NO332499B1 - Fremgangsmate for ekspresjon av heterologe proteiner i M capsulatus samt fusjonsprotein - Google Patents

Abstract

Det beskrives et ekspresjonssystem for uttrykking av proteiner og peptider i en metanotrof bakterie, fortrinnsvis M. capsulatus. Videre vedrører oppfinnelsen utnyttelse og fremvisning av nevnte peptider og proteiner på overflaten av nevnte bakterie. Oppfinnelsen beskriver også en fremgangsmåte for produksjonen av et ønsket protein i M. capsulatus.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et fusjonsprotein, og en fremgangsmåte for å produsere et ønsket protein i M. capsulatus.

Ekspresjonen av polypeptider på overflaten av bakterier og bakterio-fager er blitt benyttet i flere år, delvis på grunn av interesse i rekombinant antistoffproduksjon. Mange andre potensielle applika-sjoner eksisterer, inkluderende produksjonen av genetisk modifiserte helcelleadsorbenter, konstruksjon av «peptidbiblioteker», celle-bundne enzymer, og anvendelse som levende vaksiner eller immonogener for å generere antistoff.

I bakterier har én løsning for å oppnå overflateuttrykte fremmende proteiner vært anvendelsen av native membranproteiner som en bærer for et fremmed protein. Generelt har de fleste forsøk på å utvikle metoder for å forankre proteiner på en bakteriell overflate fokusert på fusjonering av det ønskede rekombinante polypeptid til et nativt protein som normalt eksponeres på cellens ytre, med det håp å resultere i et hybrid som også vil lokaliseres på overflaten.

Fra litteraturen er det kjent yttermembranproteiner fra M. capsulatus. Publikasjonene til Fjellbirkeland; Fjellbirkeland et al., Outer membran proteins of Methylococcus capsulatus (Bath), Archives of Microbiology., vol 168, nr. 2, 1997, og Fjellbirkeland et al.., Molecular analysis of an outer membrane protein, MopB, og Methylococcus capsulatus (Bath) and structural comparisons with proteins of the OmpA family, Archives of Microbiology., vol 173, nr. 5-6 2000 beskriver nukleotidsekvensen som koder for MopB, men ingen av disse publikasjoner beskriver nukleotidsekvensen som koder for MopE. Med referanse til publikasjonen Geogiou et al., Display of heterologous proteins on the surface of microorgansims, Biotechnology, vol. 15, nr. 1, 1997, omtaler disse at eksterne løkker på yttermembranproteiner kan tolerere innsetting av heterologe proteiner og danne nye stammer med nye overflate-egenskaper.

Det beskrives i denne søknad et ekspresjonssystem hvor et heterologt polypeptid (benevnt «ønsket» protein) uttrykkes i bakterien Methylococcus capsulatus. Det heterologe protein er fortrinnsvis koblet til ett av yttermembranproteinene i M. capsulatus. Disse yttermembranproteiner er blitt identifisert basert på sekvenshomologistudier.

De identifiserte sekvensene angitt som SEKV ID NR 1 til SEKV ID NR 4 er nukleotider som koder for proteinene MopC, MopD, MopE og MopF, respektivt. Videre beskrives sekvensen angitt i SEKV ID NR 5, som identifiseres som D15, og sekvensene gitt som SEKV ID NR 6 til SEKV ID NR 14 idet disse sekvenser identifiseres som hjelperproteiner.

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere et ønsket protein i M. capsulatus, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter transformering av nevnte M. capsulatus med en rekombinant vektor omfattende en første nukleotidsekvens omfattende SEKV ID NR 3, og hvor nevnte vektor omfatter en ytterligere nukleotidsekvens som koder for nevnte protein, hvor nevnte ytterligere nukleotidsekvens er operativt koblet i ramme til nevnte første nukleotidsekvens, og dyrkning av nevnte transformerte M. capsulatus i et egnet medium under betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte protein.

I en foretrukket utførelse omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet å gjenvinne det uttrykte protein eller peptid fra mediet.

I en utførelse er det ønskede uttrykte protein er et medikament.

I en utførelse ekstraheres medikamentet fra nevnte M. capsulatus, eller anvendes sammen med nevnte M. capsulatus for fremstilling av en vaksine.

I en utførelse er vaksinen for oral administrering.

I en utførelse eksponeres nevnte protein på overflaten av nevnte M. capsulatus.

I en utførelse har nevnte ytterligere nukleotidsekvens multiple kloningsseter, hvor nevnte multiple kloningssete er posisjonert slikt at innsetting av en tredje nukleotidsekvens inn i kloningssetet operativt kobler nevnte tredje nukleotidsekvens til nevnte første nukleotidsekvens.

I en utførelse koder nevnte tredje nukleotidsekvens for et ønsket protein eller peptid.

I en utførelse omfatter nevnte nukleotidsekvenser et gen som koder for en seleksjonsmarkør.

I en utførelse er nevnte seleksjonsmarkør en antibiotisk seleksj onsmarkør.

I en utførelse er nevnte seleksjonsmarkør kanamycin.

I en utførelse omfatter nevnte nukleinsyre ytterligere et replikasjonsorigo som fungerer i M. capsulatus.

I en utførelse er nevnte replikasjonsorigo sMMO.

I en utførelse er nevnte replikasjonsorigo pmmo.

I en utførelse inneholder nukleotidsekvensen som koder for det ønskede protein en region som koder for et peptidområde som fungerer som et substrat for et hydrolyserende enzym i stand til å spalte det ønskede protein fra det resterende membran forankrede protein, slik at det ønskede protein utskilles til dyrkningsmedium.

I en utførelse er den rekombinante vektor et plasmid.

I en utførelse er vektoren plasmidet pAFpglO.

I et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelsen et fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det inneholder en protein-eller peptidsekvens som kodes for av en nukleotidsekvens omfattende SEKV ID NR 3, og et ytterligere ønsket protein eller peptid.

I en utførelse er nevnte fusjonsprotein et overflateeksponert protein.

I en utførelse er nevnte protein et medikament.

I en utførelse er nevnte protein et antigen, eller et antistoff.

Bakterien M. capsulatus er i stand til å utnytte metan som den eneste karbon- og energikilde. Bakterier i stand til å oksidere metan benevnes samlet som metanotrofe bakterier. De tilhører forskjellige familier og grupper av eubakterier som har det som felles at de omfatter det uvanlige enzym metanmonooksygenase, som katalyserer oksideringen av metan til metanol.

Bakterien har også et obligatorisk krav for metan eller metanol og en optimal veksttemperatur på 45°C. Metan oksideres via metanol til formaldehyd som enten assimileres til cellulær biomasse, eller dissimileres til karbondioksid for å frigjøre cellulær energi.

M. capsulatus har en Gram-negative cellekappe. Mye av det intra-cellulære rom okkuperes av et utstrakt intracytoplasmisk membran- system. Genomet i M. capsulatus (Bath) har en molekylvekt av 2,8 x IO<9>Da og etG+C-innhold av 62,5%.

Kommersielle interesser som omfatter M. capsulatus og andre metanotrofe bakterier kan grovt inndeles i 2 kategorier: Det som drar fordel av kostnadsbillige vekstkrav til bakterien, og det som drar fordel av unike katalytiske aktiviteter som oppvises av bakteriene.

Utviklingen av fermenteringsteknologi med høy celletetthet for M. capsulatus har etablert mulighetene for å produsere store mengder av spesialiserte forbindelser så som f.eks. aminosyrer, ko-faktorer, vitaminer, metabolske sluttprodukter, og forskjellige høyverdi-proteiner, til fornuftige kostnader.

Andre anvendelser for proteinfremvisningsmetodene inkluderer f.eks. epitopkartlegging, screening av antistoffbibliotek og levende bakterielle vaksiner.

I en samtidig patentsøknad har oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt data for flere gener i genomet til Metylococcus capsulatus. Noen av disse gener deler betydelig homologi med gener som koder for overflateproteiner i andre bakterier, og proteinene som kodes av disse gener kan anvendes i et ekspresjonssystem for å transportere heterologe proteiner til overflaten til metanotrofe bakterier. Disse funn eksemplifiseres ved etablering av et fusjonsprotein for MopE fra M. capsulatus og VP2-proteinet fra det infek-siøse pankreatiske nekrosevirus (IPN), som er detaljert forklart i den eksperimentelle del.

Den omtalte fremgangsmåte er spesielt egnet for produksjon av vaksiner som kan administreres oralt for anvendelse i dyr, fisk og mennesker. Teknikken kan også potensielt anvendes for fremvisning av vaksiner, spesielt for oral administrering.

