NO331826B1 - Nukleotidsekvens, vektor, protein, farmasoytisk preparat, intradermal avleveringsanordning, samt fremgangsmate for fremstilling av en nukleotidsekvens. - Google Patents

Nukleotidsekvens, vektor, protein, farmasoytisk preparat, intradermal avleveringsanordning, samt fremgangsmate for fremstilling av en nukleotidsekvens. Download PDF

Info

Publication number
NO331826B1
NO331826B1 NO20041157A NO20041157A NO331826B1 NO 331826 B1 NO331826 B1 NO 331826B1 NO 20041157 A NO20041157 A NO 20041157A NO 20041157 A NO20041157 A NO 20041157A NO 331826 B1 NO331826 B1 NO 331826B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
nucleotide sequence
protein
gene
gag
sec
Prior art date
Application number
NO20041157A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20041157L (no
Inventor
Peter Franz Ertl
Gerald Wayne Gough
John Philip Tite
Andrew Beaton
Andrew Lear
Original Assignee
Glaxo Group Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/GB2001/004207 external-priority patent/WO2002024225A1/en
Priority claimed from GB0129604A external-priority patent/GB0129604D0/en
Priority claimed from GB0206462A external-priority patent/GB0206462D0/en
Application filed by Glaxo Group Ltd filed Critical Glaxo Group Ltd
Publication of NO20041157L publication Critical patent/NO20041157L/no
Publication of NO331826B1 publication Critical patent/NO331826B1/no

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Det beskrives en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 gag-protein eller fragment derav inneholdende en gag-epitop og et andre HIV-antigen eller et fragment som koder for en epitop av nevnte andre HIV-antigen, operativt koblet til en heterolog promoter. Foretrukne polynukleotidsekvenser koder dessuten for nef eller et fragment derav, og RT eller et fragment derav.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en nukleotidsekvens, en vektor som omfatter nevnte nukleotidsekvens, et protein som kodes for av nevnte nukleotidsekvens, et farmasøytisk preparat som omfatter nevnte nukleotidsekvens, en intradermal avleveringsanordning som omfatter nevnte farmasøytiske preparat, samt en fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen.
Vaksineformuleringer som omfatter slike nukleinsyrekonstruksjoner og anvendelsen av slike formuleringer innen medisinen er beskrevet, særlig DNA-vaksiner som er anvendelige ved forebyggelse og behandling av HIV-infeksjoner, nærmere bestemt når slike administreres ved partikkel-mediert avlevering.
HIV-1 er hovedårsaken til AIDS (tilegnet immunsviktsyndrom) som ansees som ett av verdens hovedhelseproblem. Selv om det har vært gjennomført omfattende forskning over hele verden for å frembringe en vaksine, har slike anstrengelser hittil ikke vært vellykkede.
Ikke-kappe-proteiner av HIV-1 har vært beskrevet og inkluderer for eksempel interne strukturproteiner, så som produktene av gag- og po/-genene og andre ikke-strukturelle proteiner, så som Rev, Nef, Vif og Tat (Green et al., New England J. Med. 324, 5, 308 et seq (1991) og Bryant et al., (red. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq (1992).
Gag-genet translateres fra full-lengde RNA under dannelse av et forløper-polyprotein som deretter spaltes i 3-5 kapsidproteiner; matriksproteinet, kapsid-proteinet og nukleinsyre-bindingsprotein og protease. (1. Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM & Howley M, 1996 2. Fields Virology Bd. 2, 1996).
Kotsopoulou E. Et al. A rev-independent human immunodeficiency virus type
1 (HIV-1 )-based vector that exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pl gene. Journal of virology. 2000, Vol. 74, No. 10, page 4839-4852 lærer kodon-optimaliserte sekvenser for HIV polyproteinet (gag-pol).
WO 0039302 A (CHIRON CORP)2000.07.06 lærer forskjellige gag-protease fusjoner og muterte env eller tat gener.
Genet gag forårsaker det 55-kilodalton (kD) Gag-forløperprotein, også kalt p55, som uttrykkes fra den uspleisede virale mRNA. Under translasjon myristoyleres N-terminalen av p55, som utløser dets assosiasjon med det cytoplasmatiske aspekt ved cellemembraner. Det membran-assosierte Gag-polyprotein rekrutterer to kopier av den virale genomiske RNA sammen med andre virale og cellulære proteiner som utløser avsnøringen av viruspartikkelen fra overflaten av en infisert celle. Etter avsnøring spaltes p55 av den viralt kodede protease (et produkt av pol-genet) under den virale modningsprosess, i fire mindre proteiner betegnet MA (matriks [p17], CA (kapsid [p24], NC (nukleokapsid [p9] og p6. (4).
I tillegg til de tre Gag-hovedproteinene, inneholder alle Gag-forløpere diverse andre regioner som spaltes av, og forblir i, virionet som peptider av ulike størrelser. Disse proteinene har forskjellige roller, f.eks. har p2-proteinet vært angitt å ha en rolle innen den regulerende aktivitet av proteasen og til å bidra til den riktige tids-tilpasning av proteolytisk prosessering.
MA-polypeptidet avledes fra den N-terminale myristoylerte ende av p55. De fleste MA-molekyler forblir forbundet med den indre overflate av virionets lipid-dobbeltlag, hvilket stabiliserer partikkelen. Et subsett av MA rekrutteres inne i de dypere lag av virionet, hvor det blir del av det kompleks som ledsager den virale DNA til kjernen (5). Disse MA-molekylene letter nukleærtransporten av det virale genom fordi et karyofilt signal på MA gjenkjennes av det cellulære nukleære importmaskineri. Dette fenomen lar HIV infisere ikke-delende celler, en uvanlig egenskap ved et retrovirus.
Proteinet p24 (CA) danner den koniske kjerne av viruspartikler. Cyklofilin A har vært vist å interagere med p24-regionen av p55, hvilket fører til dets inkorporering i HIV-partikler. Interaksjonen mellom Gag og cyklofilin A er essensiell fordi forstyrrelse av denne interaksjon med cyklosporin A inhiberer viral replikasjon.
NC-regionen av Gag er ansvarlig for spesifikk gjenkjenning av det såkalte HIV-pakkingssignal. Pakkingssignalet består av fire stem loop strukturer lokalisert nær 5'-enden av den virale RNA, og er tilstrekkelig til å mediere inkorporeringen av en heterolog RNA i HIV-1 virioner. NC binder til pakkingssignalet gjennom interaksjoner mediert av to Zinkfinger-motiver. NC letter også revers transkripsjon.
Polypeptidregionen p6 medierer interaksjoner mellom p55 Gag og hjelpe-proteinet Vpr, som fører til inkorporeringen av Vpr i sammensettende virioner. Regionen p6 inneholder også et såkalt sent domene som fordres for den effektive frigjøring av avsnørende virioner fra en infisert celle.
Pol-genet koder for to proteiner som inneholder de to aktiviteter som viruset trenger ved tidlig infeksjon, nemlig RT og integraseproteinet som trengs for integrering av viral DNA i celle-DNA. Primærproduktet av Pol avspaltes av virion-proteasen for å gi det aminoterminale RT-peptid som inneholder nødvendige aktiviteter for DNA-syntese (RNA- og DNA-rettet DNA-polymerase, ribonuklease H) og karboksyterminalt integraseprotein.
HIV RT er en heterodimer av full-lengde RT (p66) og et spaltningsprodukt (p51) som mangler det karboksyterminale Rnase-integrase-domenet.
RT er en av de sterkest konserverte proteiner som kodes av det retrovirale genom. To hovedaktiviteter av RT er DNA Pol og ribonuklease H. DNA Pol-aktiviteten av RT benytter RNA og DNA som templater om hverandre, og er som alle kjente DNA-polymeraser ikke i stand til å initiere DNA-syntese de novo, men fordrer et på forhånd eksisterende molekyl for å tjene som en primer (RNA).
Den iboende Rnase H aktivitet i alle RT-proteiner spiller den vesentlige rolle tidlig i replikasjonen ved å fjerne RNA-genomet etter som DNA-syntesen skrider frem. Den nedbryter selektivt RNA fra alle RNA-DNA-hybridmolekyler. Strukturelt opptar polymerasen og ribo H separate, ikke-overlappende domener hvor Pol dekker to tredjedeler av aminoenden av Pol.
Den p66-katalytiske subenhet foldes i 5 distinkte subdomener. De 23 aminoterminale av disse har delen med RT-aktivitet. Karboksyenden av disse er Rnase H domenet.
Etter infeksjon av vertscellen kopieres det retrovirale RNA-genom inn i lineær ds DNA med den reverse transkriptase som er tilstede i den infiserende partikkel. Integrasen (omtalt i Skalka AM '99 Adv in Virus Res. 52 271-273) gjenkjenner endene av den virale DNA, trimmer disse og ledsager den virale DNA til et verts-kromosomalt sete for å katalysere integrasjon. Mange seter i vertens DNA kan mål-søkes for integrasjon. Selv om integrasen er tilstrekkelig til å katalysere integrasjon in vitro, er det ikke det eneste protein assosiert med den virale DNA in vivo. Det store protein, viralt DNA-kompleks, isolert fra de infiserte cellene har vært betegnet pre-integrasjonskomplekset. Dette letter tilegnelsen av vertscellegenene med avkommets virale genomer.
Integrasen dannes av 3 distinkte domener, det N-terminale domene, den katalytiske kjerne og det C-terminale domene. Det katalytiske kjernedomenet inneholder alt som fordres for polynukleotidyl-overføringens kjemi.
Nef-proteinet fjerner som kjent CD4, HIV-reseptoren, fra celleoverflaten, men den biologiske betydning av denne funksjon er under diskusjon. Dessuten inter-agerer Nef med signalveien til T-celler og induserer en aktiv tilstand, som i sin tur kan fremme mer effektiv genekspresjon. Enkelte HIV-isolater har mutasjoner i dette området som bevirker at de ikke koder for funksjonelt protein og er alvorlig hemmet i deres replikasjon og patogenese in vivo.
DNA-vaksiner består vanligvis av en bakteriell plasmidvektor som det er inn-ført en sterk promoter i, genet av interesse som koder for et antigent peptid, og polyadenylerings/transkripsjonelle termineringssekvenser. Genet av interesse kan kode for et fullt protein eller ganske enkelt en antigen peptidsekvens relatert til patogenet, tumoren eller annet agens som det er ment å beskyttes mot. Plasmidet kan dyrkes i bakterier som for eksempel E. coli, og deretter isoleres og tilberedes i et passende medium, avhengig av den tiltenkte administrasjonsmåte, før det administreres til verten. Etter administrering tas plasmidet opp av vertens celler, hvor det kodede peptid produseres. Plasmidvektoren vil fortrinnsvis være fremstillet uten et replikasjonsorigo som er funksjonelt i eukaryote celler, for å forhindre plasmid-replikasjon i pattedyrverten og integrasjon i kromosomalt DNA til vedkommende dyr.
Det finnes en rekke fordeler ved DNA-vaksinasjon i forhold til tradisjonelle
vaksinasjonsteknikker. For det første forventes det siden de proteiner som kodes av DNA-sekvensen syntetiseres i verten, at strukturen eller konformasjonen av proteinet vil tilsvare det naturlige protein som er assosiert med sykdomstilstanden. Det er også sannsynlig at DNA-vaksinasjon vil gi beskyttelse mot forskjellige stammer av et virus ved å frembringe cytotoksiske T-lymfocyttresponser som gjenkjenner epitoper fra konserverte proteiner. Siden plasmidene tas opp av de vertsceller hvor det kan produseres antigent protein, vil det dessuten utløses en langvarig immunrespons. Teknologien byr også på den mulighet å kombinere diverse immunogener i et enkelt preparat for å lette samtidig immunisering med relasjon til en rekke sykdoms-tilstander.
Nyttig bakgrunnsinformasjon med relasjon til DNA-vaksinasjon er gitt i Donnelly et al. "DNA vaccines" Ann. Rev. Immunol. 1997 15:617-648.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en nukleotidsekvens som omfatter en sekvens som koder for et immunogenisk fusjonsprotein som omfatter et kodon optimalisert HIV-1 gag-protein, et kodon optimalisert RT protein og et HIV-1 Nef protein, operativt koblet til en heterolog promoter, hvori gag proteinet omfatter p17 og p24, RT proteinet inneholder en mutasjon for i alt vesentlig å inaktivere en hvilken som helst revers transkriptase aktivitet, og Nef proteinet inneholder en N-terminal trunkering.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en vektor som omfatter en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen tilveiebringer også et protein som kodes for av en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som omfatter en nukleotidsekvens eller en vektor ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, fortynningsmiddel, bærer eller adjuvans.
Oppfinnelsen tilveiebringer også en intradermal avleveringsanordning, som omfatter et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen.
Endelig tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen som omfatter operativ kobling av en nukleotidsekvens som koder for HIV-1 gag-protein eller fragment derav og et HIV-1 Nef-protein eller fragment derav, til en heterolog promotersekvens.
Det er beskrevet et nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleotidsekvens som koder for HIV gag-protein, eller fragment derav, koblet til en nukleotidsekvens som koder for et ytterligere HIV-antigen, eller fragment derav, og som operativt er koblet til en heterolog promoter. Fragmentet av nevnte nukleotidsekvens vil kode for en HIV-epitop og koder typisk for et peptid på minst 8 aminosyrer. Nukleotidsekvensen er fortrinnsvis en DNA-sekvens og inngår fortrinnsvis i et plasmid uten et replikasjonsorigo. Slike nukleinsyremolekyler formuleres med farmasøytisk akseptable hjelpestoffer, bærere, fortynningsmidler eller adjuvanser for fremstilling av en farmasøytisk blanding egnet for behandlingen og/eller forebyggelsen av HIV-infeksjon og AIDS.
Foretrukket formuleres DNA-sekvensen på overflaten av inerte partikler eller kuler egnet for partikkelmediert medikamentavlevering. Fortrinnsvis er kulene av gull.
Det tilveiebringes en DNA-sekvens som høyt uttrykt koder for gag-protein, en sekvens som optimaliseres for å ligne kodonanvendelsen av gener i pattedyrceller. Særlig optimaliseres gag-proteinet for å gi likhet med det til høyt uttrykte humane gener.
DNA-koden har 4 bokstaver (A, T, C og G) og benytter disse til å stave tre-bokstavs "kodoner" som representerer aminosyrene i proteiner som kodes av en organismes gener. Den lineære sekvens av kodoner langs DNA-molekylet translateres til den lineære sekvens av aminosyrer i de proteiner som kodes av disse genene. Koden er sterkt degenerert, med 61 kodoner som koder for de 20 naturlig forekommende aminosyrer og 3 kodoner som representerer "stop<p>signaler. De fleste aminosyrer kodes således av mer en ett kodon - faktisk kodes flere av fire eller flere forskjellige kodoner.
Når mer enn ett kodon er tilgjengelig til koding av en gitt aminosyre, har det vært observert at organismers mønster for kodonanvendelse i høy grad ikke er vilkårlig. Ulike arter oppviser en forskjellig forfordeling i deres kodonvalg, og kodonanvendelsen kan i en enkelt art være klart forskjellig mellom gener som uttrykkes i høye og lave nivåer. Denne forfordeling er forskjellig i virus-, plante-, bakterie- og pattedyrceller, og enkelte arter oppviser en sterkere forfordeling bort fra tilfeldig kodonvalg enn andre. For eksempel skjer mindre sterk forfordeling hos mennesker og andre pattedyr enn hos enkelte bakterier eller virus. Det er av disse grunner en signifikant sannsynlighet for at et pattedyrgen uttrykt i E. coli eller et fremmed eller rekombinant gen uttrykt i pattedyrceller, vil ha en upassende fordeling av kodoner for effektiv ekspresjon. I en heterolog DNA-sekvens antas det at nærværet av ansamlinger (dusters) av kodoner eller en rikelighet av kodoner som sjeldent observeres i den vert hvor ekspresjon skal skje, er prediktiv for lave heterologe ekspresjonsnivåer i vedkommende vert.
Det er beskrevet en gag polynukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens, hvor kodonanvendelsesmønsteret for polynukleotidsekvensen ligner det for høyt uttrykte pattedyrgener. Fortrinnsvis er polynukleotidsekvensen en DNA-sekvens. Det er ønskelig at kodonanvendelsesmønsteret av polynukleotidsekvensen typisk er av høyt uttrykte humangener.
I polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse er kodonanvendelses-mønsteret endret fra det typiske for humane immunsviktvirus til nærmere å representere kodon-forfordelingen av målorganismen, f.eks. et pattedyr, spesielt et menneske. "Kodonanvendelseskoeffisienten" er et mål på hvor sterkt kodon-mønsteret av en gitt polynukleotidsekvens ligner det for en tilsiktet art. Kodon-frekvenser kan avledes fra litteraturkilder for de høyt uttrykte genene til mange arter (se f.eks. Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). Kodon-frekvensene for hver av de 61 kodonene (uttrykt som det antall forekomster som forekommer per 1000 kodoner av den valgte klasse av gener) er normalisert for hver av de tyve naturlige aminosyrene, slik at verdien for det hyppigst anvendte kodon for hver aminosyre er satt til 1, og frekvensene for de mindre vanlige kodonene er anbragt på en skala mellom null og 1. Hver av de 61 kodonene tilordnes således en verdi på 1 eller mindre for de høyt uttrykte gener til de tilsiktede arter. For å beregne en kodonanvendelseskoeffisient for et bestemt polynukleotid, i forhold til de høyt uttrykte gener av vedkommende art, registreres den skalerte verdi for hvert kodon av det bestemte polynukleotid, hvorpå det geometriske middel av alle disse verdiene tas (ved å dividere summen av de naturlige logaritmer av disse verdier med det totale antall kodoner og benytte anti-log-verdien). Koeffisienten vil ha en verdi mellom null og 1 og jo høyere koeffisient dess flere kodoner i polynukleotidet er hyppig benyttede kodoner. Dersom en polynukleotidsekvens har en kodonanvendelseskoeffisient på 1, er alle kodonene "mest hyppige" kodoner for høyt uttrykte gener av de tilsiktede arter.
Kodonanvendelsesmønsteret for polynukleotidet vil fortrinnsvis utelukke kodoner med en RSCU-verdi på mindre enn 0,2 i høyt uttrykte gener i målorganismen. Alternativt vil kodonanvendelsesmønsteret utelukke kodoner som representerer <10% av de kodoner som benyttes for en bestemt aminosyre. En RSCU- (relative synonymous codon usage) verdi er det observerte antall kodoner dividert med det forventede antall dersom alle kodoner for vedkommende aminosyre ble benyttet like hyppig. Et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse vil i alminnelighet ha en kodonanvendelseskoeffisient (eller RSCU) for høyt uttrykte humangener på mer enn 0,3, fortrinnsvis mer enn 0,4, mest foretrukket mer enn 0,5. Kodonanvendelsestabeller for mennesker finnes også i Genebank.
Til sammenligning har et høyt uttrykt beta-aktingen en RSCU på 0,747. Kodonanvendelsestabellen for homo sapiens er angitt nedenfor:
Kodonanvendelsestabell 1:
Homo sapiens [ gbpril] : 27143 CDS (12816923 kodoner)
felt: [triplett] [frekvens: per tusen] ([antall])
Kodende GC 52,51% 1.bokstav GC 56,04% 2.bokstav, GC 42,35% 3.bokstav GC 59,13%.
Kodonanvendelsestabell 2 (foretrukket):
Kodonanvendelse for humangener (sterkt uttrykt) 1/24/91 (human_high.cod)
I henhold til et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en ekspresjonsvektor som omfatter, og er i stand til å styre ekspresjonen av en polynukleotidsekvens i henhold til det første aspekt ved oppfinnelsen, særlig er kodon-anvendelsesmønsteret av gag polynukleotidsekvensen typisk for høyt uttrykte pattedyrgener, fortrinnsvis høyt uttrykte humangener. Vektoren kan være egnet for å styre ekspresjon av heterolog DNA i bakterie-, insekt- eller pattedyrceller, særlig humanceller. I én utførelsesform er ekspresjonsvektoren p7313 (se Figur 1).
Foretrukket koder ikke gag-genet for gag p6-peptidet. NEF-genet er trunkert for å fjerne sekvensen som koder for den N-terminale region, dvs. fjerning av 30-85, fortrinnsvis 60-85, typisk ca. 81, fortrinnsvis de N-terminale 65 aminosyrene.
RT-genet er også optimalisert for å ligne et høyt uttrykt humangen. RT koder fortrinnsvis for en mutasjon for i det vesentlige å inaktivere enhver revers transkriptaseaktivitet. En foretrukket inaktiveringsmutasjon involverer bruk av W-tryptofan 229 i stedet for K (lysin).
Det kan tilveiebringes en vertscelle som omfatter en polynukleotidsekvens i henhold til oppfinnelsen eller en ekspresjonsvektor i henhold til oppfinnelsen. Vertscellen kan være bakteriell, f.eks. E. coli, pattedyr, f.eks. menneske, eller være en insektcelle. Pattedyrceller som omfatter en vektor i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være dyrkede celler transfektert in vitro eller transfektert in vivo ved administrering av vektoren til pattedyret.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et farmasøytisk preparat som omfatter en polynukleotidsekvens i henhold til oppfinnelsen. Fortrinnsvis omfatter preparatet en DNA-vektor. Foretrukket omfatter preparatet en pluralitet av partikler, fortrinnsvis gullpartikler, belagt med DNA som omfatter en vektor som koder for en polynukleotidsekvens ifølge oppfinnelsen. Fortrinnsvis koder sekvensen for en HIV gag aminosyresekvens, hvor kodonanvendelsesmønsteret av polynukleotidsekvensen er typisk for høyt uttrykte pattedyrgener, særlig humangener. I alternative utførelsesformer omfatter blandingen et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff og en DNA-vektor i henhold til det andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse. Blandingen kan også innbefatte en adjuvans.
Vektorene kan benyttes med immunstimulerende midler. Fortrinnsvis administreres det immunstimulerende middel samtidig med nukleinsyrevektoren ifølge oppfinnelsen, og formuleres foretrukket sammen. Slike immunstimulerende midler innbefatter, men denne liste er ikke på noen måte uttømmende og utelukker ikke andre midler: syntetiske imidazokinoliner som imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison et al. "Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine", Vaccine 19:1820-1826, (2001)); and resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos et al. «Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN», Cellular immunology 204:64-74 (2000).), Schiffske baser av karbonylgrupper og aminer som konstitutivt uttrykkes på antigenpresenterende celler og T-celleoverflater, så som tucaresol (Rhodes, J. et al. "Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs", Nature 377:71-75 (1995)), cytokin, kjemokin og kostimulerende molekyler som enten protein eller peptid, hvilket ville inkludere proinflammatoriske cytokiner så som GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa og TGF-beta, Th1 indusere så som interferon gamma, IL-2, IL-12, IL-15 og IL-18, Th2 indusere så som IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 og IL-13 og andre kjemokin- og kostimulerende gener så som MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 og CD40L, andre immunstimulerende målsøkende ligander så som CTLA-4 og L-selektin, apoptose-stimulerende proteiner og peptider så som Fas (49), syntetiske lipidbaserte adjuvanser så som vaxfectin, (Reyes et al., "Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization", Vaccine 19:3778-3786), skvalen, alfa-tokoferol, polysorbat 80, DOPC og kolesterol, endotoksin, [LPS], Beutler, B., "Endotoxin, "Toll-like receptor4, and the afferent limb of innate immunity", Current Opinion in Microbiology 3:23-30 (2000)); CpG oligo- og dinukleotider, Sato, Y. et al., "Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization", Science 273 (5273):352-354
(1996). Hemmi, H. et al., "Atoll-like receptor recognizes bacterial DNA", Nature 408:740-745, (2000) og andre potensielle ligander som utløser Toll-reseptorer for å frembringe Th 1-induserende cytokiner, så som syntetiske mykobakterielle lipo-proteiner, mykobakterielt protein p19, peptidoglykan, teikoinsyre og lipid A.
Enkelte foretrukne adjuvanser for utløsning av en hovedsakelig Th1-type respons innbefatter for eksempel et lipid A-derivat, så som monofosforyl lipid A, eller fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyl lipid A. MPL® adjuvanser er tilgjengelige fra Corixa Corporation (Seattle, WA; se for eksempel US-patent 4.436.727; 4.877.611;
4.866.034 og 4.912.094). CpG-holdige oligonukleotider (hvor CpG-dinukleotidet er umetylert) induserer også en hovedsakelig Th1-respons. Slike oligonukleotider er velkjente og er beskrevet for eksempel i WO 96/02555, WO 99/33488 og US-patent 6.008.200 og 5.856.462. Immunstimulerende DNA-sekvenser er også beskrevet, for eksempel av Sato et al., Science 273:352, 1996. En annen foretrukket adjuvans omfatter et saponin som f.eks. Quil A, eller derivater derav, inklusivt QS21 og QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin:Digitonin; eller Gypsophila eller Chenopodium quinoa saponiner.
Ved oppfinnelsen muliggjøres også anvendelsen av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen eller en vektor ifølge oppfinnelsen, ved behandlingen eller forebyggelse av en HIV-infeksjon.
Fremgangsmåter for behandling eller forhindring av HIV-infeksjoner, eventuelle symptomer eller sykdommer assosiert med slike er beskrevet, som omfatter administrering av en effektiv mengde av et polynukleotid, en vektor eller et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen. Administrering av et farmasøytisk preparat kan skje i form av én eller flere individuelle doser, for eksempel som gjentatte doser av det samme DNA-plasmid eller i et "prime-boost" terapeutisk vaksinasjonsregime. I enkelte tilfeller kan "prime" vaksinasjonen være via partikkel-mediert DNA-avlevering av et polynukleotid i henhold til foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis inkorporert i en plasmid-avledet vektor, og "boost" ved administrering av en rekombinant viral vektor som omfatter den samme polynukleotidsekvens, eller ved å gi boosterdosen med proteinet i adjuvans. Omvendt kan primingen være med den virale vektor eller med en proteinformulering, i alminnelighet et protein formulert i adjuvans, og boosterdosen en DNA-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse. Det kan benyttes flere doser av primer og/eller booster.
Fragmenter av gag, nef eller RT-proteiner kan være aktuelle. For eksempel kan et polynukleotid ifølge oppfinnelsen kode for et fragment av HIV gag, nef eller RT protein. Et polynukleotid som koder for et fragment av minst 8, for eksempel 8-10 aminosyrer eller opp til 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 eller 200 aminosyrers lengde ansees å falle innenfor rammen av oppfinnelsen så lenge det kodede oligo- eller polypeptid oppviser HIV-antigenitet. Særlig, men ikke utelukkende, omfatter dette den situasjon hvor polynukleotidet koder for et fragment av en komplett HIV-proteinsekvens, og kan representere én eller flere diskrete epitoper av vedkommende protein. Slike fragmenter kan kodonoptimaliseres slik at fragmentet har et kodonanvendelsesmønster som ligner det for et høyt uttrykt pattedyrgen.
Foretrukne konstruksjoner inkluderer:
1. p17, p24, fusjonert til trunkert NEF (som mangler nukleotider som koder for terminale aminosyrer 1-65) 2. p17, p24, RT, trunkert NEF (som mangler nukleotider som koder for terminale aminosyrer 1-65) 3. p17, p24 (optimalisert gag) trunkert NEF (som mangler nukleotider som koder for terminale aminosyrer 1-65) 4. p17, p24 (optimalisert gag) RT (optimalisert) trunkert NEF (som mangler nukleotider som koder for terminale aminosyrer 1-85) 5. p17, p24, RT (optimalisert) trunkert NEF (som mangler nukleotider som koder for terminale aminosyrer 1-65) 6. Trunkert NEF - (som mangler nukleotid 1-65) fusjonert til optimalisert p17, p24 gag. 7. Særlig foretrukne konstruksjoner ifølge oppfinnelsen inkluderer trippel-fusjonene RT-NEF-Gag og RT-Gag-Nef, særlig:
8. Optimalisert RT, trunkert NEF og optimalisert p17, p24 (gag) (RNG) og
9. Optimalisert RT, optimalisert p17, 24 (gag), Nef trunkert (mangler aminosyrene 1-65) RGN
Det er å foretrekke at HIV-konstruksjonene er avledet fra en HIV "Clade B" eller "Clade C", særlig "Clade B".
Som omtalt ovenfor inkluderer foreliggende oppfinnelse ekspresjonsvektorer som omfatter nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen. Slike ekspresjonsvektorer konstrueres rutinemessig på feltet molekylær biologi, og kan for eksempel involvere anvendelsen av plasmid DNA og passende initiatorer, promotere, enhancere og andre elementer, som for eksempel polyadenyleringssignaler som kan være nød-vendige og som er anbrakt i den riktige orientering, for å muliggjøre protein-ekspresjon. Andre egnede vektorer vil være åpenbare for fagmannen. I henhold til et ytterligere eksempel i så henseende viser vi til Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2. utg. CSH Laboratory Press, (1989).
Fortrinnsvis kobles et polynukleotid ifølge oppfinnelsen eller for bruk i oppfinnelsen, i en vektor, operativt til en kontrollsekvens som kan sørge for ekspresjonen av den kodende sekvens i vertscellen, dvs. vektoren er en ekspresjonsvektor. Betegnelsen "operativt koblet" refererer seg til en posisjonering ved siden av hverandre, hvor de beskrevne komponenter står i et forhold som lar dem virke på tiltenkt måte. En regulatorsekvens, som f.eks. en promoter, "operativt koblet" til en kodende sekvens er posisjonert på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er forenelige med regulator-sekvensen.
Vektorene kan for eksempel være plasmider, kunstige kromosomer (f.eks. BAC, PAC, YAC), virus eller fagvektorer forsynt med et replikasjonsorigo, eventuelt en promoter for ekspresjonen av polynukleotidet og eventuelt en regulator av promoteren. Vektorene kan inneholde ett eller flere selekterbare markørgener, for eksempel et ampicillin- eller kanamycinresistens-gen når det er tale om et bakterielt plasmid, eller et resistensgen for en soppvektor. Vektorer kan benyttes in vitro, for eksempel for fremstillingen av DNA eller RNA eller benyttes til å transfektere eller transformere en vertscelle, for eksempel en pattedyr-vertscelle, f.eks. for fremstillingen av protein som kodes av vektoren. Vektorene kan også tilpasses anvendelse in vivo, for eksempel i en fremgangsmåte for DNA-vaksinasjon eller for genterapi.
Promotere og andre ekspresjonsreguleringssignaler kan velges slik at de er forlikelige med den vertscelle som ekspresjonen er beregnet for.
For eksempel kan pattedyr-promotere inkludere metallotionein-promoteren som kan induseres som respons på tungmetaller, som f.eks. kadmium, og (3-aktin promoteren. Virale promotere så som den SV40 store T-antigen-promoteren, humant cytomegalovirus (CMV) umiddelbart tidlige (IE) promoteren, Rous' sarcoma virus LTR-promoter, adenovirus promoter eller en HPV-promoter, særlig den HPV oppstrøms regulerende region (URR) kan også benyttes. Alle disse promoterene er grundig beskrevet og lett tilgjengelige på området.
Et foretrukket promoterelement er den CMV umiddelbart tidlige promoter, uten intron A, men inklusivt ekson 1. Promoterelementet kan være det minimale promoterelement eller den forsterkede promoter, hvorav den forsterkede promoter fore-trekkes. Det tilveiebringes følgelig en vektor som omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen under kontroll av HCMV 1E tidlige promoter.
Eksempler på egnede virale vektorer er herpes simplex virale vektorer, vaccinia eller alfavirus-vektorer og retrovirus, inklusivt lentivirus, adenovirus og adenoassosiert virus. Genoverføringsteknikker som gjør bruk av disse virus er kjent for fagmannen. Retrovirus-vektorer kan for eksempel benyttes til stabilt å integrere polynukleotidet ifølge oppfinnelsen i vertsgenomet, selv om slik rekombinasjon ikke er å foretrekke. Replikasjonsdefekte adenovirus-vektorer forblir derimot episomale og vil derfor tillate transient ekspresjon. Vektorer som er i stand til å styre ekspresjon i insektceller (for eksempel baculovirus-vektorer), i humanceller, gjær eller i bakterier, kan benyttes for å produsere mengder av det HIV-protein som kodes av polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel for bruk som subunit-vaksiner eller i immunoassays.
Polynukleotidene i henhold til oppfinnelsen kan benyttes i produksjonen ved ekspresjon av de kodede proteiner, hvor ekspresjon kan skje in vitro, in vivo eller ex vivo. Nukleotidene kan derfor være involvert i rekombinant proteinsyntese, for eksempel for å øke utbytter, eller kan faktisk finne anvendelse som terapeutiske midler i egen kraft, benyttet i DNA-vaksinasjonsteknikker. Når polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse benyttes ved fremstillingen av de kodede proteiner in vitro eller ex vivo, vil celler, for eksempel i cellekultur, bli modifisert til å inkludere det polynukleotid som skal uttrykkes. Slike celler inkluderer transiente eller fortrinnsvis stabile, pattedyrcellelinjer. Spesielle eksempler på celler som kan modifiseres ved innføring av vektorer som koder for et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, innbefatter pattedyr HEK293T-, CHO-, HeLa-, 293- og COS-celler. Fortrinnsvis vil celle-linjen som velges være en som ikke bare er stabil, men som også tillater moden glykosylering og celleoverflateekspresjon av et polypeptid. Ekspresjon kan oppnås i transformerte oocytter. Et polypeptid kan uttrykkes fra et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, i celler fra et transgent dyr utenom mennesket, fortrinnsvis en mus. Et transgent dyr utenom mennesket som uttrykker et polypeptid fra et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, faller inn under rammen for oppfinnelsen.
En fremgangsmåte for vaksinering av et pattedyr er beskrevet, som omfatter administrering av en effektiv mengde av en slik vaksine eller vaksineblanding. Mest foretrukket vil ekspresjonsvektorer for bruk i DNA-vaksiner, vaksineblandinger og immunterapeutiske midler være plasmidvektorer.
DNA-vaksiner kan administreres i form av "naken DNA", for eksempel i en flytende formulering, administrert ved å benytte en sprøyte eller høytrykksstråle, eller DNA-formulert med liposomer eller en irriterende transfeksjons-forsterker eller ved partikkelmediert DNA-mediert avlevering (PMDD). Alle disse avleveringssystemene er velkjente på området. Vektoren kan føres inn i et pattedyr, for eksempel ved hjelp av et viralt vektoravleveringssystem.
Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan avgis ved hjelp av en rekke administrasjonsmåter, så som intramuskulært, subkutant, intraperitonealt, intra-venøst eller mukosalt.
Foretrukket administreres preparatet intradermalt. Spesielt avleveres preparatet ved hjelp av en genkanon, særlig ved partikkelbombardement som innebærer at vektoren belegges på en kule (f.eks. gull) som deretter administreres under høyt trykk inn i epidermis; som for eksempel beskrevet i Haynes et al., J. Biotechnology 44:37-42 (1996).
I ett illustrerende eksempel kan det oppnås gassdrevet partikkelakselerasjon med anordninger fremstillet av Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) og Powderject Vaccines Inc. (Madison, Wl), hvorav enkelte eksempler er beskrevet i US-patent 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807 og i EP patent nr. 0500 799. Denne fremgangsmåte byr på en nålfri avleveringsmåte, hvor en tørrpulver-formulering av mikroskopiske partikler, så som polynukleotid, akselereres til høy hastighet i en helium gass-stråle utviklet av en manuell anordning, hvor partiklene drives inn i et målvev av interesse, i alminnelighet huden. Partiklene er fortrinnsvis gullkuler med en 0,4-4,0^m, mer foretrukket 0,6-2,0^m diameter som DNA-konjugatet er belagt på og som så er innkapslet i en patron eller kassett for anbringelse i "genkanonen".
Andre anordninger og fremgangsmåter som kan være egnet for gassdrevet nålfri injeksjon av preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte dem som leveres av Bioject, Inc. (Portland, OR), hvorav enkelte eksempler er beskrevet i US- patent 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 og 5.993.412.
Vektorene som omfatter de nukleotidsekvenser som koder for antigene peptider, administreres i en mengde som vil være profylaktisk eller terapeutisk effektiv. Mengden som administreres ligger i alminnelighet i området fra 1 pikogram til 1 milligram, fortrinnsvis 1 pikogram til 10 mikrogram for partikkelmediert avlevering, og 100 nanogram til 1 milligram, fortrinnsvis 10 mikrogram til 1 milligram forandre administrasjonsmåter, nukleotid per dose. Den nøyaktige mengde kan variere betydelig avhengig av vekten av pasienten som immuniseres og av administrasjonsmåten.
Det er mulig å administrere den immunogenkomponent som omfatter nukleotidsekvensen som koder for det antigene peptid, som en engangsoperasjon eller å foreta administreringen gjentatt, for eksempel mellom 1 og 7 ganger, fortrinnsvis mellom 1 og 4 ganger, med mellomrom på ca. 1 dag og ca. 18 måneder. Dette behandlingsregime vil imidlertid variere betydelig avhengig av størrelsen av angjeldende pasient, mengden av administrert nukleotidsekvens, administrasjonsmåten og andre faktorer som vil være åpenbare for en veterinær eller lege. Pasienten kan få én eller flere andre anti-HIV retrovirale medikamenter som del av deres totale behandlingsregime. Nukleinsyre-immunogenet kan dessuten administreres med en adjuvans.
Den her angitte adjuvanskomponent kan administreres tilsvarende via en rekke forskjellige administrasjonsmåter, som for eksempel peroralt, nasalt, pulmonalt, intramuskulært, subkutant, intradermalt eller topisk. Fortrinnsvis administreres adjuvanskomponenten intradermalt eller topisk, mest foretrukket topisk. Administreringen kan foretas mellom ca. 14 dager før og ca. 14 dager etter administrering av nukleotidsekvensen, fortrinnsvis mellom ca. 1 dag før og ca. 3 dager etter administrering av nukleotidsekvensen. I en utførelsesform administreres adjuvanskomponenten i det vesentlige samtidig med administreringen av nukleotidsekvensen. Med "i det vesentlige samtidig med" menes at administreringen av adjuvanskomponenten fortrinnsvis skjer samtidig som administreringen av nukleotidsekvensen, eller om ikke, minst i løpet av få timer før eller etter nukleotidsekvens-administrering. Etter den mest foretrukne behandlingsprotokoll vil adjuvanskomponenten bli administrert i det vesentlige samtidig med administrering av nukleotidsekvensen. Denne protokoll kan selvsagt varieres etter behov, overens- stemmende med typen av variabler omtalt ovenfor. Det er å foretrekke at adjuvansen er et 1H-imidazo[4,5-c]-kinolin-4-aminderivat, så som imiquimod. I alminnelighet vil imiquimod bli tilberedt som en topisk kremformulering og bli administrert i henhold til ovennevnte protokoll.
Igjen vil den administrerte dose av derivatet også variere med slike variabler, men kan for eksempel variere mellom ca. 0,1 mg per kg til ca. 100 mg per kg, hvor "per kg" refererer seg til kroppsvekten av angjeldende pattedyr. Denne administrering av 1H-imidazo[4,5-c]kinolin-4-aminderivatet vil fortrinnsvis bli gjentatt ved hver påfølgende administrering eller booster-administrering av nukleotidsekvensen. Mest foretrukket vil den administrerte dose være mellom ca. 1 mg per kg til ca. 50 mg per kg. Når det gjelder et "prime-boosf-skjema som her beskrevet, kan imiquimod eller annet 1 H-imidazo[4,5-c]kinolon-4-aminderivatet administreres enten med primer-eller boosterdosen eller med både primer- og boosterdosen.
Selv om adjuvanskomponenten kan omfatte kun 1 H-imidazo[4,5-c]kinolin-4-aminderivater for administrering i rå kjemisk tilstand, er det å foretrekke at administreringen skjer i form av en farmasøytisk formulering. Det vil si at adjuvanskomponenten fortrinnsvis vil omfatte 1H-imidazo[4,5-c]-kinolin-4-aminet kombinert med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere, og eventuelt med andre terapeutiske ingredienser. Bærerne må være "akseptable" i den forstand at de er forlikelige med andre ingredienser i formuleringen og ikke skadelige for mottakeren av denne. Formuleringenes natur vil selvsagt variere med den tiltenkte administrasjonsmåte, og de kan fremstilles etter fremgangsmåter velkjent på det farmasøytiske området. Alle metodene inkluderer det trinn å bringe et 1 H-imidazo-[4,5-c]-kinolin-4-aminderivat sammen med én eller flere passende bærere. I alminnelighet fremstilles formuleringene ved jevnt og intimt å bringe sammen derivatet med flytende bærere eller findelte faste bærere, eller begge, og deretter om nødvendig, forme produktet til den ønskede formulering. Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse egnet for peroral administrering kan tilberedes som diskrete enheter, som f.eks. kapsler, oblatkapsler eller tabletter som hver inneholder en fast-satt mengde virkestoff; som et pulver eller granuler; en løsning eller en suspensjon i en vandig væske eller en ikke-vandig væske; eller som en flytende olje-i-vann emulsjon eller en vann-i-olje emulsjon. Virkestoffet kan også tilberedes som bolus, klyster eller pasta.
En tablett kan fremstilles ved pressing eller støping, eventuelt med én eller flere hjelpeingredienser. Pressede tabletter kan fremstilles ved i en egnet maskin og presse virkestoffet i en frittstrømmende form så som pulver eller granuler, eventuelt blandet med et bindemiddel, smøremiddel, inert fortynningsmiddel, smørende, overflateaktivt eller dispergerende middel. Støpte tabletter kan fremstilles i en passende maskin og støpe en blanding av den pulveriserte forbindelse fuktet med et inert flytende fortynningsmiddel.
Tablettene kan eventuelt være drasjert eller forsynt med deleskår og kan formuleres slik at de gir langsom eller kontrollert frigjøring av virkestoffet.
Formuleringer for injeksjon, for eksempel ved intramuskulær, intraperitoneal
eller subkutan administrering, innbefatter vandige og ikke-vandige sterile injeksjons-løsninger som kan inneholde antioksydanter, buffere, bakteriostatika og oppløst stoff som gjør formuleringen isotonisk med blodet til den tiltenkte mottaker; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderingsmidler og for-tykningsmidler. Formuleringene kan tilberedes i enhetsdoseform eller som fler-dosebeholdere, for eksempel forseglede ampuller og glass, og kan oppbevares i frysetørket (lyofilisert) tilstand som bare fordrer tilsetning av den sterile flytende bærer, for eksempel vann for injeksjon, umiddelbart før bruk. Injeksjonsløsninger og suspensjoner for tilberedning på stedet kan fremstilles fra sterile pulvere, granuler og
tabletter av den ovenfor beskrevne type. Formuleringer egnet for pulmonal administrasjon via kinn- eller nesekaviteten tilberedes slik at partiklene som inneholder virkestoffet og hensiktsmessig har en diameter i området fra 0,5 til 7 mikron, avleveres til mottakerens bronkialtre. Slike formuleringer har den mulighet at de er i form av findelte pulvere som lett kan fremstilles enten som en perforerbar kapsel, for eksempel av gelatin, for anvendelse i en inhalasjonsanordning, eller alternativt, som en selvdrevet formulering som omfatter virkestoff, et egnet flytende drivmiddel og eventuelt andre ingredienser, så som surfaktant og/eller fast fortynningsmiddel. Det kan også benyttes selvdrevne formuleringer hvor virkestoffet avgis i form av dråper av en løsning eller suspensjon. Slike selvdrevne formuleringer tilsvarer de som er kjent på området og kan fremstilles etter etablerte fremgangsmåter. Disse er hensiktsmessig forsynt med en ventil som kan betjenes manuelt eller automatisk og som har de ønskede forstøvningsegenskaper. Ventilene kan med fordel være av avmålingstype som avgir et fast volum, for eksempel 50 til 100 ved hver betjening av denne.
Som en ytterligere mulighet kan adjuvanskomponenten ha form av en løsning for bruk i en atomisør eller nebulisator, hvorved en akselerert luftstrøm eller ultralyd-agitasjon benyttes for å produsere en tåke av fine dråper for inhalasjon.
Formuleringer egnet for intranasal administrasjon innbefatter i alminnelighet lignende former som de som ovenfor er beskrevet for pulmonal administrasjon, selv om det er å foretrekke at slike formuleringer har en partikkeldiameter i området fra ca. 10 til ca. 200 mikron, slik at de kan holdes igjen i nesekaviteten. Dette kan oppnås ved å benytte et pulver av egnet partikkelstørrelse eller ved valg av en passende ventil. Andre egnede formuleringer er grove pulvere som har en partikkeldiameter i området fra ca. 20 til ca. 500 mikron, for administrasjon ved hurtig inhalasjon gjennom nesepassasjen, fra en beholder som holdes tett opp til nesen, og nesedråper som omfatter ca. 0,2 til 5 vekt % virkestoff i vann- eller oljebaserte løsninger. I én utførelsesform av oppfinnelsen kan vektoren som omfatter den nukleotidsekvens som koder for det antigene peptid, administreres i den samme formulering som 1 H-imidazo[4,5-c]kinolin-4-aminderivatet. I denne utførelsesform finnes således immunogen- og adjuvanskomponenten i den samme formulering.
I én utførelsesform fremstilles adjuvanskomponenten i en form egnet for administrering med genkanon og administreres på denne måte i det vesentlige samtidig med administrering av nukleotidsekvensen. For fremstilling av formuleringer egnet for bruk på denne måte kan det være nødvendig at 1 H-imidazo[4,5-c]-kinolin-4-aminderivatet lyofiliseres og klebes til for eksempel gullkuler som er egnet for administrering med genkanon.
I en alternativ utførelsesform kan adjuvanskomponenten administreres som et tørt pulver via gassfremdrift under høyt trykk.
Selv om de ikke formuleres sammen kan det være hensiktsmessig at adjuvanskomponenten administreres til eller omtrent det samme administrasjonssete som nukleotidsekvensen.
Andre detaljer angående farmasøytiske preparater finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennysylvania
(1985), som her med hele sitt innhold inkorporeres ved referanse.
Passende teknikker for innføring av det nakne polynukleotid eller vektoren i en pasient inkluderer også topisk administrering med en passende bærer. Nukleinsyren kan administreres topisk til huden eller til slimhinner, for eksempel ved intranasal, peroral, intravaginal eller intrarektal administrering. Det nakne polynukleotid eller vektoren kan foreligge sammen med et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, som f.eks. fosfatbuffret saltvann (PBS). DNA-opptak kan lettes ytterligere ved å benytte midler som f.eks. bupivakain, enten separat eller inkludert i DNA-formuleringen. Andre fremgangsmåter for administrering av nukleinsyren direkte til en mottaker omfatter ultralyd, elektrisk stimulering, elektroporering og "microseeding" som er beskrevet i US-patent 5.697.901.
Opptak av nukleinsyrekonstruksjoner kan forbedres ved hjelp av flere kjente transfeksjonsteknikker, for eksempel de som inkluderer anvendelsen av trans-feksjonsmidler. Eksempler på slike midler er kationiske midler, for eksempel kalsium-fosfat og DEAE-dekstran og lipofektanter, for eksempel lipofectam og transfectam. Doseringen av den nukleinsyre som skal administreres kan endres.
En nukleinsyresekvens kan også administreres ved hjelp av spesielle avleveringsvektorer egnet innen genterapi. Genterapimetoder er omtalt for eksempel av Verme et al., Nature 1997, 389:239-242. Både virale og ikke-virale vektorsystemer kan benyttes. Virusbaserte systemer omfatter retrovirale, lentivirale, adenovirale, adenoassosiert virale, herpes-virale, Canarypox- og vaccinia-virale systemer. Systemer som ikke er basert på virus, inkluderer direkte administrering av nukleinsyrer, mikrokuleinnkapslings-teknologi (poly(laktid-ko-glykolid) og liposombaserte systemer. Virale og ikke-virale avleveringssystemer kan kombineres når det er ønskelig å gi boosterinjeksjoner etter en initial vaksinasjon, for eksempel en initial "prime" DNA-vaksinasjon, ved å benytte en ikke-viral vektor som f.eks. et plasmid, etterfulgt av én eller flere "booster" vaksinasjoner ved bruk av en viral vektor eller et ikke-viralt system. Tilsvarende kan det i forbindelse med oppfinnelsen vurderes "prime boot" systemer med polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, etterfulgt av booster-injeksjoner med protein i adjuvans eller vice versa.
En nukleinsyresekvens kan også administreres ved hjelp av transformerte celler. Slike celler inkluderer celler tatt fra et individ. Det nakne polynukleotid eller vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse kan innføres i slike celler in vitro, og de transformerte cellene kan senere returneres til individet. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan integreres i nukleinsyre som allerede foreligger i en celle, ved homolog rekombinasjon. Om ønskes kan en transformert celle dyrkes in vitro og én eller flere av de resulterende celler kan benyttes. Celler kan tilføres til et passende sted i en pasient ved hjelp av kjent kirurgisk eller mikrokirurgisk teknikk (f.eks. grafting, mikro-injeksjon, etc).
De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere adjuvansforbindelser slik som angitt detaljert ovenfor, eller andre substanser som kan tjene til å øke den immunrespons som induseres av proteinet som kodes av denne DNA. Disse kan kodes av DNA, enten separat fra antigenet eller som en fusjon med dette, eller kan inkluderes som ikke-DNA-elementer av formuleringen. Eksempler på substanser av adjuvans-type som kan inkluderes i formuleringen ifølge foreliggende oppfinnelse er ubikvitin, lysosomalt assosiert membranprotein (LAMP), hepatitt B, viruskjerneantigen, FLT3-ligand (et cytokin som er viktig ved utviklingen av profesjonelle antigenpresenterende celler, særlig dendrittiske celler) og andre cytokiner som f.eks. IFN-y og GMCSF. Andre foretrukne adjuvanser omfatter imiquimod og Resiquimod og Tucarasol. Imiquimod er særlig å foretrekke.
Ved den foreliggende oppfinnelse muliggjøres foretrukket anvendelsen av et nukleinsyremolekyl som her beskrevet, for behandling eller forebyggelse av HIV-infeksjon. Nukleinsyremolekylet administreres fortrinnsvis med imiquimod. Imiquimod administreres fortrinnsvis topisk, mens nukleinsyremolekylet fortrinnsvis administreres ved hjelp av partikkelmediert avlevering.
En fremgangsmåte for behandling av et individ som lider av eller er mottagelig for HIV-infeksjon er beskrevet, som omfatter administrering av et nukleinsyremolekyl som her beskrevet, og imiquimod.
Foreliggende oppfinnelse vil nedenfor bli beskrevet med henvisning til de følgende eksempler:
EKSEMPLER
Eksempel 1: Optimalisering av p55 gag (p17, p24, p13) for etterligning av kodonanvendelse av høyt uttrykte humane gener.
Gen av interesse
Et syntetisk gen som koder for p55 gag-antigenet av HIV-1 clade B stamme HXB2 (GenBank tilgang K03455), optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller, ble sammensatt av overlappende oligonukleotider ved PCR.
Optimalisering involverte endring av kodonanvendelsesmønsteret for det virale gen for å gi en kodonfrekvens som var nærmere den som finnes i høyt uttrykte humangener. Kodoner ble tilordnet ved å benytte et statistisk Visual Basic program betegnet Syngene (en oppdatert versjon av Calcgene, skrevet av R.S. Hale og G. Thompson, Protein Expression and Purification bd. 12 s. 185-188, 1998).
Kloning:
1528bp gag PCR-produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjonsendonukleasene Not og Barn Hl og ligert inn i Notl/BamHI kuttet vektor WRG7077. Dette plasserer genet mellom CMV promoteren/intron A og polyadenyleringssignalet for bovint veksthormon.
Kloner ble sekvensert og kontrollert med henblikk på feil. Ingen enkeltklon var 100% korrekt. Regioner med korrekt sekvens fra to kloner ble derfor kombinert ved overlappende PCR under bruk av passende kombinasjoner av det optimaliserte oligosett for å gi et full-lengde kodonoptimalisert gag-gen. Denne endelige klon ble senere funnet å inneholde en enkelt nukleotiddelesjon som resulterte i en ramme-forskyvning og for tidlig terminering av translasjon. Delesjonen ble reparert ved å kutte ut det området av genet som inneholdt den feilaktige sekvens og klone inn den riktige sekvens fra den tilsvarende region av en annen klon. Dette ga den endelige kodonoptimaliserte p55 gag-klon:
Gagoptrpr2. (Se Figur 2)
Eksempel 2: Fremstilling av et p17/p24 trunkert Nef fusjonsgen
Gen av interesse
p17- og p24-delene av p55gag-genet avledet fra HIV-1 clade B-stamme HXB2 ble PCR-amplifisert fra plasmidet pHXB?Pr (B.Maschera, E. Furfine og E.D. Blair, 1995 J. Virol 69, 5431-5436). pHXB?Pr. 426bp fra 3' enden av HXB2 nef-genet ble amplifisert fra det samme plasmid. Siden HXB2 nef-genet inneholder en prematur termineringskodon ble to overlappende PCR brukt til å reparere kodonet (TGA [stop] til TGG [Trp]).
PCR-produktene p17/p24-linker og trNEF-linker ble forbundet for å danne p17p24trNEF-fusjonsgenet (Figur 3) i en PCR-reaksjon (antisense).
1542bp-produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjonsendonukleasene Noti og BamHI og klonet inn i Noti BamHI setene til vektor WRG7077. Dette anbringer
genet mellom CMV promoter/intron A og polyadenyleringssignalet for bovint veksthormon.
Eksempel 3: Produksjon av et Gag p17/24opt/trNef 1 ("Gagopt/Nef") fusjonsgen Gen av interesse
p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte p55gag-gen avledet fra HIV-1 clade B stamme HXB2 ble PCR-amplifisert fra plasmidet pGagOPTrpr2. Det trunkerte HXB2 Nef-gen med den premature termineringskodon reparert (TGA [stop] til TGG [Trp]) ble amplifisert ved PCR fra plasmidet 7077trNef20. De to PCR-produktene ble konstruert med overlappende ender slik at de to genene kunne forbindes ved en andre PCR.
1544bp produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjonsendonukleasene Noti og BamHI og klonet (se figurer) inn i Noti BamHI setene av vektor WRG7077. Dette anbringer genet mellom CMV promoter/intron A og polyadenyleringssignalet for det bovine veksthormon.
Eksempel 4: Plasmid: p7077-RT3 klon #A
Gen av interesse
Et syntetisk gen som koder for RT-delen av pol-genet av HIV-1 clade B stamme HXB2, optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller, ble sammensatt av overlappende oligonukleotider ved PCR. Den klonede sekvens tilsvarer posisjonene 2550-4222 av HXB2-referansesekvensen (GenBank tilgang K03455). For å sikre ekspresjon har den klonede sekvens to ytterligere kodoner i 5' enden som ikke forekom i det opprinnelige gen - AUG GGC (Met Gly). Optimalisering involverte endring av kodonanvendelsesmønsteret av det virale gen for å gi en kodonfrekvens nærmere den som finnes i høyt uttrykte humangener, men uten sjeldent benyttede kodoner. Kodoner ble tilordnet ved å benyttet et statistisk Visual Basic program betegnet Syngene (en oppdatert versjon av Calcgene, skrevet av R.S. Hale & G. Thompson, Protein Expression and Purification bd. 12 s. 185-188, 1998).
Den endelige klon ble konstruert fra to intermediære kloner, #16 og #21.
Kloning:
De 1,7 kb PCR-produktene ble gelrenset, kuttet med Noti og BamHI og PCR-rensetførde ble ligert med Notl/BamHI-kuttet pWRG7077. Dette anbringer genet mellom CMV-promoteren og polyadenyleringssignalet for bovint veksthormon. Kloner ble sekvensert. Ingen klon var 100% korrekt, men klon #16 ble korrigert ved å erstatte 403 bp Kpnl-BamHI-fragmentet som inneholdt 3 feil med et korrekt Kpnl-BamHI-fragment fra klon #21. Den endelige klon ble verifisert ved sekvensering (se
Figur 5).
Eksempel 5: Optimalisert RT
Gen av interesse
Det syntetiske gen som koder for RT-delen av pol-genet av HIV-1 clade B stamme HXB2, optimalisert for ekspresjon i pattedyrceller, ble kuttet ut fra plasmid p7077-RT3 som et 1697 bp Notl/BamHI-fragment, gelrenset og klonet inn i Noti & BamHI-setene av p7313-ie (avledet fra pspC31) for å anbringe genet nedstrøms for en Iowa lengde HCMV-promoter + ekson 1, og oppstrøms for et kanin globin polyadenyleringssignal. (R7004 p27) (Figur 6).
Eksempel 6
Plasmid: 7077trNef20
Gen av interesse
Innskuddet omfatter del av Nef-genet fra HIV-1 clade B stamme HXB2.195 bp er deletert fra 5' enden av genet som fjernet kodonene for de første 65 aminosyrene av Nef. Dessuten er det premature termineringskodon i den publiserte HXB2 nef-sekvens blitt reparert (TAG til TGG [Trp]), som beskrevet for plasmid p17/24trNEF1. Den trunkerte nef-sekvens ble PCR-amplifisert fra plasmidet p17/24trNef1. Den klonede sekvens er ekvivalent med posisjonene 8992-9417 av HXB2 referansesekvensen (GenBank tilgang K03455). For å sikre ekspresjon har den klonede sekvens et ytterligere kodon ved 5' enden som ikke er tilstede i det opprinnelige gen - AUG (Met).
Primere:
AstrNef (antisense)
PCR: 94°C 2 min, deretter 25 sykluser: 94°C 30 sek, 50°C 30 sek, 72°C 2min, avslutning 72°C 5 min.
Kloning:
455 bp RT PCR-produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjons-endonukleasene Noti og BamHI og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet vektor WRG7077. Dette anbringer genet mellom CMV promoteren/intron A og polyadenyleringssignalet av bovint veksthormon.
Eksempel 7
Plasmid: 7077RT8
Gen av interesse
RT-delen av pol-genet ble avledet fra HIV-1 clade B stamme HXB2. Den ble PCR-amplifisert fra plasmidet p7077Pol14.
Den klonede sekvens er ekvivalent med posisjonene 2550-4234 av HXB2 referansesekvensen (GenBank tilgang K03455). For å sikre ekspresjon har den klonede sekvens to ytterligere kodoner ved 5' enden som ikke er tilstede i det opprinnelige gen - AUG GGC (Met Gly).
Primere:
ASRT (antisense)
PCR: 94°C 2 min, deretter 25 sykluser: 94°C 30 sek, 50°C 30 sek, 72°C 4 min, avslutning 72°C 5 min.
Kloning:
1720 bp RT PCR-produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjons-endonukleasene Noti og BamHI og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet vektor WRG7077. Dette anbringer genet mellom CMV promoter/intron A og polyadenyleringssignalet av bovint veksthormon.
Eksempel 8
p17/24opt/RT/trNef 13 ("Gagopt/RT/Nef')
Denne konstruksjon inneholder en PCR som bevirker en R- til H-aminosyreendring.
Gen av interesse
p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte p55 gag-gen avledet fra HIV-1 clade B stamme HXB2 ble PCR-amplifisert fra plasmidet pGagOPT rpr2. Den RT-kodende sekvens ble PCR-amplifisert fra plasmidet 7077RT 8. Det trunkerte HXB2 Nef-gen med det premature termineringskodon reparert (TGA [stop] til TGG [Trp]) ble amplifisert ved PCR fra plasmidet 7077trNef20. De tre PCR-produktene ble konstruert med overlappende ender slik at de tre genene kunne forbindes ved en andre PCR.
Primere:
(P17/24)
Sp17p24opt (sense)
ASp17p24optRTIinker (antisense)
TGGGGCCCATCAACACTCTGGCTTTGTGTC [SEKV. ID. Nr:6]
PCR: 94°C 1 min, deretter 20 sykluser: 94°C 30 sek, 50°C 30 sek, 72°C 2 min, avslutning 72°C 4 min.
1114 bp p17/24opt-produkter ble gelrenset
(RT)
Sp17p24optRTIinker (sense)
ASRTtrNeflinker (antisense)
PCR som ovenfor
1711 bp RT PCR-produktet ble gelrenset
(5' trunkert nef)
SRTtrNeflinker (sense)
AStrNef (antisense)
PCR som ovenfor
448 bp-produktet ble gelrenset.
De tre PCR-produktene ble deretter hektet sammen i en andre PCR med primerne Sp17/24opt og AstrNef.
PCR: 94°C 1 min, deretter 30 sykluser: 94°C 30 sek, 50°C 30 sek, 72°C 4 min, avslutning 72°C 4 min.
3253 bp-produktet ble gelrenset, kuttet med restriksjons-endonukleasene Noti og BamHI og klonet inn i Noti BamHI-setene av vektor WRG7077. Dette bringer genet mellom CMV promoteren/intron A og polyadenyleringssignalet av bovint veksthormon.
Eksempel 9
Plasmid: pGRN#16 (p17/p24opt corr/RT/trNef.)
Gen av interesse
Polyproteinet utviklet med p17/24opt/RT/trNef13 ("Gagopt/RT/Nef) ble observert å uttrykke et trunkert produkt av -30 kDa som følge av en ansamling av ugunstige kodoner innen p24 omkring aminosyre 270. Denne ble erstattet med optimale kodoner ved PCR sammenhektende mutagenese.
p17/24opt/RT/trNef13 ble benyttet som templat for å amplifisere delen av Gag 5' til mutasjonen med primerne Sp17/p24opt og GTR-A, og delen av Gag 3' til mutasjonen med primerne GTR-S og Asp17/p24optRTIinker. Overlappingen av de
produkter som inneholdt kodonendringene og de gelrensede produktene ble hektet sammen ved å benytte Sp17/p24opt- og Asp17/p24optRTIinker-primerne. Produktet ble kuttet med Noti og Agel og innskutt i et tilsvarende kuttet p17/24opt/RT/trNef13, for å frembringe pGRN.
Klon #16 ble verifisert og progressert.
Primere:
5' PCR: Sp17p24opt (sense)
ATAAGAATGCGGCCGCCATGGGTGCCCGAGCTTCGGT [SEKV. ID. Nr:11]
GTR-A (Antisense)
3' PCR
Sense: GTR-S (Sense)
ASp17p24optRTIinker (antisense)
PCR-betingelserfor individuelle produkter og sammenhekting ved å benytte PWO DNA-polymerase (Roche): 95°C 1 min, deretter 20 sykluser: 95°C 30 sek, 55°C 30 sek, 72°C 180 sek, avslutning 72°C 120 sek og 4°C hold.
1114 bp-produktet ble gelrenset og kuttet med Noti og Agel for å frigjøre et 6647 bp-fragment som ble gelrenset og ligert inn i Noti/Agel-kuttet gelrenset p17/24opt/RT/trNef13 for å frembringe pGRN#16.
Eksempel 10:
Plasmid: p73i-GRN2 Klon #19
(p17/p24(opt) /RT (opt) trNef) - reparert
Gen av interesse
p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte gag, kodonoptimalisert RT og trunkerte Nef-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV-promoter + eksonl, og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Plasmider inneholdende trNef-genet avledet fra plasmid p17/24trNef1 inneholder en PCR-feil som gir en R- til H-aminosyreendring 19 aminosyrer fra enden av nef. Denne ble korrigert ved PCR-mutagenese, den korrigerte nef PCR hektet til kodonoptimalisert RT fra p7077-RT3 og det tilhektede fragment kuttet med Apal og BamHI og klonet inn i Apal/BamHI kuttet p73i-GRN.
Primere:
PCR coRT fra p7077-RT3 under bruk av primere:
(Polymerase = PWO (Roche) gjennom det hele.
Sense: U1
AScoRT-Nef
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 20 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C (180 sek), deretter 72°C (120 sek) og hold ved 4°C.
Det 1,7 kb PCR-produktet ble gelrenset.
PCR 5' Nef fra p17/24trNef1 ved å benyttet primere:
Sense: S-Nef
Antisense: ASNef-G:
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C (60 sek), deretter 72°C (120 sek) og hold ved 4°C.
PCR 3' Nef fra p17/24trNef1 ved å benytte primere:
Sense SNEF-G
Antisense:
AStrNef (antisense)
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C (60 sek), deretter 72°C (120 sek) og hold ved 4°C.
PCR-produktene ble gelrenset. I første omgang ble de to Nef-produktene hektet sammen ved å benytte 5' (S-Nef) og 3' (AstrNef) primerne.
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C
(60 sek), deretter 72°C (180 sek) og hold ved 4°C.
PCR-produktet ble PCR-renset og hektet til RT-produktet ved å benytte U1 og AstrNef-primerne.
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 20 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C
(180 sek), deretter 72°C (180 sek) og hold ved 4°C.
2,1 kb-produktet ble gelrenset og kuttet med Apal og BamHI. Plasmidet p73l-GRN ble også kuttet med Apal og BamHI gelrenset og ligert med Apal-Bam RT3trNef for å regenerere p17/p24 (opt)/RT (opt) trNef-genet.
Eksempel 11
p73i-GN2 Klon #2 (p17/p24opt/trNef) - reparert
Gen av interesse
p17/p24-delen av de kodonoptimaliserte gag- og trunkerte Nef-genene fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV-promoter + eksonl og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Plasmider inneholdende trNef-genet avledet fra plasmid p17/24trNef1 inneholder en PCR-feil som gir en R- til H-aminosyreendring 19 aminosyrer fra enden av Nef. Denne ble korrigert ved PCR-mutagenese og det korrigerte fragment kuttet med Bglll og BamHI og klonet inn i Bglll/BamHI-kuttet p73l-GN. (Figur 12) regenererer det korrigerte p17/p24opt/trNef-fusjonsgen nedstrøms for Iowa lengde HCMV-promoteren + eksonl, og oppstrøms for kanin p-globin polyadenyleringssignalet.
PCR 5' Nef fra p17/24trNef1 ved å benytte primere:
Polymerase = PWO (Roche) gjennom det hele.
Sense: S-Nef
Antisense: ASNef- G:
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C (60 sek), deretter 72°C (120 sek) og hold ved 4°C.
PCR 3' Nef fra p17/24trNef1 ved å benytte primere:
Sense: SNEF-G Antisense: AStrNef
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C
(60 sek), deretter 72°C (120 sek) og hold ved 4°C.
PCR-produktene ble gelrenset og hektet sammen ved å benytte 5' (S-Nef) og 3' (AstrNef) primere.
Syklus: 95°C (30 sek) deretter 15 sykluser 95°C (30 sek), 55°C (30 sek), 72°C
(60 sek), deretter 72°C (180 sek) og hold ved 4°C.
PCR-produktet ble PCR-renset, kuttet med Bglll/BamHI og det 367 bp-fragmentet gelrenset og klonet inn i Bglll/BamHI-kuttet gelrenset p73i-GN.
Eksempel 12
Plasmid: p73i-RT w229k (inaktivert RT)
Gen av interesse
Utvikling av et inaktivert RT-gen nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + ekson 1 og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Som følge av betenkeligheter ved anvendelsen av en aktiv HIV RT art i en terapeutisk vaksine var inaktivering av genet ønskelig. Dette ble oppnådd ved PCR-mutagenese av RT (avledet fra P73I-GRN2) aminosyreposisjon 229 fra Trp til Lys (R7271 p1-28).
Primere:
PCR 5' RT + mutasjon ved bruk av primere:
(polymerase = PWO (Roche) gjennom det hele)
Sense: RT3-u:1
Antisense: AScoRT-Trp229Lys
Syklus:
1 x [94°C (30 sek) ]
15 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (60 sek) ] 1 x [72°C (180 sek)]
PCR-gelrens
PCR 3' RT + mutasjon ved bruk av primere:
Antisense: RT3-1:1
Sense: ScoRT-Trp229Lys
Syklus:
1 x [94°C (30 sek) ]
15 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (60 sek) ] 1 x [72°C (180 sek)]
PCR- gelrens
PCR-produktene ble gelrenset og 5'- og 3'- enden av RT ble hektet sammen ved å benytte 5' (RT3-U1)- og 3' (RT3-L1)-primerne.
Syklus:
1 x [94°C (30 sek) ]
15 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (120 sek) ] 1 x [72°C (180 sek)]
PCR-produktet ble gelrenset og klonet inn i p7313ie, ved å benytte Noti og BamHI restriksjonsseter for å utvikle p73l-RT w229k. (Se Figur 13).
Eksempel 13:
Plasmid: p73i-Tgrn (#3)
Gen av interesse
p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte gag-, kodonoptimalisert RT- og trunkerte Nef-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Trippel fusjonskonstruksjoner som inneholder en aktiv form av RT kan kanskje ikke aksepteres for human anvendelse av regulerende myndigheter, og inaktivering av RT ble deretter foretatt ved insersjon av et Nhel- og Apal-kuttet fragment fra p73i-RT w229k, i en Nhel/Apal-kuttet p73i-GRN2#19 (Figur 14). Dette resultererer i en W-> K endring i posisjon 229 i RT.
Eksempel 14
p73l-Tnrg (#16)
Gen av interesse
Det trunkerte Nef, inaktiverte kodonoptimaliserte RT og p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte gag-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Rekkefølgen av genet i polyproteinet som kodes av p73l-Tgrn ble omleiret ved PCR og PCR-sammenhekting for å frembringe p73l-Tnrg (Figur 15). Hvert gen ble PCR-amplifisert og gelrenset før PCR-sammenhekting av genene for å danne et enkelt polyprotein. Produktet ble gelrenset, Notl/BamHI-kuttet og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet p7313ie.
Primere:
trNef PCR
S-Nef (Not I)
AS-Nef-coRT linker RTw229k PCR S-coRT AS-coRT-p17p24 linker p17p24oDt PCR S-p17p24opt
AS-p17p24opt (BamHI)
PCR-betingelser for individuelle produkter og sammenhekting ved å benytte VENT DNA-polymerase (NEB):
1 x [94°C (30 sek) ]
25 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (120 sek) [p17p24 eller RT] eller
60 sek [trNef])]
1 x [72°C (240 sek)]
PCR-produktene ble gelrenset og benyttet i en PCR-sammenhekting ved å benytte primerne S-trNef (Noti) og AS-p17p24opt (BamHI):
1 x [94°C (30 sek) ]
25 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (210 sek) ] 1 x [72°C (240 sek)]
Produktet på 3000 bp ble gelrenset og kuttet med Noti og BamHI som ble PCR-renset og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet gelrenset p7313ie for å frembringe p73i-Tnrg.
Eksempel 15:
1. Plasmid: P73i-Tngr (#3)
Gen av interesse
Den trunkerte Nef, p17/p24-del av det kodonoptimaliserte gag- og inaktiverte kodonoptimaliserte RT-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl, og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Rekkefølgen av genene i det polyprotein som kodes av p73i-Tgrn ble omleiret ved PCR for å frembringe p73l-Tngr (Figur 16). Kodonoptimalisert p17/p24 og RT ble utviklet som et enkelt produkt og PCR-hektet til amplifisert trNef. Produktet ble gelrenset, Notl/BamHI-kuttet og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet p7313ie.
Primere:
P17/ P24 - RT3' PCR:
Sp17p24opt (sense)
RT3 1:1 (antisense)
TrNef 5' PCR S-Nef (Noti) AS-Nef-p17p24
PCR-betingelser for individuelle produkter og sammenhekting ved bruk av VENT DNA-polymerase (NEB):
1 x [94°C (30 sek) ]
25 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (180 sek [p17p24+RT] eller 60 sek [trNef] eller 210 sek [sammenhekting])] 1 x [72°C (240 sek)]
Produktet på 3000 bp ble gelrenset og kuttet med Noti og BamHI som ble PCR-renset og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet gelrenset p7313ie for å frembringe p73i-Tngr.
Eksempel 16:
Plasmid: p73l-Trgn (#6)
Gen av interesse
Det inaktiverte kodonoptimaliserte RT, p17/p24-delen av det kodon-optimaliserte gag- og trunkerte Nef-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Rekkefølgen av genene i konstruksjonen ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon av p17p24-trNef og RTw229kfra plasmidene henholdsvis p73l-GN2 og p73l-RTw229k. PCR-sammenhekting ble foretatt og produktet gelrenset og Notl/BamHI-kuttet før ligering med Notl/BamHI-kuttet p7313ie. Sekvensering viste at p17p24 ikke var fullstendig optimalisert og et 700 bp-fragment ble deretter Agel/Munl-kuttet fra den kodende region og erstattet med Munl/Age-fragment fra p73i-Tgrn#3 inneholdende den korrekte kodende sekvens. (Se Figur 17).
Primere:
p17p24- trNef PCR
S-p17p24opt
AstrNef (BamHI) RTw229k RT3-U:1 AS-coRT-p17p24opt linker
PCR-betingelser for individuelle produkter og sammenhekting ved bruk av VENT DNA-polymerase (NEB):
1 x [94°C (30 sek) ]
25 x [94°C (30 sek) / 55°C (30 sek) /72°C (120 sek (PCR) eller 180 sek
(sammenhekting)
1 x [72°C (240 sek)]
Produktet på 3000 bp fra PCR-sammenhektingen ble gelrenset og kuttet med Noti og BamHI, som ble PCR-renset og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet gelrenset p7313ie for å frembringe p73i-Tngr. Sekvensanalyse viste at p17p24-sekvensen oppnådd fra p73l-GN2 ikke var fullstendig kodonoptimalisert og at denne var blitt overført til det nye plasmid. Dette ble rettet ved kutting av et 700 bp-fragment fra p73i-Tngr kuttet med Munl og Agel, som ble erstattet ved ligering med et 700 bp Munl/Agel-oppsluttet produkt fra p73i-Tgrn for å frembringe konstruksjonen p73l-Tngr#6.
Eksempel 17:
Plasmid: p73i-Trng (#11)
Gen av interesse
Den inaktiverte kodonoptimaliserte RT, trunkerte Nef- og p17/p24-del av det kodonoptimaliserte gag-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Rekkefølgen av genene i konstruksjonen ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon av RT-trNef og p17p24-genene fra p73i-Tgrn. PCR-sammenhekting av de to DNA-fragmentene ble foretatt og produktet på 3 kb gelrenset og Notl/BamHI-kuttet før ligering med Notl/BamHI-oppsluttet p7313ie, hvilket førte til p73l Trng (#11).
Primere: RTw229k- trNef RT3-u:1 AS-Nef-p17p24opt linker P17<p>24 S-p17p24opt AS-p17p24opt (BamHI)
PCR-betingelserfor individuelle produkter og sammenhekting ved å benytte VENT DNA-polymerase (NEB):
1 x [94°C (30 sek)]
25 x [94°C (30 sek)/55°C (30 sek)/72°C (120 sek (PCR av gener) eller 180 sek
(sammenhekting)
1 x [72°C (240 sek)]
Produktet på 3000 bp fra PCR-sammenhektingen ble gelrenset og kuttet med Noti og BamHI, som ble PCR-renset og ligert inn i Notl/BamHI-kuttet gelrenset p7313ie for å frembringe p73i-Tngr.
Eksempel 18:
p73i-Tgnr(#f1)
Gen av interesse
p17/p24-delen av det kodonoptimaliserte gag-, trunkerte Nef- og kodonoptimaliserte inaktiverte RT-gen fra HIV-1 clade B stamme HXB2 nedstrøms for en Iowa lengde HCMV promoter + eksonl, og oppstrøms for et kanin p-globin polyadenyleringssignal.
Rekkefølgen av genene i konstruksjonen ble oppnådd ved PCR-amplifikasjon av p17p24-trNef og RTw229kfra plasmidene henholdsvis p73l-GN2 og p73l-RTw229k. PCR-sammenhekting ble foretatt og produktet gelrenset og Notl/BamHI-kuttet før ligering med Notl/BamHI-oppsluttet p7313ie. To sekvensfeil ble registrert i sekvensen (p17p24 og RT) som senere ble reparert ved erstatning med korrekte deler av genene ved å benytte restriksjonsseter innen polyproteinet.
(Se Figur 19).
Primere:
p17p24- trNef PCR
S-p17p24opt
AS-Nef-coRTIinker RTw229k S-coRT RT3-1:1
PCR-betingelser for individuelle produkter og sammenhekting ved å benytte VENT DNA-polymerase (NEB):
1 x [94°C (30 sek)]
25 x [94°C (30 sek)/55°C (30 sek)/72°C (120 sek (PCR) eller 180 sek (sammenhekting) 1 x [72°C (240 sek)]
Produktet på 3000 bp ble gelrenset og kuttet med Noti og BamHI som ble PCR-renset og ligert inn i Notl/BamHI-oppsluttet gelrenset p7313ie for å frembringe p73i-Tngr. Sekvensering viste at p17p24 ikke var fullstendig optimalisert, og et 700 bp-fragment ble deretter Agel/Munl-kuttet fra den kodende region og erstattet med Munl/Age-fragment fra p73i-Tgrn#3 inneholdende den korrekte kodende sekvens. Polyproteinet inneholdt også en enkelt punktmutasjon (G2609A) som resulterte i en aminosyresubstitusjon av Thr til Ala i RT-delen av polyproteinet. Mutasjonen ble korrigert ved Apal/BamHI-oppslutning av konstruksjonen og PCR-opprensning for å fjerne den muterte sekvens, som ble erstattet ved ligering med en Apal/BamHI-oppsluttet del av RT fra p73i-Tgnr.
Eksempel 19:
Fremstilling av plasmid-belagt «gull-oppslemming» for «genkanon» DNA-patroner
Plasmid DNA (ca. 1 \ ig/\ iL), f.eks. 100^g, og 2^m gullpartikler, f.eks. 50 mg (Powderject), ble suspendert i 0.05M spermidin, f.eks. 100 (Sigma). DNA ble utfelt på gullpartiklene ved tilsetning av 1M CaCI2, f.eks. 100 \ A. (American Pharmaceutical Partners, Inc., USA). DNA/gull-komplekser ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur, vasket tre ganger i absolutt etanol, f.eks. 3x1 mL (på forhånd tørket på molekylsikt 3Å (BDH)). Prøver ble resuspendert i absolutt etanol inneholdende 0,05 mg/mL polyvinylpyrrolidon (PVP, Sigma) og delt i tre like alikvoter i 1,5 mL mikrosentrifugerør (Eppendorf). Alikvotene var for analyse av (a) «gull-oppslemming», (b) eluat-plasmid eluertfra (a), og (c) for fremstilling av gull/plasmid-belagte Tefzel-patroner for «genkanonen» (se Eksempel 3 nedenfor). For fremstilling av prøvene (a) og (b) ble rørene inneholdende plasmid DNA/»gull-oppslemming» i etanol/PVP sentrifugert i 2 minutter med maksimal hastighet i en Eppendorf 5418 mikrosentrifuge, hvorpå supernatanten ble fjernet og «gull-oppslemmingen» tørket i 10 minutter ved romtemperatur. Prøve (a) ble resuspendert til 0,5-1,0 \ ig/ yL
plasmid DNA i TE pH 8,0, anslått til ca. 50% belegging. For eluering ble prøve (b) resuspendert til 0,5-1,0 \ ig/ yL av plasmid DNA i TE pH 8,0, og inkubert ved 37°C i 30 minutter, kraftig ristet og deretter sentrifugert i 2 minutter ved maksimal hastighet i en Eppendorf 5418 mikrosentrifuge og supernatanten, eluatet, tatt ut og oppbevart ved -20°C. Den eksakt eluerte DNA-konsentrasjon ble bestemt ved spektro-fotometrisk kvantifisering ved å benytte Genequant II (Pharmacia Biotech).
Eksempel 20:
Fremstillinger av patroner for DNA-immunisering
Fremstilling av patroner for Accell-genoverføringsanordningen var som tidligere beskrevet (Eisenbraun et al., DNA and Cell Biology, 1993, Bd. 12, Nr. 9, s. 791-797; Pertner et al.). I korte trekk ble plasmid DNA belagt på 2^m gullpartikler (DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA) og fylt over i Tefzel-slange, som senere ble skåret i 1,27 cm lengde for å tjene som patroner og oppbevart i tørket tilstand ved 4°C inntil bruk. Ved en typisk vaksinasjon inneholdt hver patron 0,5 mg gull belagt med totalt 0,5^g DNA/patron.
Eksempel 21:
Immunrespons på HIV-antigener etter DNA-vaksinasjon ved å benytte genkanonen
Mus (n=3/gruppe) ble vaksinert med antigener kodet av nukleinsyre og lokalisert i to vektorer. P7077 som utnytter HCMV IE-promoteren som inkluderer Intron A og eksonl (fcmv-promoter). P73I avleverer det samme antigen, men inneholder den HCMV IE-promoter (icmv-promoter) som mangler Intron A, men inkluderer ekson 1.
Plasmidet ble avlevert til det barberte målsetet av abdominal hud av F1 (C3H x Balb/c) mus. Musene ble gitt en primær immunisering av 2 x 0,5 fag DNA på dag 0, boosterdoser på 2 x 0,5^g DNA på dag 35, og cellulær respons ble påvist på dag 40 ved å benytte IFN-gamma Elispot.
Cytotoksiske T-celleresponser
Den cytotoksiske T-cellerespons ble bestemt ved CD8+ T-celle-begrenset IFN-y ELISPOT-analyse av splenocytter oppsamlet 5 dager senere. Mus ble avlivet ved cervikal dislokasjon og milten oppsamlet i iskald PBS. Splenocytter ble «teased» ut i fosfat-buffret saltvann (PBS) etterfulgt av lyse av røde blodceller (1 minutt i buffer bestående av 155 mM NH4CI, 10 mM KHC03, 0,1 mM EDTA). Etter to vaskinger i PBS for å fjerne partikler, ble enkeltcellesuspensjonen delt i alikvoter i ELISPOT-plater som på forhånd var belagt med oppfangende IFN-y antistoff og stimulert med CD8-begrenset kognat-peptid (Gag, Nef eller RT). Etter dyrking over natten ble IFN-y produserende celler visualisert ved anvendelse av anti-murint IFN-y biotin-merket antistoff (Pharmingen) etterfulgt av streptavidin-konjugert alkalisk fosfatase og kvantifisert ved å benytte avbildningsanalyse.
Resultatene av dette forsøk er vist i Figur 20, 21 og 22.
Eksempel 22
Immunogenitet av vaksinekonstruksjoner
1. Cellulære tester
Den cellulære immunrespons omfatter cytotoksiske CD8-celler og CD4-hjelperceller. En følsom metode for å påvise spesifikke CD8- og CD4-celler er ELIspot-testen som kan benyttes for å kvantifisere antall celler som kan utskille interferon-y eller IL-2. ELIspot-testen baserer seg på oppfangingen av cytokiner utskilt fra individuelle celler. I korte trekk belegges spesialiserte mikrotiterplater med anti-cytokin antistoffer. Splenocytter isolert fra immuniserte dyr inkuberes over natten i nærvær av spesifikke peptider som representerer kjente epitoper (CD8) eller proteiner (CD4). Dersom celler stimuleres til frigjøring av cytokiner, vil de binde til antistoffene på den plateoverflate som omgir lokaliteten av de individuelle produserende celler. Cytokiner forblir festet til antistoff-belegget etter at cellene er lysert og platene vasket. Testen er utviklet på lignende måte som en ELISA-test ved å benytte et biotin/avidin amplifikasjonssystem. Antallet av flekker er likt antallet av cytokinproduserende celler.
CD8-responser på følgende K2<d->begrensede murine epitoper: Gag (AMQMLKETI), Nef (MTYKAAVDL) og RT (YYDPSKDLI) og CD4-responser på Gag-og RT-proteiner ble registrert for alle seks konstruksjoner. Resultatene av disse testene ble analysert statistisk og konstruksjoner rangert i henhold til deres immunogenitet. Resultatene er vist i Figur 23 av figurene.
2. Humorale tester
Blodprøver fra to forsøk ble oppsamlet for antistoffanalyse 7 og 14 dager etter boosterdosen. Serum ble fraskilt og oppbevart nedfrosset inntil antistoff-titeret kunne måles ved å benytte spesifikke ELISA-tester. Alle prøver ble testet med henblikk på antistoffer mot Gag, Nef og RT. I korte trekk ble ELISA-plater belagt med det relevante protein. Overskytende protein ble vasket av før fortynnede serumprøver ble inkubert i brønnene. Serumprøvene ble vasket av, og anti-mus antiserum konjugert til en passende merking, ble tilsatt. Platen ble fremkalt og lest på en plateleser. Resultatene er vist i Figur 24.
3. Antistoff-data
Antistoff-titere ble målt for alle seks konstruksjoner i fire forsøk. Konstruksjon p73i-GNR ga konsekvent ingen antistoffrespons på Gag og begrensede antistoff-responser på Nef. Grunnen til dette er uklar, idet T-celleresponser ble observert fra splenocytter isolert fra den samme mus, hvilket tyder på at Gag-proteinet ble uttrykt in vivo.
Rangeringen for utviklingen av Gag-spesifikke antistoffer var:
RNG>GRN>NRG>RGN>NGR>GNR
Analyse av cellulære immunologi-data
Formålet var å rangere de seks konstruksjonene på grunnlag av data fra telling av flekker fra 3 immunologiforsøk. Tre sett av responser ble målt: CD8-responser på Gag, Nef og RT på Dag 7 (7 dager etter primærdose), CD4-responser på Gag og RT på Dag 35 (7 dager etter boosterdose), CD8-responser på Gag, Nef og RT på Dag 35 (7 dager etter boosterdose).
Hver respons (f.eks. CD8-respons på Gag) ble forsøkt i modell ved å benytte en modell med lineær blandet effekt i SAS-versjon 8. Modellen inkluderte faste effekter av konstruksjon, enten angjeldende antigen (Gag, Nef eller RT) var tilstede eller fraværende, og om IL-2 var tilstede eller fraværende. For CD8-responser, hvor data var tilgjengelige fra hver enkelt mus, ble dessuten individ inkludert som en tilfeldig effekt i modellen. Modellen inkluderte interaksjonsbetingelser for å ta hensyn til en ulik konstruksjonseffekt for hver kombinasjon av antigenet (tilstede/fraværende) og IL-2 (tilstede/fraværende).
Ut fra modellen ble forskjellen i justert gjennomsnittlig respons mellom hver konstruksjon og p7313 (kontrollgruppen) anslått separat for hver kombinasjon av antigen (tilstede/fraværende) og IL-2 (tilstede/fraværende), sammen med en p-verdi som indikerer hvorvidt forskjellen var statistisk signifikant. Basert på forskjellene og p-verdiene i nærvær av antigenet og i fravær av IL-2, ble konstruksjoner rangert ved å tilordne en skåre på 6 til konstruksjonen med størst forskjell, 5 til den nest største, etc, men 0 til eventuelle konstruksjoner hvor forskjellen ikke var statistisk signifikant på 5% nivået.
Forutsetningene for modellen - at restene var normalfordelt med konstant varians, ble bestemt ved å benytte grafiske metoder og sensitivitetsanalyser, hvor først en log og dernest en kvadratrot-transformasjon av responsen ble benyttet i modellen. Rangeringen av konstruksjonene var ikke følsom for avvik fra forutsetningene for modellen.
Etter beregning av rangeringene for hver respons i hvert forsøk for seg, ble total rangering for de tre settene av responser beregnet over alle tre forsøk. Den følgende tabell viser de totale rangeringer over de tre forsøkene.
Totale rangeringer av konstruksjoner for hvert av tre sett av responser, kombinert over 3 immunologiske forsøk
RNG har den høyeste rangering for begge sett av responser på Dag 35 og den nest høyeste rangering, etter RGN, på Dag 7. RGN får også høye rangeringer for begge sett av responser på Dag 35.

Claims (16)

1. Nukleotidsekvens,karakterisert vedat den omfatter en sekvens som koder for et immunogenisk fusjonsprotein som omfatter et kodon optimalisert HIV-1 gag-protein, et kodon optimalisert RT protein og et HIV-1 Nef protein, operativt koblet til en heterolog promoter, hvori gag proteinet omfatter p17 og p24, RT proteinet inneholder en mutasjon for i alt vesentlig å inaktivere en hvilken som helst revers transkriptase aktivitet, og Nef proteinet inneholder en N-terminal trunkering.
2. Nukleotidsekvens ifølge krav 1, karakterisert vedat den kodonoptimaliserte sekvens etterligner kodonanvendelsen i et høyt uttrykt humant gen som har en RSCU-verdi på 0,5.
3. Nukleotidsekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat rekkefølgen av sekvensene er RT, gag, Nef eller RT, Nef, gag.
4. Nukleotidsekvens ifølge krav 1, karakterisert vedat den heterologe promoter er promoteren fra HCMV IE-gen.
5. Nukleotidsekvens ifølge krav 4,karakterisert vedat 5'av promoteren omfatter ekson 1.
6. Nukleotidsekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat RT er mutert ved å erstatte lysin med tryptofan 229.
7. Vektor,karakterisert vedat den omfatter en nukleotidsekvens ifølge krav 1.
8. Vektor ifølge krav 7,karakterisert vedat den er en viral vektor.
9. Vektor ifølge krav 8,karakterisert vedat den er et replikasjonsdefekt adenovirus.
10. Vektor ifølge krav 9,karakterisert vedat den er et dobbeltkjedet DNA-plasmid.
11. Protein,karakterisert vedat det kodes for av en nukleotidsekvens ifølge krav 1.
12. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens ifølge krav 1 eller en vektor ifølge krav 7 og et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff, fortynningsmiddel, bærer eller adjuvans.
13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det er tilpasset intramuskulær eller intradermal administrering.
14. Farmasøytisk preparat ifølge krav 12, karakterisert vedat bæreren er en gullkule.
15. Intradermal avleveringsanordning,karakterisert vedat den omfatter et farmasøytisk preparat ifølge krav 12.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av en nukleotidsekvens ifølge krav 1,karakterisert vedat den omfatter operativ kobling av en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 gag-protein eller fragment derav og et HIV-1 Nef-protein eller fragment derav, til en heterolog promotersekvens.
NO20041157A 2001-09-20 2004-03-19 Nukleotidsekvens, vektor, protein, farmasoytisk preparat, intradermal avleveringsanordning, samt fremgangsmate for fremstilling av en nukleotidsekvens. NO331826B1 (no)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/GB2001/004207 WO2002024225A1 (en) 2000-09-20 2001-09-20 Use of immidazoquinolinamines as adjuvants in dna vaccination
GB0129604A GB0129604D0 (en) 2001-12-11 2001-12-11 Novel compounds
GB0206462A GB0206462D0 (en) 2002-03-19 2002-03-19 Vaccines
PCT/EP2002/010592 WO2003025003A2 (en) 2001-09-20 2002-09-18 Hiv-gag codon-optimised dna vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20041157L NO20041157L (no) 2004-05-19
NO331826B1 true NO331826B1 (no) 2012-04-16

Family

ID=27256076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20041157A NO331826B1 (no) 2001-09-20 2004-03-19 Nukleotidsekvens, vektor, protein, farmasoytisk preparat, intradermal avleveringsanordning, samt fremgangsmate for fremstilling av en nukleotidsekvens.

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20070015721A1 (no)
EP (2) EP2322626A1 (no)
JP (1) JP4601956B2 (no)
CN (1) CN100392085C (no)
AR (1) AR036566A1 (no)
AU (1) AU2002362368B2 (no)
BR (1) BR0212619A (no)
CA (1) CA2461056A1 (no)
CO (1) CO5560591A2 (no)
HU (1) HUP0402259A3 (no)
IL (1) IL160809A0 (no)
MX (1) MXPA04002631A (no)
NO (1) NO331826B1 (no)
NZ (1) NZ531814A (no)
PL (1) PL207168B1 (no)
WO (1) WO2003025003A2 (no)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003216852B2 (en) * 2002-03-19 2008-09-11 Glaxo Group Limited Imidazoquinolineamines as adjuvants in HIV DNA vaccination
GB0225788D0 (en) 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
GB2406336A (en) * 2003-09-24 2005-03-30 Oxxon Pharmaccines Ltd HIV Pharmaccines
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
DE102004049223A1 (de) * 2004-10-08 2006-04-20 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Zubereitung zum Impfen, Impfverfahren und Verwendung einer Impf-Zubereitung
AU2012201827B2 (en) * 2005-05-12 2014-09-04 Glaxo Group Limited Vaccine composition
SG182173A1 (en) * 2005-05-12 2012-07-30 Glaxo Group Ltd Vaccine composition
EP2099486A2 (en) * 2006-11-30 2009-09-16 Government Of The United States Of America, As Represented by the Secretary Codon modified immunogenic compositions and methods of use
GB0700914D0 (en) * 2007-01-18 2007-02-28 Animal Health Inst Polynucleotides and uses thereof
DK2137210T3 (en) 2007-03-02 2017-01-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hitherto unknown method and compositions
CL2008001491A1 (es) 2007-05-24 2008-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion liofilizada que comprende uno o mas antigenos y un agonista del receptor de tipo toll 9 (tlr9); y procedimiento de preparacion.
WO2009092113A2 (en) * 2008-01-19 2009-07-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the delivery of vaccines to disrupted epithelium
EP2485759A4 (en) * 2009-10-09 2013-07-24 Univ New York METHODS, AGENTS AND PEPTIDES FOR INDUCING IMMUNE RESPONSE INNEED IN VACCINATION AGAINST HIV
BRPI0914507A2 (pt) * 2009-12-23 2012-04-10 Fundacao Oswaldo Cruz vacina para lentivìrus baseada em vìrus recombinante vacinal da febre amarela
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PT2772265T (pt) 2010-05-14 2018-04-20 Univ Oregon Health & Science Vectores de hcmv e rhcmv recombinantes e seus usos
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
DK2691530T3 (en) 2011-06-10 2018-05-22 Univ Oregon Health & Science CMV GLYCOPROTEIN AND RECOMBINANT VECTORS
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
US9783823B2 (en) 2013-03-05 2017-10-10 Oregon Health & Science University Cytomegalovirus vectors enabling control of T cell targeting
EP3083618B1 (en) 2013-12-17 2018-02-21 Pfizer Inc Novel 3,4-disubstituted-1h-pyrrolo[2,3-b]pyridines and 4,5-disubstituted-7h-pyrrolo[2,3-c]pyridazines as lrrk2 inhibitors
AP2017009743A0 (en) 2014-07-16 2017-02-28 Univ Oregon Health & Science Human cytomegalovirus comprising exogenous antigens
MA40783A (fr) 2014-10-03 2017-08-08 Los Alamos Nat Security Llc Vaccins contre le vih comprenant un ou plusieurs antigènes episensus de population
MA41756A (fr) 2015-02-10 2017-12-20 Fruh Klaus Procédés et compositions utiles dans la génération de réponses non canoniques de lymphocytes t cd8+
JP6873980B2 (ja) 2015-09-14 2021-05-19 ファイザー・インク ＬＲＲＫ２阻害薬としての新規のイミダゾ［４，５−ｃ］キノリンおよびイミダゾ［４，５−ｃ］［１，５］ナフチリジン誘導体
US10688164B2 (en) 2015-11-20 2020-06-23 Oregon Health & Science University CMV vectors comprising microRNA recognition elements
US10532099B2 (en) 2016-10-18 2020-01-14 Oregon Health & Science University Cytomegalovirus vectors eliciting T cells restricted by major histocompatibility complex E molecules
AU2020384323A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
EP0500799B1 (en) 1989-11-16 1998-01-14 Duke University Particle mediated transformation of animal skin tissue cells
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5583035A (en) * 1992-12-07 1996-12-10 Bayer Aktiengesellschaft HIV antisense expression vectors
US5654186A (en) 1993-02-26 1997-08-05 The Picower Institute For Medical Research Blood-borne mesenchymal cells
AU674815B2 (en) 1994-01-21 1997-01-09 Powderject Vaccines, Inc. Gas driven gene delivery instrument
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5786464C1 (en) * 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
GB9502879D0 (en) 1995-02-14 1995-04-05 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
HUP9901112A3 (en) * 1996-02-22 2001-06-28 Merck & Co Inc Synthetic hiv genes
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
WO1998039463A2 (en) * 1997-03-06 1998-09-11 Ueberla Klaus Lentivirus based vector and vector system
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2360347C (en) * 1998-12-31 2013-05-07 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
EP1141314A2 (en) * 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
AP1674A (en) * 1999-11-16 2006-10-30 Geneart Ag The genome of the HIV-1 inter-subtype (C/B') and use thereof.
EP1242441A4 (en) * 1999-12-17 2004-04-14 Merck & Co Inc POLYNUCLEOTIDE VACCINES EXPRESSING CODON-OPTIMIZED NEF HIV-1 PROTEIN AND MODIFIED HIV-1 NEF PROTEIN
MXPA02006379A (es) * 1999-12-23 2004-06-21 Medical Res Council Mejoriasen o relacionadas con la respuesta inmune a vih.
US6656706B2 (en) * 1999-12-23 2003-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes
EP1156112B1 (en) * 2000-05-18 2006-03-01 Geneart GmbH Synthetic gagpol genes and their uses
WO2002032943A2 (en) * 2000-08-14 2002-04-25 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modifications of hiv env, gag, and pol enhance immunogenicity for genetic immunization

Also Published As

Publication number Publication date
US20090203144A1 (en) 2009-08-13
NZ531814A (en) 2005-10-28
AU2002362368B2 (en) 2006-09-21
PL207168B1 (pl) 2010-11-30
NO20041157L (no) 2004-05-19
EP1427826B1 (en) 2011-04-20
WO2003025003A3 (en) 2003-12-04
CA2461056A1 (en) 2003-03-27
IL160809A0 (en) 2004-08-31
PL370359A1 (en) 2005-05-16
HUP0402259A2 (hu) 2005-01-28
BR0212619A (pt) 2004-08-17
MXPA04002631A (es) 2004-07-08
US20070015721A1 (en) 2007-01-18
EP1427826A2 (en) 2004-06-16
JP4601956B2 (ja) 2010-12-22
JP2005511019A (ja) 2005-04-28
HUP0402259A3 (en) 2010-01-28
CN100392085C (zh) 2008-06-04
CN1606624A (zh) 2005-04-13
CO5560591A2 (es) 2005-09-30
EP2322626A1 (en) 2011-05-18
WO2003025003A2 (en) 2003-03-27
AR036566A1 (es) 2004-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002362368B2 (en) HIV-gag codon-optimised DNA vaccines
AU2002362368A1 (en) HIV-gag codon-optimised DNA vaccines
EP0689551B1 (en) Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
KR100874552B1 (ko) 코돈-최적화 파필로마 바이러스 서열
JP4580410B2 (ja) 改善された免疫応答を誘導し得る発現ベクターおよびこのベクターの使用方法
JP4805511B2 (ja) Ｈｉｖに対する免疫応答における改善、または免疫応答に関する改善
US20070248679A1 (en) Vaccine
HRP970092A2 (en) Synthetic hiv genes
US7655235B2 (en) Vaccine
Kameoka et al. Cytotoxic T lymphocyte response in mice induced by a recombinant BCG vaccination which produces an extracellular α antigen that fused with the human immunodeficiency virus type 1 envelope immunodominant domain in the V3 loop
AU2003288084A1 (en) Vaccine against hcv
RU2312896C2 (ru) Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок gag вич-1, способ получения указанной последовательности, вектор, содержащий ее, белок, кодируемый ею, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики и/или лечения вич-инфекции и спида
KR101067231B1 (ko) Ｈｉｖ-ｇａｇ 코돈-최적화된 ｄｎａ 백신
ES2364466T3 (es) Vacunas de adn optimizadas por codón rt-nef-gaf para vih.
JP2006516386A (ja) ワクチン
CN101255434A (zh) 疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees