant region sekvenser og hvor i behandlingen rhuMAb 2C4 administreres som en fast dose på 420 mg hver tredje uke, og hvor behandlingen også inkluderer administrering av et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff enten før eller etter administreringen av rhuMab 2C4 eller samtidig. The invention further specifies the use of a recombinant, humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for the preparation of a drug for the treatment of ovarian, breast, lung or prostate cancer in a cancer patient, where rhuMAb 2C4 comprises the variable light and variable heavy amino acid sequences SEQ ID No. 3 and 4, respectively, and human light and heavy IgGl (non-A allotype) constant region sequences and where in the treatment rhuMAb 2C4 is administered as a fixed dose of 420 mg every three weeks, and where the treatment also includes the administration of a second, different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody either before or after the administration of rhuMab 2C4 or at the same time.

I en utførelsesform er det andre, forskjellige vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoffet trastuzumab. In one embodiment, the second, different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody is trastuzumab.

Kort beskrivelse av figurene Brief description of the figures

Figurene IA og IB avbilder oppstillinger av aminosyresekvensene til de variable lett kjede (VL)-(Fig. IA) og variable tung kjede (VH)-(Fig. IB) domener i det monoklonale museantistoff 2C4 (SEKV. ID. Nr. 1 henholdsvis 2), VL- og VH-domener fra humanisert 2C4 versjon 574 (SEKV. ID. Nr. 3 henholdsvis 4) og humane VL- og VH-konsensus rammeverk (humk1, lett kappa subgruppe I, humlll, tung subgruppe III) Figures IA and IB depict alignments of the amino acid sequences of the variable light chain (VL)-(Fig. IA) and variable heavy chain (VH)-(Fig. IB) domains of the mouse monoclonal antibody 2C4 (SEQ. ID. No. 1 respectively 2), VL and VH domains from humanized 2C4 version 574 (SEQ. ID. No. 3 and 4 respectively) and human VL and VH consensus frameworks (humk1, light kappa subgroup I, humlll, heavy subgroup III)

(SEKV. ID. Nr. 5 henholdsvis 6). Stjerner angir forskjeller mellom humanisert 2C4 versjon 574 og det monoklonale museantistoff 2C4 eller mellom humanisert 2C4 versjon 574 og humant rammeverk. Komplementaritetsbestemmende områder (CDR) er i parenteser. (SEQ. ID. No. 5 and 6 respectively). Asterisks indicate differences between humanized 2C4 version 574 and the mouse monoclonal antibody 2C4 or between humanized 2C4 version 574 and human framework. Complementarity determining regions (CDR) are in parentheses.

Figurene 2A og 2B viser virkningen av det monoklonale antistoff 2C4, "HERCEPTIN<®>"-antistoff eller et anti-EGFR-antistoff på heregulin (HRG)-avhengig assosiasjon mellom ErbB2 og ErbB3 i MCF7-celler, som uttrykker ErbB2 i lavt/normalt nivå (Fig. 2A) og SK-BR-3-celler, som uttrykker ErbB2 i høyt nivå (Fig. 2B), se Eksempel 2 nedenfor. Figur 3 er et immunblot som viser nærvær av HER1/HER2- og HER2/HER3-heterodimerer i proteinekstrakter fra xenopodede eksplantater fra ikke-småcellet lungekreft. Figur 4 er et immunblot som viser nærvær av HER2-fosforylering i protein-e kst rakte r fra xenopodede eksplantater fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Figures 2A and 2B show the effect of the monoclonal antibody 2C4, "HERCEPTIN<®>" antibody or an anti-EGFR antibody on heregulin (HRG)-dependent association between ErbB2 and ErbB3 in MCF7 cells, which express ErbB2 in low/ normal level (Fig. 2A) and SK-BR-3 cells, which express ErbB2 at a high level (Fig. 2B), see Example 2 below. Figure 3 is an immunoblot showing the presence of HER1/HER2 and HER2/HER3 heterodimers in protein extracts from xenografted non-small cell lung cancer explants. Figure 4 is an immunoblot showing the presence of HER2 phosphorylation in protein extracts from xenopodized non-small cell lung cancer (NSCLC) explants.

Detaljert beskrivelse av den foretrukne utførelse Detailed description of the preferred embodiment

Foreliggende beskrivelse bygger delvis på det eksperimentelle funnet at evnen til å respondere på anti-HER2-antistoffet rhuMAb 2C4 korrelerer med nærvær av HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer og/eller fosforylering av en ErbB-reseptor i tumorceller. En tumor kan således identifiseres som responsiv på behandling med et anti-HER2-antistoff, fortrinnsvis et anti-HER2-antistoff som har én eller flere av de biologiske aktivitetene til anti-HER2-antistoffet 2C4, basert på nærvær av HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer og/eller fosforylering av en ErbB-reseptor. HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer og/eller ErbB-reseptorfosforylering kan påvises ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget. Ved å identifisere spesifikke tumorer og tumortyper som responderer på behandling med anti-HER2-antistoffer kan pasienter som sannsynligvis har mest nytte av slik behandling identifiseres. I tillegg kan pasienter som sannsynligvis ikke vil ha nytte av behandling med det monoklonale antistoff 2C4 identifiseres. The present description is partly based on the experimental finding that the ability to respond to the anti-HER2 antibody rhuMAb 2C4 correlates with the presence of HER2/HER3 and/or HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers and/or phosphorylation of a ErbB receptor in tumor cells. A tumor can thus be identified as responsive to treatment with an anti-HER2 antibody, preferably an anti-HER2 antibody that has one or more of the biological activities of the anti-HER2 antibody 2C4, based on the presence of HER2/HER3 and /or HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers and/or phosphorylation of an ErbB receptor. HER2/HER3 and/or HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers and/or ErbB receptor phosphorylation can be detected by any method known in the art. By identifying specific tumors and tumor types that respond to treatment with anti-HER2 antibodies, patients who are likely to benefit most from such treatment can be identified. In addition, patients who are unlikely to benefit from treatment with the monoclonal antibody 2C4 can be identified.

Definisjoner Definitions

En "ErbB-reseptor" er en reseptor protein-tyrosinkinase som tilhører ErbB-reseptorfamilien og inkluderer reseptorene EGFR (ErbBl), ERRP, ErbB2, ErbB3 og ErbB4 og andre medlemmer av denne familie som vil påvises i fremtiden. ErbB-reseptoren vil generelt omfatte et ekstracellulært domene som kan binde en ErbB-ligand; et lipofilt transmembran domene; et konservert, intracellulært tyrosinkinase domene; og et karboksylterminalt signaldomene som bærer flere tyrosinrester som kan fosforyleres. ErbB-reseptoren kan være en "nativ sekvens" ErbB-reseptor eller en "aminosyresekvens variant" derav. ErbB-reseptoren er fortrinnsvis human ErbB-reseptor med nativ sekvens. Følgelig et er "medlem av ErbB-reseptorfamilien" EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3, ErbB4 eller enhver annen ErbB-reseptor som i dag er kjent eller som vil påvises i fremtiden. Fortrinnsvis er medlemmet EGFR (ErbBl), ErbB2, ErbB3 eller ErbB4. An "ErbB receptor" is a receptor protein tyrosine kinase that belongs to the ErbB receptor family and includes the receptors EGFR (ErbBl), ERRP, ErbB2, ErbB3 and ErbB4 and other members of this family that will be identified in the future. The ErbB receptor will generally comprise an extracellular domain that can bind an ErbB ligand; a lipophilic transmembrane domain; a conserved intracellular tyrosine kinase domain; and a carboxyl-terminal signal domain bearing multiple tyrosine residues that can be phosphorylated. The ErbB receptor may be a "native sequence" ErbB receptor or an "amino acid sequence variant" thereof. The ErbB receptor is preferably human ErbB receptor with native sequence. Accordingly, a "member of the ErbB receptor family" is EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3, ErbB4, or any other ErbB receptor currently known or to be detected in the future. Preferably, the member is EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 or ErbB4.

Begrepene "ErbBl", "epidermal vekstfaktor reseptor", "EGFR" og "HERI" anvendes her om hverandre og viser til EGFR, som beskrevet i for eksempel Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914 (1987), innbefattet naturlig forekommende mutante former derav (f. eks. en delesjonsmutant av EGFR som i Humphrey et al., PNAS (USA), 8_7:4207-4211 (1990)). ErbBl viser til genet som koder for EGFR-protein-produktet. Antistoffer mot HERI er for eksempel beskrevet i Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560 (1987) og i WO 95/25167. The terms "ErbB1", "epidermal growth factor receptor", "EGFR" and "HERI" are used interchangeably herein and refer to EGFR, as described in, for example, Carpenter et al., Ann. Fox. Biochem., 56:881-914 (1987), including naturally occurring mutant forms thereof (eg, a deletion mutant of EGFR as in Humphrey et al., PNAS (USA), 8_7:4207-4211 (1990)). ErbBl refers to the gene that codes for the EGFR protein product. Antibodies against HERI are described, for example, in Murthy et al., Arch. Biochem. Biophys., 252:549-560 (1987) and in WO 95/25167.

Begrepene "ERRP", "EGF-reseptorbeslektet protein", "EGFR-beslektet protein" og "epidermal vekstfaktor reseptorbeslektet protein" benyttes her om hverandre og viser til ERRP som beskrevet i for eksempel US patentskrift nr. 6 399 743 og US patent-publikasjon nr. 2003/0096373. The terms "ERRP", "EGF receptor-related protein", "EGFR-related protein" and "epidermal growth factor receptor-related protein" are used here interchangeably and refer to ERRP as described in, for example, US patent document no. 6,399,743 and US patent publication No. 2003/0096373.

Uttrykkene "ErbB2" og "HER2" anvendes her om hverandre her og viser til humant HER2-protein som beskrevet for eksempel i Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) og Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986) (Genbank aksesjons-nummer X03363). Begrepet "erbB2" viser til genet som koder for humant ErbB2 og "neu" viser til genet som koder for pl85neu fra rotte. Et foretrukket ErbB2 er humant ErbB2 med nativ sekvens. The terms "ErbB2" and "HER2" are used interchangeably herein and refer to human HER2 protein as described, for example, in Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501 (1985) and Yamamoto et al., Nature , 319:230-234 (1986) (Genbank accession number X03363). The term "erbB2" refers to the gene encoding human ErbB2 and "neu" refers to the gene encoding rat pl85neu. A preferred ErbB2 is native sequence human ErbB2.

"ErbB3" og "HER3" viser til reseptor-polypeptidet som beskrivet for eksempel i US patentskrift nr. 5 183 884 og 5 480 968, så vel som i Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989). Antistoffer mot ErbB3 er kjente innen faget og beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 5 183 884, 5 480 968 og i WO 97/35885. "ErbB3" and "HER3" refer to the receptor polypeptide as described, for example, in US Patent Nos. 5,183,884 and 5,480,968, as well as in Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197 (1989 ). Antibodies against ErbB3 are known in the art and are described, for example, in US Patent Nos. 5,183,884, 5,480,968 and in WO 97/35885.

Begrepene "ErbB4" og "HER4" viser her til reseptor-polypeptidet som beskrevet foreksempel i EP patentsøknad nr. 599 274; Plowman et al., Proe. Nati. Acad. Sc. USA 90:1746-1750 (1993) og Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), inkludert isoformer derav, f. eks. som beskrevet i WO 99/19488, publisert 22. april 1999. Antistoffer mot HER4 er for eksempel beskrevet i WO 02/18444. The terms "ErbB4" and "HER4" refer here to the receptor polypeptide as described for example in EP patent application no. 599 274; Plowman et al., Proe. Nati. Acad. Sc. USA 90:1746-1750 (1993) and Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), including isoforms thereof, e.g. as described in WO 99/19488, published 22 April 1999. Antibodies against HER4 are for example described in WO 02/18444.

Antistoffer mot ErbB-reseptorer er kommersielt tilgjengelige fra en rekke kilder, inkludert for eksempel Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA. Antibodies against ErbB receptors are commercially available from a number of sources, including, for example, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, USA.

Med "ErbB-ligand" menes et polypeptid som bindes til og/eller aktiverer en ErbB-reseptor. ErbB-liganden kan være en human ErbB-ligand med nativ sekvens, slik som epidermal vekstfaktor (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chej., 247:7612-7621 (1972)); transformerende vekstfaktor alfa (TGF-a) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082 By "ErbB ligand" is meant a polypeptide that binds to and/or activates an ErbB receptor. The ErbB ligand can be a native sequence human ErbB ligand, such as epidermal growth factor (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chej., 247:7612-7621 (1972)); transforming growth factor alpha (TGF-α) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082

(1984)); amfiregulin, også betegnet schwanoma eller autokrin keratinocytt vekstfaktor (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1984)); amphiregulin, also called schwannoma or autocrine keratinocyte growth factor (Shoyab et al., Science, 243:1074-1076 (1989); Kimura et al., Nature, 348:257-260

(1990); og Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacellulin (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993) og Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)), heparinbindende epidermal vekstfaktor (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); epiregulin (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1990); and Cook et al., Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacellulin (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993) and Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)), heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF) (Higashiyama et al. al., Science, 251:936-939 (1991)); epiregulin (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500

(1995); og Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); heregulin (se nedenfor), neregulin-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neregulin-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 94:9562-9567 (1997)); neregulin-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) eller kripto (CR-1) (1995); and Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); heregulin (see below), nonregulemin-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); nonregulamine-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 94:9562-9567 (1997)); nonregulamine-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) or crypto (CR-1)

(Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). ErbB-ligander som bindes til EGFR omfatter EGF, TGF-a, amfiregulin, betacellulin, HB-EGF og epiregulin. ErbB-ligander som bindes til ErbB3 inkluderer hereguliner. ErbB-ligander som er istand til å bindes til ErbB4 omfatter betacellulin, epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 og (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). ErbB ligands that bind to EGFR include EGF, TGF-α, amphiregulin, betacellulin, HB-EGF and epiregulin. ErbB ligands that bind to ErbB3 include heregulins. ErbB ligands capable of binding to ErbB4 include betacellulin, epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 and

hereguliner. ErbB-liganden kan også være en syntetisk ErbB-ligand. Den syntetiske ligand kan være spesifikk for en gitt ErbB-reseptor eller kan gjenkjenne spesielle ErbB-reseptorkomplekser. Et eksempel på en syntetisk ligand er den syntetiske heregulin/egf-kimær biregulin (se for eksempel Jones et al., FEBS Letters, 447:227-231 (1999)). heregulines. The ErbB ligand can also be a synthetic ErbB ligand. The synthetic ligand may be specific for a given ErbB receptor or may recognize particular ErbB receptor complexes. An example of a synthetic ligand is the synthetic heregulin/egf chimeric biregulin (see, for example, Jones et al., FEBS Letters, 447:227-231 (1999)).

"Heregulin" (HRG) når anvendt her viser til et polypeptid som kodes av heregulingenet, som beskrevet i US patentskrift nr. 5 641 869 eller Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Eksempler på hereguliner omfatter heregulin-cc, heregulin-pi, heregulin-p2 og heregulin-|33 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) og US patentskrift nr. 5 641 869), neu-differensieringsfaktor (NDF) (Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992)), acetylkolin reseptorinduserende aktivitet (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)), glia vekstfaktorer (GGF) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)), sanse- og motorneuronavledet faktor (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)), y-heregulin (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). Begrepet inkluderer biologisk aktive fragmenter og/eller aminosyresekvens varianter av et HRG-polypeptid med nativ sekvens, for eksempel et EGF-lignende domenefragment derav (f. eks. HERGpl 177-244). "Heregulin" (HRG) as used herein refers to a polypeptide encoded by the heregulin gene, as described in US Patent No. 5,641,869 or Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Examples of heregulins include heregulin-cc, heregulin-pi, heregulin-p2 and heregulin-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992) and US Patent No. 5,641,869), neu differentiation factor ( NDF) (Peles et al., Cell, 69:205-216 (1992)), acetylcholine receptor-inducing activity (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815 (1993)), glial growth factors (GGF) ( Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)), sensory and motor neuron-derived factor (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)), y- heregulin (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). The term includes biologically active fragments and/or amino acid sequence variants of a native sequence HRG polypeptide, for example an EGF-like domain fragment thereof (eg, HERGpl 177-244).

En "ErbB-hetero-oligomer" er her ikke-kovalent sammenbundet oligomer som omfatter minst to forskjellige ErbB-reseptorer. En "ErbB-dimer" er en ikke-kovalent An "ErbB hetero-oligomer" here is a non-covalently linked oligomer comprising at least two different ErbB receptors. An "ErbB dimer" is a non-covalent

sammenbundet oligomer som omfatter to forskjellige ErbB-reseptorer. Slike komplekser kan dannes når en celle som uttrykker to eller flere ErbB-reseptorer utsettes for en ErbB-ligand. ErbB-oligomerer, slik som ErbB-dimerer, kan isoleres ved immunpresipitering og analyseres ved SDS-PAGE som beskrevet for eksempel i Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Eksempler på slike ErbB-hetero-oligomerer inkluderer EGFR-ErbB2- (også betegnet HER1/HER2), ErbB2-ErbB3- (HER2/HER3) og ErbB3-ErbB4-(HER3/HER4) komplekser. ErbB-hetero-oligomerer kan videre omfatte to eller flere ErbB2-reseptorer kombinert med en annen ErbB-reseptor, slik som ErbB3, ErbB4 eller EGFR (ErbBl). Andre proteiner, slik som en cytokin reseptorsubenhet (f. eks. gpl30) kan inngå i hetero-oligomeren. linked oligomer comprising two different ErbB receptors. Such complexes can form when a cell expressing two or more ErbB receptors is exposed to an ErbB ligand. ErbB oligomers, such as ErbB dimers, can be isolated by immunoprecipitation and analyzed by SDS-PAGE as described, for example, in Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Examples of such ErbB hetero-oligomers include EGFR-ErbB2 (also termed HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) and ErbB3-ErbB4-(HER3/HER4) complexes. ErbB hetero-oligomers can further comprise two or more ErbB2 receptors combined with another ErbB receptor, such as ErbB3, ErbB4 or EGFR (ErbB1). Other proteins, such as a cytokine receptor subunit (e.g. gp130) may be included in the hetero-oligomer.

Med "ligandaktivering av en ErbB-reseptor" menes signaloverføring (f. eks. den forårsaket av et intracellulært kinasedomene i en ErbB-reseptor som fosforylerer tyrosinrester i ErtB-reseptoren eller et substrat polypeptid) formidlet av en ErbB-ligand som bindes til en ErbB-hetero-oligomer som omfatter ErbB-reseptoren av interesse. Vanligvis vil dette involvere binding av en ErbB-ligand til en ErbB-hetero-oligomer, som aktivierer et kinasedomene i én eller flere av ErbB-reseptorene i hetero-oligomeren og derved gi fosforylering av tyrosinrester i én eller flere av ErbB-reseptorene og/eller fosforylering av tyrosinrester i ytterligere substratpolypeptid(er). ErbB-reseptoraktivering kan kvantifiseres ved anvendelse av forskjellige tyrosinfosforylerings analyser. By "ligand activation of an ErbB receptor" is meant signal transduction (eg, that caused by an intracellular kinase domain of an ErbB receptor that phosphorylates tyrosine residues of the ErtB receptor or a substrate polypeptide) mediated by an ErbB ligand binding to an ErbB -hetero-oligomers comprising the ErbB receptor of interest. Typically, this will involve binding of an ErbB ligand to an ErbB hetero-oligomer, which activates a kinase domain in one or more of the ErbB receptors in the hetero-oligomer and thereby results in phosphorylation of tyrosine residues in one or more of the ErbB receptors and/ or phosphorylation of tyrosine residues in additional substrate polypeptide(s). ErbB receptor activation can be quantified using various tyrosine phosphorylation assays.

Et polypeptid med "nativ sekvens" er et polypeptid som har samme aminosyresekvens som et polypeptid (f. eks. en ErbB-reseptor eller ErbB-ligand) som stammer fra naturen. Slike polypeptider med nativ sekvens kan isoleres fra naturen eller fremstilles ved rekombinante eller syntetiske midler. Således kan et polypeptid med nativ sekvens ha aminosyresekvensen til det naturlig forekommende humane polypeptid, muse polypeptid eller polypeptid fra enhver annen pattedyrs art. A "native sequence" polypeptide is a polypeptide that has the same amino acid sequence as a naturally occurring polypeptide (eg, an ErbB receptor or ErbB ligand). Such native sequence polypeptides can be isolated from nature or produced by recombinant or synthetic means. Thus, a native sequence polypeptide may have the amino acid sequence of the naturally occurring human polypeptide, mouse polypeptide, or polypeptide from any other mammalian species.

Begrepet "aminosyresekvens variant" viser til polypeptider med aminosyresekvenser som i en viss grad avviker fra polypeptidets native sekvens. Vanligvis vil aminosyresekvens varianter vise minst omtrent 70 % homologi med minst et reseptorbindende domene fra en nativ ErbB-ligand eller minst et ligandbindende domene fra en nativ ErbB-reseptor, og vil fortrinnsvis viste minst omtrent 80%, mer foretrukket minst omtrent 90% homologi med et slikt reseptor- eller ligandbindende domene. Aminosyresekvens variantene innehar substitusjoner, delesjoner og/eller insersjoner i visse posisjoner i den native aminosyresekvensen. The term "amino acid sequence variant" refers to polypeptides with amino acid sequences that deviate to some extent from the polypeptide's native sequence. Typically, amino acid sequence variants will show at least about 70% homology with at least one receptor-binding domain from a native ErbB ligand or at least one ligand-binding domain from a native ErbB receptor, and will preferably show at least about 80%, more preferably at least about 90% homology with such a receptor or ligand binding domain. The amino acid sequence variants contain substitutions, deletions and/or insertions in certain positions in the native amino acid sequence.

"Homologi" er definert som prosentandelen aminosyrerester i aminosyresekvens varianten som er identiske med utgangssekvensen etter sammenstilling av sekvensene og om nødvendig innføring av hull for å oppnå den maksimale prosenthomologi. Fremgangsmåter og datamaskinprogrammer for sammenstillingen er vel kjente innen faget. Et slik datamaskin program er "Align 2", forfattet av Genentech, Inc., som ble innlevert med brukerveiledning hos United States Copyright Office, Washington, DC 230559 den 10. desember 1991. "Homology" is defined as the percentage of amino acid residues in the amino acid sequence variant that are identical to the starting sequence after assembly of the sequences and, if necessary, the introduction of gaps to achieve the maximum percentage homology. Methods and computer programs for the assembly are well known in the art. One such computer program is "Align 2", authored by Genentech, Inc., which was filed with the user manual in the United States Copyright Office, Washington, DC 230559 on December 10, 1991.

Begrepet "antistoff" anvendes her i den bredeste betydning og omfatter spesifikt intakte, monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer, flerspesifikke antistoffer (f. eks. bispesifikke antistoffer) dannet fra minst to intakte antistoffer, og antistoff-fragmenter, så lenge som disse viser den ønskede biologiske aktivitet. The term "antibody" is used here in the broadest sense and includes specifically intact, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g. bispecific antibodies) formed from at least two intact antibodies, and antibody fragments, as long as these show the desired biological activity.

Begrepet "monoklonalt antistoff" som anvendt her viser til et antistoff fremskaffet fra en populasjon av i det vesentlige homogene antistoffer, dvs. at de enkelte antistoffer som utgjør populasjonen er identiske bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke og er rettet mot et enkelt antigent sete. I motsetning til polyklonale antistoff preparater, som omfatter forskjellige antistoffer rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er videre hvert monoklonale antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet. I tillegg til deres spesifisitet er de monoklonale antistoffene fordelaktige ved at de kan syntetiseres uten å være forurenset av andre antistoffer. Adjektivet "monoklonalt" indikerer antistoffets egenskaper som blir oppnådd fra en vesentlig homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke tolkes på en slik måte at det krever fremstilling av antistoffet ved en bestemt fremgangsmåte. De monoklonale antistoffene som skal anvendes i samsvar med forliggende oppfinnelse kan for eksempel være fremstilt ved hybridom fremgangsmåten, først beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), eller kan være laget ved rekombinant DNA-fremgangsmåter (se f. eks. US patentskrift nr. 4 816 567). De "monoklonale antistoffene" kan også være isolert fra bakteriofag antistoff biblioteker ved anvendelse av teknikkene beskrevet for eksempel i Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 The term "monoclonal antibody" as used here refers to an antibody obtained from a population of essentially homogeneous antibodies, i.e. that the individual antibodies that make up the population are identical apart from possible naturally occurring mutations that may be present in smaller quantities. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigenic site. In contrast to polyclonal antibody preparations, which comprise different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is further directed against a single determinant on the antigen. In addition to their specificity, the monoclonal antibodies are advantageous in that they can be synthesized without being contaminated by other antibodies. The adjective "monoclonal" indicates the properties of the antibody which are obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and should not be interpreted in such a way as to require the production of the antibody by a specific method. The monoclonal antibodies to be used in accordance with the present invention can, for example, be produced by the hybridoma method, first described by Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), or can be made by recombinant DNA methods (see e.g. e.g. US Patent No. 4,816,567). The "monoclonal antibodies" can also be isolated from bacteriophage antibody libraries using the techniques described, for example, in Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597

(1991). (1991).

De monoklonale antistoffene her inkluderer spesifikt "kimære" antistoffer, i hvilke en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en bestemt art eller tilhørende en bestemt antistoffklasse eller underklasse, mens resten av kjeden(e) er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en annen art eller tilhørende en annen antistoffklasse eller underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge som de utviser den ønskede biologiske aktiviteten (US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). Kimære antistoffer av interesse her omfatter "primatiserte" antistoffer, som omfatter antigen-bindende sekvenser i det variable domenet som er avledet fra en ikke-human primat (f. eks. Østaper, aper osv.) og humane konstant region sekvenser. The monoclonal antibodies herein specifically include "chimeric" antibodies, in which a portion of the heavy and/or light chain is identical or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remainder of the chain (e) is identical to or homologous to corresponding sequences in antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass, as well as fragments of such antibodies, so long as they exhibit the desired biological activity (US Patent No. 4,816 567 and Morrison et al., Proe. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Chimeric antibodies of interest herein include "primatized" antibodies, which comprise antigen-binding sequences in the variable domain derived from a non-human primate (eg, great ape, monkey, etc.) and human constant region sequences.

"Antistoff fragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, fortrinnsvis omfattes det antigenbindende eller variable området derav. Eksempler på antistoff fragmenter inkluderer Fab-, Fab'-, F(ab')2- og Fv-fragmenter, diastoffer, lineære antistoffer, enkeltkjedede antistoff-molekyler og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoff fragment(er). "Antibody fragments" comprise part of an intact antibody, preferably the antigen-binding or variable region thereof. Examples of antibody fragments include Fab, Fab', F(ab')2 and Fv fragments, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules and multispecific antibodies formed from antibody fragment(s).

Et "intakt" antistoff er ett som omfatter et antigen-bindende variabelt område, så vel som et lett kjede konstant domene (CL) og tung kjede konstante domenene CH1, CH2 og CH3. De konstante domenene kan være nativ sekvens konstante domener (f.eks. humane nativ sekvens konstante domener) eller aminosyresekvens varianter av disse. Fortrinnsvis har det intakte antistoffet én eller flere effektorfunksjoner. An "intact" antibody is one that comprises an antigen-binding variable region as well as a light chain constant domain (CL) and heavy chain constant domains CH1, CH2 and CH3. The constant domains can be native sequence constant domains (eg human native sequence constant domains) or amino acid sequence variants thereof. Preferably, the intact antibody has one or more effector functions.

Antistoff "effektorfunksjoner" refererer til de biologiske aktivitetene som kan tilskrives Fc-området (en nativ sekvens Fc-område eller en aminosyresekvens variant Fc-område) i et antistoff. Eksempler på antistoff effektorfunksjoner inkluderer Clq-binding, komplementavhengig cytotoksisitet, Fc-reseptorbinding, antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflate reseptorer (f. eks. B-celle reseptor, BCR) osv. Antibody "effector functions" refer to the biological activities attributable to the Fc region (a native sequence Fc region or an amino acid sequence variant Fc region) of an antibody. Examples of antibody effector functions include Clq binding, complement-dependent cytotoxicity, Fc receptor binding, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, downregulation of cell surface receptors (eg, B-cell receptor, BCR), etc.

Avhengig av aminosyresekvensen til det konstante domenet i deres tunge kjeder kan intakte antistoffer tilordnes til forskjellige "klasser". Det er fem hovedklasser av intakte antistoffer: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan også inndeles videre i "underklasser" (isotyper), f. eks. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA og IgA2. De tunge kjedenes konstante domener som korresponderer til de forskjellige klassene av antistoffer betegnes henholdsvis a, 8, e, y og \ i. Subenhet-strukturene og den tredimensjonale konfigurasjonen av forskjellige klasser av iummunglobuliner er velkjent. Depending on the amino acid sequence of the constant domain of their heavy chains, intact antibodies can be assigned to different "classes". There are five main classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM and several of these can also be further divided into "subclasses" (isotypes), e.g. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of antibodies are designated a, 8, e, y, and \i, respectively. The subunit structures and three-dimensional configuration of different classes of immunoglobulins are well known.

"Antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet" og "ADCC" viser til en cellemediert reaksjon hvor uspesifikke, cytotoksiske celler som uttrykker Fc-reseptorer (FcR) (f. eks. "Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity" and "ADCC" refer to a cell-mediated reaction in which non-specific, cytotoxic cells expressing Fc receptors (FcR) (e.g.

naturlige dreper-(NK)-celler, neutrofile celler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff på en målcelle og deretter forårsaker lysis av målcellen. De primære cellene for mediering av ADCC, NK-celler, uttrykker bare FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII. FcR-ekspresjon på hematopoetiske celler er oppsummert i Tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). For å anslå ADCC-aktivitet av et molekyl av interesse kan en in wtro-ADCC-analyse, slik som den beskrevet i US patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337 utføres. Anvendbare effektorceller for slike analyser inkluderer mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og naturlige dreper-(NK)-celler. Alternativt eller i tillegg kan ADCC-aktivitet av molekylet av interesse anslås in vivo, f. eks. i en dyremodell slik som den som beskrives i Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998). natural killer (NK) cells, neutrophils and macrophages) recognize bound antibody on a target cell and then cause lysis of the target cell. The primary cells for mediating ADCC, NK cells, express only FcγRIII, whereas monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Fox. Immunol., 9:457-92 (1991). To estimate ADCC activity of a molecule of interest, an in vitro ADCC assay such as that described in US Patent Nos. 5,500,362 or 5,821,337 can be performed. Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively or additionally, ADCC activity of the molecule of interest can be assessed in vivo, e.g. in an animal model such as that described in Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

"Humane effektorceller" er leukocytter som uttrykker én eller flere FcRer og utfører effektorfunksjoner. Fortrinnsvis uttrykker cellene minst FcyRIII og utfører ADCC-effektorfunksjonen. Eksempler på humane leukocytter som medierer ADCC inkluderer mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), naturlige dreper-(NK)-celler, monocytter, cytotoksiske T-celler og neutrofile celler, med PBMC og NK-celler som foretrukne. Effektorcellene kan isoleres fra en nativ kilde, f.eks. fra blod eller PBMC som beskrevet her. "Human effector cells" are leukocytes that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcγRIII and perform the ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils, with PBMC and NK cells being preferred. The effector cells can be isolated from a native source, e.g. from blood or PBMC as described here.

Begrepene "Fc-reseptor" eller "FcR" anvendes for å beskrive en reseptor som bindes til Fc-område på et antistoff. Den foretrukne FcR er en human FcR med nativ sekvens. Videre er en foretrukket FcR én som binder et IgG-antistoff (en gamma-reseptor) og inkluderer reseptorer fra FcyRI, FcyRII og FcyRIII underklassene, inkludert alleliske varianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. FcyRII-reseptorer inkluderer FcyRIIA (en "aktiverende reseptor") og FcyRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har liknende aminosyresekvenser som skiller seg hovedsakelig i de cytoplasmatiske domener derav. Aktiverende reseptor FcyRIIA inneholder et immunreseptor tyrosin-basert aktiveringsmotiv (ITAM) i sitt cytoplasmatiske domene. Inhiberende reseptor FcyRIIB inneholder et immunreseptor tyrosin-basert inhiberingsmotiv (ITIM) i sitt cytoplasmatiske domene. (Se gjennomgang M. i Daéron, Anu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcR er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 The terms "Fc receptor" or "FcR" are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody. The preferred FcR is a native sequence human FcR. Furthermore, a preferred FcR is one that binds an IgG antibody (a gamma receptor) and includes receptors from the FcγRI, FcγRII and FcγRIII subclasses, including allelic variants and alternatively spliced forms of these receptors. FcγRII receptors include FcγRIIA (an "activating receptor") and FcγRIIB (an "inhibitory receptor"), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains. Activating receptor FcγRIIA contains an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. Inhibitory receptor FcγRIIB contains an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) in its cytoplasmic domain. (See review M. in Daéron, Anu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). FcR is reviewed in Ravetch and Kinet, Annu. Fox. Immunol., 9:457-92

(1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Andre FcR, inkludert de som vil bli påvist i fremtiden, omfattes av begrepet "FcR" her. Begrepet inkluderer også den neonatale reseptor, FcRn, som er ansvarlig for overføringen av maternale IgG til fosteret (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) og Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). "Komplementavhengig cytotoksisitet" eller "CDC" referer til et molekyls evne til å lysere et mål i nærvær av komplement. Komplementaktiveringsveien initieres ved binding av den første komponenten av komplementsystemet (Clq) til et molekyl (f. eks. et antistoff) i kompleks med et beslektet antigen. For måling av komplementaktivering kan en CDC-analyse, f. eks. som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) utføres. "Native antistoffer" er vanligvis hete rotet ra me ri ske glykoproteiner på omtrent 150 000 dalton sammensatt av to identiske lette kjeder (L) og to identiske tunge kjeder (H). Hver lette kjede er bundet til en tung kjede via én kovalent disulfid binding, mens antall disulfidbindinger varierer mellom tunge kjeder fra forskjellige immunglobulin-isotyper. Hver tunge og lette kjede har også intrakjede-disulfid broer plassert med jevne mellomrom. Hver tunge kjede har i én ende et variabelt domene (VH), fulgt av et antall konstante domener. Hver lette kjede har et variabelt domene i én ende (VL) og et konstant domene i sin andre ende. Det konstante domet til den lette kjeden er sammenstilt med det første konstante domenet i den tunge kjeden, og den lette kjedens variable domene er sammenstilt med den tunge kjedens variable domene. Spesielle aminosyrerester antas å danne en interfase mellom den lette kjedens og den tunge kjedens variable domener. Begrepet "variabelt" refererer til det faktum av visse deler av de variable domenene varierer i stor utstrekning blant antistoffer og anvendes i bindingen og spesifisiteten av hvert antistoff for dets spesielle antigen. Variabiliteten er imidlertid ikke jevnt fordelt over antistoffenes variable domener. Den er konsentrert i tre segmenter som betegnes hypervariable områder, både i den lette kjedens og den tunge kjedens variable domener. De mer høyt konserverte delene av de variable domener betegnes rammeverksområder (FR). De variable domener i native tunge og lette kjeder omfatter hver fire FRer, som hovedsakelig inntar en p-platekonfigurasjon, forbundet ved hjelp av tre hypervariable områder som danner løkker som forbinder og i noen tilfeller utgjør en del av p-platestrukturen. De hypervariable områdene i hver kjede holdes sammen i umiddelbar nærhet av FRene og, sammen med de hypervariable områder fra den andre kjeden, bidrar til dannelse av det antigenbindende sete til antistoffet (se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). De konstante domenene er ikke direkte involverti binding av et antistoff til et antigen, men viser forskjellige effektorfunksjoner, slik som deltagelse av antistoffet i antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Other FcRs, including those that will be identified in the future, are encompassed by the term "FcR" herein. The term also includes the neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 ( 1994)). "Complement-dependent cytotoxicity" or "CDC" refers to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement. The complement activation pathway is initiated by binding of the first component of the complement system (Clq) to a molecule (eg an antibody) in complex with a cognate antigen. For measuring complement activation, a CDC analysis, e.g. as described in Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) is performed. "Native antibodies" are usually warm-rooted framework glycoproteins of approximately 150,000 daltons composed of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H). Each light chain is linked to a heavy chain via one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds varies between heavy chains from different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has intrachain disulfide bridges placed at regular intervals. Each heavy chain has at one end a variable domain (VH), followed by a number of constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at its other end. The constant domain of the light chain is mapped to the first constant domain of the heavy chain, and the variable domain of the light chain is mapped to the variable domain of the heavy chain. Special amino acid residues are thought to form an interphase between the light chain and heavy chain variable domains. The term "variable" refers to the fact that certain portions of the variable domains vary widely among antibodies and are used in the binding and specificity of each antibody for its particular antigen. However, the variability is not evenly distributed over the antibodies' variable domains. It is concentrated in three segments termed hypervariable regions, in both the light chain and heavy chain variable domains. The more highly conserved parts of the variable domains are called framework regions (FR). The variable domains in native heavy and light chains each comprise four FRs, which predominantly occupy a β-sheet configuration, connected by three hypervariable regions that form loops that connect and in some cases form part of the β-sheet structure. The hypervariable regions in each chain are held together in close proximity by the FRs and, together with the hypervariable regions from the other chain, contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody (see Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)). The constant domains are not directly involved in the binding of an antibody to an antigen, but show different effector functions, such as participation of the antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity

(ADCC). (ADCC).

Begrepet "hypervariabelt område" refererer, når det anvendes her, til aminosyrerestene i et antistoff som er ansvarlige for antigen-bindingen. Det hypervariable området omfatter generelt aminosyrerester fra et "komplementaritetsbestemmende område" eller "CDR" (f. eks. aminosyrerestene 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i den lette kjedens variable domene og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i den tunge kjedens variable domene, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller aminosyrerester fra en "hypervariabel løkke" (f. eks. aminosyrerestene 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i den lette kjedens variable domene og 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i den tunge kjedens variable domene, Chothia og Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). "Rammeverksområde"- eller "RF"-aminosyrerester er de aminosyrerestene i det variable domenet som ikke er aminosyrerester i et hypervariabelt område som definert her. The term "hypervariable region" as used herein refers to the amino acid residues in an antibody that are responsible for antigen binding. The hypervariable region generally comprises amino acid residues from a "complementarity determining region" or "CDR" (eg, amino acid residues 24-34 (LI), 50-56 (L2), and 89-97 (L3) of the light chain variable domain and 31 -35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health , Bethesda, MD (1991)) and/or amino acid residues from a "hypervariable loop" (eg amino acid residues 26-32 (LI), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) of the light chain variable domain and 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the heavy chain variable domain, Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)). "Framework region" or "RF" amino acid residues are those amino acid residues in the variable domain that are not amino acid residues in a hypervariable region as defined herein.

Papainspalting av antistoffer gir to identiske antigenbindende fragmenter som betegnes "Fab"-fragmenter, hver med et enkelt antigenbindende sete, og et gjenværende "Fc"-fragment, hvis navn gjenspeiler dets evner til lett å krystallisere. Pepsinbehandling giret F(ab')2-fragment med to antigenbindende seter som fortsatt er i stand til å kryssbinde antigen. Papain cleavage of antibodies yields two identical antigen-binding fragments termed "Fab" fragments, each with a single antigen-binding site, and a residual "Fc" fragment, whose name reflects its ability to readily crystallize. Pepsin treatment yielded F(ab')2 fragment with two antigen-binding sites still capable of cross-linking antigen.

"Fv" er det minste antistoff-fragmentet som inneholder et fullstendig antigen gjenkjennings- og antigen bindingssete. Dette området består av en dimer av ett tung kjede og ett lett kjede variabelt domene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfigurasjonen at de tre hypervariable områdene i hvert av de variable domenene interagerer for å definere et antigen bindingssete på overflaten av VH-VL-dimeren. Samlet gir de hypervariable områdene antistoffet dets antigenbindende spesifisitet. Selv et enkelt variabelt domene (eller halvparten av et Fv som omfatter kun tre hypervariable områder spesifikt for et antigen) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigen, om enn med lavere affinitet enn det hele bindingssetet. "Fv" is the smallest antibody fragment that contains a complete antigen recognition and antigen binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain and one light chain variable domain in tight, non-covalent association. It is in this configuration that the three hypervariable regions in each of the variable domains interact to define an antigen binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the hypervariable regions give the antibody its antigen-binding specificity. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three hypervariable regions specific for an antigen) has the ability to recognize and bind antigen, albeit with lower affinity than the entire binding site.

Fab-fragmentet inneholder også den lette kjedens konstante domene og det første konstante domenet (CH1) fra den tunge kjeden. Fab'-fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved addesjon av noen få aminosyrerester i karboksyenden av den tunge kjedens CHl-domene, inkludert én eller flere cystinrester fra antistoffets hengselområde. Fab'-SH er her betegnelsen på Fab' hvor cyste in reste n(e) i de konstante domener bærer minst én fri tiolgruppe. F(ab')2-antistoff fragmenter ble opprinnelig fremstilt som par av Fab'-fragmenter som har hengsel cysteiner mellom seg. Andre kjemiske sammen-koblinger av antistoff fragmenter er også kjente. The Fab fragment also contains the light chain constant domain and the first constant domain (CH1) from the heavy chain. Fab' fragments differ from Fab fragments by the addition of a few amino acid residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain, including one or more cystine residues from the hinge region of the antibody. Fab'-SH is here the term for Fab' where cyste in reste n(e) in the constant domains carry at least one free thiol group. F(ab')2-antibody fragments were originally prepared as pairs of Fab' fragments that have hinge cysteines between them. Other chemical linkages of antibody fragments are also known.

De "lette kjedene" av antistoffer fra alle virveldyr arter kan tildeles til én av to klart forskjellige typer betegnet kappa (k) og lambda ( k), basert på aminosyresekven i deres konstante domener. The "light chains" of antibodies from all vertebrate species can be assigned to one of two distinct types designated kappa (k) and lambda (k), based on the amino acid sequence of their constant domains.

"Enkeltkjedede Fv" eller "scFv"-antistoff fragmenter omfatter VH- og VL-domene til antistoff, hvor disse domener foreligger i en enkelt polypeptid-kjede. Fv-polypeptidet omfatter videre fortrinnsvis en polypeptid linker mellom VH- og VL-domenet som gjør scFv-molekylet istand til å danne den ønskede struktur for antigenbinding. For en gjennomgang av scFv se Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, bind 113, Rosenburg og Morre, red., Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994). Anti-ErbB2-antistoff scFv-fragmenter er beskrevet i WO 93/16185, US patentskrift nr. "Single-chain Fv" or "scFv" antibody fragments comprise the VH and VL domains of the antibody, where these domains are present in a single polypeptide chain. The Fv polypeptide further preferably comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains which enables the scFv molecule to form the desired structure for antigen binding. For a review of scFv see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Volume 113, Rosenburg and Morre, Eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). Anti-ErbB2 antibody scFv fragments are described in WO 93/16185, US Patent No.

5 571 894 og US patentskrift nr. 5 587 458. 5,571,894 and US Patent No. 5,587,458.

Begrepet "diastoffer" viser til små antistoff fragmenter med to antigenbindende seter, hvor fragmentene omfatter et variabelt tung kjede domene (VH) bundet til et variabelt lett kjede domene (VL) i samme polypeptid kjede (VH - VL). Ved å anvende en linker som er for kort til å tillatte parring at de to domener i samme kjede, tvinges domenene til å danne par med de komplementære domener i en annen kjede og skape to antigen bindingsseter. Diastoffer beskrives i mer detalj i for eksempel EP 404 097, WO 93/11161 og Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 90:6444-6448 (1993). The term "diasubstance" refers to small antibody fragments with two antigen-binding sites, where the fragments comprise a variable heavy chain domain (VH) bound to a variable light chain domain (VL) in the same polypeptide chain (VH - VL). By using a linker that is too short to allow pairing of the two domains in the same chain, the domains are forced to pair with the complementary domains in another chain and create two antigen binding sites. Diastoffers are described in more detail in, for example, EP 404 097, WO 93/11161 and Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA. 90:6444-6448 (1993).

"Humaniserte" former av ikke-humane (f. eks. gnager) antistoffer er kimære antistoffer som inneholderen minimal sekvens avledet fra ikke-humant immunglobulin. I største delen er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottaker antistoffer) hvor aminosyrerester fra et hyperva ria belt område i mottagermolekylet er erstattet med aminosyrerester fra et hyperva ria belt område fra en ikke-human art (donor antistoff), slik som mus, rotte, kanin eller ikke-human primat, som har den ønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller er aminosyrerester i rammeverksområdet (FR) i det humane immunglobulin erstattet med tilsvarende ikke-humane aminosyrerester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte aminosyrerester som verken finnes i mottager-antistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene er gjort for ytterligere å forbedre antistoffets yteevne. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte i det vesentlige alt av minst ett og typisk to variable domener, i hvilke alle eller i det vesentlige alle av de hypervariable løkkene tilsvarer løkkene i et ikke-humant immunglobulin og alle eller i det vesentlige alle FRene er de fra en human immunglobulin-sekvens. Det humaniserte antistoffet vil om ønskelig også omfatte minst en del av et immunglobulin konstant område (Fc), typisk det fra et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer se Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). "Humanized" forms of non-human (eg, rodent) antibodies are chimeric antibodies that contain a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies) where amino acid residues from a hypervariable region in the recipient molecule are replaced with amino acid residues from a hypervariable region from a non-human species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, which has the desired specificity, affinity and capacity. In some cases, amino acid residues in the framework region (FR) of the human immunoglobulin are replaced with corresponding non-human amino acid residues. Furthermore, humanized antibodies may comprise amino acid residues that are neither found in the recipient antibody nor in the donor antibody. These modifications have been made to further improve the antibody's performance. In general, the humanized antibody will comprise substantially all of at least one and typically two variable domains, in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to the loops of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FRs are those of a human immunoglobulin sequence. If desired, the humanized antibody will also comprise at least part of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that from a human immunoglobulin. For further details see Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).

Humaniserte anti-ErbB2-antistoffer inkluderer huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 og huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") som beskrevet i Tabell 3 i US patentskrift nr. 5 821 337, humanisert 520C9 (WO 93/21319) og humaniserte 2C4-antistoffer som beskrevet her nedenfor. Humanized anti-ErbB2 antibodies include huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 and huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") as described in Table 3 of US Patent No. 5,821,337, humanized 520C9 (WO 93/21319) and humanized 2C4 antibodies as described hereinbelow.

Et "isolert" antistoff er ett som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en bestanddel av sitt naturlige miljø. Kontaminerende bestanddeler fra dets naturlige miljø er materialer som ville interferere med diagnostisk eller terapeutisk anvendelse av antistoffet og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteinøse eller ikke proteinøse løste stoffer. I foretrukne utførelser vil antistoffet være renset (1) til mer enn 95 % (vekt/vekt) antistoff som bestemt ved Lowry-fremgangsmåten, og mest foretrukket til mer enn 99 % (vekt/vekt), (2) i en grad som er tilstrekkelig til å oppnå minst 15 aminosyrerester fra N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av en spinnkopp-sekvensator, eller (3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av Coomassie blue eller, fortrinnsvis, sølvfarging. Isolert antistoff inkluderer antistoffet in situ inne i rekombinante celler, siden minst én bestanddel av antistoffets naturlige miljø ikke vil være tilstede. Vanligvis vil imidlertid isolert antistoff fremstilles ved minst ett renset trinn. An "isolated" antibody is one that has been identified and separated and/or recovered from a component of its natural environment. Contaminants from its natural environment are materials that would interfere with the diagnostic or therapeutic use of the antibody and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In preferred embodiments, the antibody will be purified (1) to greater than 95% (w/w) antibody as determined by the Lowry method, and most preferably to greater than 99% (w/w), (2) to a degree that is sufficient to obtain at least 15 amino acid residues from the N-terminal or internal amino acid sequence using a spinning cup sequencer, or (3) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue or, preferably, silver staining. Isolated antibody includes the antibody in situ inside recombinant cells, since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Usually, however, isolated antibody will be prepared by at least one purified step.

Et antistoff "som binder" et antigen av interesse, for eksempel ErbB2-antigen, er ett som er istand til å binde det antigenet med tilstrekkelig affinitet slik at antistoffet er anvendbart for målstyring til en celle som uttrykker antigenet. Dersom antistoffet er ett som binder ErbB2 vil det vanligvis fortrinnvis binde ErbB2 i motsetning til andre ErbB-reseptorer, og kan være ett som ikke i vesentlig grad kryssreagerer med andre proteiner slik som EGFR, ErbB3 eller ErbB4. I slike utførelser vil graden av binding av antistoffet til disse ikke-ErbB2-proteinene (f. eks. binding til endogen reseptor på celleoverflaten) være mindre enn 10 %, som bestemt ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-analyse eller radioimmunpresipitering (RIA). Noen ganger vil anti-ErbB2-antistoffet ikke i vesentlig grad kryssreagere med neu-proteinet fra rotte, f. eks. som beskrevet i Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) og Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984). An antibody that "binds" an antigen of interest, such as ErbB2 antigen, is one that is capable of binding that antigen with sufficient affinity such that the antibody is useful for targeting to a cell expressing the antigen. If the antibody is one that binds ErbB2, it will usually preferentially bind ErbB2 in contrast to other ErbB receptors, and may be one that does not significantly cross-react with other proteins such as EGFR, ErbB3 or ErbB4. In such embodiments, the degree of binding of the antibody to these non-ErbB2 proteins (eg, binding to endogenous receptor on the cell surface) will be less than 10%, as determined by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis or radioimmunoprecipitation (RIA). Sometimes the anti-ErbB2 antibody will not significantly cross-react with the rat neu protein, e.g. as described in Schecter et al., Nature, 312:513 (1984) and Drebin et al., Nature, 312:545-548 (1984).

Et antistoff som "blokkerer" ligandaktivering av en ErbB-reseptor er ett som reduserer eller forhindrer slik aktivering som definert her ovenfor, hvor antistoffet er istand til å blokkere ligandaktivering av ErbB-reseptoren vesentlig mer effektivt enn det monoklonale antistoff 4D5, f. eks. omtrent like effektivt som de monoklonale antistoffene 7F3 eller 2C4 eller Fab-fragmenter av disse, og fortrinnsvis omtrent like effektivt som det monoklonale antistoff 2C4 eller et Fab-fragment derav. Antistoffet som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor kan for eksempel være ett som er omtrent 50-100 % mer effektivt enn 4D5 til å blokkere dannelsen av en ErbB-hetero-oligomer. Blokkering av ligandaktivering av en ErbB-reseptor kan skje på hvilke som helst måte, f.eks. ved å forstyrre: ligandbinding til en ErbB-reseptor, ErbB-kompleksdannelse, tyrosinkinase aktivitet av en ErbB-reseptor i et ErbB-kompleks og/eller fosforylering av tyrosin kinase rest(er) i eller ved en ErbB-reseptor. Eksempler på antistoffer som blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor inkluderer de monoklonale antistoffene 2C4 og 7F3 (som blokkerer HRG-aktivering av ErbB2/ErbB3- og ErbB2/ErbB4-hetero-oligomerer, og EGF-, TGF-a, amfiregulin, HB-EGF og/eller epiregulinaktivering av en EGFR/ErbB2-hetero-oligomer), og L26, L96 og L288 antistoffene (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)) som blokkerer EGF- og NDF-binding til T47D-celler som uttrykker EGFR, ErbB2, ErbB3 og ErbB4. An antibody that "blocks" ligand activation of an ErbB receptor is one that reduces or prevents such activation as defined herein above, where the antibody is able to block ligand activation of the ErbB receptor substantially more effectively than the monoclonal antibody 4D5, e.g. about as effective as the monoclonal antibodies 7F3 or 2C4 or Fab fragments thereof, and preferably about as effective as the monoclonal antibody 2C4 or a Fab fragment thereof. For example, the antibody that blocks ligand activation of an ErbB receptor may be one that is approximately 50-100% more effective than 4D5 at blocking the formation of an ErbB hetero-oligomer. Blocking ligand activation of an ErbB receptor can occur in any number of ways, e.g. by interfering with: ligand binding to an ErbB receptor, ErbB complex formation, tyrosine kinase activity of an ErbB receptor in an ErbB complex and/or phosphorylation of tyrosine kinase residue(s) in or at an ErbB receptor. Examples of antibodies that block ligand activation of an ErbB receptor include the monoclonal antibodies 2C4 and 7F3 (which block HRG activation of ErbB2/ErbB3 and ErbB2/ErbB4 hetero-oligomers, and EGF, TGF-α, amphiregulin, HB- EGF and/or epiregulin activation by an EGFR/ErbB2 hetero-oligomer), and the L26, L96 and L288 antibodies (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109 (1997)) which block EGF and NDF binding to T47D -cells expressing EGFR, ErbB2, ErbB3 and ErbB4.

Et antistoff som har en "biologisk egenskap" til et angitt antistoff, slik som det monoklonale antistoff som betegnes 2C4 er ett som besitter én eller flere av de biologiske egenskaper til dette antistoffet som skiller det fra andre antistoffer som binder til det samme antigenet (f. eks. ErbB2). For eksempel kan et antistoff med en biologisk egenskap til 2C4 blokkere HRG-aktivering av en ErbB-hetero-oligomer som omfatter ErbB2 og ErbB3, ErbBl eller ErbB4, blokkere EGF-, TGF-a-, HB-EGF-, epiregulin- og/eller amfiregulin aktivering av en ErbB-reseptor som omfatter EGFR og ErbB2, blokkere EGF-, TGF-a- og/eller HRG-mediert aktivering av MAPK, og/eller binde den samme epitopen i det ekstracellulære domenet av ErbB2 som det som bindes av 2C4 (f.eks. som blokkerer binding av det monoklonale antistoff 2C4 til ErbB2). An antibody that has a "biological property" of a given antibody, such as the monoclonal antibody designated 2C4, is one that possesses one or more of the biological properties of that antibody that distinguish it from other antibodies that bind to the same antigen (f .eg ErbB2). For example, an antibody with a biological property of 2C4 can block HRG activation of an ErbB hetero-oligomer comprising ErbB2 and ErbB3, ErbB1 or ErbB4, block EGF-, TGF-α, HB-EGF, epiregulin- and/or or amphiregulin activation of an ErbB receptor comprising EGFR and ErbB2, block EGF-, TGF-α and/or HRG-mediated activation of MAPK, and/or bind the same epitope in the extracellular domain of ErbB2 as that bound by 2C4 (eg, which blocks binding of the monoclonal antibody 2C4 to ErbB2).

Dersom ikke annet er angitt refererer uttrykket "det monoklonale antistoff 2C4" til et antistoff som har antigenbindende aminosyrerester fra eller avledet fra muse antistoffet 2C4 i eksemplene nedenfor. Det monoklonale antistoff 2C4 kan for eksempel være det monoklonale muse antistoff 2C4 eller en variant derav, slik som det humaniserte antistoff 2C4, som besitter antigenbindende aminosyrerester fra det monoklonale muse antistoff 2C4. Eksempler på humaniserte 2C4-antistoffer gis her og i WO 01/00245. Dersom ikke annet er angitt viser uttrykket "rhuMAb 2C4" ved anvendelse her til et antistoff som omfatter de variable lett kjede (VL)- og variable tung kjede (VH)-sekvenser ifølge SEKV. ID. Nr. 3 henholdsvis 4, fusjonert til humane lett og tung IgGl (ikke-A-allotype) konstant område sekvenser, om ønskelig uttrykt i en Kinesisk hamster ovarie-celle (CHO)-celle. Unless otherwise stated, the term "the monoclonal antibody 2C4" refers to an antibody that has antigen-binding amino acid residues from or derived from the mouse antibody 2C4 in the examples below. The monoclonal antibody 2C4 can, for example, be the monoclonal mouse antibody 2C4 or a variant thereof, such as the humanized antibody 2C4, which possesses antigen-binding amino acid residues from the monoclonal mouse antibody 2C4. Examples of humanized 2C4 antibodies are given here and in WO 01/00245. Unless otherwise stated, the term "rhuMAb 2C4" when used herein refers to an antibody comprising the variable light chain (VL) and variable heavy chain (VH) sequences according to SEQV. ID. No. 3 and 4 respectively, fused to human light and heavy IgG1 (non-A allotype) constant region sequences, if desired expressed in a Chinese hamster ovary (CHO) cell.

Dersom ikke annet er angitt viser uttrykket "det monoklonale antistoff 4D5" til et antistoff med antigenbindende aminosyrerester fra eller avledet fra muse antistoffet 4D5 (ATCC CRL 10463). Det monoklonale antistoff 4D5 kan for eksempel bære det monoklonale muse antistoff 4D5 eller en variant derav, for eksempel et humanisert 4D5, som besitter antigenbindende aminosyrerester fra det monoklonale muse antistoff 4D5. Eksempler på humaniserte 4D5-antistoffer omfatter huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 og huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") som i US patentskrift nr. 5 821 337 hvor huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") er et foretrukket humanisert 4D5-antistoff. Unless otherwise stated, the term "the monoclonal antibody 4D5" refers to an antibody with antigen-binding amino acid residues from or derived from the mouse antibody 4D5 (ATCC CRL 10463). The monoclonal antibody 4D5 can, for example, carry the monoclonal mouse antibody 4D5 or a variant thereof, for example a humanized 4D5, which possesses antigen-binding amino acid residues from the monoclonal mouse antibody 4D5. Examples of humanized 4D5 antibodies include huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 and huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") as in US Patent No. 5,821,337 wherein huMAb4D5-8 ("HERCEPTIN®") is a preferred humanized 4D5 antibody.

Et "vekstinhiberende middel" refererer her til en forbindelse eller et preparat som inhiberer vekst av en celle, fortrinnsvis en ErbB-uttrykkende kreftcelle, enten in vitro eller in vivo. Det vekstinhiberende middel kan således være et middel som signifikant reduserer prosentdelen av ErbB-uttrykkende celler i S-fase. Eksempler på vekstinhiberende midler inkluderer midler som blokkerer cellesyklus progresjonen (på et annet sted enn S-fasen), slik som midler som induserer Gl-stopp og M-fase stopp. Klassiske M-fase blokkerere omfatter vinkaene (vinkristin og vinblastin), taksaner og topo II inhibitorer som doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid og bleomycin. De midlene som stopper Gl går også over til S-fase stopp, for eksempel DNA-alkylerende midler slik som tamoksifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluoruracil og ara-C. Ytterligere informasjon kan finnes i the Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn og Israel, red., kapitel 1, med tittelen "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" av Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), særlig side 13. A "growth inhibitory agent" refers herein to a compound or preparation that inhibits the growth of a cell, preferably an ErbB-expressing cancer cell, either in vitro or in vivo. The growth-inhibiting agent can thus be an agent that significantly reduces the percentage of ErbB-expressing cells in S phase. Examples of growth inhibitory agents include agents that block cell cycle progression (at a site other than S phase), such as agents that induce G1 arrest and M phase arrest. Classical M-phase blockers include the vincas (vincristine and vinblastine), taxanes and topo II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide and bleomycin. Those agents that stop Gl also switch to S-phase arrest, for example DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechlorethamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil and ara-C. Further information can be found in the Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially page 13.

Eksempler på "vekstinhiberende" antistoffer er de som binder til ErbB2 og inhiberer veksten av kreftceller som overuttrykker ErbB2. Foretrukne vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoffer inhiberer veksten av brysttumor cellene SK-BR-3 i cellekultur med mer enn 20 % og fortrinnsvis mer enn 50 % (f. eks. fra omtrent 50 % til omtrent 100 %) ved en antistoff konsentrasjon på omtrent 0,5 til 30 ug/ml, hvor vekstinhiberingen måles 6 dager etter at SK-BR-3-cellene eksponeres for antistoffet (se US patentskrift nr. 5 677 171, tildelt 14. oktober 1997). SK-BR-3-cellevekst inhiberingsanalyse beskrives i mer detalj i det patentskriftet og her nedenfor. Det foretrukne vekstinhiberende antistoffet er det monoklonale antistoff 4D5, f.eks. humanisert 4D5. Examples of "growth inhibitory" antibodies are those that bind to ErbB2 and inhibit the growth of cancer cells that overexpress ErbB2. Preferred growth inhibitory anti-ErbB2 antibodies inhibit the growth of breast tumor cells SK-BR-3 in cell culture by more than 20% and preferably more than 50% (eg, from about 50% to about 100%) at an antibody concentration of about 0.5 to 30 µg/ml, where the growth inhibition is measured 6 days after the SK-BR-3 cells are exposed to the antibody (see US Patent No. 5,677,171, assigned October 14, 1997). The SK-BR-3 cell growth inhibition assay is described in more detail in that patent and here below. The preferred growth inhibitory antibody is the monoclonal antibody 4D5, e.g. humanized 4D5.

Et antisoff som "induserer celledød" er ett som får en levende celle til å bli ikke-levnde. Cellen er generelt én som uttrykker ErbB2-reseptoren, fortrinnsvis en celle som overuttrykker ErbB2-reseptoren. Cellen er fortrinnsvis en kreftcelle, for eksempel en bryst-, ovarie-, mage-, endometrium-, spyttkjertel-, lunge-, nyre-, tykktarm-, tyroid-, bukspyttkjertel- eller blære celle. In vitro kan cellen være en SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-, MDA-MB-453-, MDA-MB-361- eller SKOV3-celle. Celledød in vitro kan bestemmes i fravær av komplement og immun effektorceller for å skille celledød indusert ved antistoff-avhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC) eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Analysen for celledød kan således utføres ved anvendelse av varmeinaktivert serum (dvs. i fravær av komplement) og i fravær av immuneffektor celler. For å fastslå hvorvidt antistoffet er istand til å indusere celledød kan tap av membranintegriteten ved opptak av propidiumjodid (PI), tryptan blått (se Morre et al., Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) eller 7AAD, evalueres sammenlignet med ubehandlede celler. Foretrukne celledød induserende antistoffer av antistoffer som induserer PI-opptak i PI-opptaksanalysen i BT474-celler (se nedenfor). An antisoph that "induces cell death" is one that causes a living cell to become non-living. The cell is generally one that expresses the ErbB2 receptor, preferably a cell that overexpresses the ErbB2 receptor. The cell is preferably a cancer cell, for example a breast, ovarian, stomach, endometrial, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas or bladder cell. In vitro, the cell may be a SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 or SKOV3 cell. Cell death in vitro can be determined in the absence of complement and immune effector cells to distinguish cell death induced by antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) or complement-dependent cytotoxicity (CDC). The analysis for cell death can thus be performed using heat-inactivated serum (ie in the absence of complement) and in the absence of immune effector cells. To determine whether the antibody is capable of inducing cell death, loss of membrane integrity upon uptake of propidium iodide (PI), tryptan blue (see Morre et al., Cytotechnology, 17:1-11 (1995)) or 7AAD can be evaluated compared to untreated cells. Preferred cell death inducing antibodies of antibodies that induce PI uptake in the PI uptake assay in BT474 cells (see below).

Et antistoff som "induserer apoptose" er ett som induserer programmert celledød, som bestemt ved binding av anneksin V, fragmentering av DNA, krymping av celler, utvidelse av det endoplasmatiske retikulum, cellefragmentering og/eller dannelse av membranvesikler (betegnet apoptotiske legemer). Cellen er vanligvis én som overuttrykker ErbB2-reseptoren. Cellen er fortrinnsvis en tumor celle, f. eks. bryst-, ovarie-, mage-, endometrium-, spyttkjertel-, lunge-, nyre-, tykktarm-, tyroid-, bukspyttkjertel- eller blære celle. In vitro kan cellen være en SK-BR-3-, BT474-, Calu 3-, MDA-MB-453-, MDA-MD-361- eller SKOV3-celle. Forskjellige fremgangsmåter er tilgjengelige for evaluering av de cellulære begivenheter som er forbundet med apoptose. For eksempel kan fosfatidylserin (PS)-translokalisering måles ved anneksin-binding, DNA-fragmentering kan evalueres gjennom DNA-«laddering», og kjerne/kromatin-kondensering sammen med DNA-fragmentering kan evalueres ved eventuell økning av hypodiploide celler. Antistoffet som induserer apoptose er fortrinnsvis ett som fører til omtrent 2 til 50 ganger, fortrinnsvis omtrent 5 til 50 ganger, og mest foretrukket omtrent 10 til 50 gangers induksjon av anneksin-binding sammenlignet med ubehandlede celler i en anneksin bindingsanalyse ved anvendelse av BT474-celler (se nedenfor). Noen ganger vil det pro-apoptotiske antistoff være ett som videre blokkerer ErbB-ligandaktivering av en ErbB-reseptor (f. eks. antistoff 7F3), dvs. at antistoffet deler en biologisk egenskap med det monoklonale antistoff 2C4. I andre situasjoner er antistoffet ett som ikke i vesentlig grad blokkerer ErbB-ligandaktivering av en ErbB-reseptor (f. eks. 7C2). Videre kan antistoffet være ett som 7C2 som, selv om det induserer apoptose, ikke induserer en stor reduksjon av prosentdelen av celler i S-fasen (f. eks. ett som kun induserer omtrent 0-10 % reduksjon av prosentdelen av disse cellene sammenlignet med kontrollen). An antibody that "induces apoptosis" is one that induces programmed cell death, as determined by binding of annexin V, fragmentation of DNA, shrinkage of cells, expansion of the endoplasmic reticulum, cell fragmentation and/or formation of membrane vesicles (termed apoptotic bodies). The cell is usually one that overexpresses the ErbB2 receptor. The cell is preferably a tumor cell, e.g. breast, ovarian, stomach, endometrial, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas or bladder cells. In vitro, the cell may be a SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MD-361 or SKOV3 cell. Various methods are available for evaluating the cellular events associated with apoptosis. For example, phosphatidylserine (PS) translocation can be measured by annexin binding, DNA fragmentation can be evaluated through DNA "laddering", and nuclear/chromatin condensation together with DNA fragmentation can be evaluated by any increase in hypodiploid cells. The apoptosis inducing antibody is preferably one that leads to about 2 to 50 fold, preferably about 5 to 50 fold, and most preferably about 10 to 50 fold induction of annexin binding compared to untreated cells in an annexin binding assay using BT474 cells (see below). Sometimes the pro-apoptotic antibody will be one that further blocks ErbB ligand activation of an ErbB receptor (e.g. antibody 7F3), ie the antibody shares a biological property with the monoclonal antibody 2C4. In other situations, the antibody is one that does not substantially block ErbB ligand activation of an ErbB receptor (eg, 7C2). Furthermore, the antibody may be one such as 7C2 that, while inducing apoptosis, does not induce a large reduction in the percentage of cells in S phase (eg, one that induces only about 0-10% reduction in the percentage of these cells compared to the control).

"Epitopen 2C4" er det området i det ekstracellulære domenet av ErbB2 som antistoff 2C4 bindes til. For å søke etter antistoffer som bindes til 2C4-epitopen kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalyse utføres, slik som den som beskrives i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988). Alternativt kan epitop kartlegging utføres for å fastslå hvorvidt antistoffet bindes til 2C4-epitopen i ErbB2 (f. eks. en hvilket som helst eller flere aminosyrerester i området fra og med omtrent aminosyrerest 22 til og med omtrent aminosyrerest 584 i ErbB2, se Fig. 1A-B). "Epitope 2C4" is the region of the extracellular domain of ErbB2 to which antibody 2C4 binds. To search for antibodies that bind to the 2C4 epitope, a routine cross-blocking assay can be performed, such as that described in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatively, epitope mapping can be performed to determine whether the antibody binds to the 2C4 epitope of ErbB2 (eg, any one or more amino acid residues in the region from about amino acid residue 22 through about amino acid residue 584 of ErbB2, see Fig. 1A -B).

"Epitopen 4D5" er det området i det ekstracellulære domenet av ErbB2 som antistoffet 4D5 (ATCC CRL 10463) bindes til. Denne epitopen er nær det transmembran domenet i ErbB2. For søk etter antistoffer som bindes til 4D5-epitopen kan en rutinemessig kryssbindingsanalyse utføres, slik som den som beskrives i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988). Alternativt kan epitop kartlegging utføres for å fastslå hvorvidt antistoffet bindes til 4D5-epitopen i ErbB2 (f. eks. en hvilket som helst eller flere aminosyrerester i området fra og med omtrent aminosyrerest 529 til og med omtrent aminosyrerest 5625, se Fig. 1A-B). "Epitope 4D5" is the region of the extracellular domain of ErbB2 to which the antibody 4D5 (ATCC CRL 10463) binds. This epitope is close to the transmembrane domain of ErbB2. To search for antibodies that bind to the 4D5 epitope, a routine cross-linking assay can be performed, such as that described in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatively, epitope mapping can be performed to determine whether the antibody binds to the 4D5 epitope in ErbB2 (eg, any one or more amino acid residues in the region from about amino acid residue 529 through about amino acid residue 5625, see Fig. 1A-B ).

"Epitopen 3H4" er det området i det ekstracellulære domenet av ErbB2 som antistoff 3H4 bindes til. Denne epitopen inkluderer aminosyrerester fra og med omtrent aminosyrerest 541 til og med omtrent aminosyrerest 599 i aminosyresekvensen til det ekstracellulære domenet i ErbB2, se Fig. 1A-B. "Epitope 3H4" is the region in the extracellular domain of ErbB2 to which antibody 3H4 binds. This epitope includes amino acid residues from about amino acid residue 541 through about amino acid residue 599 in the amino acid sequence of the extracellular domain of ErbB2, see Fig. 1A-B.

"Epitopen 7C2/7F3" er det området ved N-terminus av det ekstracellulære domenet i ErbB2 som antistoffene 7C2 og/eller 7F3 bindes til (begge deponert hos ATCC, se nedenfor). For søk etter antistoffer som bindes til 7C2/7F3-epitopen kan en rutinemessig kryssblokkeringanalyse utføres slik som den som beskrives i Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988). Alternativt kan epitop kartlegging utføres for å fastslå hvorvidt antistoffet bindes til 7C2/7F3-epitopen på ErbB2 (f. eks. en hvilket som helst eller flere aminosyrerester i området fra omtrent aminosyrerest 22 til omtrent aminosyrerest 53 i ErbB2, se Fig. 1A-B). "Epitope 7C2/7F3" is the region at the N-terminus of the extracellular domain of ErbB2 to which antibodies 7C2 and/or 7F3 bind (both deposited with ATCC, see below). To search for antibodies that bind to the 7C2/7F3 epitope, a routine cross-blocking assay can be performed such as that described in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternatively, epitope mapping can be performed to determine whether the antibody binds to the 7C2/7F3 epitope on ErbB2 (eg, any one or more amino acid residues in the region from about amino acid residue 22 to about amino acid residue 53 of ErbB2, see Fig. 1A-B ).

"Pattedyr" for behandlingsformål refererer til ethvert dyr som er klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, husdyr og gårdsdyr, dyr i zoologiske hager, sportsdyr "Mammal" for treatment purposes refers to any animal classified as a mammal, including humans, livestock and farm animals, zoo animals, sporting animals

og kjeledyr, slik som hunder, hester, katter, kuer osv. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske. and pets, such as dogs, horses, cats, cows, etc. The mammal is preferably a human.

En tumor som "responderer på behandling" viser statistisk signifikant forbedring i respons på anti-ErbB-antistoffbehandling sammenlignet med ingen behandling eller behandling med placebo i en anerkjent dyremodell eller et klinisk forsøk på mennesker, eller som responderer på innledende behandling med anti-ErbB-antistoffer, men som vokser etter hvert som behandlingen fortsettes. A tumor that "responds to treatment" shows statistically significant improvement in response to anti-ErbB antibody therapy compared to no treatment or placebo treatment in a recognized animal model or human clinical trial, or that responds to initial treatment with anti-ErbB- antibodies, but which increase as treatment is continued.

Begrepene "behandle" eller "behandling" viser til både terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende tiltak, hvor formålet er å forhindre eller forsinke (redusere) en uønsket fysiologisk endring eller forstyrrelse, slik som utviklingen eller spredningen av kreft. Formålet med denne oppfinnelses inkluderer gunstige eller ønskede kliniske resultater lindring av symptomer, reduksjon av graden av sykdom, stabilisert (dvs. ikke forverret) sykdomstilstand, forsinkelse eller demping av sykdomsprogresjon, forbedring eller lindring av sykdomstilstanden og remisjon (enten delvis eller fullstendig), enten påvisbart eller ikke-påvisbart. "Behandling" kan også bety forlenget overlevelse sammenlignet med den forventede overlevelse uten behandling. De med behov for behandling omfatter de som allerede har tilstanden eller forstyrrelsen, så vel som de som er utsatt for å få tilstanden eller forstyrrelsen og de i hvilke tilstanden eller forstyrrelsen skal forebygges. The terms "treat" or "treatment" refer to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures, the purpose of which is to prevent or delay (reduce) an unwanted physiological change or disturbance, such as the development or spread of cancer. The purpose of this invention includes favorable or desired clinical results relief of symptoms, reduction of the degree of disease, stabilized (ie not worsening) disease state, delay or attenuation of disease progression, improvement or alleviation of the disease state and remission (either partial or complete), either detectable or non-detectable. "Treatment" can also mean prolonged survival compared to the expected survival without treatment. Those in need of treatment include those who already have the condition or disorder, as well as those who are at risk of developing the condition or disorder and those in whom the condition or disorder is to be prevented.

En "forstyrrelse" er enhver tilstand som ville dra nytte av behandling ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette innkluderer kroniske og akutte forstyrrelser eller sykdommer, innkludert de patologiske tilstander som predisponerer pattedyret for forstyrrelsen det gjelder. Eksempler på forstyrrelser som kan behandles her inkluderer godartede og ondartede tumorer, leukemier og ondartede tilstander i lymfesystemet, fortrinnsvis bryst-, ovarie-, mage-, endometerium-, spyttkjertel-, lunge-, nyre-, tykktarm-, skjoldkjertel-, bukspyttkjertel-, prostata- eller urin blære kreft, neuronale, gliale, astrocytale, hypotalamiske og andre kjertelforstyrrelser, makrofagale, epiteliale, stromale og blastosøliske forstyrrelser og inflammatoriske, angiogene og immunologiske forstyrrelser. En foretrukket forstyrrelse for behandling i samsvar med foreliggende oppfinnelse er en ondartet tumor. A "disorder" is any condition that would benefit from treatment according to the present invention. This includes chronic and acute disorders or diseases, including the pathological conditions that predispose the mammal to the disorder in question. Examples of disorders that can be treated here include benign and malignant tumors, leukemias and malignant conditions of the lymphatic system, preferably breast, ovarian, stomach, endometrial, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas , prostate or urinary bladder cancer, neuronal, glial, astrocytic, hypothalamic and other glandular disorders, macrophagal, epithelial, stromal and blastosolic disorders and inflammatory, angiogenic and immunological disorders. A preferred disorder for treatment in accordance with the present invention is a malignant tumor.

Begrepet "terapeutisk effektiv mengde" viser til en mengde av et medikament som effektivt behandler en sykdom eller forstyrrelse i et pattedyr. Når det gjelder kreft kan den terapeutisk effektive mengde av medikamentet redusere antall kreftceller, redusere tumorstørrelsen, inhibere (dvs. i en viss grad redusere og fortrinnsvis stoppe) infiltrasjon av kreftceller i perifere organer, inhibere (dvs. redusere i en viss grad og fortrinnsvis stoppe) tumormetastase, inhibere, i en viss grad, tumorvekst og/eller til en viss grad lindre ett eller flere av symptomene som er forbundet med kreften. I den grad medikamentet kan forhindre vekst av og/eller drepe eksiterende kreftceller kan det være cytostatisk og/eller cytotoksisk. For kreftbehandling kan virkningen for eksempel måles ved å anslå tiden for sykdomsprogresjon (TTP) og/eller bestemme responsrate (RR). The term "therapeutically effective amount" refers to an amount of a drug that effectively treats a disease or disorder in a mammal. In the case of cancer, the therapeutically effective amount of the drug can reduce the number of cancer cells, reduce tumor size, inhibit (i.e. reduce to a certain extent and preferably stop) infiltration of cancer cells into peripheral organs, inhibit (i.e. reduce to a certain extent and preferably stop ) tumor metastasis, inhibit, to a certain extent, tumor growth and/or to a certain extent relieve one or more of the symptoms associated with the cancer. To the extent that the drug can prevent the growth of and/or kill excitable cancer cells, it can be cytostatic and/or cytotoxic. For cancer treatment, the effect can be measured, for example, by estimating the time to disease progression (TTP) and/or determining the response rate (RR).

Begrepene "kreft" og "kreftaktig" viser til eller beskriver den fysiologiske tilstand hos pattedyr som typisk særpreges ved uregulert cellevekst. En "tumor" omfatter én eller flere kreftaktige celler. Eksempler på kreft inkluderer karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi eller lymfoide ondartede tilstander. Mer spesielle eksempler på slike kreftformer omfatter epitelcellekreft (f. eks. plateepitelcellekreft), lungekreft inkludert små-cellet-lungekreft, ikke-småcellet-lungekreft ("NSCLC"), adenokarsinom i lunge og plateepitel karsinom i lungen, kreft i bukhinnen, hepatocellulær kreft, gastrisk eller magekreft inkludert gastrointestinal-kreft, buks pytt kjerte I kreft, glioblastom, livmorshals-kreft, ovariekreft, leverkreft, urinblærekreft, hepatom, brystkreft, tykktarmskreft, endetarmskreft, kolorektal kreft, endometrium eller livmorskarsinom, spyttkjertel karsinom, nyre- eller uri nve is kreft, prostatakreft, kreft i vulva, skjoldkjertelkreft, leverkarsinom, anal karsinom, penis karsinom så vel som kreft i hode og hals. The terms "cancer" and "cancerous" refer to or describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. A "tumor" comprises one or more cancerous cells. Examples of cancer include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia or lymphoid malignancies. More specific examples of such cancers include epithelial cell carcinoma (eg, squamous cell carcinoma), lung cancer including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer ("NSCLC"), lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, hepatocellular carcinoma , gastric or stomach cancer including gastrointestinal cancer, abdominal salivary gland I cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrium or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney or urinary vein ice cancer, prostate cancer, cancer of the vulva, thyroid cancer, liver carcinoma, anal carcinoma, penile carcinoma as well as head and neck cancer.

En "ErbB-uttrykkende kreft" er én som omfatter celler som har ErbB-protein tilstede på deres celleoverflate. En "ErbB2-uttrykkende kreft" er én som danner tilstrekkelige mengder av ErbB2 på overflaten av kreftcellene slik at et anti-ErbB2-antistoff kan bindes til denne og ha en terapeutisk virkning når det gjelder kreften. An "ErbB-expressing cancer" is one that includes cells that have ErbB protein present on their cell surface. An "ErbB2-expressing cancer" is one that forms sufficient amounts of ErbB2 on the surface of the cancer cells so that an anti-ErbB2 antibody can bind to it and have a therapeutic effect on the cancer.

En kreft "kjennetegnet ved overdreven aktivering" av en ErbB-reseptor er én i hvilken omfanget av ErbB-reseptoraktivering i kreftcellene signifikant overskrider aktiveringsnivået av denne reseptor i ikke-kreftceller av samme type vev. Slik overdreven aktivering kan være en følge av overekspresjon av ErbB-reseptoren og/eller høyere enn normalt nivå av en ErbB-ligand tilgjengelig for aktivering av ErbB-reseptoren i kreftcellene. Slik overdreven aktivering kan forårsake og/eller være forårsaket av den ondartede tilstand i en kreftcelle. I noen utførelser vil kreften utsettes for en diagnostisk eller prognostisk analyse for å fastslå hvorvidt forsterkning og/eller overekspresjon av en ErbB-reseptor skjer som resulterer i slik overdreven aktivering av ErbB-reseptoren. Alternativt eller i tillegg kan kreften utsettes ved en diagnostisk eller prognostisk analyse for å fastslå hvorvidt forsterkning og/eller overekspresjon av en ErbB-ligand skjer i kreften som bidrar til overdreven aktivering av reseptoren. I en undergruppe av slike kreftformer kan overdreven aktivering av reseptoren skyldes en autokrin stimulerende reaksjonsvei. A cancer "characterized by excessive activation" of an ErbB receptor is one in which the extent of ErbB receptor activation in the cancer cells significantly exceeds the level of activation of this receptor in non-cancerous cells of the same type of tissue. Such excessive activation may be a consequence of overexpression of the ErbB receptor and/or higher than normal levels of an ErbB ligand available for activation of the ErbB receptor in the cancer cells. Such excessive activation can cause and/or be caused by the malignant state of a cancer cell. In some embodiments, the cancer will be subjected to a diagnostic or prognostic assay to determine whether amplification and/or overexpression of an ErbB receptor occurs resulting in such excessive activation of the ErbB receptor. Alternatively or additionally, the cancer may be subjected to a diagnostic or prognostic analysis to determine whether amplification and/or overexpression of an ErbB ligand occurs in the cancer that contributes to excessive activation of the receptor. In a subset of such cancers, excessive activation of the receptor may be due to an autocrine stimulatory response pathway.

I en "autokrin" stimulerende reaksjonsvei skjer selvstimulering ved at kreftcellen danner både en ErbB-ligand og dens beslektede ErbB-reseptor. Kreft kan for eksempel uttrykke eller overuttrykke EGFR og også uttrykke eller overuttrykke en EGFR-ligand (f. eks. EGF, TGF-a eller HB-EGF). I en annen utførelse kan kreften uttrykke eller overuttrykke ErbB2 og også uttrykke eller overuttrykke et heregulin (f. eks. y-HRG). In an "autocrine" stimulatory response pathway, self-stimulation occurs by the cancer cell forming both an ErbB ligand and its cognate ErbB receptor. For example, cancer may express or overexpress EGFR and also express or overexpress an EGFR ligand (eg, EGF, TGF-α, or HB-EGF). In another embodiment, the cancer may express or overexpress ErbB2 and also express or overexpress a heregulin (eg, γ-HRG).

En kreft som "overuttrykker" en ErbB-reseptor er én som har signifikant høyere nivå av en ErbB-reseptor, slik som ErbB2, på celleoverflaten sammenlignet med en ikke- kreftcelle av samme type vev. Slik overekspresjon kan være forårsaket av genamplifisering eller forhøyet transkripsjon eller translasjon. ErbB-reseptor overekspresjon kan bestemmes i en diagnostisk eller prognostisk analyse ved å evaluere det forhøyede nivå av ErbB-proteinet som foreligger på overflaten av en celle (f. eks. ved hjelp av en immunhistokjemisk analyse, IHC). Alternativt eller i tillegg kan man måle nivået av ErbB-kodende nukleinsyre i cellen, f. eks. ved hjelp av fluorescensbasert in situ-hybridisiering (FISH, se WO 98/45479 publisert oktober, 1988), southern-blotting eller polymerase-kjedereaksjon (PCR)-teknikker, slik som sanntids kvantitativ PCR (RT-PCR). Overekspresjon av ErbB-liganden kan bestemmes diagnostisk ved å evaluere nivået av liganden (eller nukleinsyre som koder for denne) i pasienten, f. eks. i en tumor biopsi eller ved forskjellige diagnostiske analyser slik som IHC-analyse, FISH-analyse, southern-blotting, PCR-analyse eller in v/Vo-analyser som er beskrevet ovenfor. Man kan også studere ErbB-reseptor overekspresjon ved å måle antigen frigitt fra cellene (f. eks. det ekstracellulære domenet fra ErbB) i en biologisk væske slik som serum (se f. eks. US patentskrift nr. 4 933 294, tildelt 12. juni 1990, WO 91/05264, publisert 18. april 1991, US patentskrift nr. 5 401 638 tildelt 28. mars 1995 og Sias et al., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). I tilegg til de ovenfor angitte analyser er forskjellige andre in vivo-analyser tilgjengelige for den erfarne fagperson. Man kan for eksempel eksponere celler i pasientens kropp for et antistoff som om ønskelig er merket med et påvisbart merke, A cancer that "overexpresses" an ErbB receptor is one that has significantly higher levels of an ErbB receptor, such as ErbB2, on the cell surface compared to a non-cancerous cell of the same type of tissue. Such overexpression may be caused by gene amplification or elevated transcription or translation. ErbB receptor overexpression can be determined in a diagnostic or prognostic assay by evaluating the elevated level of ErbB protein present on the surface of a cell (eg, by immunohistochemical analysis, IHC). Alternatively or additionally, one can measure the level of ErbB-encoding nucleic acid in the cell, e.g. using fluorescence in situ hybridization (FISH, see WO 98/45479 published October, 1988), southern blotting or polymerase chain reaction (PCR) techniques, such as real-time quantitative PCR (RT-PCR). Overexpression of the ErbB ligand can be determined diagnostically by evaluating the level of the ligand (or nucleic acid encoding it) in the patient, e.g. in a tumor biopsy or by various diagnostic analyzes such as IHC analysis, FISH analysis, southern blotting, PCR analysis or in v/Vo analyzes as described above. One can also study ErbB receptor overexpression by measuring antigen released from the cells (e.g., the extracellular domain from ErbB) in a biological fluid such as serum (see, e.g., US Patent No. 4,933,294, assigned 12 June 1990, WO 91/05264, published April 18, 1991, US Patent No. 5,401,638 assigned March 28, 1995 and Sias et al., J. Immunol. Methods, 132: 73-80 (1990)). In addition to the above stated assays, various other in vivo assays are available to the skilled person. One can, for example, expose cells in the patient's body to an antibody which, if desired, is labeled with a detectable label,

f. eks. en radioaktiv isotop, og binding av antistoffet til celler i pasienten kan evalueres f. eks. ved ytre skanning for radioaktivitet eller ved å analysere en biopsi fra en pasient som tidligere var eksponert for antistoffet. e.g. a radioactive isotope, and binding of the antibody to cells in the patient can be evaluated, e.g. by external scanning for radioactivity or by analyzing a biopsy from a patient previously exposed to the antibody.

Tumorene som overuttrykker HER2 vurderes ut fra immunhistokjemiske poeng som tilsvarer antall kopier av HER2-molekyler som uttrykkes per celle og kan bestemmes biokjemisk: 0 = 0-10 000 kopier/celler, 1+ = minst omtrent 200 000 kopier/celler, 2+ = minst omtrent 500 000 kopier/celle, 3+ = minst omtrent 2 000 000 kopier/celle. Overekspresjon av HER2 på 3+-nivå, som fører til liganduavhengig aktivering av tyrosinkinase (Hudziak et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:7159-7163 (1987)) opptrer hos omtrent 30 % av all brystkreft og i disse pasientene er overlevelse uten tilbakefall og total overlevelse redusert (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989), Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)). The tumors that overexpress HER2 are assessed based on immunohistochemical scores corresponding to the number of copies of HER2 molecules expressed per cell and can be determined biochemically: 0 = 0-10,000 copies/cell, 1+ = at least approximately 200,000 copies/cell, 2+ = at least about 500,000 copies/cell, 3+ = at least about 2,000,000 copies/cell. Overexpression of HER2 at the 3+ level, leading to ligand-independent activation of tyrosine kinase (Hudziak et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 84:7159-7163 (1987)) occurs in approximately 30% of all breast cancers and in these patients, relapse-free survival and overall survival are reduced (Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989), Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987)).

Omvent er en kreft som "ikke karakteriseres ved overekspresjon av ErbB2-reseptoren" én som i en diagnostisk analyse ikke uttrykker et høyere enn normalt nivå av ErbB2-reseptoren sammenlignet med en ikke-kreftcelle av samme type vev. Conversely, a cancer "not characterized by overexpression of the ErbB2 receptor" is one that, in a diagnostic assay, does not express a higher than normal level of the ErbB2 receptor compared to a non-cancerous cell of the same type of tissue.

En "hormonuavhengig" kreft er én for hvilken proliferasjonen ikke avhenger av nærvær av et hormon som bindes til en reseptor som uttrykkes av celler i kreften. Slik kreft gjennomgår ikke klinisk regresjon ved administrasjon av farmakologiske eller kirurgiske strategier som reduserer hormonkonsentrasjonen i eller nær tumoren. Eksempler på hormonuavhengige kreft inkluderer androgenuavhengig prostatakreft, østrogenuavhengig brystkreft, endometriumkreft og ovariekreft. Slike kreftformer kan begynne som hormonavhengige tumorer og utvikle seg ifra et hormonsensitivt stadium til en hormonrefraktorisk tumor etter anti-hormonbehandling. A "hormone-independent" cancer is one for which proliferation does not depend on the presence of a hormone that binds to a receptor expressed by cells in the cancer. Such cancers do not undergo clinical regression with the administration of pharmacological or surgical strategies that reduce hormone concentrations in or near the tumor. Examples of hormone-independent cancers include androgen-independent prostate cancer, estrogen-independent breast cancer, endometrial cancer, and ovarian cancer. Such cancers can begin as hormone-dependent tumors and develop from a hormone-sensitive stage to a hormone-refractory tumor after anti-hormone treatment.

Begrepet "cytotoksisk middel" som anvendt her viser til en forbindelse som inhiberer eller forhindrer funksjonen av celler og/eller fører til ødeleggelse av celler. Begrepet er ment å omfatte radioaktive isotoper (f. eks. At211,1131,1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 og radioaktive isotoper av Lu), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som lavmolekylære toksiner eller enzymatisk aktive toksiner med opphav i bakterier, sopp, planter eller dyr, inkluderer fragmenter og/eller varianter av disse. The term "cytotoxic agent" as used herein refers to a compound that inhibits or prevents the function of cells and/or leads to the destruction of cells. The term is intended to include radioactive isotopes (e.g. At211,1131,1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 and radioactive isotopes of Lu), chemotherapeutic agents and toxins such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins of origin in bacteria, fungi, plants or animals, includes fragments and/or variants thereof.

Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er anvendbar ved behandling av kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler omfatter alkylerende midler som tiotepa og cyklofosfamid ("CYTOXAN™"), alkylsulfonater som busulfan, improsulfan og piposulfan, aziridiner som benzodopa, karbokon, meturedopa og uredopa, etylen-iminer og metylamelaminer, innbefattet altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosfor-amid, trietylentiofosfaoramid og trimetylolomelamin, nitrogenmustarder samt klorambucil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, isfosfamid, mekloretamin, mekloretaminoksid-hydroklorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilmustard, nitrosureaer som karmustin, klorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin, antibiotika som aklacinomysiner, aktinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, kaktinomycin, kalichemicin, karabicin, karminmycin, karzinofilin, kromomyciner, daktinomycin, daunorubucin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomyciner, mykofenolsyre, nogalamycin, olivomyciner, peplomycin, potfiromycin, puromycin, kelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin, anti-metabolitter som metotreksat og 5-fluoruracil (5-FU), folsyreanaloger som denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat, purinanaloger som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin, pyrimidinanaloger som ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, cytarabin, dideoksyuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU, androgener som kalusteron, dromostanolonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, anti-binyre midler som aminoglutetimid, mitotan, trilostan, midler for nysyntese av folsyre som frolinsyre, aceglaton, aldofosfamidglykosid, aminolevulinsyre, amsakrin, bestrabucil, bisantren, edatraksat, defofamin, demekolcin, diazikon, elfornitin, elliptiniumacetat, etoglucid, galliumnitrat, hydroksyurea, lentinan, lonidamin, mitoguazon, mitoxantron, mopidamol, nitrakrin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podofyllinsyrer, 2-etylhydrazid, prokarbazin, "PSK®", razoksan, sizofiran, spirogermanium, tenuazonsyre, triazikon, 2,2',2"-triklortrietylamin, uretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytosin, arabinosid ("Ara-C"), syklofosfamid, tiotepa, taksaner, for eksempel paklitaksel ("TAXOL®", Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og docetaksel ("TAXOTERE®"), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike), klorambucil, gemcitabin, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, platina analoger som cisplatin og karboplatin, vinblastin, platina, etoposid (VP-16), ifosfamid, mitomycin C, mitoxantron, vinkristin, vinorelbin, navelbin, novantron, teniposid, daunomycin, aminopterin, xeloda, ibandronat, CPT-11, topoisomerase inhibitoren RFS 2000, difluormetylornitin, (DMFO), retinoinsyre, esperamiciner, kapecitabin og farmasøytisk aksepterbare salter, syrer eller derivater av alle de ovenfor nevnte. Også omfattet av denne definisjonen er anti-hormonmidler som virker ved å regulere eller inhibere hormoners virkning på tumorer, for eksempel anti-østrogener, innbefattet for eksempel tamoksifen, raloksifen, aromatseinhiberende 4(5)-imidazoler, 4-hydroksytamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston og toremifen (Fareston) og anti-androgene midler som flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid og goserelin, samt farmasøytisk aksepterbare salter, syrer eller derivater av et hvilket som helst av de ovenfor nevnte. A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound that is useful in the treatment of cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide ("CYTOXAN™"), alkylsulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan, aziridines such as benzodopa, carboxone, meturedopa and uredopa, ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide , triethylenethiophosphaoramide and trimethylolomelamine, nitrogen mustards as well as chlorambucil, chlornafazine, colophosphamide, estramustine, isphosphamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembiquine, fenesterin, prednimustine, trophosphamide, uracil mustard, nitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine, ranimustine, antibiotics such as aclacinomycins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycins, cactinomycin, calichemicin, carabicin, carminmycin, carcinophilin, chromomycins, dactinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucin, doxorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin , mitomycins, mycophenolic acid, nogalamycin , olivomycins, peplomycin, potfiromycin, puromycin, kelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin, anti-metabolites such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU), folic acid analogues such as denopterin, methotrexate, pteropterin, trimetrexate, purine analogues such as fludarabine, 6-mercaptopurine, thiamiprine, thioguanine, pyrimidine analogues such as ancitabine, azacitidine, 6-azauridine, karmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxifluridine, enocitabine, floxuridine, 5-FU, androgens such as calusterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepitiostan, testolactone, anti-adrenal agents such as aminoglutethimide, mitotane, trilostane, folic acid neosynthesis agents such as frolic acid, aceglatone, aldophosphamide glycoside, aminolevulinic acid, amsacrine, bestrabucil, bisantrene, edatraksate, defofamine, demecolcin, diazikon, elfornitine, elliptinium acetate, etoglucid, gallium nitrate, hydroxyurea, lentinan , lonidamine, mitoguazone, mitoxantrone, mopidamol, nitracrine, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podo phyllic acids, 2-ethylhydrazide, procarbazine, "PSK®", razoxane, sizofiran, spirogermanium, tenuazonic acid, triazicon, 2,2',2"-trichlorotriethylamine, urethane, vindesine, dacarbazine, mannomustine, mitobronitol, mitolactol, pipobroman, gacytosine, arabinoside ("Ara-C"), cyclophosphamide, thiotepa, taxanes, such as paclitaxel ("TAXOL®", Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and docetaxel ("TAXOTERE®"), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France ), chlorambucil, gemcitabine, 6-thioguanine, mercaptopurine, methotrexate, platinum analogues such as cisplatin and carboplatin, vinblastine, platinum, etoposide (VP-16), ifosfamide, mitomycin C, mitoxantrone, vincristine, vinorelbine, navelbine, novantrone, teniposide, daunomycin , aminopterin, xeloda, ibandronate, CPT-11, the topoisomerase inhibitor RFS 2000, difluoromethylornithine, (DMFO), retinoic acid, esperamycins, capecitabine and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of all of the above. Also covered by this definition are anti-hormonal agents that act by regulating or inhibiting the effect of hormones on tumors, for example anti-estrogens, including for example tamoxifen, raloxifene, aroma-inhibiting 4(5)-imidazoles, 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone and toremifene (Fareston) and anti-androgenic agents such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide and goserelin, as well as pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.

Som anvendt her viser begrepet "EGFR-rettet medikament" til et terapeutisk middel som bindes til EGFR og eventuelt inhiberer EGFR-aktivering. Eksempler på slike midler omfatter antistoffer og små molekyler som bindes til EGFR. Eksempler på antistoffer som bindes til EGFR omfatter MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) As used herein, the term "EGFR-directed drug" refers to a therapeutic agent that binds to EGFR and optionally inhibits EGFR activation. Examples of such agents include antibodies and small molecules that bind to EGFR. Examples of antibodies that bind to EGFR include MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509)

(se US patentskrift nr. 4 943 533, Mendelsohn et al.) og varianter av disse, for eksempel kimerisert 225 (C225 eller Cetuximab, "ERBUTIX®") og omformet humant 225 (H225) (see US Patent No. 4,943,533, Mendelsohn et al.) and variants thereof, for example chimerized 225 (C225 or Cetuximab, "ERBUTIX®") and reshaped human 225 (H225)

(se WO 96/40210, Imclone Systems Inc.), antistoffer som bindes til type II mutant EGFR (US patentskrift nr. 5 212 290), humaniserte og kimære antistoffer som bindes til EGFR som beskrevet i US patentskrift nr. 5 891 996, og humane antistoffer som bindes til EGFR, for eksempel ABX-EGF (se WO 98/50433, Abgenix). Anti-EGFR-antistoffet kan være konjugert til et cytotoksisk middel slik at det dannes et immunkonjugat (se for eksempel EP 659 439A2, merck Patent GmbH). Eksempler på små molekyler som bindes til EGFR omfatter ZD1839 eller Gefitinib ("IRESSA™", Astra Zeneca), CP-358774 ("TARCEVA™", Genentech(OSI) og AG1478, AG1571 (SU 5271, Sugen). En "tyrosinkinase inhibitor" er et molekyl som i en viss grad inhiberer tyrosinkinase aktiviteten til en tyrosinkinase, for eksempel en ErbB-reseptor. Eksempler på slike inhibitorer omfatter de EGFR-rettede medikamentene som er angitt i avsnittet ovenfor, så vel som kinazoliner som PC 153035, 4(3-kloranilin)kinazolin, pyridopyrimidiner, pyrimidopyrimidiner, pyrrolpyrimidiner, 4-(fenylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidiner, kurkumin(diferuloylmetan, 4,5-bis-(4-fluoranilin)ftalimid), tyrfostiner som inneholder nitrotiofengrupper, PD-0183805 (Warner-Lamber), "antisense"-molekyler (f. eks. molekyler som bindes til ErbB-kodende nukleinsyre), kinoksaliner (US patetnskrift nr. (see WO 96/40210, Imclone Systems Inc.), antibodies that bind to type II mutant EGFR (US Patent No. 5,212,290), humanized and chimeric antibodies that bind to EGFR as described in US Patent No. 5,891,996, and human antibodies that bind to EGFR, for example ABX-EGF (see WO 98/50433, Abgenix). The anti-EGFR antibody can be conjugated to a cytotoxic agent so that an immunoconjugate is formed (see for example EP 659 439A2, merck Patent GmbH). Examples of small molecules that bind to EGFR include ZD1839 or Gefitinib ("IRESSA™", Astra Zeneca), CP-358774 ("TARCEVA™", Genentech(OSI) and AG1478, AG1571 (SU 5271, Sugen). A "tyrosine kinase inhibitor " is a molecule that to some extent inhibits the tyrosine kinase activity of a tyrosine kinase, such as an ErbB receptor. Examples of such inhibitors include the EGFR-directed drugs listed in the paragraph above, as well as quinazolines such as PC 153035, 4( 3-chloroaniline)quinazoline, pyridopyrimidines, pyrimidopyrimidines, pyrrolepyrimidines, 4-(phenylamino)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidines, curcumin (diferuloylmethane, 4,5-bis-(4-fluoroaniline)phthalimide), tyrphostins as contains nitrothiophene groups, PD-0183805 (Warner-Lamber), "antisense" molecules (eg, molecules that bind to ErbB-encoding nucleic acid), quinoxalines (US Pat. No.

5 804 396), tryfostiner (US patentskrift nr. 5 804 396), ZD6474 (Astra Zeneca), PTK-787 (Novartis/Schering AG), pan-ErbB-inhibitorer som CI-1033 (Pfizer), affinitac (ISIS 3521, Isis/Lilly), imatinibmesylat (Gleevac, Novartis), PKI 166 (Novartis), GW2016 (Glaxo 5,804,396), tryphostins (US Patent No. 5,804,396), ZD6474 (Astra Zeneca), PTK-787 (Novartis/Schering AG), pan-ErbB inhibitors such as CI-1033 (Pfizer), affinitac (ISIS 3521, Isis/Lilly), imatinib mesylate (Gleevac, Novartis), PKI 166 (Novartis), GW2016 (Glaxo

SmithKline), CI-1033 (Pfizer), EKB-569 (Wyeth), semaxanib (Sugen), ZD6474 (AstraZeneca), PTK-787 (NOvartis/Schering AG), INC-1C11 (Imclone) eller som beskrevet i enhver av de påfølgende patentskrifter: US patentskrift nr. 5 804 396, WO 99/09016 (American Cyanimid), WO 98/43960 (American Cyanamid), WO 97/38983 (Warner Lambert), WO 99/06378 (Warner Lambert), WO 99/06396 (Warner Lambert), WO 96/30347 (Pfizer, Inc.), WO 96/33978 (Zeneca), WO 96/3397 (Zeneca) og WO 96/33980 (Zeneca). SmithKline), CI-1033 (Pfizer), EKB-569 (Wyeth), semaxanib (Sugen), ZD6474 (AstraZeneca), PTK-787 (NOvartis/Schering AG), INC-1C11 (Imclone) or as described in any of the subsequent patents: US Patent No. 5,804,396, WO 99/09016 (American Cyanamid), WO 98/43960 (American Cyanamid), WO 97/38983 (Warner Lambert), WO 99/06378 (Warner Lambert), WO 99/ 06396 (Warner Lambert), WO 96/30347 (Pfizer, Inc.), WO 96/33978 (Zeneca), WO 96/3397 (Zeneca) and WO 96/33980 (Zeneca).

Et "anti-angiogenisk middel" viser til en forbindelse som blokkerer eller i en viss grad forstyrrer utviklingen av blodkar. Den anti-angiogeniske faktor kan for eksempel være et lite molekyl eller et antistoff som bindes til en vekstfaktor eller en vekstfaktor reseptor som deltar i fremming av angiogenese. Den foretrukne anti-angiogene faktor her er et antistoff som bindes til vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF). An "anti-angiogenic agent" refers to a compound that blocks or to some extent interferes with the development of blood vessels. The anti-angiogenic factor can, for example, be a small molecule or an antibody that binds to a growth factor or a growth factor receptor that participates in the promotion of angiogenesis. The preferred anti-angiogenic factor here is an antibody that binds to vascular endothelial growth factor (VEGF).

Begrepet "cytokin" er en generisk betegnelse på proteiner som frigis av en cellepopulasjon og som virker på en annen celle som intercellulære formidlere. Eksempler på slike cytokiner er lymfokiner, monokiner og tradisjonelle polypeptid hormoner. Innbefattet blant cytokinene er veksthormon, for eksempel humant veksthormon, N-metionyl-humant veksthormon og veksthormon fra storfe, parathyroid hormon, thyroksin, insulin, proinsulin, relaksin, prorelaksin, glykoprotein hormoner som follikel-stimulerende hormon (FSH), thyroid-stimulerende hormon (TSH) og luteiniserende hormon (LH), hepatisk vekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, prolaktin, placentalt laktogen, tumor nekrosefaktor-a og -p, mullerian-inhiberende substans, gonadotropin-assosiert peptid fra mus, inhibin, aktivin, vaskulær endotel vekstfaktor, integrin, trombopoietin (TPO), nerve vekstfaktorer som NGF-p, blodplate vekstfaktor, transformerende vekstfaktorer (TGF) som TGF-a og TGF-p, insulin-lignende vekstfaktor I og II, erytropoietin (EPO), osteoinduktive faktorer, interferoner som interferon-a, -p og - y, kolonistimulerende faktorer (CSF) som makrofag-CSF (G-CSF), g ra nu locytt-makrofag-CSF (GM-CSF) og granulocytt-CSF (G-CSF), interleukiner (IL) som IL-1, IL-la, -IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, en tumor nekrosefaktor som TNF-a eller TNF-p og andre polypeptid faktorer, innbefattet LIF og kit-ligand (KL). Som anvendt her omfatter begrepet cytokin proteiner fra naturlige kilder eller fra rekombinant cellekultur og biologisk aktive ekvivalenter av cytokiner med nativ sekvens. The term "cytokine" is a generic term for proteins released by one cell population and acting on another cell as intercellular mediators. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines and traditional polypeptide hormones. Included among the cytokines are growth hormone, for example human growth hormone, N-methionyl human growth hormone and bovine growth hormone, parathyroid hormone, thyroxine, insulin, proinsulin, relaxin, prorelaxin, glycoprotein hormones such as follicle-stimulating hormone (FSH), thyroid-stimulating hormone (TSH) and luteinizing hormone (LH), hepatic growth factor, fibroblast growth factor, prolactin, placental lactogen, tumor necrosis factor-a and -p, mullerian inhibitory substance, mouse gonadotropin-associated peptide, inhibin, activin, vascular endothelial growth factor, integrin , thrombopoietin (TPO), nerve growth factors such as NGF-p, platelet growth factor, transforming growth factors (TGF) such as TGF-a and TGF-p, insulin-like growth factor I and II, erythropoietin (EPO), osteoinductive factors, interferons such as interferon- a, -p and - y, colony stimulating factors (CSF) such as macrophage-CSF (G-CSF), granulocyte-macrophage-CSF (GM-CSF) and granulocyte-CSF (G-CSF), interleukins (IL) such as IL-1, IL-1α, -IL-2, IL -3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, a tumor necrosis factor such as TNF-α or TNF-β and other polypeptide factors, including LIF and kit-ligand (KL). As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture and biologically active equivalents of native sequence cytokines.

Begrepet "prodrug" som anvendt i foreliggende patentsøknad viser til en forløper eller et derivat av en farmasøytisk aktiv forbindelse som er mindre cytotoksisk ovenfor tumorceller enn utgangsmedikamentet og som kan aktiveres enzymatisk eller omdannes til den mer aktive utgangsform. Se for eksempel William,"Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, s. 375-382, 615. møte Blefast The term "prodrug" as used in the present patent application refers to a precursor or a derivative of a pharmaceutical active compound which is less cytotoxic to tumor cells than the starting drug and which can be enzymatically activated or converted into the more active starting form. See for example William, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615. meet Blefast

(1986) og Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (red.), s. 247-267, Humana Press (1985). Prodrugene ifølge foreliggende beskrivelse omfatter fosfatholdige prodruger, tiofosfat- holdige prodruger, sulfatholdige prodruger, peptidholdige prodruger, D-aminosyre-modifiserte prodruger, glykosylerte prodruger, p-lakamholdige prodruger, om ønskelig substituerte fenoksyacetamid-holdige prodruger eller om ønskelig substituerte fenylacetamidholdige prodruger, 5-fluorcytocin og andre 5-fluoruridin prodruger som kan omdannes til det mer aktive, cytotoksiske frie medikament. Eksempler på cytotoksiske medikamenter som kan derivatiseres til en prodrug form for anvendelse ifølge foreliggende beskrivelse omfatter de kjemoterapeutiske midler som er beskrevet ovenfor. (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (eds.), pp. 247-267, Humana Press (1985). The prodrugs according to the present description include phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, D-amino acid-modified prodrugs, glycosylated prodrugs, p-lacam-containing prodrugs, optionally substituted phenoxyacetamide-containing prodrugs or optionally substituted phenylacetamide-containing prodrugs, 5- fluorocytocin and other 5-fluorouridine prodrugs that can be converted to the more active, cytotoxic free drug. Examples of cytotoxic drugs that can be derivatized into a prodrug form for use according to the present description include the chemotherapeutic agents described above.

Et "liposom" er en liten vesikkel som er sammensatt av forskjellige typer lipider, fosfolipider og/eller overflateaktive midler og som er anvendbar for tilførsel av et medikament (f. eks. anti-ErbB2-antistoffene som beskrives her og om ønskelig et kjemoterapeutisk middel) til et pattedyr. Liposomets bestanddeler er vanligvis arrangert i en to-lags form som ligner på måten lipider er arrangert på i biologiske membraner. A "liposome" is a small vesicle composed of various types of lipids, phospholipids and/or surfactants and which is useful for the delivery of a drug (eg, the anti-ErbB2 antibodies described herein and, if desired, a chemotherapeutic agent ) to a mammal. The liposome's constituents are usually arranged in a two-layered form similar to the way lipids are arranged in biological membranes.

Begrepet "pakningsvedlegg" anvendes for å vise til instruksjoner som vanligvis inngår i kommersielle pakker av terapeutiske produkter og som inneholder informasjon vedrørende indikasjoner, anvendelse, dosering, tilførsel, kontraindikasjoner og/eller advarsler som gjelder anvendelse av slike terapeutiske produkter. The term "package insert" is used to refer to instructions that are usually included in commercial packages of therapeutic products and which contain information regarding indications, use, dosage, administration, contraindications and/or warnings that apply to the use of such therapeutic products.

Et "kardiobeskyttende middel" er en forbindelse eller et preparat som forhindrer eller reduserer myokard dysfunksjon (dvs. kardiomyopati og/eller kongestiv hjertesvikt) forbundet med tilførsel av et medikament, for eksempel et antibiotikum av antracyklintype og/eller et anti-ErbB2-antistoff, til en pasient. Det kardiobeskyttende middel kan for eksempel blokkere eller redusere en kardiotoksisk virkning formidlet av frie radikaler og/eller forhindre eller redusere skader grunnet oksidativt stress. Eksempler på kardiobeskyttende midler som omfattes av de foreliggende definisjoner omfatter det jern-skjellaterende middel dekstrazoksan (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072 (1994)), et lipid-reduserende middel og/eller en antioksidant, for eksempel probukol (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 27:1055-1063 A "cardioprotective agent" is a compound or preparation that prevents or reduces myocardial dysfunction (ie, cardiomyopathy and/or congestive heart failure) associated with the administration of a drug, for example an anthracycline-type antibiotic and/or an anti-ErbB2 antibody, to a patient. The cardioprotective agent can, for example, block or reduce a cardiotoxic effect mediated by free radicals and/or prevent or reduce damage due to oxidative stress. Examples of cardioprotective agents encompassed by the present definitions include the iron-chelating agent dextrazoxane (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072 (1994)), a lipid-lowering agent and/ or an antioxidant, for example probucol (Singal et al., J. Mol. Cell Cardiol., 27:1055-1063

(1995)), amifostin (aminotiol-2-[(3-aminopropyl)amino]etanetioldihydrogenfosfatester også betegnet WR-2721, og den defosforylerte form av denne for opptak i celler betegnet WR-1065) og S-3-(3~metylaminopropylamino)propylfosforotionsyre (WR-151327) se Green et al., Cancer Research, 54:738-741 (1994), digoxin (Bristow, M.R. i Bristow MR, red. Drug-Induced Heart Disease. New York. Elsevier 191-215 (1980)), beta-blokkere som metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994) og Shaddy et al., Am. Heart J., 129:197-9 (1995)), vitamin E, askorbinsyre (vitamin C), midler som oppfanger frie radikaler, for eksempel olianolsyre, ursolsyre og N-acetylcystein (NAC), spin-fangende forbindelser som alfa-fenyl-tert-butylnitron (PBN), (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)), organiske selenforbindelser som P251 (Elbesen) og lignende. (1995)), amifostine (aminothiol-2-[(3-aminopropyl)amino]ethanethiol dihydrogen phosphate ester also designated WR-2721, and the dephosphorylated form thereof for uptake into cells designated WR-1065) and S-3-(3-methylaminopropylamino )propylphosphorothionic acid (WR-151327) see Green et al., Cancer Research, 54:738-741 (1994), digoxin (Bristow, M.R. in Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York. Elsevier 191-215 ( 1980)), beta-blockers such as metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs 47:Suppl 4:31-9 (1994) and Shaddy et al., Am. Heart J., 129:197-9 (1995)), vitamin E, ascorbic acid (vitamin C), free radical scavengers such as oleanolic acid, ursolic acid and N-acetylcysteine (NAC), spin-trapping compounds such as alpha-phenyl-tert-butyl nitrone (PBN), (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612 (1993)), organic selenium compounds such as P251 (Elbesen) and the like.

Et "isolert" nukleinsyremolekyl" er et nukleinsyremolekyl som er påvist og separert fra minst et kontaminerende nukleinsyremolekyl som det vanligvis er forbundet med i antistoff nukleinsyrens naturlige kilde. Et isolert nukleinsyremolekyl har en annen form eller foreligger i en annen sammenheng enn molekylet foreligger i naturen. Isolerte nukleinsyremolekyler er derfor forskjellige fra nukleinsyremolekyler som foreligger i naturlige celler. Et isolert nukleinsyremolekyl omfatter imidlertid et nukleinsyremolekyl som foreligger i celler som vanligvis uttrykker antistoffet, men hvor for eksempel nukleinsyremolekylet haren annen kromosomal plassering enn i naturlige celler. An "isolated" nucleic acid molecule" is a nucleic acid molecule that has been detected and separated from at least one contaminating nucleic acid molecule with which it is usually associated in the antibody nucleic acid's natural source. An isolated nucleic acid molecule has a different form or exists in a different context than the molecule exists in nature. Isolated nucleic acid molecules are therefore different from nucleic acid molecules present in natural cells. However, an isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule present in cells that normally express the antibody, but where, for example, the nucleic acid molecule has a different chromosomal location than in natural cells.

Uttrykket "kontrollsekvenser" viser til DNA-sekvenser som er nødvendige for ekspresjon av en operativt tilkoblet kodende sekvens i en gitt vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnede for prokarioter omfatter for eksempel en promoter, om ønskelig en operatorsekvens og et ribosom bindingssete. Eukaryote celler vites å benytte promotere, polyadenyleringssignaler og enhancere. The term "control sequences" refers to DNA sequences necessary for expression of an operably linked coding sequence in a given host organism. The control sequences which are suitable for prokaryotes comprise, for example, a promoter, if desired an operator sequence and a ribosome binding site. Eukaryotic cells are known to use promoters, polyadenylation signals and enhancers.

En nukleinsyre er "operativt koblet" dersom den er plassert i et funksjonelt forhold til en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk ledersekvens operativt koblet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som deltar i sekresjon av polypeptidet, en promoter eller enhancer er operativt koblet til en kodende sekvens dersom den påvirker transkripsjon av sekvensen, eller et ribosom bindingssete er operativt koblet til en kodende sekvens dersom den er plassert slik at translasjonen lettes. Generelt betyr "operativt koblet" at DNA-sekvensene som er sammenkoblet er kontinuerlige, og når det gjelder en sekretorisk ledersekvens, kontinuerlige og i samme leseramme. Imidlertid må enhancere ikke nødvendigvis være kontinuerlige. Sammenkobling oppnås ved ligering i egnede restriksjonsseter. Dersom slike seter ikke foreligger, anvendes syntetiske oligonukleotid adaptere eller linkere i samsvar med konvensjonelle fremgangsmåter. A nucleic acid is "operably linked" if it is placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, DNA for a presequence or secretory leader sequence is operably linked to DNA for a polypeptide if it is expressed as a preprotein that participates in secretion of the polypeptide, a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence, or a ribosome binding site is operatively linked to a coding sequence if it is positioned so that translation is facilitated. In general, "operably linked" means that the DNA sequences linked are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, contiguous and in the same reading frame. However, enhancers need not necessarily be continuous. Linkage is achieved by ligation in suitable restriction sites. If such sites are not available, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional methods.

Som anvendt her anvendes uttrykkene "celle", "cellelinje" og "cellekultur" om hverandre, og alle slike betegnelser inkluderer avkom. Ordene "transformanter" og "transformerte celler" omfatter således den angjeldende primærcelle og kulturer avledet fra denne, uten at det tas hensyn til antall overføringer. Det bør også forstås at alt avkom ikke nødvendigvis må være fullstendig identisk når det gjelder DNA-innhold grunnet ønskede eller utilsiktede mutasjoner. Mutant avkom som har den samme funksjon eller biologiske aktivitet som det ble søkt for i den opprinnelig transformerte celle inngår. Dersom forskjellige betegnelser er tilsiktet vil dette være åpenbart ut fra sammenhengen. As used herein, the terms "cell", "cell line" and "cell culture" are used interchangeably, and all such terms include progeny. The words "transformants" and "transformed cells" thus include the relevant primary cell and cultures derived from it, without regard to the number of transfers. It should also be understood that all offspring do not necessarily have to be completely identical in terms of DNA content due to desired or unintended mutations. Mutant offspring that have the same function or biological activity as was sought for in the originally transformed cell are included. If different designations are intended, this will be obvious from the context.

Fremgangsmåter for påvisning av tumorer som responderer på behandling med Anti-HER2-antistoffer Methods for the detection of tumors that respond to treatment with Anti-HER2 antibodies

Kilder for tumorer og tumorceller Sources of tumors and tumor cells

Tumorer kan karakteriseres som responderende på behandling med 2C4 basert på nærvær av EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer på celleoverflaten, som et mål på HER2-aktivering. Tumorprøver kan analyseres for nærvær av heterodimerer ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget. Nærvær av heterodimerer fastslås fortrinnsvis ved én eller flere av fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor. Tumors can be characterized as responding to treatment with 2C4 based on the presence of EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers on the cell surface, as a measure of HER2 activation. Tumor samples can be analyzed for the presence of heterodimers by any method known in the art. The presence of heterodimers is preferably determined by one or more of the methods described below.

Siden HER2-aktivering er en følge av reseptor-heterodimerisering og fosforylering er en spesielt viktig fremgangsmåte for påvisning av tumorer som responderer på behandling med 2C4 påvisning av fosforylering av ErbB2-reseptor, slik som fosforylering av ErbB2 (HER2)-reseptor, som beskrevet nedenfor. Since HER2 activation is a consequence of receptor heterodimerization and phosphorylation, a particularly important method for detecting tumors that respond to treatment with 2C4 is the detection of ErbB2 receptor phosphorylation, such as ErbB2 (HER2) receptor phosphorylation, as described below .

Kilder for tumorceller som kan analyseres omfatter tumorbiopsier, sirkulerende tumorceller, sirkulerende plasmaproteiner, ascitis væske, xenopodete tumorer og andre tumormodeller og primære cellekulturer eller cellelinjer avledet fra tumorer eller som viser tumorlignende egenskaper, så vel som konserverte tumorprøver, for eksempel formalinfikserte, parafininnstøpte tumorprøver. Gjennomsøking av sett av forskjellige tumor celletyper for EGFR-ErB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer og/eller fosforylering av ErbB-reseptor omfattes av foreliggende oppfinnelse. Tumorceller av samme type som tumorceller som gir positiv analyse for heterodimerer og/eller fosforylering av ErbB-reseptor, foreksempel ErbB2 (HER2)-reseptor, kan behandles med 2C4. Tumormodellene som beskrives nedenfor gis som eksempler. Sources of tumor cells that can be analyzed include tumor biopsies, circulating tumor cells, circulating plasma proteins, ascitis fluid, xenopodized tumors and other tumor models and primary cell cultures or cell lines derived from tumors or showing tumor-like properties, as well as preserved tumor specimens, such as formalin-fixed, paraffin-embedded tumor specimens. Screening of sets of different tumor cell types for EGFR-ErB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers and/or phosphorylation of ErbB receptor is covered by the present invention. Tumor cells of the same type as tumor cells that give a positive analysis for heterodimers and/or phosphorylation of ErbB receptor, for example ErbB2 (HER2) receptor, can be treated with 2C4. The tumor models described below are given as examples.

I én utførelsesform analyseres tumorceller med opphav i en pasient som i øyeblikket lider av en tumor for responsivitet for behandling med 2C4. Dersom cellene fastslås å respondere, basert på nærvær av HER2/HER3- og/eller HER2/HER1-heterodimerer eller ved at fosforylering av ErbB-reseptor vises, kan pasienten deretter behandles med et antistoff med én eller flere av de biologiske egenskapene til 2C4. Fortrinnsvis behandles pasienten med rhuMAb 2C4. In one embodiment, tumor cells originating in a patient currently suffering from a tumor are analyzed for responsiveness to treatment with 2C4. If the cells are determined to respond, based on the presence of HER2/HER3 and/or HER2/HER1 heterodimers or by showing phosphorylation of the ErbB receptor, the patient can then be treated with an antibody with one or more of the biological properties of 2C4. Preferably, the patient is treated with rhuMAb 2C4.

I en annen utførelsesform analyseres tumorceller fra en gitt tumortype eller celler som antas å ha de samme egenskaper som en gitt tumortype for nærvær av EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforyleringen av ErbB-reseptor, fortrinnsvis ErbB2 (HER2)-reseptor. Hvis EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer og/eller fosforylering av ErbB-reseptor påvises anses denne tumortype å være en god kandidat for behandling med rhuMAb 2C4. Pasienter som lider av denne tumortype kan så behandles med et slikt antistoff. In another embodiment, tumor cells from a given tumor type or cells believed to have the same characteristics as a given tumor type are analyzed for the presence of EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for the phosphorylation of ErbB receptor, preferably ErbB2 (HER2 ) receptor. If EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers and/or phosphorylation of the ErbB receptor is detected, this tumor type is considered a good candidate for treatment with rhuMAb 2C4. Patients suffering from this type of tumor can then be treated with such an antibody.

Xenopoding av cellelinjer Xenopodization of cell lines

Tumorceller oppformert in vitro, slik som tumorceller dyrket i kultur og tumorcellelinjer, kan xenopodes inn i mus ved direkte implantering av celler i et interessant område. Slike fremgangsmåter er velkjente blant fagpersoner. Cellene analyseres for påvisning av nærvær av EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, slik som fosforylering av ErbB2 (HER2)-reseptor. Tumor cells propagated in vitro, such as tumor cells grown in culture and tumor cell lines, can be xenografted into mice by direct implantation of cells into an area of interest. Such methods are well known among those skilled in the art. The cells are analyzed for the presence of EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for phosphorylation of ErbB receptor, such as phosphorylation of ErbB2 (HER2) receptor.

I én utførelsesform implanteres tumorceller subkutant i en mus, fortrinnsvis en atymisk naken mus. I en annen utførelsesform implanteres tumorceller i et fysiologisk relevant område for fremstilling av en egnet in s/tu-tumormodell. For eksempel kan celler fra en brystkreft cellelinje implanteres i forskjellige konsentrasjoner i brystfettputen hos atymiske naken mus for på en mer korrekt måte å modellere biologien til brystkreft. Tumorceller kan analyseres for nærvær av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, enten før eller etter implantering. Tumorcellene analyseres fortrinnsvis etter at de implanterte cellene har utviklet seg til en tumor av en på forhånd bestemt størrelse. Musene kan også behandles med 2C4 eller et funksjonelt ekvivalent antistoff, hvor ubehandlede mus fungerer som kontroll. In one embodiment, tumor cells are implanted subcutaneously in a mouse, preferably an athymic nude mouse. In another embodiment, tumor cells are implanted in a physiologically relevant area to produce a suitable in s/tu tumor model. For example, cells from a breast cancer cell line can be implanted in different concentrations into the mammary fat pad of athymic nude mice to more accurately model the biology of breast cancer. Tumor cells can be analyzed for the presence of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for phosphorylation of the ErbB receptor, either before or after implantation. The tumor cells are preferably analyzed after the implanted cells have developed into a tumor of a predetermined size. The mice can also be treated with 2C4 or a functionally equivalent antibody, with untreated mice serving as controls.

Tilsvarende modeller kan etableres for enhver tumortype fra hvilke dyrkede celler eller cellelinjer har blitt avledet. Tumortypene omfatter urinblære, hjerne, bryst, kolon, spiserør, nyre, leukemi, lever, lunge, melanom, ovarie, bukspyttkjertel, prostata, sarkom, mage, testikkel og uterus. I én utførelsesform anvendes tumorceller eller cellelinjer som overuttrykker ErbB2 for implantering, mens det i en annen utførelsesform anvendes tumorceller eller cellelinjer som uttrykker normale eller under normale mengder av ErbB2 for implantering. I nok en utførelsesform anvendes tumorceller eller cellelinjer som ikke responderer på "HERCEPTIN®" for implantering. Corresponding models can be established for any tumor type from which cultured cells or cell lines have been derived. Tumor types include bladder, brain, breast, colon, esophagus, kidney, leukaemia, liver, lung, melanoma, ovary, pancreas, prostate, sarcoma, stomach, testicle and uterus. In one embodiment, tumor cells or cell lines that overexpress ErbB2 are used for implantation, while in another embodiment, tumor cells or cell lines that express normal or below normal amounts of ErbB2 are used for implantation. In yet another embodiment, tumor cells or cell lines that do not respond to "HERCEPTIN®" are used for implantation.

I en spesifikk utførelsesform implanteres omtrent 20 millioner MDA-175-brysttumor celler i den gonadale fettpute hos mus. Ekspresjon av HER2/HER1- og/eller HER2/HER2-dimerer på overflaten av de xenopodete cellene bestemmes, slik som ved én av fremgangsmåtene som beskrives nedenfor. Således implanterte mus kan også behandles med 0,3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg eller 100 mg/kg 2C4. Andre doseringsskjemaer vil kunne fastslås av en gjennomsnitts fagperson. In a specific embodiment, approximately 20 million MDA-175 mammary tumor cells are implanted into the gonadal fat pad of mice. Expression of HER2/HER1 and/or HER2/HER2 dimers on the surface of the xenopodized cells is determined, such as by one of the methods described below. Thus implanted mice can also be treated with 0.3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg or 100 mg/kg 2C4. Other dosage forms can be determined by one of ordinary skill in the art.

Selv om foreliggende oppfinnelse er egnet for klassifisering av enhver HER2-uttrykkende tumor er faste tumorer, for eksempel brystkreft, ovariekreft, lungekreft, prostatakreft og kolorektal kreft spesielt godt egnede for analyse og behandling ifølge foreliggende oppfinnelse. Although the present invention is suitable for the classification of any HER2-expressing tumor, solid tumors, for example breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, prostate cancer and colorectal cancer are particularly well suited for analysis and treatment according to the present invention.

Tumor-xenopoding Tumor xenografting

Prøver av pattedyrs tumorer, fortrinnsvis prøver av humane tumorer, kan fremskaffes og implanteres i mus, fortrinnsvis atymiske naken mus. Tumorprøvene kan fremskaffes ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget. Tumorprøvene kan opereres ut kirurgisk, slik som i en biopsi eller under kirurgiske inngrep for fjerning av tumoren fra pattedyret. Tumorprøven kan fremskaffes ved å rense sirkulerende tumorceller fra pattedyrets blod. Mammalian tumor samples, preferably human tumor samples, can be obtained and implanted into mice, preferably athymic nude mice. The tumor samples can be obtained by any method known in the art. The tumor samples can be removed surgically, such as in a biopsy or during surgical interventions to remove the tumor from the mammal. The tumor sample can be obtained by purifying circulating tumor cells from the mammal's blood.

Faste, humane tumorsnitt med omtrent 5 x 5 x 0,5 til 1 mm diameter kan implanteres i siden på atymiske nakne mus, generelt fire fragmenter per mus. Når de implanterte tumorene når en midlere diameter på omtrent 10-15 mm kan de serielt overføres, vanligvis ved anvendelse av mindre tumorfragmenter. Fremgangsmåter for fremstilling og undersøkelser av humane tumor-xenopodinger er beskrevet i de påfølgende referanser: Fiebig et al., "Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterizationand Discorvery of New Anticancer Agents" i Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig & Bruger, red. Fixed human tumor sections approximately 5 x 5 x 0.5 to 1 mm in diameter can be implanted into the side of athymic nude mice, generally four fragments per mouse. When the implanted tumors reach a mean diameter of about 10-15 mm they can be serially transferred, usually using smaller tumor fragments. Procedures for the preparation and investigation of human tumor xenografts are described in the following references: Fiebig et al., "Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterizationand Discovery of New Anticancer Agents" in Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, Fiebig & Bruger, ed.

(Basel, Karger 1999), bind 54, s. 29-50, Berger et al., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice" i Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig & Berger, red. (1992), s. 23-46, Fiebig & Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants" i Models in Cancer Research, Teicher, red. (Humana Press 2002) s. 113-137. (Basel, Karger 1999), vol. 54, pp. 29-50, Berger et al., "Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice" in Immunodeficient Mice in Oncology, Fiebig & Berger, eds. (1992), pp. 23-46, Fiebig & Burger, "Human Tumor Xenografts and Explants" in Models in Cancer Research, Teicher, ed. (Humana Press 2002) pp. 113-137.

Humane xenopodinger anses å være svært prediktive for tumorens adferd i donorpasienten, siden xenopodingen vokser som en fast tumor, differensierer og utvikler et stroma, vaskulatur og en sentral nekrose. I de fleste tilfeller beholder xenopodinger de fleste molekylære, histologiske og patofysiologiske egenskaper forbundet med den ferske pasientavledede tumor. Tumorceller fra mus som inneholder første eller serielt passerte tumorer kan analyseres for nærvær av EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor. Musene kan også behandles med 2C4 eller et funksjonelt ekvivalent antistoff. Human xenografts are considered to be highly predictive of tumor behavior in the donor patient, since the xenograft grows as a solid tumor, differentiates and develops a stroma, vasculature and a central necrosis. In most cases, xenografts retain most of the molecular, histological and pathophysiological characteristics associated with the fresh patient-derived tumor. Tumor cells from mice containing primary or serially passaged tumors can be analyzed for the presence of EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for ErbB receptor phosphorylation. The mice can also be treated with 2C4 or a functionally equivalent antibody.

Et nyfremstilt eller etablert sett av humane tumor-xenopodinger kan gjennomsøkes for nærvær av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor. Fiebig & Burger, supra, beskriver et sett på over 300 humane tumor-xenopodinger etablert fra en rekke vanlige krefttyper, slik som urinblære, hjerne, bryst, tykktarm, spiserør, nyre, leukemi, lever, lunge, melanom, ovarie, bukspyttkjertel, prostata, sarkom, mage, testikkel og livmor. Hele settet kan gjennomsøkes for heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, slik som ErbB2 (HER2)-reseptor. Undergrupper av dette settet kan også gjennomsøkes for heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, hvor undergruppene for eksempel er basert på type vev, over-, under- eller normal ekspresjon av ErbB2 eller manglende respons på "HERCEPTIN®". På denne måten kan tumorer klassifiseres som kandidater for behandling med 2C4 basert på nærvær av heterodimerer eller ved at fosforylering av ErbB-reseptor, slik som ErbB2 (HER2)-reseptor, påvises. Likeså kan pasienter som har tumorer som er klassifisert på denne måten hurtigere vurderes som egnede for behandling med 2C4 eller et funksjonelt ekvivalent antistoff. A freshly prepared or established set of human tumor xenografts can be screened for the presence of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for ErbB receptor phosphorylation. Fiebig & Burger, supra, describe a set of over 300 human tumor xenografts established from a variety of common cancers, such as bladder, brain, breast, colon, esophagus, kidney, leukemia, liver, lung, melanoma, ovarian, pancreas, prostate , sarcoma, stomach, testicle and uterus. The entire kit can be screened for heterodimers or for phosphorylation of ErbB receptor, such as ErbB2 (HER2) receptor. Subgroups of this set can also be screened for heterodimers or for phosphorylation of ErbB receptor, where the subgroups are for example based on type of tissue, over-, under- or normal expression of ErbB2 or lack of response to "HERCEPTIN®". In this way, tumors can be classified as candidates for treatment with 2C4 based on the presence of heterodimers or by the detection of phosphorylation of ErbB receptor, such as ErbB2 (HER2) receptor. Likewise, patients who have tumors classified in this way can be more quickly assessed as suitable for treatment with 2C4 or a functionally equivalent antibody.

Tumorprøver kan analyseres for nærvær av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, enten før eller etter implanteringen. Tilnærmet 1 g av tumor fra et første og/eller serielt overført xenopoding kan karateriseres molekylært for heterodimerer eller fryses hurtig ned i flytende nitrogen og lagres ved -80C for senere karakterisering. Xenopodede tumorer kan videre analyseres ved en tolags myk-agar analyse, også betegnet en klonogen analyse, som beskrevet for eksempel i Fiebig & Burger, supra. Faste humane tumor-xenopodinger oppbrytes mekanisk og proteolytisk til en enkelt-celle suspensjon som utsåes i flerbrønns plater belagt med myk-agar som beskrevet. Tu mo reel I eve kst in vitro fører til dannelse av kolonier som kan analyseres videre for molekylære egenskaper, slik som heterodimerer eller for fosforylering av ErbB-reseptor, eller for andre histokjemiske eller morfologiske egenskaper. Tumor samples can be analyzed for the presence of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers or for ErbB receptor phosphorylation, either before or after implantation. Approximately 1 g of tumor from a first and/or serially transferred xenopodization can be characterized molecularly for heterodimers or quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -80C for later characterization. Xenopodized tumors can further be analyzed by a two-layer soft-agar assay, also referred to as a clonogenic assay, as described for example in Fiebig & Burger, supra. Fixed human tumor xenografts are broken up mechanically and proteolytically into a single-cell suspension which is seeded in multi-well plates coated with soft agar as described. Tu mo real I eve kst in vitro leads to the formation of colonies which can be analyzed further for molecular characteristics, such as heterodimers or for phosphorylation of ErbB receptor, or for other histochemical or morphological characteristics.

B. Påvisning av EGFR-ErbB2- og ErbB2-ErbB3-heterodimerer B. Detection of EGFR-ErbB2 and ErbB2-ErbB3 heterodimers

Enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget kan anvendes for påvisning av EGFR-ErbB2- eller ErbB2- ErbB3-heterodimerer i tumorer. Flere foretrukne fremgangsmåter er beskrevet nedenfor. Disse fremgangsmåtene påviser ikke-kovalente protein-protein interaksjoner eller viser på annen måte nærhet mellom proteiner av interesse. Fremgangsmåtene som beskrives nedenfor gis som eksempler. Any method known in the art can be used for the detection of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers in tumors. Several preferred methods are described below. These methods detect non-covalent protein-protein interactions or otherwise show proximity between proteins of interest. The procedures described below are given as examples.

Ko-immunpresipitering og immunblotting Co-immunoprecipitation and immunoblotting

Immunaffinitetsbaserte fremgangsmåter, slik som immunpresipitering eller ELISA, kan anvendes for påvisning av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer. Anti-ErbB2-antistoffer kan anvendes for immunpresipitering av komplekser som omfatter ErbB2 fra tumorceller, og det resulterende immunpresipitatet analyseres så for nærvær av EGFR eller ErbB3 ved immunblotting. EGFR- eller ErbB3-antistoffer kan anvendes for immunpresipiteringstrinnet, hvoretter immunpresipitatet analyseres med ErbB2-antistoffer. ErbB-ligander som er spesifikke for HERI, HER3, HER2/HERl-komplekser eller HER2/HER3-komplekser kan anvendes for presipitering av komplekser, som så analyseres for nærvær av HER2. For eksempel kan ligander konjugeres til avidin og kompleksene renses på en biotinkolonne. Immunoaffinity-based methods, such as immunoprecipitation or ELISA, can be used for the detection of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers. Anti-ErbB2 antibodies can be used to immunoprecipitate complexes comprising ErbB2 from tumor cells, and the resulting immunoprecipitate is then analyzed for the presence of EGFR or ErbB3 by immunoblotting. EGFR or ErbB3 antibodies can be used for the immunoprecipitation step, after which the immunoprecipitate is analyzed with ErbB2 antibodies. ErbB ligands specific for HERI, HER3, HER2/HER1 complexes or HER2/HER3 complexes can be used to precipitate complexes, which are then analyzed for the presence of HER2. For example, ligands can be conjugated to avidin and the complexes purified on a biotin column.

I andre utførelsesformer, slik som ELISA-analyser eller antistoff-baserte analyser av "sandwich"-type, immobiliseres antistoffer mot ErbB2 til et fast støttemiddel, settes i forbindelse med tumorceller eller tumorcelle lysat, vaskes og eksponeres for antistoff mot EGFR eller ErbB3. Binding av dette siste antistoff, som kan påvises direkte eller ved hjelp av et sekundært antistoff konjungert til en påvisbar gruppe, indikerer nærvær av heterodimerer. EGFR- eller ErbB3-antistoff kan immobiliseres mens ErbB2-antistoffet anvendes for påvisningstrinnet. I andre utførelsesformer kan ErbB-reseptorligander anvendes i stedet for eller i kombinasjon med anti-ErbB-reseptorantistoffer. In other embodiments, such as ELISA assays or antibody-based "sandwich" type assays, antibodies against ErbB2 are immobilized to a solid support, contacted with tumor cells or tumor cell lysate, washed and exposed to antibody against EGFR or ErbB3. Binding of this latter antibody, which can be detected directly or by means of a secondary antibody conjugated to a detectable group, indicates the presence of heterodimers. EGFR or ErbB3 antibody can be immobilized while the ErbB2 antibody is used for the detection step. In other embodiments, ErbB receptor ligands can be used instead of or in combination with anti-ErbB receptor antibodies.

Immunpresipitering med EGFR-, ErbB2- eller ErbB3-antistoff kan følges av en funksjonell analyse for heterodimerer som et alternativ eller supplement til immunblotting. Immunpresipitering med ErbB-antistoff kan etterfølges av en analyse for reseptor tyrosinkinase aktivitet i immunpresipitatet. Fordi ErbB3 ikke har iboende tyrosinkinase aktivitet viser nærvær av tyrosinkinase aktivitet i immunpresipitatet at ErbB3 sannsynligvis er assosiert med ErbB2. Graus-Porta et all., EMBO Jl, 16:1647-55 Immunoprecipitation with EGFR, ErbB2 or ErbB3 antibody can be followed by a functional assay for heterodimers as an alternative or supplement to immunoblotting. Immunoprecipitation with ErbB antibody can be followed by an analysis for receptor tyrosine kinase activity in the immunoprecipitate. Because ErbB3 does not have intrinsic tyrosine kinase activity, the presence of tyrosine kinase activity in the immunoprecipitate indicates that ErbB3 is likely associated with ErbB2. Graus-Porta et al., EMBO Jl, 16:1647-55

(1997), Klapper et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 96:4995-5000 (1999). Dette resultat kan bekreftes ved immunblotting med ErbB2-antistoffer. Immunpresipitering med ErbB-antistoff kan etterfølges av en analyse for EGFR-reseptor tyrosinkinase aktivitet. I denne analysen settes immunpresipitatet i forbindelse med radioaktivt ATP og et peptidsubstrat som ligner in wVo-setet for transfosforylering av ErbB2 ved hjelp av EGFR. Fosforylering av peptidet viser ko-immunpresipitering og således heterodimerisering av EGFR og ErbB2. Reseptor tyrosinkinase aktivitetsanalyser er velkjente innen faget og omfatter analyser som påviser fosforylering av målsubstrater, for eksempel med fosfotyrosin antistoff og aktivering av tilhørende signaloverførings-veier, for eksempel MAPK-signalveien. (1997), Klapper et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA, 96:4995-5000 (1999). This result can be confirmed by immunoblotting with ErbB2 antibodies. Immunoprecipitation with ErbB antibody can be followed by an assay for EGFR receptor tyrosine kinase activity. In this assay, the immunoprecipitate is combined with radioactive ATP and a peptide substrate that resembles the in wVo site for transphosphorylation of ErbB2 by EGFR. Phosphorylation of the peptide shows co-immunoprecipitation and thus heterodimerization of EGFR and ErbB2. Receptor tyrosine kinase activity assays are well known in the art and include assays that detect phosphorylation of target substrates, for example with phosphotyrosine antibody and activation of associated signal transmission pathways, for example the MAPK signaling pathway.

Variasjoner av fremgangsmåtene og analysene ovenfor vil være åpenbare og rutinemessige for gjennomsnitts fagpersoner. Variations of the above procedures and analyzes will be obvious and routine to those of ordinary skill in the art.

Kjemisk kryssbinding eller UV-kryssbinding kan også anvendes for kovalent sammenbinding av heterodimerer på overflaten av levende celler. Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53. Eksempler på kjemiske kryssbindere omfatter ditiobis-(suksinimidyl)propionat (DSP) og 3,3'-ditiobis(sulfosukinimidyl)propionat (DTSSP). I én utførelsesform analyseres celleekstrakter fra kjemisk kryssbunde tumorceller med SDS-PAGE og immunblottes med antistoffer mot EGFR og/eller ErbB3. Et bånd med endret mobilitet og passende molekylvekt representerer sannsynligvis EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer, siden ErbB2 er den foretrukne heterodimeriseringspartner for EGFR og ErbB3. Dette resultat kan bekreftes med påfølgende immunblotting med ErbB2-antistoffer. Chemical cross-linking or UV cross-linking can also be used for covalent linking of heterodimers on the surface of living cells. Hunter et al., Biochem. J., 320:847-53. Examples of chemical crosslinkers include dithiobis-(succinimidyl)propionate (DSP) and 3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidyl)propionate (DTSSP). In one embodiment, cell extracts from chemically cross-linked tumor cells are analyzed by SDS-PAGE and immunoblotted with antibodies against EGFR and/or ErbB3. A band with altered mobility and appropriate molecular weight likely represents EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers, since ErbB2 is the preferred heterodimerization partner for EGFR and ErbB3. This result can be confirmed with subsequent immunoblotting with ErbB2 antibodies.

FRET og fluorescensbaserte fremgangsmåter FRET and fluorescence-based methods

Fluorescensressonans energioverføring (FRET) kan også anvendes for påvisning av EGFR-ErbB2- eller ErB2-ErbB3-heterodimerer. FRET påviser konformasjonsendringer i proteiner og protein-protein interaksjoner in vivo og in vitro basert på overføring av Fluorescence resonance energy transfer (FRET) can also be used for the detection of EGFR-ErbB2 or ErB2-ErbB3 heterodimers. FRET detects conformational changes in proteins and protein-protein interactions in vivo and in vitro based on the transfer of

energi fra en donor fluorofor til en akseptor fluorofor. Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34 energy from a donor fluorophore to an acceptor fluorophore. Selvin, Nat. Struct. Biol., 7:730-34

(2000). Energioverføringen finner kun sted dersom donor fluoroforen er tilstrekkelig nær akseptor fluoroforen. I et typisk FRET-eksperiment merkes to proteiner eller to seter i et enkelt protein med forskjellige fluoriserende prober. Én av probene, donorproben, eksiteres til en høyere energitilstand ved innfallende lys av en gitt bølgelengde. Donorproben overfører så sin energi til den andre proben, akseptorproben, noe som fører til en reduksjon av donorens fluorescens intensitet og en økning av akseptorens fluorescens utsending. For å måle omfanget av energioverføring sammenlignes donorens intensitet i en prøve merket med donor- og akseptorprober med intensiteten i en prøve som kun er merket med donorprobe. Om ønskelig sammenlignes akseptorintensiteten i donor/akseptorprøve og prøver med kun akseptor. Egnede prober er kjente innen faget og omfatter for eksempel membrangjennomtrengende fargestoffer som fluorescein og rhodamin, organiske fargestoffer, for eksempel cyanin fargestoffer, og lantanid atomer. Selvin, supra. Fremgangsmåter og instrumentering for påvisning og måling av energi-overføring er også kjente innen faget. Selvin supra. (2000). The energy transfer only takes place if the donor fluorophore is sufficiently close to the acceptor fluorophore. In a typical FRET experiment, two proteins or two sites in a single protein are labeled with different fluorescent probes. One of the probes, the donor probe, is excited to a higher energy state by incident light of a given wavelength. The donor probe then transfers its energy to the other probe, the acceptor probe, which leads to a decrease in the donor's fluorescence intensity and an increase in the acceptor's fluorescence emission. To measure the extent of energy transfer, the intensity of the donor in a sample labeled with donor and acceptor probes is compared to the intensity in a sample labeled only with donor probe. If desired, compare the acceptor intensity in donor/acceptor sample and samples with only acceptor. Suitable probes are known in the art and include, for example, membrane-penetrating dyes such as fluorescein and rhodamine, organic dyes, for example cyanine dyes, and lanthanide atoms. Selvin, supra. Methods and instrumentation for detecting and measuring energy transfer are also known in the art. Selvin supra.

FRET-baserte teknikker som er egnede for påvisning og måling av protein-protein interaksjoner i enkeltceller er også kjente innen faget. For eksempel kan donor lysblekende fluorescens ressonans energioverføring (pbFRET)-mikroskopi og sanntids fluorescens billeddannelses mikroskopi (FLIM) anvendes for påvisning av dimerisering av celleoverflatereseptorer. Selvin, supra, Gadella &. Jovin, J. Cell. Biol., 129:1543-58 FRET-based techniques which are suitable for the detection and measurement of protein-protein interactions in single cells are also known in the art. For example, donor light-bleaching fluorescence resonance energy transfer (pbFRET) microscopy and real-time fluorescence imaging microscopy (FLIM) can be used to detect dimerization of cell surface receptors. Selvin, supra, Gadella &. Jovin, J. Cell. Biol., 129:1543-58

(1995). pbFRET kan anvendes på celler, enten "i suspensjon" eller "in situ", for påvisning og måling av dannelsen av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer som beskrevet i Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 (1998). Disse teknikkene måler reduksjonen i en donors fluorescens levetid grunnet energioverføring. (1995). pbFRET can be applied to cells, either "in suspension" or "in situ", to detect and measure the formation of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers as described in Nagy et al., Cytometry, 32:120-131 ( 1998). These techniques measure the reduction in a donor's fluorescence lifetime due to energy transfer.

En "flow"-cytometrisk FRET-teknikk av Foerster-type (FCET) kan anvendes for å undersøke EGFR-ErbB2- og ErbB2-ErbB3-heterodimerisering som beskrevet i Nagy et al., supra og Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48 (2001). A Foerster-type flow cytometric FRET technique (FCET) can be used to examine EGFR-ErbB2 and ErbB2-ErbB3 heterodimerization as described in Nagy et al., supra and Brockhoff et al., Cytometry, 44: 338-48 (2001).

FRET anvendes fortrinnsvis i forbindelse med standardteknikker for immunhistokjemisk merking. Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). Foreksempel kan antistoffer konjungert til egnede fluorescerende fargestoffer anvendes som prober for merking av to forskjellige proteiner. Dersom proteinene ligger nær hverandre fungerer de fluorescerende fargestoffene som donorer og akseptorer for FRET. Energioverføring påvises ved standard fremgangsmåter. Energioverføring kan påvises ved "flow"-cytometriske midler eller ved hjelp av digitale mikroskopi systemer, for eksempel konfokal mikroskopi eller bredfelt-fluorescens mikroskopi, koblet til et CCD-kamera. FRET is preferably used in conjunction with standard techniques for immunohistochemical labeling. Kenworthy, Methods, 24:289-96 (2001). For example, antibodies conjugated to suitable fluorescent dyes can be used as probes for labeling two different proteins. If the proteins are close to each other, the fluorescent dyes act as donors and acceptors for FRET. Energy transfer is detected by standard methods. Energy transfer can be detected by flow cytometric means or by means of digital microscopy systems, such as confocal microscopy or wide-field fluorescence microscopy, connected to a CCD camera.

ErbB2-antistoffer og enten EGFR eller ErbB3-antistoffer kan merkes direkte med to forskjellige fluoroforer for eksempel som beskrevet i Nagy et al., supra. Tumorceller eller tumorcelle lysater settes i forbindelse med de differensielt merkede antistoffene, som fungerer som donor og akseptor for FRET i nærvær av EGFR-ErbB2- eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer. Alternativt anvendes umerkede antistoffer mot ErbB2 og enten EGFR eller ErbB3 sammen med differensielt merkede sekundære antistoffer som fungerer som donorer og akseptorer. Se for eksempel Brockhoff et al., supra. Energioverføring påvises og nærvær av heterodimerer fastslås dersom de merkede gruppene finnes å ligge nær hverandre. ErbB2 antibodies and either EGFR or ErbB3 antibodies can be directly labeled with two different fluorophores for example as described in Nagy et al., supra. Tumor cells or tumor cell lysates are put in connection with the differentially labeled antibodies, which act as donor and acceptor for FRET in the presence of EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers. Alternatively, unlabeled antibodies against ErbB2 and either EGFR or ErbB3 are used together with differentially labeled secondary antibodies that function as donors and acceptors. See, for example, Brockhoff et al., supra. Energy transfer is detected and the presence of heterodimers is determined if the labeled groups are found to be close to each other.

ErbB-reseptorligander som er spesifikke for HER2 og enten HERI eller HER3 kan fluorescensmerkes og anvendes for FRET-undersøkelser. ErbB receptor ligands specific for HER2 and either HERI or HER3 can be fluorescently labeled and used for FRET studies.

Nærvær av heterodimrer på overflaten av tumorceller kan påvises ved ko-lokalisering av ErbB2 og enten EGFR eller ErbB3 ved anvendelse av standard direkte eller indirekte immunfluorescensteknikker og konfokal laserscannende mikroskopi. Alternativt anvendes laserscannende billeddannelse (LSI) for påvisning av antistoff binding og ko-lokalisering av ErbB2 og enten EGFR eller ErbB3 i et høy-kapasitetsformat, for eksempel en mikrobrønn plate som beskrevet i Zuck et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 96:11122-27 (1999). The presence of heterodimers on the surface of tumor cells can be detected by co-localization of ErbB2 and either EGFR or ErbB3 using standard direct or indirect immunofluorescence techniques and confocal laser scanning microscopy. Alternatively, laser scanning imaging (LSI) is used to detect antibody binding and co-localization of ErbB2 and either EGFR or ErbB3 in a high-throughput format, for example a microwell plate as described in Zuck et al., Proe. Nati. Acad. Pollock. USA, 96:11122-27 (1999).

Nærvær av EGFR-ErbB2- og/eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer kan bestemmes ved å påvise enzymatisk aktivitet som avhenger av at heterodimer bestanddelene ligger nær hverandre. Et ErbB2-antistoff konjugeres til et enzym, mens et EGFR- eller ErbB3-antistoff konjugeres til et andre enzym. Et første substrat for det første enzym tilsettes, og reaksjonen danner et andre substrat for det andre enzym. Dette fører til en reaksjon med et annet molekyl slik at det dannes en påvisbar forbindelse, slik som et fargestoff. Nærvær av et annet kjemisk stoff nedbryter det andre substratet, slik at reaksjonen med det andre enzym forhindres med mindre det første og det andre enzym, og således de to antistoffene, ligger nær hverandre. Tumorceller eller cellelysater kan settes i forbindelse med et ErbB2-antistoff som er konjungert til glukoseoksidase og et ErbB3- eller ErbBl-antistoff som er konjungert til pepperrot peroksidase. Glukose tilsettes til reaksjonen sammen med en forløper for et fargestoff, for eksempel DAB, og katalase. Nærvær av heterodimerer bestemmes ved fargedannelse etter farging for DAB. The presence of EGFR-ErbB2 and/or ErbB2-ErbB3 heterodimers can be determined by detecting enzymatic activity that depends on the proximity of the heterodimer components. An ErbB2 antibody is conjugated to an enzyme, while an EGFR or ErbB3 antibody is conjugated to a second enzyme. A first substrate for the first enzyme is added, and the reaction forms a second substrate for the second enzyme. This leads to a reaction with another molecule to form a detectable compound, such as a dye. The presence of another chemical substance degrades the second substrate, so that the reaction with the second enzyme is prevented unless the first and the second enzyme, and thus the two antibodies, are close to each other. Tumor cells or cell lysates can be combined with an ErbB2 antibody conjugated to glucose oxidase and an ErbB3 or ErbB1 antibody conjugated to horseradish peroxidase. Glucose is added to the reaction along with a precursor for a dye, such as DAB, and catalase. The presence of heterodimers is determined by color formation after staining for DAB.

"eTag™" -analysesystem "eTag™" analysis system

Heterodimerer kan påvises ved anvendelse av fremgangsmåter basert på "eTag™"-analysesystemet (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), som beskrevet i for eksempel WO 83502 og i US patentsøknad nr. 2001/0049105, publisert 6. desember 2001. En "eTag™" eller "elektroforetisk merkelapp" omfatter en påvisbar rapportør-gruppe, for eksempel en fluorescerende gruppe. Den kan også omfatte en "mobilitetsmodifiserende gruppe", som i det vesentlige består av en gruppe med spesiell elektroforetisk mobilitet. Disse gruppene tillater separasjon og påvisning av "eTag™" fra en kompleks blanding under definerte elektroforetiske betingelser, for eksempel kapillær elektroforese (CE). Den delen av "eTag™"-gruppen som inneholder rapportørgruppen og om ønskelig den mobilitetsmodifiserende gruppe kobles til en første målbindende gruppe ved hjelp av en spaltbar sammenbindingsgruppe slik at det dannes en første bindende forbindelse. Den første målbindende gruppe gjenkjenner spesifikt et gitt første mål, for eksempel en nukleinsyre eller et protein. Den første målbindende gruppen er for eksempel et polynukleotid eller et polypeptid. Den første målbindende gruppen er fortrinnsvis et antistoff eller et antistoff fragment. Alternativt kan den første målbindende gruppen være en ErbB-reseptorligand eller et bindende fragment av denne. Heterodimers can be detected using methods based on the "eTag™" assay system (Aclara Bio Sciences, Mountain View, CA), as described in, for example, WO 83502 and in US Patent Application No. 2001/0049105, published December 6, 2001. A "eTag™" or "electrophoretic tag" comprises a detectable reporter group, such as a fluorescent group. It may also comprise a "mobility modifying group", which essentially consists of a group with special electrophoretic mobility. These groups allow the separation and detection of "eTag™" from a complex mixture under defined electrophoretic conditions, for example capillary electrophoresis (CE). The part of the "eTag™" group containing the reporter group and, if desired, the mobility modifying group is linked to a first target binding group by means of a cleavable linking group so that a first binding compound is formed. The first target binding group specifically recognizes a given first target, for example a nucleic acid or a protein. The first target-binding group is, for example, a polynucleotide or a polypeptide. The first target-binding group is preferably an antibody or an antibody fragment. Alternatively, the first target binding group can be an ErbB receptor ligand or a binding fragment thereof.

Sammenkoblingsgruppen omfatter fortrinnsvis en spaltbar gruppe, slik som et enzymsubstrat, eller en hvilken som helst kjemisk binding som kan spaltes under definerte betingelser. Når den første målbindende gruppen binder til sitt mål innføres og/eller aktiveres spaltningsmiddelet, og sammenkoblingsgruppen spaltes slik at den del av "eTag™" som inneholder rapportørgruppen og den mobilitetsmodifiserende gruppe frigis. Nærvær av "fri" "eTag™" viser således binding av den målbindende gruppe til sitt The linking group preferably comprises a cleavable group, such as an enzyme substrate, or any chemical bond that can be cleaved under defined conditions. When the first target-binding group binds to its target, the cleavage agent is introduced and/or activated, and the linking group is cleaved so that the part of the "eTag™" containing the reporter group and the mobility-modifying group is released. The presence of "free" "eTag™" thus shows binding of the target binding group to its

o, oh,

mal. goal.

En andre bindende forbindelse omfatter fortrinnsvis spaltningsmiddelet og en andre målbindende gruppe som spesifikt gjenkjenner et andre mål. Den andre målbindende gruppe kan for eksempel være et antistoff eller et antistoff fragment eller en ErbB-reseptorligand eller et bindende ligandfragment. Spaltningsmiddelet er slik at det kun vil spalte sammenkoblingsgruppen i den første bindende forbindelse dersom den første bindende forbindelse og den andre bindende forbindelse befinner seg svært nær hverandre. A second binding compound preferably comprises the cleavage agent and a second target binding group that specifically recognizes a second target. The second target-binding group can, for example, be an antibody or an antibody fragment or an ErbB receptor ligand or a binding ligand fragment. The cleaving agent is such that it will only cleave the linking group in the first binding compound if the first binding compound and the second binding compound are very close to each other.

En første bindende forbindelse kan omfatte en "eTag™" i hvilken et antistoff mot ErbB2 fungerer som den første målbindende gruppe. En andre bindende forbindelse omfatter et antistoff mot EGFR eller ErbB3 koblet til et spaltningsmiddel som kan spalte "eTag™"-koblingsgruppen. Spaltningsmiddelet må fortrinnsvis aktiveres for å kunne spalte koblingsgruppen. Tumorceller eller tumor cellelysater settes i forbindelse med "eTag™"-forbindelsen, som bindes til ErbB2, og med det modifiserte EGFR- eller ErbB3-antistoff, som bindes til EGFR eller ErbB3 på celleoverflaten. Ubundet bindene forbindelse fjernes fortrinnsvis og spaltningsmiddelet aktiveres om nødvendig. Dersom EGFR-ErbB2 eller ErbB2-ErbB3-heterodimerer foreligger vil spaltningsmiddelet spalte koblingsgruppen og frigi "eTag™" grunnet den korte avstand mellom spaltningsmiddelet og koblingsgruppen. Fri "eTag™" kan så påvises ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen faget, for eksempel kapillær elektroforese. A first binding compound may comprise an "eTag™" in which an antibody against ErbB2 serves as the first target binding group. A second binding compound comprises an antibody against EGFR or ErbB3 linked to a cleaving agent capable of cleaving the "eTag™" linker. The cleaving agent must preferably be activated in order to cleave the linking group. Tumor cells or tumor cell lysates are combined with the "eTag™" compound, which binds to ErbB2, and with the modified EGFR or ErbB3 antibody, which binds to EGFR or ErbB3 on the cell surface. Unbound bound compounds are preferably removed and the cleavage agent is activated if necessary. If EGFR-ErbB2 or ErbB2-ErbB3 heterodimers are present, the cleavage agent will cleave the coupling group and release "eTag™" due to the short distance between the cleavage agent and the coupling group. Free "eTag™" can then be detected by any method known in the art, for example capillary electrophoresis.

Spaltningsmiddelet kan være et aktiverbart kjemisk molekyl som virker på koblingsgruppen. Spaltningsmiddelet kan for eksempel aktiveres ved å utsette prøven for lys. The cleaving agent can be an activatable chemical molecule that acts on the linking group. The cleavage agent can be activated, for example, by exposing the sample to light.

"eTag™"-gruppen kan fremstilles ved anvendelse av et antistoff mot EGFR eller ErbB3 som den første målbindende gruppe, mens den andre bindende forbindelsen er fremstilt fra et antistoff mot ErbB2. The "eTag™" group can be prepared using an antibody against EGFR or ErbB3 as the first target binding group, while the second binding compound is prepared from an antibody against ErbB2.

Påvisning av fosforlyering av ErbB-reseptor Detection of ErbB receptor phosphorylation

Forekomst av fosforylering av ErbB-reseptor kan anvendes for å vise HER2-aktivering. Occurrence of phosphorylation of ErbB receptor can be used to show HER2 activation.

I én utførelsesform påvises fosforylering av ErbB-reseptor ved immunpresipitering av én eller flere ErbB-reseptorer, for eksempel ErbB2 (HER2)-reseptor, og Western-blott analyse. For eksempel vises positiv fosforylering ved nærvær av et fosfo-HER2-bånd i gelen ved anvendelse av et anti-fosfotyrosin antistoff for påvisning av én eller flere fosforylerte tyrosinrester i den eller de immunpresipiterte ErbB-reseptorene. Anti-fosfotyrosin antistoffer er kommersielt tilgjengelige fra PanVera (Madison, WI), en undergruppe av Invitrogen, Chmicon International Inc. (Temecula, CA) eller Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Et negativt resultat vises ved fravær av båndet. In one embodiment, phosphorylation of ErbB receptor is detected by immunoprecipitation of one or more ErbB receptors, for example ErbB2 (HER2) receptor, and Western blot analysis. For example, positive phosphorylation is shown by the presence of a phospho-HER2 band in the gel using an anti-phosphotyrosine antibody to detect one or more phosphorylated tyrosine residues in the immunoprecipitated ErbB receptor(s). Anti-phosphotyrosine antibodies are commercially available from PanVera (Madison, WI), a subsidiary of Invitrogen, Chmicon International Inc. (Temecula, CA), or Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). A negative result is indicated by the absence of the band.

Fosforylering av ErbB2 (HER2)-reseptor kan påvises ved immunhistokjemisk analyse og anvendelse av et fosforspesifikt anti-HER2-antistoff (klon PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000)). Phosphorylation of ErbB2 (HER2) receptor can be detected by immunohistochemical analysis and the use of a phosphor-specific anti-HER2 antibody (clone PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol., 18(18):3230-3239 (2000) ).

Andre fremgangsmåter for påvisning av fosforylering av én eller flere ErbB-reseptorer inkluderer KIRA ELISA (US patentskrift nr. 5 766 863, 5 891 650, 5 914 237, 6 025 145 og 6 287 784), massespektrometri (sammenligning av størrelsen av fosforylert og ikke-fosforylert HER2) og "e-Tag™"-proksimtetsanalyse med anti-HER2-antistoff (f. eks. ved anvendelse av "eTag™"-analysesettet som er tilgjengelig fra Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Detaljer vedrørende "eTag™"-analysen er beskrevet her ovenfor. Other methods for detecting phosphorylation of one or more ErbB receptors include KIRA ELISA (US Patent Nos. 5,766,863, 5,891,650, 5,914,237, 6,025,145 and 6,287,784), mass spectrometry (comparison of the size of phosphorylated and non-phosphorylated HER2) and "e-Tag™" proximity assay with anti-HER2 antibody (eg, using the "eTag™" assay kit available from Aclara BioSciences (Mountain View, CA). Details regarding " The "eTag™" analysis is described here above.

Vektorer, vertsceller og rekombinante fremgangsmåter Vectors, host cells and recombinant methods

Beskrevet her er isolert nukleinsyre som koder for humaniserte anti-ErbB2-antistoff, rhu Mab2C4, vektorer og vertsceller som omfatter nukleinsyren og rekombinante teknikker for fremstilling av antistoffet. Described herein are isolated nucleic acid encoding humanized anti-ErbB2 antibody, rhu Mab2C4, vectors and host cells comprising the nucleic acid and recombinant techniques for producing the antibody.

For rekombinant fremstilling av et antistoff isoleres nukleinsyren som koder for antistoffet og settes inn i en replikerbar vektor for videre kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. DNA som koder for det monoklonale antistoffet kan lett isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (f. eks. ved anvendelse av oligonukleotid-prober som er istand til å bindes spesifikt til gener som koder for de tunge og lette kjedene til antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Vektor-komponenten inkluderer vanligvis én eller flere av følgende: en signalsekvens, et replikasjonsorigo, ett eller flere markørgener, et enhancer element, en promoter og en transkripsjonsterminerings-sekvens. For recombinant production of an antibody, the nucleic acid that codes for the antibody is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or for expression. DNA encoding the monoclonal antibody can be readily isolated and sequenced using conventional methods (eg, using oligonucleotide probes capable of binding specifically to genes encoding the heavy and light chains of the antibody). Many vectors are available. The vector component usually includes one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter and a transcription termination sequence.

Signalsekvens bestanddelen The signal sequence component

Rhu Mab 2C4 kan fremstilles rekombinant, ikke bare direkte, men også som fusjonspolypeptider med et heterologt polypeptid, som fortrinnsvis er en signal-sekvens eller et annet polypeptid med et spesifikt kløyvingssete i N-enden av det modne protein eller polypeptid. Den valgte heterologe signalsekvensen er fortrinnsvis en sekvens som gjenkjennes og prosesseres (dvs. spaltes av en signalpeptidase) av vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og prosesserer den native signalsekvens i anti-ErbB2-antistoffet erstattes signalsekvensen med en prokaryot signalsekvens som for eksempel er valgt fra gruppen som består av ledersekvenser fra alkalisk fosfatase, penicillinase, Ipp eller varme-stabilt enterotoksin II. For sekresjon i gjær kan den native signalsekvens for eksempel erstattes med ledersekvensen fra invertase i gjær, a-faktor-leder sekvens (inkludert a-faktor ledersekvens fra Saccharomyces og Kluyveromyces) eller ledersekvens fra sur fosfatase, ledersekvensen fra glukoamylase fra C. albicans eller signalsekvensen beskrevet i WO 90/13646. For ekspresjon i pattedyr-celler er signalsekvenser fra pattedyr så vel som virus sekretoriske ledere, for eksempel herpes simplex gD signalet, tilgjengelige. Rhu Mab 2C4 can be produced recombinantly, not only directly, but also as fusion polypeptides with a heterologous polypeptide, which is preferably a signal sequence or another polypeptide with a specific cleavage site at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. The chosen heterologous signal sequence is preferably a sequence that is recognized and processed (ie cleaved by a signal peptidase) by the host cell. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native signal sequence in the anti-ErbB2 antibody, the signal sequence is replaced with a prokaryotic signal sequence selected, for example, from the group consisting of leader sequences from alkaline phosphatase, penicillinase, Ipp or heat-stable enterotoxin II. For secretion in yeast, the native signal sequence can for example be replaced with the leader sequence from invertase in yeast, α-factor leader sequence (including α-factor leader sequence from Saccharomyces and Kluyveromyces) or leader sequence from acid phosphatase, the leader sequence from glucoamylase from C. albicans or the signal sequence described in WO 90/13646. For expression in mammalian cells, signal sequences from mammals as well as viral secretory leaders, for example the herpes simplex gD signal, are available.

DNA for et slikt forløperområde ligeres med opprettholdt leseramme til DNA som koder for anti-ErbB2-antistoffet. DNA for such a precursor region is ligated with maintained reading frame to DNA encoding the anti-ErbB2 antibody.

Replikasjonsorigo- bestanddelen The origin of replication component

Både ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som gjør vektoren istand til å replikeres i én eller flere valgte vertsceller. I kloningsvektorer er denne sekvensen vanligvis én som gjør vektoren istand til å replikeres uavhengig av vertens kromosomale DNA og inkluderer replikasjonsorigo'er eller autonomt replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente for en rekke bakterier, gjær og vimser. Replikasjonsorigo fra plasmid pBR322 er egnet for de fleste Gram-negative bakterier, det 2n-plasmidorigoet er egnet for gjær og forskjellige virus origo'er (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller PBV) er nyttige for kloningsvektorer i pattedyrceller. Vanligvis er replikasjonsorigo-bestanddelen ikke nødvendig for pattedyr ekspresjonsvektorer (SV40-origoet kan typisk anvendes bare fordi denne omfatter den tidlige promoter) Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. In cloning vectors, this sequence is usually one that enables the vector to replicate independently of the host's chromosomal DNA and includes origins of replication or autonomously replicating sequences. Such sequences are well known for a number of bacteria, yeasts and fungi. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2n plasmid origin is suitable for yeast and various virus origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or PBV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. Generally, the origin of replication component is not required for mammalian expression vectors (the SV40 origin can typically be used only because it includes the early promoter)

Seleksjonsgen - bestanddelen Selection gene - the component

Ekspresjons- og kloningsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen, også betegnet en seleksjonsmarkør. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) gir resistens ovenfor antibiotika eller andre toksiner, f. eks. ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetracyklin, (b) komplementerer auksotrofiske mangler eller (c) tilfører nødvendige næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra komplekse medier, f. eks. genet som koder for D-alanin racemase for Bacilli. Expression and cloning vectors may contain a selection gene, also referred to as a selection marker. Typical selection genes code for proteins that (a) provide resistance to antibiotics or other toxins, e.g. ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b) complement auxotrophic deficiencies or (c) supply necessary nutrients not available from complex media, e.g. the gene encoding D-alanine racemase for Bacilli.

Ett eksempel på et seleksjonsskjema benytter et medikament for å stoppe vekst av en vertscelle. De cellene som er vellykket transformert med et heterologt gen danner et protein som gir medikamentresistens og overlever derfor seleksjonsregimet. Eksempler på slik dominant seleksjon anvender medikamentene neomycin, mykofenolsyre og hygromycin. One example of a selection scheme uses a drug to stop the growth of a host cell. Those cells that are successfully transformed with a heterologous gene form a protein that confers drug resistance and therefore survive the selection regime. Examples of such dominant selection use the drugs neomycin, mycophenolic acid and hygromycin.

Et annet eksempel på egnede seleksjonsmarkører for pattedyrceller er de som muliggjør identifisering av celler som er kompetente til å ta opp anti-ErbB-antistoff-nukleinsyren slik som DHFR-genet, thymidinkinase genet, metallotionein-I og -II-gener, fortrinnsvis primat metallotionein gener, adenosindeaminase genet, ornitin-dekarboksylase genet osv. Another example of suitable selection markers for mammalian cells are those which enable the identification of cells competent to take up the anti-ErbB antibody nucleic acid such as the DHFR gene, thymidine kinase gene, metallothionein-I and -II genes, preferably primate metallothionein genes, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, etc.

