NO331506B1 - G-protein-koblet reseptor, nukleinsyre som koder for denne, ekspresjonsvektor, vertscelle og primer og anvendelse derav i assayer - Google Patents
G-protein-koblet reseptor, nukleinsyre som koder for denne, ekspresjonsvektor, vertscelle og primer og anvendelse derav i assayer Download PDFInfo
- Publication number
- NO331506B1 NO331506B1 NO20024779A NO20024779A NO331506B1 NO 331506 B1 NO331506 B1 NO 331506B1 NO 20024779 A NO20024779 A NO 20024779A NO 20024779 A NO20024779 A NO 20024779A NO 331506 B1 NO331506 B1 NO 331506B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- adenine
- binding
- nucleic acid
- polypeptide
- receptor
- Prior art date
Links
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 137
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 title claims abstract description 134
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 88
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 71
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 71
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 10
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims abstract description 167
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims abstract description 153
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 150
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 141
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 122
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 121
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 119
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 60
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 60
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 58
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 19
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 16
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 108010080192 Purinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000033 Purinergic Receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 129
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 27
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 26
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 8
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 8
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 7
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 7
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 7
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000001696 purinergic effect Effects 0.000 description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 6
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 6
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N UDP-Glc Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 5
- 108091008880 orphan GPCRs Proteins 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 5
- XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N γS-GTP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=S)[C@@H](O)[C@H]1O XOFLBQFBSOEHOG-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Chemical compound CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 101000857740 Homo sapiens Probable G-protein coupled receptor 160 Proteins 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102100025346 Probable G-protein coupled receptor 160 Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000007885 bronchoconstriction Effects 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000020341 sensory perception of pain Effects 0.000 description 4
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 4
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 3
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 description 3
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 3
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 3
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002057 chronotropic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000001091 dromotropic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 3
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000003326 hypnotic agent Substances 0.000 description 3
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000297 inotrophic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 3
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 108010056653 rat adenine receptor Proteins 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229940125723 sedative agent Drugs 0.000 description 3
- 239000000932 sedative agent Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 3
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 3
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 3
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 1-methyladenine Natural products N=C1N(C)C=NC2=C1NC=N2 SATCOUWSAZBIJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N Fluo-4 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OUVXYXNWSVIOSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033062 G-protein coupled receptor 61 Human genes 0.000 description 2
- 229940124812 GPR61 ligand Drugs 0.000 description 2
- 102100033839 Glucose-dependent insulinotropic receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100122785 Homo sapiens GPR61 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000996752 Homo sapiens Glucose-dependent insulinotropic receptor Proteins 0.000 description 2
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 101100497636 Mus musculus Cxcr5 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100122769 Mus musculus Gpr3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102100028045 P2Y purinoceptor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710096700 P2Y purinoceptor 2 Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101150059178 Plec gene Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical group C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003288 anthiarrhythmic effect Effects 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 230000001977 ataxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 208000021822 hypotensive Diseases 0.000 description 2
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N probenecid Chemical compound CCCN(CCC)S(=O)(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 DBABZHXKTCFAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003081 probenecid Drugs 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- DCQXTYAFFMSNNH-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanol;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.OCCN(CCO)CCO DCQXTYAFFMSNNH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N (z)-octadec-9-enoate;tris(2-hydroxyethyl)azanium Chemical compound OCCN(CCO)CCO.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ICLYJLBTOGPLMC-KVVVOXFISA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- DFCRUBKUVOJCOV-UHFFFAOYSA-N Fluo-5N Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1=CC=C(C2=C3C=C(F)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(F)C=C32)C=C1OCCOC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1N(CC(O)=O)CC(O)=O DFCRUBKUVOJCOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000008338 G protein-coupled adenosine receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040002766 G protein-coupled adenosine receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000887490 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(z) subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001017968 Homo sapiens Leukotriene B4 receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102100033374 Leukotriene B4 receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000543 Ligand-Gated Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004086 Ligand-Gated Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100040405 Lysophosphatidic acid receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710149746 Lysophosphatidic acid receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100040406 Lysophosphatidic acid receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710149751 Lysophosphatidic acid receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 102100037600 P2Y purinoceptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050008996 P2Y purinoceptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710096698 P2Y purinoceptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028070 P2Y purinoceptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108050009478 P2Y purinoceptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100028074 P2Y purinoceptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710096702 P2Y purinoceptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099471 Phosphodiesterase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Chemical group 0.000 description 1
- 102000004257 Potassium Channel Human genes 0.000 description 1
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100026173 Putative P2Y purinoceptor 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710085183 Putative P2Y purinoceptor 10 Proteins 0.000 description 1
- 101100015376 Rattus norvegicus Gnaz gene Proteins 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010042602 Supraventricular extrasystoles Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 102000041191 Type 1 family Human genes 0.000 description 1
- 108091061180 Type 1 family Proteins 0.000 description 1
- 102000041192 Type 2 family Human genes 0.000 description 1
- 108091061186 Type 2 family Proteins 0.000 description 1
- 102000038952 Type 3 family Human genes 0.000 description 1
- 108091065328 Type 3 family Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 1
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- MCEXQZRGUKALLT-VVEOGCPPSA-N acetyloxymethyl 2-[n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-2-[2-[[6-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-2-[(e)-(5-oxo-2-sulfanylideneimidazolidin-4-ylidene)methyl]-1-benzofuran-5-yl]oxy]ethoxy]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC(C(=C1)N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=CC2=C1OC(\C=C\1C(NC(=S)N/1)=O)=C2 MCEXQZRGUKALLT-VVEOGCPPSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000010953 base metal Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005460 biophysical method Methods 0.000 description 1
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000013262 cAMP assay Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002001 electrophysiology Methods 0.000 description 1
- 230000007831 electrophysiology Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003348 filter assay Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000052301 human GNAZ Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- RCCPEORTSYDPMB-UHFFFAOYSA-N hydroxy benzenecarboximidothioate Chemical compound OSC(=N)C1=CC=CC=C1 RCCPEORTSYDPMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002571 phosphodiesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Chemical group 0.000 description 1
- 108020001213 potassium channel Proteins 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UGJCNRLBGKEGEH-UHFFFAOYSA-N sodium-binding benzofuran isophthalate Chemical compound COC1=CC=2C=C(C=3C(=CC(=CC=3)C(O)=O)C(O)=O)OC=2C=C1N(CCOCC1)CCOCCOCCN1C(C(=CC=1C=2)OC)=CC=1OC=2C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O UGJCNRLBGKEGEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000874 thyrotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000001748 thyrotropin Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 229940117013 triethanolamine oleate Drugs 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/06—Antiarrhythmics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Psychology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
Abstract
Det beskrives en nukleinsyre som koder for en G-proteinkoblet receptor (adeninbindende GPCR) med spesifisitet for adenin, isolert adeninbindende GPCR, assay- og behandlingsmetoder som benytter seg av denne.
Description
Område for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny G-protein-koblet receptor fra pattedyr, nukleinsyre som koder for denne og anvendelse derav i assayer.
Bakgrunn for oppfinnelsen
GTP-bindende proteiner (G-proteiner) fungerer som mellomledd mellom bindingen av ligander slik som hormoner og andre kjemiske mediatorer til G-protein-koblede reseptorer (GPCR'er) og aktivering av intracellulære effektorer. Etter binding av en ligand til en GPCR, gjennomgår de cytoplasmatiske domener av receptoren konformasjonelle endringer som muliggjør en vekselvirkning av receptoren med et G-protein, hvilket i sin tur muliggjør en aktivering av intracellulære mellomledd slik som adenylatcyklase, fosfolipase C eller ionkanaler. Et slikt system tillater amplifikasjon av det opprinnelige signal idet mange sekundære budbringere kan produseres som respons på bindingen av en enkelt ligand ved GPCR. Ved denne mekanisme kan celler føle og reagere på endringer i sitt eksterne miljø.
G-protein-koblede reseptorer danner en superfamilie av integrale plasmamembranproteiner, idet hver receptor har som et felles trekk syv hydrofobe transmembrane domener som hvert er 20-30 aminosyrer langt og som er koblet sammen av hydrofile aminosyresekvenser av forskjellig lengde. Aminoterminus av receptoren er ekstracellulær, mens karboksyterminus finnes i cytoplasma av cellen.
GPCR'er finnes i et bredt utvalg av vev og celletyper og er omfattet i mange forskjellige fysiologiske prosesser. De aktiveres av et bredt utvalg av ligander, for eksempel hormoner slik som luteiniserende hormon, follikkelstimulerende hormon, choriongonadotrofin, thyrotropin, adrenokortikotrofin, glukagon og vasopressin; neurotransmittere slik som 5-HT, acetylkolin (muskarin-AchR), histamin, prostaglandiner, kalsitonin, leukotriener og Ca<2+>. Den brede fordeling og de vidt forskjellige roller av GPCR'er tyder på at GPCR'er kan spille viktige roller i forskjellige patologiske tilstander. Faktisk har GPCR'er vist seg å være omfattet i sykdommer forbundet med bronkokonstriksjon, hypertensjon, betennelse, hormonforstyrrelser, diabetes, apoptose, nocicepsjon, forenkling av neurotransmisjon og tremorforstyrrelser.
Én gruppe GPCR'er som er av spesiell interesse, er slike som virker som reseptorer for nukleotider. Nukleotidreseptorer er blitt plassert i tre familier: Pl, P2Y og P2X
(Ralevic og Burnstock, 1998 Pharmacological Reviews 50 (3): 413-492), hvorav Pl-og P2Y-familiene er GPCR'er. Pl-reseptorer aktiveres av adenosin og binder ikke adenin (Bruns et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77 (50: 5547-51, 1980; Schwabe
og Trost, 1980 Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 313 (3): 197-87; Schwabe et al., 1982, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 321 (1): 84-87). Medlemmer av Pl-receptorfamilien er delt opp i tre delfamilier, som er kjent som adenosin type 1-familien, adenosin type 2-familien og adenosin type 3-familien.
P2Y-familien inneholder fire familier av GPCR'er som aktiveres av nukleotider. Nærmere bestemt er dette P2Y1 (som aktiveres av ADP og ATP), P2Y2 (også benevnt P2; disse GPCR'er aktiveres like sterkt av ATP og UTP), P2Y3 og P2Y6 (den relative agoniststyrke er UDP>UTP>ADP) og P2Y4 (UTP>ATP). Et antall andre GPCR'er som har sekvenshomologi med P2Y2-gruppen, ble opprinnelig ansett å også være nukleotidreseptorer (P2Y5, P2Y7, P2Y9 og P2Y10), men det er nå kjent at de ikke aktiveres av nukleotider.
P2X-familien er en gruppe ubeslektede proteiner som ikke kobles til G-proteiner. Medlemmer av denne gruppe er ligandportforsynte ionkanaler.
W099/32519A1 beskriver syv G-proteinkoblede reseptorer hovedsakelig uttrykt i de dorsale rotganglier, en fra rotte og seks humane. Reseptorene kan anvendes i assays for å identifisere forbindelser som binder til, og modulerer, de biologiske effektene av reseptorene, og som således fungerer som agonister aller antagonister. SEQ ID NO 9 i W099/32519A1 har 52.761% identitet over et område på 326 aminosyrer med SEQ ID. NO. 2 i den foreliggende søknaden og 99.068% identitet over et område på 322 aminosyrer med SEQ ID NO: 4 i den foreliggende søknaden. Nukleinsyren angitt i SEQ ID NO 10 i W099/32519A1 koder for polypeptidet angitt i SEQ ID NO 9 beskrevet i den foreliggende beskrivelsen.
EMBL-referansenr. AC027026 viser en nukleinsyresekvens som har 67.991% sekvensidentitet med SEQ ID NO 1 i den foreliggende beskrivelsen, over et område på 931 basepar. Det tilsvarende kodede produkt har 53.11% sekvensidentitet med SEQ ID NO 2 i den foreliggende beskrivelsen, over et område på 337 aminosyrer.
EMBL-referansenr. AC023078 viser en nukleinsyresekvens som omfatter nukleinsyrene ifølge SEQ ID NO 3, 5, 6, 7, 8 og 9 i den foreliggende beskrivelsen. Ettersom G-protein-koblede reseptorer spiller en såpass viktig rolle i et bredt utvalg av cellulære og fysiologiske prosesser, finnes det en pågående interesse i å bedømme funksjonen av slike reseptorer og deres potensielle rolle i forskjellige sykdommer.
Sammenfatning av oppfinnelsen
I løpet av forskningen om GPCR'er, har foreliggende oppfinnere oppdaget en ny GPCR som representerer en ny GPCR-klasse og som er blitt benevnt adeninbindende GPCR. Når sekvensen av den nye GPCR i rotte ble sammenlignet med hva som var kjent i teknikkens stand, fant oppfinnerne til sin overraskelse at den nærmest beslektede GPCR har til felles kun ca. 50% sekvensidentitet med den nye receptor, hvilket tyder på at den nye GPCR representerer et medlem av en ny klasse GPCR. Nærmere undersøkelser identifiserte den naturlige ligand av receptoren som adenin. Dette er den første demonstrasjon av en GPCR som har adenin som sin naturlige ligand, hvilket tyder på at denne GPCR representerer en ny klasse GPCR. Faktisk er dette den første demonstrasjon av en receptor av hvilken som helst type som har adenin som sin naturlige receptor og, ettersom den nye receptor har vist seg å foreligge i pattedyr-cortex, representerer den den første beskrivelse av adenin som neurotransmitter. Nærmere undersøkelser identifiserte seks humane homologer av receptoren, som også utgjør en del av oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en adeninbindende G-protein-koblet receptor. Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert polypeptid som har sekvensen SEKV ID NR: 2. Polypeptider som er fragmenter av polypeptidet med SEKV ID NR: 2, tilveiebringes også, idet disse fragmenter har en størrelse på minst 10, for eksempel minst 20, 30, 40, 50, 75, 100 eller 150 eller flere aminosyrer. Slike fragmenter kan avledes fra N-terminal region av henholdsvis SEKV ID NR: 2. Fragmenter som omfatter N-terminal region, kan brukes til å rekonstituere det ekstracellulære parti av receptoren for å tilveiebringe receptorbindingsseter. Fortrinnsvis vil fragmenter beholde sin evne til å binde adenin.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert polypeptid som har minst 80% og fortrinnsvis minst 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet med polypeptidet med SEKV ID NR: 2. Det er ønskelig at slike polypeptider beholder sin evne til å binde adenin og fortrinnsvis til å danne en receptor som kan aktiveres av adenin. På lignende måte tilveiebringes polypeptider som er fragmenter med minst 20 aminosyrer av disse polypeptider og som fortrinnsvis har minst 80% og fortrinnsvis minst 90%, 95% eller 98% identitet med et fragment med SEKV ID NR: 2 av den tilsvarende lengde, bl.a. N-terminale fragmenter. Det er ønskelig at slike polypeptider beholder sin evne til å binde adenin og fortrinnsvis til å danne en receptor som kan aktiveres av adenin.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en isolert nukleinsyresekvens som koder for polypeptidet med SEKV ID NR: 2. I et foretrukket trekk er den isolerte sekvens sekvensen med SEKV ID NR:1. Oppfinnelsen tilveiebringer også et DNA-molekyl som koder for polypeptidet med SEKV ID NR: 2. Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten isolerte nukleinsyrer som koder for polypeptidene som ble nevnt i de siste to avsnitt. Dessuten tilveiebringes DNA-molekyler som koder for polypeptidene.
Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen omfatter dessuten nukleinsyrer som omfatter en sekvens som har minst 80% og fortrinnsvis minst 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet med nukleinsyresekvensen med SEKV ID NR: 1. Fortrinnsvis vil denne sekvensen hybridisere til den tilsvarende nukleinsyre under betingelser som er regulert for å minimere den ikke-spesifikke binding. Fortrinnsvis brukes stringente til moderat stringente hybridiseringsbetingelser. Egnede betingelser omfatter f.eks. for påvisning av sekvenser som er ca. 80-90% identiske, hybridisering over natten ved 42°C i 0,25M Na2HP04, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% dekstransulfat og en endelig vasking ved 55°C i 0,1X SSC, 0,1% SDS. For påvisning av sekvenser som er mer enn ca. 90% identiske, omfatter egnede betingelser hybridisering over natten ved 65°C i 0,25M Na2HP04, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% dekstransulfat og en endelig vasking ved 60°C i 0,1X SSC, 0,1% SDS.
Det vil forstås at slike nukleinsyrer ikke nødvendigvis koder for "hellengdes" polypeptider, og dermed vil omfatte nukleinsyrer som for eksempel representerer mutantformer av det adeninbindende GPCR-gen hvor den kodende sekvens er blitt terminert for tidlig enten ved en substitusjon som førte til et stop-kodon, eller en rammeforskyvningsmutasjon. Disse utgjør også nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyrer som er fragmenter av nukleinsyrene som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. I ett trekk tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyreprimere som i det vesentlige består av fra 15 til 50, for eksempel fra 15 til 35, 18 til 35, 15 til 24, 18 til 30, 18 til 21 eller 21 til 24 nukleotider av en sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen eller dens komplement.
Nukleinsyrer og polypeptider ifølge oppfinnelsen kan brukes terapeutisk for å behandle sykdom. Nærmere bestemt kan de brukes til å behandle sykdommer hvis patologi er forbundet med en virkning ved purinreseptorer, spesielt slike som er forbundet med med mutasjon eller nedregulering av ekspresjonen av native adeninbindende GPCR'er. Nærmere bestemt kan de brukes som antikonvulsiva, sedativer, hypnotiske midler, hypotensiver, antiarrhytmiske midler, negative kronotropika, dromotropika og inotropika, eller ved behandling av patologiske tremorforstyrrelser, ataksi eller av sykdom forbundet med nocicepsjon eller forenkling av neurotransmisjonen. I tillegg til at de finner anvendelse i forstyrrelser forbundet med CNS, kan de dessuten brukes som inhibitorer av blodplateaggregasjon, stimulanter av NO-produksjon av vaskulære endotelceller i det kardiovaskulære system, som inhibitorer av magesaftutsondring eller ved sykdom forbundet med apoptose, bronkokonstriksjon, vasodilasjon eller betennelse.
I et ytterligere trekk tilveiebringes vektorer som omfatter sekvensene av nukleinsyrene, spesielt ekspresjonsvektorer som omfatter en promoter operabelt bundet til nukleinsyresekvensene ifølge oppfinnelsen. Vektorene kan bæres av en vertcelle og uttrykkes i cellen. Etter ekspresjonen kan polypeptider ifølge oppfinnelsen isoleres.
I et ytterligere trekk tilveiebringer oppfinnelsen assaymetoder for identifikasjon av substanser som bindes til eller modulerer aktiviteten av polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Nærmere bestemt ser man for seg at slike substanser, som kan være peptider eller ikke-peptider, brukes ved behandling som beskrevet ovenfor.
Ettersom foreliggende oppfinnere er de første som har identifisert en receptor av hvilken som helst type som har adenin som sin naturlige ligand, og ettersom den nye receptor har vist seg å foreligge i pattedyr-cortex, er oppfinnerne de første som beskriver adenin som en neurotransmitter. Dermed åpner foreliggende oppfinnelse for muligheten til å bruke adenin i og for seg og/eller forbindelser som etterligner eller antagoniserer adenin, i terapeutiske anvendelser. Nærmere bestemt ser man for seg at adenin kan brukes til behandling av sykdom hvis patologi er forbundet med virkning ved purinreseptorer, spesielt adeninreseptorer. Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av adenin ved fremstilling av et legemiddel for behandling av hvilken som helst av sykdommene eller tilstandene som ble beskrevet ovenfor. Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer og bindingsfragmenter derav som har evnen til å selektivt bindes til polypeptider ifølge oppfinnelsen. Antistoffene og bindingsfragmentene kan derfor brukes ved diagnostiske tester for identifikasjon av polypeptidene ifølge oppfinnelsen i biologiske prøver.
Disse og andre trekk av oppfinnelsen skal beskrives i større detalj heri.
Beskrivelse av sekvensene
SEKV ID NR: 1 er nukleotidsekvensen for adeninbindende GPCR i rotte.
SEKV ID NR: 2 er aminosyresekvensen for adeninbindende GPCR i rotte.
Kort beskrivelse av tegningene
Fig. 1 illustrerer sekvenslinjestillingen av aminosyresekvensene av adeninbindende GPCR fra rotte (SEKV ID NR: 2) og humant adeninbindende GPCR1 (SEKV ID NR: 4) Fig. 2 illustrerer aktivering av adeninbindende GPCR fra rotte med cortexekstrakt-C18-fraksjoner fra svin etter forbigående transfeksjon inn i HEK293-celler som uttrykker Gaqo-kimærer. Fig. 3 illustrerer aktivering av adeninbindende GPCR fra rotte med cortexekstrakt-C18-fraksjoner fra svin etter forbigående transfeksjon inn i HEK293-celler som uttrykker Gaqi-kimærene. Fig. 4 illustrerer stimulering av Ca<2+->transienter i HEK293/Gaqi-celler som var transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte/pcDNA3 ved påføring av 3,3 nM til 33 uM adenin. Fig. 5 illustrerer Ca<2+->transienter som var utløst i HEK293/Gaqi-celler som var transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte/pcDNA3 ved påføring av 3,3 uM uridin, guanin, hypoxantin, xantin, koffein, UDP og adenin. Fig. 6 illustrerer Ca<2+->transienter som var utløst i HEK293/Gaqi-celler som var transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte/pcDNA3 ved påføring av 3,3 uM adenosin, AMP, ADP, ATP og adenin. Fig. 7 illustrerer Ca<2+->transienter som var utløst i HEK293/Gaqi-celler som var transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte/pcDNA3 ved påføring av 3uM PBS, xantin, guanin og hypoxantin. Fig. 8a illustrerer stimulering av [<35>S]GTPyS-binding på CHO-membraner som var forbigående transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte. Dataen presenteres som gjennomsnittet for 3 uavhengige eksperimenter (±SEM; n=3). Fig. 8b illustrerer stimulering av [<35>S]GTPyS-binding på villtype-CHO-membraner. Dataen presenteres som gjennomsnittet for 3 uavhengige eksperimenter (±SEM; n=3). Fig. 9a illustrerer inhibering av forskolin-stimulert cAMP-dannelse på CHO-celler som var forbigående transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte. Assayet ble utført i 0,5% hiFCS ved bruk av direkte RIA-settet fra NEN. Representative kurver. Fig. 9b illustrerer inhibering av forskolin-stimulert cAMP-dannelse på CHO-celler som var forbigående transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte. Assayet ble utført i 2% hiFCS ved bruk av direkte RIA-settet fra NEN. Representative kurver. Fig. 10 illustrerer adenin-doseresponskurven for stimulering av [<35>S]GTPyS-binding på CHO-membraner som var permanent transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte. Fig. Ila illustrerer inhibering av forskolin-stimulert cAMP-dannelse på CHO-celler som var permanent transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte (klon 28). Figuren viser representative kurver som ble erholdt ved bruk av 0,5 og 10% serumkonsentrasjoner, hver i nærvær og fravær av Na-butyratinduksjon. Fig. 11b illustrerer inhibering av forskolin-stimulert cAMP-dannelse på villtype-CHO-celler. Figuren viser representative kurver som ble erholdt ved bruk av 0,5 og 10% serumkonsentrasjoner, hver i nærvær og fravær av Na-butyratinduksjon. Fig. 12a illustrerer adenin-doseresponskurver for målinger av intracellulært Ca<2+>på CHO-celler som var permanent transfisert med adeninbindende GPCR fra rotte (klon 28) i nærvær og fravær av Na-butyrat. Fig. 12b illustrerer adenin-doseresponskurver for målinger av intracellulært Ca<2+>på villtype-CHO-celler, i nærvær og fravær av Na-butyrat.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Nukleinsyre
Nukleinsyre omfatter DNA (både genomisk og cDNA)og RNA. Når nukleinsyre ifølge oppfinnelsen omfatter RNA, skal henvisninger til sekvensene som vises i de vedlagte sekvensopplistinger, anses å vise til RNA-ekvivalenten, hvor U erstatter T.
Nukleinsyre ifølge oppfinnelsen kan være enkelt- eller dobbeltkjedet. Enkeltkjedede nukleinsyrer ifølge oppfinnelsen omfatter anti-sense nukleinsyrer. Dermed vil det forstås at en henvisning til SEKV ID NR: 1 eller sekvenser som omfatter SEKV ID NR: 1 eller fragmenter derav, omfatter komplementære sekvenser hvis ikke det motsatte klart fremgår fra sammenhengen.
Generelt tilveiebringes nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse som et isolat, i isolert og/eller renset form, eller fri eller i det vesentlige fri for materiale som det er naturlig forbundet med, slik som fri eller i det vesentlige fri for nukleinsyre som flankerer genet i den humane genom, unntatt eventuelt én eller flere regulatoriske sekvenser for ekspresjon. Nukleinsyre kan være helt eller delvis syntetisk og kan omfatte genomisk DNA, cDNA eller RNA.
Oppfinnelsen tilveiebringer også nukleinsyrer som er fragmenter av nukleinsyrene som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. I ett trekk tilveiebringer oppfinnelsen nukleinsyreprimere som i det vesentlige består av fra 15 til 50, for eksempel fra 15 til 35, 18 til 35, 15 til 24, 18 til 30, 18 til 21 eller 21 til 24 nukleotider av en sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen eller dens komplement.
Begrepet "består i det vesentlige av" viser til nukleinsyrer som ikke omfatter noen ytterligere 5'- eller 3'-nukleinsyresekvenser. I et ytterligere trekk av oppfinnelsen kan imidlertid nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen som i det vesentlige består av fra 15 til 30 nukleotider som definert ovenfor, være bundet i 3'-, men fortrinnsvis 5'-ende til korte (f.eks. fra 4 til 15, slik som fra 4 til 10 nukleotider) ytterligere sekvenser som de ikke er naturlig bundet til. Slike ytterligere sekvenser er fortrinnsvis bindeledd som omfatter et restriksjonsenzym-gjenkjenningssete for å forenkle kloning når nukleinsyren ifølge oppfinnelsen brukes for eksempel som PCR-primer.
Det er ønskelig at primere ifølge oppfinnelsen har evnen til å selektivt hybridisere til nukleinsyrer som koder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen. Med "selektiv" menes selektiv med hensyn til sekvenser som koder for andre purinreseptorer, og nærmere bestemt med hensyn til andre reseptorer enn adeninreseptorer. Evnen av sekvensen til å hybridisere selektivt kan bestemmes ved eksperimentering eller beregnes.
Én måte å beregne Tm-verdien av en primer er for eksempel ved henvisning til formelen for å beregne Tm-verdien av primere til en homolog målsekvens. Denne formel erTm(<0>C) = 2(A+T) + 4(G+C) - 5. Dette vil gi Tm-verdien under betingelser med 3xSSC og 0,1% SDS (hvor SSC er 0,15 M NaCI, 0,015 M natriumcitrat, pH 7). Denne formel er generelt egnet for primere med en lengde på opptil ca. 50 nukleotider. I foreliggende oppfinnelse kan denne formel brukes som algoritme for å beregne en nominell Tm-verdi av en primer for en bestemt sekvens avledet fra en sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Tm-verdien kan sammenlignes med en beregnet Tm-verdi for GPCR-sekvenser fra mennesker og rotter, på grunnlag av det maksimale antall overensstemmeler med hvilken som helst del av disse andre sekvenser.
Egnede betingelser for at en primer skal hybridisere til en målsekvens kan også måles eksperimentelt. Egnede eksperimentelle betingelser omfatter å hybridisere en kandidatprimer både til en nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, og til en nukleinsyre som koder for andre adeninreseptorer, på en fast bærer under lavstringente hybridiseringsbetingelser (f.eks. 6xSSC ved 55°C), vasking ved nesatt SSC og/eller høyere temperatur, for eksempel ved 0,2xSSC ved 45°C, og å heve hybridiseringstemperaturen trinnvis for å bestemme hybridiseringsbetingelsene som gjør det mulig for primeren å hybridisere til nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, men ikke til andre purinreseptorer som koder for nukleinsyrer.
Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen, spesielt primere, kan bære en gjenkjenningsmarkør. Egnede markører omfatter radioisotoper slik som<32>P eller<35>S, fluorescerende markører, enzymmarkører eller andre proteinmarkører slik som biotin. Slike markører kan tilføyes til polynukleotider eller primere ifølge oppfinnelsen og kan påvises ved bruk av teknikker som i og for seg er kjent. Primere ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte syntetiske nukleinsyrer, slik som slike med modifiserte grunnstrukturer som er ment å skulle forbedre stabiliteten av nukleinsyren i en celle. Et antall forskjellige typer modifikasjoner av oligonukleotider er kjent innen faget. Disse omfatter metylfosfonat- og fosfortioat-grunnstrukturer, tilføyelse av akridin- eller polylysin-kjeder i 3'- og/eller 5'-ende av molekylet. For hensiktene med foreliggende oppfinnelse bør det forstås at polynukleotidene som beskrives heri, kan være modifisert ved hvilken som helst metode som er tilgjengelig innen faget. Slike modifikasjoner kan utføres for å forbedre in wVo-aktiviteten eller levetiden av polynukleotidene ifølge oppfinnelsen.
Også omfattet innen rammen for oppfinnelsen er antisense-sekvenser basert på nukleinsyrensekvenser som beskrives heri, fortrinnsvis i form av oligonukleotider, spesielt stabiliserte oligonukleotider, eller ribozymer.
Antisense-oligonukleotider kan være utformet til å hybridisere til den komplementære sekvens av nukleinsyre, pre-mRNA eller modent mRNA, forstyrre produksjonen av polypeptid som kodes for av en gitt mål-DNA-sekvens, slik at dens ekspresjon nedsettes eller forhindres fullstendig. Ribozymer vil utformes til å spalte mRNA som kodes for av en adeninbindende GPCR som koder for en nukleinsyresekvens ifølge oppfinnelsen, helst ved en målsekvens som er spesifikk for den adeninbindende GPCR, dvs. én som ikke finnes i andre GPCR-sekvenser. Konstruksjonen av antisense-sekvenser og deres anvendelse beskrives av Peyman og Ulman, Chemical Reviews, 90: 543-584, (1990); Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 329-376, (1992); og Zamecnik og Stephenson, P.N.A.S, 75: 280-284,
(1974). Konstruksjonen av ribozymer og deres anvendelse beskrives av for eksempel Gibson og Shillitoe, Molecular Biotechnology 7 (2): 125-137, (1997).
Antisense- og ribozymsekvenser ifølge oppfinnelsen kan innføres i pattedyrcellelinjer i kultur for å undersøke funksjonen av adeninbindende GPCR, for eksempel ved å forårsake en nedregulering av dette gen og å observere de fenotypiske virkninger, eller ved ekspresjon eller lokalisering av proteiner som beskrives heri og som forbindes med adeninbindende GPCR. I celler hvor det finner sted en avvikende ekspresjon av adeninbindende GPCR, kan slike antisense- og ribozymsekvenser brukes til å nedregulere ekspresjonen av genet.
cDNA-sekvensen av GPCR'en ifølge oppfinnelsen kan kloned ved bruk av standard PCR (polymerasekjedereaksjon)-kloneteknikker. Dette omfatter å fremstille et primerpar for 5'- og 3'-ende på motstående kjeder av SEKV ID NR: 1, bringe
primerne i berøring med mRNA eller cDNA erholdt fra en cortikalcelle fra pattedyr, utføre en polymerasekjedereaksjon under betingelser som tilveiebringer amplifikasjon av den ønskede region, isolere det amplifiserte fragment (f.eks. ved å rense reaksjonsblandingen på en agarosegel) og isolere det amplifiserte DNA. Primerne kan være utformet til å inneholde egnede restriksjonsenzym-gjenkjenningsseter slik at det amplifiserte DNA kan klones inn i en egnet kloningsvektor.
Polynukleotider som ikke er 100% homologe med sekvensen av SEKV ID NR: 1, men som koder for enten SEKV ID NR: 2 eller andre polypeptider ifølge oppfinnelsen, kan erholdes på forskjellige måter.
For eksempel kan det utføres en seterettet mutagenese av sekvensen med SEKV ID NR: 1. Dette er nyttig når det for eksempel er nødvendig med stumme kodonendringer i sekvenser for å optimere kodonpreferanser for en bestemt vertcelle hvor polynukleotidsekvensene skal uttrykkes. Andre sekvensendringer kan være ønskelige for å innføre restriksjonsenzym-gjenkjenningsseter, eller for å endre egenskapene eller funksjonen av polypeptidene som kodes for av polynukleotidene. Ytterligere endringer kan være ønskelige for å representere bestemte kodeendringer som er nødvendige for å for eksempel tilveiebringe konservative substitusjoner.
Nukleinsyrene ifølge oppfinnelsen kan omfatte ytterligere sekvenser i 5'- eller 3'-ende. For eksempel kan syntetiske eller naturlige 5'-ledesekvenser festes til nukleinsyren som koder for polypeptidene ifølge oppfinnelsen. De ytterligere sekvenser kan også omfatte 5'- eller 3'-utranslaterte regioner som er nødvendige for transkripsjonen av nukleinsyre ifølge oppfinnelsen i bestemte vertceller.
I tillegg kan andre animalske homologer, spesielt fra pattedyr (f.eks. mennesker eller kaniner), mer spesielt primater, bl.a. mennesker, av adeninbindende GPCR erholdes. Slike sekvenser kan erholdes ved å fremstille eller erholde cDNA-samlinger fremstilt fra delende celler eller vev eller genomiske DNA-samlinger fra andre dyrearter, og å probe slike samlinger med prober omfattende hele eller deler av SEKV ID NR: 1, under betingelser med middels til høy stringens (for eksempel 0,03 M natriumklorid og 0,03 M natriumcitrat ved fra ca. 50<*>C til ca. 60<*>C).
Foreliggende oppfinnelse omfatter dessuten en isolert DNA-sekvens som omfatter sekvenser som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, men hvor de kodende sekvenser er delt opp i to eller flere (fortrinnsvis ikke flere enn fem, f.eks. fire eller tre) eksoner. Slike eksonsekvenser kan være naturlige og erholdt fra genomiske kloner, eller syntetiske. Eksonsekvenser kan brukes ved konstruksjon av mini-gensekvenser som omfatter nukleinsyre som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen, hvilke sekvenser er avbrutt av én eller flere eksonsekvenser.
Mini-gener kan også konstrueres ved bruk av heterologe eksoner, avledet fra hvilken som helst eukaryotiske kilde.
Nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, slik som en hellengdes kodende sekvens eller en oligonucleotidprobe eller primer, kan tilveiebringes som en del av
et sett, f.eks. i en egnet beholder slik som et glass, hvor inneholdet er beskyttet fra det eksterne miljø. Settet kan omfatte veiledninger for bruk av nukleinsyren, f.eks.
i PCR og/eller en fremgangsmåte for å bestemme nærvær av en aktuell nukleinsyre i en testprøve. Et sett hvor nukleinsyren er tiltenkt en bruk i PCR, kan omfatte ett eller flere andre reagensmidler som er nødvendige for reaksjonen, slik som polymerase, nukleosider, bufferoppløsning osv.
Nukleinsyren ifølge oppfinnelsen kan brukes i nukleinsyre-baserte tester for å påvise den adeninbindende GPCR som koder for sekvenser i rotters, menneskers eller andre pattedyrs kropp eller vev eller prøver erholdt derav. I tilfellet av påvisning, kan denne være kvalitativ og/eller kvantitativ, bl.a. metoder slik som mikroarrayteknologi på en DNA-brikke. Påvisningen omfatter analytiske trinn slik som slike som omfatter å sekvensiere genet helt eller delvis.
Slike tester for påvisning omfatter generelt å bringe en human prøve som inneholder DNA eller RNA, i berøring med en probe som omfatter en nukleinsyre ifølge oppfinnelsen eller en primer ifølge oppfinnelsen, under hybridiserende betingelser, og å påvise eventuelle duplekser som dannes mellom proben og nukleinsyren i prøven. En slik påvisning kan oppnås ved bruk av teknikker slik som PCR eller ved å immobilisere proben på en fast bærer, fjerne nukleinsyre i prøven som ikke hybridiseres til proben, og deretter påvise nukleinsyre som har hybridisert til proben. Alternativt kan nukleinsyreprøven immobiliseres på en fast bærer, og mengden av probe som bindes til en slik bærer, kan påvises. Egnede assaymetoder av dette eller andre formater finnes for eksempel i WO89/03891 og WO90/13667.
En ytterligre påvisningsmetode ifølge oppfinnelsen er å påvise endringer i villtype-adeninbindende GPCR-gener, bl.a. enkeltbaseendringer, for eksempel ved bruk av enkeltkjedet konformasjonell polymorfisme (SSCP)-analyse. En nukleinsyresekvens fra hele eller en del av en adeninbindende GPCR som koder for DNA eller mRNA i en prøve, kan hybridiseres til en referansesekvens, og mobiliteten av hybridet observeres i en gel under betingelser hvor alle eventuelle ikke-hybridiserte regioner innen dupleksen gir opphav til endringer i mobiliteten.
Nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse er også nyttige ved vevfordelingsundersøkelser, for å bekrefte og utvide kunnskapen om dette gens fordeling i cortex, dorsalroten, CNS og PNS og andre vev.
Polypeptider
Isolerte polypeptider ifølge oppfinnelsen vil være slike som ble definert ovenfor, i isolert form, fri eller i det vesentlige fri for materiale som det naturlig er forbundet med, slik som andre polypeptider som det finnes sammen med i cellen. Polypeptidene kan såklart formuleres med tynnere eller adjuvanser og fortsatt være isolert i praktisk forstand - for eksempel vil polypeptidene normalt være blandet sammen med gelatin eller andre bærere hvis de brukes til å bestryke mikrotiterplater for bruk i immunoassayer. Polypeptidene kan være glykosylert, enten naturlig eller ved bruk av systemer med heterologe eukaryotiske celler, eller de kan (for eksempel hvis de er blitt fremstilt ved ekspresjon i en prokaryotisk celle) være uglykosylert. Polypeptider kan også være fosforylert og/eller acetylert.
Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også foreligge i i det vesentlige renset form, i hvilket tilfelle det generelt vil omfatte polypeptidet i et preparat hvor over 90%, f.eks. 95%, 98% eller 99% av polypeptidet i preparatet er et polypeptid ifølge oppfinnelsen.
Polypeptider ifølge oppfinnelsen kan modifiseres for eksempel ved tilføyelse av histidinresiduer for å fremme deres rensing, eller ved tilføyelse av en signalsekvens for å fremme deres utsondring fra en celle.
Polypeptider som har minst 80%, for eksempel 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet med SEKV ID NR: 2, kan være polypeptider som er aminosyresekvensvarianter, alleler, derivater eller mutanter av henholdsvis SEKV ID NR: 2, og tilveiebringes også av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan et slikt polypeptid ha en aminosyresekvens som skiller seg fra hva som oppgis i SEKV ID NR: 2, med én eller flere tilføyelser, substitusjoner, delesjoner og innføyelse av én eller flere (slik som fra 1 til 20, for eksempel 2, 3, 4, eller 5 til 10) aminosyrer.
Prosentdelen identitet av polypeptidsekvenser kan beregnes ved bruk av handelstilgjengelige algoritmer som sammenligner en referansesekvens(f.eks. SEKV ID NR: 2 ifølge foreliggende oppfinnelse) med en spørresekvens. Ytterligere detaljer ved bedømmelse av identiteten, skal beskrives i det følgende.
I foreliggende undersøkelse ble nukleotidsekvensen SEKV ID NR: 2 analysert ved BLAST (Altschul et al., 1997)-søk for å undersøke om beslektede GPCR'er med kjente ligander kunne påvises. Imidlertid var de nærmeste homologer av denne foreldreløse GPCR som ble funnet, selv foreldreløse GPCR'er. Disse var en familie av humane GPCR'er (Derwent sekvensdatabase-tilgangsnumre Z10067, Z10068, Z10069, Z10070, Z10071 og Z10072) klonet fra dorsalroot-ganglion som har ca. 50% residuer til felles med adeninbindende GPCR fra rotte. Foreliggende oppfinnere har nå identifisert disse seks foreldreløse GPCR'er som å være seks humane homologer av adeninbindende GPCR fra rotte. De seks homologer er blitt benevnt henholdsvis humant adeninbindende GPCR 1, 2, 3, 4, 5 og 6. Den nest-nærmeste homolog er det mas-beslektede gen som har 33% residuer til felles med adeninbindende GPCR.
Når en spørresekvens viser seg å ha en identitet med sekvensen av SEKV ID NR: 2 på minst 80% og fortrinnsvis minst 90%, 95% eller 98%, og denne sekvens er sekvensen av et polypeptid som bevarer en adeninbindende receptoraktivitet, utgjør en slik sekvens en del av foreliggende oppfinnelse.
Et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres og/eller renses (f.eks. ved bruk av et antistoff) for eksempel etter produksjon ved ekspresjon fra en kodende
nukleinsyre. Det isolerte og/eller rensede polypeptid kan brukes ved formulering av en sammensetning som kan omfatte minst én ytterligere komponent, for eksempel en farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel eksipiens, et hjelpemiddel eller en bærer.
Et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes som et immunogen eller på annen måte ved fremstilling av spesifikke antistoffer. Antistoffer er nyttige ved rensing og annen manipulasjon av polypeptider, diagnostisk testing og terapeutisk sammenheng. Dette skal diskuteres nærmere i det følgende.
Et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes ved testing for molekyler som bindes til det eller som modulerer dets aktivitet eller funksjon. Slike molekyler kan være nyttige i terapeutisk (eventuelt bl.a. profylaktisk) sammenheng.
Et polypeptid ifølge oppfinnelsen kan merkes med en gjenkjenningsmarkør. Gjenkjenningsmarkøren kan være hvilken som helst egnet markør som gjør det mulig å påvise polypeptidet. Egnede markører omfatter radioisotoper, f.eks.125I, enzymer, antistoffer, polynukleotider og bindeledd slik som biotin. Merkede polypeptider ifølge oppfinnelsen kan brukes i diagnostiske prosedyrer slik som immunoassayer for å bestemme mengden av et polypeptid ifølge oppfinnelsen i en prøve. Polypeptider eller merkede polypeptider ifølge oppfinnelsen kan også brukes i serologiske eller cellemedierte immunassayer for påvisning av immunreaktivitet til polypeptidene i dyr og mennesker ved bruk av standardprotokoller.
Et polypeptid eller et merket polypeptid ifølge oppfinnelsen eller et fragment derav kan også festes til en fast fase, for eksempel overflaten av en immunoassaybrønn eller en dyppepinne.
Slike merkede og/eller im mobiliserte polypeptider kan pakkes i sett i en egnet beholder sammen med egnede reagensmidler, kontroller, bruksanvisninger og lignende.
Slike polypeptider og sett kan brukes i fremgangsmåter ved påvisning av antistoffer mot slike polypeptider som foreligger i en prøve, eller aktive partier eller fragmenter derav, ved immunoassay.
Immunoassaymetoder er velkjent innen faget og vil generelt omfatte å:
(a) tilveiebringe et polypeptid som omfatter en epitop som kan bindes av et antistoff mot proteinet; (b) inkubere en biologisk prøve med polypeptidet under betingelser som muliggjør en dannelse av et antistoff/antigen-kompleks; og (c) bestemme om det dannes antistoff/antigen-kompleks omfattende polypeptidet.
Sekvensidentitet
Prosentdelen identitet av nukleinsyre- og polypeptidsekvenser kan beregnes ved bruk av handelstilgjengelige algoritmer som sammenligner en referansesekvens med en spørresekvens. De følgende programmer (levert av the National Center for Biotechnology Information) kan brukes til å bestemme homologier/identiteter: "BLAST", "gapped BLAST", "BLASTN" og "PSI-BLAST", som kan brukes med sta nda rd pa ra metre.
Algoritmen "GAP" (Genetics Computer Group, Madison, WI) benytter seg av Needleman- og Wunsch-algoritmen for å linjestille to fullstendige sekvenser, som maksimerer antallet overensstemmelser og minimerer antallet brudd. Generelt brukes standardparametrene, med en bruddannelsesstraff = 12 og bruddforlengelsesstraff = 4.
En annen metode for å bestemme den beste samlede overensstemmelse mellom en nukleinsyresekvens eller en del derav og en spørresekvens, er bruk av "FASTDB"-dataprogrammet som baserer seg på algoritmen til Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6; 237-245 (1990)). Programmet tilveiebringer en global sekvenslinjestilling. Resultatet av den globale sekvenslinjestilling er i prosent identitet. Egnede parametre som benyttes i et "FASTDB"-søk av en DNA-sekvens for å beregne prosent identitet, er: Matriks=Enhetlig, k-tupel=4, Uoverensstemmelsesstraff=l, Sammenføyningsstraff=30, Vilkårliggjøringsgruppes lengde=0, Avskjæringspoeng=l, Bruddstraff=5, Bruddstørrelsesstraff=0,05, og Vindusstørrelse=500eller spørresekvenslengde i nukleotidbaser, avhengig av hvilken som er kortere. Egnede parametre for å beregne prosent identitet og likhet av en aminosyrelinjestilling er: Matriks=PAM150, k-tupel=2, Uoverensstemmelsesstraff=l, Sammenføyningsstraff=20, Vilkårliggjøringsgruppes lengde=0, Avkjæringspoeng=l, Bruddstraff=5, Bruddstørrelsesstraff=0,05og Vindusstørrelse=500eller spørresekvensens lengde i nukleotidbaser, avhengig av hvilken som er kortere.
Antistoffer
Tilveiebringelsen av polypeptidene ifølge oppfinnelsen muliggjør en produksjon av antistoffer som har evnen til å binde adeninbindende GPCR fra rotter eller mennesker på spesifikk måte. Dermed tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som har evnen til å bindes spesifikt til et polypeptid ifølge oppfinnelsen og ikke til andre purinergiske GPCR'er. Et slikt antistoff vil ha en affinitet for et polypeptid ifølge oppfinnelsen på minst 100 ganger større, fortrinnsvis minst 1000 ganger større enn til andre purinergiske GPCR'er. Slike antistoffer kan fremstilles ved bru av epitoper av polypeptider ifølge oppfinnelsen som ikke foreligger i andre GPCR'er. Slike epitoper kan bestemmes ved å søke etter forskjeller mellom polypeptider ifølge oppfinnelsen og andre purinergiske GPCR-sekvenser.
Antistoffer kan erholdes ved bruk av teknikker som er standard innen faget. Fremgangsmåter ved fremstilling av antistoffer omfatter å immunisere et pattedyr (f.eks. mus, rotte, kanin) med et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Antistoffer kan erholdes fra immuniserte dyr ved bruk av hvilken som helst av forskjellige teknikker som er kjent innen faget, og testes, fortrinnsvis ved bruk av bindingen av et antistoff til et aktuelt antigen. For eksempel kan Western blotting-teknikker eller immunofelning brukes (Armitage eta/., Nature, 357: 80-82, 1992).
Som et alternativ eller supplement til å immunisere et pattedyr med et peptid, kan et antistoff som er spesifikt for et protein, erholdes fra en rekombinant fremstilt samling av uttrykte immunoglobulin-variable domener, f.eks. ved bruk av lambda-bakteriofag eller filamentøs bakteriofag som oppviser funksjonelle immunoglobulin-bindende domener på sin overflate; se for eksempel WO92/01047.
Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan modifiseres på et antall måter. Faktisk bør begrepet "antistoff" anses å dekke hvilken som helst bindende substans som har en bindingsdomene med den nødvendige spesifisitet. Således dekker oppfinnelsen antistoff rag menter, derivater, funksjonelle ekvivalenter og homologer av antistoffer, bl.a. syntetiske molekyler og molekyler hvis form etterligner formen av et antistoff og gjør det mulig for det å binde et antigen eller en epitop.
Eksempler på antistoff rag menter som har evnen til å binde et antigen eller andre bindingspartnere, er Fab-fragment, som består av VL-, VH-, Cl- og CHl-domene; Fd-fragment, som består av VH- og CHl-domene; Fv-fragment, som består av VL-og VH-domene av en enkelt arm av et antistoff; dAb-fragment, som består av VH-domene; solerte CDR-regioner og F(ab')2-fragmenter, et toverdig fragment omfattende to Fab-fragmenter koblet sammen via en disulfidbro i hengselpartiet. Enkeltkjedede Fv-fragmenter er også omfattet.
Reaktiviteten av antistoffer på en prøve kan bestemmes på hvilken som helst egnet måte. Tagging med enkelte reportermolekyler er én mulighet. Reportermolekylene kan direkte eller indirekte generere påvisbare, og fortrinnsvis målbare, signaler. Bindingen av reportermolekyler kan være direkte eller indirekte, kovalent, f.eks. via en peptidbinding, eller ikke-kovalent. Binding via en peptidbinding kan skje som et resultat av en rekombinant ekspresjon av en genfusjon som koder for antistoff og reportermolekyl.
På hvilken måte bindingen bestemmes, er ikke et trekk av foreliggende oppfinnelse, og fagmannen vil kunne velge en egnet måte i henhold til sine preferanser og generelle kunnskaper.
Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes ved testing for nærvær av et polypeptid, for eksempel i en testprøve som inneholder celler eller cellelysat som beskrevet, og kan brukes ved rensing og/eller isolasjon av et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel etter produksjon av polypeptidet ved ekspresjon fra den kodende nukleinsyre. Antistoffer kan modulere aktiviteten av polypeptidet som de bindes til, og hvis dette polypeptid har en skadelig virkning i et individ, kan de dermed være nyttige i terapeutisk sammenheng (som kan omfatte profylakse).
Et antistoff kan tilveiebringes i et sett, som kan omfatte bruksanvisninger for bruk av antistoffet, f.eks. ved bestemmelse av nærvær av en bestemt substans i en testprøve. Ett eller flere andre reagensmidler kan innlemmes, slik som merkende molekyler, bufferoppløsninger, elueringsmidler og så videre. Reagensmidler kan tilveiebringes i beholdere som beskytter dem fra det eksterne miljø, slik som en lukket flaske.
Vektorer
Nukleinsyresekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan innlemmes i vektorer, spesielt ekspresjonsvektorer. Vektoren kan brukes til å replikere nukleinsyren i en kompatibel vertcelle. I et ytterligere trekk tilveiebringer oppfinnelsen dermed en fremgangsmåte ved fremstilling av polynukleotider ifølge oppfinnelsen ved å innføre et polynukleotid ifølge oppfinnelsen inn i en repliserbar vektor, innføre vektoren i en kompatibel vertcelle og dyrke vertcellen under betingelser som tilveiebringer replikasjon av vektoren. Vektoren kan isoleres fra vertcellen. Egnede vertceller skal beskrives i det følgende i sammenheng med ekspresjonsvektorer.
Fortrinnsvis er et polynukleotid ifølge oppfinnelsen i en vektor operabelt bundet til en styresekvens som har evnen til å tilveiebringe ekspresjon av den kodende sekvens i vertcellen, dvs. at vektoren er en ekspresjonsvektor.
Begrepet "operabelt bundet" viser til en sidestilling hvor de beskrevne komponenter står i et forhold som tillater dem å fungere på sin tenkte måte. En styresekvens som er "operabelt bundet" til en kodende sekvens, er ligert på en slik måte at ekspresjonen av den kodende sekvens oppnås under betingelser som er kompatible med styresekvensene.
Egnede vektorer kan velges eller konstrueres som inneholder egnede regulatoriske sekvenser, bl.a. promotersekvenser, terminatorfragmenter,
polyadenylasjonssekvenser, forsterkersekvenser, markørgener og andre sekvenser som passende. Vektorer kan være plasmider, virale f.eks. fag, fagemid eller bakuloviral, kosmider, YACer, BACer eller PACer som passende. Vektorer omfatter genterapivektorer, for eksempel vektorer basert på adenovirus, adeno-assosiert virus, retrovirus (slik som HIV eller MLV) eller alfa-virusvektorer.
Vektorene kan utstyres med et replikasjonsopphav, valgfritt en promoter for ekspresjonen av polynukleotidet og valgfritt en regulator for promoteren. Vektorene kan inneholde ett eller flere selekterbare markørgener, for eksempel et ampicillinresistensgen i tilfellet av et bakterielt plasmid eller et neomycinresistensgen for en pattedyrvektor. Vektorer may brukes in vitro, for eksempel for produksjon av RNA, eller brukes til å transfisere eller transformere en vertcelle. Vektoren kan også tilpasses bruk in vivo, for eksempel i genterapeutiske fremgangsmåter. Systems for kloning og ekspresjon av et polypeptid i forskjellige vertceller er velkjent. Egnede vertceller omfatter bakterier, eukaryotiske celler slik som pattedyrceller og gjær, og baculovirussystemer. Pattedyrcellelinjer som er tilgjengelige innen faget for ekspresjon av et heterologt polypeptid, omfatter kinesisk hamster-ovarieceller, HeLa-celler, babyhamster-nyreceller, COS-celler og mange andre.
Promotere og andre ekspresjonsregulerende signaler kan velges slik at de er kompatible med vertcellen som ekspresjonsvektoren er utviklet for. For eksempel omfatter gjærpromotere S. cere visiae- GAL4- og ADH-promotere, S. pombe- nmtl-og adh-promoter. Pattedyrpromotere omfatter metalltioneinpromoter som kan induseres som respons på tungmetaller slik som kadmium. Virale promotere slik som SV40-stor T-antigenpromoter eller adenoviruspromotere kan også brukes. Alle disse promotorene er lett tilgjengelige innen faget.
Vektorene kan omfatte andre sekvenser slik som promotere eller forsterkere for å drive ekspresjonen av de innføyde nukleinsyrer eller nukleinsyresekvenser slik at polypeptidet dannes som en fusjon og/eller en nukleinsyre som koder for utsondringssignaler slik at polypeptidet som dannes i vertcellen, utsondres fra cellen.
Vektorer for produksjon av polypeptider ifølge oppfinnelsen og for bruk i genterapi, omfatter vektorer som bærer en mini-gensekvens ifølge oppfinnelsen.
For nærmere detaljer se for eksempel Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. utg., Sambrook eta/., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Mange kjente teknikker og protokoller for manipulasjon av nukleinsyre, for eksempel ved fremstilling av nukleinsyrekonstrukter, mutagenese, sekvensiering, innføring av DNA i celler og genekspresjon, og analyse of proteiner, beskrives i detalj i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. utg., John Wiley & Sons, 1992.
Vektorer kan transformeres inn i en egnet vertcelle som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe ekspresjon av et polypeptid ifølge oppfinnelsen. I et ytterligere trekk tilveiebringer oppfinnelsen dermed en fremgangsmåte ved fremstilling av polypeptider ifølge oppfinnelsen, som omfatter å dyrke en vertcelle som er blitt transformert eller transfisert med en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor, under betingelser som tilveiebringer at vektoren uttrykker en kodende sekvens som koder for polypeptidene, og å isolere de uttrykte polypeptider. Polypeptider kan også uttrykkes i in wtro-systemer, slik som retikulocyttlysat.
En ytterligere utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer vertceller som er blitt transformert eller transfisert med vektorene for replikasjon og ekspresjon av polynukleotider ifølge oppfinnelsen. Cellene vil velges slik at de er kompatible med vektoren, og kan for eksempel være bakterielle celler, gjærceller, insektceller eller pattedyrceller. Vertcellene kan dyrkes under betingelser for ekspresjon av genet, slik at det kodede polypeptid dannes. Hvis polypeptidet uttrykkes koblet til et egnet signal-lederpeptid, kan det utsondres fra cellen inn i kulturmediet. Etter produksjon ved ekspresjon, kan et polypeptid isoleres og/eller renses fra vertcellen og/eller kulturmediet, alt ettersom, og deretter brukes etter ønske, f.eks. ved formulering av en sammensetning som kan omfatte én eller flere ytterligere bestanddeler, slik som en farmasøytisk sammensetning som omfatter én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser, hjelpestoffer eller bærere.
Polynukleotider ifølge oppfinnelsen kan også innføyes i de ovenfor beskrevne vektorer i antisense-retning for å tilveiebringe en produksjon av antisense-RNA eller ribozymer.
Assayer
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et assay for en forbindelse som har evnen til å vekselvirke med adeninbindende GPCR-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, hvilket assay omfatter å: tilveiebringe en G-protein-koblet receptor omfattende minst ett polypeptid ifølge oppfinnelsen, bringe receptoren i berøring med en tenkt bindende forbindelse; og bestemme om forbindelsen har evnen til å vekselvirke med receptoren.
I én utførelse av assayet, kan receptoren eller delenheter av receptoren brukes i et bindingsassay. Bindingsassayer kan være kompetitive eller ikke-kompetitive. Et slikt assay kan forenes med en rask testing av et stort antall forbindelser for å bestemme hvilke forbindelser, om overhodet, som har evnen til å bindes til polypeptidene. Deretter kan mer detaljerte assayer utføres med forbindelser som viser seg å bindes, for å nærmere bestemme om slike forbindelser virker som agonister eller antagonister av polypeptidene ifølge oppfinnelsen.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et bioassay for å identifisere forbindelser som modulerer aktiviteten av reseptorer omfattende polypeptider ifølge oppfinnelsen. In én utførelse utføres bioassayet ved bruk av Saccharomyces cerevisiae- ceWer, manipulert med GPCR'er ifølge oppfinnelsen og G-proteiner fra rotte eller mennesker for å erstatte endogene GPCR'er og G-proteiner, som normalt virker som feromon-banen som er nødvendig for en konjugering og parring av gjærcellene. Den normale gjærrespons på aktiveringsligand (vekststans) manipuleres også slik at den omdannes til positiv vekst. Med en slik manipulasjon kan gjærcellene brukes i funksjonelle assayer for å identifisere agonister og antagonister av GPCR'ene ifølge oppfinnelsen, med hvor vekst tyder på en aktivering ved hjelp av GPCR'en. For eksempel kan bioassayet utføres ved å bringe slike gjærceller som uttrykker GPCR'en omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen, i berøring med minst én potensiell agonist, og å deretter overvåke cellene for endringer i vekstaktiviteten. I enda en annen utførelse utføres bioassayet ved å bringe gjærceller som uttrykker en receptor omfattende et polypeptid ifølge oppfinnelsen, i berøring med en konstant mengde av en kjent agonist, f.eks. adenin, og å heve mengden av minst én potensiell antagonist og deretter overvåke cellene for endringer i veksten.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et bioassay for å identifisere forbindelser som modulerer de regulatoriske regioner av det adeninbindende GPCR-gen. Et slikt assay utføres ved bruk av rotte- eller menneskeceller som har evnen til å uttrykke et polypeptid ifølge oppfinnelsen (fortrinnsvis med SEKV ID NR: 2). Cellene bringes i berøring med minst én forbindelse, idet forbindelsens evne til å modulere den regulatoriske region, er kjent. Deretter overvåkes cellene for ekspresjon av nukleinsyren ifølge oppfinnelsen. Alternatively kan promoteren bindes til et reportergen. Egnede reportergener som kan brukes, omfatter for eksempel kloramfenikolacetyltransferasegen, luciferasegen og lignende.
En forbindelse eller et signal som "modulerer aktiviteten" av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, viser til en forbindelse eller et signal som endrer aktiviteten av polypeptidet slik at det beter seg forskjellig i nærvær av forbindelsen eller signalet enn i fravær av forbindelsen eller signalet. Forbindelser som bevirker modulasjon, omfatter agonister og antagonister. En agonist omfatter en forbindelse slik som adenin, som aktiverer den adeninbindende GPCR-funksjon. Alternativt omfatter en antagonist en forbindelse som forstyrrer den adeninbindende GPCR-funksjon. Vanligvis observeres virkningen av en antagonist som en blokkering av agonist-indusert receptoraktivering. Antagonister omfatter kompetitive samt ikke-kompetitive antagonists. En kompetitiv antagonist (eller kompetitiv blokkerer) vekselvirker med eller nær setet som er spesifikt for agonistbinding. En ikke-kompetitiv antagonist eller blokkerer inaktiverer funksjonen av receptoren ved å vekselvirke med et annet sete nn agonistvekselvirkningssetet. Slik det skal beskrives i det følgende, har guanin en svak antagonistisk virkning ved disse reseptorer.
Slik det forstås av fagmannen, krever bioassaymetoder for å identifisere forbindelser som modulerer aktiviteten av reseptorer slik som polypeptider ifølge oppfinnelsen, generelt en sammenligning med en kontroll. Én type "kontroll" er en celle eller kultur som behandles på i det vesentlige samme måte som testcellen eller testkulturen som utsettes for forbindelsen, med den forskjell at "kontroll"-cellen eller kulturen ikke utsettes for forbindelsen. En annen type "kontroll"-celle eller kultur som kan brukes, er en celle eller kultur som er identisk med de transfiserte celler, unntatt at "kontroll"-cellen eller kulturen ikke uttrykker funksjonelt adeninbindende GPCR. Følgelig kan responsen av den transfiserte celle sammenlignes med aktiviteten av "kontroM"-cellen eller kulturen som respons på samme forbindelse under de samme reaksjonsbetingelser.
Spesielt foretrukne typer assayer omfatter bindingsassayer og funksjonelle assayer, som kan utføres som følger:
Bindingsassayer
Overekspresjon av nukleinsyre som koder for polypeptider ifølge oppfinnelsen i cellelinjer (bl.a. pattedyr-HEK 293-celler, CHO-celler og Sf9-insektceller) kan brukes til å fremstille membranpreparater som bærer polypeptidene (i dette avsnitt benevnt adeninbindende GPCR for enkelthetens skyld), for ligandbindingsstudier. Disse membranpreparater kan brukes i konvensjonelle filter-bindingsassayer (f.eks. ved bruk av Brandel-filterassayutstyr) eller i bindingsassayer av typen "Scintillation Proximity" med høyt gjennomløp (SPA og "Cytostar-T flashplate"-teknologi; Amersham Pharmacia Biotech) for å påvise bindingen av radiomerkede purinergiske ligander (bl.a. [2-<3>H Adenin (Amersham, TRK311 og 8-<3>H Adenin (Amersham, TRK343)] og forskyvning av slike radioligander av konkurrenter om bindingssetet. Radioaktiviteten kan måles med Packard Topcount, eller lignende instrumenter, som har evnen til å ta raske målinger fra 96-, 384- og 1536-mikrotiterbrønnformater. SPA/Cytostar-T-teknologi er spesielt brukbar for testing i stor skala, og derfor er denne teknologi egnet for bruk som test for forbindelser som har evnen til å forskyve standardligander.
En annen fremgangsmåte for å undersøke bindingen av ligander til adeninbindende GPCR-protein i et miljø som omtrent tilsvarer den native situasjon, benytter seg av en overflateplasmon-resonanseffekt som utnyttes av Biacore-instrumentet (Biacore). Adeninbindende GPCR i membranpreparater eller hele celler kunne festes til biosensorbrikken av et Biacore, og bindingen av ligander kunne undersøkes i nærvær og fravær av forbindelser for å identifisere konkurrenter om bindingssetet.
Funksjonelle assayer
Ettersom adeninbindende GPCR virker via Gi eller G0(inhibitorisk G-protein), som vanligvis vekselvirker med GIRK ("inward rectifying potassium channels"), bør en kaliumionstrøm føre til en aktivering av disse reseptorer. Denne strøm av ioner kan måles i sanntid ved bruk av forskjellige teknikker for å bestemme de agonistiske eller antagonistiske virkninger av bestemte forbindelser. Derfor kan rekombinante adeninbindende GPCR-reseptorer som uttrykkes i cellelinjer eller for eksempel Xenopus oocytes karakteriseres ved bruk av heleceller og enkeltkanal-elektrofysiologi for å bestemme virkningsmekanismen av aktuelle forbindelser. En elektrofysiologisk testing for forbindelser som er aktive ved adeninbindende GPCR, kan utføres ved bruk av konvensjonelle elektrofysiologiske teknikker, og når de blir tilgjengelige, også nye metoder med høy kapasitet som for tiden er under utvikling.
Fluorescens: Kalsium- og natriumstrømmer er målbare ved bruk av flere ion-følsomme fluorescerende fargestoffer, bl.a. fluo-3, fluo-4, fluo-5N, fura red, Natrium Green, SBFI og andre lignende prober fra leverandører slik som Molecular Probes. Kalsium- og natriuminnstrømning som et resultat av adeninbindende GPCR kan dermed karakteriseres i sanntid ved bruk av fluorometriske og fluorescensavbildende teknikker, bl.a. fluorescensmikroscopi med eller uten laser-confokale metoder kombinert med bildeanalysealgoritmer.
En annen fremgangsmåte er et sikteassay med høy kapasitet for forbindelser som er aktive som enten agonister eller modulatorer som bevirker kalsium-transienter. Dette assay baserer seg på et instrument som benevnes en "Fluorescens Imaging Plate Reader" ((FLIPR®), Molecular Devices Corporation). I sin vanligste konfigurasjon eksiterer og måler den fluorescensen som utstøtes av fluorescein-baserte fargestoffer. Den benytter seg av en argon-ion-laser for å produsere høykrafts eksitasjon ved 488 nm av en fluorofore, et system av optikk for å raskt gjennomsøke bunnen av en 96-/384-brønners plate, og et følsomt, avkjølt CCD-kamera for å innfange den utstrålte fluorescens. Den inneholder også et 96-/384-brønners pipetteringshode som gjør det mulig for instrumentet å levere oppløsninger av testmidler inn i brønnene av en 96-/384-brønners plate. FLIPR.assayet er utviklet for å måle fluorescenssignaler fra populasjoner før, under og etter tilsetningen av forbindelser, i sanntid, fra alle 96/384 brønner samtidig. FLIPR-assayet kan brukes til å sile ut og karakterisere forbindelser som er funksjonelt aktive ved rekombinant adeninbindende GPCR, f.eks. adeninbindende GPCR fra rotter eller mennesker, som uttrykkes i cellelinjene. Slik det skal beskrives i det følgende, målte man kalsium-transienter i celler som var transfisert med adeninbindende GPCR, ved bruk av FLIPR-assayet for å måle aktiveringen av receptorene med forskjellige substrater, for å bestemme den naturlige ligand av receptoren.
Forbindelser som viser seg å modulere aktiviteten av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, har et antall terapeutiske anvendelser. Slik det er åpenbart fra BLAST-søkene, tilhører adeninbindende GPCR ikke noen av de kjente delfamilier av GPCR'er som er aktiverte strukturer som ligner adenin. Dette tyder på at adeninbindende GPCR er et medlem av en ny delgruppe av purinergiske GPCR'er hvor det vil være mulig å utvikle en ny farmakologi for de forskjellige terapeutiske områder hvor purinergika er blitt brukt inntil idag.. Nærmere bestemt omfatter dette sykdommer forbundet med apoptose (Chow et al., 1997), patologiske tremorforstyrrelser (Mally og Stone, 1996), nocicepsjon (Burnstock, 1997). Purinergiske forbindelser er også blitt foreslått for bruk som antikonvulsiva, sedativer, hypnotiske midler, ataksiske midler (CNS), hypotensiver, antiarrhytmiske midler, negative kronotropika, dromotropika og inotropika, inhibitorer av blodplateaggregasjon, stimulanter av NO-produksjon i vaskulære endotelceller i det kardiovaskulære system og som inhibitorer av magesaftutsondring (Gil-Rodrigo et al., Pharmacol. Res. 22 (2): 103-13, 1990). Videre tyder undersøkelser på grunnlag av transgene dyr, på at reseptorer fra denne familie spiller en rolle i bronkokonstriksjon, vasodilasjon, betennelse og forenkling av neurotransmisjon (Nyce, 1999). Sammenfattet kan adeninbindende GPCR og beslektede reseptorer brukes som et verdifult verktøy for legemiddelutvikling i forskjellige terapeutiske områder.
Videre åpner demonstrasjonen at adenin i og for seg virker som den naturlige ligand for denne receptor, for muligheten til å bruke adenin og forbindelser som etterligner eller antagoniserer adenin, ved utvikling av behandlinger for de ovennevnte sykdommer.
Vevfordelingsundersøkelser
Adeninbindende GPCR-DNA-sekvenser er nyttige for å bekrefte og utvide kunnskapene om disse GPCR'ers fordeling, ved hybridiserings/PCR-undersøkelser i menneskets helse og sykdom. Rekombinant adeninbindende GPCR i cellelinjer er nyttige for å karakterisere adeninbindende GPCR-funksjon, og et bredt utvalg av biokjemiske og biofysiske metoder er tilgjengelige for å teste denne receptor. Assayer ifølge oppfinnelsen som beskrives heri, er også nyttige for utsilingsformål for å oppdage legemidler.
Bindingsmidler
Dermed tilveiebringer oppfinnelsen dessuten nye bindingsmidler, bl.a.
modulatoriske midler som erholdes ved et assay ifølge foreliggende oppfinnelse, og sammensetninger omfattende slike midler. Midler som bindes til receptoren og som kan ha en agonistisk eller antagonistisk aktivitet, kan brukes i fremgangsmåter ved behandling av sykdommer hvis patologi kjennetegnes av en virkning via adeninbindende GPCR-receptor, og en slik anvendelse utgjør et ytterligere trekk av oppfinnelsen. Slike sykdommer kan omfatte sykdommer forbundet med apoptose, patologiske tremorforstyrrelser og nocicepsjon, bronkokonstriksjon, vasodilasjon, betennelse og forenkling av neurotransmisjon. Videre kan midlene brukes i behandlinger hvor antikonvulsiva, sedativer, hypnotiske midler, ataksiske midler (CNS), hypotensive midler, antiarrhytmiske midler, negative kronotropika, dromotropika og inotropika, inhibitorer av blodplateaggregasjon, stimulanter av NO-produksjon i vaskulære endotelceller i det kardiovaskulære system eller som inhibitorer av magesaftutsondring kan være nyttige. Midlene kan administreres i en virksom mengde av et middel ifølge oppfinnelsen. Ettersom mange av de ovennevnte tilstander er kroniske og ofte ikke kan kureres, vil det forstås at "behandling" skal omfatte å oppnå en reduksjon av symptomene over et tidsrom slik som noen få timer, dager eller uker, og å omfatte en sinking av progresjonen av sykdommens forløp.
Slike midler kan formuleres i sammensetninger omfattende et middel sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer eller tynner. Midlet kan foreligge i form av et fysiologisk funksjonelt derivat, slik som en ester eller et salt, slik som et syreaddisjonssalt eller basemetallsalt, eller et N- eller S-oksid. Sammensetninger kan formuleres for hvilken som helst administrasjonsrute og -måte. Farmasøytisk akseptable bærere eller tynnere omfatter slike som brukes i formuleringer som er egnet for oral, rektal, nasal, inhalerbar, topisk (bl.a. bukkal og sublingual), vaginal eller parenteral (bl.a. subkutan, intramuskulær, intravenøs, intradermal, intratekal og epidural) administrasjon. Valget av bærer eller tynner vil såklart avhenge av den tenkte administrasjonsrute, som kan avhenge av midlet og dets terapeutiske hensikt. Formuleringene kan bekvemt foreligge i enhetsdoseform, og kan fremstilles ved hvilken som helst av metodene som er velkjent innen faget farmasi. Slike metoder omfatter trinnet å bringe den aktive ingrediens i berøring med bæreren, som utgjør ett eller flere hjelpeingredienser. Generelt fremstilles formuleringene ved å enhetlig og intimt bringe den aktive ingrediens i berøring med flytende bærerere eller fintdelte faste bærerere eller både og, og å deretter om nødvendig forme produktet.
For faste sammensetninger kan konvensjonelle ikke-toksiske faste bærere av farmasøytisk kvalitet, for eksempel mannitol, melkesukker, cellulose, cellulosederivater, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, glukose, sakkarose, magnesiumkarbonat og lignende brukes. Den aktive forbindelse som definert ovenfor kan formuleres som suppositorier ved bruk av for eksempel polyalkylenglykoler, acetylerte triglycerider og lignende, som bærer. Flytende farmasøytisk administrerbare sammensetninger kan for eksempel fremstilles ved å løse opp, dispergere osv. en aktiv forbindelse som definert ovenfor og valgfrie farmasøytiske adjuvanser i en bærer, slik som for eksempel vann, salin-vandig dekstrose, glycerol, etanol og lignende, for å dermed danne en oppløsning eller suspensjon. Om ønsket kan den farmasøytiske sammensetning som skal administreres, også inneholde mindre mengder ikke-toksiske hjelpestoffer slik som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufrende midler og lignende, for eksempel natriumacetat, sorbitanmonolaurat, trietanolaminnatriumacetat, sorbitanmonolaurat, trietanolaminoleat osv. De faktiske metoder for å fremstille slike doseringsformer er kjent, eller vil være åpenbare, for fagmannen; se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. utg., 1975.
Sammensetningen eller formuleringen som skal administreres, vil i hvert tilfelle inneholde en mengde av den eller de aktive forbindelser som virksomt lindrer symptomene av individet som behandles.
Doseringsformer eller sammensetninger som inneholder aktiv ingrediens i en mengde fra 0,25 til 95%, hvor resten utgjøres av ikke-toksiske bærere, kan fremstilles.
For oral administrasjon dannes en farmasøytisk akseptabel ikke-toksisk sammensetning ved innlemmelse av hvilken som helst vanligvis brukte eksipiens, slik som for eksempel farmasøytisk kvalitet av mannitol, melkesukker, cellulose, cellulosederivater, natriumcrosscarmellose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, glukose, sakkarose, magnesium, karbonat og lignende. Slike sammensetninger har formen av oppløsninger, suspensjoner, tabletter, piller, kapsler, pulvere, formuleringer med vedvarende frigivning og lignende. Slike sammensetninger kan inneholde l%-95% aktiv ingrediens, mer foretrukket 2-50%, mest foretrukket 5-8%.
Parenteral administrasjon kjennetegnes generelt ved injeksjon, enten subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Injiserbare midler kan fremstilles i konvensjonell form, enten som flytende oppløsninger eller suspensjoner, faste former som er gnet for å løses opp eller suspenderes i væske før injeksjon, eller som emulsjoner. Egnede eksipienser er for eksempel vann, salin, dekstrose, glycerol, etanol eller lignende. I tillegg kan de farmasøytiske sammensetninger som skal administreres, om ønsket også inneholde mindre mengder ikke-toksiske hjelpestoffer slik som fukte- eller emulgeringsmidler, pH-bufrende midler og lignende, slik som for eksempel natriumacetat, sorbitanmonolaurat, trietanolaminoleat, trietanolaminnatriumacetat osv.
Prosentdelen aktiv forbindelse som foreligger i slike parenterale sammensetninger, er sterkt avhengig av den bestemte natur derav, samt aktiviteten av forbindelsen og individets behov. Imidlerdit kan en prosentdel aktiv ingrediens fra 0,1% til 10%
i oppløsning brukes, og mengden vil være høyere hvis sammensetningen er et fast stoff som etterhvert skal fortynnes til de ovennevnte prosentdeler. Fortrinnsvis vil sammensetningen omfatte 0,2-2% aktivt stoff i oppløsning.
EKSEMPLER
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. Andre utførelser vil by seg for fagmannen i lys av disse eksempler.
Eksempel 1: Analyse av ny GPCR
Sekvensen som oppgis i SEKV ID NR: 1, ble analysert ved BLAST-søk (Altschul et al., 1997) for å undersøke om beslektede GPCR'er med kjente ligander kunne finnes. Imidlertid var de nærmeste homologer av dette foreldreløse GPCR som ble funnet, i og for seg foreldreløse GPCR'er. Disse var en familie av humane GPCR'er (Derwent sekvensdatabase-tilgangsnumre Z10067, Z10068, Z10069, Z10070, Z10071 og Z10072) kloned fra dorsalrot-ganglion som har ca. 50% residuer til felles med den nye GPCR (adeninbindende GPCR fra rotte). Den nestnærmeste homolog er det mas-beslektede gen, som har 33% residuer til felles med adeninbindende GPCR.
Ved bruk av nukleotidsekvensen of SEKV ID NR: 1 har foreliggende oppfinnere
identifisert de ovennevnte humane GPCR'er for å være seks humane homologer de nye GPCR fra rotte. Disse er blitt benevnt humant adeninbindende GPCR1 (SEKV ID NR: 3), humant adeninbindende GPCR2 (SEKV ID NR: 5), humant adeninbindende GPCR3 (SEKV ID NR: 6), humant adeninbindende GPCR4 (SEKV ID NR: 7), humant adeninbindende GPCR5 (SEKV ID NR: 8) og humant adeninbindende GPCR6 (SEKV ID NR: 9). Nukleotid- og aminosyresekvensene for humant adeninbindende GPCR1 vises i SEKV ID NR: 3 og SEKV ID NR: 4, hvor aminosyresekvensene av adeninbindende GPCR fra rotte (SEKV ID NR: 2) og humant adeninbindende GPCR1 (SEKV ID NR: 4) er linjestilt på fig. 1. Nukleinsyrensekvensen for humant adeninbindende GPCR2, humant adeninbindende GPCR3, humant adeninbindende GPCR4, humant adeninbindende GPCR5 og humant adeninbindende GPCR6 vises i henholdsvis SEKV ID NR: 5-9. "N" in SEKV ID NR: 5 er A eller T eller C eller G.
Eksempel 2: Identifikasjon av den naturlige ligand for den nye GPCR
Ettersom ingen beslektede GPCR'er med kjente ligander kunne finnes i teknikkens stand, prøvde oppfinnerne å identifisere hvilken naturlige ligand som ville bindes til receptoren. For å identifisere den naturlige ligand av den sekvensierte GPCR, brukte man "reverse pharmacology". I det vesentlige preparerte man et ekstrakt fra vevet hvor denne GPCR uttrykkes (hjernecortex), og rensingen av den naturlige ligand ble etterfulgt av et cellulært assay basert på aktiveringen av det foreldreløse
GPCR.
Eksempel 3: Transient ekspresjon i pattedyrceller og FLIPR-assay
Hellengdes leseramme ble innføyd i pattedyrekspresjonsvektoren pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.), og den dannede ekspresjonskonstrukt ble forbigående transfisert med FuGENE 6-reagensmiddel (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) inn i HEK293-celler som var stabilt transfisert (E. Bender, upublisert) med pLEC/Gqi eller pLEC/Gqo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, U.S.A.). Cellene ble fylt med Fluo-4 (Molecular Probes, Eugene, ELLER, U.S.A.) i henhold til leverandørens anbefalinger.
Eksempel 4: Preparering av vevekstrakter og ekstraktfraksjonering
10 kg grisecortex ble homogenisert og ekstrahert i metanol/vann/eddiksyre, 90/9/1, vol/vol/vol. Etter sentrifugering ble supernatanten delipidert ved n-heksan- ekstrahering, og det vandige sjikt ble fraksjonert ved Megabondelute-fraksjonering. Materialet som ble eluert ved 50% acetonitril/H20, ble ytterligere fraksjonert på en HPLC-C18-kolonne. Fraksjonene som ble avledet derav, ble testet for aktivering av den nye GPCR i FLIPR-assayet. Påfølgende rensetrinn på en Hypersil C18, en analytisk C8-kolonne, en Biosep-kolonne og til slutt en HPLC-C18-kolonne ble også etterfulgt av det FLIPR-baserte aktivitetsassay for fraksjoner som aktiverte celler som var transfisert med den nye GPCR. Fraksjonen som inneholdt aktiviteten etter det endelige rensetrinn, ble analysert ved massespektrometri (Q-TOF, MicroMass, Manchester, U.K.).
Utsilingen av grisecortexekstraktet etter den første fraksjonering på en C18-kolonne gav et nokså bredt utvalg av fraksjoner som førte til en transient intracellulær Ca<2+->frigivning for celler som var transient transfisert med det nye GPCR-ekspresjonskonstrukt. Dette var tilfellet for HEK293-celler som uttrykte enten Gqo- eller Gqi-kimærer (fig. 2 og fig. 3), men ikke for villtype-HEK293-celler (data ikke vist). Én av disse fraksjoner, nummer 19, som gav en sterk stimulering for begge G-protein kim ærer, ble valgt for ytterligere delfraksjonering, og behandlet som beskrevet ovenfor. Rensingen ble styrt av det FLIPR-baserte aktivitetsassay, og fraksjonen som oppviste aktivitet fra det siste kolonnegjennomløp, ble underkastet massespektrometri for å bestemme renheten samt strukturen av forbindelsene som den inneholdt.
Eksempel 5: Identifikasjon av aktiverende substans ved massespektrometri
Masseanalyse av den aktive rensede fraksjon fra Symmetry C18 (4,6 x 250 mm; 5um, Vanns) reversfasekolonnen, gav ett hovedion ved m/z 136. Massen ble låst på (NaI+Na)<+->ionet (172,8840 Da) som gav en mer nøyaktig masse for det aktuelle ion (136,0623 Da). Denne masse ble brukt i elementsammensetningsanalysen. Massenøyaktighetstoleransen ble justert til 20 ppm. Den beste overensstemmelse var C5H6N5(136,0623 Da), som tilsvarer Adenin + H+. CID-spektret av det native molekyl ble sammenlignet med spektret av syntetisk adenin.
Fragmentering av begge opphavsmolekyler førte til de samme fragmentioner ved m/z 119,0, 109,0, 94,0, 92,0, 82,0, 77,0, 67,0 og 65,0. Konklusjonen fra resultatene som ble erholdt ved tandem-massespektrometri på et Q-TOF, var at den aktiverende substans var adenin. Den nye GPCR ble derfor benevnt adeninbindende GPCR.
Eksempel 6: Testing av ny GPCR med utvalgte rene forbindelser
For å bekrefte resultatet som ble erholdt fra massespektrometrien, løste man opp rent adenin i PBS for å gi endelige konsentrasjoner fra 3,3 nM til 33 uM, og tilsatte dette til HEK293/Gaqo-celler som var blitt transient transfisert med ekspresjonskonstruktet av den nye GPCR (adeninbindende GPCR) fra rotte/pcDNA3, og til celler som var blitt transfisert med tomme ekspresjonsvektorer. Ved bruk av FLIPR-assayet som beskrevet ovenfor, ble kalsium-transienter målt i begge sett av celler, hvor transientene som kunne tilskrives den nye GPCR, ble målt som differansen mellom de to transienter. Resultatene illustreres på fig. 4. Adenin provoserte en dosereagerende kalsiumtransient i cellene, hvilket tydet på at den nye GPCR (adeninbindende GPCR) har en høy affinitet for denne forbindelse. Derimot demonstrerte andre puriner og pyrimidiner ikke noen agonistisk aktivitet. Fig. 5 illustrerer at kalsiumtransienter ikke kunne utløses i HEK293/Gaqo-cellene ved tilsetning av 3,3 uM uridin, guanin, hypoxantin, xantin, koffein, UDP eller UDP, hvilket bekreftet spesifisiteten av den adeninbindende GPCR-receptor for adenin. For å ytterligere teste spesifisiteten av receptoren for adenin, testet man et antall nukleosid- og nukleotidderivater ved bruk av det samme assay. Resultatene vises på fig. 6. For nukleosid- og nukleotidderivater av adenin viser kun adenosin og AMP noe svak delvis agonisme ved høye konsentrasjoner (> 3,3 uM).
For å undersøke man blant de samme forbindelser kunne finne molekyler med antagonistiske egenskaper, ble celler som var transfisert med adeninbindende GPCR, utsatt for forskjellige puriner (guanin, hypoxantin, xantin, koffein, theofyllin), pyrimidiner (uridin, UDP, UTP), kjente antagonister ved andre nukleotidreseptorer (suramin, reactive blue) og nukleosid- eller nukleotidderivater av adenin (adenosin, AMP, ADP, ATP) i konsentrasjoner som varierte fra 30 DM til 30 pM mens man målte Ca2+-transienter i FLIPR. I dette eksperiment oppdaget man ingen ytterligere agonistiske virkninger enn hva som ble nevnt ovenfor. Etter 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur ble de samme celler behandlet med 30 nM adenin, for å påvise antagonistiske egenskaper av molekylene som ble tilført i den første superfusjonsrunde. Kun guanin oppviste en svak antagonistisk virkning ved 30 og 3 uM (fig. 7). Ingen av de øvrige forbindelser utløste antagonistiske virkninger på adeninbindende GPCR ved de testede konsentrasjoner.
Eksemplene 7 til 12: Karakterisering av rotte-adeninreceptor på transient og permanent transfiserte CHO-celler
For å nærmere karakterisere den nye rotte-adeninreseptor, ble CHO-celler transient og permanent transfisert ved bruk av lipofectamin-plus-metoden. De farmakologiske egenskaper av forskjellige adeninderivater ble bedømt ved bruk av radioligandbindingseksperimenter, stimulering av [<35>S]GTPOS-bindingen og cAMP-målinger. Alle disse eksperimenter ble kjørt parallelt med villtype-CHO-celler som kontroll.
Eksempel 7 beskriver radioligandbindingseksperimenter ved brukav [<3>H]-adenin i transient og permanent transfiserte CHO-celler. Maling av bindingen av [<35>S]-GTPyS som respons på adenin beskrives for transient og permanent transfiserte celler i henholdsvis eksempel 8 og 10. Målingen av cAMP som respons på adenin beskrives for transient og permanent transfiserte celler i henholdsvis eksempel 9 og 11. I eksempel 12 beskrives virkningen av adenin på intracellulært Ca<2+>.
Cellekultur og transfeksjonsmetoder
CHO-celler ble holdt i Dulbecco's modifiserte Eagle's-medium
(DMEM)/næringsmiddelblanding Ham's F12 (Life Technologies, Belgium) i et forhold på 1:1 supplementert med 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum og en antibiotisk oppløsning inneholdende 100 IU/ml penicillin G, 100 ug/ml streptomycinsulfat, 110 ug/ul pyrodruesyre og 300 ug/ml L-glutamin. Cellene ble dyrket i 175 cm<2>kulturkolber ved 37°C i et 5% C02-miljø. For de permanent transfiserte celler ble de transfiserte celler én gang annenhver uke dyrket i et seleksjonsmedium (Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) næringsmiddelblanding Ham's F12 (forhold 1:1), Life Technologies, Belgium) som inneholdt 800 ug/ml geneticin (G418).
For forbigående transfeksjoner av CHO-celler brukte man lipofectamin-PLUS (Life Technologies)-metoden. Én dag før transfeksjonen ble CHO-cellene podet i 50 mm Petri-skåler i en tetthet på 20.000 celler/cm<2>i DMEM næringsmiddelblanding Ham's F12 (forhold 1:1) (Life Technologies). For transfeksjonen av én Petri-skål, tilsatte man 6,5 ug DNA til 17,5 pl PLUS-reagensmiddel (Life Technologies), blandet og inkuberte i 15 minutter ved romtemperatur (oppløsning A). 15 pl lipofectamin-PLUS-reagensmiddel ble tilsatt til 735 pl serumfritt medium (oppløsning B). Oppløsning A og B ble slått sammen, forsiktig blandet og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur for å danne et kompleks. Etter 15 minutter ble 3,5 ml serumfritt medium tilsatt til blandingen. Cellene ble vasket én gang med serumfritt medium, DNA-lipofectamin-PLUS-komplekset (i et endelig volum på 5 ml) ble tilsatt til cellene, og det hele ble inkubert i 3 timer ved 37°C i en 5% C02-inkubator. Etter inkubasjonen ble 5 ml DMEM/Ham's F12 (forhold 1:1), supplementert med 20% varme-inaktivert føtalt kalveserum tilsatt til cellene, og det hele fikk stå over natten i inkubatoren. Den følgende dag ble mediet fjernet og erstattet med det samme vekstmedium som ovenfor.
Lipofectamine-PLUS-metoden ble også brukt for permanent transfeksjon av CHO-celler, med små modifikasjoner. Én dag etter transfeksjonen ble mediet erstattet med seleksjonsmedium, som ble skiftet hver 2. eller 3. dag. Cellene ble dyrket inntil det oppstod kolonier (mellom dag 8 og 10) og delt opp i en 175 cm<2>kulturkolbe for ytterligere kultur og eksperimenter. Monoklonale cellelinjer ble fremstilt ved begrenset fortynningspoding i 96-brønners plater.
Membranpreparat
Membranene ble preparert som totale partikkelformede fraksjoner. Cellelinjene ble dyrket til 90% konfluens på 145 mm Petri-skåler og behandlet med 5 mM natriumbutyrat, 24 timer før innhøstingen. Kulturmediet ble fjernet, og cellene ble vasket to ganger med iskaldt fosfatbufret salin (PBS uten Ca<2+>eller Mg<2+>), skrapt fra platene i 50 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, og samlet ved sentrifugering (10 minutter ved 16.000 rpm ved 4°C). Cellepelleten ble resuspendert i hypotonisk 5 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, og homogenisert med en Ultra Turrax-homogenisator (Janker Kunkel, Germany). Homogenatet ble sentrifugert ved 18.000 rpm i 20 minutter ved 4°C. Den endelige pellet ble resuspendert i 50 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, og lagret i alikvoter ved -70°C. En proteinbestemmeise ble utført ved bruk av Bradford-proteinassay (Biorad, Germany) ved bruk av bovint serumalbumin (BSA) som standard.
Eksempel 7: [<3>H]-Adeninbinding
A) Metoder: [<3>H]-Adeninbindingseksperimenter ble utført for å karakterisere villtype-cellelinjer før transfeksjon av både transient og permanent transfiserte cellelinjer. Membraner ble tint på is og fortynnet i 50 mM HEPES-buffer, pH 7,4, supplementert med 10 mM MgCI2og 1 mM EGTA. Den ikke-spesifikke binding ble definert i nærvær av 1 pM adenin, og en 1 times inkubasjon ved 25°C med [<3>H]- adenin (spesifikk aktivitet på 30,4 Ci/mmol), viste seg å være optimal for metnings- og konkurranse-bindingsassayer. Begge assayene ble utført i et endelig volum på 500 pl, ved bruk av 18 pg membranprotein for de transfiserte CHO-celler og 30 pg membranprotein for villtype-CHO-cellene for metningsbindingen. For konkurransebindingseksperimenter ble 15 og 50 pg membranprotein brukt for henholdsvis transfiserte og villtype-celler. Reaksjonen ble avsluttet ved rask filtrering gjennom Whatman GF/B-filtre ved bruk av en Brandel flerkanalers celleinnhøster (96 brønner). Filtrene ble vasket tre ganger med 3 ml iskald 50 mM HEPES-buffer, pH 7,4, overført til væskescintillasjonsglass, og 3 ml scintillasjonsvæske (Ultima Gold MV, Packard, Nederland) ble tilsatt. Prøvene ble telt i en p-scintillasjonsteller etter minst 6 timer for å tillate glassfiberfiltrene å bli enhetlig gjennomsiktige.
Metningsanalyse av [<3>H]-adeninbindingen ble utført ved bruk av 18 konsentrasjoner av radioliganden som varierte fra 0,2 til 90 nM.
Den kompetitive inhibering av [<3>H]-adenin med forbindelsene, adenin, 1-metyladenin og andre analoger ble utført med 15 nM [<3>H]-adenin og forskjellige konsentrasjoner av de umerkede forbindelser, som omspente 5 størrelsesordener.
Det maksimale antall bindingsseter (Bmax), den tilsynelatende likevekts-dissosiasjonskonstant (KD) og pIC50-verdiene (idet IC50-verdien representerer konsentrasjonen som inhiberer 50% av den spesifikke radioligandbinding) ble avledet fra ikke-lineær kurvetilpasning. B) Results: Preliminære radioligandbindingseksperimenter med [<3>H]-adenin ble utført på forskjellige villtypeceller. Assaybetingelsene var identiske som for de transfiserte celler. Bindingsresultatene som ble erholdt med de forskjellige cellelinjer, vises i det følgende:
C6-glioma: 839 fmol/mG-protein
Cos7: 226 fmol/mG-protein
HEK293: 168 fmol/mG-protein
NIH3T3: 642 fmol/mG-protein
CHO: 303 fmol/mG-protein (samling 1)
583 fmol/mG-protein (samling 2)
CHO-cellene ble valgt for transfeksjon med rotte-adeninreceptor og ytterligere eksperimenter.
I uavhengige eksperimenter 48 timer etter transfeksjonen (effektiviteten var 50-60% i henhold til bedømmelser ifølge p-gal-flekking ved bruk av konvensjonelle teknikker som er kjent for fagmannen) ble CHO-celler bedømt for sin [<3>H]-adeninbinding. I preliminære bindingseksperimenter som ble utført ved bruk av 4 nM [<3>H]-adenin, observerte man de følgende bindingsnivåer:
samling 1 3554 fmol/mG-protein
samling 2 3444 fmol/mG-protein
samling 3 2436 fmol/mG-protein
samling 4 1717 fmol/mG-protein
Metningsbindingsanalyse av [<3>H]-adenin ble utført med og uten tilsetning av 100 pM guanylylimiddifosfat (Gpp-NHp) på transfiserte samt villtype-CHO-celler, ved bruk av gjennomsnittlig 16 radioligandkonsentrasjoner som varierte fra 0,1 til 80 nM (tabell 1). Tilsetning av Gpp-NHp blokkerer høyaffinitets- eller agonistbindingssetene av GPCR'er, slik at kun lav-affinitetsseter er tilgjengelige.
I transfiserte celler var det midlere metningsbindingsnivå ca. 19 pmol/mg, og KD-verdien for [<3>H]-adenin var 24 nM. En spesifikk binding med lignende KD-verdi ble også observert i villtype-CHO-celler, men med en meget lavere Bmax-verdi (ca. 1,1 pmol/mg). Videre var KD-verdien av transfiserte celler følsom for Gpp-NHp-tilsetning, mens KD-verdien i villtype-celler ikke var det.
En kompetitiv inhibering av [<3>H]-adeninbindingen med forskjellige adeninderivater ble utført ved bruk av 15 nM [<3>H]-adenin på celler som var blitt transient transfisert med receptoren, og på villtype-CHO-celler (tabell 2).
Høyaffinitets konkurransebinding kunne kun oppnås med adenin i og for seg, med en Ki-verdi på 18 nM, hvilket er meget nært den direkte målte KD-verdi.
Eksempel 8: [<35>S]-GTPYS-binding i transient infiserte celler
A) Metoder: Bestemmelse av [<35>S]GTPyS-bindingen til G-proteinene ble utført i henhold til en modifisert Lazareno-prosedyre (Methods Mol. Biol., 83: 107-116, 1997). Disse eksperimenter ble utført for en første funksjonell bedømmelse av receptoren på nivået av et membranpreparat.
I preliminære [<35>S]GTPYS-bindingseksperimenter, optimerte man assaybetingelsene, hvilket førte til valget av den følgende inkubasjonsbuffer: 20 mM Hepes, pH 7,4, som inneholdt 100 mM NaCI, 10 pM GDP, 10 mM MgCI2og 10 pg/ml saponin. Assayblandingen inneholdt henholdsvis 10 og 35 pg membranprotein for transfiserte og villtype-CHO-celler.
For å teste den agonistiske aktivitet ble 175 pl fortynnede membraner forinkubert i den ovenfor beskrevne buffer sammen med 25 pl buffer og 25 pl av forskjellige konsentrasjoner av forbindelsen i et samlet volum på 225 pl. Etter en 20 minutters forinkubasjonsperiode ved 30°C, tilsatte man 25 pl [<35>S]GTPyS til en endelig konsentrasjon på 0,25 nM, og assayblandingene ble ytterligere inkubert i 20 minutter ved 30°C. Bundet og fritt [<35>S]GTPyS ble adskilt ved rask filtrering over et UniFilter™-96, GF/B™ under redusert trykk ved bruk av Filtermate 196-filtrering (Packard Company, Nederland). Mengden av bundet radioaktivitet på filterenheten ble bestemt etter tørking av filtrene og tilsetning av scintillasjonsmiddel (Microscint-O; Packard Company), ved væskescintillasjonstelling.
Grunnivået for [<35>S]GTPyS-bindingen ble målt i fravær av forbindelser. Stimulering med agonist ble beregnet som prosentdelen økning over grunnivået. De sigmoide agonistkonsentrasjons-responskurver ble analysert ved ikke-lineær regresjon ved bruk av GraphPad Prism-programmet. De forskjellige konsentrasjonspunkter ble utført in duplo, og den rapporterte data ble hentet fra uavhengige eksperimenter. B) Resultater: [<35>S]GTPyS-bindingen på membraner fra transient transfiserte CHO-celler hadde en maksimal stimulering med adenin på 150% over grunnverdien for bindingsnivået. Den midlere EC50-verdi for adenin var 112 nM. 1-Metyladenin og AMP stimulerte receptoren delvis med en meget lavere potens, tilsvarende deres lavere affinitet i konkurransebindingsassayer.
Ingen stimulering av GTPyS-bindingen ble målt i villtype-CHO-celler (se tabell 3 og fig. 8a (transient transfiserte CHO) og fig. 8b (villtype-CHO)). Verdiene i prosentdeler er normalisert til den maksimale adeninrespons, dvs. adeninstimuleringen over grunnivået anses å være 100%.
Eksempel 9: cAMP-målinger i transient transfiserte CHO-celler
A) Metoder: For transient transfiserte CHO-celler utførte man cAMP-målinger ved bruk av direkte RIA-settet fra NEN (Belgium).
Cellene ble innhøstet fra 50 mm Petri-skåler ved tilsetning av 1 ml 0,04% EDTA og resuspensjon av cellene i PBS (uten Ca<2+>eller Mg<2+>). Cellene ble deretter sentrifugert i 5 minutter ved 1,500 rpm, supernatanten ble fjernet, og pelleten ble resuspendert i stimuleringsbuffer (levert av leverandøren, NEN). Cellene ble telt, og 50 pl ble tilsatt til hver brønn av en 96-brønners flashplate i en tetthet på IO<6>celler/brønn. En standardkurve for cAMP ble fremstilt i stimuleringsbuffer som spente seg over et området fra 10 til 1.000 nM, og 50 pl ble tilsatt til flashplaten.
Forbindelsene ble fortynnet i PBS med forskolin (i konsentrasjonen 50 pM), 50 pl ligand, 2 ganger den endelige konsentrasjon, ble tilsatt til cellene, og det hele ble inkubert i 20 minutter ved 37 °C. Etter inkubasjonen i 20 minutter, ble 100 pl [<125>I]cAMP-sporemiddel (2 pCi) tilsatt til hver brønn, hvilket førte til et endelig volum på 200 pl/brønn. Platen fikk stå ved romtemperatur inntil den ble telt i en Topcount™ mikroplate-scintillasjonsteller (Packard, Nederland). De sigmoide konsentrasjonsresponskurver (punkter in duplo) ble analysert ved bruk av GraphPad Prism-programmet (GraphPad Software, CA, USA). b) Resultater: Inhiberingen av forskolin-stimulert cAMP med den direkte metode var meget lav (15-30%). Forskolinverdiene, grunnverdiene og pEC50-verdiene for begge metoder oppgis i tabell 4; representative kurver fra assayet vises på fig. 9a (0,5%hiFCS) og fig. 9b (2%hiFCS).
Selv om responseområdet for assayene var lavt, bekreftet assayet den agonistiske aktivitet av adenin på receptoren, og den målte EC50-verdi (ca. 15 nM) var nær dens adeninaffinity.
Ettersom det lave signal i det funksjonelle cAMP-assay på transient transfiserte celler kunne skyldes den heterogene natur (transfiserte og ikke-transfiserte celler) av cellene, bestemte man seg for å velge permanent transfiserte cellelinjer.
Et antall monoklonale cellelinjer ble undersøkt ved radioligandbinding slik det ble beskrevet ovenfor, idet tre (klon 26 (moderplate 1), 28, 29 og 30 (moderplate 9)) ble valgt for nærmere undersøkelser.
Eksempel 10: [<35>S]GTPdS-binding i permanent transfiserte celler
Den første funksjonelle karakterisering av de monoklonale cellelinjer ble utført i [<35>S]GTPYS-bindingseksperimenter. Den maksimale stimulering av [<35>S] GTPyS-bindingen med adenin for hver av de 4 valgte kloner var meget høyere (500 til 650 ganger høyere) enn hva som finnes i de forbigående transfeksjoner, hvilket bekreftet den forventede bedre kobling i permanente cellelinjer (se tabell 5). Den midlere EC50-verdi på 62 nM er imidlertid nær det transiente preparat (jfr eksempel 8). Et eksempel på [<35>S]GTPyS-bindingsstimulering med adenin gis på fig. 10.
Eksempel 11: cAMP-målinger i permanent transfiserte CHO-celler
For permanent transfiserte CHO-celler utførte man cAMP-målinger ved bruk av det indirekte RIA-sett fra NEN (Belgia). A) Metoder: To dager før eksperimentet ble cellene podet i en 96-brønners plate i den tetthet som var nødvendig for ca. 90% konfluens på dagen for eksperimentet. Etter fjerning av vekstmediet ble cellene vasket to ganger med en kontrollert saltoppløsning (CSS) som inneholdt 25 mM Tris-HCI, pH 7,4, 120 mM NaCI, 5,4 mM KCI, 0,8 mM MgCI2, 1,8 mM CaCI2, 15 mM glukose og 15 mg/l phenol red, med tilsetning av en fosfodiesterase-inhibitor IBMX (3-isobutyl-l-metylxantin) i en konsentrasjon på 1 mM og 0,1% BSA. Grunnverdiene for cAMP ble bestemt i CSS som inneholdt disse additiver, og det maksimale stimulerte cAMP-nivå ble bestemt i nærvær av 50 pM forskolin. For å teste den agonistiske aktivitet ble forbindelsene inkubert med cellene i 20 minutter ved 37 °C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av iskaldt HCI04(1N), og det hele ble lagret ved -20°C. Etter tining ble blandingene nøytralisert med en likeverdig mengde fosfatbufret KOH, fikk stå ved 4°C i 30 minutter for å la saltene felles, og ble sentrifugert ved 2.000 rpm i 5 minutter ved 4°C.
For den kvantitative bestemmelse av cAMP-nivået brukte man et 96-brønners flashplate-radioimmunoassaysett fra NEN, i henhold til leverandørens protokoll. De sigmoide konsentrasjonsresponskurver (punkter in duplo) ble analysert ved bruk av GraphPad Prism-programmet. b) Resultater: Virkningene av en Na-butyratinduksjon og forskjellige serumkonsentrasjoner ble bedømt. Idet man undersøkte de 4 valgte kloner,
oppviste klon 28 (MP9) den høyeste (-75%) inhibering av forskolin-stimulert cAMP-
nivå. Villtype-CHO-celler viste ingen respons på adenin. Forskolinverdien, grunnverdien og pEC50-verdiene for klon 28 og villtype-CHO-celler vises i tabell 6. Et pålitelig høyt vindu i cAMP-eksperimenter kunne kun erholdes etter Na-butyratinduksjon av receptorekspresjonsnivåer. Den målte EC50-verdi var i det lave nanomolare område (3 nM). Representative konsentrasjonsresponskurver vises på fig. Ila og fig. 11b for henholdsvis permanent transfiserte og villtype-CHO-celler.
Eksempel 12: Intracellulære kalsiummålinger i permanent transfiserte CHO-celler
Til slutt utførte man målinger av intracellulært Ca<2+>på den best funksjonelt koblede CHO-cellelinje, nemlig klon 28. Virkningen av en forbehandling med Na-butyrat ble undersøkt ved bruk av en doseresponskurve for adenin. A) Metoder: To dager før eksperimentet ble cellene podet i en 96-brønners plate i den tetthet som var nødvendig for ca. 90% cellekonfluens på dagen for eksperimentet. Forbindelsene ble fortynnet i kalsiumbuffer (5 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCI, 1 mM MgCI2, 5 mM KCI, 10 mM glukose, 1,25 mM CaCI2, 2,5 mM probenecid, pH 7,4), to ganger deres endelige konsentrasjoner. For grunnverdiene påførte man kalsiumbuffer, og for den maksimale respons brukte man 10 pM ionomycin. Vekstmediet ble fjernet, og cellene ble fylt på serumfritt vekstmedium som var supplementert med probenecid (5 mM), indikatoren Fluo-3 (2 pM), 20 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, og 0,1% BSA i inkubatoren ved 37°C. Etter 60 minutters inkubasjon ble cellene vasket 3 ganger med kalsium bufferen. 100 pl fortynnede forbindelser ble overført til brønnene, og endringene i det intracellulære kalsiumnivå ble målt med FLIPR<®>(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices). Hvert datapunkt ble utført in duplo, og toppen for Ca<2+->transienten ble ansett å være det relevante signal. De sigmoide konsentrasjonsresponskurver ble analysert ved bruk av GraphPad Prism-programmet. B) Resultater: Villtype-CHO-celler viste ingen respons på adenin. For ikke-Na-butyrat-behandlede celler forårsaket adenin en 1,25 gangers heving av grunnverdien i forhold til fluorescensenheter (RFU) i området fra 6800 til 8500. For de Na-butyrat-behandlede celler induserte adenin en 3 gangers heving av RFU som varierte fra 6600 til 19800. pEC50-verdiene for adeninresponsen var henholdsvis 7,14 og 7,83. Et representativt eksempel på Ca<2+->responsen som ble utløst av adenin, gis på fig. 12a og fig. 12b for henholdsvis permanent transfiserte og villtype-CHO-celler.
Litteraturhenvisninger:
Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.
Birnbaumer, M. (1995) Mutations and diseases of G protein coupled receptors. J. Receptor signal Transduction Res. 15, 131-160.
Buck, L., and Axel, R. (1991) A novel family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell 65, 175-187.
Burnstock, G.(1997) The past, present and future of purine nucleotides as signalling molecules. Neuropharmacology, 36 (9), 1127-1139.
Chow, S.C., Kass, G.E.N., and Orrenius, S., Purines and their roles in apoptosis. Neuropharmacology, 36(9), 1149-1156.
Hinuma, S. et al (1998) A prolactin-releasing peptide in the brain. Nature 393, 272-276.
Libert, F., Parmentier, M., Lefort, A., Dinsart, C, van Sande, J., Maenhaut, Simons, M.-J., Dumont, J.E., and Vassart, G. (1989) Selective amplification and doning of four new members of the G protein B coupled receptor family. Science 244, 569-572.
Mally, J., and Stone, T.W. (1996) Potential role of adenosine antagonist therapy in pathological tremor disorders. Pharmacol. Ther., 72 (3), 243-250.
ManiatisT., Fritsch E.F., and Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York.
Meunier J.-C, (1997) Nociceptin/orphanin FQ and the opioid receptor-like ORL1 receptor. Eur. J. Pharmacol. 340, 1-15.
Nyce, J.W. (1999) Insight into adenosine receptor function using antisense and gene-knockout approaches. TiPS 20, 79-83.
Reinscheid R.K. et al., (1995) Orphanin FQ: A neuropeptide that activates an opioidlike G-protein-coupled receptor. Science 270, 792-794.
Sakurai T. et al., (1998) Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptide and G-protein-coupled receptors that regulate feeding behaviour. Cell 92, 573-585.
Stadel, J.M., Wilson, S., and Bergsma, D.J. (1997) Orphan G protein-coupled receptors: a neglected opportunity for pioneer drug discovery. TiPS 18, 430-437.
Claims (12)
1. Isolert nukleinsyresekvens som koder for en adeninbindende G-protein-koblet reseptor, omfattende polypeptidet med SEKV ID NR: 2 eller et polypeptid som bibeholder adeninbindende reseptoraktivitet som har minst 80% sekvensidentitet med polypeptidet ifølge SEKV ID NR: 2.
2. Isolert nukleinsyresekvens ifølge krav 1 omfattende SEKV ID NR: 1, eller en sekvens som har minst 80% identitet med denne.
3. Isolert adeninbindende G-protein-koblet reseptor, eller et polypeptid, eller fragment derav, som bibeholder adeninbindende reseptoraktivitet som har minst 80% sekvensidentitet med polypeptidet som har SEKV ID NR: 2.
4. Ekspresjonsvektor omfattende en nukleinsyre ifølge krav 1 eller 2.
5. Vertcelle som bærer en vektor ifølge krav 4.
6. Nukleinsyreprimer som består av et fragment med fra 15 til 50 nukleotider av en nukleinsyre som koder for et polypeptid ifølge krav 3, som er i stand til å selektivt hybridisere til nevnte nukleinsyre, valgfritt bundet 5' eller 3' til en sekvens bestående av 4 til 15 nukleotider til hvilken den ikke er naturlig bundet.
7. In vitro assay for en forbindelse i stand til å interagere med en adenin-bindende G-protein-koblet reseptor, hvilket assay omfatter trinnene å: - tilveiebringe en G-protein-koblet reseptor omfattende minst ett polypeptid som har adenin-bindende aktivitet kodet av en isolert nukleinsyresekvens med SEKV ID NR: 1, eller en nukleinsyresekvens som har minst 80% sekvensidentitet med SEKV ID NR: 1; - bringe reseptoren i berøring med en tenkt vekselvirkende forbindelse; og bestemme om forbindelsen er en agonist eller antagonist for den adenin-induserte reseptoraktiveringen.
8. Assay ifølge krav 7, hvor vekselvirkningen bestemmes i henhold til forbindelsens evne til å bindes til reseptoren.
9. Assay ifølge krav 7, hvor vekselvirkningen bestemmes ved evnen av forbindelsen til å modulere aktiviteten av reseptoren.
10. Assay ifølge et av kravene 7 til 9, hvor reseptoren er lokalisert i membranen av en celle i hvilken polypeptidet ifølge krav 2 uttrykkes fra en vektor ifølge krav 4.
11. Anvendelse av et assay ifølge et av kravene 7 til 10 for identifikasjon av en modulatorforbindelse for behandling av en sykdom hvis patologi er forbundet med virkning ved purinreseptorer.
12. Anvendelse av et isolert polypeptid ifølge krav 1 eller 2 ved fremstilling av et legemiddel for behandling av en sykdom hvis patologi er forbundet med virkning ved purinreseptorer.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0008252.9A GB0008252D0 (en) | 2000-04-04 | 2000-04-04 | G protien coupled receptor |
PCT/EP2001/003688 WO2001074902A2 (en) | 2000-04-04 | 2001-04-02 | Adenine binding g protein coupled receptors |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20024779D0 NO20024779D0 (no) | 2002-10-03 |
NO20024779L NO20024779L (no) | 2002-12-04 |
NO331506B1 true NO331506B1 (no) | 2012-01-16 |
Family
ID=9889162
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20024779A NO331506B1 (no) | 2000-04-04 | 2002-10-03 | G-protein-koblet reseptor, nukleinsyre som koder for denne, ekspresjonsvektor, vertscelle og primer og anvendelse derav i assayer |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20030157516A1 (no) |
EP (1) | EP1274729B1 (no) |
JP (1) | JP4928702B2 (no) |
KR (1) | KR100851255B1 (no) |
AT (1) | ATE391137T1 (no) |
AU (2) | AU5041001A (no) |
CA (1) | CA2404679C (no) |
DE (1) | DE60133455T2 (no) |
ES (1) | ES2304382T3 (no) |
GB (1) | GB0008252D0 (no) |
IL (2) | IL152062A0 (no) |
NO (1) | NO331506B1 (no) |
NZ (1) | NZ521598A (no) |
WO (1) | WO2001074902A2 (no) |
ZA (1) | ZA200207970B (no) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7510845B2 (en) | 2000-05-04 | 2009-03-31 | California Institute Of Technology | Assay employing G protein-coupled receptor expressed in dorsal root ganglia |
US20030092035A1 (en) | 2000-05-04 | 2003-05-15 | Anderson David J. | Pain signaling molecules |
US20040076951A1 (en) * | 2000-10-25 | 2004-04-22 | Ming-Hui Wei | Isolated human G-protein coupled receptors, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof |
WO2004042402A2 (en) * | 2002-11-04 | 2004-05-21 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human mas-related gene x1 (mrgx1) |
DE10310758A1 (de) * | 2003-03-11 | 2004-09-23 | Grünenthal GmbH | Identifizierung von schmerzrelevanten Genen der SNSR (Sensory Neuron Specific Receptor)-Familie |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE9704836D0 (sv) * | 1997-12-22 | 1997-12-22 | Astra Pharma Inc | Novel receptor |
-
2000
- 2000-04-04 GB GBGB0008252.9A patent/GB0008252D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-04-02 US US10/240,998 patent/US20030157516A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-02 IL IL15206201A patent/IL152062A0/xx unknown
- 2001-04-02 DE DE60133455T patent/DE60133455T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-02 KR KR1020027012865A patent/KR100851255B1/ko active IP Right Grant
- 2001-04-02 NZ NZ521598A patent/NZ521598A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-04-02 ES ES01923707T patent/ES2304382T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-02 EP EP01923707A patent/EP1274729B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-02 AU AU5041001A patent/AU5041001A/xx active Pending
- 2001-04-02 WO PCT/EP2001/003688 patent/WO2001074902A2/en active IP Right Grant
- 2001-04-02 JP JP2001572591A patent/JP4928702B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-02 AT AT01923707T patent/ATE391137T1/de active
- 2001-04-02 AU AU2001250410A patent/AU2001250410B2/en not_active Expired
- 2001-04-02 CA CA2404679A patent/CA2404679C/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-10-02 IL IL152062A patent/IL152062A/en unknown
- 2002-10-03 NO NO20024779A patent/NO331506B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-10-03 ZA ZA200207970A patent/ZA200207970B/en unknown
-
2006
- 2006-07-28 US US11/494,775 patent/US20070087388A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2001250410B2 (en) | 2005-12-22 |
US20030157516A1 (en) | 2003-08-21 |
WO2001074902A3 (en) | 2002-03-21 |
AU5041001A (en) | 2001-10-15 |
NZ521598A (en) | 2004-11-26 |
IL152062A0 (en) | 2003-05-29 |
DE60133455T2 (de) | 2009-04-30 |
JP2003530095A (ja) | 2003-10-14 |
CA2404679A1 (en) | 2001-10-11 |
EP1274729B1 (en) | 2008-04-02 |
KR100851255B1 (ko) | 2008-08-08 |
ZA200207970B (en) | 2004-01-27 |
NO20024779L (no) | 2002-12-04 |
EP1274729A2 (en) | 2003-01-15 |
DE60133455D1 (de) | 2008-05-15 |
CA2404679C (en) | 2012-08-14 |
KR20020086723A (ko) | 2002-11-18 |
ES2304382T3 (es) | 2008-10-16 |
ATE391137T1 (de) | 2008-04-15 |
NO20024779D0 (no) | 2002-10-03 |
IL152062A (en) | 2009-05-04 |
WO2001074902A2 (en) | 2001-10-11 |
US20070087388A1 (en) | 2007-04-19 |
GB0008252D0 (en) | 2000-05-24 |
JP4928702B2 (ja) | 2012-05-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7897386B2 (en) | Cell-based assays for G-protein-coupled receptor-mediated activities | |
EP1196572A1 (en) | Axor21, a g-protein coupled receptor | |
US20070087388A1 (en) | G protein coupled receptor | |
US6358695B1 (en) | Methods of screening for agonists and antagonists of the HNEAA81 receptor | |
AU2001250410A1 (en) | Adenine binding G protein coupled receptors | |
EP1137938A1 (en) | Methods of screening for agonists and antagonists of the hdpxu17 receptor | |
KR100977824B1 (ko) | Epf 수용체 에세이, 화합물 및 치료학적 조성물 | |
MX2008015670A (es) | Receptor 39 acoplado a proteina g (gpr39). | |
US20030096751A1 (en) | G-protein coupled receptor polynucleotides and methods of use thereof | |
WO2002026824A2 (en) | A novel human g-protein coupled receptor, hgprbmy5, expressed highly in brain and ovarian tissues | |
WO2002044208A1 (en) | Methods of screening for agonists and antagonists of the hneaa81 receptor | |
US20010021509A1 (en) | cDNA clone HNEAA81 that encodes a human 7-transmembrane receptor | |
JP4768946B2 (ja) | ヒトgタンパク質共役型受容体の内因性および非内因性型 | |
WO2003062393A2 (en) | G protein-coupled receptor variants | |
JP2003512854A (ja) | Axor35、g蛋白結合受容体 | |
JP2007509631A (ja) | 電位色素及びカルシウム色素を用いた新規の細胞ベースアッセイ | |
US20040147732A1 (en) | Novel human G-protein coupled receptor, HGPRBMY9, expressed highly in brain and testes | |
JP2011097950A (ja) | ヒトgタンパク質共役型受容体の内因性および非内因性型 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |