NO324828B1

NO324828B1 - Kapillaroppstilling og apparat for utforelse av fotometrisk analyse og anvendelse derav.

Info

Publication number: NO324828B1
Application number: NO20001389A
Authority: NO
Inventors: John Charles William Comley; Coulton Heath Legge; Li Qun Yang
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1997-09-17
Filing date: 2000-03-16
Publication date: 2007-12-10
Also published as: NO20001389D0; DE69807089D1; AU9540198A; CA2304059C; EP1015111A1; NO20001389L; NZ503388A; DE69807089T2; WO1999013986A1; CA2304059A1; GB9719673D0; US6652809B1; JP2001516870A; AU747973B2; ES2180203T3; ATE221802T1; EP1015111B1

Description

Denne oppfinnelse vedrører en kapillaroppstilling for fotometrisk analyse og et nytt apparat for utførelse av fotometriske analyser, særlig biokjemiske fotometriske analyser, samt anvendelser derav.

Konvensjonelt utføres fotometriske analyser i mikrotiterplater omfattende 96, 384, 864 eller endog 1536 brønner (henholdsvis 8x12, 16x24, 24x36 og 32x48). Geometrien for disse plater er blitt standardisert for å muliggjøre fotometriske avlesninger basert på prinsippene med absorpsjon, fluorescens, luminescens, fosforescens eller spredning foretatt ved hjelp av en platelesende maskin på alle brønnene innenfor et standard format. Slike analysesystemer lider av den ulempe at det nødvendige volum av prøven kan være forholdsvis stort og konsentrasjonen av substansen som skal analyseres forholdsvis høy med økte omkostninger. Videre, ettersom analysevolumer minsker blir systemer som ikke sørger for avdekking eller tetting i økende grad utsatt for fordampning.

US 5048957 beskriver en analyse-plate med brønner for innsetningsbare kyvetter.

WO-A-95/11437 beskriver overføring av en væske fra et reaksjonsområde til et deteksjonsområde i forbindelse med syntese av nukleinsyrer.

Det har forblitt et behov for å miniatyrisere fotometriske analysesystemer for å muliggjøre analysering av prøver med mindre volum mens følsomhet og tilstrekkelig signal til støyforhold opprettholdes.

Det er nå oppfunnet et apparat som tillater utførelsen av fotometriske analyser med høy densitet og lavt volum med signifikant større følsomhet enn det hittil har vært mulig og med vesentlig redusert problem med fordampning. Andre fordeler ved dette apparat, som for eksempel redusert interferens mellom signaler fra prøver vil fremgå av det følgende.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebragt en kapillaroppstilling for fotometrisk analyse som omfatter: 1. et flertall gjennomskinnelige kapillarer som hver er forseglet i én ende; 2. midler for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon fra en nabokapillar Videre tilveiebringer oppfinnelsen et apparat for utførelse av fotometriske analyser som omfatter 1. en husdel;

2. en kapillaroppstilling ifølge krav 1 til 2, og

3. optisk instrumentering og koblingskretser tilpasset for å avlese en optisk respons eller inntruffet forhold i hver kapillar.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av kapillaroppstillingen og apparatet ifølge oppfinnelsen.

Husdelen kan fremstilles fra et hvilket som helst stivt materiale, som for eksempel plast (for eksempel perspex) eller metall (for eksempel stål, aluminium). Husdelen vil tjene til å holde kapillarene i den ønskede orientering for avlesning av den optiske instrumentering og koblingskretsene.

Foretrukket vil antallet gjennomskinnelige kapillarer bli anordnet med en regelmessig orientering. For eksempel kan de anordnes i husdelen i oppstillinger på 8x12, 16x24, 32x48, 64x96 (særlig når dette er i samsvar med det konvensjonelle mikro-plateformat) eller hvilken som helst annen ønsket geometrisk anordning.

Alternativt (selv om dette ikke foretrekkes) kan de være tettpakket, idet de i dette tilfellet foretrukket vil være tettpakket i et regelmessig mønster, som for eksempel et kvadrat, rektangel, sekskant eller den tettpakkede anordning kan da være holdt på plass i husdelen.

Kapillarer vil generelt ha sirkulært tverrsnitt, typisk med indre og ytre dimen-sjoner i området 0,1 til 4 mm, for eksempel 0,8 mm henholdsvis 1,0 mm. Kapillarer vil ha en lengde i området 1 til 50 mm, for eksempel 10 mm.

Kapillarer kan også ha andre indre og ytre geometrier enn sirkulære. For eksempel kan et heksagonalt ytre tverrsnitt være en fordelaktig geometri for tett pakking.

Foretrukket, når kapillarene er anordnet i oppstillinger tilveiebringes midlene for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon fra en nabokapillar når den del av husdelen som holder kapillarene på plass omfatter en underlagsblokk hvori det er fremstilt hull, ideelt som en regelmessig anordning, hvor hvert hull er i stand til å opp-ta og holde en enkelt kapillar på plass.

Materialet for fremstilling av husdelen bør ikke bidra med et vesentlig bakgrunnssignal for den anvendte analysemetode og skal ikke tillate overgang av signal fra en kapillar til den neste ("krysspåvirkning") i noen særlig grad.

Foretrukket fremstilles underlagsblokken av et lysugjennomtrengelig, for eksempel et plastmateriale, som perspex eller høydensitet polypropylen- eller polytetra-fluoretylen-materiale som kan være farget sort. Hele husdelen kan fremstilles av det samme materialet.

For fluorescensanvendelser vil underlagsblokken foretrukket være ugjennomtrengelig for lys ved emisjonsbølgelengden selv om den ikke er ugjennomtrengelig for lys ved eksitasjonsbølgelengden.

For fluorescensanvendelser vil materialet for fremstilling av underlagsblokken foretrukket ha lav egenfluorescens.

Kapillarer kan anordnes i underlagsblokken med en tetthet på typisk 1 til 10.000/cm<2>. Kapillarer anordnet i systemer med 96, 384 og 1536 vil generelt anordnes med en separasjon på henholdsvis 9, 4,5 og 2,25 mm.

Enden av kapillaren som inneholder eller skal inneholde prøven kan stå ut fra eller holdes innenfor underlagsblokken. Den vil foretrukket stå ut fra underlagsblokken.

Det foretrekkes at enden av kapillaren er tettet til å danne en smeltet boble.

Når kapillarene er tett pakket kan midlene for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon fra en nabokapillar tilveiebringes ved å belegge hver kapillar med et lysugjennomtrengelig materiale. Alternativt kan de forsynes med et belegg som er høyt innvendig reflekterende som for eksempel et sølv- eller aluminiumbelegg.

Generelt vil belegget være et plastbelegg. Belegget bør være tilstrekkelig tykt og tett og materialet vil ha egenskaper egnet for anvendelsen. For fluorescensanvendelser vil det foretrukket ha lav egenfluorescens. Ofte vil belegget bestå av et sort plastmateriale.

Det er også tenkt at kapillarene belagt med et lysugjennomtrengelig materiale kan holdes på plass i husdelen omfattende en underlagsblokk som ikke behøver å være fremstilt av et lysugjennomtrengelig materiale.

I en alternativ utførelsesform, når kapillarene er anordnet i oppstilling, kan midlene for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon fra en nabokapillar omfatte et luftrom. Kapillarene vil likevel være forbundet gjennom husdelen for å bibeholde dem i den ønskede orientering selv om disse forbindelser vil være slik at ingen vesentlig krysspåvirkning forekommer.

Ved et raffinement av denne utførelsesform kan kapillarene anses å være holdt på plass i en underlagsblokk i den betydning at underlagsblokken holder dem stivt på plass i en fast orientering, bortsett fra at den del av kapillaren som inneholder eller skal inneholde en flytende prøve ikke befinner seg inne i underlagsblokken men er omgitt av luftrom.

Midlene for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon fra en nabokapillar kan også omfatte et luftrom sammen med et kapillarbelegg av lysugjennomtrengelig materiale.

Utførelse av en analyse vil innbefatte at væske avgis inn i en eller flere kapillarer. Dette kan gjennomføres manuelt, men vil foretrukket bli utført ved hjelp av et automatisert system.

Det vil ofte være nødvendig å avgi en prøve som skal analyseres med mindre volum og et analysereagens med større volum, men det kan også være nødvendig å avgi en prøve med større volum. I alle fall kan væsken som skal avgis i kapillaren avgis i en eller flere delvolum i området fra lite (nanoliter- til picoliter-område) til stort (mikroliter-område).

Hver delmengde kan tilføres ved hjelp av standard kontaktleveringsmetoder, for eksempel sprøytenål, pipettespiss eller overføringsnål. En prøve kan tilføres bunnen av kapillaren ved bruk av en mikroinjeksjonsnål, men blir foretrukket tilført mot toppen av kapillaren og hjelpes til bunnen av kapillaren, for eksempel ved vibrasjon, idet man trekker fordel av overflatebelegg eller geometriske trekk, ved bruk av trykk-forskjeller eller foretrukket ved sentrifugering.

Sentrifugering har den ytterligere fordel at den fremmer sammenblanding av prøver.

Sentrifugering kan gjennomføres ved bruk av konvensjonelle apparater, for eksempel en konvensjonell mikroplatesentrifuge. Formen av husdelen kan tilpasses for å bedre sentrifugeringen.

Apparatet (for eksempel 96, 384 eller 1536 multikanalfordelere) kan anvendes idet dette muliggjør at et antall anordnede delmengder kan fordeles samtidig.

Delmengder kan også fordeles ved hjelp av ikke-kontaktfordeling, for eksempel ved bruk av piezoelektrisk- eller solenoidventilfordeler. Denne metode er mer egnet forfordeling av mindre volum (nanoliter- til picoliter-område).

Typiske delmengdevolum som vil bli fordelt til en kapillar er i området 0,1 til 10 uJ, foreksempel 1 jllI.

Når kapillarene er anordnet med en regelmessig oppstilling kan hver være forsynt med en flensende som åpner til en munningsåpning større enn for kapillaren for å fremme tilførsel av en prøve. Når den ytre dimensjon av kapillaren er 1,0 mm er det funnet at en flens som strekker seg til 1,2 mm er meget egnet.

Alternativt eller i tillegg kan hver kapillar holdes på plass i en. underlagsblokk som er forsynt med et væskeinngangstrekk tilpasset til å lede væske som gjennom en trakt inn i hver kapillar. Traktanordningen for væskeinngangstrekket kan omfatte en formstøpt konus med en åpen ende med større diameter enn den indre diameter av kapillaren for å fremme fordelingen av prøvene. En størrelse som kan sammen-lignes med størrelsen av konvensjonelle mikrotiterplater slik at det muliggjøres anvendelse av konvensjonelt fordelingsutstyr (for eksempel multikanal 96- eller 384-fordelere) er særlig fordelaktig.

Underlagsblokken kan tilveiebringe en traktanordning både i utførelsesform-ene når den del av kapillaren som inneholder eller skal inneholde en væskeprøve holdes på plass inne i underlagsblokken og i utførelsesformer når denne del ikke holdes på plass inne i underlagsblokken, men er omgitt av luftrom.

Når en kapillar med en flens anvendes sammen med en underlagsblokk med traktanordningen kan flensen fordelaktig tjene det ytterligere formål å støtte og for-segle kapillaren i underlagsblokken.

Kapillarer kan fremstilles fra et område av gjennomskinnelige materialer, for eksempel plast (som perspex), glass (som for eksempel smeltet silika) og kvarts. Det foretrekkes at materialet gir en lav bakgrunnsavlesning i den optiske analysemetode som anvendes. Glass og kvarts foretrekkes spesielt, særlig smeltet silika som viser lav fosforescens.

Uten å skulle begrenses av teori, antas det at følsomheten av apparatet økes for den største del ettersom kapillarveggen virker som en optisk bølgestyring som meget effektivt samler og leder lys ut av den innesluttede væske. Foretrukket avleses en fotonisk respons eller inntruffet forhold i hver kapillar ved dens forseglede ende, det vil si lys (for eksempel fluorescens eller luminescens) samles foretrukket fra overflaten av den forseglede ende snarere enn fra væskeoverflaten. Videre, når den forseglede ende danner en smeltet boble (som foretrekkes) kan denne virke som en linse i stand til å konsentrere og fokusere lys overført gjennom kapillarveggen, generelt ved dens spiss eller ved et brennpunkt under dens spiss, foretrukket på et enkelt eller multippelt fokalplan. Boblen kan fremby et område av geometrier til den indre overflate, for eksempel konkav, konveks eller plan.

En ytterligere fordel ved systemet er at ved å avbilde fokalplanet av boblene i en oppstilling kan eliminere problemer med paralakse/skygge som sees ved avbild-ning av konvensjonelle mikrotiterbrønner. Ytterligere kan systemet signifikant bedre forholdet signal-til-støy (kontrast).

Formålet med den lysugjennomtrengbare barrieren mellom kapillarer er å eliminere eller i vesentlig grad å redusere "krysspåvirkning" eller interferens i signal mellom en kapillar og en annen.

I det følgende vil anordningen av flertallet av kapillarer benevnes en "kapillaroppstilling".

Kapillaroppstillinger kan avleses ved bruk av konvensjonell teknologi for utfør-else av fotometriske analyser. En hvilken som helst analyse hvori lysfotoner emiteres kan anvendes. Typiske analyser inkluderer absorbsjonsanalyser, fluorescensanalyser, luminescensanalyser, fosforescensanalyser og analyser basert på spredning (for eksempel av Råman- eller nefelometritypen) i væsker inneholdende partikler.

For fluorescensanvendelser kan fluorescenssignalet avgis av en eller flere fluoroforer knyttet til målmolekyler eller inne i målmolekyler (autofluorescens). Slik fluorescens kan induseres ved prosesser som innebærer ett eller flere fotoner.

Metoden er egnet for utførelse av alle typer av fotometrisk analyse, som biokjemiske, kjemiske og immunologiske analyser, etc.

For absorbsjonsanalyser vil det være vanlig å belyse overflaten av væsken i hver kapillar med lys og måle overført lys ved overflaten av den forseglede ende av kapillaren eller ved brennpunktet under den forseglede ende når enden fremviser en linseeffekt. Måling vil bestå i å måle antallet fotoner overført ved en bestemt bølge-lengde. Alternativt kan absorbsjonsspektra måles over et område av bølgelengder.

For fluorescensanalyser er en mulig anordning lignende den som er beskrevet i det foregående for absorbsjonsanalyser, det vil si slik at væsken belyses med lys av en bestemt bølgelengde og det emitterte lys måles fra overflaten av den forseglede ende av kapillaren eller dens brennpunkt. Måling vil bestå av å måle antallet fotoner emittert med en bestemt bølgelengde som generelt vil være en bølgelengde som er forskjellig fra bølgelengden av det eksiterende lys. Alternativt kan antallet fotoner emittert over et område av bølgelengder måles.

Eksitasjon av prøven kan i prinsippet oppnås ved belysning av prøven fra en hvilken som helst vinkel. Generelt foretrekkes det å belyse overflaten av væsken innesluttet i kapillaren fra den åpne ende, selv om prøven også kan eksiteres ved å belyse den forseglede ende av kapillaren i stedet for væskeove rf laten.

Det er omfattet, selv om det ikke foretrekkes, at prøven kan belyses fra siden for eksempel gjennom en underlagsblokk som er fremstilt av eller omfatter et lys-transmitterende materiale. I en mulig anordning (som indikert i det foregående) kan underlagsblokken fremstilles av et materiale som er ugjennomtrengelig for lys ved emisjonsbølgelengden men som slipper gjennom lys ved eksitasjonsbølgelengden slik at prøven kan belyses på siden mens krysspåvirkning minimeres eller elimineres. Prøven kan også belyses fra siden ved hjelp av en anordning som inkluderer en lysstyring.

Måling av fluorescenslyset kan foretas umiddelbart etter eksitasjon eller etter en forsinkelse. På grunn av at de fleste bakgrunnssignaler har kort levetid tillater bruk av fluorescensmerkinger med en lang levetid, for eksempel 10 til 1000 ns tids-dekomponert påvisning for reduksjon av bakgrunnsinterferens.

Den beskrevne kapillaranordning kan være nyttig for å muliggjøre miniatyriser-ing av de analysemetodikker-som bruker tids-dekomponert fluorescens (inklusive levetidsfluorescens) for eksempel Packard Biosciences homogen tids-dekomponert fluorescens (HTRF) eller Wallac lantanid-chelat eksitasjonsteknologi (LANCE).

For luminescensanalyser vil luminescens generelt utvikles ved hjelp av kjemiske eller biologiske midler. For kjemiluminescerende anvendelser vil det lys som måles være et resultat av en kjemisk reaksjon slik som for eksempel innvirkning av en radioaktiv substans med et scintillasjonsmiddel. Et eksempel på en slik anvendelse er en scintillasjons-proksimitetsanalyse. Generelt blir det meste eller alt emittert lys oppsamlet. Det lys som emitteres ved overflaten av den forseglede ende av kapillaren eller ved dens brennpunkt måles. Scintillasjonsmiddelet kan være i form av en kule og interaksjon med den radioaktive substans kan fremmes ved å knytte kulen til et antistoff med affinitet for den radioaktive substans.

Ved en særlig fordelaktig anordning for utførelse av en scintillasjons-proksimitetsanalyse kan scintillasjonsmiddelet være belagt på den indre overflate av kapillaren og det emitterte lys kan ledes gjennom kapillarveggen til den forseglede ende med særlig høy effektivitet.

Belegging kan oppnås ved hjelp av hvilke som helst kjente midler, for eksempel ved hjelp av Langmuir Blodgett selv-samlende monolag.

Overflaten av kapillaren kan også belegges eller behandles for å tilveiebringe ønskede egenskaper, for eksempel å endre fukteegenskapene av kapillaren eller ved å utføre en vevsdyrkingsbehandling på den indre overflate for å lette celleadhesjon.

For bioluminescerende anvendelser kan lys genereres ved hjelp av enzym-reaksjon, for eksempel ved reaksjon av luciferase.

En lang rekke forskjellige luminescensanalyser kan gjennomføres ved å koble et reaksjonsforhold til et lysgenererende forhold basert på kjemiske eller biologiske prinsipper.

For fosforescensanalyser beskrives anordninger for fluorescensanalyser som vil være egnet bortsett fra at fotoner av emittert lys vil bli samlet og målt over en tids-periode, for eksempel 0,1 til 10 millisekunder.

For analyser av lys som spres i væsker inneholdende partikler, er det mulig med et antall anordninger hvori det spredte lys kan måles direkte eller indirekte. For eksempel kan væsken i hver kapillar belyses fra siden med lys og spredt lys avbøyes mot den forseglede ende av en kapillar kan samles og måles fra overflaten av den forseglede ende eller ved dens brennpunkt. Måling vil bestå i at antallet samlede fotoner måles idet disse vil ha den samme eller en forskjellig bølgelengdeprofil enn den tilsvarende for det belysende lys. Alternativt kan overflaten av væsken i hver kapillar belyses fra den åpne ende og det lys som ikke spres og avbøyes mot kilden samles og måles fra overflaten av den forseglede ende eller ved dens brennpunkt.

Som drøftet i det foregående vil påvisningsoptikk foretrukket bli fokusert på den forseglede ende av kapillaren og når denne danner en smeltet boble, ved dens spiss eller ved dens brennpunkt når den fremviser linseeffekten beskrevet i det foregående.

Utførelsen av analysen kan foretas med kapillaroppstillingen i en hvilken som helst orientering. Selv om det godt kan være foretrukket å utføre analyser med oppstillingen i opprett stilling kan de like godt utføres med oppstillingen snudd opp-ned ettersom prøven i dette tilfellet vil bli holdt ved den forseglede ende ved kapillar-virkning.

Når geometriene av kapillaroppstillingen er den samme som i konvensjonelle mikroplater (det vil si 8x12-, 16x24- og 32x48-oppstillinger, med kapillarseparasjon på henholdsvis 9 mm, 4,5 mm og 2,25 mm) kan det anvendes konvensjonelle mikro-platelesere og bildedannere.

Et eksempel på en eksitasjonsmetode for fluorescensanalyser er med en Xenon blitzlampe med et passende eksitasjonsfilter, for eksempel et filter i området 300 til 700 nm. En filterbåndbredde på 10 nm eller mindre foretrekkes. Generelt vil måling av oppfanget lys foretas etter passering av lyset gjennom et passende emi-sjonsfilter.

Fotonoppsamlingsmålinger vil generelt foretas ved hjelp av et fotoforsterker-rør, en fotodiode eller ladet koblet innretning.

Generelt vil fotonoppsamling utføres sekvensmessig på hver kapillar, noe som vil innebære at det anordnes midler for å bevege detektoren eller kapillaroppstillingen fra et sted til et annet. Når det gjennomføres fotonoppsamling med en ladningskoblet innretning kan det imidlertid være mulig å samle fotoner samtidig i noen eller alle kapillarer idet dette har klare fordeler med hensyn til avlesningshastighet og mekan-isk enkelhet. Et slikt system maksimerer fordelene ved oppfinnelsen med hensyn til evnen til effektivt å måle meget store antall av prøver uten betydelig tidsforsinkelse.

Når den del av kapillaren i en oppstilling som inneholder eller skal inneholde en prøve er omgitt av luftrom kan oppstillingen neddykkes i en væske eller et varme-overføringsmedium for sykliske termiske anvendelser.

I kapillaroppstillingen kan kapillarene holdes på plass i en underlagsblokk hvori det er fremstilt hull, ideelt i et regelmessig mønster, idet hvert hull er i stand til å motta og fastholde en enkelt kapillar.

I kapillaroppstillingen kan kapillarene være tett pakket og holdt på plass i en husdel.

Andre trekk ved kapillaroppstillingen vil fremgå av det følgende. Oppfinnelsen skal illustreres med henvisning til de medfølgende figurer hvori: fig. 1 viser fire eksempelvise kapillarkonstruksjoner;

fig. 2a viser et delperspektivriss av en kapillaroppstilling ifølge en utførelses-form av oppfinnelsen hvori kapillarkonstruksjonen A i fig. 1 er illustrert;

fig. 2b viser et riss ovenfra av kapillaroppstillingen i fig. 2a;

fig. 2c viser et snitt langs linjen A-A gjennom kapillaroppstillingen i fig. 2b og viser fire forskjellige alternative husdeler bortsett fra at kapillarkonstruksjon C i fig. 1 er illustrert i utførelsesformene (i) til (iii) i stedet for kapillarkonstruksjon A og at kapillarkonstruksjon B i fig. 1 er illustrert i utførelsesform (iv) i stedet for kapillarkonstruksjon A;

fig. 3a og 3b viser skjemaer som illustrerer følsomheten av et apparat ifølge oppfinnelsen i en fluorescensanalyse (lineær henholdsvis logaritmisk skala);

fig. 4 viser en sammenligning av tendensen til fordampning i en utførelsesform av apparatet ifølge oppfinnelsen med et konvensjonelt apparat;

fig. 5 viser en fluorescensavsøkning ("scanning") av tre kapillarer i en 1536-kapillaroppstilling ifølge oppfinnelsen;

fig. 6a viser en sammenligning av fluorescensbildet av fluorescein-prøver i en utførelsesform av oppfinnelsen og en konvensjonell mikroplate;

fig. 6b viser et histogram av fluorescensintensiteten av fluorescein-prøvene i en utførelsesform av oppfinnelsen sammenlignet med en konvensjonell mikroplate.

I fig. 1 vises kapillarer 1 som (A) har en vanlig forseglet ende med en konkav indre overflategeometri, (B) er forseglet ved en ende for å danne en smeltet boble med en konveks indre overflategeometri 2a, (C) kan inneholde en flens 3 ved den åpne ende og (D) er forseglet ved en ende for å danne en smeltet boble med en plan indre overflategeometri 2b.

I fig. 2a, 2b og 2c er hver kapillar 1 holdt på plass i en husdel 4 omfattende en underlagsblokk hvori det er tildannet hull 5 innrettet for å motta kapillaren. I fig. 2c(i) er den del av kapillaren som skal inneholde en væskeprøve holdt på plass inne i underlagsblokken. I fig. 2c(ii) er den del av kapillaren som skal inneholde en væske-prøve ikke inneholdt i underlagsblokken, men er omgitt av luftrom. Fig. 2c(iii) viser underlagsblokken forsynt med et konisk væskeinnløpstrekk 6 tilpasset til å føre væske inn i hver kapillar som gjennom en trakt. Fig. 2c(iv) viser en modifikasjon av utførelsesformen i fig. 2c(iii) hvori væskeinngangstrekket er fraværende og kapillarkonstruksjon B i fig. 1 anvendes.

Fig. 3a og 3b viser en sammenligning av fluorescenssignalet (relative fluorescensenheter) oppnådd fra et område av fluorescein-konsentrasjoner (0,01 til 1000 ng/ml) når forskjellige prøvevolumer av disse fluorescein-oppløsninger ble målt i forskjellige konvensjonelle mikrotiterplatebrønner (datasett 1, 2, 3, 4, 6 og 7) versus kapillaroppstillingen ifølge oppfinnelsen (datasett 5) i en utførelsesform som lignet utførelsesformen i fig. 2c(iv). Alle mikrotiterplater hadde brønner med opake sorte vegger og klar bunn, bortsett fra 864-platen som hadde vegger og en klar bunn. Alle fluorescensmålinger ble foretatt opp-ned ved bruk av en enkelt PMT-basert fluorescensplateleser ved en bestemt forsterkningsinnstilling med eksitasjon ved 485 nm og emisjon ved 535 nm. Avlesninger var korrigert for bakgrunnen på de respektive mikrotiterplater eller kapillaroppstillinger.

Datasettene som oppført representerer gjennomsnittet av ti avlesninger fra de følgende konvensjonelle mikrotiterplatebrønner eller kapillaroppstillingsformat, sammen med det målte prøvevolum:

1: 384-brønn (16x24) mikrotiterplate, prøvevolum 1 uJ.

2: 864-brønn (24x36) mikrotiterplate, prøvevolum 1 u,l.

3: 1536-brønn (32x48) mikrotiterplater, prøvevolum 1 uJ.

4: 864-brønn (24x36) mikrotiterplate, prøvevolum 5 |il.

5: 384-kapillar- (16x24) oppstilling, ifølge oppfinnelsen, prøvevolum 1 |il.

(Kapillardimensjoner: 1,0 mm ytre diameter, 0,8 mm indre diameter, lengde 10 mm)

6: 96-brønn (8x12) mikrotiterplate, prøvevolum 200 (il.

7: 384-brønn (16x24) mikrotiterplate, prøvevolum 50 |il.

Fig. 3a viser at på basis av det totale signal samlet fra apparatet i en 384-oppstilling kunne prøvevolumet på 1 uJ (datasett 5) ifølge oppfinnelsen sammenlig-nes med signalet oppnådd med en konvensjonell 96-brønn mikrotiterplate, prøve-volum på 200 |il (datasett 7) eller signalet oppnådd med konvensjonell 384-mikrotiterplate, prøvevolum 50 (il (datasett 6). Alle tre datasett (5, 6 og 7) viste fluorescenssignaler i det minste to ganger så store, og i mange tilfeller fire ganger så store som 1 eller 5 |il delmengder i 864- eller 1536-mikroplater (datasett 1, 2, 3 og 4). Fig. 3b viser at fluorescein-konsentrasjonene ved hvilke tydelig signal i forhold til bakgrunn fremdeles kan detekteres (absolutt følsomhet) strekker seg ned til 0,01 ng/ml for apparatet i en 384-oppstilling, prøvevolum 1 (il (datasett 5). Sammen-lignbar følsomhet ble også sett med en konvensjonell 96-brønn mikrotiterplate, prøvevolum 200 jil (datasett 7) og med en konvensjonell 384-mikrotiterplate, prøve-volum 50 (il (datasett 6). Alle tre datasett (5, 6 og 7) hadde minst en (datasett 4) eller to størrelsesordener (datasett 1, 2 og 3) større følsomhet enn 1 eller 5 uJ delmengder i 864- eller 1536-mikroplater (datasett 1, 2, 3 og 4). Fig. 4 viser en grafisk fremstilling av fordampningshastigheten fra 1 (il vann fra en smeltet endekapillar versus en åpen 1536-plate. Resultatene er uttrykt som en prosentandel av utgangsvekten og ble bestemt ved gjentatt innveining (til 0,00001 g) av enten ti kapillarer sammen (hver inneholdende 10 |il vann ved bunnen av kapillaren) eller en del av en 1536-plate (inneholdende ti separate delmengder av 1 uJ

vann/brønn). Fordampning ble fulgt ved romtemperatur og det ble ikke gjort noe for-søk på å overdekke kapillarene eller brønnene. Resultatene viser klart fordelen med kapillarene til å redusere fordampning ved at mindre enn 10% av vannet gikk tapt fra

kapillarene i løpet av 5 timer, mens 1 uJ delmengde av vann anbragt i brønnene på 1536-platen var fullstendig fordampet i løpet av 3 timer.

Fig. 5 viser sveipoversikt ("scanning") av fluorescensen avgitt fra tre nabokapillarer i en 1536 (32x48) oppstilling med kapillaravstand 2,25 mm i en utførelsesform av oppfinnelsen som lignet utførelsesformen i fig. 2c(iv).

Det kan sees at der er meget lite kryssoverføring i rommet mellom kapillarene. Kapillardimensjoner var: 1,0 mm ytre diameter, 0,8 mm indre diameter, lengde 10 mm. Kapillaroppstillingen ble avbildet med en fluorescens-sveipavbilder og fluorescensintensiteten (rfu) integrert langs midtlinjen av tre nabokapillarer som hver inneholdt 1 uJ av en 100 ng/ml oppløsning av fluorescein.

Fig. 6a og 6b viser en sammenligning av fluorescens-avbildningen oppnådd for et område av fluorescein-oppløsninger når 1 jil av disse oppløsninger ble målt i en konvensjonell fast sort mikroplate versus en kapillaroppstilling, ifølge oppfinnelsen i en utførelsesform som lignet utførelsesformen i fig. 2c(iv). Både mikroplaten og kapillaroppstillingen var ved 1536 densitet med 2,25 mm avstand mellom brønnene.

Konsentrasjonen av fluorescein i oppløsningene var 1:1000 nM, 2:333,3 nM, 3:111,1 nM, 4:37,0 nM, 5:12,3 nM, 6:4,1 nM, 7:1,37 nM og 8:buffer alene. Hver fortynning var firfoldig med fortynning 1 på toppen av avbildningen, og gikk videre ned til fortynning 8 ved bunnen av avbildningen. I fig. 6a ble avbildningen av mikroplaten og kapillaroppstillingen oppnådd ved bruk av et mikroplateavbildningssystem under identiske betingelser (10 sekunders eksponering, 4X forsterkning, 2x2 oppdeling, med eksitasjon ved 485 nm og emisjon ved 535 nm). Epifluorescensbilder ble oppnådd ved å fokusere bildedanneren fra den øvre mikroplateoverflate eller på den smeltede ende av kapillarene. Fig. 6b viser et histogram av intensiteten av fluorescenssignalet (OD-nivåer x1000) sammen med fortynningsseriene for den sorte mikroplate eller kapillaroppstillingen.

Det kan fra fig. 6a og 6b sees at den konvensjonelle sorte mikroplate viser et betraktelig bakgrunnssignal ved bildedannelsen hovedsakelig på grunn av refleksjon av fluorescens fra overflaten av mikroplaten. I motsetning til dette, når kapillaroppstillingen ble avbildet ved brennpunktet for kapillarboblene som befant seg utenfor underlagsblokken, nedsettes bakgrunnen nesten til null. Resultatet er at forholdet signal/støy (kontrast) av kapillaroppstillingen er tydelig forbedret i forhold til den konvensjonelle mikroplate og det er mulig å skjelne mellom lavere fluorescein-fortynn-inger.

Claims

1. Kapillaroppstilling for fotometrisk analyse, karakterisert ved at den omfatter: 1. et flertall gjennomskinnelige kapillarer som hver er forseglet ved en ende; og 2. midler for å forsyne hver kapillar med fotonisk isolasjon overfor en nabokapillar.

2. Kapillaroppstilling ifølge krav 1, karakterisert ved at kapillarene er holdt på plass i en underlagsblokk hvori det er tildannet hull, ideelt i et regelmessig arrangement, idet hvert hull er i stand til å motta og holde en enkelt kapillar på plass.

3. Apparat for utførelse av fotometriske analyser, karakterisert ved at det omfatter

4. en husdel;

5. en kapillaroppstilling ifølge krav 1 til 2, og

6. optisk instrumentering og koblingskretser tilpasset for å avlese en optisk respons eller inntruffet forhold i hver kapillar. 4. Apparat ifølge krav 3, karakterisert ved at flertallet av gjennomskinnelige kapillarer er anordnet med en regelmessig orientering. 5. Apparat ifølge krav 4, karakterisert ved at kapillarene er anordnet i en oppstilling. 6. Apparat ifølge krav 5, karakterisert ved at kapillarene er anordnet i oppstillinger på 8x12,16x24 eller 32x48.

7. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 6, karakterisert ved at kapillarene holdes på plass i en underlagsblokk hvori det er tildannet hull, idet hvert hull er i stand til å motta en enkelt kapillar.

8. Apparat ifølge krav 7, karakterisert ved at underlagsblokken er fremstilt av et lysugjennomtrengelig materiale.

9. Apparat ifølge krav 8, karakterisert ved at det lysugjennomtrengelige materialet er et sort plastmateriale.

10. Apparat ifølge krav 7, karakterisert ved at underlagsblokken er fremstilt av et materiale med lav egenfluorescens.

11. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 7 til 9, karakterisert ved at den delen av kapillaren som inneholder eller skal inneholde en væskeprøve holdes på plass inne i underlagsblokken.

12. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 7 til 9, karakterisert ved at den del av kapillaren som inneholder eller skal inneholde en væskeprøve ikke holdes på plass inne i underlagsblokken, men er omgitt av luftrom.

13. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 12, karakterisert ved at hver kapillar er forsynt med en flensende ende.

14. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 13, karakterisert ved at underlagsblokken er forsynt med et væskeinnløpstrekk tilpasset til å føre væske inn i hver kapillar med en traktvirkning.

15. Apparat ifølge krav 14, karakterisert ved at traktanordningen for væskeinnløpstrekket omfatter en støpt konus.

16. Apparat ifølge krav 12, karakterisert ved at hver kapillar er belagt med et lysugjennomtrengelig materiale.

17. Apparat ifølge krav 16, karakterisert ved at det lysugjennomtrengelige materiale er et sort plastmateriale.

18. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 17, karakterisert ved at kapillaren er fremstilt av glass eller kvarts.

19. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 18, karakterisert ved at den optiske respons eller inntruffet forhold i hver kapillar avleses ved dens forseglede ende.

20. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 19, karakterisert ved at enden av hver kapillar er forseglet til å danne en smeltet boble.

21. Apparat ifølge krav 20, karakterisert ved at boblen fremviser en linsevirkning i stand til å konsentrere og fokusere lys overført gjennom kapillarveggen.

22. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 21, karakterisert ved at kapillarene er belagt eller overflatebehandlet.

23. Apparat ifølge krav 22, karakterisert ved at overflatebehandlingen omfatter utførelse av en vevs-kulturbehandling på den indre overflate for å øke celleadhesjon.

24. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 23, karakterisert ved at den optiske instrumentering og koblingskretsene er tilpasset for å måle absorbsjon av en væske inneholdt i en kapillar.

25. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 23, karakterisert ved at den optiske instrumentering og koblingskretsene er tilpasset for å måle luminescensen av en væske inneholdt i en kapillar.

26. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 23, karakterisert ved at den optiske instrumentering og koblingskretsene er tilpasset for å eksitere en væske inneholdt i en kapillar med lys og måle lyset emittert ved fluorescens.

27. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 23, karakterisert ved at den optiske instrumentering og koblingskretsen er tilpasset for å eksitere en væske inneholdt i en kapillar med lys og måle lyset emittert ved fosforescens.

28. Apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 23, karakterisert ved at den optiske instrumentering og koblingskretsene er tilpasset å eksitere en væske inneholdt i en kapillar med lys og måle det spredte lys direkte eller indirekte.

29. Anvendelse av et apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 28 ved ut-førelse av en fotometrisk analyse.

30. Anvendelse av et apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 28 der den del av kapillaren i en oppstilling som inneholder eller skal inneholde en prøve er omgitt av luftrom, ved en anvendelse som innebærer termisk syklisk regulering.

31. Anvendelse av kapillaroppstillingen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 2 i et apparat ifølge hvilket som helst av kravene 3 til 28.