NO332516B1 - Process for producing biomass, as well as fermentation reactor - Google Patents

Description

Tittel: Fremgangsmåte for fremstilling av biomasse, samt fermenteringsreaktor Denne oppfinnelsen angår forbedringer av og i forhold til fremgangsmåter for fermentering av mikroorganismer, for eksempel dannelsen av biomasse eller fremstillingen av materialer fremstilt ved hjelp av mikroorganismer, og fermentorapparater for utførelsen derav, spesielt fremgangsmåter for å dyrke mikroorganismer i en løkkereaktor ved anvendelse av et gassholdig næringsstoff. Nylig har mye oppmerksomhet vært rettet mot utviklingen av nye proteinkilder som kan inkorporeres i mat for humant og/eller dyreforbruk. En rekke forskjellige proteininneholdende materialer er blitt foreslått som substitutter for mer tradisjonelle proteinkilder slik som fiskemel, soyaprodukter og blodplasma, i menneskefor og som dyrefor. Disse materialene inkluderer encellede mikroorganismer slik som sopp, gjær og bakterier som inneholder høye andeler av proteiner. Disse kan dyrkes ved reproduksjon og produsere biomasse gjennom veksten av mikroorganismene på hydrokarbon eller andre substrater. I dag er de mest anvendte proteininneholdende mikroorganismene (også henvist til heri som "enkeltcelle proteiner") de som er utledet fra sopp eller gjær. Enkeltcelleproteinmateriale kan anvendes direkte i mat, for eksempel som et forstøvningstørket produkt eller biomassen kan ytterligere bearbeides, for eksempel ved hjelp av hydrolyse og/eller separasjon før anvendelse. Title: Method for the production of biomass, and fermentation reactor This invention relates to improvements in and in relation to methods for the fermentation of microorganisms, for example the formation of biomass or the production of materials produced with the help of microorganisms, and fermenter apparatus for the execution thereof, in particular methods for grow microorganisms in a loop reactor using a gaseous nutrient. Recently, much attention has been directed towards the development of new protein sources that can be incorporated into food for human and/or animal consumption. A number of different protein-containing materials have been proposed as substitutes for more traditional protein sources such as fish meal, soy products and blood plasma, in human feed and as animal feed. These materials include unicellular microorganisms such as fungi, yeasts and bacteria that contain high proportions of proteins. These can be cultivated by reproduction and produce biomass through the growth of the microorganisms on hydrocarbon or other substrates. Today, the most widely used protein-containing microorganisms (also referred to herein as "single-cell proteins") are those derived from fungi or yeast. Single cell protein material can be used directly in food, for example as a spray-dried product or the biomass can be further processed, for example by means of hydrolysis and/or separation before use.

Ved siden av kun å anvendes som kilde for biomasse, kan mikroorganismer dyrkes og høstes og tjene som kilder for anvendelige kjemikalier, for eksempel medikamentforbindelser, proteiner, karotenoider osv. For eksempel beskriver Du Pont i WO 02/18617, WO 02/20815, WO 02/20728 og WO 02/20733 anvendelsen av metanotrofe bakterier og spesielt Methylomonas 16a (ATCC PTA 2402) for fremstillingen av karotenoider. Besides being used only as a source of biomass, microorganisms can be cultivated and harvested and serve as sources of useful chemicals, for example drug compounds, proteins, carotenoids, etc. For example, Du Pont describes in WO 02/18617, WO 02/20815, WO 02/20728 and WO 02/20733 the use of methanotrophic bacteria and in particular Methylomonas 16a (ATCC PTA 2402) for the production of carotenoids.

I DK-B-170824 og EP 0418187 (Dansk Bioprotein A/S) og WO 01/60974 (Norferm DA) beskrives en løkkereaktor for anvendelse i dyrking av mikroorganismer for å danne biomasse, for eksempel for dyrking av metanotrofe bakterier for å danne et materiale som for eksempel kan anvendes i eller som en forløper til mat for mennesker eller dyr. DK-B-170824 and EP 0418187 (Dansk Bioprotein A/S) and WO 01/60974 (Norferm DA) describe a loop reactor for use in the cultivation of microorganisms to form biomass, for example for the cultivation of methanotrophic bacteria to form a material that can, for example, be used in or as a precursor to food for humans or animals.

WO 00/70014 (UniBioTech A/S) gjør kjent en biomasseproduksjonsprosess ved dyrking av en mikroorganisme i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra WO 00/70014 (UniBioTech A/S) discloses a biomass production process by cultivating a microorganism in an aqueous liquid culture medium that circulates in a loop reactor with a waste gas removal zone from which

karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren. waste gas containing carbon dioxide is removed from the reactor.

Løkkereaktoren som beskrives i DK-B-170824 har en toppenhet bundet til en kanal med, i rekkefølge, en nedstrømsseksjon, en i alt vesentlig horisontal strømseksjon, en oppstrømsseksjon og en ikke-vertikal utstrømsseksjon. Toppenheten er sylindrisk og dens akse er vertikal og med nedstrømsseksjonen til kanalen bundet til sitt fundament. Utstrømsdelen til kanalen strekker seg tangentielt fra en side av toppenheten. På denne måten kan avløpsgass og flytende kulturmedium som strømmer inn i toppenheten fra utstrømsseksjonen separeres effektivt, og hvor gassen trekkes tilbake fra hoderommet til toppenheten og væsken returneres til nedstrømsdelen av kanalen. Det vandige flytende kulturmediet drives rundt reaksjonsløkken, med gassholdige og ikke-gassholdige næringsstoffer (for eksempel oksygen-, metan-, nitrogenkilder og mineraler) som introduseres i kanalen og blandes med det flytende kulturmediet deri, og hvor biomasseinneholdende kulturmedium trekkes ut fra kanalen og hvor avløpsgass (for eksempel karbondioksidinneholdende gass) trekkes ut fra toppenheten. Næringstilførsel og avløpsgassuttrekking skjer generelt kontinuerlig mens biomasseuttrekking skjer kontinuerlig eller satsvis. The loop reactor described in DK-B-170824 has a top assembly connected to a channel with, in order, a downstream section, a substantially horizontal flow section, an upstream section and a non-vertical outflow section. The top assembly is cylindrical and its axis is vertical and with the downstream section of the channel tied to its foundation. The outflow portion of the channel extends tangentially from one side of the top unit. In this way, effluent gas and liquid culture medium flowing into the top unit from the outflow section can be effectively separated, and where the gas is withdrawn from the head space of the top unit and the liquid is returned to the downstream part of the channel. The aqueous liquid culture medium is driven around the reaction loop, with gaseous and non-gaseous nutrients (for example, oxygen, methane, nitrogen sources and minerals) introduced into the channel and mixed with the liquid culture medium therein, and where biomass-containing culture medium is withdrawn from the channel and where waste gas (e.g. gas containing carbon dioxide) is extracted from the top unit. Nutrient supply and waste gas extraction generally take place continuously, while biomass extraction takes place continuously or in batches.

I løkkereaktoren som beskrives i DK-B-170824 er sirkuleringshastigheten til reaksjonsmediet generelt omtrent 30 til 90 sekunder pr sirkulering. Ettersom ubenyttet oksygen og metan i avløpsgassen ville gjøre denne potensielt eksplosiv og uøkonomisk, siden oksygen og metan ville være bortkastet, kunne ikke gassholdig næringstilførsel skje ved alle punktene langs kanalen. På samme måte, for å sikre avløpsseparering av karbondioksid fra det flytende reaksjonsmediet for avluftning fra toppenheten, kunne heller ikke gass/væskeblanding utføres ved alle punktene langs kanalen. I løkkereaktoren i DK-B-170824 foregår i praksis gassholdig næringstilførsel ved at det oppløste oksygeninnholdet i kulturmediet faller til omtrent null ved det tidspunktet kulturmediet når toppen av utstrømsseksjonen til kanalen. In the loop reactor described in DK-B-170824, the circulation rate of the reaction medium is generally about 30 to 90 seconds per circulation. As unused oxygen and methane in the waste gas would make it potentially explosive and uneconomical, since oxygen and methane would be wasted, gaseous nutrient supply could not take place at all points along the canal. Likewise, to ensure effluent separation of carbon dioxide from the liquid reaction medium for deaeration from the top unit, gas/liquid mixing could not be performed at all points along the channel either. In the loop reactor in DK-B-170824, gaseous nutrient supply takes place in practice by the dissolved oxygen content in the culture medium falling to approximately zero at the time the culture medium reaches the top of the outflow section of the channel.

Mens løkkereaktoren beskrevet i DK-B-170824 imidlertid med hell kan anvendes for biomasseproduksjon når den anvender høybiomassekonsentrasjoner (for eksempel over 5 g/l), er produksjonsprosessen utsatt for tilfeldige plutselige feil og dette krever at prosessen startes på nytt med ferske levende bakterier. However, while the loop reactor described in DK-B-170824 can be successfully used for biomass production when it uses high biomass concentrations (for example above 5 g/l), the production process is subject to random sudden failures and this requires that the process be restarted with fresh live bacteria.

Vi har nå funnet at dette problemet kan reduseres eller unngås dersom næringsgassen (for eksempel metan og/eller oksygen, spesielt oksygen) tilføres i kanalen for slik å redusere den tiden kulturmediet i alt vesentlig er fritt for et vesentlig næringsstoff og/eller for slik å unngå eller minimalisere perioder med urimelig høye konsentrasjoner av næringsgasser i kulturmediet. We have now found that this problem can be reduced or avoided if the nutrient gas (for example methane and/or oxygen, especially oxygen) is fed into the channel in order to reduce the time that the culture medium is essentially free of an essential nutrient and/or so that avoid or minimize periods of unreasonably high concentrations of nutrient gases in the culture medium.

I ett aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes følgelig en fremgangsmåte for fremstillingen av biomasse ved å dyrke en mikroorganisme, fortrinnsvis en metanotrof bakterie, i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren, hvori fremgangsmåten er kjennetegnet ved at løkkereaktoren har oppstrøms for avløpsgassfjerningssonen en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksid i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase, og videre har oppstrøms for nevnte avgassingssone er en næringsgassintroduksjonssone hvori oksygen og fortrinnsvis også metan introduseres inn i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, hvori oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone utføres på flere steder langs strømningsveien gjennom nevnte løkkereaktor ved en hastighet slik at det gjennomsnittlige oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium, målt ved anvendelse av en polarografisk oksygenelektrode (for eksempel i blandingsfrie seksjoner av reaktoren) ikke overskrider 25 ppm, mer foretrukket 20 ppm, spesielt 15 ppm, mer spesielt 10 ppm og fortrinnsvis også slik at det oppløste oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet ved hver nevnte lokalitet (med det valgfrie unntaket for den første nevnte lokalitet nedstrøms for nevnte avgassingssone) er ved i det minste 0,5 ppm, spesielt ved i det minste 1 ppm, nærmere bestemt ved i det minste 3 ppm. Accordingly, in one aspect of the invention, a method is provided for the production of biomass by growing a microorganism, preferably a methanotrophic bacterium, in an aqueous liquid culture medium that circulates in a loop reactor with a waste gas removal zone from which waste gas containing carbon dioxide is removed from the reactor, wherein the method is characterized by the loop reactor has upstream of the waste gas removal zone a degassing zone in which a propellant gas is introduced to drive carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase, and further upstream of said degassing zone is a nutrient gas introduction zone in which oxygen and preferably also methane are introduced into the reactor and mixed with the liquid the culture medium therein, wherein oxygen introduction into said nutrient gas introduction zone is carried out at several locations along the flow path through said loop reactor at a rate such that the average dissolved oxygen content of said liquid culture medium, measured using a polarographic oxygen electrode (for example in unmixed sections of the reactor) does not exceed 25 ppm, more preferably 20 ppm, especially 15 ppm, more especially 10 ppm and preferably also such that the dissolved oxygen content of the liquid culture medium at each said location (with the optional exception of the first mentioned location downstream of said degassing zone) is at least 0.5 ppm, particularly at least 1 ppm, more specifically at at least 3 ppm.

I dette aspektet ved oppfinnelsen er oksygenintroduksjonsposisjonene fortrinnsvis slik plassert at strømningstiden mellom posisjonene er mindre enn 20 sekunder, fortrinnsvis mindre enn 16 sekunder, nærmere bestemt mindre enn 6 sekunder, mer foretrukket mindre enn 5 sekunder, enda mer foretrukket mindre enn 4 sekunder, bortsett fra mellom den første og den siste posisjonen (det vil si de som er plassert umiddelbart oppstrøms og nedstrøms for avgassingssonen). In this aspect of the invention, the oxygen introduction positions are preferably positioned such that the flow time between the positions is less than 20 seconds, preferably less than 16 seconds, more specifically less than 6 seconds, more preferably less than 5 seconds, even more preferably less than 4 seconds, except between the first and the last position (that is, those located immediately upstream and downstream of the degassing zone).

Med gjennomsnittlig oppløst oksygeninnhold menes gjennomsnittet langs en diameter av tverrsnittsplanet til reaktoren. Når reaktoren ikke er sirkulær i tverrsnitt, skal uttrykket diameter forstås å bety maksimal dimensjon mellom veggenes innside. Et slikt gjennomsnitt kan tas ved å måle oppløst oksygeninnhold ved flere, for eksempel 3, 5 eller 7 punkter med lik avstand langs diameteren. By average dissolved oxygen content is meant the average along a diameter of the cross-sectional plane of the reactor. When the reactor is not circular in cross-section, the term diameter shall be understood to mean the maximum dimension between the inside of the walls. Such an average can be taken by measuring dissolved oxygen content at several, for example 3, 5 or 7 points equally spaced along the diameter.

Det oppløste oksygeninnholdet bør fortrinnsvis måles ved blanderfrie seksjoner i løkkereaktoren, det vil si plasseres inne i reaktoren hvor tverrsnittet gjennom reaktoren ikke passerer gjennom en blandingsanordning. Fortrinnsvis måles det oppløste oksygeninnholdet ved blandingsfrie deler nedstrøms for oksygenintroduksjonssonene og de følgende blanderne. The dissolved oxygen content should preferably be measured at mixer-free sections in the loop reactor, i.e. placed inside the reactor where the cross-section through the reactor does not pass through a mixing device. Preferably, the dissolved oxygen content is measured at unmixed parts downstream of the oxygen introduction zones and the following mixers.

Det oppløste oksygeninnholdet i kulturmediet måles følgelig passende ved anvendelse av en polarografisk oksygenelektrode (kommersielt tilgjengelig for eksempel fra Ingold) ved posisjoner mellom oksygenintroduksjonsstedene tilstrekkelig langt nedstrøms for det foregående stedet slik at blandingen av oksygen og kulturmedium i alt vesentlig er fullstendig. The dissolved oxygen content of the culture medium is accordingly appropriately measured using a polarographic oxygen electrode (commercially available for example from Ingold) at positions between the oxygen introduction sites sufficiently far downstream of the preceding site so that the mixing of oxygen and culture medium is essentially complete.

For at oksygenkonsentrasjonsekstremene skal kunne unngås ved oksygenintroduksjon, utføres introduksjon fortrinnsvis gjennom flere apparater ved hvert introduksjonssted, for eksempel en oppstilling av apparater plassert fra hverandre i det tversgående planet til strømningsretningen og eventuelt også langs strømningsretningen. Dette kan oppnås ved å spre flerarmede perforerte gassfordelere, fortrinnsvis med trykkfallet fra innsiden til utsiden av, fordeleren er opp til 6 bar, for eksempel 0,4 til 3 bar, spesielt 0,6 til 1 bar i reaktoren. Slike fordelere plasseres passende i mellomrommene mellom tilstøtende statiske blandings oppstillinger i reaktoren. I en foretrukket utførelsesform settes også gassfordelere innenfor de statiske blanderoppstillingene, for eksempel ved å plassere perforerte rør langs blandingskanaler eller ved å anvende perforerte bølgede paneler som fungerer både som gassfordelere og som plater inne i blanderoppstillingen. Hule panelblanderplater hvori kjølemiddel (for eksempel kaldt vann) strømmer gjennom, kan også anvendes for å avkjøle kulturmediet i reaktoren. In order for oxygen concentration extremes to be avoided during oxygen introduction, introduction is preferably carried out through several devices at each introduction point, for example an array of devices placed apart in the transverse plane to the direction of flow and possibly also along the direction of flow. This can be achieved by spreading multi-arm perforated gas distributors, preferably with the pressure drop from the inside to the outside of the distributor being up to 6 bar, for example 0.4 to 3 bar, especially 0.6 to 1 bar in the reactor. Such distributors are suitably placed in the spaces between adjacent static mixing arrangements in the reactor. In a preferred embodiment, gas distributors are also placed within the static mixer arrays, for example by placing perforated pipes along mixing channels or by using perforated corrugated panels that function both as gas distributors and as plates inside the mixer array. Hollow panel mixer plates, in which coolant (for example cold water) flows through, can also be used to cool the culture medium in the reactor.

Det oppløste oksygeninnholdet måles fortrinnsvis oppstrøms for hvert oksygenintroduksjonssted hvor måleverdiene registreres i en datamaskin som er satt opp for å kontrollere næringsintroduksjonshastigheter, avkjøling, biomasseuttrekk osv. På denne måten kan det oppløste oksygeninnholdet opprettholdes innenfor det ønskede området gjennom reaktoren og i lengre operasjonsperioder. The dissolved oxygen content is preferably measured upstream of each oxygen introduction point, where the measurement values are recorded in a computer set up to control nutrient introduction rates, cooling, biomass extraction, etc. In this way, the dissolved oxygen content can be maintained within the desired range throughout the reactor and for longer periods of operation.

Oksygeninnholdet i kulturmediet av avløpsgassfjerningssonen, eller ved det laveste oppløste oksygenkonsentrasjonspunktet i løkken er om ønskelig mindre enn 0,1 ppm regnet på vekt. Dette gir biomasseproduktet med større biotilgjengelighet som forstoff. The oxygen content in the culture medium of the waste gas removal zone, or at the lowest dissolved oxygen concentration point in the loop, is if desired less than 0.1 ppm calculated by weight. This gives the biomass product greater bioavailability as precursor.

Mens det oppløste oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet kan falle til neglisjerbare eller ikke påvisbare nivåer, det vil si omtrent 0 ppm regnet på vekt, er det foretrukket at det bør forbli ved påvisbare nivåer over i det minste en signifikant del av strømningsdelve i lengden gjennom reaktoren. Følgelig tilveiebringer enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstillingen av biomasse ved å dyrke en mikroorganisme, fortrinnsvis en metanotrof bakterie, i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningsfase hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren og oppstrøms derav en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksidet i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase og hvor det oppstrøms for nevnte avgassingssone er en næringsgassintroduksjonssone hvori oksygen og fortrinnsvis også metan introduseres inn i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, kjennetegnet ved at oksygenintroduksjonen i nevnte næringsgassintroduksjonssone er slik at slik at oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet ikke faller under 3 ppm regnet på vekt (fortrinnsvis i det minste 4 ppm, spesielt i det minste 5 ppm) mellom nevnte While the dissolved oxygen content of the liquid culture medium may drop to negligible or undetectable levels, i.e. approximately 0 ppm by weight, it is preferred that it should remain at detectable levels over at least a significant portion of the flow fraction of the length through the reactor . Accordingly, certain embodiments of the invention provide a method for the production of biomass by growing a microorganism, preferably a methanotrophic bacterium, in an aqueous liquid culture medium circulating in a loop reactor with an off-gas removal phase from which carbon dioxide-containing off-gas is removed from the reactor and upstream of it a degassing zone in which a propellant gas is introduced to drive the carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase and where upstream of said degassing zone there is a nutrient gas introduction zone in which oxygen and preferably also methane are introduced into the reactor and mixed with the liquid culture medium therein, characterized in that the introduction of oxygen in said nutrient gas introduction zone is so that the oxygen content in the liquid culture medium does not fall below 3 ppm by weight (preferably at least 4 ppm, especially at least 5 ppm) between said

næringsgassintroduksjonssone og nevnte avgassingssone. nutrient gas introduction zone and said degassing zone.

Enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av biomasse ved å dyrke en mikroorganisme, fortrinnsvis en metanotrof bakterie, i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren og oppstrøms for denne en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksid i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase og hvor det oppstrøms for nevnte avgassingssone er en næringsgassintroduksjonssone hvori oksygen og fortrinnsvis også metan introduseres inn i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, kjennetegnet ved at oksygenintroduksjonen i nevnte flytende kulturmedium utføres slik at det oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium ikke faller under 3 ppm regnet på vekt (fortrinnsvis i det minste 4, spesielt i det minste 5 ppm) i løpet av strømningslengden til løkkereaktoren som tilsvarer mer enn 30 sekunder, fortrinnsvis 20 sekunder, mer foretrukket 10 sekunder, spesielt 5 sekunder. Certain embodiments of the invention provide a method for the production of biomass by growing a microorganism, preferably a methanotrophic bacterium, in an aqueous liquid culture medium that circulates in a loop reactor with a waste gas removal zone from which waste gas containing carbon dioxide is removed from the reactor and upstream of this a degassing zone in which a propellant gas is introduced to drive carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase and where upstream of said degassing zone there is a nutrient gas introduction zone in which oxygen and preferably also methane are introduced into the reactor and mixed with the liquid culture medium therein, characterized in that the introduction of oxygen into said liquid culture medium is carried out so that the dissolved oxygen content in said liquid culture medium does not fall below 3 ppm by weight (preferably at least 4, especially at least 5 ppm) during the flow length of the loop reactor which corresponds to m is than 30 seconds, preferably 20 seconds, more preferably 10 seconds, especially 5 seconds.

Enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstillingen av biomasse ved å dyrke en mikroorganisme, fortrinnsvis en metanotrof bakterie, i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren, og oppstrøms for denne, med en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksid i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase og hvor det oppstrøms for nevnte avgassingssone er en næringsgassintroduksjonssone hvori oksygen og fortrinnsvis også metan introduseres inn i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, kjennetegnet ved at oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone er slik at det oppløste oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet ikke faller under X ppm regnet på vekt, hvori X er definert gjennom Certain embodiments of the invention provide a method for the production of biomass by cultivating a microorganism, preferably a methanotrophic bacterium, in an aqueous liquid culture medium circulating in a loop reactor with a waste gas removal zone from which carbon dioxide-containing waste gas is removed from the reactor, and upstream of this, with a degassing zone in which a driving gas is introduced to drive carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase and where upstream of said degassing zone there is a nutrient gas introduction zone in which oxygen and preferably also methane are introduced into the reactor and mixed with the liquid culture medium therein, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is such that the dissolved oxygen content in the liquid culture medium does not fall below X ppm calculated by weight, where X is defined through

hvori B er biomasseinnholdet til kulturmediet i g/l og Y er fra 0,75 til 1,25, fortrinnsvis 0,80 til 1,20, spesielt 0,85 til 1,15, mer foretrukket 0,90 til 1,10, mer foretrukket 0,95 til 1,05 og B er større enn 5, spesielt større enn 10, spesielt 15 til 30, spesielt dl 8 til 25 mellom nevnte næringsgassintroduksjonssone og nevnte avgassingssone. in which B is the biomass content of the culture medium in g/l and Y is from 0.75 to 1.25, preferably 0.80 to 1.20, especially 0.85 to 1.15, more preferably 0.90 to 1.10, more preferably 0.95 to 1.05 and B is greater than 5, especially greater than 10, especially 15 to 30, especially dl 8 to 25 between said nutrient gas introduction zone and said degassing zone.

Enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av biomasse ved å dyrke en mikroorganisme, fortrinnsvis en metanotrof bakterie, i et flytende vandig kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren og oppstrøms derav, en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksid i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase og som har oppstrøms for nevnte avgassone en næringsgassintroduksjonssone hvor oksygen og fortrinnsvis også metan introduseres inn i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, kjennetegnet ved at oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone er slik at det oppløste oksygeninnholdet til det flytende kulturmediet er i det minste 30% (fortrinnsvis i det minste 50%, mer foretrukket i det minste 60%) av strømningslengdeveien til løkke reaktoren er i det minste 10 ppm regnet på vekt, det oppløste oksygeninnholdet til det flytende kulturmediet umiddelbart forut for introduksjon av nevnte drivgass i nevnte avgassingssone er i det minste 3 ppm regnet på vekt (fortrinnsvis i det minste 4 ppm, spesielt i det minste 5 ppm), og oksygeninnholdet i nevnte avløpsgass er i det minste 1 mol% (fortrinnsvis i det minste 2 mol%, for eksempel 2 til 8 mol%). Certain embodiments of the invention provide a method for the production of biomass by cultivating a microorganism, preferably a methanotrophic bacterium, in a liquid aqueous culture medium circulating in a loop reactor with a waste gas removal zone from which carbon dioxide-containing waste gas is removed from the reactor and, upstream thereof, a degassing zone in which a propellant gas is introduced to drive carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase and which has, upstream of said exhaust gas zone, a nutrient gas introduction zone where oxygen and preferably also methane are introduced into the reactor and mixed with the liquid culture medium therein, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is as follows that the dissolved oxygen content of the liquid culture medium is at least 30% (preferably at least 50%, more preferably at least 60%) of the flow length path to the loop reactor is at least 10 ppm calculated by weight, it o The dissolved oxygen content of the liquid culture medium immediately prior to the introduction of said driving gas into said degassing zone is at least 3 ppm by weight (preferably at least 4 ppm, especially at least 5 ppm), and the oxygen content of said waste gas is at least 1 mol% (preferably at least 2 mol%, for example 2 to 8 mol%).

Disse fremgangsmåtene som er beskrevet heri som tilveiebrakt i enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen, kombineres fortrinnsvis med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som først definert. These methods, which are described herein as provided in certain embodiments of the invention, are preferably combined with the method according to the invention as first defined.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det foretrukket å drive det flytende kulturmediet rundt løkkereaktoren ved anvendelse av en propell. Det er spesielt foretrukket å anvende en propell med overlappende eller flere radielt kurvede blader, det vil si en lavkavitasjonspropell. Slike lavkavitasjonspropeller er velkjente i fagområdet design av undervannsbåter. Med overlappende blader menes at det eksisterer minst én linje som er parallell til propellaksen og som passerer gjennom i det minste to blader. Med et radielt kurvet blad menes at det er en vinkel mellom radiallinjene som passerer gjennom grunnelementet og bladtuppen. In the method according to the invention, it is preferred to drive the liquid culture medium around the loop reactor using a propeller. It is particularly preferred to use a propeller with overlapping or several radially curved blades, i.e. a low-cavitation propeller. Such low-cavitation propellers are well known in the field of submarine design. By overlapping blades is meant that there exists at least one line that is parallel to the propeller axis and that passes through at least two blades. A radially curved blade means that there is an angle between the radial lines that pass through the base element and the blade tip.

Ved anvendelse av slike lavkavitasjonspropeller er det mulig å pumpe væske med et større gassinnhold enn ved konvensjonelle propeller, og følgelig er det mulig å introdusere næringsgasser inn i det flytende kulturmediet nærmere oppstrøms for propellen enn hva ellers er mulig. På denne måten kan proporsjonen på reaktorløpslengden som har lavt oppløst gassinnhold reduseres. When using such low-cavitation propellers, it is possible to pump liquid with a greater gas content than with conventional propellers, and consequently it is possible to introduce nutrient gases into the liquid culture medium closer upstream of the propeller than is otherwise possible. In this way, the proportion of the reactor run length that has a low dissolved gas content can be reduced.

Blandingen av næringsgassene inn i det flytende kulturmediet er et viktig aspekt ved utøvelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Vi har funnet at anvendelsen av statiske blandere, som hver omfatter en oppstilling av blanderplater posisjonert nedstrøms for næringsgassinjeksjonspunktene, resulterer i en spesielt effektiv oppløsning av næringsgassene selv om gass:væskevolumforholdet er relativt liten. Følgelig, i foretrukne utførelsesformer blandes næringsgassen og det flytende kulturmedium i nevnte løkkereaktor ved passering gjennom en statisk blander som omfatter en stabel av parallelle, bølgede, fleksible (og fortrinnsvis perforerte) plater arrangert slik at stabelretningen er vinkelrett på retningen av gjennomstrømningen av nevnte flytende medium og med bølgeformede riller derav vinklet til nevnte gjennomstrømningsretning (for eksempel ved en vinkel på 20 til 70°, fortrinnsvis 40 til 50°, spesielt 45°, relativ til gjennomstrømningsretningen) og hvor deres vinkel til retningen av gjennomstrømningen i alt vesentlig er lik og motsatt av tilstøtende plater. The mixing of the nutrient gases into the liquid culture medium is an important aspect of the practice of the method according to the invention. We have found that the use of static mixers, each comprising an array of mixing plates positioned downstream of the nutrient gas injection points, results in particularly effective dissolution of the nutrient gases even though the gas:liquid volume ratio is relatively small. Accordingly, in preferred embodiments, the nutrient gas and the liquid culture medium are mixed in said loop reactor by passing through a static mixer comprising a stack of parallel, corrugated, flexible (and preferably perforated) plates arranged so that the stacking direction is perpendicular to the direction of flow of said liquid medium and with wavy grooves thereof angled to said direction of flow (for example at an angle of 20 to 70°, preferably 40 to 50°, especially 45°, relative to the direction of flow) and where their angle to the direction of flow is substantially equal and opposite of adjacent plates.

Stabelretningen, det vil si normalen til overflaten av en plan plate plassert over en av hovedoverflatene til en blanderplate, kan være hvor som helst mellom vertikal og horisontal. Imidlertid er det foretrukket at stabelretningen mellom påfølgende stabler fortrinnsvis roteres gjennom 90°, fortrinnsvis 80 til 90°, mer foretrukket omtrent 90°, 0°, 90°, 0° osv eller +45°, -45°, -45° i forhold til vertikalen. Spesielt foretrukket er ikke stabelretningen for påfølgende stabler 0°, 0°, 0° osv i forhold til vertikalen. The stack direction, that is, the normal to the surface of a flat plate placed over one of the main surfaces of a mixer plate, can be anywhere between vertical and horizontal. However, it is preferred that the stack direction between successive stacks is preferably rotated through 90°, preferably 80 to 90°, more preferably approximately 90°, 0°, 90°, 0° etc. or +45°, -45°, -45° in relation to the vertical. Particularly preferred is that the stacking direction for successive stacks is not 0°, 0°, 0° etc. in relation to the vertical.

I de fleste utførelsesformer av oppfinnelsen, er løkkereaktoren fortrinnsvis en som har en senterlinje, det vil si gjennomstrømnings veilengde på i det minste 40 m, mer foretrukket i det minste 80 m. In most embodiments of the invention, the loop reactor is preferably one having a centerline, ie flow path length of at least 40 m, more preferably at least 80 m.

Fortrinnsvis dyrkes en mikroorganisme i et flytende reaksjonsmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med et avløpsgass-væskereaksjonsmedium-separeringssone oppstrøms for en avløpsgassfjerningssone, og oksygen og/eller metan fores inn i det flytende reaksjonsmediet i nevnte separeringssone. Preferably, a microorganism is grown in a liquid reaction medium circulating in a loop reactor with a waste gas-liquid reaction medium separation zone upstream of a waste gas removal zone, and oxygen and/or methane are fed into the liquid reaction medium in said separation zone.

Løkkereaktoren anvendt i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis en som er avhengig av fremdrift heller enn gassheving for å bevege det flytende kulturmediet rundt løkken. Siden det er enklere å opprettholde næringsgass og flytende kulturmedium godt blandet i en i alt vesentlig horisontal del av løkken, og siden masseoverføring (det vil si overføring av næringsgass inn i den flytende fasen) øker med økt trykk i kulturmediet, omfatter løkken fortrinnsvis en i alt vesentlig vertikal nedstrømningssone fra avløpsgassfjerningssonen etterfulgt av en i alt vesentlig horisontal (det vil si "U"-formet) sone i sving etterfulgt av en i alt vesentlig vertikal oppstrømningssone som leder tilbake til avløpsgassfjernings-sonen. For at avgassingen og avløpsgass/flytende kulturmedium skal være spesielt effektivt mellom den i alt vesentlige vertikale oppstrømningssonen og avløpsgass-fjerningssonen, er det ønskelig å ha en i alt vesentlig ikke-vertikal, for eksempel horisontal utstrømningssone mellom de to. Dette, hvori mesteparten eller all avløpsgass/fly tende kulturmediumseparering skjer, kan ha en enhetlig gradient, kan gradvis bli mer horisontal eller kan endres trinnvis mot horisontalt. Drivgassen, det vil si gassen som anvendes for å fortrenge karbondioksid fra den oppløste fasen (vanligvis nitrogen men valgfritt andre inerte ikke brennbare gasser) kan for eksempel introduseres ved ett eller flere punkter fra begynnelsen av den i alt vesentlig vertikale oppstrømningssonen for å gå inn i avløpsgassfjerningssonen, imidlertid introduseres den spesielt foretrukket ved ett eller flere punkter mellom den øvre delen (for eksempel de øvre 20%, mer foretrukket øvre 10%) av den vertikale delen av oppgjennomstrømningssonen og begynnelsen av den flateste (det vil si mest horisontale) delen av utstrømningssonen. Spesielt foretrukket introduseres drivgassen i den øvre delen av den vertikale delen av oppstrømningssonen. I denne betydningen skal det forstås at "punkt" hvorved en gass kan introduseres kan ha en forlenget lengde innen den flytende strømningsveien inne i løkken, for eksempel hvor gass introduseres gjennom en serie av innløpsporter eller gjennom flere perforerte innløpsporter. The loop reactor used in the method of the present invention is preferably one that relies on propulsion rather than gas lift to move the liquid culture medium around the loop. Since it is easier to maintain nutrient gas and liquid culture medium well mixed in an essentially horizontal part of the loop, and since mass transfer (that is, transfer of nutrient gas into the liquid phase) increases with increased pressure in the culture medium, the loop preferably comprises a substantially vertical downflow zone from the waste gas removal zone followed by a substantially horizontal (ie "U" shaped) zone in turn followed by a substantially vertical upflow zone leading back to the waste gas removal zone. In order for the degassing and waste gas/liquid culture medium to be particularly effective between the essentially vertical upflow zone and the waste gas removal zone, it is desirable to have an essentially non-vertical, for example horizontal outflow zone between the two. This, in which most or all of the waste gas/liquid culture medium separation occurs, may have a uniform gradient, may gradually become more horizontal, or may change stepwise toward horizontal. The propellant gas, i.e. the gas used to displace carbon dioxide from the dissolved phase (usually nitrogen but optionally other inert non-combustible gases) may for example be introduced at one or more points from the beginning of the essentially vertical upwelling zone to enter the offgas removal zone, however, it is particularly preferably introduced at one or more points between the upper part (eg the upper 20%, more preferably the upper 10%) of the vertical part of the upflow zone and the beginning of the flattest (that is, most horizontal) part of the outflow zone. The propellant gas is particularly preferably introduced in the upper part of the vertical part of the upwelling zone. In this sense, it is to be understood that the "point" at which a gas can be introduced may have an extended length within the liquid flow path within the loop, for example where gas is introduced through a series of inlet ports or through multiple perforated inlet ports.

Generelt vil dette være gjennom løkkesvingen heller enn gjennom en skarp vinkel bøyd for slik å forbedre gjennomstrømningsegenskapene til det flytende kulturmediet når senterlinjen til løkken, på utsiden av gassavløpsfjerningssonen, endrer retning. Generally this will be through the loop bend rather than through a sharp angle bent so as to improve the flow characteristics of the liquid culture medium when the center line of the loop, on the outside of the gas effluent removal zone, changes direction.

Gasstrykket i hoderommet i gassavløpsfjerningssonen vil fortrinnsvis være fra -0,5 til +1,0 atmosfære relativ til omgivelsestrykket, spesielt +0,2 til +0,6. Det vertikale fallet mellom gass-væskeoverflaten og enden av utstrømningssonen og senterlinjen til løkken i den horisontale sonen er fortrinnsvis i det minste 10 m, spesielt i det minste 18 m, for eksempel 18 til 30 m. The gas pressure in the head space in the gas waste removal zone will preferably be from -0.5 to +1.0 atmosphere relative to the ambient pressure, especially +0.2 to +0.6. The vertical drop between the gas-liquid surface and the end of the outflow zone and the centerline of the loop in the horizontal zone is preferably at least 10 m, especially at least 18 m, for example 18 to 30 m.

Tverrsnittsområdet til løkkereaktoren (på utsiden av gassavløpsfjerningssonen) kan være konstant, men økes fortrinnsvis ved i det minste utløpssonen, for eksempel til en maksimal verdi på i det minste 2,0 ganger, mer foretrukket i det minste 4,0 ganger som i den minimale tverrsnittsområdedelen til nedstrømssonen og den horisontale strømnings sonen (som typisk er før propellen). Vanligvis er den indre diameteren til løkken, på utsiden av gassavløpsfjerningssonen i området 30 cm til 3,0 m, spesielt 1,0 til 2,5 m. Senterlinjen til løkken, bortsett fra gassavløpsfjerningssonen, har en lengde i området fra 40 til 200 m, fortrinnsvis 80 til 150 m, fortrinnsvis er i det minste 50%, mer foretrukket i det minste 60%, spesielt i det minste 70% av denne i den horisontale sonen. Utstrømningssonen har fortrinnsvis en senterlinjelengde på 0,5 til 10 m, spesielt 1,5 til 8 m. The cross-sectional area of the loop reactor (on the outside of the gas effluent removal zone) may be constant, but is preferably increased at least at the effluent zone, for example to a maximum value of at least 2.0 times, more preferably at least 4.0 times as in the minimum the cross-sectional area portion of the downstream zone and the horizontal flow zone (which is typically before the propeller). Generally, the inner diameter of the loop, on the outside of the gas drain removal zone is in the range of 30 cm to 3.0 m, especially 1.0 to 2.5 m. The center line of the loop, apart from the gas drain removal zone, has a length in the range of 40 to 200 m , preferably 80 to 150 m, is preferably at least 50%, more preferably at least 60%, especially at least 70% of this in the horizontal zone. The outflow zone preferably has a centerline length of 0.5 to 10 m, especially 1.5 to 8 m.

Løkkereaktoren vil vanligvis være sirkelformet i tverrsnittet på utsiden av gassfjerningssonen; i separeringssonen kan imidlertid andre konfigurasjoner, for eksempel rektangulære, elliptiske eller eggformede tverrsnitt tilpasses for å øke gass-væskeseparering. The loop reactor will usually be circular in cross-section on the outside of the gas removal zone; however, in the separation zone, other configurations, for example rectangular, elliptical or egg-shaped cross-sections, can be adapted to increase gas-liquid separation.

Næringsgassintroduksjon i løkken utføres fortrinnsvis ved i det minste 3, mer foretrukket ved i det minste 6 posisjoner langs løkke lengden hvor fortrinnsvis i det minste 60% introduseres i den horisontale sonen. Mens det er foretrukket at næringsgasser introduseres i nedstrømsdelen, kan dette kreve anvendelsen av en lavkavitasjonspropell for påfølgende fremdrift av det flytende kulturmediet. Slik propellutforming er velkjent på området for konstruksjon av undervannsbåter. Typiske lavkavitasjonspropeller kan ha overlappende blader eller flere (for eksempel i det minste 6) radielt kurvede blader (det vil si blader hvor grunnelementet og tuppen er radielt skjøvet fra hverandre). Til forskjell fra tidligere reaktorutforminger hvor næringsgassinnløp ble konstruert for å gi i alt vesentlig intet oppløst oksygeninnhold i kulturmediet ved begynnelsen av avgassingssonen, er det ønskelig å introdusere næringsgass, spesielt oksygen, i slike mengder at oppløst oksygeninnhold ved begynnelsen av avgassingssonen er i det minste 3 ppm. Ved denne enden introduseres fortrinnsvis noe av næringsgassen, for eksempel opp til omtrent 25% av næringsgassen, i oppstrømssonen. Nutrient gas introduction into the loop is preferably carried out at at least 3, more preferably at least 6 positions along the loop length where preferably at least 60% is introduced in the horizontal zone. While it is preferred that nutrient gases are introduced in the downstream section, this may require the use of a low cavitation propeller for subsequent propulsion of the liquid culture medium. Such a propeller design is well known in the area of submarine construction. Typical low-cavitation propellers may have overlapping blades or multiple (eg at least 6) radially curved blades (that is, blades where the base member and tip are radially offset from each other). In contrast to previous reactor designs where nutrient gas inlets were designed to provide essentially no dissolved oxygen content in the culture medium at the beginning of the degassing zone, it is desirable to introduce nutrient gas, especially oxygen, in such quantities that the dissolved oxygen content at the beginning of the degassing zone is at least 3 ppm. At this end, some of the nutrient gas, for example up to approximately 25% of the nutrient gas, is preferably introduced into the upstream zone.

Ettersom overskudd av næringsgass gir en risiko for toksitetsproblemer for mikroorganismene som dyrkes i reaktoren, introduseres fortrinnsvis oksygen for å oppnå et maksimalt oppløst oksygeninnhold i det flytende kulturmediet på ikke mer enn 25 ppm, spesielt ikke mer enn 20 ppm, mer bestemt ikke mer enn 15 ppm. På samme måte, for å maksimalisere prosesseffektiviteten i forhold til biomasseproduksjon, introduseres fortrinnsvis metan i et 1:1 til 1:3, spesielt 1:1,2 til 1:2,5, nærmere bestemt omtrent 1:1,8, molforhold til oksygen. As excess nutrient gas presents a risk of toxicity problems for the microorganisms grown in the reactor, oxygen is preferably introduced to achieve a maximum dissolved oxygen content in the liquid culture medium of no more than 25 ppm, in particular no more than 20 ppm, more specifically no more than 15 ppm. Likewise, to maximize process efficiency in relation to biomass production, methane is preferably introduced in a 1:1 to 1:3, especially 1:1.2 to 1:2.5, more specifically about 1:1.8, molar ratio to oxygen.

Metan kan anvendes i renset form eller i en gassblanding, for eksempel naturgass eller metanberiket naturgass. På samme måte kan renset oksygen eller oksygen i en gassblanding (for eksempel luft eller oksygenberiket luft) anvendes. Når luft anvendes, er det fortrinnsvis filtrert for å unngå introduksjon av toksiske urenheter. Methane can be used in purified form or in a gas mixture, for example natural gas or methane-enriched natural gas. In the same way, purified oxygen or oxygen in a gas mixture (for example air or oxygen-enriched air) can be used. When air is used, it is preferably filtered to avoid the introduction of toxic impurities.

Anvendt metan og oksygen kan på samme måte være i gassholdig (for eksempel komprimert) eller flytende form; i det sistnevnte tilfellet vil imidlertid forhåndsoppvarming kreves for å forhindre at næringsgassen avkjøler det flytende kulturmediet urimelig. Methane and oxygen used can similarly be in gaseous (eg compressed) or liquid form; however, in the latter case, preheating will be required to prevent the nutrient gas from cooling the liquid culture medium unreasonably.

Naturgass består hovedsakelig av metan, selv om dens sammensetning vil variere fra forskjellige gassfelter. Vanligvis kan naturgass forventes å inneholde omtrent 90% metan, omtrent 5% etan, omtrent 2% propan og noe høyere hydrokarboner. Gjennom fermenteringen av naturgass oksideres metan ved hjelp av metanotrofe bakterier til biomasse og karbondioksid. Metanol, formaldehyd og maursyre er metabolske mellomprodukter. Formaldehyd og i noen grad karbondioksid assimileres til biomasse. Metanotrofe bakterier er imidlertid ikke i stand til å anvende substrater som omfatter karbon-karbonbindinger for vekst og gjenværende komponenter i naturgass, for eksempel etan, propan og i noen grad høyere hydrokarboner, oksideres av metanotrofe bakterier som produserer de korresponderende karboksylsyrene (for eksempel oksideres etan til eddiksyre). Slike produkter kan være inhibitoriske for metanotrofe bakterier og det er derfor viktig at deres konsentrasjoner forblir lave, fortrinnsvis under 50 mg/l, gjennom fremstillingen av biomassen. En løsning på dette problemet er den kombinerte anvendelsen av en eller flere heterotrofe bakterier som er i stand til å utnytte metabolittene fremstilt av de metanotrofe bakteriene. Slike bakterier er også i stand til å utnytte organisk materiale frigjort i fermenteringsblandingen ved hjelp av cellelyse. Dette er viktig for å unngå skumdannelse og også for å minimalisere risikoen for at kulturen kontamineres med uønskede bakterier. En kombinasjon av metanotrofe og heterotrofe bakterier resulterer i en stabil kultur med høy ytelse. Natural gas consists mainly of methane, although its composition will vary from different gas fields. Typically, natural gas can be expected to contain about 90% methane, about 5% ethane, about 2% propane, and somewhat higher hydrocarbons. Through the fermentation of natural gas, methane is oxidized with the help of methanotrophic bacteria into biomass and carbon dioxide. Methanol, formaldehyde and formic acid are metabolic intermediates. Formaldehyde and to some extent carbon dioxide are assimilated into biomass. However, methanotrophic bacteria are unable to use substrates that include carbon-carbon bonds for growth and remaining components of natural gas, for example ethane, propane and to some extent higher hydrocarbons, are oxidized by methanotrophic bacteria that produce the corresponding carboxylic acids (for example, ethane is oxidized to acetic acid). Such products can be inhibitory for methanotrophic bacteria and it is therefore important that their concentrations remain low, preferably below 50 mg/l, throughout the production of the biomass. A solution to this problem is the combined use of one or more heterotrophic bacteria capable of utilizing the metabolites produced by the methanotrophic bacteria. Such bacteria are also able to utilize organic material released in the fermentation mixture by means of cell lysis. This is important to avoid foam formation and also to minimize the risk of the culture being contaminated with unwanted bacteria. A combination of methanotrophic and heterotrophic bacteria results in a stable culture with high performance.

Ved siden av oksygen og metan, kan andre næringsstoffer som for eksempel mineraler og en nitrogenkilde (for eksempel ammoniakk, nitrater, urea osv) vanligvis tilsettes til det flytende kulturmediet. I motsetning til oksygen og metan, påvirker imidlertid avgassingsoperasjonen ikke kritisk deres konsentrasjon og tilsetningen derav kan vanligvis utføres ved ett, to eller tre punkter langs løkken. For visse mineraler, spesielt kobber, kan det imidlertid være ønskelig å utføre introduksjonen av et høyere antall punkter langs løkken. For kobber er dette relevant ettersom økt kobberkonsentrasjon gir økt metanforbruk. Besides oxygen and methane, other nutrients such as minerals and a nitrogen source (eg ammonia, nitrates, urea, etc.) can usually be added to the liquid culture medium. Unlike oxygen and methane, however, the degassing operation does not critically affect their concentration and their addition can usually be carried out at one, two or three points along the loop. However, for certain minerals, especially copper, it may be desirable to carry out the introduction of a higher number of points along the loop. For copper, this is relevant as increased copper concentration results in increased methane consumption.

Luft eller rent oksygen kan anvendes for oksygenering og ammoniakk anvendes fortrinnsvis som nitrogenkilden. I tillegg til disse næringsstoffene vil bakteriekulturen vanligvis kreve vann, fosfat (for eksempel fosforsyre) og flere mineraler som kan inkludere magnesium, kalsium, kalium, jern, kobber, sink, mangan, nikkel, kobolt og molybdenum, vanligvis anvendt som sulfater, klorider eller nitrater. Alle mineralene anvendt i fremstillingen av enkeltcellematerialet bør være av matvarekvalitet. Air or pure oxygen can be used for oxygenation and ammonia is preferably used as the nitrogen source. In addition to these nutrients, the bacterial culture will usually require water, phosphate (for example phosphoric acid) and several minerals which may include magnesium, calcium, potassium, iron, copper, zinc, manganese, nickel, cobalt and molybdenum, usually applied as sulphates, chlorides or nitrates. All the minerals used in the production of the single cell material should be of food grade.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det ønskelig å måle karbondioksid-, oksygen- og metaninnhold i avløpsgassen og biomassen, nitrogen, oppløst oksygen, fosfat og mineralinnhold i kulturmediet. Biomasseinnhold kan måles ved å bruke prøver av biomasseinneholdende medium ekstrahert for ytterligere bearbeiding; for eksempel ved å separere biomasse fra væske ved hjelp av sentrifugering og veiing. Nitrogen-, fosfat- og mineralinnhold kan også måles i dette ekstraherte materialet, for eksempel ved å anvende standardprosedyrer, for eksempel atomabsorpsjon osv. Oppløst oksygeninnhold, igjen målt ved hjelp av standardprosedyrer, overvåkes fortrinnsvis ved to eller flere punkter rundt løkken. Avløpsgass samles fortrinnsvis og avkjøles til omtrent 5°C, hvoretter oksygen fortrinnsvis bestemmes ved å måle gassens paramagnetisme og metan og karbondioksid ved hjelp av infrarød spektrometri. Typiske oksygeninnhold er fortrinnsvis omtrent 7,5% (volum/volum), metaninnhold omtrent 4% (volum/volum) og karbondioksidinnhold omtrent 35% In the method according to the invention, it is desirable to measure carbon dioxide, oxygen and methane content in the waste gas and the biomass, nitrogen, dissolved oxygen, phosphate and mineral content in the culture medium. Biomass content can be measured using samples of biomass-containing medium extracted for further processing; for example by separating biomass from liquid using centrifugation and weighing. Nitrogen, phosphate and mineral content can also be measured in this extracted material, for example using standard procedures, eg atomic absorption etc. Dissolved oxygen content, again measured using standard procedures, is preferably monitored at two or more points around the loop. Waste gas is preferably collected and cooled to about 5°C, after which oxygen is preferably determined by measuring the paramagnetism of the gas and methane and carbon dioxide by infrared spectrometry. Typical oxygen contents are preferably about 7.5% (vol/vol), methane contents about 4% (vol/vol) and carbon dioxide contents about 35%

(volum/volum) når fremgangsmåten kjøres glatt. (volume/volume) when the procedure is run smoothly.

Ammoniakkonsentrasjon er fortrinnsvis opp til 200 ppm regnet på vekt, spesielt 0,1 til 5 ppm regnet på vekt. Ammonia concentration is preferably up to 200 ppm calculated by weight, especially 0.1 to 5 ppm calculated by weight.

Biomassekonsentrasjon er fortrinnsvis opp til 30 g/l, for eksempel 5 til 20 g/l. Biomass concentration is preferably up to 30 g/l, for example 5 to 20 g/l.

Fosfatinnhold i kulturmediet er fortrinnsvis i det minste 10 ppm regnet på vekt for å minimalisere skumdannelse ved reaktortoppen, spesielt omkring 100 til 200 ppm. Phosphate content in the culture medium is preferably at least 10 ppm calculated by weight to minimize foam formation at the reactor top, especially around 100 to 200 ppm.

Kalium-, magnesium- og kalsiuminnhold i kulturmediet er fortrinnsvis i det minste henholdsvis 5, 0,5 og 0,5 ppm regnet på vekt, spesielt omkring henholdsvis 100-200, 20-50 og 20-50 ppm. Kobber- og jerninnhold kan passende måles i den ekstraherte biomassen; fortrinnsvis er deres minimumsinnhold henholdsvis 5 og 200 mg/kg. Potassium, magnesium and calcium content in the culture medium is preferably at least 5, 0.5 and 0.5 ppm respectively calculated by weight, especially around 100-200, 20-50 and 20-50 ppm respectively. Copper and iron content can conveniently be measured in the extracted biomass; preferably their minimum content is 5 and 200 mg/kg respectively.

Gjennom produksjonen av enkeltcellemateriale, reguleres gjerne fermenteringsblandingen pH til mellom omtrent 5,5 og 7,5, for eksempel 6,5 ± 0,3. Egnede syrer/baser for pH-regulering kan lett velges av fagfolk på området. Spesielt egnet for anvendelse i denne forbindelse er natriumhydroksid og svovelsyre. Gjennom fermentering bør temperaturen inne i fermentoren fortrinnsvis opprettholdes innenfor området fra 40°C til 50°C, mest foretrukket 45°C + 2°C. Through the production of single cell material, the pH of the fermentation mixture is preferably adjusted to between approximately 5.5 and 7.5, for example 6.5 ± 0.3. Suitable acids/bases for pH regulation can be easily selected by professionals in the field. Particularly suitable for use in this connection are sodium hydroxide and sulfuric acid. During fermentation, the temperature inside the fermenter should preferably be maintained within the range from 40°C to 50°C, most preferably 45°C + 2°C.

I driften av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, sprayes fortrinnsvis væsken (for eksempel noe eller alt av de flytende næringsstoffene, væsken tilført for å kompensere for biomassefjerning, en fraksjon av væsken trukket ut fra reaktoren, avkjølt og returnert til reaktoren for å kontrollere temperaturen osv), eventuelt inneholdende antiskummiddel, på overflaten av det flytende kulturmediet i avgassingssonen for å redusere skumoppbygging. På samme måte er den horisontale strømningsdelen til avgassingssonen fortrinnsvis tilveiebrakt i dens øvre del med utgående skjermer på tvers for å bekjempe skumoppbygging. Som et ytterligere antiskumdannende middel, kan reaktoren ha dampinnløp plassert for å injisere damp i hoderommet ovenfor den flytende overflaten i avgassingssonen. In the operation of the method according to the invention, the liquid is preferably sprayed (for example some or all of the liquid nutrients, the liquid added to compensate for biomass removal, a fraction of the liquid withdrawn from the reactor, cooled and returned to the reactor to control the temperature, etc.), optionally containing antifoam agent, on the surface of the liquid culture medium in the degassing zone to reduce foam build-up. Similarly, the horizontal flow portion of the degassing zone is preferably provided in its upper portion with outlet screens across to combat foam build-up. As a further antifoaming agent, the reactor may have steam inlets positioned to inject steam into the headspace above the liquid surface in the degassing zone.

Ethvert enkeltcelle proteinmateriale kan fremstilles i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Imidlertid inkluderer foretrukne mikroorganismer bakterier og gjær. Enhver bakterie eller gjær tilpasset for anvendelse i forprodukter kan anvendes og egnede arter kan lett velges av fagfolk på området. Spesielt foretrukket vil enkeltcellene som anvendes i oppfinnelsen være en mikrobiell kultur som inneholder metanotrofe bakterier, eventuelt i kombinasjon med en eller flere heterotrofe bakteriearter, spesielt foretrukket en kombinasjon av metanotrofe og heterotrofe bakterier. Som anvendt heri, omfatter uttrykket "metanotrof enhver bakterie som utnytter metan eller metanol for vekst. Uttrykket "heterotrof" anvendes for bakterier som utnytter organiske substrater andre enn metan eller metanol for vekst. Any single cell protein material can be produced according to the method according to the invention. However, preferred microorganisms include bacteria and yeast. Any bacteria or yeast adapted for use in pre-products can be used and suitable species can be easily selected by those skilled in the art. Particularly preferably, the single cells used in the invention will be a microbial culture containing methanotrophic bacteria, possibly in combination with one or more heterotrophic bacterial species, particularly preferably a combination of methanotrophic and heterotrophic bacteria. As used herein, the term "methanotroph" includes any bacteria that utilizes methane or methanol for growth. The term "heterotroph" is used for bacteria that utilize organic substrates other than methane or methanol for growth.

Mens fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for fremstillingen av biomasse som kan anvendes med relativt lite videre bearbeiding som et forstoff eller fortilskudd, kan fremgangsmåten også anvendes for fremstilling av spesifikke kjemikalier som dannes av mikroorganismen/mikroorganismene i det flytende kulturmediet. I henhold til dette, vil behandlingen av kulturmediet etter fermentering omfatte separering av de spesifikke kjemikaliene av interesse, for eksempel ved hjelp av konvensjonelle kjemiske teknikker, eventuelt etterfulgt av lysis av mikroorganismecellene for å frigjøre kjemikaliene av interesse. I denne utførelsesformen av oppfinnelsen kan mikroorganismer som naturlig fremstiller kjemikaliene av interesse (for eksempel proteiner, medikamenter, karotenoider osv) eller som er genetisk modifisert til å fremstille kjemikaliene av interesse, anvendes. Mange slike mikroorganismer er kjent fra litteraturen; imidlertid er det spesielt foretrukket å anvende metanotrofe bakterier. While the method according to the invention is particularly suitable for the production of biomass that can be used with relatively little further processing as a precursor or supplement, the method can also be used for the production of specific chemicals that are formed by the microorganism(s) in the liquid culture medium. Accordingly, treatment of the culture medium after fermentation will include separation of the specific chemicals of interest, for example by means of conventional chemical techniques, possibly followed by lysis of the microorganism cells to release the chemicals of interest. In this embodiment of the invention, microorganisms which naturally produce the chemicals of interest (for example proteins, drugs, carotenoids, etc.) or which have been genetically modified to produce the chemicals of interest can be used. Many such microorganisms are known from the literature; however, it is particularly preferred to use methanotrophic bacteria.

Foretrukne bakterier for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer Methylococcus capsulatus (Bath), en termofil bakterie opprinnelig isolert fra de varme kildene i Batn, England og deponert som NCIMB 11132 ved The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Skottland. M. capsulatus (Bath) har optimal vekst ved omtrent 45°C, selv om vekst også kan skje mellom 37°C og 52°C. Det er en gramnegativ, ikke-bevegelig sfærisk celle som vanligvis opptrer i par. De intracellulære membranene er arrangert som bunter av blæreskiver karakteristisk for type I metanotrofer. M. capsulatus (Bath) er genetisk en svært stabil organisme uten kjente plasmider. Den kan utnytte metan eller metanol for vekst og ammoniakk, nitrat eller molekylært nitrogen som en nitrogenkilde for proteinsyntese. Preferred bacteria for use in the invention include Methylococcus capsulatus (Bath), a thermophilic bacterium originally isolated from the hot springs of Batn, England and deposited as NCIMB 11132 at The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland. M. capsulatus (Bath) has optimum growth at about 45°C, although growth can also occur between 37°C and 52°C. It is a gram-negative, non-motile spherical cell that usually occurs in pairs. The intracellular membranes are arranged as bundles of vesicular discs characteristic of type I methanotrophs. M. capsulatus (Bath) is genetically a very stable organism with no known plasmids. It can utilize methane or methanol for growth and ammonia, nitrate or molecular nitrogen as a nitrogen source for protein synthesis.

Andre bakterier egnet for anvendelse i oppfinnelsen inkluderer de heterotrofe bakteriene Ralstonia sp. (tidligere Alcaligenes acidovorans), DB3 (stamme NCIMB 13287), Brevibacillus agri (tidligere Bacillus firmus) DB5 (stamme NCIMB 13289) og Aneurinibacillus sp. (tidligere Bacillus brevis) DB4 (stamme NCIMB 13288) som hver har optimal vekst ved en temperatur på omtrent 45°C. Other bacteria suitable for use in the invention include the heterotrophic bacteria Ralstonia sp. (formerly Alcaligenes acidovorans), DB3 (strain NCIMB 13287), Brevibacillus agri (formerly Bacillus firmus) DB5 (strain NCIMB 13289) and Aneurinibacillus sp. (formerly Bacillus brevis) DB4 (strain NCIMB 13288) each of which has optimal growth at a temperature of approximately 45°C.

Ralstonia sp. DB3 er en gramnegativ, aerob, bevegelig stavbakterie som tilhører Pseudomonadaceae-familien som kan anvende etanol, acetat, propionat og butyrat for vekst. Aneurinibacillus sp. DB4 er en gramnegativ, endosporedannende, aerob stavbakterie som tilhører slekten Bacillus som kan utnytte acetat, D-fruktose, D-mannose, ribose og D-tagatose. Brevibacillus agri DB5 er en gramnegativ, endosporedannende, bevegelig, aerob stavbakterie av -Sac/V/ws-slekten som kan utnytte acetat, N-acetylglukosamin, citrat, glukonat, D-glukose, glyserol og mannitol. Ralstonia sp. DB3 is a Gram-negative, aerobic, motile rod bacterium belonging to the Pseudomonadaceae family that can utilize ethanol, acetate, propionate and butyrate for growth. Aneurinibacillus sp. DB4 is a Gram-negative, endospore-forming, aerobic rod bacterium belonging to the genus Bacillus that can utilize acetate, D-fructose, D-mannose, ribose and D-tagatose. Brevibacillus agri DB5 is a Gram-negative, endospore-forming, motile, aerobic rod bacterium of the -Sac/V/ws genus that can utilize acetate, N-acetylglucosamine, citrate, gluconate, D-glucose, glycerol and mannitol.

Spesielt foretrukket for anvendelse i oppfinnelsen er en mikrobiell kultur som omfatter en kombinasjon av den metanotrofe bakterien Methylococcus capsulatus (Bath) (stamme NCIMB 11132) og den heterotrofe bakterien Ralstonia sp. DB3 (stamme NCIMB 13287) og Brevibacillus agri DB5 (stamme NCIMB 13289), eventuelt i kombinasjon med Aneurinibacillus sp. DB4 (stamme NCIMB 13288). Ralstonia sp. DB3 sin rolle er å utnytte acetat og proptionat fremstilt av M. capsulatis (Bath) fra etan og propan i naturgassen. Ralstonia sp. DB3 kan stå for opp til 10%, for eksempel omtrent 6 til 8%, av det totale celletallet i den resulterende biomassen. Rollen til Aneurinibacillus sp. DB4 og Brevibacillus agri DB 5 er å utnytte lysisprodukter og metabolitter i mediet. Typisk vil Aneurinibacillus sp. DB4 og Brevibacillus agri DB5 hver stå for mindre enn 1% av celletallet gjennom kontinuerlig fermentering. Particularly preferred for use in the invention is a microbial culture comprising a combination of the methanotrophic bacterium Methylococcus capsulatus (Bath) (strain NCIMB 11132) and the heterotrophic bacterium Ralstonia sp. DB3 (strain NCIMB 13287) and Brevibacillus agri DB5 (strain NCIMB 13289), possibly in combination with Aneurinibacillus sp. DB4 (strain NCIMB 13288). Ralstonia sp. DB3's role is to utilize acetate and propionate produced by M. capsulatis (Bath) from ethane and propane in the natural gas. Ralstonia sp. DB3 may account for up to 10%, for example about 6 to 8%, of the total cell count in the resulting biomass. The role of Aneurinibacillus sp. DB4 and Brevibacillus agri DB 5 are to utilize lysis products and metabolites in the medium. Typically, Aneurinibacillus sp. DB4 and Brevibacillus agri DB5 each account for less than 1% of the cell count through continuous fermentation.

Egnede gjær for anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan velges fra gruppen bestående av Saccharomyces og Candida. Suitable yeasts for use in the method according to the invention can be selected from the group consisting of Saccharomyces and Candida.

Om ønskelig kan fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres ved anvendelse av bakterier (eller gjær) som er genetisk modifisert for å danne en ønsket kjemisk forbindelse som deretter kan ekstraheres fra den intracellulære væsken eller biomassen høstet fra reaktoren. Den vitenskapelige litteraturen og patentlitteraturen inneholder flere eksempler på slike genetisk modifiserte mikroorganismer, inkludert blant annet metanotrofe bakterier. If desired, the method according to the invention can be carried out using bacteria (or yeast) which have been genetically modified to form a desired chemical compound which can then be extracted from the intracellular fluid or the biomass harvested from the reactor. The scientific literature and the patent literature contain several examples of such genetically modified microorganisms, including among others methanotrophic bacteria.

I en spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, utføres fremgangsmåten ved å anvende metanotrofe bakterier av den type som er beskrevet i WO 02/18617 for å fremstille karotenoider, for eksempel anteraxantin, adonixantin, astaxantin, cantaxantin, zeaxantin og de andre karotenoidene nevnt på sidene 39 og 40 i WO 02/18617. Den metanotrofe bakterien Methylomonas 16a (ATCC PTA 2402) kan være spesielt foretrukket å anvende. Karotenoider fremstilt på denne måten kan separeres ut fra det flytende kulturmediet som beskrevet i WO 02/18617, WO 02/20728 og WO 02/20733. In a particularly preferred embodiment of the invention, the method is carried out by using methanotrophic bacteria of the type described in WO 02/18617 to produce carotenoids, for example antheraxanthin, adonixanthin, astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin and the other carotenoids mentioned on pages 39 and 40 in WO 02/18617. The methanotrophic bacterium Methylomonas 16a (ATCC PTA 2402) may be particularly preferred to use. Carotenoids produced in this way can be separated from the liquid culture medium as described in WO 02/18617, WO 02/20728 and WO 02/20733.

Ideelt omfatter biomassen fremstilt fra fermentering av naturgass fra 60 til 80 vekt% ubearbeidet protein; fra 5 til 20 vekt% ubearbeidet fett; fra 3 til 15 vekt% aske; fra 3 til 15 vekt% nukleinsyrer (RNA og DNA); fra 10 til 30 g/kg fosfor; opp til 500 mg/kg jern; og opp til 250 mg/kg kobber. Spesielt foretrukket omfatter biomassen fra 68 til 73 vekt%, for eksempel omtrent 70 vekt% ubearbeidet protein; fra 9 til 11 vekt%, for eksempel omtrent 10 vekt% ubearbeidet fett; fra 5 til 10 vekt%, for eksempel 7 vekt% aske; fra 8 til 12 vekt%, for eksempel omtrent 10 vekt% nukleinsyrer (RNA og DNA); fra 10 til 25 g/kg fosfor; opp til 310 mg/kg jern; og opp til 110 mg/kg kobber. Aminosyreprofilen til proteininnholdet bør næringsmessig fortrinnsvis ha en høy andel av de mer viktige aminosyrene cystein, metionin, treonin, lysin, tryptofan og arginin. Typisk kan disse være tilstede i mengder på henholdsvis omtrent 0,7%, 3,1%, 5,2%, 7,2%, 2,5% og 6,9% (uttrykt som en prosent av den totale mengden aminosyrer). Generelt vil fettsyrene omfatte hovedsakelig den mettede palmitinsyren (tilnærmet 50%) og den monoumettede palmitoleinsyren (tilnærmet 36%). Mineralinnholdet i produktet vil typisk omfatte høye mengder fosfor (omtrent 1,5 vekt%), kalium (omtrent 0,8 vekt%) og magnesium (omtrent 0,2 vekt%). Ideally, the biomass produced from fermentation of natural gas comprises from 60 to 80% by weight of unprocessed protein; from 5 to 20% by weight unprocessed fat; from 3 to 15% by weight ash; from 3 to 15% by weight nucleic acids (RNA and DNA); from 10 to 30 g/kg phosphorus; up to 500 mg/kg iron; and up to 250 mg/kg copper. Particularly preferred, the biomass comprises from 68 to 73% by weight, for example about 70% by weight of unprocessed protein; from 9 to 11% by weight, for example about 10% by weight unprocessed fat; from 5 to 10% by weight, for example 7% by weight ash; from 8 to 12% by weight, for example about 10% by weight nucleic acids (RNA and DNA); from 10 to 25 g/kg phosphorus; up to 310 mg/kg iron; and up to 110 mg/kg copper. The amino acid profile of the protein content should nutritionally preferably have a high proportion of the more important amino acids cysteine, methionine, threonine, lysine, tryptophan and arginine. Typically these may be present in amounts of approximately 0.7%, 3.1%, 5.2%, 7.2%, 2.5% and 6.9% respectively (expressed as a percentage of the total amount of amino acids) . In general, the fatty acids will comprise mainly the saturated palmitic acid (approximately 50%) and the monounsaturated palmitoleic acid (approximately 36%). The mineral content of the product will typically include high amounts of phosphorus (about 1.5% by weight), potassium (about 0.8% by weight) and magnesium (about 0.2% by weight).

Biomasseproduktet ifølge oppfinnelsen er spesielt anvendelig som en komponent eller forløper i forprodukter, spesielt når det anvendes som et substitutt for naturlig plasma i dyrefor og kjæledyrfor. Når det anvendes i kjæledyrfor kan i tillegg ytterligere ingredienser tilsettes til produktet slik som fett, sukker, salt, smaksstoffer, mineraler osv. Produktet kan deretter formes til klumper som etterligner naturlige kjøttklumper av utseende og tekstur. Produktet ifølge oppfinnelsen har den ytterligere fordelen at det lett formuleres slik at det inneholder nødvendige næringsstoffer, fordøyes lett av dyrene og er tiltalende for dyret. The biomass product according to the invention is particularly useful as a component or precursor in precursor products, especially when used as a substitute for natural plasma in animal feed and pet feed. When used in pet food, additional ingredients can also be added to the product such as fat, sugar, salt, flavorings, minerals, etc. The product can then be formed into lumps that mimic natural meat lumps in appearance and texture. The product according to the invention has the further advantage that it is easily formulated so that it contains the necessary nutrients, is easily digested by the animals and is appealing to the animal.

Produktet ifølge oppfinnelsen kan ytterligere anvendes som et strukturelement i kjøttprodukter (for eksempel kjøttboller), som en erstatning for plasmaproteiner som vanligvis anvendes som fyllstoffer i ferskt kjøtt for å øke vekt og volum, som et emulgeringsmiddel (for eksempel i dressinger osv) og i bakeriprodukter for å øke deigens egenskaper. The product according to the invention can further be used as a structural element in meat products (for example meatballs), as a substitute for plasma proteins which are usually used as fillers in fresh meat to increase weight and volume, as an emulsifier (for example in dressings, etc.) and in bakery products to increase the properties of the dough.

Når det anvendes i forprodukter, kan biomassen eller det bearbeidede biomassematerialet vanligvis anvendes i en mengde fra omtrent 1 til 10 vekt%, fortrinnsvis opp til 5 vekt%. Den eksakte andelen avhenger av den ønskede funksjonen til materialet og kan lett bestemmes av fagfolk på området. Typisk kan det være tilstede i en mengde på opp til 20 vekt%, for eksempel 5 til 10 vekt% When used in precursors, the biomass or the processed biomass material can usually be used in an amount from about 1 to 10% by weight, preferably up to 5% by weight. The exact proportion depends on the desired function of the material and can be easily determined by professionals in the field. Typically, it may be present in an amount of up to 20% by weight, for example 5 to 10% by weight

(basert på tørrstoffinnhold i produktet) når det anvendes som gelatineringsmiddel. (based on solids content in the product) when used as a gelatinizing agent.

Når reaktoren ble kjørt uten å møte de oppløste oksygeninnholdsbetingelsene som angitt ovenfor (spesielt når alt for høyt innhold av oppløst oksygen opptrer), og når et visst biomasseinnhold ble nådd, selv om reaktoren fortsatte å virke tilfredsstillende i mange timer, falt relativt brått ammoniakkforbruket innen et tidsrom på kun to eller tre timer. Den levende bakteriepopulasjonen (og følgelig biomasseinnholdet til materialet dersom dette fortsatt ble ekstrahert fra reaktoren) falt til så å si null. Selv om i noen tilfeller umiddelbart opphør av ammoniakktilførsel, reduksjon eller opphør av biomasseekstraksjon fra reaktoren og økning eller reduksjon av oksygentilførsel kunne "helbrede" mikroorganismepopulasjonen og gjenopprette biomasseutbyttet, var dette i mange tilfeller ikke tilstrekkelig. Undersøkelser av de døde bakteriene viste at selv om disse ikke hadde lysert, var den indre organellestrukturen signifikant ødelagt. Dette indikerte at bakteriegenomet var vert for hittil ikke oppdagede virusnukleinsyresekvenser som ble aktivert og uttrykte produkter som medførte avbryting av normale celleoperasjoner under de ekstraordinære betingelsene opplevd i reaktoren. Det er antatt at slik genomisk profag, heller enn viral plasmidinfeksjon av monocellulære mikroorganismer, hittil ikke har blitt identifisert og som likeledes kan vise seg å være problematisk i høy-biomassedrift av aerobe løkke re aktorfermentorer, for eksempel med bakterier, sopp (for eksempel fusarium), gjær eller genetisk modifiserte celler (for eksempel bakterier, pattedyrceller (for eksempel humane, hamster, mus osv), og enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen anvender løsningene ifølge oppfinnelsen relatert til reduksjonen av banelengden med redusert oppløst oksygen i reaktoren i aerobe løkkereaktorfermenteringer av bakterier, sopp, gjær eller genetisk modifiserte celler, for eksempel i fremstillingen av alkoholer (spesielt metanol eller etanol), for- og matvareadditiver eller forløpere derav, farmasøytiske midler, antistoffer osv. When the reactor was operated without meeting the dissolved oxygen content conditions stated above (especially when excessively high dissolved oxygen content occurs), and when a certain biomass content was reached, although the reactor continued to operate satisfactorily for many hours, the ammonia consumption dropped relatively abruptly within a period of only two or three hours. The live bacterial population (and consequently the biomass content of the material if it was still extracted from the reactor) dropped to virtually zero. Although in some cases immediate cessation of ammonia supply, reduction or cessation of biomass extraction from the reactor and increase or reduction of oxygen supply could "heal" the microorganism population and restore the biomass yield, in many cases this was not sufficient. Examination of the dead bacteria showed that, although these had not lysed, the internal organelle structure was significantly destroyed. This indicated that the bacterial genome hosted previously undiscovered viral nucleic acid sequences that were activated and expressed products that disrupted normal cell operations under the extraordinary conditions experienced in the reactor. It is believed that such genomic prophage, rather than viral plasmid infection of monocellular microorganisms, has so far not been identified and which may likewise prove problematic in high-biomass operation of aerobic loop re actor fermenters, e.g. with bacteria, fungi (e.g. Fusarium ), yeast or genetically modified cells (for example bacteria, mammalian cells (for example human, hamster, mouse, etc.), and some embodiments of the invention use the solutions according to the invention related to the reduction of the path length with reduced dissolved oxygen in the reactor in aerobic loop reactor fermentations of bacteria, fungi, yeast or genetically modified cells, for example in the production of alcohols (especially methanol or ethanol), food and food additives or precursors thereof, pharmaceuticals, antibodies, etc.

Rearrangementet av mikroorganismeorganellene som ble observert ved prosessfunksjonsfeil kan også anvendes som en kontrollparameter for tilbakemeldingskontroll av fermenteringsreaktorer generelt, og løkkereaktorer spesielt, for eksempel ved observasjon av organellerearrangement i det hele tatt, eller over et terskelnivå, som medfører igangsetning av økt næringstilførsel, spesielt oksygen- og/eller metantilførsel, eller å redusere eller stanse ammoniakktilførsel osv. Slik observasjon kan for eksempel utføres ved anvendelse av gjennomstrømningscytometri på celler fjernet fra en ekstraksjon eller prøveport i reaktoren. The rearrangement of the microorganism organelles that was observed in case of process malfunctions can also be used as a control parameter for feedback control of fermentation reactors in general, and loop reactors in particular, for example when organelle arrangement is observed at all, or above a threshold level, which leads to the initiation of increased nutrient supply, especially oxygen- and/or methane supply, or to reduce or stop ammonia supply, etc. Such observation can be carried out, for example, by using flow cytometry on cells removed from an extraction or sampling port in the reactor.

En primær indikator for funksjonsfeil i driften av prosessen ifølge oppfinnelsen, er når en hemmet pH i kulturmediet inntreffer og som skjer igjen til tross for pH-justering med basetilførsel (for eksempel NaOH). Dette synes å skyldes maursyreoppbygging eller utilstrekkelig maursyre-til-karbondioksidomdanning ved hjelp av de metanotrofe bakteriene. Et forhåndsvarsel av dette problemet kan oppnås ved å overvåke den intracellulære maursyrekonsentrasjonen i bakterien, for eksempel ved å ta prøver av kulturmediet, lysere cellene og spektrometrisk måle maursyre. Når påvisning av maursyrekonsentrasjonen øker over et på forhånd satt terskelnivå, kan man igangsette forebyggende handlinger, for eksempel ved å redusere oksygen- og/eller ammoniakktilførselshastighetene osv. Ved siden av intracellulær maursyre, kan ekstracellulær maursyre konsentrasjon overvåkes og anvendes som en prosesskontrollparameter. På samme måte kan oppløst oksygenkonsentrasjon, oppløst metankonsentrasjon og oppløst ammoniakkonsentrasjon overvåkes og anvendes som prosesskontrollparametere. Fortrinnsvis utføres slik overvåkning på stedet, det vil si ved reaktoren, og konvensjonelle overvåkingsapparater (for eksempel spektrometre og lignende) kan anvendes. A primary indicator of malfunctions in the operation of the process according to the invention is when an inhibited pH in the culture medium occurs and which occurs again despite pH adjustment with base addition (for example NaOH). This appears to be due to formic acid build-up or insufficient formic acid-to-carbon dioxide conversion by the methanotrophic bacteria. An early warning of this problem can be obtained by monitoring the intracellular formic acid concentration in the bacterium, for example by sampling the culture medium, lysing the cells and measuring formic acid spectrometrically. When detection of the formic acid concentration increases above a pre-set threshold level, preventive actions can be initiated, for example by reducing the oxygen and/or ammonia supply rates, etc. Next to intracellular formic acid, extracellular formic acid concentration can be monitored and used as a process control parameter. In the same way, dissolved oxygen concentration, dissolved methane concentration and dissolved ammonia concentration can be monitored and used as process control parameters. Such monitoring is preferably carried out on site, that is to say at the reactor, and conventional monitoring devices (for example spectrometers and the like) can be used.

Sett fra et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen, tilveiebringes en fermenteringsløkkereaktor i følge krav 14. Seen from a further aspect of the invention, a fermentation loop reactor is provided according to claim 14.

Når en løkkereaktor anvendes for celledyrking, er fjerning av oppløst karbondioksid fra kulturmediet viktig og nitrogen er i denne sammenhengen spesielt egnet til dette (det vil si som en drivgass som nevnt ovenfor). When a loop reactor is used for cell cultivation, removal of dissolved carbon dioxide from the culture medium is important and nitrogen is in this context particularly suitable for this (that is, as a propellant gas as mentioned above).

Som et resultat er det spesielt fordelaktig å plassere reaktoren i nærheten av (for eksempel innen 1 km av) et apparat med et stort behov for oksygen, for eksempel et alkohol- eller etanolproduksjonsanlegg. På denne måten kan nitrogen produsert i luftseparering (for eksempel kondensert) for å fremstille oksygen for ett anlegg anvendes i fermenteringsapparater, sammen med om ønsket en liten del av oksygenet (for eksempel som en næringsgass i fermentoren). Når fermentorproduktet skal tørkes, og spesielt når det er oksygenfølsomt ved tørking slik som tilfellet er med biomasseproduksjon for bioproteiner, kan videre nitrogenet også anvendes som tørkegass i en forstøvningstørker. As a result, it is particularly advantageous to place the reactor close to (eg within 1 km of) an apparatus with a high demand for oxygen, such as an alcohol or ethanol production plant. In this way, nitrogen produced in air separation (for example condensed) to produce oxygen for one plant can be used in fermenters, together with, if desired, a small part of the oxygen (for example as a nutrient gas in the fermenter). When the fermenter product is to be dried, and especially when it is oxygen-sensitive during drying, as is the case with biomass production for bioproteins, the nitrogen can also be used as drying gas in an atomization dryer.

Når storskaladrift av prosessen ifølge oppfinnelsen er ønskelig, er det selvfølgelig mulig å enkelt øke dimensjonene på reaktoren og kraften til drivmotoren. Et alternativ er imidlertid å drifte et sett av reaktorer, for eksempel arrangert slik at de radierer ut fra en sentral enhet som huser avgassingssonene for alle reaktorene. En fordel ved å anvende et sett (for eksempel 2, 3, 4 eller 5) av reaktorer er at reaksjonsstarten i en reaktor kan igangsettes ved inokulering med flytende kulturmedium fra en reaktor som allerede er i drift. Siden reaktorene vanligvis ikke har noen unyttbar tid for rensing eller reparasjon, sikrer et slikt arrangement at driften kan være kontinuerlig og at starttiden for de individuelle reaktorene signifikant kan reduseres. When large-scale operation of the process according to the invention is desirable, it is of course possible to easily increase the dimensions of the reactor and the power of the drive motor. An alternative, however, is to operate a set of reactors, for example arranged to radiate from a central unit housing the degassing zones for all the reactors. An advantage of using a set (for example 2, 3, 4 or 5) of reactors is that the start of the reaction in a reactor can be initiated by inoculation with liquid culture medium from a reactor that is already in operation. Since the reactors usually have no downtime for cleaning or repair, such an arrangement ensures that operation can be continuous and that the start-up time for the individual reactors can be significantly reduced.

Utførelsesformer av fremgangsmåten og apparat ifølge oppfinnelsen vil nå bli beskrevet ytterligere med henvisning til de tilhørende tegningene, hvori: Figur 1 er en skjematisk tegning av en løkkereaktor i henhold til oppfinnelsen; Figur 2 er et tverrsnitt gjennom en horisontal del av reaktoren i figur 1 og viser skjematisk arrangementet av platene til den statiske blanderen deri; Figur 3 er et skjematisk bilde av en ytterligere løkkereaktor i henhold til oppfinnelsen; og Figur 4 er et tverrsnitt gjennom en horisontal del av reaktoren i figur 1 eller figur 3 som viser skjematisk arrangementet av platene til den statiske blanderen deri. Embodiments of the method and apparatus according to the invention will now be described further with reference to the associated drawings, in which: Figure 1 is a schematic drawing of a loop reactor according to the invention; Figure 2 is a cross-section through a horizontal part of the reactor of Figure 1 and schematically shows the arrangement of the plates of the static mixer therein; Figure 3 is a schematic view of a further loop reactor according to the invention; and Figure 4 is a cross-section through a horizontal part of the reactor in Figure 1 or Figure 3 showing schematically the arrangement of the plates of the static mixer therein.

Med henvisning til figur 1, vises det der en løkkereaktor 1, hvor løkken omfatter en toppenhet 2 for avløpsgassfjerning, en vertikal nedstrømsdel 3, en horisontal strømsdel 4, en vertikal oppstrømsdel 5, og en horisontal avløpsgass/fly tende reaktormediumsepareringsdel 6. Nedstrømsdelen 3 er festet til det koniske elementet til sylindrisk toppenhet 2 mens separeringsdelen 6 går inn i toppenheten 2 tangentielt ved en side for slik å oppnå syklonisk gass/væskeseparering. Fra toppen til toppenhet 2 fjernes avløpsgass gjennom utløpsport 7. Toppen til toppenheten er også tilveiebrakt med en reserveventil 8 som åpnes automatisk dersom avløpsgasstrykket i toppenheten overskrider et på forhånd satt maksimalt nivå, for eksempel 0,5 atmosfære over omgivelsestrykk. With reference to figure 1, there is shown a loop reactor 1, where the loop comprises a top unit 2 for waste gas removal, a vertical downstream part 3, a horizontal current part 4, a vertical upstream part 5, and a horizontal waste gas/flowing reactor medium separation part 6. The downstream part 3 is attached to the conical member of the cylindrical top unit 2 while the separating part 6 enters the top unit 2 tangentially at one side so as to achieve cyclonic gas/liquid separation. From the top to the top unit 2, waste gas is removed through outlet port 7. The top to the top unit is also provided with a reserve valve 8 which opens automatically if the waste gas pressure in the top unit exceeds a preset maximum level, for example 0.5 atmospheres above ambient pressure.

Det flytende kulturmediet 9 sirkuleres rundt løkken ved av propeller 10 drevet av motor 11 (for eksempel en 650 kW motor). Oppstrøms for propellen 10 er utgangsport 12 hvorfra biomasse fjernes for avvanning og ytterligere bearbeiding, for eksempel hydrolyse, forstøvningstørking osv. The liquid culture medium 9 is circulated around the loop by propeller 10 driven by motor 11 (for example a 650 kW motor). Upstream of the propeller 10 is exit port 12 from which biomass is removed for dewatering and further processing, for example hydrolysis, spray drying, etc.

Inne i den horisontale delen 4 til løkken, er den serie av innløp 13 (for eksempel sprederapparater) for næringsgasser (for eksempel O2og CH4) og statiske blandere 14 plassert. Næringsgassinnløp 15 og 16 er fortrinnsvis også tilveiebrakt i nedstrøms- og oppstrømsseksjonene 3 og 5. Ammoniakk- og mineralinnløp 17 og 18 og prøvetakingsporter er fortrinnsvis tilveiebrakt rundt løkken. Overvåkings- og prøvetakingsporter (ikke vist) er også fortrinnsvis tilveiebrakt rundt løkken og i hoderommet til toppenheten 2. Inside the horizontal part 4 of the loop, the series of inlets 13 (for example diffusers) for nutrient gases (for example O2 and CH4) and static mixers 14 are located. Nutrient gas inlets 15 and 16 are preferably also provided in the downstream and upstream sections 3 and 5. Ammonia and mineral inlets 17 and 18 and sampling ports are preferably provided around the loop. Monitoring and sampling ports (not shown) are also preferably provided around the loop and in the headspace of the head unit 2.

Mot toppen av utstrømsdelen 5 er det tilveiebrakt et drivgassinnløp 19 (for eksempel for nitrogen), for eksempel en sprederplate. 1 elementet til separeringsdelen 6 er det fortrinnsvis tilveiebrakt en porøs spreder 20 for næringsgass (spesielt oksygen) som forlenges langs strømningsretningen for slik å tilføre næringsgass i væsken som separeres ut i denne delen. Towards the top of the outflow part 5, a propellant gas inlet 19 (for example for nitrogen), for example a spreader plate, is provided. 1 element of the separation part 6, a porous spreader 20 for nutrient gas (especially oxygen) is preferably provided which is extended along the flow direction so as to supply nutrient gas in the liquid which is separated out in this part.

Ved henvisning til figur 2, er løkkereaktoren vist å inneholde en stabel av parallelle horisontale bølgede perforerte plater 21 plassert oppå hverandre med bølgene i registrer, men med vekslende retning for slik å tilveiebringe strømningskanaler 22 for kulturmediet. Referring to Figure 2, the loop reactor is shown to contain a stack of parallel horizontal corrugated perforated plates 21 placed one on top of the other with the waves in registers, but with alternating direction so as to provide flow channels 22 for the culture medium.

Ved henvisning til figur 3, er det vist en løkkereaktor 1, hvor løkken derav omfatter en toppenhet 2 for avløpsgassfjerning, en vertikal nedstrømsdel 3, en horisontal strømningsdel 4, en vertikal oppstrømsdel 5, og en horisontal avløpsgass/fly tende reaksjonsmediumseparasjonsdel 6. Nedstrømsdel 3 er festet til det koniske elementet til sylindrisk toppenhet 2, mens separeringsdelen 6 går inn i toppenheten 2 ved en side. Fra toppen av toppenhet 2 fjernes avløpsgass gjennom utløpsport 7. Toppen til toppenheten er også tilveiebrakt med reserveventil som åpnes automatisk dersom avløpsgasstrykket i toppenheten overskrider et på forhånd satt maksimum, for eksempel 0,5 atmosfære over omgivelsestrykk. With reference to Figure 3, a loop reactor 1 is shown, the loop thereof comprising a top unit 2 for waste gas removal, a vertical downstream part 3, a horizontal flow part 4, a vertical upstream part 5, and a horizontal waste gas/liquid reaction medium separation part 6. Downstream part 3 is attached to the conical element of the cylindrical top unit 2, while the separating part 6 enters the top unit 2 at one side. From the top of top unit 2, waste gas is removed through outlet port 7. The top of the top unit is also provided with a reserve valve that opens automatically if the waste gas pressure in the top unit exceeds a preset maximum, for example 0.5 atmospheres above ambient pressure.

Det flytende kulturmediet 9 sirkuleres rundt løkken ved hjelp av en propell drevet av en vertikalt plassert drivaksel drevet ved hjelp av motor (for eksempel en 650 kW motor). Oppstrøms for en propell drevet av en vertikalt plassert drivaksel, er en utgangsport 12 hvorfra biomasse fjernes for avvanning og ytterligere bearbeiding, for eksempel hydrolyse, forstøvningstørking osv. The liquid culture medium 9 is circulated around the loop by means of a propeller driven by a vertically positioned drive shaft driven by means of a motor (for example a 650 kW motor). Upstream of a propeller driven by a vertically positioned drive shaft, is an exit port 12 from which biomass is removed for dewatering and further processing, such as hydrolysis, spray drying, etc.

Inne i den horisontale delen 4 til løkken er det plassert en rekke næringsgass (for eksempel O2og CH4) -innløp 13 (for eksempel sprederplater) og statiske blandere. Ammoniakk- og mineralinnløp 17 og 18 og prøvetakingsporter er fortrinnsvis tilveiebrakt rundt løkken. Overvåknings- og prøvetakingsporter (ikke vist) er også fortrinnsvis tilveiebrakt rundt løkken og i hoderommet til toppenheten 2. Inside the horizontal part 4 of the loop are placed a number of nutrient gas (for example O2 and CH4) inlets 13 (for example spreader plates) and static mixers. Ammonia and mineral inlets 17 and 18 and sampling ports are preferably provided around the loop. Monitoring and sampling ports (not shown) are also preferably provided around the loop and in the headspace of the head unit 2.

Mot toppen av utstrømsdelen 5 er det tilveiebrakt et drivgassinnløp 19 (for eksempel nitrogen), for eksempel en sprederplate. Towards the top of the outflow part 5, a propellant gas inlet 19 (for example nitrogen), for example a spreader plate, is provided.

Oppløst oksygeninnhold måles ved hjelp av prober 23 inne i reaktoren. Ammoniakkonsentrasjon og celletetthet måles ved hjelp av prober 24 og 25 i høstingsutløpet til reaktoren, gassammensetning (CO2, O2, CH4) måles ved hjelp av probe 26 i avgassventileringslinjen. Temperatur og pH måles inne i reaktoren ved hjelp av prober 27 og 28. Informasjonen fra disse probene anvendes for tilbakemeldingskontroll hvorved et utbytte-optimal gass- og ammoniakkfordeling forhold beregnes basert på en mekanisk modell for fermenteringsprosessen og som tilveiebringer repeterende optimale innstillinger for O2-, CH4- og NH3-introduksjonsventiler, for den bortledede strømmen av kulturmedium fra reaktoren inn i varmevekslere og tilbake til reaktoren, og for syre/basedosering for å optimalisere pH. Dissolved oxygen content is measured using probes 23 inside the reactor. Ammonia concentration and cell density are measured using probes 24 and 25 in the harvesting outlet of the reactor, gas composition (CO2, O2, CH4) is measured using probe 26 in the exhaust gas ventilation line. Temperature and pH are measured inside the reactor using probes 27 and 28. The information from these probes is used for feedback control whereby a yield-optimal gas and ammonia distribution ratio is calculated based on a mechanical model for the fermentation process and which provides repeatable optimal settings for O2-, CH4 and NH3 introduction valves, for the diverted flow of culture medium from the reactor into heat exchangers and back to the reactor, and for acid/base dosing to optimize pH.

I figur 4 er et mer foretrukket blandingsarrangement vist. I denne utførelsesformen er de parallelle vertikale bølgede perforerte platene 21 plassert med sine korrugeringer vinklet i forhold til strømningsretningen og i vekselvis orientering. In Figure 4, a more preferred mixing arrangement is shown. In this embodiment, the parallel vertical corrugated perforated plates 21 are positioned with their corrugations angled relative to the direction of flow and in alternating orientation.

Blanderplatene er fortrinnsvis fleksible i den forstand at de er selvrensende. De er fortrinnsvis dannet av rustfritt stål og med en tykkelse på minst 0,2 mm, for eksempel omtrent 0,5 til 1,5 mm, spesielt 0,8 til 1,2 mm tykkelse. Det maksimale mellomrommet mellom platene, det vil si kanalhøyden mellom bølgene, er fortrinnsvis minst 25 mm, for eksempel 50 til 250 mm, nærmere bestemt 80 til 150 mm, spesielt 90 til 110 mm. The mixing plates are preferably flexible in the sense that they are self-cleaning. They are preferably formed of stainless steel and with a thickness of at least 0.2 mm, for example approximately 0.5 to 1.5 mm, especially 0.8 to 1.2 mm thickness. The maximum space between the plates, that is the channel height between the waves, is preferably at least 25 mm, for example 50 to 250 mm, more specifically 80 to 150 mm, especially 90 to 110 mm.

Det følgende ikke-begrensende eksempelet illustrerer oppfinnelsen ytterligere. The following non-limiting example further illustrates the invention.

Eksempel 1 - Fremstilling av homogenisert biomasse Example 1 - Production of homogenized biomass

En mikrobiell kultur som omfatter Methylococcus capsulatus (Bath) (stamme NCIMB 11132), Ralstonia sp. (tidligere Alcaligenes acidovorans) DB3 (stamme NCIMB 13287) og Brevibacillus agri (tidligere Bacillus firmus) DB5 (stamme NCIMB 13289) og eventuelt og fortrinnsvis Aneurinibacillus sp. DB4 (stamme NCIMB 13288) fremstilles i en løkketypefermentor ved kontinuerlig aerob fermentering av naturgass i et ammoniakk/mineralsaltmedium (AMS) ved 45°C, pH 6,5. AMS-mediet inneholder følgende pr liter: 10 mg NH3, 75 mg H3PO4, 380 mg MgS04.7H20, 100 mg CaCl2.2H20, 200 mg K2S04, 75 mg FeS04.7H20, 1,0 mg CuS04.5H20, 0,86 mg ZnS04.7H20, 120 ug CoCl2.6H20, 48 ug MnCl2.4H20, 36 Hg H3BO3, 24 ug NiCl2.6H20 og 1,20 ug NaMo04.2H20. A microbial culture comprising Methylococcus capsulatus (Bath) (strain NCIMB 11132), Ralstonia sp. (formerly Alcaligenes acidovorans) DB3 (strain NCIMB 13287) and Brevibacillus agri (formerly Bacillus firmus) DB5 (strain NCIMB 13289) and optionally and preferably Aneurinibacillus sp. DB4 (strain NCIMB 13288) is produced in a loop type fermenter by continuous aerobic fermentation of natural gas in an ammonia/mineral salt medium (AMS) at 45°C, pH 6.5. The AMS medium contains the following per liter: 10 mg NH3, 75 mg H3PO4, 380 mg MgS04.7H20, 100 mg CaCl2.2H20, 200 mg K2S04, 75 mg FeS04.7H20, 1.0 mg CuS04.5H20, 0.86 mg ZnSO 4 .7H 2 O, 120 µg CoCl 2 .6H 2 O, 48 µg MnCl 2 .4H 2 O, 36 Hg H 3 BO 3 , 24 µg NiCl 2 .6H 2 O and 1.20 µg NaMoO 4 .2H 2 O.

Fermentoren fylles med vann som er varmesterilisert ved 125°C i 10 sekunder. Tilsetning av de ulike næringsstoffene reguleres i henhold til forbruket derav. Med gradvis oppbygging over tid, kjøres kontinuerlig fermentering med 1-3% biomasse (på en tørrvektbasis). The fermenter is filled with water that has been heat sterilized at 125°C for 10 seconds. Addition of the various nutrients is regulated according to their consumption. With gradual build-up over time, continuous fermentation is run with 1-3% biomass (on a dry weight basis).

Biomassen utsettes for sentrifugering i en industriell kontinuerlig sentrifuge ved 3000 rpm, eventuelt etterfulgt av homogenisering i en industriell homogenisator (trykkfall: 1000 bar (100 MPa); innløpstemperatur: 15°C for å fremstille en homogenisert biomasse), etterfulgt av ultrafiltrering ved anvendelse av membraner med en eksklusjonsstørrelse på 200000 Dalton. The biomass is subjected to centrifugation in an industrial continuous centrifuge at 3000 rpm, optionally followed by homogenization in an industrial homogenizer (pressure drop: 1000 bar (100 MPa); inlet temperature: 15°C to produce a homogenized biomass), followed by ultrafiltration using membranes with an exclusion size of 200,000 Dalton.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av biomasse ved dyrking av en mikroorganisme i et vandig flytende kulturmedium som sirkulerer i en løkkereaktor med en avløpsgassfjerningssone hvorfra karbondioksidinneholdende avløpsgass fjernes fra reaktoren, karakterisert vedat løkkereaktoren oppstrøms for avløpsgassfjerningssonen har en avgassingssone hvori en drivgass introduseres for å drive karbondioksid i den flytende fasen inn i en separerbar avløpsgassfase og videre har oppstrøms for nevnte avgassingssone en næringsgassintroduksjonssone hvori oksygen introduseres i reaktoren og blandes med det flytende kulturmediet deri, hvori oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone utføres flere steder langs strømningslengden gjennom nevnte løkkereaktor ved en hastighet slik at det gjennomsnittlig oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium målt ved anvendelse av en polarografisk oksygenelektrode ikke overskrider 25 ppm.1. Process for producing biomass by cultivating a microorganism in an aqueous liquid culture medium that circulates in a loop reactor with a waste gas removal zone from which waste gas containing carbon dioxide is removed from the reactor, characterized in that the loop reactor upstream of the waste gas removal zone has a degassing zone in which a propellant gas is introduced to drive carbon dioxide in the liquid phase into a separable waste gas phase and further upstream of said degassing zone has a nutrient gas introduction zone in which oxygen is introduced into the reactor and mixed with the liquid culture medium therein, in which oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is carried out in several places along the flow length through said loop reactor at a speed such that the average dissolved oxygen content in said liquid culture medium measured using a polarographic oxygen electrode does not exceed 25 ppm. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat nevnte flytende kulturmedium inneholder en metanotrof bakterie og hvori oksygen og metan introduseres i nevnte reaktor og blandes med nevnte flytende kulturmedium.2. Method according to claim 1, characterized in that said liquid culture medium contains a methanotrophic bacterium and in which oxygen and methane are introduced into said reactor and mixed with said liquid culture medium. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert vedytterligere å omfatte høsting av biomasse fra nevnte reaktor og eventuelt bearbeiding av den høstede biomassen.3. Method according to claims 1 and 2, further characterized to include harvesting biomass from said reactor and possibly processing the harvested biomass. 4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 2, karakterisert vedytterligere å omfatte høsting av biomasse som inneholder flytende kulturmedium fra nevnte reaktor og å separere derfra en kjemisk forbindelse fremstilt av nevnte mikroorganisme.4. Method according to any of claims 1 and 2, characterized by further comprising harvesting biomass containing liquid culture medium from said reactor and separating therefrom a chemical compound produced by said microorganism. 5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 4, karakterisert vedat oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone utføres ved flere steder langs strømningslengden gjennom nevnte løkkereaktor ved en hastighet slik at det gjennomsnittlige oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium målt ved anvendelse av en polarografisk oksygenelektrode ikke overskrider 15 ppm.5. Method according to any one of claims 1 and 4, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is carried out at several places along the flow length through said loop reactor at a rate such that the average dissolved oxygen content in said liquid culture medium measured using a polarographic oxygen electrode does not exceed 15 ppm. 6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 5, karakterisert vedat oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone utføres ved flere steder langs strømningslengden gjennom nevnte løkkereaktor ved en hastighet slik at det oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium ved hvert sted, med unntak av det første nevnte stedet nedstrøms for nevnte avgassingssone, er i det minste 0,5 ppm.6. Method according to any one of claims 1 and 5, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is carried out at several places along the flow length through said loop reactor at a rate such that the dissolved oxygen content in said liquid culture medium at each place, with the exception of the first mentioned place downstream of said degassing zone, is at least 0.5 ppm. 7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert vedat oksygenintroduksjonen utføres ved en hastighet slik at det oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium ved første sted nedstrøms for nevnte avgassingssone er i det minste 0,5 ppm.7. Method according to claim 6, characterized in that the oxygen introduction is carried out at a rate such that the dissolved oxygen content in said liquid culture medium at the first location downstream of said degassing zone is at least 0.5 ppm. 8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og7, karakterisert vedat oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone er slik at mellom nevnte næringsgassintroduksjonssone og nevnte avgassingssone faller det oppløste oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet ikke under 3 ppm regnet på vekt.8. Method according to any of claims 1 and 7, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is such that between said nutrient gas introduction zone and said degassing zone the dissolved oxygen content in the liquid culture medium does not fall below 3 ppm calculated by weight. 9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 8, karakterisert vedat oksygenintroduksjon i nevnte flytende kulturmedium utføres slik at det oppløste oksygeninnholdet i nevnte flytende kulturmedium ikke faller under 3 ppm regnet på vekt over en banelengde av løkkereaktoren svarende til mer enn 30 sekunder.9. Method according to any one of claims 1 and 8, characterized in that oxygen introduction in said liquid culture medium is carried out so that the dissolved oxygen content in said liquid culture medium does not fall below 3 ppm calculated by weight over a path length of the loop reactor corresponding to more than 30 seconds. 10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 9, karakterisert vedat nevnte flytende kulturmedium sirkuleres gjennom nevnte løkkereaktor under virkning av en propell med overlappende eller flere, radielt kurvede blader.10. Method according to any one of claims 1 and 9, characterized in that said liquid culture medium is circulated through said loop reactor under the action of a propeller with overlapping or several radially curved blades. 11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 10, karakterisert vedat næringsgass og flytende kulturmedium blandes i nevnte løkkereaktor ved å passere gjennom en statisk blander som omfatter en stabel av parallelt bølgede fleksible plater arrangert med stabelretningen perpendikulært til retningen av strømningen av nevnte flytende medium og hvor de bølgeformede furene derav er vinklet til nevnte strømningsretning og hvor deres vinkling til strømningsretningen i alt vesentlig er lik eller motsatt til tilstøtende plater.11. Method according to any one of claims 1 and 10, characterized in that nutrient gas and liquid culture medium are mixed in said loop reactor by passing through a static mixer comprising a stack of parallel corrugated flexible plates arranged with the stack direction perpendicular to the direction of flow of said liquid medium and where the wave-shaped furrows thereof are angled to said direction of flow and where their angle to the direction of flow is essentially the same or opposite to adjacent plates. 12. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 11, karakterisert vedat oksygenintroduksjon i nevnte næringsgassintroduksjonssone er slik at mellom nevnte næringsgassintroduksjonssone og nevnte avgassingssone faller ikke det oppløste oksygeninnholdet i det flytende kulturmediet under X ppm regnet på vekt, hvor X er definert gjennom X = 1,35 Y.B hvor B er biomasseinnholdet i kulturmediet i g/l og Y er fra 0,75 til 1,25, og B er større enn 5.12. Method according to any one of claims 1 and 11, characterized in that oxygen introduction in said nutrient gas introduction zone is such that between said nutrient gas introduction zone and said degassing zone the dissolved oxygen content in the liquid culture medium does not fall below X ppm calculated by weight, where X is defined through X = 1.35 Y.B where B is the biomass content of the culture medium in g/l and Y is from 0.75 to 1.25, and B is greater than 5. 13. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 12, karakterisert vedat nevnte løkkereaktor her en strømningsbane på i det minste 40 m.13. Method according to any one of claims 1 and 12, characterized in that said loop reactor here has a flow path of at least 40 m. 14. Fermenteringsløkkereaktor tilpasset for anvendelse i en fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav karakterisert vedat reaktoren har: - en avløpsgassfjerningssone omfattende en avløpsgassventil; - en avgassingssone oppstrøms for avløpsgassfjerningssonen omfattende et drivgassinnløp; og - en næringsgassintroduksjonssone oppstrøms for nevnte avgassingssone omfattende flere innløp for oksygen langs strømningslengden gjennom reaktoren.14. Fermentation loop reactor adapted for use in a method according to any of the preceding claims characterized in that the reactor has: - a waste gas removal zone comprising a waste gas valve; - a degassing zone upstream of the waste gas removal zone comprising a propellant gas inlet; and - a nutrient gas introduction zone upstream of said degassing zone comprising several inlets for oxygen along the flow length through the reactor.