For eksempel identifiseres først celler som er transformert med DHFR-seleksjons-genet ved å dyrke alle transformantene i et dyrkningsmedium som inneholder metotreksat (Mtx), en kompetitiv DHFR-antagonist. En egnet vertscelle når DHFR av vildtype benyttes, er den kinesisk hamster ovarie (CHO)-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet. For example, cells transformed with the DHFR selection gene are first identified by growing all the transformants in a culture medium containing methotrexate (Mtx), a competitive DHFR antagonist. A suitable host cell when wild-type DHFR is used is the Chinese hamster ovary (CHO) cell line lacking DHFR activity.

Alternativt kan vertsceller (fortrinnsvis vertsceller av vildtype som inneholder endogen DHFR) transformert eller ko-transformert med DNA-sekvenser som koder for anti-ErbB2-antistoff, vildtype DHFR-protein og en annen seleksjonsmarkør, slik som aminoglykosid-3'-fosfotransferase (APH), selekteres ved celledyrking i medium som inneholder et seleksjonsmiddel for seleksjonsmarøkren slik som et aminoglykosidisk antibiotikum, f. eks. kanamycin, neomycin eller G418. Se US patentskrift nr. 4 965 199. Alternatively, host cells (preferably wild-type host cells containing endogenous DHFR) can be transformed or co-transformed with DNA sequences encoding anti-ErbB2 antibody, wild-type DHFR protein and another selection marker, such as aminoglycoside 3'-phosphotransferase (APH ), are selected by cell cultivation in medium containing a selection agent for the selection marrow, such as an aminoglycoside antibiotic, e.g. kanamycin, neomycin or G418. See US Patent No. 4,965,199.

Et egnet seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trpl-genet som foreligger i gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Trpl-genet giren seleksjonsmarkør for en mutert gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Nærværet av trpl-lesjonen i gjær-vertscellegenomet gir så et effektivt miljø for påvisning av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan. På tilsvarende måte komplementeres Lau2-manglende gjærstammer (ATCC 20 622 eller 38,626) av kjente plasmider som bærer Leu2-genet. A suitable selection gene for use in yeast is the trpl gene present in the yeast plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). The trpl gene provides a selectable marker for a mutant yeast strain lacking the ability to grow in tryptophan, for example ATCC No. 44076 or PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). The presence of the trpl lesion in the yeast host cell genome then provides an efficient environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan. In a similar way, Lau2-deficient yeast strains (ATCC 20 622 or 38,626) are complemented by known plasmids carrying the Leu2 gene.

I tillegg kan vektorer avledet fra det 1,6 nm sirkulære plasmid pKDl anvendes for transformasjon av /C/yu<y>eromyces-gjærceller. Alternativt ble et ekspresjonssystem for stor-skala fremstilling av rekombinant kalvechymosin rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stabile flere-kopi-ekspresjonsvektorer for sekresjon av modent, rekombinant humant serumalbumin fra industrielle stammer av Kluyveromyces har også blitt beskrevet. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). In addition, vectors derived from the 1.6 nm circular plasmid pKD1 can be used for transformation of /C/yu<y>eromyces yeast cells. Alternatively, an expression system for large-scale production of recombinant calf chymosin was reported for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stable multi-copy expression vectors for the secretion of mature recombinant human serum albumin from industrial strains of Kluyveromyces have also been described. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

Promoter bestanddelen Promote the ingredient

Ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promoter som gjenkjennes av vertsorganismen og som er operativt koblet til anti-ErbB2-antistoff-nukleinsyren. Promotere som er egnede for anvendelse med prokaryote verter inkluderer phoA-promoteren, p-laktamase- og laktose-promotersystemer, alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp)-promotersystem og hybride promotere, for eksempel tac-promoteren. Imidlertid er også andre kjente bakte ri ep ro mote re egnet. Promotere for anvendelse i bakterielle systemer vil også inneholde en Shine-Delgarno (S.D.)-sekvens operativt koblet til DNA som koder for anti-ErbB2-antistoffet. Expression and cloning vectors typically contain a promoter recognized by the host organism operably linked to the anti-ErbB2 antibody nucleic acid. Promoters suitable for use with prokaryotic hosts include the phoA promoter, β-lactamase and lactose promoter systems, alkaline phosphatase, a tryptophan (trp) promoter system, and hybrid promoters, such as the tac promoter. However, other known baked goods are also suitable. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Delgarno (S.D.) sequence operably linked to DNA encoding the anti-ErbB2 antibody.

Promotersekvenser er kjente for eukaryoter. Nær sagt alle eukaryote gener har et AT-rikt område plassert tilnærmet 25 til 30 baser oppstrøms for setet hvor transkripsjonen initieres. En annen sekvens som finnes 70 til 80 baser oppstrøms for transkripsjonsstart i mange gener er et CNCAAT-område, hvor N kan være ethvert nukleotid. I 3'-enden av de fleste eukaryote gener er en AATAAA-sekvens som kan være signalet for addering av poly A-halen til 3'-enden av den kodende sekvens. Alle disse sekvensene innsettes på egnet vis i eukaryote ekspresjonsvektorer. Promoter sequences are known for eukaryotes. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25 to 30 bases upstream of the site where transcription is initiated. Another sequence found 70 to 80 bases upstream of the transcription start in many genes is a CNCAAT region, where N can be any nucleotide. At the 3' end of most eukaryotic genes is an AATAAA sequence which may be the signal for addition of the poly A tail to the 3' end of the coding sequence. All these sequences are suitably inserted into eukaryotic expression vectors.

Eksempler på egnede promotersekvenser for anvendelse med gjær-vertsceller inkluderer promoteren fra 3-fosfoglyceratkinase eller andre glykolytiske enzymer, slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfolglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Examples of suitable promoter sequences for use with yeast host cells include the promoter from 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase , triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase.

Andre gjærpromotere som er induserbare promotere som har den ekstra fordelen at transkripsjonen kontrolleres av vekstbetingelsene er promoterområdene fra alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer forbundet med nitrogenmebatolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for maltose og galaktose utnyttelse. Egnede vektorer og promotere for anvendelse ved gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i EP 73 657. Gjær-enhancere anvendes også med fordel sammen med gjærpromotere. Other yeast promoters that are inducible promoters that have the added advantage that transcription is controlled by growth conditions are the promoter regions of alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzymes associated with nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and enzymes responsible for maltose and galactose utilization. Suitable vectors and promoters for use in yeast expression are further described in EP 73 657. Yeast enhancers are also advantageously used together with yeast promoters.

Anti-ErbB2-antistoff transkripsjon fra vektorer i pattedyr vertsceller kontrolleres for eksempel av promotere fremskaffet fra genomet til virus slik som polyomavirus, fjærfekoppervirus, adenovirus (slik som adenovirus 2), bovint papilloma virus, fugle sarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og mest foretrukket Simian virus 40 (SV40), fra heterologe pattedyr promotere, f. eks. aktinpromoteren eller en immunglobulin promoter, fra varmesjokk promotere, forutsatt at disse promoterne er forenelige med vertscelle-systemene. Anti-ErbB2 antibody transcription from vectors in mammalian host cells is controlled, for example, by promoters derived from the genome of viruses such as polyoma virus, fowl pox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, a retrovirus, hepatitis-B -virus and most preferably Simian virus 40 (SV40), from heterologous mammalian promoters, e.g. the actin promoter or an immunoglobulin promoter, from heat shock promoters, provided that these promoters are compatible with the host cell systems.

Den tidlige og sene promoter fra SV40-virus fremskaffes hendig som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder replikasjonsorigoet for SV40 virus. Den umiddelbart tidligere promoter fra humant cytomegalovirus fremskaffes hendig som et HindIII-E-restriksjonsfragment. Et system for ekspresjon av DNA i pattedyr vertsceller som benytter bovint papilloma virus som en vektor er beskrevet i US patentskrift nr. 4 419 446. En modifikasjon av dette systemet er beskrevet i US patentskrift nr. 4 601 978. Se også Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) vedrørende ekspresjon av humant p-interferon-cDNA i museceller under kontroll av en thymidinkinase-promoter fra herpes simpleks-virus. Alternativt kan lang-terminal-repitisjon fra rous sarkom virus anvendes som promoter. The SV40 virus early and late promoter is conveniently obtained as an SV40 restriction fragment which also contains the SV40 virus origin of replication. The immediately preceding promoter from human cytomegalovirus is conveniently provided as a HindIII-E restriction fragment. A system for expression of DNA in mammalian host cells using bovine papilloma virus as a vector is described in US Patent No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Patent No. 4,601,978. See also Reyes et al. , Nature, 297:598-601 (1982) regarding the expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of a herpes simplex virus thymidine kinase promoter. Alternatively, long-terminal repeat from rous sarcoma virus can be used as a promoter.

Enhancerelement- bestanddelen The enhancer element component

Transkripsjon av et DNA som koder for anti-ErbB2-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse i høyere eukaryoter økes ofte ved å innføre en enhancersekvens i vektoren. Mange enhancersekvenser er nå kjente fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, a-ketoprotein og insulin). Typisk vil man imidlertid anvende en enhancer fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-enhancere på den sene siden av replikasjonsorigoet (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig promoter enhanceren, polyoma-enhanceren fra den sene side av replikasjonsorigoet og adenovirus-enhancere. Se også Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) vedrørende enhancer-elementer for aktivering av eukaryote promotere. Enhanceren kan spleises inn i vektoren i en posisjon 5' eller 3' for den anti- ErbB2-antistoffkodende sekvens, men er fortrinnsvis lokalisert i et sete 5'for promoteren. Transcription of a DNA encoding the anti-ErbB2 antibody of the present invention in higher eukaryotes is often increased by introducing an enhancer sequence into the vector. Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-ketoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer from a eukaryotic cell virus. Examples include SV40 enhancers on the late side of the replication origin (bp 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancers. See also Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) regarding enhancer elements for activation of eukaryotic promoters. The enhancer can be spliced into the vector at a position 5' or 3' of the anti-ErbB2 antibody coding sequence, but is preferably located at a site 5' of the promoter.

Transkripsjonsterminerings- bestanddelen The transcription termination component

Ekspresjonsvektorer som anvendes i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, insekt - celler, planteceller, dyreceller, humane celler eller celler med en kjerne fra andre multi-cellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendige for transkripsjonsterminering og for stabilisering av mRNA. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige fra de 5'- og, fra tid til annen, de 3'-ikke-translaterte områdene i eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse områdene inneholder nukleotidsegmenter som transkriberes som polyadenylerte fragmenter i den ikke-translaterte delen av mRNAet som koder for anti-ErbB2-antistoff. Én anvendbar transkripsjonsterminerings-bestanddel er polyadenyliseringsområdet fra veksthormon fra storfe. Se WO 94/11026 og ekspresjonsvektoren som beskrives der. Expression vectors used in eukaryotic host cells (yeast, fungi, insect cells, plant cells, animal cells, human cells or cells with a nucleus from other multi-cellular organisms) will also contain sequences necessary for transcription termination and for stabilization of mRNA. Such sequences are usually available from the 5' and, from time to time, the 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding anti-ErbB2 antibody. One useful transcription termination component is the bovine growth hormone polyadenylation region. See WO 94/11026 and the expression vector described therein.

Seleksjon og transformasjon av vertsceller Selection and transformation of host cells

Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA i vektorene her er de prokaryote cellene, gjærcellene eller de høyere eukaryote cellene beskrevet ovenfor. Egnede prokaryoter for dette formål inkluderer eubakterier slik som Gram-negative eller Gram-positive organismer, for eksempel Enterobacteriaceae slik som Escherichia, f. eks. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, f. eks. Salmonella typhimurium, Serratia, f. eks. Serratia marcescans og Shigella, så vel som Bacilli slik som B. subtilis og B. licheniformis (f. eks. B. licheniformis 41P, som beskrevet i D 266 710, publisert 12. april 1989), Pseudomonas slik som P. aeruginosa og Streptomyces. Én foretrukket E. coli kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31 446), selv om andre stammer, slik som E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) og E. coli W3110 (ATCC 27 325) er egnede. Suitable host cells for cloning or expression of DNA in the vectors herein are the prokaryotic cells, the yeast cells or the higher eukaryotic cells described above. Suitable prokaryotes for this purpose include eubacteria such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for example Enterobacteriaceae such as Escherichia, e.g. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella typhimurium, Serratia, e.g. Serratia marcescans and Shigella, as well as Bacilli such as B. subtilis and B. licheniformis (eg, B. licheniformis 41P, as described in D 266 710, published April 12, 1989), Pseudomonas such as P. aeruginosa and Streptomyces . One preferred E. coli cloning host is E. coli 294 (ATCC 31 446), although other strains, such as E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) and E. coli W3110 (ATCC 27 325) are suitable .

I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober, slik som filamentøse sopp eller gjær, egnede klonings- eller ekspresjonsverter for vektorer som koder for anti-ErbB2-antistoff. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig brødgjær er den hyppigst anvendte av de lavere eukaryote verts mikroorganismer. En rekke andre slekter, arter og stammer er imidlertid alminnelig tilgjengelig og anvendbare her, foreksempel Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces- verter som for eksempel K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans og K. marxianus, yarrowia (EP In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes, such as filamentous fungi or yeast, are suitable cloning or expression hosts for vectors encoding anti-ErbB2 antibody. Saccharomyces cerevisiae or common baker's yeast is the most frequently used of the lower eukaryotic host microorganisms. However, a number of other genera, species and strains are generally available and applicable here, for example Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces hosts such as K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans and K. marxianus, yarrowia (EP

402 226), Pichia pastoris (EP 183 070), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa, Schwanniomyces slik som Schwanniomyces occidentalis og filamentøse sopp, f. eks. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus- verter som A. nidulans og A. niger. 402 226), Pichia pastoris (EP 183 070), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa, Schwanniomyces such as Schwanniomyces occidentalis and filamentous fungi, e.g. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium and Aspergillus hosts such as A. nidulans and A. niger.

Egnede vertsceller for ekspresjon av glykosylert anti-ErbB2-antistoff er avledet fra flercellulære orgnaismer. Eksempler på invertebrat celler omfatter planteceller og innsektsceller. En rekke baculovirus-stammer og -varianter og tilsvarende, permissive insekt-vertsceller fra verter som Spodoptera frugiperda (kålorm), Åedes aegypti (moskito), Åedes albopictus (moskito), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx moh, har blitt identifisert. En rekke virusstammer for transfeksjon er allment tilgjengelige, for eksempel L-l-varianten av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori-NPV, og slike virus kan anvendes som viruset her ifølge foreliggende oppfinnelse, særlig for transfeksjon av Spodoptera frugiperda- ceWer. Suitable host cells for expression of glycosylated anti-ErbB2 antibody are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant cells and insect cells. A number of baculovirus strains and variants and corresponding permissive insect host cells from hosts such as Spodoptera frugiperda (cabbage worm), Åedes aegypti (mosquito), Åedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (banana fly) and Bombyx moh have been identified. A number of virus strains for transfection are widely available, for example the L-1 variant of Autographa californica NPV and the Bm-5 strain of Bombyx mori-NPV, and such viruses can be used as the virus here according to the present invention, in particular for transfection of Spodoptera frugiperdaceWer .

Plantecellekulturer fra bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat og tobakk kan også anvendes som verter. Plant cell cultures from cotton, maize, potato, soybean, petunia, tomato and tobacco can also be used as hosts.

Interessen har imidlertid vært høyest for vertebrat-celler og oppformering av vertebrat-celler i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig fremgangsmåte. Eksempler på egnede pattedyr vertscellelinjer er apenyre cellelinjen CV1 transformert med SV40 (COS-7, ATCC RL 1651), humane embryonale nyre cellelinjer (293 eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 However, the interest has been highest for vertebrate cells and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a routine procedure. Examples of suitable mammalian host cell lines are the monkey kidney cell line CV1 transformed with SV40 (COS-7, ATCC RL 1651), human embryonic kidney cell lines (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59

(1977)), hamsterunge nyreceller (BHK, ATCC CCL 10), kinesisk hamster ovarieceller/- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)), muse-sertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), ape nyreceller (CV1 ATCC CCL 70), nyreceller fra afrikansk grønn ape (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane cerviks karsinomceller (HELA, ATCC CCL 2), hunde nyreceller (MDCK, ATCC CCL 34), bøffelrotte leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), muse brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 (1982)), MRC 5-celler, FS4-celler og en human hepatom linje (Hep G2). (1977)), juvenile hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), Chinese hamster ovary cells/- DHFR (CHO, Urlaub et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)), mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70), African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587), human cervical carcinoma cells (HELA , ATCC CCL 2), dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442), human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human liver cells (Hep G2, HB 8065), mouse mammary tumor ( MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI cells (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei., 383:44-68 (1982)), MRC 5 cells, FS4 cells and a human hepatoma line (Hep G2 ).

Vertscellene transformeres med de ovenfor beskrevne ekspresjons- eller kloningssektorer for anti-ErbB2-antistoff fremstilling og dyrkes i konvensjonelle næringsmedier modifisert på egnet vis for induksjon av promotere, seleksjon av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvenser. The host cells are transformed with the above-described expression or cloning sectors for anti-ErbB2 antibody production and grown in conventional nutrient media modified in a suitable way for induction of promoters, selection of transformants or amplification of the genes encoding the desired sequences.

Dyrking av vertscellene Cultivation of the host cells

Vertcellene som anvendes for fremstilling av anti-ErbB2-antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan dyrkes i en rekke medier. Kommersielt tilgjengelige medier som Ham's F10 (Sigma), minimalt essensielt medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) og Dulbecco's modifiserte Eagel's medium ((DEMEM), Sigma) er egnede for dyrking av vertscellene. I tillegg kan ethvert av mediene som beskrives i Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), US patentskrift nr. 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469, WO 90/03430, WO 87/00195 eller US patentskrift re. 30 985, anvendes som dyrkningsmedium for vertscellene. Ethvert av disse mediene kan være supplementert etter behov med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (for eksempel insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (for eksempel natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (for eksempel HEPES), nukleotider (for eksempel adenosin og thymidin), antibiotika (for eksempel medikamentet "GENTAMYCIN®"), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger i sluttkonsentrasjon i mikromolar området) og glukose eller en tilsvarende energikilde. Eventuelt andre nødvendige tilsetningsstoffer kan også inngå i egnede konsentrasjoner som vil være kjente blant fagfolk. Dyrknings-betingelsene når det gjelder for eksempel temperatur, pH og lignende er de betingelser som tidligere har blitt benyttet for vertscellen som er valgt for ekspresjonen og vil være åpenbare for gjennomsnitts fagfolk. The host cells used for the production of the anti-ErbB2 antibody according to the present invention can be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma), minimal essential medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's modified Eagel's medium ((DEMEM), Sigma) are suitable for culturing the host cells. In addition, any of the media described in Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), US Patent Nos. 4,767,704, 4,657 866, 4,927,762, 4,560,655 or 5,122,469, WO 90/03430, WO 87/00195 or US Patent No. 30,985, are used as culture medium for the host cells. Any of these media may be supplemented as needed with hormones and/or or other growth factors (for example insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (for example sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers (for example HEPES), nucleotides (for example adenosine and thymidine), antibiotics (for example the drug "GENTAMYCIN ®"), trace elements (defined as inorganic compounds that are usually present in final concentration in the micromolar range) and glucose or a similar energy source. Any other necessary additives can also be included in suitable concentrations which will be known to those skilled in the art. The culture conditions in terms of, for example, temperature, pH and the like are the conditions that have previously been used for the host cell selected for the expression and will be obvious to the average person skilled in the art.

Rensing av anti- ErbB2- antistoff Purification of anti-ErbB2 antibody

Ved anvendelse av rekombinante teknikker kan antistoffer produseres intracellulært, i periplasmarommet eller utskilles direkte i mediet. Hvis antistoffet dannes intracellulært fjernes som et første trinn parti kei rester, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, for eksempel ved sentrifugering eller ultrafiltrering. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) beskriver en fremgangsmåte for isolering av antistoffer som utskilles i periplasmarommet hos E. coli. Kort beskrevet opptines cellemassen i nærvær av natriumacetat (pH 3,5), EDTA og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) over et tidsrom på omtrent 30 minutter. Cellerester kan fjernes ved sentrifugering. Dersom antistoffet utskilles i mediet oppkonsentreres generelt først supernatanter fra slike ekspresjonssystemer ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig protein oppkonsentreringsfilter, for eksempel en Amicon eller Millipore Pellicon utralfiltreringsenhet. En proteaseinhibitor, slik som PMSF, kan inkluderes i ethvert av de ovenfor nevnte trinn for inhibering av proteolyse, og antibiotika kan inkluderes for å forhindre vekst av tilfeldige kontaminanter. When using recombinant techniques, antibodies can be produced intracellularly, in the periplasmic space or secreted directly into the medium. If the antibody is formed intracellularly, as a first step, any residues, either host cells or lysed fragments, are removed, for example by centrifugation or ultrafiltration. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) describes a method for isolating antibodies that are secreted in the periplasmic space of E. coli. Briefly, the cell mass is digested in the presence of sodium acetate (pH 3.5), EDTA and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) over a period of approximately 30 minutes. Cell debris can be removed by centrifugation. If the antibody is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example an Amicon or Millipore Pellicon neutral filtration unit. A protease inhibitor, such as PMSF, may be included in any of the above steps to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of adventitious contaminants.

Antistoff preparatet som fremstilles fra cellene kan renses ved for eksempel anvendelse av hydroksylapatitt kromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitets-kromatografi, hvor affinintetskromatografi er den foretrukne renseteknikk. Egnetheten av protein A som affinitetsligand avhenger av type og isotype av Fc-immunglobulin domenet som eventuelt foreligger i antistoffet. Protein A kan anvendes for rensing av antistoffer som bygger på humane yl-, y2- eller y4-tungkjeder (Lindbarm et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). Protein G anbefales for alle muse isotyper og for humant y3 (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). Støttemiddelet som affinintets-liganden er koblet til er vanligvis agarose, men andre støttemidler er tilgjengelige. Mekanisk stabile støttemidler som glass med kontrollert porestørrelse eller poly(styren-divinyl)benzen tillater hurtigere gjennomstrømningshastighet og kortere prosesseringstid enn hva som kan oppnås med agarose. Dersom antistoffet omfatter et CH3-domene er resinet "Bakerbond ABX™" (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) nyttig for rensing. Andre teknikker for proteinrensing, for eksempel fraksjonering i en ionebytter kolonne, etanolpresipitering, reversfase-HPLC, kromatografi på kiselgel, kromatografi på heparin-"SEPHAROSE™", kromatografi på et anion- eller kationbytter resin (slik som en polyasparaginsyre kolonne), kromatofokusering, SDS-PAGE og ammoniumsulfat presipitering er også tilgjengelige, avhengig av antistoffet som skal gjenvinnes. The antibody preparation produced from the cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, where affinity chromatography is the preferred purification technique. The suitability of protein A as an affinity ligand depends on the type and isotype of the Fc-immunoglobulin domain that may be present in the antibody. Protein A can be used for the purification of antibodies based on human y1, y2 or y4 heavy chains (Lindbarm et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). Protein G is recommended for all mouse isotypes and for human y3 (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). The support to which the affinity ligand is attached is usually agarose, but other supports are available. Mechanically stable supports such as glass with controlled pore size or poly(styrene-divinyl)benzene allow faster flow rates and shorter processing times than can be achieved with agarose. If the antibody comprises a CH3 domain, the resin "Bakerbond ABX™" (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) is useful for purification. Other techniques for protein purification, such as fractionation in an ion-exchange column, ethanol precipitation, reverse-phase HPLC, chromatography on silica gel, chromatography on heparin-"SEPHAROSE™", chromatography on an anion- or cation-exchange resin (such as a polyaspartic acid column), chromatofocusing, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation are also available, depending on the antibody to be recovered.

Etter et hvilket som helst innledende rensetrinn kan blandingen som omfatter antistoffet av interesse og kontaminanter utsettes for hydrofob interaksjonskromatografi ved lav pH ved anvendelse av en elueringsbuffer med en pH på mellom omtrent 2,5 og 4,5, fortrinnsvis utført ved lav saltkonsentrasjon (f. eks. fra omtrent 0-0,25M salt). After any initial purification step, the mixture comprising the antibody of interest and contaminants can be subjected to hydrophobic interaction chromatography at low pH using an elution buffer with a pH between about 2.5 and 4.5, preferably carried out at low salt concentration (e.g. eg from about 0-0.25M salt).

Farmasøytiske preparater Pharmaceutical preparations

Terapeutiske formuleringer av antistoff som anvendes i samsvar med foreliggende oppfinnelse tilbredes for lagring ved å blande et antistoff med den ønskede renhetsgrad med eventuelt farmasøytisk aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A. red. (1980)) i form av frysetørkede preparater eller vandige løsninger. Aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottageren i de anvendte doser og konsentrasjoner og inkluderer buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter, inkludert askorbinsyre og metionin, konserveringsmidler (slik som oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametnoiumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkylparabener som metyl- eller propylparaben, catechol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylære polypeptider (med mindre enn omtrent 10 aminosyrerester), proteiner som serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer som polyvinyl-pyrrolidon, aminosyrer som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater, inkludert glukose, mannose og dekstriner, chelateringsmidler som EDTA, sukkere som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner som natrium, metallkomplekser (f. eks. Zn-protein-komplekser) og/eller ikke-ioniske overflateaktive midler som 'TWEEN™", "PLURONICS™" eller polyetylenglykol (PEG). Foretrukne frysetørkede anti-ErbB2-antistoff formuleringer er beskrevet i WO 97/04801. Therapeutic formulations of antibody used in accordance with the present invention are prepared for storage by mixing an antibody with the desired degree of purity with any pharmaceutically acceptable carriers, excipients or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980) ) in the form of freeze-dried preparations or aqueous solutions. Acceptable carriers, excipients or stabilizers are non-toxic to the recipient in the doses and concentrations used and include buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants including ascorbic acid and methionine, preservatives (such as octadecyldimethylbenzylammonium chloride, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, phenol , butyl or benzyl alcohol, alkylparabens such as methyl or propylparaben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol and m-cresol), low molecular weight polypeptides (with less than about 10 amino acid residues), proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins, hydrophilic polymers such as polyvinyl-pyrrolidone, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates, including glucose, mannose and dextrins, chelating agents such as EDTA, sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol, salt-forming counterions such as sodium , metal comp homework (eg. e.g. Zn-protein complexes) and/or non-ionic surfactants such as 'TWEEN™', 'PLURONICS™' or polyethylene glycol (PEG). Preferred freeze-dried anti-ErbB2 antibody formulations are described in WO 97/04801.

Formuleringen her kan også inneholde mer enn én aktiv forbindelse etter behov forden spesielle indikasjon som skal behandles, fortrinnsvis de med komplementære aktiviteter som ikke påvirker hverandre på uønsket måte. Det kan for eksempel være ønskelig å videre fremskaffe antistoffer som bindes til EFR, ErbB2 (f. eks. et antistoff som bindes til en annen epitop på ErbB2), ErbB3, ErbB4 eller vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF) i én formulering. Alternativt eller i tillegg kan preparatet videre omfatte et kjemoterapeutisk middel, et cytotoksisk middel, et cytokin, et vekstinhiberende middel, et anti-hormon middel, et EGFR-rettet medikament, et anti-antiogent middel og/eller et hjertebeskyttende middel. Slike molekyler foreligger fortrinnsvis i kombinasjon i mengder som er effektive for det påtenkte formål. The formulation herein may also contain more than one active compound as required for the particular indication to be treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. For example, it may be desirable to further provide antibodies that bind to EFR, ErbB2 (e.g. an antibody that binds to a different epitope on ErbB2), ErbB3, ErbB4 or vascular endothelial growth factor (VEGF) in one formulation. Alternatively or in addition, the preparation may further comprise a chemotherapeutic agent, a cytotoxic agent, a cytokine, a growth inhibitory agent, an anti-hormonal agent, an EGFR-directed drug, an anti-antiogenic agent and/or a cardioprotective agent. Such molecules are preferably present in combination in amounts that are effective for the intended purpose.

De aktive bestanddeler kan også være innesluttet i mikrokapsler, for eksempel fremstilt ved koacervasjonsteknikker eller ved interfase polymerisering, for eksempel mikrokapsler av hydroksymetylcellulose eller gelatin henholdsvis poly-(metylmetakrylat)-mikrokapsler, i kolloidale medikament tilførselssystemer (for eksempel liposomer, albumin mikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makro-emulsjoner. Slike teknikker beskrives i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A. red. (1980). The active ingredients can also be enclosed in microcapsules, for example produced by coacervation techniques or by interphase polymerization, for example microcapsules of hydroxymethyl cellulose or gelatin or poly-(methyl methacrylate) microcapsules, in colloidal drug delivery systems (for example liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macro-emulsions. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980).

Preparater for vedvarende frigivelse kan fremstilles. Egnede eksempler på preparater for vedvarende frigivelse omfatter semipermeable støttemidler av faste, hydrofobe polymerer som inneholder antistoffet, hvor støttemiddelet foreligger i form av utformede gjenstander, f. eks. filmer eller mikrokapsler. Eksempler på søttemidler for vedvarende frigivelse omfatter polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksy-etylmetakrylat) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentskrift nr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbart etylenvinylacetat, degraderbare melkesyre-glykolsyre-kopolymerer som "LUPRON DEPOT™" (injiserbare mikrokuler som består av melkesyre-glykolsyre-kopolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Sustained release preparations can be prepared. Suitable examples of preparations for sustained release include semipermeable supports of solid, hydrophobic polymers containing the antibody, where the support is in the form of shaped objects, e.g. films or microcapsules. Examples of sustained release sweeteners include polyesters, hydrogels (eg, poly(2-hydroxyethyl methacrylate) or poly(vinyl alcohol)), polylactides (US Patent No. 3,773,919), copolymers of L-glutamic acid and γ-ethyl-L -glutamate, non-degradable ethylene vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as "LUPRON DEPOT™" (injectable microspheres consisting of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate) and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid.

Formuleringer som skal anvendes for tilførsel in vivo må være sterile. Dette oppnås lett ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner. Formulations to be used for administration in vivo must be sterile. This is easily achieved by filtration through sterile filtration membranes.

Behandling med anti-ErbB2-antistoff Treatment with anti-ErbB2 antibody

Det antas at anti-ErbB2-antistoffet, rhuMAB 2Cf, ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å behande kreft, som definert i kravene It is believed that the anti-ErbB2 antibody, rhuMAB 2Cf, according to the present invention can be used to treat cancer, as defined in the claims

Eksempler på kreft som kan behandles inkluderer karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi samt lymfoide ondartede tilstander. Nærmere eksempler på slike kreftformer omfatter epitel-cellekreft (foreksempel plateepitelial-cellekreft), lungekreft, innbefattet små-cellet-lungekreft, ikke-småcellet-lungekreft, adenokarsinom i lunge og epitelkarsinom i lunge, bukhinnekreft, hepatocellulær kreft, magekreft, innbefattet mage-tarmkreft, bukspyttkjertelkreft, glioblastom, livmorhalskreft, ovarie kreft, leverkreft, urinblære kreft, hepatom, brystkreft, tykktarmskreft, rektal kreft, kolorektal kreft, endometrium karsinom eller uterus karsinom, spyttkjertel karsinom, nyrekreft, prostatakreft, vulva kreft, skjoldkjertelkreft, lever karsinom, anal karsinom, penis karsinom samt kreft i hode og hals. Kreften som skal behandles er fortrinnsvis vist å respondere på behandling med anti-ErbB2-antistoffer basert på påvirkning av HER2/HER3- og/eller HER2/HERl-heterodimerer eller fosforylering av ErbB-reseptor i en tumorprøve. En spesiell gruppe av kreft hvor HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- heterodimer dannelse og/eller fosforylering av ErbB-reseptor forventes å påvises omfatter lungekreft, brystkreft, ovariekreft innbefattet fremskreden, refraktorisk eller tilbakevendende ovariekreft, prostatakreft, kolorektal kreft og bukspyttkjertelkreft. Examples of treatable cancers include carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma and leukemia as well as lymphoid malignancies. Closer examples of such cancers include epithelial cell cancer (for example squamous cell cancer), lung cancer, including small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung and epithelial carcinoma of the lung, peritoneal cancer, hepatocellular cancer, gastric cancer, including gastrointestinal cancer , pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, endometrial carcinoma or uterine carcinoma, salivary gland carcinoma, kidney cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver carcinoma, anal carcinoma , penile carcinoma and head and neck cancer. The cancer to be treated is preferably shown to respond to treatment with anti-ErbB2 antibodies based on the effect of HER2/HER3 and/or HER2/HER1 heterodimers or phosphorylation of ErbB receptor in a tumor sample. A particular group of cancers where HER2/HER3 and/or HER2/HER1 heterodimer formation and/or ErbB receptor phosphorylation is expected to be detected includes lung cancer, breast cancer, ovarian cancer including advanced, refractory or recurrent ovarian cancer, prostate cancer, colorectal cancer and pancreatic cancer .

Kreften vil vanligvis omfatte ErbB2-uttrykkende celler, slik at anti-ErbB2-antistoffet her kan bindes til kreften. Selv om kreften kan karakteriseres ved overekspresjon av ErbB2-reseptoren tilveiebringer foreliggende patentsøknad videre behandling av kreft som ikke anses å være en ErbB2-overuttrykkende kreftform. For å bestemme ErbB2-ekspresjonen i kreften er forskjellige diagnostiske/prognostiske analyser tilgjengelige. ErbB2-overkespresjon kan analyseres ved IHC, f. eks. ved anvendelse av "HERCEPTEST®" (Dako). Parafin-innstøpte vevssnitt fra en tumorbiopsi kan analyseres ved IHC-analysen og tilskrives et ErbB2-proteinfargings intensitets-kriterium som følger: The cancer will usually include ErbB2-expressing cells, so that the anti-ErbB2 antibody can bind to the cancer. Although the cancer can be characterized by overexpression of the ErbB2 receptor, the present patent application further provides for the treatment of cancer that is not considered to be an ErbB2-overexpressing cancer. To determine ErbB2 expression in the cancer, various diagnostic/prognostic assays are available. ErbB2 overexpression can be analyzed by IHC, e.g. using "HERCEPTEST®" (Dako). Paraffin-embedded tissue sections from a tumor biopsy can be analyzed by the IHC assay and assigned an ErbB2 protein staining intensity criterion as follows:

0 Poeng 0 Points

ingen farging observeres eller membranfarging observeres hos mindre enn 10 % av tumorcellene. no staining is observed or membrane staining is observed in less than 10% of tumor cells.

1+ Poeng 1+ Points

en svak/knapt observerbar membranfarging observeres i mer enn 10 % av tumorcellene. Cellene farges kun i deler av membranen. a weak/barely observable membrane staining is observed in more than 10% of the tumor cells. The cells are stained only in parts of the membrane.

2+ Poeng 2+ Points

svakt til moderat, fullstendig membranfarging observeres hos mer enn 10 % av tumorcellene. weak to moderate, complete membrane staining is observed in more than 10% of tumor cells.

3+ Poeng 3+ Points

moderat til kraftig, fullstendig membranfarging observeres hos mer enn 10 % av tumorcellene. moderate to strong, complete membrane staining is observed in more than 10% of tumor cells.

Tumorer med poeng 0 eller 1+ for ErbB2-overekspresjonsanslaget kan karakteriseres som ikke-overuttrykkende ErbB2, mens tumorer med poeng 2+ eller 3+ kan karakteriseres som overuttrykkende av ErbB2. Tumors with a score of 0 or 1+ for the ErbB2 overexpression estimate can be characterized as not overexpressing ErbB2, while tumors with a score of 2+ or 3+ can be characterized as overexpressing ErbB2.

Alternativt eller i tillegg kan FISH-analyser som "INFORM™" (som selges av Ventana, Arizona) eller "PATHVISION™" (Vysis, Illinois) utføres på formalinfiksert, parafininstøpt tumorvev for å bestemme omfanget (om noe) av ErbB2-overekspresjon i tumoren. 1 én utførelsesform vil kreftformen være en kreftform som uttrykker (og som kan, men ikke nødvendigvis må, overuttrykke) EGFR. Alternatively or additionally, FISH assays such as "INFORM™" (sold by Ventana, Arizona) or "PATHVISION™" (Vysis, Illinois) can be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissue to determine the extent (if any) of ErbB2 overexpression in the tumor. In one embodiment, the cancer will be a cancer that expresses (and may, but need not necessarily overexpress) EGFR.

Kreften som skal behandles her kan være én som særpreges ved overdreven aktivering av en ErbB-reseptor, f. eks. EGFR. Slik overdreven aktivering kan tilskrives overekspresjon eller forhøyet dannelse av ErbB-reseptoren eller en ErbB-ligand. I én utførelsesform av oppfinnelsen vil en diagnostisk eller prognostisk analyse utføres for å fastslå hvorvidt pasientens kreft særpreges av overdreven aktivering av en ErbB-reseptor. For eksempel kan ErbB-genamplifisering og/eller overekspresjon av en ErbB- reseptor i kreftcellene bestemmes. Forskjellige analyser for bestemmelse av slik amplifisering/overekspresjon er tilgjengelige innen faget og omfatter IHS-analysen, FISH-analysen og analysen av frigjort antigen som beskrives ovenfor. Alternativt eller i tillegg kan nivået av en ErbB-ligand, for eksempel TGF-a, i eller forbundet med tumoren bestemmes ifølge kjente fremgangsmåter. Slike analyser kan påvise protein og/eller nukleinsyre som koder for proteinet i prøven som skal analyseres. Nivået av ErbB-ligand i tumoren bestemmes ved anvendelse av immunhistokjemi (IHC), se for eksempel Scher et al., Clin. Cancer Research, 1:545-550 (1995). Alternativt eller i tillegg kan man evaluere nivået av ErbB-ligandkodende nukleinsyre i prøven som skal analyseres, f. eks. ved hjelp av FISH-, southern-blotting- eller PCR-teknikker. The cancer to be treated here may be one that is characterized by excessive activation of an ErbB receptor, e.g. EGFR. Such excessive activation can be attributed to overexpression or elevated formation of the ErbB receptor or an ErbB ligand. In one embodiment of the invention, a diagnostic or prognostic analysis will be performed to determine whether the patient's cancer is characterized by excessive activation of an ErbB receptor. For example, ErbB gene amplification and/or overexpression of an ErbB receptor in the cancer cells can be determined. Various assays for determining such amplification/overexpression are available in the art and include the IHS assay, the FISH assay and the released antigen assay described above. Alternatively or additionally, the level of an ErbB ligand, for example TGF-α, in or associated with the tumor can be determined according to known methods. Such analyzes can detect protein and/or nucleic acid that codes for the protein in the sample to be analyzed. The level of ErbB ligand in the tumor is determined using immunohistochemistry (IHC), see, for example, Scher et al., Clin. Cancer Research, 1:545-550 (1995). Alternatively or additionally, one can evaluate the level of ErbB ligand-encoding nucleic acid in the sample to be analyzed, e.g. using FISH, southern blotting or PCR techniques.

Videre kan overekspresjon eller amplifisering av ErbB-reseptor eller ErbB-ligand evalueres ved anvendelse av en in vivo diagnostisk analyse, for eksempel ved å tilføre et molekyl (for eksempel et antistoff) som bindes til molekylet som skal påvises og som er merket med en påvisbar gruppe (for eksempel en radioaktiv isotop) og foreta utvendig scanning av pasienten for lokalisering av markøren. Furthermore, overexpression or amplification of ErbB receptor or ErbB ligand can be evaluated using an in vivo diagnostic assay, for example by adding a molecule (for example an antibody) which binds to the molecule to be detected and which is labeled with a detectable group (for example a radioactive isotope) and carry out an external scan of the patient to locate the marker.

Dersom kreften som skal behandles er en hormonuavhengig kreftform kan ekspresjon av hormonet (f. eks. androgen) og/eller den tilhørende reseptor i tumoren anslås ved anvendelse av enhver av de forskjellige tilgjengelige analyser, f. eks. som beskrevet ovenfor. Alternativt eller i tillegg kan pasienten diagnostiseres til å ha en hormonuavhengig kreft ved at pasienten ikke lenger responderer på anti-androgen behandling. If the cancer to be treated is a hormone-independent form of cancer, expression of the hormone (e.g. androgen) and/or the associated receptor in the tumor can be estimated using any of the various available analyses, e.g. as described above. Alternatively or additionally, the patient can be diagnosed as having a hormone-independent cancer in that the patient no longer responds to anti-androgen treatment.

Et immunkonjugat som omfatter anti-ErbB2-antistoffet konjugert til et cytotoksisk middel kan administreres til pasienten. Immunkonjugatet og/eller ErbB2-proteinet som inngår i konjugatet internaliseres fortrinnsvis av cellen, noe som fører til økt terapeutisk virkning av immunkonjugatet når det gjelder dreping av kreftcellen som det bindes til. Det cytotoksiske midlet rettes mot eller interfererer med nukleinsyre i kreftcellen. Eksempler på slike cytotoksiske midler omfatter maytansinoider, calicheamiciner, ribonukleaser og DNA-endonukleaser. An immunoconjugate comprising the anti-ErbB2 antibody conjugated to a cytotoxic agent can be administered to the patient. The immunoconjugate and/or the ErbB2 protein included in the conjugate is preferably internalized by the cell, which leads to an increased therapeutic effect of the immunoconjugate in terms of killing the cancer cell to which it binds. The cytotoxic agent targets or interferes with nucleic acid in the cancer cell. Examples of such cytotoxic agents include maytansinoids, calicheamicins, ribonucleases and DNA endonucleases.

Antistoffet for administrering er rhuMAb 2C4. RhuMAb 2C4 er et humanisert monoklonalt antistoff som bygger på humane IgGl-rammeverkssekvenser og består av to tunge kjeder (449 aminosyrerester) og to lette kjeder (214 aminosyrerester). RhuMAb 2C4 avviker signifikant fra et annet anti-HER2-antistoff "HERCEPTIN®" The antibody for administration is rhuMAb 2C4. RhuMAb 2C4 is a humanized monoclonal antibody based on human IgGl framework sequences and consists of two heavy chains (449 amino acid residues) and two light chains (214 amino acid residues). RhuMAb 2C4 differs significantly from another anti-HER2 antibody "HERCEPTIN®"

(Trastuzumab) i de epitopbindende områdene i den lette kjeden og tunge kjeden. Som en følge av dette bindes rhuMAb 2C4 til en helt annen epitop på HER2. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følsomme fremgangsmåter for påvisning av kreft som responderer på behandling med rhuMAb 2C4 eller funksjonelle ekvivalenter derav. Det bør bemerkes at slike kreftformer som responderer på rhuMAb 2C4-behandling ikke nødvendigvis overuttrykker HER2. (Trastuzumab) in the epitope binding regions of the light chain and heavy chain. As a result, rhuMAb 2C4 binds to a completely different epitope on HER2. The present invention provides sensitive methods for the detection of cancer that responds to treatment with rhuMAb 2C4 or functional equivalents thereof. It should be noted that such cancers that respond to rhuMAb 2C4 treatment do not necessarily overexpress HER2.

Anti-ErbB2-antistoffene eller immunkonjugatene tilføres til en human pasient i samsvar med kjente fremgangsmåter, for eksempel ved intravenøs tilførsel, f. eks. som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon over et tidsrom, ved intramuskulære, intra-peritoneale, intracerebrospinale, subkutane, intraartikulære, intrasynoviale, intratekale, orale, topiske eller inhalatoriske tilførselsveier. Intravenøs eller subkutan administrasjon av antistoffet foretrekkes. The anti-ErbB2 antibodies or immunoconjugates are administered to a human patient according to known methods, for example by intravenous administration, e.g. as a bolus or by continuous infusion over a period of time, by intramuscular, intra-peritoneal, intracerebrospinal, subcutaneous, intra-articular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical or inhalation routes of administration. Intravenous or subcutaneous administration of the antibody is preferred.

Andre terapeutiske regimer kan kombineres med administrasjon av anti-ErbB2-antistoffet. Den kombinerte administrasjon omfatter ko-administrasjon ved anvendelse av separate formuleringer eller en enkelt farmasøytisk formulering, og på hverandre følgende administrering i enhver rekkefølge, hvor det fortrinnsvis er et tidsrom i hvilket begge (eller alle) de aktive midler samtidig utøver sin biologiske aktivitet. Other therapeutic regimens may be combined with administration of the anti-ErbB2 antibody. The combined administration includes co-administration using separate formulations or a single pharmaceutical formulation, and consecutive administration in any order, where there is preferably a period of time in which both (or all) of the active agents simultaneously exert their biological activity.

Pasienten kan behandles med to forskjellige anti-ErbB2-antistoffer. Pasienten kan for eksempel behandles med rhuMAB 2C4 som et første anti-ErbB2-antistoff så vel som med et andre anti-ErbB2-antistoff som er vekstinhiberende (f. eks. "HERCEPTIN®") eller et anti-ErbB2-antistoff som induserer apoptose av en ErbB2-overuttrykkende celle (f. eks. 7C2, 7F3 eller humaniserte varianter av disse). Slik kombinasjonsbehandling fører fortrinnsvis til en synergistisk terapeutisk virkning. Man kan for eksempel behandle pasienten med "HERCEPTIN®" og deretter med rhuMAb 2C4, f. eks. dersom pasienten ikke responderer på "HERCEPTIN®"-behandling. I en annen utførelsesform kan pasienten først behandles med rhuMAb 2C4 og så motta "HERCEPTIN®"-behandling. I nok en utførelsesform kan pasienten behandles med både rhuMAb 2C4 og "HERCEPTIN®" samtidig. The patient can be treated with two different anti-ErbB2 antibodies. For example, the patient can be treated with rhuMAB 2C4 as a first anti-ErbB2 antibody as well as with a second anti-ErbB2 antibody that is growth inhibitory (eg, "HERCEPTIN®") or an anti-ErbB2 antibody that induces apoptosis of an ErbB2-overexpressing cell (eg 7C2, 7F3 or humanized variants thereof). Such combination treatment preferably leads to a synergistic therapeutic effect. One can, for example, treat the patient with "HERCEPTIN®" and then with rhuMAb 2C4, e.g. if the patient does not respond to "HERCEPTIN®" treatment. In another embodiment, the patient may first be treated with rhuMAb 2C4 and then receive "HERCEPTIN®" therapy. In yet another embodiment, the patient can be treated with both rhuMAb 2C4 and "HERCEPTIN®" at the same time.

Det kan også være ønskelig å kombinere administrasjonen av anti-ErbB2-antistoffet med administrasjon av et antistoff rettet mot et annet tumorassosiert antigen. I dette tilfellet kan det andre antistoffet for eksempel bindes til EGFR, ErbB3, ErbB4 eller vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF). It may also be desirable to combine the administration of the anti-ErbB2 antibody with the administration of an antibody directed against another tumor-associated antigen. In this case, the second antibody can for example bind to EGFR, ErbB3, ErbB4 or vascular endothelial growth factor (VEGF).

Behandlingen kan innebære kombinert administrasjon av anti-ErbB2-antistoffet og et eller flere kjemoterapeutiske midler eller vekstinhiberende midler, inkludert ko-administrasjon av cocktailer av forskjellige kjemoterapeutiske midler. Foretrukne kjemoterapeutiske midler inkluderer taksaner (slik som paclitaxel og docetaxel) og/eller antibiotika av antracyklintyper. Fremstilling og doseringsskjemaer for slike kjemoterapeutiske midler kan anvendes ifølge produsentens instruksjoner eller som bestemt empirisk av den erfarne behandlende lege. Fremstilling og doseringsskjemaer for slik kjemoterapi beskrives også i Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Blatimore, MD (1992). The treatment may involve the combined administration of the anti-ErbB2 antibody and one or more chemotherapeutic agents or growth inhibitory agents, including co-administration of cocktails of different chemotherapeutic agents. Preferred chemotherapeutic agents include taxanes (such as paclitaxel and docetaxel) and/or anthracycline-type antibiotics. Preparation and dosing schedules for such chemotherapeutic agents can be used according to the manufacturer's instructions or as determined empirically by the experienced treating physician. Preparation and dosage forms for such chemotherapy are also described in Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Antistoffet kan kombineres med en anti-hormonforbindelse, f. eks. en anti-østrogenforbindelse som tamoksifen, et anti-progesteron som onapriston (se EP The antibody can be combined with an anti-hormone compound, e.g. an anti-estrogen compound such as tamoxifen, an anti-progesterone such as onapristone (see EP

616 812), ellet et anti-androgen slik som flutamid, i doser som er kjente for slike molekyler. Dersom kreften som skal behandles er en hormonuavhengig kreft kan 616,812), or an anti-androgen such as flutamide, in doses known for such molecules. If the cancer to be treated is a hormone-independent cancer,

pasienten tidligere ha blitt utsatt for anti-hormonell terapi, og etter at kreften blir hormonuavhengig kan anti-ErbB2-antistoffet (og eventuelt andre midler som beskrevet her) administreres til pasienten. the patient has previously been exposed to anti-hormonal therapy, and after the cancer becomes hormone-independent, the anti-ErbB2 antibody (and possibly other agents as described here) can be administered to the patient.

Noen ganger kan det være gunstig å også ko-administrere et hjertebeskyttende middel (for å forhindre eller redusere myokard feilfunksjon forbundet med behandlingen) eller et eller flere cytokiner til pasienten. Man kan også ko-administrere et EGFR-rettet medikament eller et anti-angiogent middel. I tillegg til de ovenfor beskrevne behandlingsskjemaer kan pasienten behandles ved kirurgisk fjerning av kreftceller og/eller strålebehandling. Sometimes it may be beneficial to also co-administer a cardioprotective agent (to prevent or reduce myocardial dysfunction associated with the treatment) or one or more cytokines to the patient. One can also co-administer an EGFR-directed drug or an anti-angiogenic agent. In addition to the treatment schemes described above, the patient can be treated by surgical removal of cancer cells and/or radiotherapy.

Anti-ErbB2-antistoffet her kan også kombineres med et EGFR-rettet medikament, for eksempel et av medikamentene diskutert ovenfor i definisjonsavsnittet, noe som fører til en komplementær og muligens synergistisk terapeutisk virkning. The anti-ErbB2 antibody herein can also be combined with an EGFR-targeted drug, such as one of the drugs discussed above in the definition section, leading to a complementary and possibly synergistic therapeutic effect.

Eksempler på ytterligere medikamenter som kan kombineres med antistoffet inkluderer kjemoterapeutiske midler som karboplatin, et taksan (f. eks. paclitaxel eller docetaxel), gemcitabin, navelbin, cisplatin, oksaliplatin eller kombinasjoner av hvilke som helst av disse, for eksempel karboplatin/docetaxel, et annet anti-HER2-antistoff (f. eks. et vekstinhiberende anti-HER2-antistoff slik som "HERCEPTIN®" eller et anti-HER2-antistoff som induserer apoptose, slik som 7C2 eller 7F3, inkludert humaniserte eller affinintetsmodne varienter derav), en farnesyl-transferaseinhibitor, et anti-angiogent middel (f. eks. en anti-VEGF-antistoff), et EGFR-rettet medikament (f. eks. C225 eller ZD1839), et cytokin (f. eks. IL-2, IL-12, G-CSF eller GM-CSF) eller kombinasjoner av de overstående. Examples of additional drugs that may be combined with the antibody include chemotherapeutic agents such as carboplatin, a taxane (eg paclitaxel or docetaxel), gemcitabine, navelbine, cisplatin, oxaliplatin or combinations of any of these, eg carboplatin/docetaxel, a other anti-HER2 antibody (eg, a growth inhibitory anti-HER2 antibody such as "HERCEPTIN®" or an anti-HER2 antibody that induces apoptosis such as 7C2 or 7F3, including humanized or affinity matured variants thereof), a farnesyl transferase inhibitor, an anti-angiogenic agent (eg, an anti-VEGF antibody), an EGFR-targeted drug (eg, C225 or ZD1839), a cytokine (eg, IL-2, IL- 12, G-CSF or GM-CSF) or combinations of the above.

Egnede doser av de ovenfor angitte samtidig tilførte midlene er de doser som i dag anvendes, og dosen kan reduseres grunnet den kombinerte virkning (synergi) av middelet og anti-ErbB2-antistoffet 2C4. Suitable doses of the above-mentioned simultaneously administered agents are the doses currently used, and the dose can be reduced due to the combined effect (synergy) of the agent and the anti-ErbB2 antibody 2C4.

For forebyggelse eller behandling av sykdom vil den egnede dose av antistoffet avhenge av hvilken type sykdom som skal behandles, som definert ovenfor, omfang og forløp av sykdommen, hvorvidt antistoffet tilføres for forebyggende eller terapeutiske formål, tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på antistoffet og den behandlende leges vurderinger. For the prevention or treatment of disease, the appropriate dose of the antibody will depend on the type of disease to be treated, as defined above, extent and course of the disease, whether the antibody is administered for preventive or therapeutic purposes, previous treatment, the patient's clinical history and response to the antibody and the treating doctor's assessments.

Dosene er for administrasjon hver tredje uke (f. eks. slik at pasienten mottar fra omtrent 2 til omtrent 20, f. eks. omtrent 6 doser av anti-ErbB2-antistoffet). En innledende, høyere oppfyllingsdose etterfulgt av en eller flere lavere doser kan administreres. Forløpet av denne behandlingen følges lett ved konvensjonelle teknikker og analyser. The doses are for administration every three weeks (eg, such that the patient receives from about 2 to about 20, eg, about 6 doses of the anti-ErbB2 antibody). An initial, higher loading dose followed by one or more lower doses may be administered. The course of this treatment is easily followed by conventional techniques and analyses.

RhuMAb 2C4 administreres i en fast dose på 420 mg (tilsvarende doser på 6 mg/kg for et individ på 70 kg) hver 3. uke. Behandlingen kan innledes med en høyere oppfyllingsdose (f. eks. 840 mg, tilsvarende 12 mg/kg kroppsvekt) for å oppnå stabile serumkonsentrasjoner hurtigere. Spesifikke doseringsskjemaer gis også i eksemplene nedenfor. RhuMAb 2C4 is administered at a fixed dose of 420 mg (equivalent doses of 6 mg/kg for a 70 kg subject) every 3 weeks. Treatment can be started with a higher loading dose (e.g. 840 mg, corresponding to 12 mg/kg body weight) to achieve stable serum concentrations more quickly. Specific dosing schedules are also provided in the examples below.

Fremstilte gjenstander Manufactured items

Også beskrevet er en fremstilt gjenstand som inneholder materialer som er nyttige for behandling av forstyrrelsene beskrevet ovenfor. Also described is an article of manufacture containing materials useful for treating the disorders described above.

Den fremstilte gjenstand omfatter en beholder og en merkelapp eller et pakningsvedlegg på eller forbundet med beholderen. Egnede beholdere omfatter for eksempel flasker, ampuller, sprøyter osv. Beholderne kan være utformet av en rekke materialer, for eksempel glass eller plast. Beholderen inneholder et preparat som er effektivt for behandling av tilstanden og kan ha en steril tilgangsport (beholderen kan for eksempel være en pose for intravenøse løsninger eller en ampulle med en kork som kan gjennomtrenges av en hypodermisk kanyle). Minst et aktivt middel i preparatet er et anti-ErbB2-antistoff. Merkelappen eller pakningsvedlegget angir at preparatet anvendes for behandling av den valgte tilstand, for eksempel kreft. I en utførelsesform angir merkelappen eller pakkevedlegget at preparatet som omfatter antistoffet som bindes til ErbB2 kan anvendes for å behandle en pasient som lider av en tumor i hvilken nærvær av HER2/HER1- og/eller HER2/HER3- og/eller HER2/HER4-komplekser har blitt identifisert og/eller fosforylering av ErbB-reseptor har blitt påvist. Videre kan den fremstilte gjenstand omfatte (a) en første beholder med et preparat i, hvor preparatet omfatter et første antistoff som bindes til ErbB2 og inhiberer veksten av kreftceller som overuttrykker ErbB2, og (b) en andre beholder som inneholder et preparat, hvor preparatet omfatter et andre antistoff som bindes til ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor. Den fremstilte gjenstanden i denne utførelsesformen av oppfinnelsen kan videre omfatte et pakningsvedlegg som som indikerer at det første og det andre antistoff preparatet kan anvendes for å behandle kreft som særpreges ved nærvær av HER2/HER1- og/eller HER2/HER3- og/eller HER2/HER4-heterodimerer og/eller ved fosforylering av ErbB-reseptor. Pakningsvedlegget kan videre instruere brukeren av preparatet (som omfatter et antistoff som bindes til ErbB2 og blokkerer ligandaktivering av en ErbB-reseptor) til å kombinere behandling med antistoffet med enhver av tilleggsbehandlingsformene som er beskrevet i den foregående seksjonen (f. eks. et kjemoterapeutisk middel, et EGFR-rettet medikament, et anti-angiogent middel, en anti-hormonforbindelse, et hjertebeskyttende middel og/eller et cytokin). Alternativt eller i tillegg kan den fremstilte gjenstand videre omfatte en andre (eller tredje) beholder som omfatter en farmasøytisk aksepterbar buffer, slik som bakteriostatisk vann for injeksjon (BWFI), fosfatbufret saltvann, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan videre inkludere andre materialer som er ønskelige fra et kommersielt synspunkt eller et brukersynspunkt, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtere, kanyler og sprøyter. The manufactured article comprises a container and a label or a package insert on or connected to the container. Suitable containers include, for example, bottles, ampoules, syringes, etc. The containers can be made of a variety of materials, for example glass or plastic. The container contains a preparation effective for treating the condition and may have a sterile access port (for example, the container may be a bag for intravenous solutions or an ampoule with a stopper that can be penetrated by a hypodermic needle). At least one active agent in the preparation is an anti-ErbB2 antibody. The label or package insert states that the preparation is used for the treatment of the selected condition, for example cancer. In one embodiment, the label or package insert states that the preparation comprising the antibody that binds to ErbB2 can be used to treat a patient suffering from a tumor in which the presence of HER2/HER1 and/or HER2/HER3 and/or HER2/HER4 complexes have been identified and/or phosphorylation of ErbB receptor has been demonstrated. Furthermore, the manufactured object may comprise (a) a first container with a preparation in, where the preparation comprises a first antibody that binds to ErbB2 and inhibits the growth of cancer cells that overexpress ErbB2, and (b) a second container containing a preparation, where the preparation comprises a second antibody that binds to ErbB2 and blocks ligand activation of an ErbB receptor. The manufactured item in this embodiment of the invention may further include a package insert indicating that the first and second antibody preparation can be used to treat cancer that is characterized by the presence of HER2/HER1 and/or HER2/HER3 and/or HER2 /HER4 heterodimers and/or by phosphorylation of the ErbB receptor. The package insert may further instruct the user of the preparation (comprising an antibody that binds to ErbB2 and blocks ligand activation of an ErbB receptor) to combine treatment with the antibody with any of the additional forms of treatment described in the previous section (e.g. a chemotherapeutic agent , an EGFR-targeted drug, an anti-angiogenic agent, an anti-hormone compound, a cardioprotective agent and/or a cytokine). Alternatively or additionally, the manufactured item may further comprise a second (or third) container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacteriostatic water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. It may further include other materials desirable from a commercial or user standpoint, including other buffers, diluents, filters, cannulas, and syringes.

Deponering av materialer Deposit of materials

Følgende hybridom cellelinjer har blitt deponert hos American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC): The following hybridoma cell lines have been deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Videre detaljer vedrørende oppfinnelsen illustreres av de påfølgende eksempler. Further details regarding the invention are illustrated by the following examples.

Eksempel 1 Example 1

HRG-avhengig assosiasjon mellom ErbB2 og ErbB3 blokkeres av det monoklonale antistoff 2C4 HRG-dependent association between ErbB2 and ErbB3 is blocked by the monoclonal antibody 2C4

Det monoklonale muse antistoff 2C4, som spesifikt bindes til det ekstracellulære domene av ErbB2, beskrives i WO 01/89566 The monoclonal mouse antibody 2C4, which specifically binds to the extracellular domain of ErbB2, is described in WO 01/89566

Evnen til ErbB3 til å assosiere med ErbB2 ble analysert i et ko-immun-presipiteringseksperiment. 1,0 x IO<6>MCF7- eller SK-BR-3-celler ble sådd ut i 6-brønners vevsdyrknings plater i 50:50 DMEM/Ham's F12-medium tilsatt 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 10 mM HPEPS, pH 7,2 (dyrkningsmedium) og fikk feste seg over natten. Cellene ble sultet i to timer i dyrkningsmedium uten serum før start av eksperimentet. The ability of ErbB3 to associate with ErbB2 was analyzed in a co-immunoprecipitation experiment. 1.0 x IO<6>MCF7 or SK-BR-3 cells were seeded in 6-well tissue culture plates in 50:50 DMEM/Ham's F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 10 mM HPEPS , pH 7.2 (culture medium) and allowed to attach overnight. The cells were starved for two hours in culture medium without serum before starting the experiment.

Cellene ble vasket raskt med fosfatbuffret saltvann (PBS) og så inkubert med enten 100 nM av det angitte antistoffet fortynnet i 0,2 % (vekt/vol) bovint serum albumin (BSA) i RPMI-medium med 10 mM HEPES, pH 7,2 (bindingsbuffer) eller med bindingsbuffer alene (kontroll). Etter 1 time ved romtemperatur ble HRG tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 nM til halvparten av brønnene (+). Et tilsvarende volum bindingsbuffer ble tilsatt til de andre brønnene (-). Inkubasjonen ble fortsatt i tilnærmet 10 minutter. The cells were washed rapidly with phosphate-buffered saline (PBS) and then incubated with either 100 nM of the indicated antibody diluted in 0.2% (w/v) bovine serum albumin (BSA) in RPMI medium with 10 mM HEPES, pH 7, 2 (binding buffer) or with binding buffer alone (control). After 1 h at room temperature, HRG was added to a final concentration of 5 nM to half of the wells (+). An equivalent volume of binding buffer was added to the other wells (-). Incubation was continued for approximately 10 minutes.

Supernatanten ble fjernet ved avsuging, og cellene ble lysert i RPMI, 10 mM HEPES, pH 7,2, 1,0 % (vol/vol) 'TRITON X-100™", 1,0 % (vekt/vol) CHAPS (lyseringsbuffer) inneholdende 0,2 mM PMSF, 10 ng/ml leupeptin og 10 TU/ml aprotinin. Uløselig materiale ble fjernet fra lysatene ved sentrifugering. The supernatant was removed by aspiration, and the cells were lysed in RPMI, 10 mM HEPES, pH 7.2, 1.0% (vol/vol) 'TRITON X-100™', 1.0% (w/v) CHAPS ( lysis buffer) containing 0.2 mM PMSF, 10 ng/ml leupeptin and 10 TU/ml aprotinin Insoluble material was removed from the lysates by centrifugation.

ErbB2 ble immunpresipitert ved anvendelse av et monoklonalt antistoff kovalent koblet til en affinitetsgel (Affi-Prep 10, Bio-Rad). Dette antistoff (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) gjenkjenner en epitop i det cytoplasmatiske domenet. Immunpresipiteringen ble utført ved å tilsette 10 ni gelsuspensjon inneholdende tilnærmet 8,5 ug immobilisert antistoff til hvert lysat, og prøvene ble blandet ved romtemperatur i 2 timer. Gelen ble så oppsamlet ved sentrifugering. Gelene ble vasket porsjonsvis tre ganger med lyseringsbuffer for å fjerne ubundet materiale. SDS-prøvebuffer ble så tilsatt, og prøvene ble oppvarmet i kort tid i et kokende vannbad. ErbB2 was immunoprecipitated using a monoclonal antibody covalently linked to an affinity gel (Affi-Prep 10, Bio-Rad). This antibody (Ab-3, Oncogene Sciences, USA) recognizes an epitope in the cytoplasmic domain. The immunoprecipitation was performed by adding 10 µl of gel suspension containing approximately 8.5 µg of immobilized antibody to each lysate, and the samples were mixed at room temperature for 2 hours. The gel was then collected by centrifugation. The gels were washed in portions three times with lysis buffer to remove unbound material. SDS sample buffer was then added and the samples were heated briefly in a boiling water bath.

Supernatantene ble kjørt på 4-12 % polyakrylamid geler og elektroblottet til nitrocellulose membraner. Nærvær av ErbB3 ble vurdert ved å probe blottene med et polyklonalt antistoff mot en cytoplasmatiske-domene-epitop derav (c-17, Santa Cruz Biotech). Blottene ble visualisert ved anvendelse av et kjemiluminiserende substrat (ECL, Amersham). The supernatants were run on 4-12% polyacrylamide gels and electroblotted to nitrocellulose membranes. The presence of ErbB3 was assessed by probing the blots with a polyclonal antibody against a cytoplasmic-domain epitope thereof (c-17, Santa Cruz Biotech). The blots were visualized using a chemiluminescent substrate (ECL, Amersham).

Som vist i kontrollsporene i Fig. 2A og 2B for MCF7-celler, henholdsvis SK-BR-3-celler forelå ErbB3 i et ErbB2-immunpresipitat kun når cellene var stimulert med HRG. Hvis cellene først ble inkubert med monoklonalt antistoff 2C4 forsvant ErbB3-signalet i MCF7-cellene (Fig. 5A, spor 2C4+) og var vesentlig redusert i SK-BR-3-cellene (Fig. 5B, spor 2C4+). Som vist i Fig. 2A-B blokkerer monoklonalt antistoff 2C4 heregulinavhengig assosiering av ErbB3 med ErbB2 i både MCF7-celler og SK-BR-3-celler vesentlig mer effektivt en "HERCEPTIN®". Pre-inkubering med "HERCEPTIN®" reduserte ErbB3-signalet i MCF7-lysater, men hadde liten eller ingen virkning på mengden ErbB2 som ble ko-presipitert fra SK-BR-3-lysater. Pre-inkubering med et antistoff mot EGF-reseptoren (Ab-1, Oncogene Sciences, USA) hadde ingen virkning på evnen til ErbB3 til å ko-immunpresipitere med ErbB2 i noen av cellelinjene. As shown in the control traces in Fig. 2A and 2B for MCF7 cells, SK-BR-3 cells, respectively, ErbB3 was present in an ErbB2 immunoprecipitate only when the cells were stimulated with HRG. If the cells were first incubated with monoclonal antibody 2C4, the ErbB3 signal disappeared in the MCF7 cells (Fig. 5A, lane 2C4+) and was significantly reduced in the SK-BR-3 cells (Fig. 5B, lane 2C4+). As shown in Fig. 2A-B, monoclonal antibody 2C4 blocks heregulin-dependent association of ErbB3 with ErbB2 in both MCF7 cells and SK-BR-3 cells significantly more effectively than "HERCEPTIN®". Pre-incubation with "HERCEPTIN®" reduced the ErbB3 signal in MCF7 lysates, but had little or no effect on the amount of ErbB2 co-precipitated from SK-BR-3 lysates. Pre-incubation with an antibody against the EGF receptor (Ab-1, Oncogene Sciences, USA) had no effect on the ability of ErbB3 to co-immunoprecipitate with ErbB2 in either cell line.

Eksempel 2 Example 2

Cellelinjer og humane tumor-xenopodingsmodellers evne til å respondere på 2C4 Ability of cell lines and human tumor xenograft models to respond to 2C4

Tilnærmet 40 tumormodeller har blitt analysert for evne til å respondere 2C4. Disse modellene representerer større kreftformer som bryst, lunge, prostata og kolon. 50-60 % av modellene responderte på 2C4-behandling. Tabell 1 nedenfor opplister utvalgte tumormodeller som er analysert for evne til å respondere på 2C4. Kort beskrevet ble humane tumor-xenopodefragmenter på omtrent 3 mm størresle ble transplantert under huden til atymiske naken mus. Alternativt ble humane tumorceller dyrket in vitro løsnet fra dyrkningsskålene, resuspendert i fosfatbufret saltvann og injisert subkutant i flanken til de immunkompromiterte musene. Tumorveksten ble målt hver annen til hver tredje dag ved anvendelse av et elektrisk skyvelær. Etter at tumorene hadde nådd en størrelse på omtrent 30 til 100 mm ble dyrene tilfeldig fordelt på forskjellige behandlingsgrupper og kontrollgrupper. 2C4 ble administrert ved intraperitoneal injeksjon én gang hver uke. Kontrolldyrene mottok det samme volum av bærestoff uten antistoff etter samme tidsplan som behandlingsgruppene. Undersøkelsen ble avsluttet etter tilnærmet 3-6 uker, når tumorene i kontrollgruppen hadde nådd en størrelse på omtrent 1 000-1 500 nm<3>. Evnen til å respondere på behandling ble definert som >.50 % reduksjon av tumorvolumet. Approximately 40 tumor models have been analyzed for ability to respond to 2C4. These models represent larger forms of cancer such as breast, lung, prostate and colon. 50-60% of the models responded to 2C4 treatment. Table 1 below lists selected tumor models that have been analyzed for ability to respond to 2C4. Briefly, human tumor xenopod fragments approximately 3 mm in size were transplanted subcutaneously into athymic nude mice. Alternatively, human tumor cells grown in vitro were detached from the culture dishes, resuspended in phosphate-buffered saline, and injected subcutaneously into the flank of the immunocompromised mice. Tumor growth was measured every two to three days using an electric caliper. After the tumors had reached a size of approximately 30 to 100 mm, the animals were randomly assigned to different treatment groups and control groups. 2C4 was administered by intraperitoneal injection once every week. Control animals received the same volume of vehicle without antibody on the same schedule as the treatment groups. The study was terminated after approximately 3-6 weeks, when the tumors in the control group had reached a size of approximately 1,000-1,500 nm<3>. The ability to respond to treatment was defined as >.50% reduction of tumor volume.

Modellene representerer to hovedtyper av tumorer, nemlig ikke-småcellet-lungekreft (NSCLC, modell nr. 1-13) og brystkreft (modell nr. 14-18). Ni av NSCLC-modellene (nr. 1-10) og alle brystkreft-modellene var fremstilt ved seriell in vivo-overføring av humane tumorfragmenter i immundefisiente mus. De gjenværende NSCLC-modellene (nr. 10-13) er cellebaserte modeller hvor/n wVo-tumorvekst induseres ved implantering av in wtro-oppformerte celler i immun kompromitterte mus. The models represent two main types of tumors, namely non-small cell lung cancer (NSCLC, model no. 1-13) and breast cancer (model no. 14-18). Nine of the NSCLC models (no. 1-10) and all the breast cancer models were prepared by serial in vivo transfer of human tumor fragments into immunodeficient mice. The remaining NSCLC models (no. 10-13) are cell-based models where wVo tumor growth is induced by implantation of in vitro propagated cells in immune compromised mice.

Berger, D.P., Winterhalter, B.R. og Fiebig, H.H. (1992). Establismeht and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice. I immunodeficient Mice in Oncology, H.H. Fiebig og D.P. Berger, red. (Base: Karger), s. 23-46. Berger, D.P., Winterhalter, B.R. and Fiebig, H.H. (1992). Establishment and Characterization of Human Tumor Xenografts in Thymus-Aplastic Nude Mice. In immunodeficient mice in oncology, H.H. Fiebig and D.P. Berger, ed. (Base: Karger), pp. 23-46.

Burger, A.M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H., og Fiebig, H.H. (2001). Pre-clinical evaluation of a methotrexate-albumin conjugate (MTX-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cancer, 92:718-24. Burger, A.M., Hartung, G., Stehle, G., Sinn, H., and Fiebig, H.H. (2001). Pre-clinical evaluation of a methotrexate-albumin conjugate (MTX-HSA) in human tumor xenografts in vivo. Int. J. Cancer, 92:718-24.

Fiebig, H.H. og Burger, A.M. (2002). Human tumor Xenografts and Explants. I Tumor Models in Cancer Research, B.A. Teicher, red. (Totowa, New Jersey: Humana Press), s. 113-137. Fiebig, H.H. and Burger, A.M. (2002). Human tumor Xenografts and Explants. In Tumor Models in Cancer Research, B.A. Teicher, ed. (Totowa, NJ: Humana Press), pp. 113-137.

Fiebig, H.H., Dengler, W.A. og Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. I Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, H.H. Fiebig og A.M. Bruger, red. (Basel: Karger), s. 29-50. Fiebig, H.H., Dengler, W.A. and Roth, T. (1999). Human Tumor Xenografts: Predictivity, Characterization and Discovery of New Anticancer Agents. In Contributions to Oncology: Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development, H.H. Fiebig and A.M. User, ed. (Basel: Karger), pp. 29-50.

Gridley, D.S., Andres, M.L., Garner, C, Mao, X.W. og Slater, J.M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarconoma modell. Oncol. Res., 8:485-95. Gridley, D.S., Andres, M.L., Garner, C, Mao, X.W. and Slater, J.M. (1996). Evaluation of TNF-alpha effects on radiation efficacy in a human lung adenocarconoma model. Oncol. Res., 8:485-95.

Stein, R., Govindan, S.v., Chen, S., Reed, L, Spiegelman, H., Griffiths, G.L., Hansen, H.J. og Goldenberg, D.M. (2001). Successful therapy of a human lung cancer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Cirt. Rev. Oncol. Hematol., 39:173-80. Stein, R., Govindan, S.v., Chen, S., Reed, L., Spiegelman, H., Griffiths, G.L., Hansen, H.J. and Goldenberg, D.M. (2001). Successful therapy of a human lung cancer xenograft using MAb RS7 labeled with residualizing radioiodine. Cirt. Fox. Oncol. Hematol., 39:173-80.

Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H., og Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung cancer xenografts. Jpn. J. Cancer Res., 88:1205-10. Yamori, T., Sato, S., Chikazawa, H., and Kadota, T. (1997). Anti-tumor efficacy of paclitaxel against human lung cancer xenografts. Japan J. Cancer Res., 88:1205-10.

Zou, Y., Wu, Q.P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M.C., Charnsangavej, C, Wallace, S. og Li, C. (2001). Effectiveness of water souluble poly(L-glutamic acid)-camptothecin conjgate against resistant human lung cancer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol., 18:331-6. Zou, Y., Wu, Q.P., Tansey, W., Chow, D., Hung, M.C., Charnsangavej, C, Wallace, S. and Li, C. (2001). Effectiveness of water soluble poly(L-glutamic acid)-camptothecin conjugate against resistant human lung cancer xenografted in nude mice. Int. J. Oncol., 18:331-6.

Eksempel 3 Example 3

Påvisning av heterodimerer i 2C4-responderende tumorer ved immunpresipitering Detection of heterodimers in 2C4-responsive tumors by immunoprecipitation

2C4-responderende og ikke-responderende tumorer ble utsatt for immunpresipitering med anti-ErbB2-antistoffer for å analysere for tilstedeværelse av ErbB2-ErbB3- og EGFR-ErbB2-heterodimerer. Dersom ikke annet er angitt ble fremgangsmåtene utført ifølge Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982. 2C4 responding and non-responding tumors were subjected to immunoprecipitation with anti-ErbB2 antibodies to analyze for the presence of ErbB2-ErbB3 and EGFR-ErbB2 heterodimers. Unless otherwise stated, the procedures were carried out according to Maniatis T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.

Anti-HER2-, anti-HER3- og anti-HERl-antistoffer som ikke kryssreagerte ble valgt. For å fastslå hvorvidt antistoffene kryssreagerte ble HERI-, HER2-, HER3- og HER4-reseptorer uttrykt i humane embryonale nyre-(HEK)-293-celler. Cellene ble lysert ved anvendelse av av en "Triton™" X100 (1 % (vekt/vol)-holdig HEPES-buffer (pH 7,5). Anti-HER2, anti-HER3 and anti-HER1 antibodies that did not cross-react were selected. To determine whether the antibodies cross-reacted, HERI, HER2, HER3 and HER4 receptors were expressed in human embryonic kidney (HEK)-293 cells. The cells were lysed using a "Triton™" X100 (1% (w/v) HEPES buffer (pH 7.5).

Tilnærmet 20 ug av totalt celleprotein fra kontrollceller og HERI-, HER2-, HER3-og HER4-uttrykkende celler ble separert i en SDS-gel og overført til en nitrocellulose-membran ved en halvtørr blotting-prosedyre. Etter blokkering med gelatin ble en rekke anti-HERl-, anti-HER2- og anti-HER3-antistoffer analysert for deres kryssreaktivitet med andre ErbB-reseptorer. Antistoffene som ble valgt for anvendelse i eksperimentene som beskrives nedenfor viste ingen signifikant kryssreaktivitet. Approximately 20 µg of total cellular protein from control cells and HERI-, HER2-, HER3- and HER4-expressing cells were separated in an SDS gel and transferred to a nitrocellulose membrane by a semi-dry blotting procedure. After blocking with gelatin, a series of anti-HER1, anti-HER2 and anti-HER3 antibodies were analyzed for their cross-reactivity with other ErbB receptors. The antibodies selected for use in the experiments described below showed no significant cross-reactivity.

Ferske tumorprøver ble knust mekanisk på is og lysert i en buffer som inneholdt 50 mM HEPES pH 7,5, 150 mm NaCI, 1,5 mM MgCI2, 1 mM EDTA, 10 % (vekt/vol) glyserol, 1 % (vekt/vol) Triton™ X-100, 1 mM PMSF, 10 ng/ml aprotinin og 0,4 mM ortovanadat. Fullstendig lyserte tumorer ble sentrifugert flere ganger inntil supernatantene var fullstendig klare. Immunpresipiteringen forløp ved å blande klarnede tumorlysater (5-7 mg protein per lysat), 5 ug anti-ErbB2-antistoff (ab-3, et monoklonalt museantistoff, katalog nr. OP15, Oncogene Inc., USA) og 50 ni protein G-koblet agarose i 1,5 ml Eppendorf-reaksjonsrør. Etter tilsetning av ett til to gangers volum av 50 mM Fresh tumor samples were crushed mechanically on ice and lysed in a buffer containing 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10% (w/v) glycerol, 1% (w/v vol) Triton™ X-100, 1 mM PMSF, 10 ng/ml aprotinin and 0.4 mM orthovanadate. Completely lysed tumors were centrifuged several times until the supernatants were completely clear. The immunoprecipitation proceeded by mixing clarified tumor lysates (5-7 mg protein per lysate), 5 µg anti-ErbB2 antibody (ab-3, a mouse monoclonal antibody, catalog no. OP15, Oncogene Inc., USA) and 50 ni protein G- cross-linked agarose in 1.5 ml Eppendorf reaction tubes. After adding one to two times the volume of 50 mM

HEPES-buffer, pH 7,5 inneholdende 0,1 % (vekt/vol) Triton™ X-100 ble rørene rotert i 3-4 timer ved 4°C, fulgt av sentrifugering. Pelletene ble vasket to til tre ganger med 500 ul HEPES buffer, pH 7.5 containing 0.1% (w/v) Triton™ X-100, the tubes were rotated for 3-4 hours at 4°C, followed by centrifugation. The pellets were washed two to three times with 500 µl

50 mM HEPES-buffer pH 7,5 inneholdende 0,1 % (vekt/vol) Triton™ X-100. Et likt volum 2x Låmmli-prøvebuffer ble tilsatt til det vaskede immunpresipitatet, og prøvene ble 50 mM HEPES buffer pH 7.5 containing 0.1% (w/v) Triton™ X-100. An equal volume of 2x Låmmli sample buffer was added to the washed immunoprecipitate, and the samples were

oppvarmet i 5 minutter ved 95°C. Prøvene ble separert med SDS-PAGE og overført til nitrocellulose. Nærvær av EGFR-ErbB2- og ErbB2-ErbB3-heterodimerer ble analysert ved å probe blottene med antistoffer mot EGFR (kanin polyklonalt antistoff mot EGFR, Upstate Inc., USA, katalog nr. 06-847) og ErbB3 (polyklonalt antistoff mot ErbB3, Santa Cruz Inc., USA, katalog nr. SC-285). ). Et peroksidase-(POD)-merket anti-kanin-Fc-antistoff (BioRad Laboratories Inc. USA) ble anvendt som sekundært antistoff. Blottene ble visualisert ved anvendelse av et kjemiluminisens substrat (ECL pluss, Amersham). heated for 5 minutes at 95°C. The samples were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose. The presence of EGFR-ErbB2 and ErbB2-ErbB3 heterodimers was analyzed by probing the blots with antibodies against EGFR (rabbit polyclonal antibody against EGFR, Upstate Inc., USA, catalog no. 06-847) and ErbB3 (polyclonal antibody against ErbB3, Santa Cruz Inc., USA, Catalog No. SC-285). ). A peroxidase (POD)-labelled anti-rabbit Fc antibody (BioRad Laboratories Inc. USA) was used as secondary antibody. The blots were visualized using a chemiluminescence substrate (ECL plus, Amersham).

Figur 3 viser resultatene av disse eksperimentene. Nærvær av ErbB2-ErbB3-og/eller EGFR-ErbB2-heterodimerer kan ses. En korrelasjon ble observert mellom evne til å respondere på 2C4, vist i Tabell 1, og nærvær av ErbB2-ErbB3- og/eller EGFR-ErbB2-heterodimerer. Figure 3 shows the results of these experiments. Presence of ErbB2-ErbB3 and/or EGFR-ErbB2 heterodimers can be seen. A correlation was observed between ability to respond to 2C4, shown in Table 1, and the presence of ErbB2-ErbB3 and/or EGFR-ErbB2 heterodimers.

Eksempel 4 Example 4

Korrelasjon mellom evne til å respondere på rhuMAb 2C4 og HER2-fosforylering Correlation between ability to respond to rhuMAb 2C4 and HER2 phosphorylation

Virkningen av rhuMAb 2C4 på tumorvekst har blitt undersøkt i 14 humane tumorer eksplantert i mus (9 lungekreft og 5 brystkreft). Eksplantering av tumoren og behandlingen ble utført som beskrevet i Eksempel 2. HER2-heterodimerer ble påvist som beskrevet i Eksempel 3. The effect of rhuMAb 2C4 on tumor growth has been investigated in 14 human tumors explanted in mice (9 lung cancer and 5 breast cancer). Explantation of the tumor and treatment was performed as described in Example 2. HER2 heterodimers were detected as described in Example 3.

HER2-fosforylering ble analysert ved immunpresipitering av HER2 og Wester-blot analyse. Positivitet ble bestemt ved nærvær av et fosfo-HER2-bånd i gelen. Negativitet ble bestemt ved fravær av båndet. HER2-fosforylering ble bekreftet ved immunhistokjemi ved anvendelse av et fosfo-spesifikt anti-HER2-antistoff (klon PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol., 18:3230-9 (2000). HER2 phosphorylation was analyzed by immunoprecipitation of HER2 and Wester-blot analysis. Positivity was determined by the presence of a phospho-HER2 band in the gel. Negativity was determined by the absence of the band. HER2 phosphorylation was confirmed by immunohistochemistry using a phospho-specific anti-HER2 antibody (clone PN2A, Thor et al., J. Clin. Oncol., 18:3230-9 (2000).

I 5 av de analyserte tumorer (3 lungekreft og 2 brystkreft) ble en signifikant inhibisjon av tumorveksten observert, som korrelerte med nærvær av påvisbare heterodimerer av HER2 og enten HERI eller HER3 og kraftig HER2-fosforylering i alle tilfeller. I 9 tumorer i hvilke ingen signifikant respons på behandling med rhuMAb 2C4 ble observert, ble heterodimerer ikke påvist og HER2-fosforylering var fraværende. Nærvær av HER2-heterodimerisering eller signifikant HER2-fosforylering er en kraftig prediktor for respons på rhuMAb 2C4 behandling i ikke-kliniske modeller. Tilsvarende observasjoner har blitt gjort med xenopodinger fra tumorcellelinjer. In 5 of the analyzed tumors (3 lung cancer and 2 breast cancer) a significant inhibition of tumor growth was observed, which correlated with the presence of detectable heterodimers of HER2 and either HERI or HER3 and strong HER2 phosphorylation in all cases. In 9 tumors in which no significant response to treatment with rhuMAb 2C4 was observed, heterodimers were not detected and HER2 phosphorylation was absent. The presence of HER2 heterodimerization or significant HER2 phosphorylation is a powerful predictor of response to rhuMAb 2C4 treatment in non-clinical models. Similar observations have been made with xenografts from tumor cell lines.

Eksempel 5 Example 5

Påvisning av HER2-fosforylering i 2C4-responderende tumorer Detection of HER2 phosphorylation in 2C4-responsive tumors

Effekten av rhuMAb 2C4 ble analysert i 9 etablerte ikke-småcellet-lungekarsinom (NSCLC)-xenopodede tumormodeller (LXFE 211, LXFA 289, LX FA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Freiburg, Tyskland). Humane tumor-xenopodinger anses å være de mest relevante modeller for anti-kreftmiddel utvikling, fordi pasientens tumorer vokser som en fast tumor, utvikler stroma, vaskulatur og en sentral nekrose samt viser kuppeldifferensiering. I tillegg ligner de xenopodete tumormodellene svært mye på de opprinnelige tumorene når det gjelder histologi og kjemosensitivitet. The efficacy of rhuMAb 2C4 was analyzed in 9 established non-small cell lung carcinoma (NSCLC) xenografted tumor models (LXFE 211, LXFA 289, LX FA 297, LXFE 397, LXFA 526, LXFA 629, LXFA 1041, LXFL 1071, Oncotest GmbH, Freiburg , Germany). Human tumor xenografts are considered to be the most relevant models for anti-cancer drug development, because the patient's tumors grow as a solid tumor, develop stroma, vasculature and a central necrosis and show domed differentiation. In addition, the xenopodized tumor models closely resemble the original tumors in terms of histology and chemosensitivity.

Vekstinhibering ble analysert som beskrevet i Eksempel 2. Signifikant vekstinhiberende aktivitet ble definert som >50 % vekstinhibering av behandlingsgruppen relativ til kontrollgruppen. I tre av NSCLC-modellene (LXFA 297, LXFA 629 og LXFL 1072) ble en signifikant vekstinhiberende respons på behandling med rhuMAb 2C4 observert. Flere kjennetegn på ligandaktivert HER2 har også blitt undersøkt på proteinnivå. Som vist i Figur 4 kunne HER2 immunpresipiteres fra tumorekstrakter fra åtte av ni NSCLC-tumorer. For å bestemme aktiveringsstatusen til HER2 ble disse blottene så probet med anti-fosfotyrosin (anti-PY)-antistoff. Som vist i det nedre feltet i Figur 4 viste de tre responderende tumorene (LXFA 297, LXFA 629 og 1072) kraftig HER2-aktivering. Growth inhibition was analyzed as described in Example 2. Significant growth inhibitory activity was defined as >50% growth inhibition of the treatment group relative to the control group. In three of the NSCLC models (LXFA 297, LXFA 629 and LXFL 1072), a significant growth inhibitory response to treatment with rhuMAb 2C4 was observed. Several characteristics of ligand-activated HER2 have also been investigated at the protein level. As shown in Figure 4, HER2 could be immunoprecipitated from tumor extracts from eight of nine NSCLC tumors. To determine the activation status of HER2, these blots were then probed with anti-phosphotyrosine (anti-PY) antibody. As shown in the lower panel of Figure 4, the three responding tumors (LXFA 297, LXFA 629 and 1072) showed strong HER2 activation.

Eksempel 6 Example 6

Klinisk studium for å identifisere lungekreft-pasienter for behandling med rhuMAb 2C4 ved påvisning av HER2-heterodimerer Clinical study to identify lung cancer patients for treatment with rhuMAb 2C4 by detection of HER2 heterodimers

En pasient vises å ha ikke-småcellet-lungekreft (NSCLC) som responderer på behandling med rhuMAb 2C4 dersom en tumor fra pasienten finnes å omfatte HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-komplekser. A patient is shown to have non-small cell lung cancer (NSCLC) that responds to treatment with rhuMAb 2C4 if a tumor from the patient is found to include HER2/HER3 and/or HER2/HER1 and/or HER2/HER4 complexes.

En tumorprøve fremskaffes ved biopsi eller under kirurgisk fjerning av tumoren. Prøven analyseres så for nærvær av HER2/HER3- og/eller HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer. A tumor sample is obtained by biopsy or during surgical removal of the tumor. The sample is then analyzed for the presence of HER2/HER3 and/or HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers.

Tumorceller eller cellelysater settes i forbindelse med en "eTag™" som spesifikt bindes til HER2. eTag™'en omfatter en påvisbar gruppe og en første bindende gruppe som er spesifikk for HER2. Den påvisbare gruppe er koblet til den første bindende gruppe ved hjelp av en spaltbar linker. Etter å gi tid til binding fjernes overskudd av "eTag™". Tumor cells or cell lysates are linked to an "eTag™" that specifically binds to HER2. The eTag™ comprises a detectable group and a first binding group specific for HER2. The detectable group is connected to the first binding group by means of a cleavable linker. After allowing time for bonding, excess "eTag™" is removed.

Tumorcellene eller cellelysatene settes i forbindelse med en andre bindende forbindelse som spesifikt bindes til HERI, HER3 eller HER4. Ubundet forbindelse fjernes ved vasking. Den andre bindende forbindelse aktiveres så. Dersom den første bindende forbindelse og den andre bindende forbindelse ligger nær hverandre spalter den aktiverte andre bindende forbindelse den spaltbare linkeren i eTag™'en for å danne en fri påvisbar gruppe. Identifikasjonen av fri påvisbar gruppe i prøven indikerer at tumoren omfatter HER2/HER1-, HER2/HER3- eller HER2/HER4-heterodimerer. The tumor cells or cell lysates are combined with a second binding compound that specifically binds to HERI, HER3 or HER4. Unbound compound is removed by washing. The second binding compound is then activated. If the first binding compound and the second binding compound are close to each other, the activated second binding compound cleaves the cleavable linker in the eTag™ to form a free detectable group. The identification of free detectable group in the sample indicates that the tumor comprises HER2/HER1, HER2/HER3 or HER2/HER4 heterodimers.

Etter at det har blitt fastslått at pasienten lider av en tumor som omfatter HER2/HER1- og/eller HER2/HER3- og/eller HER2/HER4-heterodimerer tilføres rhuMAb 2C4 intravenøst (IV) ukentlig eller hver tredje uke i en dose på 2 henholdsvis 4 mg/kg inntil sykdomsprogresjon. Antistoffet leveres som et flytende formulering med flere doser (20 ml oppfylling ved en konsentrasjon på 20 mg/ml eller høyere konsentrasjon). Primære effektmål omfatter responshastighet og sikkerhet. Sekundære effektmål inkluderer: total overlevelse, tid til sykdomsprogresjon, livskvalitet og/eller varighet av respons. After it has been established that the patient suffers from a tumor comprising HER2/HER1 and/or HER2/HER3 and/or HER2/HER4 heterodimers, rhuMAb 2C4 is administered intravenously (IV) weekly or every three weeks at a dose of 2 respectively 4 mg/kg until disease progression. The antibody is supplied as a multi-dose liquid formulation (20 ml refill at a concentration of 20 mg/ml or higher concentration). Primary performance measures include response speed and security. Secondary efficacy measures include: overall survival, time to disease progression, quality of life and/or duration of response.

Eksempel 7 Example 7

Klinisk studie for å identifisere kreftpasienter for behandling med rhuMAb 2C4 Clinical trial to identify cancer patients for treatment with rhuMAb 2C4

En biologisk prøve som omfatter kreftceller fremskaffes fra kandidater til behandlingen, f. eks. ved biopsi av tumorvev, utsugning av tumorceller fra ascitis væske eller ved hvilken som helst annen fremgangsmåte som er kjent i klinisk praksis. Den biologiske prøven analyseres for HER2-fosforylering, f. eks. ved immunpresipitering og Western-blot analyse, og/eller for nærvær av HER2/HER3-, HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer ved hvilken som helst av teknikkene som er beskrevet ovenfor. Individer hvis biologiske prøve var positiv for HER2-fosforylering og/eller nærvær av HER2/HER3-, HER2/HER1- og/eller HER2/HER4-heterodimerer vil sannsynligvis vise en bedre respons på behandling med rhuMAb 2C4 enn pasienter hvis tumorprøve viste ingen HER2-fosforylering eller hvor ingen heterodimer ble påvist. A biological sample comprising cancer cells is obtained from candidates for the treatment, e.g. by biopsy of tumor tissue, extraction of tumor cells from ascitis fluid or by any other method known in clinical practice. The biological sample is analyzed for HER2 phosphorylation, e.g. by immunoprecipitation and Western blot analysis, and/or for the presence of HER2/HER3, HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers by any of the techniques described above. Individuals whose biological sample was positive for HER2 phosphorylation and/or the presence of HER2/HER3, HER2/HER1 and/or HER2/HER4 heterodimers are likely to show a better response to treatment with rhuMAb 2C4 than patients whose tumor sample showed no HER2 -phosphorylation or where no heterodimer was detected.

For eksempel vil individer diagnostisert med ovariekreft gjennomgå en biopsi av tumorvev eller utsugning av tumorceller fra ascitis væske. Dette vev blir analysert for HER2-fosforylering ved immunpresipitering og Western-blot analyse. Dette vil kreve et minimum på omtrent 250 mg tumorvev. For example, individuals diagnosed with ovarian cancer will undergo a biopsy of tumor tissue or aspiration of tumor cells from ascitis fluid. This tissue is analyzed for HER2 phosphorylation by immunoprecipitation and Western blot analysis. This will require a minimum of approximately 250 mg of tumor tissue.

Ved bestemmelse av at pasienten lider av kreft, (slik som kastrasjonsresistent prostatakreft - CRPC - eller ovariekreft) som er positive for HER2-fosforylering, vil When determining that the patient suffers from cancer, (such as castration-resistant prostate cancer - CRPC - or ovarian cancer) that are positive for HER2 phosphorylation, the

pasienten gis en startdose på 840 mg rhuMAb 2C4 på dag 1 i syklus 1 (første 21-dagers behandlingsperiode), fulgt av 420 mg på dag 1 i hver påfølgende 21-dagers syklus, som kontinuerlig intravenøs infusjon. Behandlingen fortsetter ved intravenøs infusjon hver 3. the patient is given a starting dose of 840 mg rhuMAb 2C4 on day 1 of cycle 1 (first 21-day treatment period), followed by 420 mg on day 1 of each subsequent 21-day cycle, as a continuous intravenous infusion. Treatment continues by intravenous infusion every 3 days.

uke i opp til ett år (17 sykluser) for pasienter som ikke viser tegn på sykdomsprogresjon. Behandlingen kan avbrytes når som helst tidligere for manglende respons, bivirkninger eller av andre grunner, ved skjønn av legen. week for up to one year (17 cycles) for patients who show no signs of disease progression. The treatment can be stopped at any time earlier for lack of response, side effects or for other reasons, at the discretion of the doctor.

Claims (12)

1. Rekombinant, humanisert antistoff 2C4 (rhuMab 2C4) for anvendelse i en frem-gangsmåte for behandling av kreft i en pasient, hvor i fremgangsmåten rhuMAb 2C4 administreres som en fast dose på 420 mg hver tredje uke, og hvor rhuMAb 2C4 omfatter de variable lett og variable tunge aminosyresekvensene SEKV ID Nr. 3 og 4, henholdsvis, og human lett og tung IgGl (ikke-A allotype) konstant region sekvenser, og hvor fremgangsmåten også inkluderer administrering av et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff enten før eller etter administreringen av rhuMab 2C4 eller samtidig.1. Recombinant, humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use in a method for treating cancer in a patient, where in the method rhuMAb 2C4 is administered as a fixed dose of 420 mg every three weeks, and where rhuMAb 2C4 comprises the variable light and variable heavy amino acid sequences SEQ ID No. 3 and 4, respectively, and human light and heavy IgGl (non-A allotype) constant region sequences, and where the method also includes the administration of a second, different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody either before or after the administration of rhuMab 2C4 or at the same time. 2. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge krav 1, hvor rhuMAb 2C4 er kinesisk hamsterovarie-(CHO)-celle uttrykt.2. Recombinant, humanized antibody for use according to claim 1, wherein rhuMAb 2C4 is Chinese Hamster Ovary (CHO) cell expressed. 3. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge krav 1 eller krav 2, hvor behandlingen med rhuMAb 2C4 innledes med en startdose på 840 mg.3. Recombinant, humanized antibody for use according to claim 1 or claim 2, where the treatment with rhuMAb 2C4 is initiated with an initial dose of 840 mg. 4. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor kreften er ovariekreft.4. Recombinant, humanized antibody for use according to any one of claims 1-3, wherein the cancer is ovarian cancer. 5. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor kreften er brystekreft.5. Recombinant, humanized antibody for use according to any one of claims 1-3, wherein the cancer is breast cancer. 6. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor kreften er lungekreft.6. Recombinant, humanized antibody for use according to any one of claims 1-3, wherein the cancer is lung cancer. 7. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvor kreften er prostatakreft.7. Recombinant, humanized antibody for use according to any one of claims 1-3, wherein the cancer is prostate cancer. 8. Rekombinant, humanisert antistoff for anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, hvor det andre, forskjellige vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoffet er trastuzumab.8. Recombinant humanized antibody for use according to any one of claims 1 to 7, wherein the second different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody is trastuzumab. 9. Anvendelse av et rekombinant, humanisert antistoff 2C4(rhuMab 2C4) for fremstillingen av et medikament for behandling av ovarie-, bryst-, lunge- eller prostatakreft hos en kreftpasient, hvor rhuMAb 2C4 omfatter de variable lett og variable tunge aminosyre-sekvensene SEKV ID Nr. 3 og 4, henholdsvis, og human lett og tung IgGl (ikke-A allotype) konstant region sekvenser og hvor i behandlingen rhuMAb 2C4 administreres som en fast dose på 420 mg hver tredje uke, og hvor behandlingen også inkluderer administrering av et andre, forskjellig vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoff enten før eller etter administreringen av rhuMab 2C4 eller samtidig.9. Use of a recombinant, humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for the production of a drug for the treatment of ovarian, breast, lung or prostate cancer in a cancer patient, where rhuMAb 2C4 comprises the variable light and variable heavy amino acid sequences SEQ ID No. 3 and 4, respectively, and human light and heavy IgGl (non-A allotype) constant region sequences and where in the treatment rhuMAb 2C4 is administered as a fixed dose of 420 mg every three weeks, and where the treatment also includes the administration of a second, different growth inhibitory anti-ErbB2 antibody either before or after the administration of rhuMab 2C4 or at the same time. 10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor rhuMAb 2C4 er kinesisk hamster ovarie-(CHO)-celle uttrykt.10. Use according to claim 9, wherein rhuMAb 2C4 is Chinese hamster ovary (CHO) cell expressed. 11. Anvendelse ifølge krav 9 eller krav 10, hvor medikamentet er for behandling av en kreftpasient hvor behandlingen med rhuMAb 2C4 innledes med en startdose på 840 mg.11. Use according to claim 9 or claim 10, where the drug is for the treatment of a cancer patient where the treatment with rhuMAb 2C4 is initiated with an initial dose of 840 mg. 12. Anvendelse ifølge krav 9 til 11, hvor det andre, forskjellige vekstinhiberende anti-ErbB2-antistoffet er trastuzumab.12. Use according to claims 9 to 11, wherein the second, different growth-inhibiting anti-ErbB2 antibody is trastuzumab.
NO20151725A 2002-07-11 2015-12-15 Recombinant humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use with a second, various growth inhibitory anti-ErbB2 antibody in a method of treating cancer in a patient and use thereof for the manufacture of a drug NO340576B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39629002A 2002-07-11 2002-07-11
PCT/US2003/021590 WO2004008099A2 (en) 2002-07-15 2003-07-11 METHODS FOR IDENTIFYING TUMORS THAT ARE RESPONSIVE TO TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20151725L NO20151725L (en) 2005-02-14
NO340576B1 true NO340576B1 (en) 2017-05-15

Family

ID=55307103

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20151725A NO340576B1 (en) 2002-07-11 2015-12-15 Recombinant humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use with a second, various growth inhibitory anti-ErbB2 antibody in a method of treating cancer in a patient and use thereof for the manufacture of a drug

Country Status (1)

Country Link
NO (1) NO340576B1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000245A2 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001000245A2 (en) * 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lu, J. et al, Genentech, When should dose be adjusted to body size? A population pharmacokinetic (PPK) simulation, Clinical Pharmacology & Therapeutics, februar 2003, 73, P86, PIII-89, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20151725L (en) 2005-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1585966B1 (en) Treatment of cancer with the anti-ErbB2 antibody rhuMAb 2C4
RU2361880C2 (en) Composition of her2 antibodies
RU2270029C2 (en) HUMANIZED ANTIBODY THAT SHOWS CAPACITY TO BIND ErbB2 AND BLOCK ACTIVATION OF ErbB2 RECEPTOR BY LIGAND (VARIANTS) AND COMPOSITION FOR USING IN CANCER TREATMENT COMPRISING THIS ANTIBODY
KR101517715B1 (en) Therapy of platinum-resistant cancer
KR100754049B1 (en) ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND COMPOSITION USED IN THE MANUFACTURE OF A MEDICAMENT FOR TREATING PROSTATE CANCER
CA2628253A1 (en) Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
ZA200500126B (en) Method for identifying tumors that are responsive to treatment with ANTI-ERBB2 antibodies
NO340576B1 (en) Recombinant humanized antibody 2C4 (rhuMab 2C4) for use with a second, various growth inhibitory anti-ErbB2 antibody in a method of treating cancer in a patient and use thereof for the manufacture of a drug
KOLL et al. Patent 2490758 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired