NO330918B1

NO330918B1 - E. coli bakterie med redusert genom, fremgangsmate for fremstilling av bakterien og rekombinante proteiner

Info

Publication number: NO330918B1
Application number: NO20043465A
Authority: NO
Inventors: Frederick R Blattner; Gyorgy Posfai; Christopher D Herring; Guy Plunkett; Trevor Martin Twose; Jeremy D Glasner
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2004-08-19
Publication date: 2011-08-15
Also published as: US20070031969A1; US20030138937A1; CN1620497B; BRPI0307125A2; IL162911A0; JP2005517429A; ATE469230T1; MX264365B; AU2008202865A1; NZ534010A; IS7355A; MXPA04006942A; KR100967592B1; JP4658478B2; KR20040077766A; CN103540543B; AU2003239116B2; IL195374A; JP2011045371A; ZA200405509B

Description

Kryssreferanse til relaterte søknader

Denne søknaden er en delvis fortsettelse av US patentsøknad serienr. 10/057 582, arkivert 23. januar 2002 og US midlertidige søknad serienr. 60/409 080, arkivert 6.

september 2002.U

Denne oppfinnelsen ble gjort med støtte av de forente staters regjering tildelt med et følgende agenturet: NIH GM 35682.

De forente stater har visse rettigheter i denne oppfinnelsen.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Bakterier er blitt anvendt for å produsere en rekke forskjellige kommersielle produkter. For eksempel er mange Streptomyces stammer og Bacillus stammer blitt anvendt for å produsere antibiotika; Pseudomonas denitrificans og mange Propionibacterium stammer er blitt anvendt for å produsere vitamin Bl2; noen andre bakterier er blitt anvendt for å produsere vitamin riboflavin; Brevibacterium flavum og Corynebacterium glutamincum er blitt anvendt for å produsere henholdsvis lysin og glutaminsyre som mattilsetninger; andre bakterier er blitt anvendt for å produsere andre aminosyrer anvendt som mattilsetninger; Alcaligenes eutrophas er blitt anvendt for å produsere bionedbrytbare mikrobielle plastikker; og mange Acetobacter og Gluconobacter stammer er blitt anvendt for å produsere eddik. Nylig er det blitt vanlig at bakterier slik som Escherichia coli (E. coli) blir genetisk konstruert og anvendt som vertsceller for produksjonen av biologiske reagenser slik som proteiner og nukleinsyrer, i laboratorier så vel som industrielle rammer. Den farmasøytiske industrien støtter flere eksempler på vellykkede produkter som er humane proteiner som er produsert i E. coli kulturer som er dyrket i et gjærkar.

Det er ikke en uvanlig forekomst for normale bakterielle proteiner og negativt affisere

produksjonen eller rensingen av et ønsket proteinprodukt fra en konstruert bakterie. For eksempel når E. coli bakterier blir anvendt som vertsceller for å lage en stor mengde av et ønsket produkt som kodes av et gen som er introdusert inn i vertsceller ved hjelp av et plasmid, kan visse normale E. coli genprodukter interferere med introduksjonen og opprettholdelse av plasmid DNA. Mer signifikant så kan kostnaden ved rensingen av et rekombinant protein være større enn kostnaden av produksjonen, på grunn av bakteriekultur fordelene ved å lage proteiner i bakterier, og noen av de naturlige proteinene som produseres av bakterieverten er sensitive rensingsproblemer. Videre så produserer mange bakteriestammer toksiner som må renses fra målproteiner som blir

produsert og noen stammer kan ved et sammentreff produsere native proteiner som ligger nær i størrelsen til målproteinet, og gjør der med at størrelsesseparasjon ikke er tilgjengelig som rensingsprosess.

Genomet til en bakterie som anvendes i et fermentor for å produsere et rekombinant protein inkluderer imidlertid også mange unødvendige gener. En bakterie som lever i et naturlig miljø har mange tilstandsresponsive gener som tilveiebringer mekanismer for å overvinne vanskelige miljøbetingelser som temperatur, stress eller mangel på næringskilder. Bakterier som lever i en gjæringstank har ikke disse problemene og følgelig trenger de ikke disse tilstandsresponsive genene. Den bakterielle verten forbruker metabolsk energi for hver fermeringssyklus som replikerer disse genene. Dermed produseres det unødvendige gener og proteiner som det ikke er bruk for, av en bakteriell vert som anvendes for produksjon av rekombinant protein, som resulterer i en mangel på effektivitet i systemet som kunne forbedres.

Det er ikke veldig vanskelig å gjøre delesjoner i genomet til en mikroorganisme. Man kan utføre tilfeldige delesjonsstudier i organismer ved enkelt å slette genomregioner for å studere hvilke trekk hos organismen som mistes ved de slettede genene. Det er imidlertid vanskeligere å gjøre målrettede delesjoner av spesifikke regioner i genomets DNA og enda vanskeligere hvis en av hensiktene med fremgangsmåten er og ikke etterlate noe innsatt DNA, her kalt et "arr", igjen i organismen etter delesjonen. Hvis regioner med innsatt DNA, dvs. arr, blir etterlatt etter en genomisk delesjonsprosedyre kan disse regionene være lokalisasjoner for uønsket rekombinasjonsbegivenheter som kunne være fjernet fra genomregionene som er ønskelige, eller fremkalle genom rearrangementer. Ved å bygge en serie med flere delesjoner kunne arr som var etterlatt i tidligere trinn bli kunstige mål for etterfølgende delesjonstrinn. Det er spesielt slik når fremgangsmåten blir anvendt gjentatte ganger for å danne en serie med delesjoner fra genomet. Med andre ord blir organismen genetisk ustabil ved hjelp av delesjonsprosessen hvis innsatt DNA blir etterlatt.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å redusere genomet til en organisme, helst uten å etterlate arr i genomet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter E. coli bakterie, som har et kromosom som er genetisk konstruert til være minst 5% til 40% mindre enn kromosomet til sin native foreldrestamme, kjennetegnet ved at kromosomet til E. coli bakterien har slettet alle DNA segmentene som er en insersjonssekvens (IS) og hvori kromosomet til E. coli bakterien ikke omfatter arr (scars), hvor nevnte arr er definert som fremmede DNA sekvenser introdusert i bakterie genomet under en slettingsprosess og som danner et potensielt problem av uønsket homolog rekombinasjon, hvis slettingsprosessen anvendes mer enn en gang i bakterien.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å fremstille en bakterie i følge krav 1, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trinnene av: å lage et artifisiellt DNA molekyl, hvor det artifisielle DNA molekylet omfatter: i) en sekvens 1 i den ende enden som er identisk til en sekvens på den venstre flanken av en kromosomregion som skal slettes, etterfulgt av en sekvens 2 som er identisk til sekvensen på den høyre flankerende siden av kromosomregionen som skal slettes og;

ii) i den andre enden, en sekvens 3, som er identisk med sekvensen innen

den kromosomale regionen som skal slettes;

iii) et sekvens-spesifikt nuklease gjenkjenningssete mellom sekvens 2 og 3,

hvori gjenkjenningssetet ikke er tilstede i bakteriens kromosom.

å introdusere det artifisielle DNA molekylet inn i bakterien under betingelser som favoriserer homolog rekombinasjon mellom sekvensene 1 og 3 og sekvenser i bakteriens kromosom for å danne en rekombinant bakterie,

å introdusere inn i den rekombinante bakterien en ekspresjonsvektor for en sekvensspesifikk nuklease som gjenkjenner gjenkjenningssetet,

å uttrykke den sekvensspesifikke nukleasen i den rekombinante bakterien,

å høste bakteriene som overlever ekspresjonen av den sekvensspesifikke nukleasen og beholder den korrekte slettingen og

repetere de foregående trinnene inntil bakterien i følge krav 1 oppnås.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for å uttrykke rekombinante proteiner i en bakterie, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter følgende trinn: å introdusere inn i en bakterie ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, en vektor som omfatter et DNA som koder for et protein som har en signalsekvens operativt koblet til en ekspresjonskontrollsekvens og å dyrke bakterien under næringsbetingelser som er egnet for ekspresjon av proteinet kodet for av DNAet.

En bakterie kan ha et genom som er genetisk konstruert slik at det er minst to prosent (2%) til tyve prosent (20%) mindre enn genomet til sin native foreldrestamme. I en utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en bakterie som har et genom som er genetisk konstruert slik at det er minst syv prosent (7%) mindre enn genomet til den native foreldrestammen. Aller helst så er genomet åtte prosent (8%) til fjorten prosent (14%) til tyve prosent (20%) mindre enn genomet til sin native foreldrestamme. Når den anvendes for å produsere et produkt kan en bakterie med et mindre genom ha en eller flere av de følgende fordelene. 1. Produksjonsprosessen kan være mer effektiv enten med hensyn til ressursforbruket eller med hensyn til produksjonshastighet, maksimal utbytteprosent eller alle tre.

2. Produksjonsrensingsprosessen kan forenkles eller renere produkter kan lages.

3. Et produkt som ikke kan produseres før som følge av nativ protein interferens kan produseres.

4. Utbytte per celle av det ønskede produktet kan økes.

Den foreliggende oppfinnelsen er også rettet mot en bakterie, som er konstruert slik at den har et "rent genom", dvs. at den for eksempel mangler genetisk material slik som visse gener som er unødvendige for vekst eller metabolisme hos bakterien, innsettingssekvenser (flyttbart element), pseudogener, profag, endogene restriksjonsmodifiseringsgener, patogene gener, toksine gener, "fimbriale" gener, periplasmiske proteingener, invasine gener, sekvenser med ukjent funksjon og sekvenser som ikke er funnet felles mellom to stammer med de samme native parenterale artene av bakterier. Andre DNA-sekvenser som ikke er nødvendig for celleoverlevelse og produksjon av visse proteiner i kultur kan slettes. Den reduserte genombakterien i den foreliggende oppfinnelsen kan ses på som en basal genetisk leseramme som kan tilsettes en myriade av genetiske elementer for ekspresjon av nyttige produkter så vel som genetiske kontrollelementer som tilbyr en enestående mulighet for å fininnstille eller optimalisere ekspresjonen av det ønskede produktet.

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også materialer og fremgangsmåter for målrettet delesjon av gener og andre DNA-sekvenser fra et bakterielt genom uten å etterlate noe gjenværende DNA fra manipulasjonen (arrløs delesjon). Fordi fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen sjelden introduserer mutasjoner eller etterlater gjenværende DNA i de genomiske DNA-sekvensene rundt delesjonssetet kan fremgangsmåtene anvendes for å lage en serie med delesjoner i en bakterie uten å øke muligheten for uønsket homolog rekombinasjon innen genomet. Noen av disse fremgangsmåtene er også nyttige for å lage lignende delesjoner, for eksempel i bakteriofag, native plasmider og lignende, så vel som i høyere organismer, slik som pattedyr og planter.

Den første delesjonsfremgangsmåten er lineært DNA basert. For å utføre prosessen blir først en lineær DNA-konstruksjon tilveiebrakt i en bakterie og en region av det bakterielle genomet blir erstattet av den lineære DNA-konstruksjonen gjennom homolog rekombinasjon styrt av et system som finnes i bakterien som kan øke frekvensen av homolog rekombinasjon. Deretter uttrykker et separat gen som tidligere er introdusert inn i bakterien en sekvensspesifikk nuklease som kutter det bakterielle genomet ved et unikt gjenkjennelsessete lokalisert på den lineære DNA-konstruksjonen. Deretter gjennomgår en DNA-sekvens, som er konstruert slik at den inneholder DNA homologt til et mål i det genomiske DNAet i den ene enden av den lineære DNA-konstruksjonen homolog rekombinasjon med en lignende genomisk DNA-sekvens lokalisert nær den andre enden av den lineære DNA-konstruksjon. Nettoresultatet er en nøyaktig delesjon av en region i genomet.

Den andre fremgangsmåten er også linært DNA-basert. To DNA-sekvenser, en som er identisk til en sekvens som flankerer en ende av en bakteriell genomregion som skal slette og den andre som er identisk til en sekvens som flankerer den andre enden av den bakterielle genomregionen som skal slettes, blir konstruert inn i en vektor hvor de to sekvensene er lokalisert ved siden av hverandre. Minst et sekvensspesifikk nuklease gjenkjenningssete ble også konstruert inn i vektoren på en side av de to sekvensene. Vektoren blir introdusert inn i en bakterie og et lineært DNA ble lagret på innsiden av bakterien ved å uttrykke på innsiden av bakterien en nuklease som gjenkjenner det sekvensspesifikke nuklease gjenkjenningssetet og kutter vektoren i det. Det lineære DNA gjennomgår homolog rekombinasjon med det bakterielle genomet, styrt av et system som finnes i bakterien for å øke frekvensen av homolog rekombinasjon. En bakterie med en målrettet delesjon som er fri for gjenværende artifakter i sitt genom blir dermed produsert.

Den andre fremgangsmåten beskrevet over kan også anvendes for å erstatte en valgt region i et bakterielt genom med en ønsket DNA-sekvens. I dette tilfellet blir en ønsket DNA-sekvens som kan gjennomgå homolog rekombinasjon ved og dermed erstatte den valgte regionen konstruert inn i vektoren. Alle andre aspekter er det samme som for å slette en målregion.

Den tredje fremgangsmåten er basert på selvmord plasmid. Det spesifikke plasmidet som anvendes i denne fremgangsmåten inneholder et replikasjonstartpunkt som kontrolleres av en promoter og en selekterbar markør, slik som et antibiotikaresistensgen. Fra å slette en utvalgt region i et bakteriegenom blir et DNA-innskudd som inneholder to DNA-sekvenser lokalisert rett etter hverandre, en som er identisk til en sekvens som presenterer en ende av den bakterielle genomregionen som skal slettes og den andre som er identisk til en sekvens som flankerer den andre enden av den bakterielle genomregion, satt inn i plasmid. Plasmidet blir så introdusert inn i bakterien og integrert inn i bakteriegenomet. Deretter blir promoteren aktivert for å indusere replikasjon av det ektopiske startpunktet som er introdusert inn i det bakterielle genomet slik at rekombinasjonsbegivenheter blir valgt. I mange bakterier vil rekombinasjonsbegivenhetene resultere i en nøyaktig delesjon av den utvalgte regionen i det bakterielle genomet og disse bakteriene kan identifiseres. En alternativ måte å velge rekombinasjonsbegivenheter er å konstruere et gjenkjenningssete for en frekvensspesifikk nuklease inn i det spesifikke plasmidet og kutte det bakterielle genomet med den sekvensspesifikke nukleasen, etter at plasmidet er integrert inn i det bakterielle genomet.

Den selvmord plasmidbaserte fremgangsmåten som er beskrevet over kan også anvendes for å erstatte en valgt region i et bakteriegenom med en ønsket DNA-sekvens. I dette tilfellet blir et innskutt DNA som inneholder en ønsket DNA-sekvens som kan gjennomgå homolog rekombinering med og følgelig erstatte den valgte regionen satt inn i plasmidet. Alle andre aspekter er de samme som for å slette en målrettet region.

Fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen er nyttige inter alia for å konstruere redusert genombakterier for produksjonen av rekombinante genprodukter. Slike konstruerte bakterier tillater forbedret produksjon av slike proteiner for å øke effektiviteten av produktet og utbytte av det ønskede genproduktet så vel som å tillate mer effektiv rensing av produktet på grunn av elimineringen av unødvendige bakterielle genprodukter. En foretrukket redusert genombakterie i den foreliggende oppfinnelse er en bakterie hvor et eller flere native gener som koder for periplasmiske proteiner og/eller membranproteiner er blitt slettet.

Den foreliggende oppfinnelsen er også rettet mot DNA og vektorer som anvendes for å utføre fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelse, fremgangsmåter for å lage DNAet og for kitt som inneholder rør og hvor disse rørene inneholder et eller flere DNA eller vektorer i den foreliggende oppfinnelsen, og valgtfritt passende buffere, primere, endonukleaser, nukleotider og polymeraser.

Den foreliggende oppfinnelsen kan også anvendes til levende vaksiner, som omfatter en redusert genombakterie fra den foreliggende oppfinnelsen eller som omfatter en redusert genombakterie i den foreliggende oppfinnelsen som har fått introdusert DNA som koder for antigenets determinanter fra patogene organismer som er operativt assosiert med ekspresjons kontrollsekvenser som tillater ekspresjonen av nevnte antigene determinanter. Levende vaksine som omfatter en redusert genombakterie fra den foreliggende oppfinnelsen der et DNA er blitt introdusert, som er utledet fra en patogen organisme og som valgfritt har et startsted for replikasjon, hvor nevnte levende vaksine er i stand til å indusere en forsterket immunrespons i en vert og mot en patogen organisme. Det nevnte DNA er foretrukket metylert ved et metyleringssete. En levende vaksine kan også produseres fra en patogen organisme ved å slette genene som er ansvarlig for patogeniteten fra genomet til den organismen, mens andre antigene determinanter blir bevart.

Andre hensikter, trekk og fordeler med oppfinnelsen vil bli tydelige ved å betrakte den følgende detaljerte beskrivelsen.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser posisjonene til genene og andre DNA-sekvenser i E. coli K-12 bakteriegenomet som var kandidater for sletting, som svarte og lysere skraverte bokser på den ytterste ringen. Figur 2 illustrerer et spesifikt eksempel på en lineær DNA-basert arrløs genetisk modifikasjonsrfemgangsmåte i den foreliggende oppfinnelsen. Figur 3 illustrerer et spesifikt eksempel på en annen lineær DNA-basert fremgangsmåte i den foreliggende oppfinnelsen. Figur 4 viser et mutagenseplasmid som kan anvendes i den lineære DNA-baserte fremgangsmåten illustrert i Figur 3. Figur 5 A-C illustrerer et spesifikt eksempel på en selvmords plasmidbasert fremgangsmåte i den foreliggende oppfinnelsen. Figur 6 viser tre plasmider som kan anvendes i den selvmordsplasmidbaserte fremgangsmåten illustrert i Figurene 5A-C.

Detaljer beskrivelse av oppfinnelsen

Bakterier i deres naturlige omgivelse blir utsatt for mange tilstander som man vanligvis ikke har i standard industriell eller laboratorievekst, og bærer dermed et stort antall tilstandsavhengige, stressinduserte gener eller på annen måte ikke essensielle gener som ikke er nødvendige for industriell- eller laboratorieanvendelse av organismene. Denne oppfinnelse begynte med forståelsen for at mye av den genetiske informasjonen som finnes i genomet til en bakteriestamme kunne slettes uten skadelig effekt for anvendelse av bakteriekulturer i industrielle prosesser eller for viktigheten av disse i laboratoriet. Det ble anerkjent at en bakterie med redusert genom kan være en fordel i forhold til native stammer i mange industrielle- og laboratorieanvendelser. For eksempel er en bakterie med et redusert genom minst i noen grad mindre metabolsk krevende og kan dermed produsere et ønsket produkt mer effektivt. I tillegg kan et redusert genom føre til færre native produkter og lavere nivåer visse native proteiner, noe som fører til lettere rensing av et ønsket protein fra de gjenværende bakterielle proteinene. Videre er noen bakterielle genetiske sekvenser assosiert med ustabilitet som kan interferere med standard industriell eller laboratoirepraksis, og kan medføre dyre og arbeidskrevende kvalitetskontrollprosedyrer.

Den foreliggende oppfinnelsen involverer også fremgangsmåter for å slette genomisk DNA fra et genom uten å etterlate noe innskutt DNA (arr sletting). Hvis man gjør flere etterfølgende slettinger fra et enkelt DNA-molekyl som utgjør et bakterielt genom, er det viktig å ikke etterlate noen innsatte DNA-sekvenser. Slike innsatte sekvenser, hvis de ble etterlatt, ville være kandidatsseter for uønskede rekombinasjonsbegivenheter som ville slette ikke karakteriserte og kanskje viktige deler av det gjenværende genomet fra bakterier eller forårsake andre uforutsette genom rearrangementer med uheldige effekter. Siden en av hensiktene med genomreduksjonsforsøket er å øke den genetiske stabiliteten til bakterien, ville det å etterlate noe innsatt DNA være motsatt hensikten, og bør unngås. Dermed ble fremgangsmåtene som anvendes for å slette DNA fra genomet viktige og sofistikerte.

I et aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelsen en bakterie som har et genom som er genetisk konstruert slik at det er mindre enn genomet til dens native foreldrestamme. Med den hensikt å eksemplifisere har arbeidet som er beskrevet her fokusert på den vanlige laboratorie og industrielle bakterie Escherichia coli. Genomreduksjonsarbeidet beskrevet her, begynte med laboratorie E. co/z-stamme K-12, som før arbeidet som er beskrevet her, hadde et genom på 4 639 221 nukleotider eller basepar. Bakterien i den foreliggende oppfinnelsen kan ha et genom som er minst to prosent (2%), helst over fem prosent (5%), mer ønskelig over syv prosent (7%) til åtte prosent (8%) til fjorten prosent (14%) til atten prosent (18%) til tyve prosent (20%) til førte prosent (40%) til seksti prosent (60%) mindre enn genomet til de native foreldrestammer. Uttrykket "nativ foreldrestamme" betyr en bakteriestamme (eller annen organisme) som finnes i naturlige eller native omgivelse, som forstås av det vitenskapelige miljøet, og på hvis genom en rekke slettinger kan gjøres, for å lage en bakteriell stamme med et mindre genom. Prosenten som et genom er blitt mindre, etter en rekke slettinger, er beregnet med å dele "det totale antall basepar slettet etter alle slettingene" med "det totale antall basepar i genomet før alle slettingene" og så gange med 100.

Et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen omfatter en redusert genombakterie hvor ca. 5% til ca. 10% av dens proteinkodende gener er slettet. Helst så er ca. 10% til 20% av de proteinkodende genene slettet. I en annen utførelsesform i oppfinnelsen er ca. 30% til ca. 40% til ca. 60% av de proteinkodende genene slettet.

Generelt er det slik, at de typer gener og andre DNA-sekvenser som kan slettes, er de som ved sletting ikke affiserer overlevelsesraten eller veksten alvorlig av bakterien under spesifikke vekstbetingelser. Om et nivå av alvorlig effekt er akseptabelt, avhenger av en spesifikk anvendelse. For eksempel så kan en 30% reduksjon i veksthastighet være akseptabel for en anvendelse, men ikke for en annen. I tillegg så kan alvorlig effekt av å slette en DNA-sekvens fra genomet reduseres ved målinger, slik som å forandre kulturbetingelser. Slike målinger kan snu en uakseptabel alvorlig effekt til en akseptabel eeffekt. Helst er veksthastigheten tilnærmet den samme som for foreldrestammen. Imidlertid så er helst veksthastighetene i området fra ca. 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% til ca. 50%, lavere enn den hos foreldrestammen innen området av denne oppfinnelsen. Mer bestemt så kan ønskede doblingstider for bakterier i den foreliggende oppfinnelsen være i størrelsesområdet fra ca. 30 minutter til ca. 3 timer.

Bakteriene i den foreliggende oppfinnelsen kan konstrueres ved hjelp av fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen, for å optimalisere deres anvendelse av tilgjengelige ressurser (dvs. næringsstoffer) for produksjonen av ønskede produkter. Disse produktene kan være rekombinante proteiner, som ikke er begrensende eksempel, insulin, interleukiner, cytokiner, veksthormoner, vekstfaktorer, erytropoietin, kolonistimulerende faktorer, interferon, antistoffer, antistoff fragmenter eller ethvert annet nyttig rekombinant protein. Det rekombinante produktet kan være et terapeutisk produkt, en vaksinekomponent, et diagnostisk produkt eller et forskningsreagens. Bakteriene kan også anvendes som en bakgrunn for å uttrykke industrielt nyttige produkter slik som kommersielt nyttige metabolske intermediater og sluttprodukter slik som vanillin, "shikimic"syre, aminosyrer, vitaminer, organiske syrer og lignende, og kjemiske forbindelser, som naturlig ikke produseres i bakterier, men er produsert som et resultat av metabolisk reaksjonsveiskonstruksjon eller annen genetisk manipulasjon (se for eksempel US patentnr. 6 472 16 og 6 372 476).

Under blir E. coli anvendt som et eksempel for å illustrere genene og andre DNA-sekvenser som er kandidater for sletting med henblikk på å lage bakterier som kan produsere et ønsket produkt mer effektivt. De generelle prinsippene som illustreres og typene av gener og andre DNA-sekvenser som er identifisert som kandidater for sletting, kan anvendes for andre bakteriearter eller stammer. Det må forstås at gener og andre DNA-sekvenser identifisert under som slettingskandidater bare er eksempler. Mange andre E. coli gener og andre DNA-sekvenser som ikke er identifisert, kan også slettes uten å affisere celleoverlevelse og vekst til et uakseptabelt nivå.

Det er forutsatt i analysen og metodologien beskrevet under, at i det minste en del av DNA-sekvensen i målbakteirestammens bakteriofag genom eller det native plasmidet er tilgjengelige. Helst så er hele sekvensen tilgjengelig. Slike komplette eller delvise sekvenser er lett tilgjengelig i GenBank databasen. Den fulle genomiske sekvensen til flere stammer av E. coli er selvfølgelig nå publisert (for eksempel Blattner et al., Science, 277:1453-74,1997 K-12 Strain MG1655; se også GenBank aksesjonsnr. U00096; Perna et al., Nature, 409, 529-533,2001; Hayashi et al., DNA Res., 8,11-22, 2001 og Welch et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA (2002) 99 (26) 17020-17024 og GenBank aksesjonsnr. AE014075), det er også sekvensen til flere andre vanlig anvendte laboratoriebakterier. For å starte slettingsprosessen blir genomet til bakteriene analysert for å se etter de sekvensene som representerer gode kandidater for sletting. Selvfølgelig kan disse teknikkene også anvendes på delvis sekvenserte genomer i de genomiske områdene som sekvensdata er tilgjengelige for eller kunne bestemme.

IE. coli og andre bakterier, så vel som i høyere organismer, inkluderer en type DNA-sekvens, som kan slettes, de som generelt vil affisere stabiliteten til organismen alvorlig eller genproduktene til den organismen. Slike elementer som gir opphav til ustabilitet inkluderer flyttbare elementer, innsettingssekvenser og annet "egoistiske DNA" elementer som kan spille en rolle i genom ustabilitet. For eksempel blir innsettingssekvens (IS) elementer og deres assosierte omflyttere ofte funnet i bakterielle genomer, og er dermed mål for sletting. IS-sekvenser er vanlig i E. coli og alle kan slettes. For klarhetens skyld anvender vi i dette dokumentet uttrykket IS-element og flyttbart element om hverandre for å referere til DNA-elementer, enten de er intakte eller ødelagte, som kan flytte seg fra et punkt til et annet i genomet. Et eksempel på de skadelige effektene til IS-elementer innen vitenskap og teknologi, er det et faktum at de kan hoppe over fra genomet i verten E. coli og inn i et BAC-plasmid under oppformering for sekvensering. Mange eksempler er funnet i det humane genomet og andre sekvenser i GenBank databasen. Dette artifakt kan forhindres ved å slette alle IS-elementene fra vertscellene. For en spesiell bruk, kan andre spesifikke gener assosiert med genom ustabilitet også slettes.

Figur 1 illustrerer E. coli genomet, som nativt i K-12-stammen, omfatter 4 639 221 basepar. Figur 1 viser på den innerste ringen, skalaen for baseparposisjonene i E. coli K-12-genomet (stamme MG1655) skalert uten slettinger (se også Blattner et al., supra). Den neste ringen progressivt utover, viser regioner i K-12-genomet som mangler eller som er sterkt forandret i en relatert stamme 0157:H7, og som dermed er potensielt detekterbar fra K-12-genomet. Den neste ringen utover viser posisjonene til IS-elementene, både fullstendig og delvis i det native genomet. Den neste ringen utover viser posisjonene til RHS-elementene A til E og flagellar og restriksjonsregioner spesifit målrettet for sletting her. Den ytre ringen viser lokalisasjonen til slettingene som faktisk er gjort i genomet, som også er oppført i tabellene 1 og 2 under. Disse slettingene utgjør ca. 14% av baseparene i det originale K-12 MG1655 genomet. Ved å anvende fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen vil 18% til 20% til 45% av genomet være slettet ved å anvende de designede paradigmene som er beskrevet her.

En annen familie med E. coli gener som kan slettes er restriksjonsmodifikasjons systemgenene og andre endogene nukleaser, hvis produkter ødelegger fremmed DNA. Disse genene er ikke viktige for bakterieoverlevelse og vekst i dyrkingsomgivelser. Disse genene kan også interferere med genetisk konstruksjon ved å ødelegge plasmider som introduseres inn i en bakterie. Posisjonene for restriksjonsmodifikasjons systemgenene på et E. coli genomkart er vist i Figur 1 og Tabell 1. I en utførelsesform i følge oppfinnelsen kan andre DNA metylasegener settes tilbake til den slettede E. coli stammen, for å optimalisere stammen for visse anvendelser, for eksempel eukaryote metylasegener.

En annen familie med E. coli-gener som kan slettes er flagella genfamilien. Flagella er ansvarlig for bevegelse i bakterier. I naturlige omgivelser svømmer bakterien for å lete etter næringskomponenter. I dyrkingsomgivelser er bakterievandring ikke viktig for celleoverlevelse og vekst og svømmebevegelsen er metabolsk veldig dyr, da den bruker over 1% av den cellulære energien til ingen nytte. Dermed kan flagella genene slettes, slik at det lages en bakterie med et mindre genom. Posisjonene til flagella genene på et E. coli genomkart er vist i Figur 1 og Tabell 1.

En type E. coli DNA-elementer, som allerede nevnt, og som kan slettes er IS-elementer (eller flyttbare elementer). IS-elementene er ikke viktig for bakterieoverlevelse og vekst i en dyrkningsomgivelse er kjent for å interferere med genomstabilitet. Dermed kan IS-elementene slettes og det kan lages en bakterie med et mindre genom. Posisjonene for IS-elementene på et E. coli genomkart er vist i Figur 1 og Tabell 1.

En annen type E. coli DNA-element som kan slettes er Rhs-elementene. Alle Rhs-elementene deler en 3,7 kB Rhs stamme, som er en stor, homolog repetert region (det er 5 kopier i E. coli K-12) som tilveiebringer et hjelpemiddel for genom rearrangement via homolog rekombinasjon. Rhs-elementene er hjelpeelementer som stort sett utvikler seg i en annen bakgrunn og sprer seg til E. coli, ved horisontal utbytting etter divergent av

E. coli som en art. Posisjonene for Rhs-elementene på et E. coli genomkart er vist i

Figur 1 og Tabell 1.

En type region i E. coli genomet som kan slettes, er de ikke-transkriberte regionene, fordi det er mindre sannsynlig at de er viktige for celleoverlevelse og vekst. Andre type regioner i E. coli gemonet, som kan slettes, er hsd-regioner. Hsd-regionene koder for hovedrestriskjonsmodifikasjons genfamilien som er blitt diskutert over. Posisjonene til de ikke-transkriberte regionene og til hsd-regionene på et E. coli genomkart, er vist i

Figur 1 og Tabell 1.

Profag, pseudogener, toksingener, patogenisitet gener, periplasmiske proteingener, membranproteingener, er også blant de genene som kan slettes, basert på genseleksjons paradigme diskutert her. Etter sekvensen til E. coli K-12 (se Blattner, et al., supra) ble sammenlignet med sekvensen til dets nære slektning 0157:H7 (se Perna et al., supra) ble det diskutert at 22% (K-12) og 46% (0157:H7) av de proteinkodende genene var lokalisert på samme spesifikke øyer fra en til ca. 85 kb innsatt tilfeldig inn i en relativt konstant bærende del (backbone).

Blant andre gener som kan slettes, er gener som koder for bakteriofag reseptorer inkludert for eksempel ton A (FhuA) og/eller dets fullstendige operon fhu ABC som koder for reseptoren for den lytiske fagen Tl.

En generell fremgangsmåte for å identifisere tilleggs gener og DNA-sekvenser som slettingskandidater, er å sammenligne genomet til en bakteriell stamme, med en eller flere andre stammer. Enhver DNA-sekvens som ikke er til stede i to eller tre av stammene, er mindre sannsynlig å være funksjonelt essensielle og kan dermed anvendes for å identifisere kandidater for sletting. I eksemplene beskrevet under ble de fullstendige genomsekvensene to E. coli stammer 0157;H7 EDL933 og K-12 MG1655 sammenlignet. DNA-sekvenser som ikke ble funnet i begge stammene ble anvendt for å identifisere mål for sletting. 12 slike identifiserte mål rfa E. coli stamme MG1655 ble slettet, noe som resulterte i en bakteriestamme med et genom som er ca. 8% mindre. Bakterier med det reduserte genomet, vokser med vesentlig samme hastighet, som den native foreldre MG1655 stammen.

DNA-sekvensen til en uropatogen E. coli stamme CFT073 H7 (se Welch et al, supra) ble nylig bestemt og dens sekvens ble sammenlignet med K-12 (MG1655) og 0157:H7. Resultater viser at bare ca. 40% av alle de kodende genene funnet i ethvert av disse genomene, er tilstede i alle genomene og CFT073, K-12 og 0157:H7 er sammensatt av 67%, 43% og 68% stammespesifikke øygener. Basert på denne informasjonen kan så mye som ca. 60% av de proteinkodende sekvensene slettes fra E. coli. Helst minst 5% eller ca. 90% eller ca. 15% eller ca. 21% av de proteinkodende genene blir slettet. Mer ønskelig blir ca. 30% av de proteinkodende genene slettet. Det bør legges merke til at det kan være gener som er viktige for vekst i en stamme, som ikke er nødvendig for vekst i andre stammer. I slike tilfeller blir genet som er viktig for vekst i den stammen slettet fra stammen eller hvis det blir slettet blir det erstattet med et annet gen, med en komplementær funksjon, for å tillate vekst av stammen.

I en bestemt utførelsesform av oppfinnelsen, blir sekvensinformasjonen anvendt for å

velge tilleggsgener fra (ved å anvende fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen) et E. coli genom, slik at det produseres et genom for ca. 3,7 megabaser (ca. 20% mindre enn K-12) som inneholder 73 slettinger for å fjerne ca. 100 "øyer" og omliggende DNA som fremdeles vil tillate adekvat vekst av stammen, når den dyrkes på minimalt

medium. Designen påkaller også fullstendig eliminering av alle gjenværende flyttbare elementer (IS-sekvenser) fra genomet.

Periplasmisk rensing og proteinekspresion

For årsaker som er diskutert her gjenstår det et behov innen fagfeltet for produksjon av rekombinatne proteiner, som vil utskilles til det periplasmiske rommet hos bakterier og fremgangsmåter i følge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer konstruksjonen av bakterier for å optimalisere periplasmisk ekspresjon.

Gram-negative bakterier slik som E. coli har to cellulære membraner, den indre cellemembranen og den ytre cellemembranen. To membraner er separerte ved hjelp av et periplasmisk rom (PS). Bakterielle proteiner med passende signalfrekvenser blir skilt ut gjennom den indre cellemembranen inn i PS ved hjelp av minst to forskjellige systemer, Sec-systemet og Tat-systemet. (Danese et al., Annu. Rev. Genet. (1998) 32:59-94; Fekes et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. (1999) 63:161-193 og Pugsley, Microbiol. Rev. (1993) 57:50-108 [sic]. Hynds et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:34868-34874; Santini et al. (1998) EMBO J. 17:101-112; Sargent et al., EMBO J. 17:101-112

[TAT].

Sec-systemet gjenkjenner et passende signalpeptid og transporterer proteinet ved å anvende cytoplasmisk ATP og elektronbevegende kraft, inn i periplasmaet i en utfoldet tilstand. Etter kløyvning av signalproteinet, foldes det nye proteinet ved hjelp av chaperoner, peptidyl-propyl isomeraser og et tioredoksinkoblet system som katalyserer disulfidbindingsdannelse. Se for eksempel Hynds et al., (1998) J. Biol. Chem. 273:34868-34874; Santini et al. (1998) EMBO J. 17:101-112; Sargent et al., EMBO J. 17:101-112 [TAT].

I motsetning til Sec-systemet tranporterer Tat-systemet store proteiner i fullstendig foldet konformasjon og er mer spesifikk i gjenkjenningen av passende signalsekvenser. Vi har valgt periplasma fordi

(1) det er et foretrukket sete for å uttrykke heterologe rekombinante proteiner,

(2) for industriell anvendelse i kontrollerte betingelser har det mange unødvendige proteiner, og (3) det spiller en rolle i mange unødvendige adapsjons- og kontrollsystemer, hvorav noen viser seg å være skadelige.

Ved å fjerne native proteiner fra periplasmaet antar vi at vi vil være i stand til og sterkt forbedre proteinproduksjonsprosessen. Ekspresjon og sekresjon av proteiner i periplasma er blitt gjennomgått i Hanahan D.J. Mol. Biol,. 1983,166(4): s. 557-80; Hockney, R.C., Trends Biotechnol, 1994,12(11): s. 456-632 ; og Hanning G. et al., Trends Biotechnol. 1998,16(2): s. 54-60.

Det er flere årsaker til at periplasma er et foretrukket sete for proteinproduksjon;

(1) det er mulig å produsere rekombinant protein med en aminoterminal ende som er identisk til det naturlige proteinet, mens i cytoplasma så begynner proteiner alltid med aminosyren metionin; (2) mange proteiner kan foldes korrekt i det periplasmiske rom; (3) de korrekte disulfidbindingene kan dannes i det oksiderende miljøet til periplasmaet; (4) det periplasmiske rommet inneholder mye mindre og færre proteiner enn cytoplamsa, noe som forenkler rensing; (5) det er færre protease enn i cytoplasma, noe som reduserer proteinkutting og tap; (6) uttrykte proteiner kan lett frigjøres ved andre periplasmiske proteiner ved spesifikt å ødelegge den ytre membranen, vesentlig fri for cytoplasmiske proteiner som det er rikelig av.

Det periplasmiske rommet har naturlige enzymsystemer, koblet til cellulært cytoplasmisk metabolisme gjennom den indre membranen, til å foreta disse prosessoppgavene, antagelig fordi dette er den organellen hvor de fleste indre og ytre membranproteinene blir laget. Motsatt har det vist seg å være veldig vanskelig å oppnå korrekt folding av rekombinante proteinkjeder som er uttrykt i det reduserende miljøet i cytoplasma. Ofte aggregerer proteiner i uløselige "inclusion bodies". Mens initiell "inclusion body" rensing kan være enklere, trenger proteiner å gjenoppløses og refoldet, en prosess som er uforutsigbar og vanskelig å kontrollere, og for noen proteiner så lite effektiv at det ikke er mulig å gjøre i industriell skala.

Rekombinante proteiner blir generelt produsert i periplasma ved å uttrykke fusjonsproteiner, hvor de er festet til et signalpeptid, som forårsaker sekresjon inn til det periplasmiske rommet. Der blir signalpeptidet kløyvet av, veldig nøyaktig ved spesifikke signalpeptidaser. Annen generasjon rekombinant humant veksthormon blir produsert ved hjelp av denne fremgangsmåten av Genetech (Nutropin, Full Prescriber Information) og Pharmacia. Ikke alle proteiner kan produseres like vellykket ved hjelp av denne måten og det er bevis for at sekresjonen og postsekresjonsprosesserings-systemene har begrenset kapasitet. Det er også fremdeles proteinkontaminanter man skal handskes med. Særlig er det en advarsel på et slik godtatt produkt, at det inneholder spor av E. coli periplasmiske proteiner som forårsaker produksjonen av antistoffer i noen pasienter. (Gonotropin: Full Prescriber information). Selv om det hevdes at det ikke er et problem i klinikken, må det bli sett på som uønsket. Materialene og fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelsen vil tillate reduksjonen eller elimineringen av dette problem.

Det er behov innen fagfeltet for produksjon av rekombinante proteiner som vil skilles ut i PS. Denne utskilling kan oppnås ved å bruke Sec- eller Tat-systemer eller ethvert annet utskillende patogen som er tilgjengelig i de respektive bakteriene. I ethvert tilfelle vil det passende signalpeptidet blir tilsatt til det rekombinante proteinet. Hvis Sec-systemet skal anvendes, så vil de følgende tilleggseksperimentene være nødvendige. Fordi det er rapporter på at Sec-systemet kan bli mettet med høy effektivitet ekspresjonskonstruksjoner, vil det første settet med eksperimenter, være å utvikle et system med optimal ekspresjonsnivå, av det rekombinante proteinet som på en korrekt måte kan transporteres og foldes i PS.

Rekombinante DNA-konstruksjoner som er nyttige for periplasmisk ekspresjon i det reduserte bakteriegenomet i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatter en første DNA-sekvens som koder for et signalpeptid som er i stand til å styre transporten av et protein til det periplasmiske rommet og som er operativt koblet til minst en andre DNA-sekvens som koder for et ønsket heterologt protein. Signalsekvensen kan være nativ for proteinet som skal uttrykkes. Helst så er proteinet som transporteres inn i det periplasmiske rommet biologisk aktivt. Ekspresjon av den rekombinante DNA-konstruksjonen kan være under kontrollen av en induserbar promoter eller en promoter som blir konstitutivt uttrykt i vertsbakterien. Anvendelsen av induserbare promotere er spesielt fordelaktig når man anvender Sec-systemet, som er kjent for å være metningsbart. For eksempel kan lac-basert promoter/repressor, som er induserbar med det ikke-metaboliserbare galaktosederivatet ff TG anvendes. Slike promotere tillater fininnstilling av ekspresjon og sekresjon gjennom Sec-systemet og optimaliserer dermed periplasmisk ekspresjon.

Det rekombinante proteinet, kan også uttrykkes samtidig med chaperoner/disulfid-bindingsdannende enzymer, for å sikre riktig folding av det rekombinante proteinet. DNA-sekvenser som er nyttige for periplasmisk ekspresjon av rekombinant protein inkluderer, men er ikke begrenset til de som er beskrevet i US patentnr. 5 747 662, 5 578 464, 6 335 178 og 6 022 952. Thomas et al., Mol-Micro, (2001) 39 (1) 47-53; Weiner et al., Cell (1998) 93, 93-101 og Current Protocols in Molecular Biology (1994) 16.6-1-16.6-14 (Copyrighted 2000 av John Wiley et al., and Sons).

I en utførelsesform i den foreliggende oppfinnelsen ble ni kjente og tre putative periplasmiske proteingener vellykket slettet med å konstruere MDS40, uten signifikant å affisere organismens evne til vekst på minimalt medium. (Se Tabell 4 og data under). Disse mutasjonene affiserer et bredt område med funksjoner, inkludert aminosyre opptak, uorganisk metabolisme, cellemembran opprettholdelse, sukkermetabolisme og adhesjon.

Ca. 85 gener er blitt slettet som koder for kjente eller putative membranproteiner, identifisert ved deres signalpeptid sekvenser. Av disse, er 33 involvert i flagellar struktur eller biosyntese; 9 er involvert i fimbrial struktur eller biosyntese; og 13 er involvert i generelle sekretoriske reaksjonsveier. De gjenværende har en rekke kjente eller putative funksjoner i cellemembranene. Mange av disse proteinene tror man prosesseres i det periplasmiske rommet. De er også blitt slettet under konstruksjonen av MDS40, uten signifikant å affisere organismens evne til å gro på minimalt medium.

Ved å søke på signalpeptid-lignende sekvenser i annoterte MG1655 databaser, og kryssrelatere disse med litteraturen, har vi identifisert 181 proteiner, hvor mesteparten av dem antas å være gjenværende periplasmiske proteiner. En rekke av disse proteinene har blitt klassifisert ifølge funksjon til flere grupper som ekskluderer: adhesjon og mobilitet; næringsstoffer og saltopptak, sporelement opptak; miljøføling; forsvar og beskyttelse; og periplasmisk proteinsekresjon og prosessering. Blant genene eller fullstendige startsteder som er blitt eller vil bli strøket er de som koder for sukker og aminosyretransport proteiner, som mest sannsynlig ikke behøves i definert minimalt medium for biofarmasøytisk produksjon.

For å måle effektiviteten av transporten av det rekombinante proteinet inn i PS kan enhver av tre kommersielt tilgjengelige merkelappene: E. coli alkalisk fosfatase, Aequoria, grønt fluorescerende protein (GFP) eller humant veksthormon protein anvendes ifølge fremgangsmåtene beskrevet over. Det humane veksthormon proteinet er på det nåværende tidspunkt mest foretrukket for sluttdemonstrasjonsformål og vil bli anvendt i ELISA og gen chip-baserte målinger av lokaliseringen av det rekombinante proteinet til PS.

Man kan teste konsekvensen av å slette et eller flere gener eller andre DNA-sekvenser fra genomet. Etter at ett eller flere gener eller andre DNA-sekvenser av genomet er blitt slettet kan en for eksempel måle overlevelse og vekstrate av den resulterende bakterie. Selv om de fleste av de ovenfor identifiserte genene eller andre DNA-sekvenser kan slettes uten skadelig effekt med hensikt på å produsere et ønsket produkt, er det mulig at slettingen av et spesifikt gen eller andre DNA-sekvenser, kan ha en uakseptabel konsekvens, slik som celledød eller uakseptabelt nivå av reduksjon i vekstraten. Denne muligheten eksisterer på grunn av at gener har flere funksjoner og interaksjoner mellom biologiske reaksjonsveier. Noen slettinger som er levedyktige i en stamme uten tilleggsslettinger, vil bare være ødeleggende i kombinasjon med andre slettinger. Muligheten eksisterer også på grunn av visse fremgangsmåter som er anvendt for å identifisere slettingskandidater. For eksempel, er en fremgangsmåte som er anvendt for å identifisere slettingskandidater å sammenligne to E. coli stammer og velge gener eller andre DNA-sekvenser som ikke er tilstede i begge stammene. Mens hovedmengden av disse genene og andre DNA-sekvenser mest sannsynlig ikke er funksjonelt essensielle, kan noen av dem være viktige for en unik stamme. En annen fremgangsmåte anvendt for å identifisere delesjonskandidater er å identifisere ikke-transkriberte regioner og muligheten eksisterer for at visse ikke-transkriberte regioner kan være viktig for genomstabilitet.

Konsekvensen av å slette en eller flere gener eller andre DNA-sekvenser som skal testes avhenger av formålet med en anvendelse. Når høy produksjonseffektivitet er hovedbekymringen, noe som er sant for mange anvendelser, kan for eksempel effekten av slettinger på vekstraten og medium forbruksraten være konsekvensen som testes. I dette tilfellet kan konsekvensen som testes også være mer spesifikk som produksjonshastigheten for kvantitet på utbytte per celle av et bestemt produkt. Når eliminering av native protein forurensinger er hovedbekymringen, kan færre native proteiner og lavere native proteinnivåer, eller fraværet av et spesifikt nativ protein være konsekvensen som testes.

Å teste konsekvensen av å slette et gen eller andre DNA-sekvenser er viktig når lite er kjent om genet eller DNA-sekvensen. Selv om det er arbeidskrevende, er dette en annen levedyktig fremgangsmåte for å identifisere slettingskandidater for å lage bakterier med et redusert genom. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig når kandidatene identifisert ved hjelp av andre fremgangsmåter er blitt slettet og tilleggskandidater søkes.

Når konsekvensen av å slette et gen eller annen DNA sekvens har en effekt på levedyktigheten til bakteriene under et sett betingelser, er et alternativ å ikke slette det spesifikke genet eller annen DNA-sekvens, for å bestemme om det er målinger som kan dempe de skadelige effektene. For eksempel hvis sletting av lipopolysakkarid (LPS) gener resulterer i dårlig overlevelse, som en følge av mer porøse cellulære membraner forårsaket av fraværet av det transmembrane domenet i LPS-proteinene fra de cellulære membranene, kan dyrkingsbetingelsene forandres for å tilpasse de mer porøse cellulære membranene, slik at bakteriene som mangler LPS-genene, kan overleve likeså godt som bakteriene som bærer LPS-genene.

Fremgangsmåter for å slette DNA-sekvenser fra bakterielle genomer som er kjent for en vanlig fagperson kan anvendes for å lage en bakterie med et redusert genom. Eksempler på disse fremgangsmåtene kan omfatte de som er beskrevet i Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997), Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27:1555-1557 (1999), Datsenko, K.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 97:6640-6649 (2000) og Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27:4409-4415 (1999). Grunnleggende kan slettingsfremgangsmåter klassifiseres til de som er basert på lineære DNA og de som er basert på selvmordsplasmider. Fremgangsmåtene som er angitt i Myurers, J.P.P. et al, Nucl. Acids Res. 27:1555-1557 (1999) og Datsenko, K.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 97:6640-6649 (2000) er lineære DNA-baserte fremgangsmåter og fremgangsmåtene som er angitt i Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179:4426-4428 (1997) og Posfai, G. et a., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999) er selvmords plasmidbaserte fremgangsmåter. Koob et al; Minimizing the genome of Escherichia coli. Motvation and strategy; Ann. NY Acad. Sei., vol 745,1994, s. 1-3, ISSN 0077-8923 diskuterer metoder for å minimere genomet til Escherichia coli og beskriver en metode hvor ulike gener og regulatoriske systemer som bakterien ikke trenger for normal vekst i en bioreaktor selektivt blir fjernet. På den måten oppnås en godtkarakterisertenkelcelle optimalisert for reaktorvekst. Her beskrives også et to-vektor system for delesjon av genomsegmentene.

Noen kjente fremgangsmåter for å slette DNA-sekvenser fra bakteriegenomer

introduserer fremmed DNA-sekvenser inn i genomet under slettingsprosessen og skaper dermed et potensielt problem med uønsket homolog rekombinasjon, hvis noen av disse fremgangsmåtene anvendes mer enn en gang i en bakterie. For å unngå dette problemet er arrløse slettingsfremgangsmåter å foretrekke. Med arrløs sletting mener vi en DNA-sekvens som er nøyaktig slettet fra genomet uten å lage andre mutasjoner ved

slettingssetene og uten å etterlate noe innsatt DNA i genomet til organismen. På grunn av feil, slik som de som gjøres i PCR-arnplifisering og DNA-reparasjonsprosesser, kan imidlertid av og til en eller to nukleotidforandringer introduseres i arrløse slettinger.

Nedenunder er beskrevet noen nye arrløse slettingsfremgangsmåter, enten lineær DNA-baserte eller selvmordsplasmid baserte. Disse nye fremgangsmåtene er blitt anvendt på E. coli stammer i eksemplene beskrevet under. Det må forstås at de spesifikke vektorene og betingelsene anvendt for E. coli stammene i eksemplene, kan adapteres av en fagperson for anvendelse i andre bakterier. Lignende fremgangsmåter og plasmider kan anvendes for lignende effekt i høyere organismer. I noen tilfeller kan det være mer passende å modifisere en eksisterende produksjonsstamme enn å overføre produksjonen til E. coli stammen med forminsket genom.

Fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen behøver ikke være begrenset til å redusere genomet til bakterier, for eksempel kan fremgangsmåtene anvendes for å slette DNA frabakteriofag slik som Pl, P2, lambda og andre bakteriofager. Slike fremgangsmåter tillater konstruksjonen av bakteriofag genomer, for å forbedre deres nyttige egenskaper og/eller å minske eller eliminere visse egenskaper som ødelegger anvendelsen av slik bakteriofag for en rekke formål. Fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen er på samme måte nyttige for å modifisere plasmider som finnes i bakterier for å eliminere skadelig elementer (for eksempel virulensgener) fra plasmidet og å forbedre andre nyttige egenskaper av plasmidene.

Den velkjente lett tilgjengelige transduserende bakteriofag Pl er blitt som beskrevet over, for å omforme deler av DNA inn i mottager E. coli. Visse gentrekk hos Pl begrenser imidlertid til syvende og sist kapasiteten til å plukke opp og pakke genomet DNA for transduksjon. Spesielt så er pakkesetet (pac) til Pl en GATC-rik region som, når den er metylert ved hjelp av dam metylasen hos Pl, begrenser mengden av genomets DNA inn i fagkappen. I fraværet av dam assosiert metylering på pakkestedet blir pakkingen av DNA imidlertid "slurvet", dvs. den pakker lettere deler av genomets DNA enn det som ville være tilfellet hvis pakkesetet var metylert. Derfor ville det en fordel å konstruere Pl-genomet ved å fjerne dam-genet ved å anvende slettingsfremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen ved dermed å øke evnen til å plukke opp og pakke genomets materiale.

En annen ulempe assosiert ved anvendelsen av Pl transduksjon er at fagen bærer to innsettingssekvenser. En innsettingssekvens IS1 finnes mellom ssb og prt loci i Pl genomet. En annen IS5 er i res genet. Som et resultat av dette er det mulig at når Pl blir anvendt for transduksjon, så ville en eller flere av innsettingssekvensene kunne ende opp ved å hoppe inn i et genomisk locus til organismen. Derfor ville det være en fordel å konstruere Pl-genomet, ved å slette IS-sekvensene ved å anvende fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen, for dermed å forhindre genomisk kontaminering når Pl blir anvendt som en transduktant.

Shigella flexneri med et redusert genom kan også anvendes. Nylig ble den fullstendige genomsekvensen til Shigella flexneri 2a stamme 2457T bestemt. (Den sekvenserte stammen ble redisponert ved the American Type Culture Collection, som tilgangsnummer ATCC 700930). Genomet til S flexneri består av et enkelt sirkulært kromosom på 4 599 354 basepar (bp) med et G+C innhold på 50,9%. Basepar 1 av kromosomet ble fastsatt å korrespondere med basepar en til E. coli K-12 fordi bakteriene viser utstrakt homologi. Genomet ble vist til å ha ca. 4082 forutsatte gener med en gjennomsnittlig størrelse på 873 basepar. S. flexneri genomet fremviser ryggraden og øymosaikk strukturen til E. coli patogenene dog med mye mindre horisontalt overført DNA og mangler 357 gener som er tilstede i E. coli (se Perna et al.,

(2001) Nature, 409:529-533). Organismen er særegen ved sitt store antall innsettingssekvenser, flere genomiske rearrangementer, 12 kryptiske pro fag, 372 pseudogener og 195 Shigella spesifikke gener. Den fullstendige annonserte sekvensen til S. flexneri ble deponert i GenBank med tilgangsnummer AE014073. (Se også "Complete Genome Srquence and Comparative Genomics of Shigella flexneri Serotype 2A strain 24571", Wei et al., innsendt for publikasjon). Det er påfallende å legge merke til at basert på sin DNA-sekvens er Shigella fylogenetisk ikke til å skjelne fra E. coli.

Som det er lett å se fra denne utregning, ved å ha S. flexner- sekveasen for hånd, kan dets genom lett reduseres ved å anvende de fremgangsmåter og genseleksjonsparadigmene diskutert her. En Shigella med redusert genom kan være nyttig for ekspresjonen av heterologe (rekombinante) proteiner eller andre nyttige næringsstoffer for grunner som er diskutert her, med hensyn til E. coli med redusert genom (levende vaksine). En annen anvendelse for Shigella med redusert genom eller for den saks skyld enhver patogen bakterie som er mottagelig for fremgangsmåten for sletting i følge den foreliggende oppfinnelse, er som et verktøy for visingen eller administrasjonen av antigener med det formålet å indusere en immunrespons fra en vert. En slik konstruert Shigella kunne for eksempel ha slettet gener som er ansvarlig for virulens fra organismen, mens opprettholde andre gener slik som de som koder for antigene determinanter, som er tilstrekkelig til å indusere en immunrespons i en vert, fortrinnsvis en mukosal immunrespons i tarmveggen til en vert.

Shigella flexneri er potensielt godt egnet for denne strategi ved at dens virulente faktorer er blittkarakterisertog er lokalisert til et 210-kb "stort virulent (eller invasjons) plasmid" hvis nukleotidsekvens er blitt bestemt og er blitt deponert som GenBank tilgangsnr. AF348706. (Se også Venkatesan et al., Infection of Immunity (mai 2001) 3271-3285). Blant de sannsynlige kandidatene for sletting fra invasjonsplasmidet er cadA-genet som koder for lysindekarboksylase.

Det slettede Shigella invasjonsplasmidet kan introduseres inn i E. coli med redusert genom og dermed tillate effektiv ekspresjon av visse Shigella plasmidgener som er i stand til å gi opphav til en immunrespons i en vert innokulert med E. coli. Invasjonsplasmidet kan også konstrueres slik at skadelige gener slettes fra plasmidet slik som genene som er ansvarlig for ødelegging av vacuole. Foretrukne kandidat gener for fjerning fra invasjonsplasmidet inkluderer en eller flere gener valgt fra gruppen som består av ipaA, ipaB, ipaC, ipaD og virB. Den foreliggende oppfinnelsen tillater også tilsettingen av andre gener til E. coli med redusert genom som invasjonsplasmidet er blitt introdusert inn i, for å optimalisere ekspresjonen av gener fra det introduserte, modifiserte invasive plasmidet.

Den foreliggende oppfinnelsen kan også anvendes i levende vaksiner som omfatter et redusert genom, for eksempel E. coli eller et redusert genom, for eksempel E. coli som har fått introdusert gener, som koder for antigener, som er i stand til å indusere en immunrespons i en vert, som er blitt innokulert med vaksinen. Reduserte genomvaksiner kan være DNA-baserte vaksiner ved at den inneholder et DNA som er kjent for å være i stand til og induserte en ønsket fysiologisk respons i en vert (dvs. immunrespons).

En av hovedfordelene med en organisme som har redusert genom ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er å tilveiebringe en ren, minimal genetisk bakgrunn som DNAet kan introduseres inn i, ikke bare for å tillate ekspresjon av et ønsket molekyl, men den byr også på muligheten til og introdusere tilleggs-DNA inn i den rene bakgrunnen, for å tilveiebringe en kilde av molekyler, som er i stand til å optimalisere ekspresjon av det ønskede produktet.

Fremgangsmåter for sletting

Konstruksjon av et lineært målsøkende DNA

Et eksempel på konstruksjonen av et lineært mål-DNA er som følger: For å lage primer a+b (Fig. 1), ble 20 pmol av primer a blandet med 20 pmol av primer b og PCR ble utført i et totalt volum på 50 ul. Syklusparametere var: 15 x (94°C 40 sek/57° eller lavere [avhengig av graden av overlapp mellom primerne a og b] 40 sek/72°C 15 sek.). Deretter ble 1 ul av dette PCT-produkt ble blandet med 20 pmol av hver av primerne a og c (Figur 1), 50 ng av pSG76-CS templat og en andre runde PCT ble utført i et volum på 2 x 50 ul. Syklusparameterne var: 28 x (94°C 40 sek/57°C 40 sek/72°C 80 sek.). Det resulterende PCR-lagde lineære DNA-fragmentet ble renset ved hjelp av Promega Wizard PCT rensingskitt, og suspendert i 20 ul vann. Eliminering av templatplasmidet (ved for eksempel Dpnl-kutting) er ikke nødvendig. pSG76-CS tjener som et templatplasmid for å lage lineære målrettede fragmenter ved hjelp av PCT. Det inneholder kloramfenikol resistens (CM<R>) genet og to I-Scel-seter, og ble skaffet til veie ved hjelp av den PCT-styrte innsetingen av et andre I-Scel-gjenkjenningssete inn i pSG76-C nedstrøms for Noti setet. De to I-Scel-stene er i motsatt orientering.

Ny lineær DNA- basert arrløs slettingsfremgangsmåte I

Den nye DNA-baserte arrløse slettingsfremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen kan best forstås når den følgende beskrivelsen leses i lys av Figur 2. Generelt så involverer fremgangsmåten å erstatte et segment av genomet, markert for sletting med en artifisiell DNA-sekvens. Den artifisielle sekvensen inneholder et eller flere gjenkjenningsseter for en sekvensspesifikk nuklease slik som I-Scel som kutter ved en sekvens som nativt ikke finnes noen steder i E. coli K-12 genomet. Nøyaktig innsetting av det lineære DNA-molekylet inn i genomet ble oppnådd ved hjelp av homolog rekombinasjon hjulpet av et system som kan øke frekvensen av homolog rekombinasjon. Når den sekvensspesifikke nukleasen blir introdusert inn i bakterien, kutter den det genomiske DNA ved det unike gjenkjenningssetet eller setene, og bare de bakteriene hvor en homolog rekombinasjonsbegivenhet har funnet sted vil overleve.

Spesifikt i henhold til Figur 2 så blir plasmidet pSG76-CS anvendt som et templat for å syntetisere det artifisielle DNA-innskuddet. Den artifisielle innsatte sekvensen utvider seg mellom sekvensene som er kalt A, B og C i Figur 2. CR indikerer et gen for antibiotikaresistens. Det innsatte DNA blir PCR-amplifisert fra plasmidet og elektroporert inn i E. coli verten. Innskuddet ble konstruert slik at sekvensene A og B motsvarer sekvensene i genomet hos verten som strekker seg over den foreslåtte slettingen. Sekvens C i innskuddet svarer til en sekvens i vertsgenomet rett på innsiden av sekvens B i vertsgenomet. Deretter blir bakterien selektert for antibiotikaresistens, en seleksjon som bare vil overleves av de bakteriene hvor der har funnet sted en homolog rekombinasjonsbegivenhet hvor det artifisielle DNA ble satt inn i det bakterielle genomet. Denne rekombinasjonsbegivenheten finner sted mellom sekvensparene A og C. Den innsatte DNA-sekvensen inkluderer også en sekvens B, som nå er posisjonert i den ene enden av innskuddet, som er laget slik at det er homologt til en sekvens i genomet rett på utsiden av den andre enden av innskuddet, som indikert i Figur2. Deretter, etter vekst av bakteriene, blir bakteriene transformert med plasmid pSTKST som uttrykker den I-Scel sekvensspesifikke nukleasen. I-Scel-enzymet kutter genomet til bakteriene og bare de individene hvor en rekombinasjonsbegivenhet finner sted vil overleve. 10-100% av de som overlever er B til B rekombinasjonsoverlevende, noe som kan identifiseres ved hjelp av et screeningstrinn. B til B rekombinasjonsbegivenheten sletter hele det innsatte DNA fra genomet og etterlater ingenting utenom den native sekvensen som omgir slettingen.

For å repetere, så involverer det første trinnet i fremgangsmåten å tilveiebringe et lineært DNA-molekyl i en bakterie. Det lineære DNA-molekylet inneholder en artifisiell lineær DNA-sekvens som har de følgende trekk: en ende av den lineære DNA-sekvensen er en sekvens som er identisk til en genomsekvens på den venstre siden av den genomiske regionen som skal slettes; den andre enden av det lineære DNA-molekylet er en sekvens som er identisk til en genomsekvens innen den genomiske regionen som skal slettes; mellom de to endene av det lineære DNA er det et gjenkjenningssete som ikke er tilstedet i genomet til bakteriestammen og et antibiotika seleksjonsgen. Den artifisielle DNA-sekvensen kan lages ved å anvende polymerase kjedereaksjon (PCR) eller ved direkte DNA-syntese. Et PCR-templat for dette formålet inneholder det unike gjenkjenningssetet og de genomiske DNA-sekvensene på begge endene av den artifisielle lineære DNA-sekvensen er del av primerne som anvendes i PCR-reaksjonen. PCR-templatet kan tilveiebringes av et plasmid. Et eksempel på et plasmid som kan anvendes som et templat er pSG76-C (GenBank aksesjonsnr. Y09893) som er beskrevet i Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997). pSG76-CS (GenBank aksesjonsnr. AF402780) som er utledet fra pSG76-C kan også anvendes. pSG76-CS inneholder kloramfenikolresistens (Cm<R>)-genet og to I-Scil-seter, og ble skaffet til veie ved hjelp av den PCR-styrte innsettingen av et andre I-Scel-gjenkjenningssete inn i pSG76-C, nedstrøms for Noti setet. De to I-Scel-setene er i motsatt orientering.

En artifisiell eller konstruert DNA-sekvens kan tilveiebringes av en bakterie ved direkte å introdusere det lineære DNA-molekylet inn i bakterien ved å anvende enhver fremgangsmåte som er kjent i fagfeltet slik som elektroporering. I dette tilfellet blir en seleksjonsmarkør slik som et antibiotikaresistensgen konstruert inn i den artifisielle DNA-sekvensen med det formål og senere selektere kolonier som inneholder den innsatte DNA-sekvensen. Alternativt kan et lineært DNA-molekyl tilveiebringes i en bakterie ved å transformere bakterien med en vektor som inneholder den artifisielle lineære DNA-sekvensen og å lage et lineært DNA-molekyl på innsiden av bakterien gjennom kutting med restriksjonsenzym. Restriksjonsenzymet som anvendes, bør bare kutte vektoren, men ikke det bakterielle genomet. I dette tilfellet må ikke den artifisielle lineære DNA-sekvensen være en seleksjonsmarkør på grunn av den høyere transformasjonseffektiviteten til en vektor, slik at en bakterie med det innsatte lineære DNA senere kan screenes ved hjelp av PCR direkte.

Det andre trinnet i den arrløse slettingsfremgangsmåten involverer å erstatte en genomisk region ved å sette inn det artifisielle DNA-molekylet. De bakterielle cellene blir konstruert slik at de inneholder et system som øker frekvensen av homolog rekombinering. Et eksempel på et slikt system er Red rekombinasesystemet. Systemet kan introduseres inn i bakteriecellene ved hjelp av en vektor. Systemet hjelper det lineære DNA-molekylet å erstatte en genomisk region som inneholder slettingsmålet. Som beskrevet i eksemplene under, er en vektor som bærer et homologt rekombinasjonssystem som kan anvendes i E. coli pBADapy som er beskrevet i Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27:1555-1557 (1999). Et annet plasmid pKD46 beskrevet i Datsenko, K.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 97:6640-6649 (2000) kan også anvendes. Andre plasmider som kan anvendes inkluderer pGPXX og pJGXX. pGXX er utledet fra pBADapy ved å erstatte startpunktet for replikasjon i pBADaPy med pSClOl startstedet for replikasjon. pJGXX er et pSClOl-plasmid som koder for Red-funksjonene fra fag 933W under kontroll av tet-promoter.

Det tredje trinnet i den arrløse slettingsfremgangsmåten, involverer fjerning av den innsatte DNA-sekvensen. En ekspresjonsvektor for en sekvensspesifikk nuklease slik som I-Scel som gjenkjenner det unike gjenkjenningssetet for den innsatte DNA-sekvensen blir introdusert inn i bakteriene. Den sekvensspesifikke nukleasen blir så uttrykt og det bakterielle genomet blir kuttet. Etter kuttingen, kan bare de cellene hvor homolog rekombinasjon finner sted som resulterer i en sletning av det innsatte binære DNA-molekylet overleve. Dermed blir bakterier med en mål DNA-sekvens som er slettet fra genomet skaffet tilveie. Eksempler på sekvensspesifikke nuklease ekspresjonssektorer som kan anvendes i E. coli inkluderer pKSUCl, pKSUC5, pSTKST, pSTAST, pKTSHa, pKTSHc, pBADScel og pBADSce2. Den sekvensspesifikke nukleasen som bæres av disse vektorene er I-Scel. pKSUCl, pKSUC5, pSTKST og pSTAST er beskrevet under i eksemplene.

Fremgangsmåten som er beskrevet over kan anvendes gjentatte ganger i en bakterie for å lage en rekke slettinger. Når ekspresjonsvektoren for det homologe rekombinasjonssystemet og ekspresjonsvektoren for den unike sekvensspesifikke nukleasen ikke er kompatibel med hverandre, slik som i tilfellet for pBADaPy og pKSUCl må transformasjonen av de to vektorene utføres for hver slettingssykel. Transformasjon av de to vektorene kan unngås i tilleggsslettingssykluser når to kompatible plasmider slik som pBADapy og pSTKST eller pKD46 og pKSUC5 blir anvendt. Et eksempel på å anvende to av disse vektorene som er kompatible med hverandre er beskrevet i eksemplene under.

Den ovenfor nevnte arrløse slettingsfremgangsmåten kan modifiseres for å lage en rekke slettinger i et bakteriegenom mer effektivt (et eksempel av dette er Prosedyre 4 i Eksemplene under). Det første trinnet i den modifiserte fremgangsmåten involverer å lage innsettinger av et lineært DNA-molekyl individuelt i bakterieceller, helst villtype bakterieceller, på en parallell måte som resulterer i et sett med stammer, som hver bærer en enkelt innsetting. Dette trinnet kan utføres som beskrevet over. Det andre trinnet i den modifiserte fremgangsmåten involverer etterpå følgende overføring av individuelle innsettinger inn i målcellen, hvis genom skal reduseres. Pl transduksjon er et eksempel på fremgangsmåtene som kan anvendes for å overføre innsettinger. Det tredje trinnet i den modifiserte fremgangsmåten, involverer rekombinasjonsfjeming av den innsatte sekvensen som kan utføres som beskrevet over.

Ny DNA- basert arrløs slettingsmetode II

I denne nye lineære DNA-baserte fremgangsmåten blir to DNA-sekvenser, en som er identisk til en sekvens som flankerer en ende av en bakterielt genomisk region som skal slettes og den andre som er identisk med en sekvens som flankerer den andre enden av den bakterielt genomiske regionen, og orientert på samme måten, konstruert inn i en plasmidvektor. Vektoren blir her kalt målvektoren. De to DNA-sekvensene er lokalisert på siden av hverandre og målvektoren. Minst et gjenkjenningssete for et enzym som bare vil kutte målvektoren, men ikke det bakterielle genomet ble også konstruert inn i målvektoren ved en lokalisering som er på utsiden av de to DNA-sekvensene. Gjenkjenningssetet kan være et som er for gensekvensspesifikk nuklease slik om I-Scel. Gjenkjenningssetet kan også være for et metyleringssensitivt restriksjonsenzym som bare kutter en umetylert sekvens. Fordi gjenkjenningssetet, hvis det er noen, på det bakterielle genomet er metylert, kan restriksjonsenzymet bare kutte målvektoren. Målvektoren blir transformert inn i en bakterie og et lineært DNA-molekyl blir laget på innsiden av bakterien ved å uttrykke enzymet som gjenkjenner og kutter gjenkjenningsstedet på målvektoren i bakterien. Deretter blir et system som kan øke homolog rekombinasjon aktivert på innsiden av bakterien for å indusere homolog rekombinasjon mellom de homologe sekvensene av det lineære DNA og det bakterielle genomet som flankerer regionen som skal slettes. En bakterie som har fått en målrettet genomisk region slettet, kan skaffes tilveie som et resultat av den ovenfor nevnte homologe rekombinasjonen.

Denne nye lineære DNA-baserte fremgangsmåten kan også anvendes for å erstatte en region i et bakterielt genom med ønsket DNA-sekvens. I dette tilfellet blir en ønsket DNA-sekvens som kan gjennomgå homolog rekombinasjon med det bakterielle genomet for å erstatte en region av genomet, konstruert inn i målvektoren. Alle andre aspekt er det samme som beskrevet over for å slette en region av det bakterielle genomet.

Uansett om fremgangsmåten blir anvendt for å slette eller erstatte en målregion i det bakterielle genomet, er det ikke nødvendig med et markørgen for å selektere inkorporering av DNA som bæres på målvektoren inn i det bakterielle genomet på grunn av den høye inkorporeringseffektiviteten. Ved enkel screening av 30-100 kolonier ved hjelp av PCR, tillater vanligvis identifikasjonen av en klon med ønsket modifikasjon i det bakterielle genomet.

Som et spesifikt eksempel illustrerer Figurene 3 og 4 anvendelsen av denne fremgangsmåten for å introdusere et Amber stopp kodon i midten av et gen. Som et første trinn blir et DNA-fragment med de ønskede modifikasjonene lokalisert nær midten av genet eller den kromosomale regionen produsert. Et sekvensspesifikt nuklease I-Scel gjenkjenningssete blir introdusert på en side av DNA-fragmentet. Dette kan lett utføres ved å inkludere sekvensen i den 5'-enden av PCR-primere som anvendes for og omformere DNA-fragmentet. Lengre DNA-fragmenter (500-5 000 nukleotider) virker generelt best.

DNA-fragmentet ble klonet inn i en fler-kopi målplasmid vektor slik som pUC19 (GenBank aksesjonsnr. M77789). Fordi denne målvektor blir anvendt sammen med en mutagenesevektor som beskrevet over, blir målvektoren konstruert slik at den er kompatibel med pl5A opprinnelsesplasmider (pACYC184-utledet (GenBank aksesjonsnr. X06403)) og har en medikamentresistensmarkør som er forskjellig fra kloramfenikol. Disse restriksjonene kan lett unngås ved å anvende et alternativt mutageneseplasmid.

Som illustrert i Figur 4 inneholder mutageneseplasmidet som anvendes i dette eksempelet de sekvensspesifikke nukleaser I-Scel og lambda red genene exo, beta og gam under kontrollen av P-BAD promoteren. Plasmidet inneholder også pl5Aori og kloramfenikol resistensgen.

Mål og mutagenseplasmidene ble transformert inn i en recA positiv E. coli. Bakteriene ble selektert for resistens mot kloramfenikol og resistensen som finnes på målplasmidet. En enkelt koloni blir så plukket og dyrket ved 37°C i ca. 7 timer i 1 ml med rikt definert medium (Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119:736-47) som inneholder 0,2% arabinose og kloramfenikol. En rekke fortynninger (for eksempel 1:1 000,1:10 000 osv.) av kulturene ble så platet ut på ikke-selektivt medium slik som LB. Deretter ble koloniene screenet for ønskede mutasjoner. Hvis en vekst fenotype er kjent, kan screeningen gjøres ved å "patche" på passende media. Hvis ikke blir screeningen gjort med koloni PCR etterfulgt av restriksjonskutting og elektroforese eller ved hjelp av sekvensering.

Selvmords plasmidbasertfremgangsmåte

Den selvmords plasmidbaserte fremgangsmåten beskrevet her, kan anvendes både for arrløs gensletting og generstatning. Grunnelementet i fremgangsmåten involverer en plasmidvektor som kalles interlock plasmid som inneholder et antibiotika resistensgen og et startsted for replikasjon under kontroll av en promoter. Interlock plasmidet inneholder også et eller flere stedet for et DNA-innskudd kan settes inn. Når fremgangsmåten anvendes for arrløs delesjon, inkluderer DNA-innskuddet to DNA-sekvenser som er lokalisert rett ved siden av hverandre, orientert på samme måte, hvor den ene er identisk til en sekvens som flankerer en ende av en bakteriell genomisk region som skal slettes og den andre er identisk til en sekvens som flankerer den andre enden av den bakterielle genomregionen. Når fremgangsmåten anvendes for generstatning, inkluderer DNA-inskuddet en sekvens, som vil erstatte et segment i et bakterielt genom. Når promoteren som kontrollerer startstedet for replikasjon blir skrudd av, blir replikasjonen av plasmidet slått av og antibiotika presset kan anvendes for å selektere for kromosomale integreringer på stedet for den flankerende regionen. Etter kromosomal integrasjon på stedet for den flankerende regionen, kan promoteren som kontrollerer startstedet for replikasjonen fra plasmidet skrues på og de eneste bakteriene som kan overleve er de hvor en rekombinasjonsbegivenhet har funnet sted for å eliminere nevnte startsted for replikasjon, dets promoter eller begge to. Når DNA-innskuddet har lageet arrløs sletting, vil rekombinasjon mellom det integrerte innskuddet og den korresponderende regionen i genomet resultere i bakterier som enten har den ønskede arrløse slettingen eller det samme genomet før integreringen. Når DNA-innskuddet utfører gen erstatning vil rekombinasjonen resultere i bakterier som enten har den ønskede erstatningen eller det samme genomet som før integrasjon. En screeningstrinn kan så utføres for å identifisere de bakteriene som har de ønskede modifikasjonene i genomet.

En variasjon av den ovenfor nevnte fremgangsmåten involverer det samme interlock plasmidet unntatt at plasmidet også inneholder et sekvensspesifikt nuklease gjenkjenningssete som er fraværende i det bakterielle genomet. Etter kromosomal integrering, i stedet for å aktivere startstedet for replikasjon kontrollpromoter for å selektere for rekombinasjonsbegivenheter, blir bakterien konstruert slik at den utgjør den sekvensspesifikke nukleasen for å kutte det bakterielle genomet og selektere for rekombinasjonsbegivenheter.

Den selvmordsplasmid-baserte fremgangsmåten kan også anvendes gjentatte ganger på en lignende måte som de nye lineære DNA-baserte fremgangsmåtene beskrevet over, for å lage en rekke slettinger på et bakterielt genom.

Figur 6 viser plasmidutførelsesformer som kan anvendes i den selvmordsplasmid-baserte fremgangsmåten. pILl er et interlock plasmid og pBAD-Sce-1 er et plasmid for ekspresjon av en sekvensspesifikk nuklease I-Scel. pIL4 er en kombinasjon fra begge. Tet-promoteren som anvendes i pILl og pIL4 er tett regulert og har dermed fordeler over andre kontrollmekanismer, slik som et temperatursensitivt element, som har mer lekkasje. Et eksempel på anvendelse av pIL4 for generstatning er vist i Figur 5A-C for å illustrere den selvmordsplasmid-baserte fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelsen. Figur 5A viser at innsettingen av et DNA-innskudd inn i pIL4 og integreringen av pIL4 inn i det bakterielle genomet. Med varmeaktivert klorotetracyklin (CTC), et tet-repressoren inaktiv, O og P promoteren er funksjonell og plasmidet replikerer. Etter å ha fjernet CTC, binder tet-repressoren promoteren for O og P promoteren og replikasjonen er blokkert. Kloramfenikol resistens kan anvendes for å selektere integrantene. Figur 5B viser innsettingen ved å anvende induksjonen av det ektopiske startstedet for å selektere for en homolog rekombinasjon og to mulige resultater av den homologe rekombinasjonen. Figur 5C viser den alternative måten for å selektere for homolog rekombinasjon og de to mulige resultatene av rekombinasjonen. Denne alternative måten involverer å indusere I-Scel ekspresjon for å lage dobbeltrådet brudd.

To spesifikke utførelsesformer av dens selvmordsplasmid baserte fremgangsmåten er beskrevet under som protokoll 1 og protokoll 2. Både pILl og pIL4 kan anvendes for protokoll 1, og pILl i kombinasjon med pBAD-Sce-1 kan anvendes for protokoll 2. En fagperson kan også adaptere protokoll 2 for anvendelse av pIL4 alene.

Protokoll 1 ( Motseleksion med lambda startsted1) :

1. Lag den ønskede genomiske modifikasjonen som et lineært DNA-fragment. I det tilfellet man skal lage en Amber mutant, kan modifikasjonen gjøres ved hjelp av megaprimer PCR. For å lage en sletting i genomet, bør en fusjon av de ønskede endepunktene av slettingen anvendes. Endene av DNA-fragmentet bør fosforyleres for kloning. 2. Lag et blunt kloningssete ved å kutte pIL4-vektoren (Figurene 5 A og 6) med restriksjonsenzymet Srfl. Defosforyler vektoren.

3. Utfør en blunt ligering av den ønskede modifikasjonen og pIL4-vektoren.

4. (Legg merke til: Dette trinnet kan potensielt unnværes i høy kapasitets implementering.) Transformer ligeringen inn i en kloningsstamme av E. coli (slik som JS5). Dyrk transformasjonen i 1 time i LB + 1 ug/ml cTc (cTc - klortetracyklin er friskt autoklavert i LB-medium. En stock på 100 ug/ml blir autoklavert i 20 minutter og deretter lagret i mørket ved 4°C. Den kan anvendes i opp til 5 dager. Alternativt kan en løsning på 2 ng/ml av anhydrotetracyklin substitueres). Plat så ut på LB + kloramfenikol (Cam 25 ug/ml) + cTc (1 ug/ml) og dyrk over natt ved 37°C. Dyrk koloniene i ekvivalent medium og lag plasmid miniprep DNA. Analyser ved hjelp av gel elektroforese og velg med en klon med et innskudd. 5. Transformer det bekreftede plasmidet inn i en recA positiv stamme av E. coli (slik som MG1655). Dyrk i 1 time i LB + 1 ug/ml cTc. Plat ut en del av det dyrkede på plater som inneholder Cam og 1 ug/ml cTc. Dyrk over natt ved 37°C. 6. Plukk en koloni inn i 1 ml LB og plat 10 ul på en Cam plate. Dyrk over natt ved 37°C. 7. Stryk en koloni på en Cam plate for å være sikker på at hver celle som er tilstede inneholder det integrerte plasmidet. Dyrk over natt ved 37°C. 8. Plukk en koloni i 1 ml LB og plat 100 ul av en 1:100 fortynning på plater som inneholder 5 ug/ml cTc. Dyrk over natt ved 37°C. 9. (Screen for mutant) Bare en del av de motselekterte koloniene vil inneholde den ønskede modifikasjonen og de andre vil være tilbakevendt til villtypen. Delen av mutanter som tilbakevender vil avhenge av lokaliseringen av modifikasjonen i det klonede fragmentet. Noen former for screening må utføres for å identifisere den ønskede mutanten. For produksjonen av Amber mutanter kan genet det er snakk om omformeres ved hjelp av PCR og kuttes med Bfal restriksjonsenzym (Bfal kutter Amber kodoner som etterfølges av en "C").

Protokoll 2 ( Høv kapasitet motseleksion med LSceD:

1 -4 Samme som protokoll 1.

5. Kotransformert interlock plasmidet som bærer innskuddet og pBAD-Scel inn i en recA positiv stamme av E. coli (slik som MG1655). Dyrk i 1 time i LB + 1 ug/ml cTc. (Alternativt kan interlock plasmidet som bærer innskuddet transformeres alene inn i kompetente celler som allerede bærer pBAD-Scel). 6. Tilsett kloramfenikol til 25 ug/ml og kanamycin til 50 ug/ml. Dyrk i 1-2 timer ved 37°C med risting. 7. Sentrifuger ned cellene i en mikrosentrifuge i 30 sekunder. Fjern medium supernatanten. 8. (Integreringstrinn) Resuspender cellene i 1 ml LB + kloramfenikol (25 ug/ml) + kanamycin (50 ug/ml) + glukose (0,2%) og dyrk over natten ved 37°C, risting. 9. Fortynn over natt kulturen 1:10 000 i det samme mediumet og dyrk i enda 16-24 timer ved 37°C. 10. (Motseleksjonstrinn). Fortynn 10 (il av kulturen i 1 ml 1 x M9 minimale salter (for å minimalisere veksthastighet). Del dette i to rør som hver er 0,5 ml. Tilsett arabinose til 0,2% til det ene og til det andre tilsett glukose til 0,2% (dette tjener som en negativ kontroll). Dyrk 1-2 timer ved 37°C med risting. 11. Plat ut 10 ul av arabinoserøret på LB + kanamycin (50 ug/ml) + arabinose (0,2%) og 10 ul av glukoserøret på LB + kloramfenikol (25 ug/ml) + kanamycin (50 ug/ml) + glukose (0,2%). Dyrk over natt ved 37°C. 12. (Screening for mutant) Utfør trinn 9 i den primære protokollen.

EKSEMPLER

Plasmider

Plasmidet som anvendes for PCR-konstruksjon av den artifisielle innsatte DNA-sekvensen ble kalt pSG76-CS (GenBank aksesjonsnr. AF402780) som ble utledet fra pSG76-C (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) ved å sette inn et andre I-Scel-sete. Det andre I-Scel setet ble skaffet tilveie ved hjelp av PCR-styrt innsetting av et andre I-Scel gjenkjenningssete inn i pSG76-C nedstrøms for Noti setet. De to I-Scel setene er i motsatt orientering.

pBADaPy plasmidet ble anvendt for å øke rekombinasjonen av lineære DNA-fragmenter inn i genomet. Dette plasmidet ble beskrevet i Muyrers, J.P.P. et al., Nucl. Acids Res. 27:1555-1557 (1999).

PKSUCl plasmidet (GenBank aksesjonsnr. AF402779) for å uttrykke I-Scel ble utledet fra pSG76-K (Posfai, G. et al, J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) og pUC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)). Xbal-Notl fragmentet (bærer Kan-genet; Notl-enden ble buttet ved hjelp av Klenow polymerase) av pSG76-K ble ligert til Xbal-Dral fragmentet (bærer I-Scel genet og pUC ori) av pUC19RP12.

pKSUC5 plasmidet for tetracyklin-regulert ekspresjon av I-Scel ble utledet fra pFT-K (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) og pKSUCl. Det store Xbal-Ncol fragmentet fra pKSUCl ble ligert til Xbal-Ncol fragmentet av pFT-K som bærer tet-repressoren.

PKD46 plasmidet var å øke rekombinasjon av lineære DNA-fragmenter inn i genomet ble beskrevet i Datsenko, K.A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 97: 6640-6649 (2000).

Plasmidet pSTKST (GenBank aksesjonsnr. AF406953) er et lavt kopiantall Kan<R>plasmid for klortetracyklin-regulert ekspresjon av I-Scel avledet fra pFT-K (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) ogpYC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)), Xbal-Pstl fragmentet fra pUC19RP12 som bærer I-Scel genet ble ligert til det store Xbal-Pstl fragmentet av pFT-K. Dette plasmidet uttrykker I-Scel når det induseres av klortetracyklin. Replikasjon av plasmidet er temperatursensitivt (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)).

Plasmidet pSTAST, et lavt kopiantall Ap<R>plasmid for klortetracyklin-regulert ekspresjon av I-Scel ble utledet fra pFT-A (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)) og pUC19RP12 (Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415

(1999)). Xbal-Pstl fragmentet fra pUC19RP12 som bærer I-Scel genet, ble ligert til det store Xbal-Pstl fragmentet fra pFT-A. Dette plasmidet uttrykker I-Scei når det induseres av klortetracyklin. Replikasjon av plasmidet er temperatur-sensitivt (Posfai, G. et al., J. Bacteriol. 179: 4426-4428 (1997)).

Slettingsprosedyre 1

Denne beskriver prosessen som ble anvendt mange ganger etter hverandre for å lage slettinger fra genomet av E. coli K-12. Denne prosedyren er en arrløs slettings fremgangsmåte. Prosedyren starter med konstruksjonen av et lineært målfragment ved hjelp av PCR. Dette ble gjort ved å blande 20 pmol av primer A med 20 pmol primer B, og utføre PCR i et totalt volum på 50 ul. Cyklusparameterne som ble anvendt var 15 x (94°C 40 sek/57°C eller lavere (avhengig av overlapp mellom A og B) 40 sek/72°C 15 sek.). 1 ul av PCR-miksen over ble tatt, tilsett til 20 pmol av hver av primerne A og C, tilsatt 50 ng pSG76-CS og PCR ble utført i et volum på 2 x 50 fil (anvendt 50 ul rør, og to rør er kombinert for å ha mer DNA). Syklusparameterne som ble anvendt var 28 x (94°C 40 sek.(57°C 40 sek/72°C 80 sek.). For å rense PCR-miksen fra det ovennevnte trinnet ble Promega Wizard PCR rensingskitt anvendt. Det resulterende DNA-fragmentet ble suspendert i 20 ul vann.

Deretter var det erstatning av en genomisk region ved å sette inn det artifisielle DNA-fragmentet. Dette ble gjort ved å ta målcellen som bærer pBADaPy og lage elektrokompetente celler som beskrevet (Posfai, G. et a., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999)), unntatt for at 0,1% arabinose ble tilsatt til kulturen 0,25 -1 time før høsting av cellene. 4 ul DNA-fragmenter (100-200 ng) ble elektroporert inn i 40 ul elektrokompetente celler. Cellene ble platet på Cam plater (25 ug cam/ml) og innkubert ved 37°C. Det vanlige resultatet var å få en total på 10 til flere hunder kolonier etter overnatt inkubasjon. Noen få kolonier ble sjekket for korrekt seteinnsetting av fragmentet ved hjelp av PCR ved å anvende primerne D og E.

Deretter var det slettingen av de innsatte sekvensene. Dette ble gjort ved å lage kompetente celler utledet fra en valgt koloni fra over ved hjelp av CaCl2

fremgangsmåten (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold P Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Plasmidet pKSUCl (~100 ng) ble transformert inn I cellene ved hjelp av standard prosedyrer (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY (1989)). Cellene ble platet på Kan-plater og innkubert ved 37°C (pKSUCl og pBADaPy er inkompatible, dermed eliminerer seleksjon på Kan pBADaPy fra cellene). Koloniene ble sjekket for korrekt sletting ved hjelp av PCR ved å anvende primerne D og E. En koloni ble valgt som bærer den korrekte slettingen. Ved dette punktet var cellene pKSUCl. Det neste trinnet er å slette dette plasmidet.

Denne sletting blir gjort gjennom erstattingen av pKSUC2 med pBADaPy. En koloni fra det tidligere trinnet ble valgt, dyrket i LB ved 37°C under ikke-selektive betingelser, reinnokulering av cellene i friskt medium 2-3 timer. Kompetente celler ble laget for enten kjemisk transformasjon eller elektroporering. Plasmidet pBADctpy (100-200 ng) ble transformert inn i de kompetente cellene som plater på Amp plater. En koloni som var Kan-sensitiv/Amp-resistent ble valgt ved å plukke hundre kolonier med tannpirker på Kan og Amp plater.

Den valgte kolonien kan anvendes i en neste runde med sletting ved å anvende et nytt målfragment og å repetere trinnet over. Hvis ingen flere slettinger er nødvendige, vil dyrking av cellene under ikke-selektive betingelser (ingen Amp tilsatt) resultere i det spontane tapet av pBADcipy fra en stor fraksjon av cellene.

Slettingsprosedyre 2

Denne prosedyren er lignende prosedyre 1, men pKSUCl er erstattet med pSTKST. Dette plasmiet er kompatibelt med pBADaPy og har et temperatursensitivt replikon, og ekspresjonen av I-Scei krever induksjon ved klortetracyklin (CTC). Fordelen e rat elimineringen av pSTKST fra cellen lett utføres ved å dyrke kulturen ved 42°C.

Konstruksjonen av et lineært målfragment ved hjelp av PCR og erstatting av en genomisk region ved å sette inn fragmentet ble gjort som beskrevet i Prosedyre 1.

For å slette de innsatte sekvensene blir kompetente celler laget fra en kultur utledet fra en valgt koloni som innehar den rette innsettingen. Cellene blir transformert med pSTKST, platet på Kan+Cam plater og innkubert ved 30°C. En koloni fra denne platen blir innokulert i 10 ml Lb+Kan supplementert med varmebehandlet induserer CTC (25 ug/ml sluttkonsentrasjon) og dyrket ved 30°C i 24 timer. Dette trinnet tjener som induksjon for ekspresjonen av I-Scel. Fortynninger av kulturen blir så platet på LB+Kan plater og innkubert over natt ved 30°C. 6-12 kolonier ble sjekket for korrekt sletting ved hjelp av PCR ved å anvende primerne D og E. En koloni ble valgt som bærer den korrekte slettingen.

For å eliminere hjelpeplasmidene fra cellen, blir kulturen dyrket ved 42°C i LB (ingen antibiotika tilsatt).

Prosedyre 3

Fordi pBADapy og pSTKST bærer kompatible replikon er gjentatte transformeringer av plasmidene ikke nødvendige når etterfølgende slettinger blir gjort i den samme verten. De to plasmidene blir opprettholdt i vertscellen gjennom etterfølgende slettingskonstruksjoner ved antibiotika seleksjon (Kan+Amp). Rekombinase og spesifikke nukleasefunksjoner blir indusert bare når det er nødvendig. Fordi replikasjon av pSTKST er temperatursensitiv, må cellene dyrkes ved 30°C.

Prosedyren er identisk med prosedyren 2, unntatt at pBADaPy og pSTKST blir transformert inn i cellen bare en gang, og inntil opprettholdelse av begge plasmidene i cellene er ønsket, dyrkes kulturen ved 30°C og Amp+Kan er inkludert i mediet. Bemerk: Noen ganger erfarte vi at det var vanskelig å dyrke cellene ved 30°C i nærværet av to (Amp+Kan) eller tre (Amp+Kan+Cam) antibiotika.

Prosedyre 4

Dette er den foretrukne fremgangsmåten når flere etterfølgende slettinger skal gjøres i samme cellen. Innsettinger (rekombinasjon av lineære fragmenter inn i genomet til en vertscelle som bærer pB ADaPy) ble gjort i parallell, og lager en rekke rekombinante celler som hver bærer et enkelt innskudd. Disse innskuddene blir så overført en etter en ved Pl transduksjon inn i cellen som bærer pSTKST og som innehar alle de tidligere slettingene. Fjerning av alle fremmede sekvenser ble gjort i sluttvert ved å indusere pSTKST. Sammenlignet med de tidligere fremgangsmåtene er hovedforskjellen at innsettingstrinnet og fjerning av de innsatte sekvensene ble gjort i separate celler. Fordi innsettingene ble gjort i parallell, er konstruksjonen av etterfølgende slettinger vanskeligere. En annen forskjell er at cellene bare ble transformert av plasmidene ved begynnelsen av den første slettingskonstruksjonen.

Teknisk så er prosedyren identisk med Prosedyre 2, unntatt at individuelle innsettinger blir overført ved hjelp av Pl transduksjon til den slettede stammen som allerede innehar pSTKST. Etter hver Pl transduksjonstrinn blir I-Scel ekspresjon indusert for å fjerne de innsatte sekvensene.

Resultater

Tolv etterfølgende genomslettinger er blitt gjort fra E. coli stammen K-12 MG1655. De tolv slettede regionene ble valgt for sletting, delvis som et resultat av sammenligning av det genomiske DNA-sekvensene til E. coli stammen 0157:H7 EDL933 og stamme K-12 MG1655. Slettingene er opplistet i Tabell 1 under. Sekvensnummereringen er tatt fra den publiserte K-12 sekvensen.

Den første slettingen MDI ble gjort ved å anvende fremgangsmåten som er beskrevet i Posfai, G. et al., Nucl. Acids Res. 27: 4409-4415 (1999). Anvendingen av denne fremgangsmåten for å lage MDI sletting etterlot en 114-bp pSG76-CS vektorsekvens, inkludert et FRT-sete, i kromosomet ved slettingssete. MD2 til MD6 slettingene ble gjort ved å anvende Prosedyre 1 som beskrevet over. Slettingene MD7 til MD 12 ble laget ved å anvende en kombinasjon av Prosedyre 4 og Prosedyre 1 eller 2. Stammebetegnelser og genomiske koordinater for hver ny sletting var: MDI 263080-324632; MD2 1398351-1480278; MD3 2556711-2563500; MD4 2754180-278970; MD5 2064327-2078613; MD6 3451565-3467490; MD7 2464565-2474198; MD8 1625542-1650865; MD9 4494243-4547279; MD10 3108697-3134392; MD11 1196360-1222299; MD12 564278-585331.

Totalt 378 180 basepar som er ca. 8,1% av det native K-12 MG1655 E. coli genomet ble fjernet ved dette trinnet. Fjerningen av disse regionene fra genomet affiserte ikke bakteriell overlevelse eller bakteriell vekst.

Tabell 2 under lister opp andre segmenter, gener og regioner i E. coli genomet som ble identifisert som kandidater for videre slettinger. Segmentene ble også vellykket fjernet fra genomet til bakterien. Igjen så ble disse slettingene gjort uten noen tydelig skadelig effekt på nytten av bakteriene i laboratorie og industriell anvendelse. Igjen er sekvensbetegnelsene tatt fra den publiserte K-12 sekvensen. To sett med slettinger utgjorde ca. 14% av det originale bakterielle genomet. Det bør legges merke til at det er mulig å slette genene selv sammen med flankerende DNA så lenge det flankerende DNA ikke ødelegger et gen som er essensielt for vekst og overlevelse av verten.

I Prosedyre 1 varierte effektiviteten av innsettingen av det lineære fragmentet med det bestemte genomiske locuset. Innsetting på korrekt sted fant sted i 1-100% (normalt 20-100%) av koloniene. Flankerende homologier i området fra 42 til 74 bp ble anvendt. Lengre homologier gir bedre innsettingseffektivitet. Fjerning på korrekt sted mellom de duplikerte sekvensene fant sted i 1-100% (normalt 10-100%) av koloniene og avhang av lengden av den duplikerte region. Lengre duplikeringer er vanligvis mer effektive. Lengden av de duplikerte sekvensene var i området fra 42 til 50 bp. Variasjoner i effektivitetene for innsetting og fjerning eksisterte mellom tilsynelatende identiske repeterte eksperimenter og er ikke fullt ut forstått enda.

Prosedyre 3 ble testet ved å gjenblande sletting MD2. Innsetting på korrekt sted av det lineære DNA-fragmentet fant sted i 6,6% av koloniene. Sletting av den innsatte sekvensen var veldig effektiv. 25 resulterende kolonier ble replika-platet ut på Cam+Amp+Kan og Amp+Kan plater og 19 av dem viste seg å være Cam sensitive. Fem av disse koloniene ble så testet med PCR, og alle 5 viste det forutsagte tapet av den innsatte sekvensen.

Tabell 8 og Tabell 9 viser en mer presis beskrivelse av slettings endepunktene for genene som er blitt eller vil bli slettet fra "landemerket". E. coli stammene MDS 12, MDS40 og MSD73 (Tabellene 8 og 9) er endepunktene for slettingene for intermediatstammene som ble anvendt for å konstruere landemerke stammene. Genene opplistet i Tabell 9 er identifisert ved "b" nummer og er basert på benevnelsene satt ut i Blattner et al., Science, supra og i GenBank aksesjonsnr. 400096. Nummereringen i Tabell 8 er også basert på Blattner et al. Supra.

Karakterisering av slettingsstammene

Transformasjonsfrekvens

Det er ønskelig å inkorporere eksogent DNA inn i genomet til E. coli slettede stammer på en slik måte at vertsbakterielle celler vil opprettholde det integrerte DNA når de deler seg og vokser. Prosessen med eksogen DNA introduksjon inn i bakteriell vertsgenom er kalt transformering og organismer som innehar eksogent DNA blir kalt transformerte organismer. Det er et behov i fagfeltet for E. coli stammer med høy effektivitet med hensyn til transformering.

E. coli stamme MDS39 ble laget ved å gjøre 39 slettinger (ca. 14,1% av genomet) i parenteral E. coli stamme MG1655 og ble funnet å være effektivt transformert ved hjelp av elektroporering. Denne høye effektiviteten for transformasjon ble utvidet til opptak av et BAC (bakterielt artifisielt kromosom) DNA av stor størrelse som gjør stammen MDS39 spesielt verdifull for et bredt område av anvendelser.

For å teste transformasjonseffektiviteten av E. coli stamme MDS39 i å inneha og stabilt opprettholde eksogent DNA ble tre stammer: DH10B, MDS31 og MDS39 dyrket under standard vekstbetingelser til optisk tetthet på 0,5 ved 600 nm. Cellekulturer ble sentrifugert ned, cellepelleter ble vasket flere ganger med vann og til slutt resuspendert i vann (ved 1/1000 av det originale dyrkingsvolumet). 25 ng av enten pBR322 DNA eller metylert BAC DNA eller ikke-metylert BAC DNA ble tilsatt til 100 ul av cellesuspensjonen og utsatt for elektroporering ved å anvende standard elektroporeringsprotokoll, for eksempel 1,8 kV og motstand på 150 ohm i en 0,1 cm elektroporeirngskuvette ved å anvende et Invitrogen Electroporator II™ utstyr. BAC DNA metylert med EcoK seter og pBR322 DNA ble lagret i E. coli stamme MG1655 ved å anvende standard protokoller. Ikke-metylert BAC DNA ble laget i E. coli stamme DH10B.

Tabell 3 viser at begge stammene, MDS31 og MDS39 blir effektivt transformert av pBR322 DNA med molekylvekt på 4 363 basepar og av metylert BAC DNA Med molekyl vekt på 100 000 basepar. Effektiviteten til transformasjonen med metylert BAC DNA for stammene MDS31 og MDS39 er sammenlignbare med effektiviteten til transformasjon for stammen DH10B, som for øyeblikket ses på som en av de stammene som har den beste transformasjonseffektivitet.

Når den blir transformert med ikke-metylert BAC DNA, var effektiviteten av transformasjonen for stamme MDS39 høyere enn effektiviteten av transformasjon for stamme DH10B (Tabell 3), mens effektiviteten av transformasjon for stamme MDS31 var lavere enn effektiviteten ved transformasjonen for begge stammene MDS39 og DH10B. Den lave effektiviteten av transformasjon for stamme MDS31 skyldes det faktum at det umetylerte DNAet er utsatt for restriksjon i stammen på grunn av at MDS31 er en r<+>m<+->stamme, mens begge stammene DH10B og MDS39 er fm"-stammer.

Nylig arbeid med MDS390 viste den mulige tilstedeværelsen av en gjenværende innsatt sekvens IS5 i sekvens gb_ba:ecu 95365. For å bestemme effekten av slettingen av den gjenværende IS-sekvensen fra MDS39, ble prosedyrer beskrevet her, anvendt for å slette sekvensen. Endepunktene for slettingene i MDS40 er stammene i Tabell 8 og 9. Den resulterende stammen MDS40 ble så testet for dens transformeringsevne og vekstkarakteristika (resultater) som diskutert under.

Elektroporeringskompetente celler ble laget som beskrevet i Invitrogen Electroporator II Manual. Kort så ble en 200 ml kultur dyrket til ODs5o=0,5, deretter ble cellene høstet ved hjelp av sentrifugering og vasket to ganger i iskaldt vann og en gang i iskald 10% glyserol med repetert sentrifugering og suspensjon. I det siste trinnet ble cellepelleten suspendert i 0,4 ml 10% glyserol, alikvotert i 40 ul porsjoner og lagret ved -80°C.

Cellene ble vanligvis elektroporert med 10-100 ng plasmid DNA ved 1,8 kV og en motstand på 150 Q i en 0,1 cm elektroporeirngskuvette ved å anvende Electroporator II utstyr (Invitrogen). Cellene ble så fortynnet med 1 ml LB, innkubert i en rister i 1 time og platet ut på selektivt medium.

Flere eksperimenter ble gjort, resultatene kan variere med en størrelsesorden. Gjennomsnitt av 2 typiske, uavhengige eksperimenter (2 paralleller hver) er vist i Tabell 5.

Transformasjonseffektiviteten til MG1655, MDS40 og DH10B ved bruk av kjemiske transformasjonsfremgangsmåter ble også anvendt. Kompetente celler ble laget ved hjelp av en enkel fremgangsmåte. En 50 ml kultur ble kjølt ned og høstet ved hjelp av sentrifugering ved ODs5o=0,4, deretter ble den vasket to ganger med 1/20 volum iskaldt CaCl<2->løsning (10 mM Tris pH 7,5,15% glyserol, 60 mM CaCl2) med repetert sentrifugering og suspensjon. Cellene ble så innkubert på is i 1 time, alikvotert i 200 ul porsjoner og lagret ved -80°C.

For transformasjon ble cellene vanligvis blandet med 100 ng plasmid DNA, innkubert på is i 30 min., varmesjokket ved 42°C i 2 min, deretter ble 0,8 ml LB tilsatt. Cellene ble innkubert ved 37°C i 0,5-1 time, deretter ble fortynninger platet på selektivt medium. Resultatene er vist i Tabell 6.

Vekstkarakteristika

Som diskutert over er det ønskelig at slettingsstammene som er laget ved hjelp av fremgangsmåter i den foreliggende oppfinnelsen har en robust evne til å vokse under visse dyrkningsbetingelser. Dyrkingsstudier ble utført som følger.

Sammenligning av E. coli stamme celle doblingstid i minutter ved 37°C ble målt med en 96-brønners plateleser (SpectraMax pluss, Molecular Devices) med rysting. Den log-lineære delen av vekstkurven ble anvendt for å beregne den gjennomsnittlige doblingstiden og standard avvik fra seks replikanter på platen. Dette utstyret tilveiebringer en beleilig måte å gjøre komparative målinger, men det "areate" cellene veldig bra slik at vekstratene er ca. to ganger så langsomme som de som skaffes til veie med rysteflasker.

Det er åpenbart at slettingsstammene vokser med samme hastighet i minimalt medium som den originale MG165 5, men ikke til den samme ultimate tetthet. Slettingene gror ikke så raskt, men til samme ultimate tetthet på rikt definert medium. Det vil færre interessant å undersøke årsaken for disse små forskjellene, men målet med å reduserte genomet vesentlig, mens evnen til å vokse robust i minimalt medium beholdes, er helt klart oppnådd.

Claims

1. E. coli bakterie, som har et kromosom som er genetisk konstruert til være minst 5% til 40% mindre enn kromosomet til sin native foreldrestamme,karakterisert vedat kromosomet til E. coli bakterien har slettet alle DNA segmentene som er en insersjonssekvens og hvori kromosomet til E. coli bakterien ikke omfatter arr, hvor nevnte arr er definert som fremmede DNA sekvenser introdusert i bakterie genomet under en slettingsprosess og som danner et potensielt problem av uønsket homolog rekombinasjon, hvis slettingsprosessen anvendes mer enn en gang i bakterien.

2. Bakterie i følge krav 1,karakterisert vedat dets kromosom er minst 7%, spesielt minst 8%, foretrukket minst 14% og mer foretrukket minst 20% mindre enn kromosomet til dens native foreldre stamme.

3. Bakterie i følge krav 2,karakterisert vedat den har et kromosom som er mindre enn 4,27 Mb eller mindre enn 4,00 Mb.

4. Bakterie i følge krav 2,karakterisert vedat den mangler 9%, som spesielt mangler 15.6%, foretrukket mangler 21.5% av dens proteinkodende gener, når den sammenliknes med dens native foreldre.

5. Bakterie i følge krav 1,karakterisert vedat et eller flere gener koder for et protein som blir utskilt til dens periplasma eller prosessert i periplasma er slettet.

6. Bakterie ifølge krav 5,karakterisert vedat en eller flere av de nevnte gener er valgt fra gruppen som består av fliY, yedO, fnB, tauA, mppA, TynA, chiA, imC, fecB, ygiH, yagP og yhcA.

7. Fremgangsmåte for å fremstille en bakterie i følge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene av: å lage et artifisiellt DNA molekyl, hvor det artifisielle DNA molekylet omfatter: i) en sekvens 1 i den ende enden som er identisk til en sekvens på den venstre flanken av en kromosomregion som skal slettes, etterfulgt av en sekvens 2 som er identisk til sekvensen på den høyre flankerende siden av kromosomregionen som skal slettes og; ii) i den andre enden, en sekvens 3, som er identisk med sekvensen innen den kromosomale regionen som skal slettes; iii) et sekvens-spesifikt nuklease gjenkjenningssete mellom sekvens 2 og 3, hvori gjenkjenningssetet ikke er tilstede i bakteriens kromosom. å introdusere det artifisielle DNA molekylet inn i bakterien under betingelser som favoriserer homolog rekombinasjon mellom sekvensene 1 og 3 og sekvenser i bakteriens kromosom for å danne en rekombinant bakterie, å introdusere inn i den rekombinante bakterien en ekspresjonsvektor for en sekvensspesifikk nuklease som gjenkjenner gjenkjenningssetet, å uttrykke den sekvensspesifikke nukleasen i den rekombinante bakterien, å høste bakteriene som overlever ekspresjonen av den sekvensspesifikke nukleasen og beholder den korrekte slettingen og repetere de foregående trinnene inntil bakterien i følge krav 1 oppnås.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det artifisielle DNA molekylet introduseres inn i bakterien ved hjelp av en vektor som bærer det artifisielle DNA molekylet eller hvori det artifisielle DNA molekylet introduseres direkte inn i bakterien.

9 Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat den videre omfatter et trinn for å introdusere inn i minst en del av bakterien en ekspresjonsvektor for et system som kan øke homolog rekombinasjon, hvori nevnte ekspresjonsvektor for systemet er kompatibel med ekspresjonsvektoren for nukleasen og hvori ekspresjonen av nukleasen er under kontroll av en induserbar promoter.

10. Fremgangsmåte i følge krav 7 eller 8,karakterisertved at den sekvensspesifikke nukleasen er I-Scel.

11. Fremgangsmåte i følge et hvert av kravene 7 til 9,karakterisert vedat det artifisielle DNA molekylet ytterligere omfatter: iv) et selekterbart markør gen mellom sekvens 2 og sekvens 3.

12. Fremgangsmåte for å fremstille en bakterie i følge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trinnene: å tilveiebringe en vektor som omfatter en sekvensspesifikk nuklease gjenkjenningssete og to DNA sekvenser, hvor den ene er identisk til en sekvens som flankerer en kromosomal region som skal slettes på en første side og den andre som er identisk til en sekvens som flankerer en kromosomal region på den motsatte siden, hvori de to DNA sekvensene er lokalisert ved siden av hverandre på vektoren og det sekvensspesifikke nuklease gjenkjenningssete er lokalisert på utsiden av de to DNA sekvensene på vektoren, å introdusere vektoren i bakterien, å introdusere inn i den vektortransformerte bakterien en ekspresjonsvektor for en sekvensspesifikk nuklease som gjenkjenner gjenkjenningssetet, å introdusere inn i den nuklease transformerte bakterien et system som er i stand til å øke frekvensen av homologe rekombinasjoner og uttrykke den sekvensspesifikke nukleasen, å identifisere en eller flere bakterier hvor kromosomregionen som skal slettes er slettet og repetere de tidligere trinnene inntil bakterien i følge krav 1 er oppnådd.

13. Fremgangsmåte for å uttrykke rekombinante proteiner i en bakterie,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter følgende trinn: å introdusere inn i en bakterie ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, en vektor som omfatter et DNA som koder for et protein som har en signalsekvens operativt koblet til en ekspresjonskontrollsekvens og å dyrke bakterien under næringsbetingelser som er egnet for ekspresjon av proteinet kodet for av DNAet.

14. Fremgangsmåte i følge krav 13,karakterisert vedat ekspresjonskontrollsekvensen er konstitutivt uttrykt eller hvori ekspresjonskontrollsekvensen er en induserbar promoter.