Videre beskrives anvendelse av genene og proteinene som kodes av disse, som gitt i den medfølgende sekvensliste, fragmenter derav, eller funksjonelt ekvivalente vesentlig homogene gener, for konstruksjon av fusjonsproteiner som bærer fremmede peptidsekvenser for fremvisning i M. capsulatus, og fortrinnsvis på overflaten av nevnte bakterie.

«Vesentlig homolog» som anvendt heri, definerer sekvenser som fremviser minst 80% sekvensidentitet og også funksjonelt ekvivalente allele varianter og beslektede gener modifisert av enkle eller flere basesubstitusjoner eller addisjon og/eller deletering.

Overflateproteiner som omtales er yttermembranproteinene MopC (SEKV ID NR 1), MopD (SEKV ID NR 2), MopE (SEKV ID NR 3) og MopF (SEKV ID NR 4) .

Videre koder ett av genene (SEKV ID NR 5) for en homolog til et overflateprotein-antigen (noen ganger benevnt D15) identifisert i en rekke Gram-negative bakterier.

Videre har oppfinnerne identifisert flere proteiner involvert i presentasjonen av de ovenfor nevnte proteiner på overflaten. Disse proteiner benevnes i denne sammenheng «hjelperproteiner», og kodes av sekvensene SEKV ID NR 6-14. M. capsulatus overflate-antigen-homolog (D15) er et stort protein med en molekylvekt på ca. 80 kD som deler ca. 50% sekvensidentitet med det korresponderende protein fra Pseudomonas aeruginosa. Lik-heten med andre Gram-negative bakterier er i området 39-20% identitet. Disse bakterier inkluderer mange viktige humane patogener, så som Vibrio cholerae (39% identitet), Shigella flexneri (38% identitet) , Neisseria men ingit idis (36% identitet), Haemophilus influenzae (32%), Campylobacter jejuni (23%), Borrelia burgdorferi (21%) og dyrepatogener så som Pasteurella multocida (34%) og Brucella abortus (28%). Idet det anvendes for immunisering av eksperimentdyr, er D15-proteinet fra H. influenzae og P. multocida blitt vist å utløse en immunrespons som beskytter de immuniserte dyr mot infeksjon av de respektive bakterier. Således har D15-genet som proteinklasse vist seg å være et immuno-genisk protein, og anvendelse av D15-antigenet som en vaksine mot en rekke sykdommer forårsaket av Gram-negative bakterier er en lovende idé. Mange andre patogener innen genera Vibrio og Shigella og likeledes beslektede genera, oppviser sannsynligvis også et D15-antigen, men er til nå ikke blittkarakterisert vedsekvensering av deres gener. Flere viktige fiskepatogener som tilhører genus Vibrio og beslektet genus Aeromonas, inneholder sannsynligvis også dette antigen. Det er et stort behov for en effektiv og kostnadsbillig vaksine for beskyttelse mot infeksjoner forårsaket av alle bakteriene angitt ovenfor, og mange flere kan sannsynligvis listes. M. capsulatus er en bakterie lisensiert for anvendelse i dyre- og fiskefor. Den har ingen virulente eller patogene egenskaper, og inneholder svært lave mengder av endotoksin (LPS). Den er således godt egnet som en bærerorganisme for rekombinante orale vaksiner, med et potensiale også for anvendelse i mennesker. Vaksiner kan konstrueres ved innsetting av fragmenter av D15-genene fra patogener inn i M. capsulatus D15-genet for å oppvise et fusjonsprotein som inneholder deler av de to D15-antigener på overflaten til M. capsulatus. Den del av D15-proteinet som har sitt opphav fra patogenet bør utløse en immunrespons til den respektive patogene bakterie. Dersom erstatning av M. capsulatus- spesifikke D15-sekvenser med korresponderende sekvenser fra patogenene tolereres godt av verten, kan større områder av D15 erstattes, og dersom mulig kan hele D15-proteinet erstattes med det korresponderende protein fra et patogen.

Som følge av sekvenskonserveringen av D15 blant distinkt beslektede bakterier, kan utbyttet av deler av genet (eller av hele genet) uten alvorlig å påvirke overlevelsen og veksten av M. capsulatus være mulig. Den spesifikke funksjon for D15-antigenet på overflaten av bakteriene er ikke kjent, men det er mulig at den spiller en struk-turell rolle og er mest sannsynlig ikke involvert i noen viktig biokjemisk prosess.

Suksessrik fremvisning av målproteinet på celleoverflaten kan detekteres ved anvendelse av en rekke metoder, f.eks., dersom målpeptidet spesifikt kan merkes ved en prosedyre som ikke opererer gjennom membranen, kan dets celleoverflatefremvisning enkelt påvises.

Dersom målpeptidet oppviser enzymatisk aktivitet kan man anvende slik aktivitet for å vise celleoverflatefremvisning. Antistoff mot målproteinet kan også anvendes.

Det kimeriske DNA kan integreres inn i vertscellekromosomet, eller bæres innen en vektor. Fremgangsmåter for å integrere DNA inn i et vertcellekromosom er godt kjent innen fagfeltet. Det kimeriske DNA kan også bæres innen en rekombinant vektor, f.eks. et plasmid.

Plasmider som er nyttige som vektor-backbone inkluderer plasmider som inneholder replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er kompatible med vertscellen. Vektoren kan også inneholdende en induserbar promotor og markørgener, f.eks. for antibiotisk resistens.

Introduksjon av det kimeriske DNA til vertscellen kan effektueres ved enhver fremgangsmåte kjent for fagkyndige innen feltet. F.eks. dersom en rekombinant vektor bærer DNA'et, kan vektoren f.eks. introduseres ved transformasjon, elektroporering eller fagtransfek-s j on.

Deteksjonsteknikkene angitt ovenfor kan anvendes innledende for å verifisere at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fungerer, dvs. at fusjonsoverflateproteinet er blitt uttrykt og transportert til den bakterielle celleoverflate og er orientert slik at målproteinet er tilgjengelig, dvs. fremvist.

Celler som fremviser "målet" kan separeres fra de som ikke gjør det ved anvendelse f.eks. av affinitetseparasjonsteknikker. Slike teknikker inkluderer affinitetkolonnekromatografi, batch-eluering fra affinitetsmatriksmaterialer og fluorescensaktiverte celle-sorteringsmekanismer.

MopE er et viktig yttermembranprotein i M. capsulatus. Det inneholder overflateeksponerte regioner, men dets eksakte folding og assosiering med celleoverflaten er ikke kjent. Under kobber-begrensninger, utskilles den C-terminale del av proteinet inn i vekstmediet, men betydelige mengder av full-lengdeproteiner forblir assosiert med celleoverflaten. Ved å anvende dette protein som en forankring er det mulig å mediere translokering av passasjer-proteiner til celleoverflaten eller til det ekstracellulære miljø. Andre yttermembranproteiner er MopC, MopD og MopF. Disse yttermembranproteiner deler strukturlikheter, og det er således antatt at også disse proteiner kan anvendes for ekspresjon av heterologe proteiner i M. capsulatus.

For å etablere ekspresjonssystemet angitt med fremgangsmåten i samsvar med foreliggende oppfinnelse, og for å illustrere konseptet, ble fusjonsproteiner sammensatt av MopE og VP2-proteinet av infeksiøst pankreatisk nekrosevirus (IPN) konstruert. Proteinene ble uttrykt i M. capsulatus (Bath) og deres lokalisering innen cellen ble undersøkt.

Eksperimentell del

Bakteriestammer og vekstbetingelser

M. capsulatus (Bath) var tilgjengelig fra The National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB 1132). E. coil DH5 ble anvendt for rutinekloneformål og E. coli S17-1 ble anvendt som en donorstamme i konjugeringseksperimentene. Begge stammer fikk vokse i Luria-Bertani (LB)medium tilsatt de egnede antibiotika. M. capsulatus ble dyrket med metan som en karbonkilde i nitratmineralsalter (NMS)-medium (Whittenbury et al., 1970). Cellevekst i medium tilsatt 1 mg/l CuS04• 5 H20 angis som «høy-kobberceller». Cellene angitt som «lav-kobberceller» fikk vokse i NMS uten tilsatt kobber, og inneholder modifiseringer av Stolyar et al., (1999).

Rekombinante DNA- teknikker

4 forskjellige DNA-fragmenter ble mangfoldiggjort med PCR. Disse kodet for den umiddelbare oppstrømsregion av sMVTO-operonet, den N-terminale regionen av MopE, F2-regionen av VP2-proteinet og C-terminal utskilt region av MopE. Primerne anvendt for mang-foldiggjøringene er angitt i Tabell I.

DNA-fragmenter som koder for det N- og C-terminale domenet av MopE ble mangfoldiggjort med PCR fra plasmidet pAFpglO (Fjellbirkeland et al., 2001). F2-regionen av VP2proteinet ble mangfoldiggjort fra et plasmid inneholdende det fullstendige genom av VP2 (tilveiebrakt av E. Bjering, NorBio). Den 1500 bp umiddelbare oppstrømsregionen av sMMOoperon ble mangfoldiggjort fra kromosomalt DNA. PCR-produktene ble spaltet med egnede restriksjonsenzymer, og innsatt i plasmid pJB3Kml (Blatny et al., 1997). DNA ble sekvensert ved anvendelse av ABI PRISM BigDye Terminatorsyklus - Sequencing Ready Reaction Kit og DNA-sekvensereren ved Universitetet i Bergen.

Konjugering

Konjugering mellom E. coli S17-1 (donorstamme) og M. capsulatus ble utført i hovedsak som beskrevet av Lloyd et al. (1999). 10 ml av en over-natten-kultur av E. coli S17-1 inneholdende det rekombinante/nopE-produkt ble vasket ved sentrifugering (7000 rpm i 5 min.) og resuspendert i 10 ml NMS. E. coli-suspensjonen ble blandet med 50 ml M. capsulatus (1,8 • 10<8->celler/ml; A60o=0,22) og filtrert ned på et 0,2 fi nitrocellulosefilter. Filteret ble inkubert på NMS-agarplater under en atmosfære av metan:luft:C02(48:50:2) ved 42°C i 14 t. Konjugeringen ble terminert ved risting av filteret i 10 ml NMS. For å utvelge rekombinant M. capsulatus ble 200 mm II av cellesuspen-sjonen fra punkt 4 utsådd på NMS-agarplate med 30 Il/ml kanamycin som selektivt middel. Platen ble inkubert under en atmosfære av metan:luft:C02(48:50:2) inntil synbar vekst fremkom. M. capsulatus som fikk vokse med 30 Il/ml kanamycin ble vist å inneholde plasmid med rekombinant mopE.

SDS- PAGE og Western- blotting

SDS-PAGE og Western-blotting ble utført som beskrevet tidligere (Fjellbirkeland et al., 2001). Anti-AfopE-antiserum ble produsert som beskrevet (Fjellbirkeland et al., 1997). Anti-VP2-antiserum og F2-monoklonale antistoff ble tilveiebrakt av E. Bjering, NorBio.

Differensiell fraksjonering av M . capsulatus

Ytremembraner ble isolert fra M. capsulatus som beskrevet tidligere (Fjellbirkeland et al., 1997).

Resultater

Resultatene oppnådd er gitt i figurene 1-5, hvor:

Fig. 1 viser de 2 fusjonskonstrukter klonet i Methylococcus capsulatus. Fig. 2 presenterer Western blot behandlet med antL- MopE antiserum i M. capsulatus- vekst i lav-kobbermedium. Cellene inneholdt intet plasmid (spor 1), plasmid pJB3KMl (spor 2) Konstrukt a (spor 3), og Konstrukt b (spor 4). Fig. 3 er SDS-PAGE av M. capsulatus som fikk vokse i høyt og lavt kobbermedium. Høykobber (spor 1) og lavkobbercelle (spor 2) vekst i fermentor (tilveiebrakt fra C.J. Murrell, University of Warwick). Cellene som ble kjørt i sporene 3, 4, 5 og 6 er identiske til dem i sporene 1, 2, 3 og 4 i Fig. 2, respektivt. Fig. 4 viser Western blot behandlet med anti-Mop£antiserum for M. capsulatus- vekst i høyt kobbermedium. Cellene inneholder Konstrukt b (spor 1), Konstrukt a (spor 2), plasmid pJB3KMl (spor 3), og intet plasmid (spor 4). Fig. 5 viser Western blot behandlet med anti-Mop£ antiserum av yttermembraner isolert fra M. capsulatus som fikk vokse i lavt kobbermedium-celler som inneholdt plasmid pJB3KMl (spori) og Konstrukt b (spor 2).

5'-enden av mopE- genet ble ligert til DNA som koder for F2-regionen av VP2-proteinet i IPN-viruset. F2-regionen er en konservert nøy-traliserende epitop av IPN-viruset og anses således som en viktig komponent i en potensiell subenhetsvaksine mot IPN i fisk (Frost et al., 1995). mopEenden koder den del av mopE som ikke utskilles i

vekstmediumet. Det utskilte protein starter med et glycin og spalting foregår mellom Ala204og Gly205i det modne protein (Fjellbirkeland et al., 2001). For å hindre spalting og sekresjon av IPN-peptidet, ble 2 aminosyrer i den spaltede region forandret til glycin og isoleucin, respektivt. Siden den C-terminale del av MopE utskilles, synes det sannsynlig at den N-terminale region av proteinet er ansvarlig for forankring av MopE til celleveggen. For å undersøke om det N-terminale fragment var tilstrekkelig for ytter-membrantranslokering av det heterologe passasjerpeptid, ble et delekteringsprotein sammensatt av det N-terminale ikke utskilte domenet av MopE, og virusepitopen ble konstruert (Konstrukt a, Fig. 1). I Konstrukt b (Fig. 1) ble det virale peptid innsatt mellom det N-terminale og C-terminale domenet av MopE. Dette muliggjør under-søkelser av viktigheten av den C-terminale del av MopE for membran translokering.

En DNA-sekvens korresponderende til 1500 bp umiddelbar oppstrøms-region av sMWO-operon (Stainthorpe et al., 1990) ble innsatt foran fusjonsgenene). Transkripsjon av sMMO reguleres med kobber (Nielsen et al., 1996, 1997). Således skulle det, ved å inkludere dette promotorelement være mulig å undertrykke/indusere ekspresjon av fusjonsproteinet ved å manipulere kobbernivået i vekstmediet.

Konstruktene ble ligert inn i et bredt-vert-område plasmid og klonet inn i E. coli S-17. Plasmidene ble deretter overført til M. capsulatus ved konjugering. Sekvenser bekreftet at de konjugerte plasmider inneholdt de korrekte innskudd og at PCR ikke ville resultere i muteringer av fusjonsgenene. De rekombinante celler fikk vokse i et lav-kobbermedium som forsterker sMMO-ekspresjon (Stolyar et al., 1999) og ble analysert med Western blotting. Celler som ikke inneholder plasmid, og celler som kun inneholder plasmid ble anvendt som negative kontroller. Anti-AfopE-antiserum gjenkjente et bånd korresponderende til MopE i alle celler (Fig. 2). I celler som inneholder Konstrukt b, ble 3 ytterligere bånd gjenkjent (Fig. 2, spor 4). Disse hadde omtrentlige molekylvekter av 40, 60 og 80 kDa. De beregnede molekylvekter av fusjonsproteinet av konstrukt b er 75 kDa. MopE migrerer litt over dens beregnede molekylvekt i SDS-PAGE

(Fjellbirkeland et al., 2001) og således representerer 80 kDa-båndet mest sannsynlig det fullstendige fusjonsprotein. Båndet av 40 kDa og 60 kDa kan representere trunkerte versjoner fusjonsproteinet, men deres sammensetning vil studeres mer detaljert. I celler som inneholder konstrukt a kunne intet fusjonsprotein detekteres som indikerer at den C-terminale del av MopE er viktig for stabilisering av proteinet.

Immunblotene ble også behandlet med polyklonalt og monoklonalt VP2-antiserum. Disse gjenkjente ingen av fusjonsproteinene. Dette kan skyldes de lave nivåer av fusjonsproteinet produsert av cellene. De rekombinante celler inneholder flere kopier av plasmidet og gitt at promotoren som driver ekspresjonen av fusjonsproteinet ikke er undertrykt, bør et relativt høyt nivå av rekombinant protein produseres. Det lave nivået kan således være et resultat av en lite effektiv promotor. For å undersøke dette, ble nivået av sMMO analysert med SDS-PAGE. Gelen viste at pMMO i stedet for sMMO var den dominante metanmonooksygenase produsert av cellene (Fig. 3), noe som indikerer at sMMO-promotoren var undertrykt.

Nivået av fusjonsprotein i celler som fikk vokse i høyt kobbermedium ble også analysert. På Western blot behandlet med anti-MopE-antiserum ble lave nivåer av fusjonsprotein detektert (Fig. 4). Dette forsterker ytterligere antagelsen av produksjon av fusjonsprotein av lavkobbercellene skyldes lekkasje fra en undertrykt promotor. Som sMMO-produksjon, er MopE-produksjon med kobbernivået i medium (ikke-publiserte resultater), og MopE kunne ikke detekteres i høy-kobberceller. Imidlertid kunne 40 og 80 kDa polypeptidene detekteres i celler som inneholder konstrukt b, og dette viser klart at disse polypeptider produseres fra en promotor som er forskjellig fra MopE-promotoren.

Lavkobbercellene inneholdende konstrukt b ble fraksjonert for å bestemme den cellulære lokalisering av de rekombinante polypeptider.

40 kDa båndet ble detektert i den løselige fraksjon inneholdende cytoplasmiske og periplasmiske proteiner (ikke vist). Et svakt 80 kDa-bånd ble detektert i yttermembranen og likeledes et høymole- kylært bånd som kan representere en dimer av fusjonsproteinet (Fig. 5). Imidlertid er det som følge av det lave nivået av fusjonsprotein og anrikelsen av MopE i yttermembranene vanskelig å diskriminere mellom fusjonsproteiner og MopE-aggregater i gelen.

Diskusj on

Et fusjonsprotein hvor en viral epitop er blitt innsatt mellom det N-terminale ikke-utskilte og C-terminale utskilte domenet av MopE er blitt uttrykt i M. capsulatus. sMMO-promotoren undertrykkes i lavt kobbermedium, men vekstbetingelsen anvendt i dette forsøk, synes ikke å derepressere promotoren fullstendig. Det er mulig at vekst av de rekombinante celler i en fermentor i stedet for flasker vil resultere i en mindre effektiv ekspresjon av fusjonsproteinet, siden fermentorvekst-celler omkobles mer effektivt mellom sMMO og pMMO-produksjon enn celler som vokser i flasker (Stanley et al., 1983).

Et DNA-konstrukt sammensatt kun av den N-terminale ikke-utskilte del av MopE og den virale epitop produserte ikke detekterbart fusjonsprotein. Dette indikerer at den C-terminale del av MopE er nødvendig for å oppnå et stabilt proteinprodukt. Det skal også bemerkes at fusjonsgenet av konstrukt b ble fulgt av RNA-polymerase-termi-neringssignalet i MopE. Fusjonsgenet av konstrukt a ble fulgt av plasmidsekvensen og dette kan ha resultert i ustabilt, ikke-hen-siktsmessig terminert RNA. Det er således mulig at propagering av konstrukt a i en ekspresjonsvektor vil resultere i produksjon av et stabilt fusjonsprotein. 80 kDa fusjonsproteinet synes å være transportert til den ytre membran i M. capsulatus. Som følge av anrikningen av MopE i yttermembranen og de lave nivåer av fusjonsprotein, var det imidlertid vanskelig å bestemme om de observerte høymolekylærbåndene representerte fusjonsprotein eller aggregater av MopE.

Konklusjon

Det er vist at det er mulig å uttrykke heterologe peptider i M. capsulatus ved anvendelse av det native protein MopE som en fusjonspartner. Resultatene indikerer at fusjonsproteinet transporteres til yttermembranen, men mer forskning vil være nødvendig for å være i stand til å bestemme mer spesifikt hvilke deler av MopE som er nødvendig for overflatefremvisning/sekresjon.

Referanser:

J.M. Blatny, T. Brautaset, H.C. Winther-Larsen, K. Haugan, S. Valla. Construction and use of a versatile set of broad-host-range cloning and expression vectors based on the RK2 replicon. Appl. Environ. Microbiol., (1997), vol 63, pp 370-379.

A. Fjellbirkeland, P.G. Kruger, V. Bemanian, B.T. Hogh, J.C. Murrell, H.B. Jensen. The C-terminal part of the surface-associated protein MopE of the metanotroph Metylococcus capsulatus (Bath) is secreted into the growth medium. Arch. Microbiol., (2001), vol 176, pp 197-203.

P. Frost, L.S. Havarstein, B. Lygren, S. Stahl, C. Endresen, K.E. Christie. Mapping of neutralization epitopes on infectious pancreatic necrosis viruses. J. Gen. Virol., (1995), vol 76, pp 1165-72.

J.S. Lloyd, P. De Marco, H. Dalton, J.C. Murrell. Heterologous expression of soluble methane mono-oxygenase genes in metanotrophs containing only particulate methane mono-oxygenase. Arch. Microbiol., (1999), vol 171,

pp 364-370.

A.K. Nielsen, K. Gerdes, H. Degn, J.C. Murrell. Regulation of bacterial methane oxidation: transcription of the soluble methane mono-oxygenase operon of Methylococcus capsulates (Bath) is repressed by copper ions. Microbiology., (1996), vol 142, pp 1289-1296.

A.K. Nielsen, K. Gerdes, J.C. Murrell. Copper-dependent reciprocal transcriptional regulation of methane mono-oxygenase genes in

Methylococcus capsulatus and Methylosinus trichosporium. Mol. Microbiol., (1997), vol 25, pp 399-409.

A.C. Stainthorpe, V. Lees, G.P.C. Salmond, H. Dalton, J.C. Murrell. The methane mono-oxygenase gene cluster of Methylococcus capsulatus (Bath). Gene (1990), vol 91, pp 27-34.

S.H. Stanley, S.D Prior, D.J. Leak, H. Dalton. Copper stress underlies the fundamental change in intracellular location of methane mono-oxygenase in methane-oxidizing organisms: studies in batch and continuos cultures. (1983), vol 7, pp 487-492.

S. Stolyar, A.M. Costello, T.L. Peeples, M.E. Lidstrom. Role of multiple genecopies in particulate methane mono-oxygenase activity in the methane-oxidizing bacterium Methylococcus capsulatus (Bath). Microbiology, (1999), vol 145, pp 1235-1244.

R. Whittenbury, K.C. Phillips et al., J.F. Wilkinson. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J. Gen. Microbiol., (1970), vol 61, pp 205-218.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for å produsere et ønsket protein i M. capsulatus,karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter transformering av nevnte M. capsulatus med en rekombinant vektor omfattende en første nukleotidsekvens omfattende SEKV ID NR 3, og hvor nevnte vektor omfatter en ytterligere nukleotidsekvens som koder for nevnte protein, hvor nevnte ytterligere nukleotidsekvens er operativt koblet i ramme til nevnte første nukleotidsekvens, og dyrkning av nevnte transformerte M. capsulatus i et egnet medium under betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte protein.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter trinnet å gjenvinne det uttrykte protein eller peptid fra mediet.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 2,karakterisert vedat det ønskede uttrykte protein er et medikament.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3,karakterisert vedat medikamentet ekstraheres fra nevnte M. capsulatus, eller anvendes sammen med nevnte M. capsulatusfor fremstilling av en vaksine.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 4,karakterisert vedat vaksinen er for oral administrering.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte protein eksponeres på overflaten av nevnte M. capsulatus.

7. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte ytterligere nukleotidsekvens har multiple kloningsseter, hvor nevnte multiple kloningssete er posisjonert slikt at innsetting av en tredje nukleotidsekvens inn i kloningssetet operativt kobler nevnte tredje nukleotidsekvens til nevnte første nukleotidsekvens.

8. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7,karakterisert vedat nevnte tredje nukleotidsekvens koder for et ønsket protein eller peptid.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 7,karakterisert vedat en av nevnte nukleotidsekvenser omfatter et gen som koder for en seleksjonsmarkør.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 9,karakterisert vedat nevnte seleksjonsmarkør er en antibiotisk seleksjonsmarkør.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10,karakterisert vedat nevnte seleksjonsmarkør er kanamycin.

12. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte nukleinsyre ytterligere omfatter et replikasjonsorigo som fungerer i M. capsulatus.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12,karakterisert vedat nevnte replikasjonsorigo er sMMO.

14. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12,karakterisert vedat nevnte replikasjonsorigo er pmmo.

15. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nukleotidsekvensen som koder for det ønskede protein inneholder en region som koder for et peptidområde som fungerer som et substrat for et hydrolyserende enzym i stand til å spalte det ønskede protein fra det resterende membranforankrede protein, slik at det ønskede protein utskilles til dyrkningsmedium.

16. Fremgangsmåte i samsvar med krav 15,karakterisert vedat den rekombinante vektor er et plasmid.

17. Fremgangsmåte i samsvar med krav 16,karakterisert vedat vektoren er plasmidet pAFpglO.

18. Fusjonsprotein,karakterisert ved at det inneholder et protein- eller peptidsekvens som kodes for, av en nukleotidsekvens omfattende SEKV ID NR 3, og et ytterligere ønsket protein eller peptid.

19. Fusjonsprotein i samsvar med krav 18,karakterisert vedat nevnte fusjonsprotein er et overflateeksponert protein.

20. Fusjonsprotein i samsvar med krav 18,karakterisert vedat nevnte protein er et medikament.

21. Fusjonsprotein i samsvar med krav 18,karakterisert vedat nevnte protein er et antigen, eller et antistoff.