NO321830B1 - Desmetylselegilin eller salt derav, medikament omfattende forbindelsen, samt anvendelser derav - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåter og farmasøytiske blandinger for anvendelse av selegilinmetabolitten desmetylselegilin og stereoisomere former derav. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesielt nye blandinger og fremgangsmåter for anvendelse av desmetylselegilin, og/eller ent-desmetylselegilin, for selegilinresponsive sykdommer og tilstander. Sykdommer og tilstander som er responsive på selegilin, inkluderer dem som frembringes ved neuronal degenerering eller neuronalt trauma, og dem som skyldes immunsystem dysfunksjon. Desmetylselegilin, og/eller ent-desmetylselegilin, administreres enten oralt eller på en administreringsmåte som ikke er avhengig av absorpsjon i mage/tarmsystemet. Desmetylselegilin er R(-)-enantiomeren av N-metylN-(prop)-2-ynyl)-2-aminofenylpropan og ent-desmetylselegilin er S(+)-enantiomeren. Krevde blandinger inkluderer både R(-) og S(+)-isomerene så vel som blandinger derav. Farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter kan også anvendes. Effektive doseringer er en daglig dose på minst ca. 0,0015mg/kg legemsvekt.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbindelse som inneholder desmetylselegilin eller salt derav, medikament omfattende forbindelsen, samt anvendelser derav. Selegilinmetabolitten desmetylselegilin og dens enantiomer, ent-desmetylselegilin, anvendes i medikamenter. Spesielt skal den foreliggende oppfinnelse tilveiebringe forbindelser og medikamenter for anvendelse av disse ved selegilinresponsive sykdommer og tilstander.

To adskilte monoaminoksydase-enzymer er kjent i teknologien. Monoaminoksydase A (MAO-A) og monoaminoksydase B (MAO-B). De cDNA'er som koder for disse enzymer, har forskjellige promotorregioner og særskilte eksondeler, som indikerer at de er kodet uavhengig i forskjellige genstillinger. Dessuten har analyse av de to protein vist forskjeller i sine respektive aminosyresekvenser.

Den første forbindelse som er funnet selektivt å inhibere MAO-B var R-(-)-N-metyl-N-(prop-2-ynyl)-2-aminofenylpropan, også kjent som L-(-)-deprenyl, R-(-)-deprenyl eller selegilin. Selegilin har følgende strukturformel:

Selektiviteten til selegilin for inhibering av MAO-B er viktig for dens sikkerhetsprofil etter oral administrering. Tranylcypromin (en MAO-inhibitor innført for ca. 30 år siden, men deretter trukket tilbake på grunn av sine alvorlige hypertensive bivirkninger), i motsetning til selegilin, er en ikke-selektiv inhibitor for MAO. Den akutte toksisitet av tranylcypromin kommer fra inhibering av MAO-A som interfererer med metabolismen av tyramin. Tyramin blir normalt metabolisert i mage/tarmkanalen av MAO-A, men når MAO-A blir inhibert blir tyraminabsorpsjonen øket etter inntaket av tyraminholdige matvarer så som ost, øl, sild osv. Dette fører til frigiving av katekolaminer som kan utløse en hypertensiv krise og fremkalle «oste-effekten». Denne effekt karakteriseres av Goodman og Gilman som den mest alvorlige toksiske effekt i forbindelse med MAO-A inhibitorer.

En av metabolittene til selegilin er dens N-desmetylanalog. Strukturelt vil desmetylselegilinmetabolitten være den R(-) enantiomere form av et sekundært amin med formelen:

Tidligere var desmetylselegilin ikke kjent for å ha farmasøytisk anvendelige MAO-relaterte effekter, kraftige og selektive inhibitoriske virkninger på MAO-B. Under bestemmelse av anvendeligheten av desmetylselegilin for formålet med den foreliggende oppfinnelse, ble de MAO-relaterte effekter av desmetylselegilin mere fullstendig karakterisert. Denne karakterisering har fastslått at desmetylselegilin har svært svake MAO-B inhibitoriske virkninger, og ingen fordeler i selektivitet med hensyn til MAO-B sammenlignet med selegilin.

Den foreliggende karakterisering etablerte for eksempel at selegilin har en IC50 - verdi mot MAO-B i humane blodplater på 5 x 10"<9> molar, mens IC50 -verdien for desmetylselegilin er 4 x 10~7 molar, hvilket indikerer at sistnevnte er ca. 80 ganger mindre potent som MAO-B inhibitor enn førstnevnte. Lignende karakteristikker kan sees i de følgende data som måler inhibering av MAO-B og MAO-A i rotte-cortex mitokondrierike fraksjoner:

Som det fremgår fra tabellen ovenfor er selegilin ca. 128 ganger mere potent som inhibitor for MAO-B i forhold til MAO-A, mens desmetylselegilin er bare 97 ganger mere potent som inhibitor for MAO-B i forhold til MAO-A. Følgelig synes desmetylselegilin å ha en ca. like høy selektivitet for MAO-B sammenlignet med MAO-A som selegilin, riktignok med en betydelig redusert potens.

Tilsvarende resultater oppnås i rottehjernevev. Selegilin har en IC50 -verdi for MAO-B på 0,11 x 10"<7> molar, mens ICso-verdien for desmetylselegilin er 7,3 x 10"7 molar, hvilket indikerer at desmetylselegilin er ca. 70 ganger mindre potent som MAO-B inhibitor enn selegilin. Begge forbindelser har lav potens for inhibering av MAO-A i rottehjernevev, 0,18 x 10"<5> for selegilin, 7,0 x 10"5 for desmetylselegilin. Desmetylselegilin er således ca. 39 ganger mindre potent enn selegilin for inhibering av MAO-A.

Basert på dens farmakologiske profil som fremsatt ovenfor, vil desmetylselegilin som MAO-B inhibitor ikke gi noen fordeler hverken i potens eller selektivitet sammenlignet med selegilin. Tvert imot antyder disse in vitro data ovenfor at anvendelse av desmetylselegilin som MAO-B inhibitor størrelsesordenmessig krever 70 ganger mengden av selegilin.

Potensen av desmetylselegilin som MAO-B inhibitor in vivo er blitt rapportert av Heinonen, E.H., et al. («Desmethylselegiline, a metabolite of selegiline, is an irreversible inhibitor of MAO-B in human subjects,» referert i akademisk avhandling «Selegiline in the Treatment of Parkinson's Disease» fra forskningsrapporter fra Department of Neurology, Universitetet i Turku, Turku, Finland, nr. 33 (1995), sidene 59-61). Ifølge Heinonen vil desmetylselegilin in vivo ha bare ca. en femdel av den MAO-B inhibitoriske effekt som selegilin, dvs. at en dose på 10 mg desmetylselegilin ville være nødvendig for den samme MAO-B virkning som 1,8 mg selegilin.

De forskjellige sykdommer og tilstander som selegilin er kjent for å være anvendelige for, inkluderer: Depresjon, (US-patent 4,861,800); Alzheimers sykdom og Parkinsons sykdom, spesielt ved anvendelse av transdermale doseringsformer, innbefattet salver, kremer og plastere; makulær degenerasjon (US-patent 5,242,950); aldersavhengig degenerasjon, innbefattet nyrefunksjon og kognitiv funksjon som kommer til syne ved romlig læreevne (US-patent 5,151,449); hypofyseavhengig Cushings sykdom (US-patent 5,192,808); immunsystemdysfunksjon (US-patent 5,276,057); og schizofreni (US-patent 5,151,419). PCT-publisert søknad WO 92/17169 beskriver anvendelse av selegilin ved behandling av neuromuskulær og neurodegenerativ sykdom og ved behandling av CNS-skade på grunn av hypoksi, hypoglykemi, ischemisk slag eller trauma.

Selv om selegilin er kjent for å være effektiv ved behandling av de foran nevnte tilstander, kjenner man ikke hverken det presise antall eller karakteren av dens virkningsmekanisme eller mekanismer. Det er imidlertid evidens for at selegilin tilveiebringer neurobeskyttelse eller neuronal redning, muligens ved å redusere oksydativ neuronal skade, ved å øke mengden av enzymet superoksiddismutase, og/eller redusere dopaminkatabolismen. PCT-publisert søknad W092/17169 rapporterer for eksempel at selegilin virker ved direkte å holde ved like, forebygge tap av, og/eller assistere ved nervefunksjonen hos dyr.

De biokjemiske virkninger av selegilin på neuronale celler er blitt inngående studert. Se for eksempel Tatton et al. «Selegiline Can Mediate Neuronal Rescue Rather than Neuronal Protection.» Movement Disorders 8 (Supp 1):S20-S30 (1993); Tatton et al., «Rescue of Dying Neurons,» J. Neurosci. Res. 30:666-672 (1991); og Tatton et al. «(-)-Deprenyl Prevents Mitochondrial Depotarization and Reduces Cell Death in Trophically-Deprived Cells,» 11th lnt'l Symp. on Parkinson's Disease, Roma, Italia, 26.-30.mars 1994.

Selegilin er kjent for å være anvendelig når det administreres til et individ ved en rekke forskjellige administreirngsveier og doseringsformer. US-patent 4,812,481 (Degussa AG) beskriver for eksempel samtidig anvendelse av selegilin og amantadin i orale, perorale, enterale, pulmonare, rektale, nasale, vaginale, linguale, intravenøse, intraarterielle, intrakardiale, intramuskulære, intraperitoneale, intrakutane og subkutane formuleringer. US-patent 5,192,550 (Alza Corporation) beskriver en doseringsform omfattende en ytre vegg som er ugjennomtrengelig for selegilin, men gjennomtrengelig for ytre fluider. Denne doseringsform kan ha anvendbarhet for den orale, sublinguale eller via kinnet administrering av selegilin. På lignende måte beskriver US-patent 5,387,615 flere forskjellige selegilinblandinger, innbefattet tabletter, piller, kapsler, pulvere, aerosoler, stikkpiller, hudplastere, parenterale medikamenter og orale væsker, innbefattet olje/vann-suspensjoner, løsninger og emulsjoner. Også beskrevet er selegilinholdige formuleringer og anordninger med forsinket frigiving langtidsvirkende.

I tillegg til desmetylselegilin frembringer selegilin en annen direkte hoved-metabolitt, metamfetamin. Både desmetylselegilin og metamfetamin metaboliseres videre til amfetamin. De siste to metabolitter, amfetamin og metamfetamin, er kjent for å ha muligheten for å frembringe neurotoksiske virkninger på dopaminneuroner, og er uønskede biprodukter. I motsetning til selegilin vil desmetylselegilin ikke frembringe metamfetamin som metabolitt, bare amfetamin.

Selv om den er en svært potent og selektiv MAO-B inhibitor, vil den praktiske anvendelse av selegilin følgelig være begrenset ved dens doseavhengige spesifisitet for MAO-B, og av farmakologien til selegilinmetabolitter dannet etter administrering.

Den foreliggende oppfinnelse angår den overraskende oppdagelse at både desmetylselegilin («DMS» eller «R(-)DMS») og dens enantiomer (ent-desmetylselegilin, forkortet som «Ent-DMS» eller «S(+)DMS») er anvendelige til å tilveiebringe selegilinlignende effekter hos individer, til tross for dramatisk redusert MAO-B inhibitorisk aktivitet og en tilsynelatende mangel på øket selektivitet for MAO-B sammenlignet med selegilin. Det beskrives spesielt den overraskende oppdagelse at desmetylselegilin, ent-desmetylselegilin og deres isomere blandinger tilveiebringer en mer fordelaktig måte til å oppnå selegilinlignende terapeutiske effekter i selegilinresponsive sykdommer eller tilstander.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer spesifikt:

I ett første aspekt en forbindelse kjennetegnet ved at den er S(+)-desmetylselegilin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, for terapeutisk anvendelse. Foretrukne terapeutiske anvendelser er neurobeskyttelse, neuronal redning, gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen. Immunsviktfunksjonen kan eventuelt være AIDS, kreft eller bakterielle eller virale infeksjoner. Forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved behandling av en selegilin responsiv sykdom slik som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse, postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en anvendelse av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for anvendelse ved neurobeskyttelse eller neuronal redning, for gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen, for behandling av en selegilinresponsiv sykdom slik som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD), postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma. Forbindelsen som anvendes kan foretrukket være et hydrokloridsalt.

I et tredje aspekt omfatter foreliggende oppfinnelse et medikament som omfatter som aktiv bestanddel en forbindelse ifølge oppfinnelsen. I en foretrukket utførelse er forbindelse som omfattes av medikamentet i hydrokloridform. Medikamentet i henhold til oppfinnelsen er foretrukket tilpasset systemisk, parenteral, sublingula, buccal, rektal eller trandermal administrering. I ytterligere et aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en anvendelse av forbindelsen R(-)-desmetylselegilin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved neurobeskyttelse eller neuronal redning, for gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen, for behandling av en selegilin responsiv sykdom som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse, postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma.

I foretrukne utførelser av anvendelsen er forbindelsen et hydrokloridsalt og immunsviktfunksjonen er AIDS, kreft eller bakterielle eller virale infeksjoner.

Som anvendt heri skal betegnelsen «selegilinresponsiv sykdom eller tilstand» referere til hvilken som helst av de forskjellige sykdommer eller tilstander hos pattedyr, innbefattet mennesker, som selegilin er kjent for å være anvendelig for. Spesielt skal en «selegilinresponsiv sykdom eller tilstand» referere til de forskjellige sykdommer eller tilstander beskrevet ovenfor, for eksempel Alzheimers sykdom, kognitiv dysfunksjon, neuronal redning og lignende. På lignende måte skal uttrykket «selegilinlignende terapeutisk effekt» referere til en eller flere av de helsebringende virkninger som utøves av selegilin hos et individ som blir behandlet for en selegilinresponsiv sykdom eller tilstand.

De selegilinresponsive sykdommer eller tilstander som er relatert til neuronal degenerering eller trauma og som gir respons på de foreliggende fremgangsmåter, inkluderer Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse, postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthets syndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi og toksisk neurodegenerering.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelser for gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen ved R(-)DMS eller S(+)DMS. Slik forbedring eller gjenoppretting er blitt rapportert å forekomme når selegilin administreres til dyr. De tilstander eller sykdommer som lar seg behandle, inkluderer aldersavhengig immunsystemdysfunksjon, AIDS, kreft og smittsomme sykdommer.

Avhengig av den spesielle vei som anvendes administreres enten desmetylselegilin eller ent-desmetylselegilin i form av en fri base eller som et fysiologisk akseptabelt ikke-toksisk syreaddisjonssalt. Slike salter inkluderer dem som er avledet fra organiske og uorganiske syrer så som, uten begrensning, saltsyre, hydrogen-bromidsyre, fosforsyre, svovelsyre, metansulfonsyre, eddiksyre, vinsyre, melkesyre, ravsyre, sitronsyre, eplesyre, maleinsyre, sorbinsyre, akontittsyre, salisylsyre, ftalsyre, emboninsyre, enantinsyre og lignende. Anvendelse av salter, spesielt hydroklorider, er spesielt ønskelig når administrasjonsveien anvender vandige løsninger, som for eksempel parenteral administrering; anvendelse av avgitt desmetylselegilin, eller ent-desmetylselegilin, i form av den frie base er spesielt anvendelig for transdermal administrering. Referanse heri til administrering av DMS eller ent-DMS eller blandinger derav vil følgelig omfatte både den frie base og syreaddisjonssaltformene.

Den optimale daglige dose av desmetylselegilin og/eller ent-desmetylselegillin anvendelig for formålet med den foreliggende oppfinnelse, blir bestemt ved fremgangsmåter kjent i teknologien, for eksempel basert på alvorlighetsgraden av den sykdom eller tilstand som behandles, tilstanden til det individ som blir gitt behandling, den ønskede grad av terapeutisk respons, og de samtidige terapier som administreres til pasienten eller dyret. Ordinært vil imidlertid den ansvarlige lege eller veterinær administrere en begynnende dose på minst ca. 0,0015 mg/kg, beregnet på basis av det frie sekundære amin, med anvendelse av progressivt høyere doser avhengig av responsen på terapien. Typisk vil den daglige dose være ca. 0,01 mg/kg og kan strekke seg til ca. 0,5 mg/kg av pasientens legemsvekt (idet alle slike doser igjen blir beregnet på basis av det frie sekundære amin). Disse retningslinjer krever videre at den aktuelle dose blir omhyggelig titrert av den ansvarlige lege eller veterinær avhengig av den individuelle pasientens eller dyrets alder, vekt, kliniske tilstand og observerte respons.

Den daglige dose kan administreres i et enkelt eller multippelt doseringsregime. Doseringsreformen og regimet kan for eksempel tillate en kontinuerlig frigiving av relativt små mengder av den aktive bestanddel fra en enkelt doseringsenhet, så som et transdermalt plaster, i løpet av en eller flere dager. Dette er særlig ønskelig ved behandling av kroniske tilstander så som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og depresjon. Alternativt kan det være ønskelig ved tilstander så som ischemi eller neural skade å administrere en eller flere bestemte doser på en mere direkte systemisk måte så som intravenøst eller ved inhalasjon. I ytterligere andre tilfeller så som glaukom og makulær degenerering, kan det indikeres lokalisert administrering, så som via den intraokutære vei.

Når det gjelder oral administrering beskrives den uventede oppdagelse at den orale anvendelse av desmetylselegilin, og/eller ent-desmetylselegilin, vil være mer effektiv enn oralt selegilin for anvendelse ved flere forskjellige tilstander og sykdommer. Følgelig blir desmetylselegilin og dets enantiomer anvendt oralt hos individer hvor man ikke ville anvende selve selegilinet på grunn av bivirkninger.

Farmasøytiske blandinger inneholdende desmetylselegilin og/eller ent-desmetylselegilin kan fremstilles ifølge konvensjonell teknikk. For eksempel kan preparater for parenteral vei for administrering av desmetylselegilin, for eksempel intramuskulær, intravenøs og intraarteriell vei, anvende sterile isotoniske saltløsninger. Sterile isotoniske løsninger kan også anvendes for intraokulær administrering.

Transdermale doseringsenhetsformer av desmetylselegilin og/eller ent-desmetylselegilin kan fremstilles ved anvendelse av flere forskjellige tidligere beskrevne teknikker (se for eksempel US-patent nr. 4.861.800; 4.868.218, 5.128.145; 5.190.763; og 5.242.950; og EP-A 404807, EP-A 509761 og EP-A 593807). For eksempel kan det anvendes en monolitisk plasterstruktur hvori desmetylselegilin er direkte inkorporert i klebemiddelet, og denne blanding blir støpt fast på en baksidefolie.

Alternativt kan desmetylselegilin, og/eller ent-desmetylselegilin, inkorporeres som et syreaddisjonssalt i et flersjikt plaster som gjennomfører en omdanning av saltet til den frie base, som beskrevet for eksempel i EP-A 593807.

Desmetylselegilin og/eller ent-desmetylselegilin kan også administreres av en anordning som anvender en lyotrop flytende krystallinsk blanding hvori for eksempel 5 til 15% desmetylselegilin blir kombinert med en blanding av flytende og faste poltetylenglykoler, en polymer og et ikke-ionisk tensid, eventuelt med tilsetning av propylenglykol og et emulgeringsmiddel. For ytterligere detaljer angående fremstillingen av slike transdermale preparater kan referanse gjøres til EP-A5509761.

Siden betegnelsen «ent-desmetylselegilin» refererer til den S(+)-isomere form av desmetylselegilin, skal referanse ovenfor til blandinger av selegilin og ent-desmetylselegilin inkludere både racemiske og ikke-rasemiske blandinger av optiske isomerer.

Individer som kan behandles av de foreliggende preparater og anvendelser inkluderer både menneskelige og ikke-menneskelige individer for hvilke selegilinlignende terapeutiske effekter er kjent for å være anvendelige. Følgelig vil blandingene og anvendelsene ovenfor tilveiebringe spesielt anvendelige terapier for pattedyr, spesielt huspattedyr. De foreliggende anvendelser og blandinger anvendes således til behandling av selegilinresponsive sykdommer eller tilstander i hunde- og kattearter.

Vellykket anvendelse av blandingene og anvendelsene ovenfor krever anvendelse av en effektiv mengde av desmetylselegilin, ent-desmetylselegilin eller en blanding derav. Selv om både desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin er dramatisk mindre potente enn selegilin som inhibitorer for MAO, vil anvendelse av disse midler, eller en blanding av disse midler, ikke kreve en forholdsmessig øket dosering for å oppnå en selegilinlignende terapeutisk respons. Overraskende vil doseringer som er nødvendige for å oppnå en selegilinlignende terapeutisk effekt, være av samme størrelsesorden som de kjente doser av selegilin. Fordi både desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin har en mye lavere inhibering av MAO-A ved slike doseringer, vil desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin følgelig gi en betydelig bredere sikkerhetsmargin med hensyn til MAO-A assosiert toksisitet sammenlignet med selegilin. Spesielt vil risikoen for de skadelige effekter av MAO-A inhibering, for eksempel hypertensiv krise, bli minimalisert på grunn av den 40-70 ganger reduserte potens for MAO-A inhibering.

Som beskrevet ovenfor og til tross for sine demonstrerbart underlegne inhibitoriske egenskaper med hensyn til MAO-B inhibering, vil desmetylselegilin og dets enantiomer være signiftkant mer effektive enn selegilin for behandling av selegilinresponsive tilstander, for eksempel tilstander som er resultatet av neuronal degenerering eller neuronal trauma. I denne henseende vil desmetylselegilin og/eller dets enantiomer, i likhet med selegilin selv, være spesielt anvendelige når de administreres på en måte som ikke er avhengig av absorpsjon i den øvre mage/tarmkanal eller annet sted i mage/tarmkanalen. Foretrukne administreringsveier inkluderer den parenterale, lokale, transdermale, intraokulære, bukale, sublinguale, intranasale, vaginale, rektale og inhalasjonsveien.

Desmetylselegilin kan anvendes både i optiske aktive former og i racemisk form, det vil si som blandinger av desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin. Desmetylselegilin, dets enantiomer og blandinger derav fremstilles beleilig ved fremgangsmåter kjent i teknologien, som beskrevet nedenfor i eksempel 1.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1: Effekt av selegilin på neuron overleving. Mesencefaliske kulturer ble fremstilt fra embryoniske 14 dager gamle rotter. Kulturene ble anvendt ved ca. 1,5 millioner celler pr. plate, og ble holdt enten i vekstmedium alene (kontrollkulturer) eller i vekstmedium supplementert med selegilin. På dag 1, 8 og 15, ble cellene immunfarget for tilstedeværelse av tyrosinhydroksylase («TH»). Fylte søyler representerer resultater oppnådd for kulturer holdt i nærvær av 50 (imolar selegilin og åpne søyler representerer resultater for kontrollkulturer. I alle tilfeller uttrykkes resultatene som en prosent av TH-positive celter til stede i kontrollkulturene på dag 1. Forkortelsen «DIV» refererer til «dager in vitro». Asterisker eller stjerner over søylene både i figur 1 og figurene diskutert nedenfor, indikerer et resultat som adskiller seg fra kontrollene i en mengde som er statistisk signifikant, det vil si P<0,05. Figur 2: [<3>H]-dopaminopptak i mesencefaliske celler. Celler dyrket som beskrevet ovenfor for figur 1, ble testet for sitt opptak av merket dopamin, og resultatene er vist i figur 2. Fylte kolonner representerer opptak i celler vedlikeholdt i nærvær av 50 smolar selegilin og åpne søyler representerer opptak i kontrollkulturer. Figur 3: Effekt av selegilin på glutamatreseptoravhengig neuronal celledød. Rotteembryo mesencefaliske celler ble dyrket som beskrevet ovenfor. Etter at kulturene fikk stabilisere seg, ble kulturmediet utvekslet daglig for et tidsrom av 4 dager for å indusere glutamatreseptoravhengig celledød. Avhengig av kulturen inneholdt mediet enten 0,5, 5,0 eller 50 fxmolar selegilin. Etter den siste medium utveksling, ble dyrkete celler immunfarget for tilstedeværelsen av tyrosinhydroksylase. Fra venstre til høyre skal søylene representere resultater for kontroller, 0,5, 5,0 og 50 limolar selegilin. Figur 4: Effekt av selegilin på dopaminopptak i neuronale kulturer. Rotte mesencefaliske celler ble dyrket, og mediet ble utvekslet på daglig basis som diskutert for figur 3. Opptak i cellene av tritiert dopamin ble målt, og resultatene er vist i figuren. Fra venstre til høyre er kolonnene i samme rekkefølge som for figur 3. Figur 5: Effekt av R(-)desmetylselegilin på glutamatreseptoravhengig neuronal celledød. Rotteembryo mesencefaliske kulturer ble fremstilt som beskrevet ovenfor, unntatt at R(-)DMS ble anvendt istedenfor selegilin. På dag 9 ble antallet TH-positive celler i kulturene bestemt. Resultatene er uttrykt som prosent av kontrollen. Fra venstre til høyre viser kolonnene resultater for kontroller, 0,5, 5 og 50 umolar R(-)DMS. Figur 6: Effekt av R(-)desmetylselegilin på dopaminopptak i neuronale kulturer. Cellekulturer ble fremstilt som beskrevet ovenfor for figur 5, og deretter testet for opptak av tritiert dopamin. Resultater for kontroller og for cellene holdt i nærvær av 0,5 limolar, 5^imolar og 50jimolar desmetylselegilin er vist fra venstre til høyre i figuren. Figur 7: Sammenligning av dopaminopptak i mesencefaliske celler inkubert i nærvær av forskjellige monoaminoksydaseinhibitorer. Rotteembryo mesencefaliske celler ble fremstilt som beskrevet for figurene 3-6, og inkubert i nærvær av flere forskjellige monoaminoksydaseinhibitorer. De undersøkte inhibitorer var selegilin; R(-)desmetylselegilin; pargylin; og klorgylin, alle ved konsentrasjoner på 0,5, 5 og 50|^molar. I tillegg ble cellene inkubert i nærvær av glutamatreseptorblokkeren MK-801 ved en konsentrasjon på 10 ^molar. Kulturene ble testet for opptak av tritiert dopamin. Figur 8: Inhibering av neuronalt dopamin neuronalt gjenopptak av deprenyl og enantiomerene av desmetylselegilin. Et in vitro nerveterminalt preparat (synaptosom preparat) ble fremstilt ved anvendelse av friskt rotteneostriatalt vev. Dette ble undersøkt for sin evne til å oppta tritiert dopamin i buffer alene eller i buffer supplementert med forskjellige konsentrasjoner av selegilin, R(-)desmetylselegilin eller S(+)desmetylselegilin. Opptak i nærvær av hver av MAO-inhibitorene ble uttrykt som prosent inhibering i forhold til opptak i nærvær av buffer alene, og resultatene er vist i figur 8. Som angitt i figuren ble diagrammene anvendt til å bestemme ID50-verdien for hvert testmiddel. ID50-verdien for S(+)DMS var 20|j.molar; for selegilin 80 |amolar; og for R(-)DMS ca. 100 umolar. Figur 9: In vivo MAO-B inhibering av marsvin hippocampus. Forskjellige doser av selegilin, R(-)desmetylselegilin og S(+)desmetylselegilin ble injisert daglig i marsvin for et tidsrom av 5 dager. Dyrene ble deretter avlivet, og MAO-B aktiviteten i hippocampusdelen av hjernen ble bestemt. Resultatene ble uttrykt som prosent inhibering i forhold til hippocampus MAO-B aktivitet i kontrolldyr, og er vist i figur 9. Diagrammene ble anvendt til å bestemme ID50-doseringen for hvert middet. ID50-verdien for selegilin var ca. 0,03 mg/kg; og for begge enantiomerene av DMS, ca. 0,3 mg/kg. Figur 10: In vitro interferon («IFN») fremstilling i miltceller fra rotter injisert med selegilin, R(-)DMS eller S(+)DMS. F344 rotter ble injisert ip, daglig i 60 dager med saltløsning, selegilin, R(-)DMS eller S(+)DMS. Alle injiserte rotter var gamle, dvs. mellom 18 og 20 måneder gamle. Etter å ha tillatt en 10 dagers «utvaskings» periode hvori det ikke ble gjort noen injeksjoner, ble rottene avlivet og deres milt fjernet. In vitro fremstillingen av interferon-y fra de stimulerte miltceller (lymfocytter) ble bestemt og sammenlignet med fremstilling fra miltceller (lymfocytter) fra ikke-injiserte gamle rotter og fra unge rotter (3 måneder gamle). Fra venstre til høyre skal søylene reflektere resultater for miltceller fra unge rotter; fra gamle rotter; fra gamle rotter injisert med saltløsning; fra gamle rotter injisert med 0,25 mg/kg selegilin; fra gamle rotter injisert med 1,0 mg/kg av selegilin; fra rotter injisert med 0,025 mg/kg av R(-)DMS; fra rotter injisert med 0,25 mg/kg av R(-)DMS; fra rotter injisert med 1,0 mg/kg av R(-)DMS; og fra rotter injisert med 1,0 mg/kg av S(+)DMS. Den.horisontale linje angir det punkt hvorved IFN-nivået adskiller seg signifikant (P<0,05) fra det nivå som observeres ved anvendelse av miltceller fra unge rotter. Resultatene er uttrykt som enheter pr. ml (u/ml). Figur 11: In vitro IFN fremstilling i miltceller fra gamle rotter. De samme resultater som er vist i figur 10, er gjentatt i figur 11, men uten å inkludere resultatene for miltceller fra unge rotter. «#» indikerer et resultat signifikant forskjellig (P<0,05) fra det som oppnås for miltceller fra gamle rotter injisert med saltløsning. «<*>» indikerer et resultat signifikant forskjellig fra alle grupper, unntatt gamle rotter injisert med 1,0 mg/kg deprenyl. Figur 12: In vitro interleukin-2 fremstilling fra miltceller fra gamle rotter. Rottene ble injisert som beskrevet ovenfor (se figur 10) og fremstillingen av interleukin-2 fra stimulerte miltceller ble bestemt. Rekkefølgen av søyler fra venstre til høyre er den samme som for figur 10. Figur 13: Prosent av rottemiltceller som er IgM-positive. Rottene ble injisert med saltløsning, selegilin, R(-)DMS eller S(+)DMS som beskrevet ovenfor (se figur 10). Milten fra rottene ble analysert for å bestemme den prosent av cellen som var IgM-positive, og resultatene er vist i figuren. Den horisontale linje i figuren tilsvarer den reduksjon i IgM-prosenten som er statistisk signifikant (P<0,05) i forhold til prosenten observert i milt oppnådd fra unge rotter. Søylene er i samme rekkefølge fra venstre til høyre som i figurene 10 og 12. Figur 14: Prosent av rottemiltceller som er CD5 positive. Eksperimentet i figur 13 ble gjentatt, men istedenfor å måle prosenten av celler som er IgM-positive, bestemte man den prosent som er CD5 positive.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den overraskende anvendbarhet av desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin til behandling av selegilinresponsive sykdommer eller tilstander kan delvis henføres til deres kraftige virkning i å forebygge tap av dopaminerge neuroner ved å befordre reparasjon og helbredelse. Ved doser så lave som 0,01 mg/kg, hvorved liten eller ingen MAO-B inhibering vanligvis blir observert, kan det følgelig observeres en reversering i neuronal skade og/eller død. Fordi desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin forebygger tap og lettere gjenopprettelse av nervecellefunksjonen, vil de være av verdi ved en rekke forskjellige neurodegenerative og neuromuskulære sykdommer. I denne henseende vil desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin være betydelige mere potente enn selegilin, som beskrevet mer empirisk i eksemplene nedenfor.

Eksempler

Eksempel 1: Fremstilling av desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin

A. Desmetylselegilin

Desmetylselegilin (betegnet nedenfor som «R(-)DMS») fremstilles ved fremgangsmåter kjent i teknologien. Desmetylselegilin er for eksempel et kjent kjemisk mellomprodukt for fremstilling av selegilin som beskrevet i US-patent nr.

4.925.878. Desmetylselegilin kan fremstilles ved behandling av en løsning av R(+)-2-aminofenylpropan (levoamfetamin);

i et inert organisk løsningsmiddel så som toluen med en ekvimolar mengde av et reaktivt propargylhalogenid så som propargylbromid, Br-CH2-C=CH, ved noe hevet temperatur (70°-90°C). Eventuelt kan omsetningen gjennomføres i nærvær av en syreakseptor så som kaliumkarbonat. Reaksjonsblandingen ekstraheres deretter med vandig syre, for eksempel 5% saltsyre, og ekstraktene gjøres alkaliske. Det ikke-vandige sjikt som danner seg blir fraskilt, for eksempel ved ekstraksjon med benzen, tørket og destillert under redusert trykk.

Alternativt kan propargyleringen gjennomføres i et to-fase system av et løsningsmiddel ikke blandbart med vann, og vandig alkali ved anvendelse av et salt av R(+)-2-aminofenylpropan med en svak syre så som tartratet, analogt med fremstillingen av selegilin som beskrevet i US-patent nr. 4.564.706.

B. Ent-desmetylselegilin

Ent-desmetylselegilin (betegnet nedenfor som «S(+)DMS») fremstilles beleilig fra det enantiomere (S-)-2-aminofenylpropan (dekstroamfetamin), det vil si

ved å følge fremgangsmåtene fremsatt ovenfor for desmetylselegilin.

C. Blandinger av enantiomerer

Blandinger av enantiomere former av desmetylselegilin, innbefattet racemisk desmetylselegilin, fremstilles beleilig fra enantiomere blandinger, innbefattet racemiske blandinger av aminofenylpropan utgangsmateriale ovenfor.

D. Omdanning til syreaddisjonssalter

N-(prop-2-ynyl)-2-aminofenylpropan i enten optisk aktiv eller racemisk form kan omdannes til et fysiologisk akseptabelt ikke-toksisk syreaddisjonssalt ved konvensjonell teknikk, så som behandling med en mineralsyre. For eksempel anvendes hydrogenklorid i isopropanol ved fremstilling av desmetylselegilin-hydroklorid. Enten den frie base eller saltet kan renses ytterligere, igjen ved konvensjonell teknikk så som ved omkrystallisering eller kromatografi.

Eksempel 2: Neuronal overleving målt ved anvendelse av tyrosinhydroksylase

Effekten av desmetylselegilin på neuron overleving kan korreleres til tyrosinhydroksylase, det hastighetsbegrensende enzym i dopaminbiosyntesen. Det gjennomføres analyser ved å bestemme antallet tyrosinhydroksylasepositive celler i dyrkete E-14 embryoniske mesencefaliske celler i løpet av et tidsrom på 7 til 14 dager. Beskyttelse i dette system er blitt observert med flere forskjellige trofiske faktorer innbefattet BDNF, GDNF, EGF og p-FGF.

A. Testmetoder

Timede drektige Sprague-Dawley rotter anvendes til å etablere neuronale kulturer fra embryonisk rottehjerne på den 14. dag av drektigheten. Mesencefalon dissikeres ut uten membrandekkende, og oppsamles i Ca" og Mg" fri balansert saltløsning ved 4°C. Vevsfragmenter dtssosieres i kjemisk definert medium ved forsiktig utgnidning med en pasteurpipette med liten diameter. Cellesuspensjonen flates ut i polyornitinbelagte 35 mm Falcon plastskåler (0,1 mg/ml, Sigma) med en tetthet på 1,5x 10<6> celler/skål. Kulturene holdes ved 37°C i en atmosfære av 10% CO2/90°C luft og 100% relativ fuktighet, og fores to ganger i uken med kjemisk definert medium bestående av MEM/F12 (1:1, Gibco), glukose (33 mmolar), HEPES (15 mmolar), NaHC03 (44,6 mmolar), transferrin (100 mg/ml), insulin (25 mg/ml), putrescin (60 nmolar), natriumselenitt (30 nmolar), progesteron (20 nmolar), og glutamin (2 mmolar). Kontrollcellene fikk ingen ytterligere tilsetninger. Det medium som ble anvendt for andre celler, inkluderte også testsubstans, for eksempel selegilin, ved en eller flere konsentrasjoner.

Kulturene fikseres i 4% paraformaldehyd i 0,1 molar fosfatbuffer (pH 7,4) i 30 minutter i romtemperatur, permeabiliseres med 0,2% Triton X-100 i 30 minutter og inkuberes med et antistoff mot tyrosinhydroksylase (1:1000; Eugene Tech) i 48 timer ved 4°C i nærvær av et blokkeringsserum. De farges deretter ved anvendelse av en peroksydasekoplet avidin-biotin fargekit (Vectastain ABC kit; Vector Labs) med 3',3'-diaminobenzidin som kromagen.

Antallet dopaminerge neuroner i kulturene bestemmes ved å telle cellene som er positivt immunfarget med TH antistoffer. 100 områder (0,5 mm x 0,5 mm) i to tversgående striper over skålens diameter, som representerte 2,5% av det samlede areal, blir tellet ved anvendelse av et Nikon invertert mikroskop ved 200 gangers forstørrelse.

B. Resultater

Ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor ble oppnådd følgende resultater:

Eksempel 3: Neuronal overleving målt ved anvendelse av dopaminopptak

I tillegg til å bestemme antallet av TH-positive celler i kultur (se eksempel 2) kan den beskyttende effekt av desmetylselegilin på neuronale celler også bestemmes ved direkte å måle dopaminopptaket. Mengden av opptak av de dyrkete hjerneceller tilsvarer aksonalveksten.

A. Testmetoder

Cellekulturer, etablert på måten beskrevet ovenfor, blir inkubert med [<3>H]dopamin (0,5 mCi/ml; 37 Ci/mmol; New England Nuclear) i 15 minutter i nærvær av askorbinsyre (0,2 mg/ml) i PBS (pH 7,3), supplementert med 0,9 mmolar CaCI2 og 0,5 mmolar MgCb ved 37°C. Etter to skyllinger og 5 minutter inkubering med frisk buffer, blir [<3>H]dopamin akkumulert inne i cellene frigitt ved inkubering av kulturene med 95% etanol i 30 minutter ved 37°C. Preparatene blir deretter tilsatt til 10 ml Ecoscint (National Diagnostics) og tellet i et scintillasjonsspektrometer. Det oppnås ikke spesifikke opptaksverdier ved å blokkere dopaminerkt neuronalt opptak med 10 mmolar mazindol.

B. Resultater

Ved anvendelse av fremgangsmåten ovenfor ble oppnådd resultatene vist i tabell 3.

C. Konklusjoner fra eksemplene 2 og 3

Resultatene beskrevet i eksemplene 2 og 3 indikerer at desmetylselegilin er overlegent i forhold til selegilin som neurobeskyttelsesmiddel. Dette er korrekt til tross for det faktum at desmetylselegilin er mye mindre potent enn selegilin som inhibitor for

MAO-B.

Eksempel 4: Neurobeskyttende virkning av desmetylselegilin-enantiomerer i

dyrkete dopaminholdige mesencefaliske neuroner in vitro

Overlevingen av mesencefaliske dopaminholdige neuronale kulturer av rottehjernevev ble anvendt til disse eksperimenter for å undersøke de neurobeskyttende egenskaper av selegilin og R(-)desmetylselegilin. Antallet TH-positive neuroner er direkte proporsjonalt med overlevingen av dopaminenerge neuroner, og <3>H-dopaminopptaket er et mål på aksonal vekst i disse neuroner.

A. Effekt av selegilin på overlevingen av dopaminerge neuroner

Mesencefaliske kulturer fremstilt fra embryoniske dag 14 rotter ble behandlet med 0,5, 5 eller 50 nmolar selegilin i 15 dager, begynnende på dagen for utplating.

(For en mer detaljert beskrivelse av dyrkingen av celler og andre fremgangsmåter anvendt i disse eksperimenter se Mytilineou et al., J. Neurochem. 61:1470-1478

(1993). Overleving og vekst av dopaminneuroner ble evaluert ved tyrosinhydroksylase (TH) immunocytokjemi og [<3>H]dopaminopptak, og resultatene er vist i figurene 1 og 2.

Ingen effekt ble observert på neuronoverleving når selegilin ble testet ved konsentrasjoner på 0,5 og 5 nmolar. Ved 50 nmolar reduserte selegilin tapet av TH-positive neuroner ved 8 og 15 dager etter utplating (figur 1) og øket dopaminopptaket etter 15 dager (figur 2). I separate eksperimenter ble det bestemt at forbehandling med 0,5, 5, 50 eller 100 nmolar selegilin ikke ville inhibere opptaket av dopamin under analysebetingeisene anvendt i eksperimentene.

Resultatene indikerer at de oppnådde opptaksverdier reflekterer dopamin neuronoverleving og prosessresultat, og at selegilin har en neurobeskyttende effekt.

B. Effekt av selegilin på glutamatreseptoravhengig celledød

Den neurobeskyttende effekt av selegilin ble også undersøkt ved anvendelse av et eksperimentelt paradigma som forårsaker neuronal celledød som kan blokkeres ved inhibering av glutamatreseptorer. I disse eksperimenter bie cellene platet ut og fikk stabilisere seg i flere dager. Vekstmediet for cellene ble deretter forandret på daglig basis for å indusere celledød som kan forhindres ved blokkering av glutamatreseptorer, for eksempel ved anvendelse av MK-801. Etter 4 dager med daglige mediumforandringer ble kulturene farget for tyrosinhydroksylase og analysert for opptak av tritiert dopamin. Resultatene vist i figurene 3 og 4 understøtter ytterligere den konklusjon at selegilin formidler overleving av dopaminerge neuroner.

C. Effekt av desmetylselegilin på overleving av dopaminneuroner

Ved anvendelse av den glutamatreseptoravhengige modell for neurondød ble det fremskaffet en enda mere kraftig beskyttelse av dopaminerge neuroner når desmetylselegilin ble anvendt istedenfor selegilin. Endog ved den laveste testede dose (0,5 nmolar), forårsaket desmetylselegilin en signifikant reduksjon i tapet av TH-positive neuroner (figur 5) og en signifikant økning i dopaminopptaket (figur 6) i forhold til kontrollkulturer hvori mediet ble anvendt uten supplementering med enten selegilin eller desmetylselegilin.

D. Sammenligning med andre MAO-inhibitorer

Ved anvendelse av det glutamatreseptoravhengige paradigma for neuro-toksisitet, ble effekten av selegilin og desmetylselegilin sammenlignet med to andre MOA-inhibitorer, pargylin og klorgylin (figur 7). I overensstemmelse med tidligere resultater kunne måling av dopaminopptaket indikere neuronbeskyttelse ved 50 ^molar deprenyl og 5 og 50 nmolar desmetylselegilin. Pargylin syntes ikke å gi noen beskyttelse ved de anvendte konsentrasjoner, mens klorgylin beskyttet ved 50 nmolar. Som ventet ble det også oppnådd beskyttelse ved NMDA-reseptorblokkeren MK-801 (10 nmolar).

E. Effekt av DMS-enantiomerer på 3H-dopaminopptaket

Data sammenfattet i tabell 4 antyder at både R(-)DMS og S(+)DMS er effektive som neurobeskyttelsesmidler i mesencefaliske dopaminholdige neuroner i kultur.

Disse resultater viser at, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, var det 40% og 134% mere aksonal vekst og terminal aksonal overleving etter behandling med henholdsvis R(-)DMS og S(+)DMS. S(+)DMS kan således være en enda mere potent og/eller effektiv neurobeskytter enn R(-)DMS.

Eksempel 5: Desmetylselegilin og ent-desmetylselegilin som inhibitorer for dopamingjenopptak

De biologiske virkninger av hjerneneurotransmitteren dopamin blir avsluttet ved synapsen med en høyaffinitet, natrium og energiavhengig transportsystem (neuronalt gjenopptak) tilstede innenfor den begrensende membran av den presynaptiske dopaminholdige nerveterminal. Inhibering av denne transportmekanisme ville forlenge virkningene av dopamin i synapsen, og derfor øke den synaptiske transmisjon av dopamin.

A. Fremgangsmåte for testing

R(-) og S(+) enantiomerene av desmetylselegilin (DMS) ble testet for sin evne til å inhibere dopamingjenopptakssystemet og sammenlignet med selegilin. Inhibitorisk aktivitet i denne analyse er en indikasjon på midler av verdi ved behandlingen av sykdommer som krever forbedret synaptisk dopaminaktivitet. For tiden vil dette inkludere Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og oppmerksomhetssvikt hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD); Attention Deficit Hyperactivity Disorder.

Det anvendte analysesystem var i alt vesentlig som beskrevet av Fang et al.

(Neuropharmacology 33:763-768 (1994)). Et in vitro nerveterminalt preparat (synaptosom preparat) ble oppnådd fra frisk rotteneostriatalt hjernevev. Transport ved dopamin nerveender ble anslått ved å måle opptaket av tritiert dopamin.

B. Resultater

Som det kan sees i de data som er presentert i tabell 5, inhiberte selegilin, R(-)DMS og S(+)DMS alle dopamingjenopptak av dopaminholdige nerveender. Selegilin og R(-)DMS var omtrent like potente. S(+)DMS var derimot 4-5 ganger mere potent enn både selegilin og R(-)DMS.

Relativ potens kan uttrykkes i form av den konsentrasjon som er nødvendig for å inhibere dopamingjenopptak med 50% (ID50). ID5o-verdiene ble bestemt grafisk (se figur 8) og er vist nedenfor i tabell 6.

C. Konklusjoner

Resultatene viser at ved den hensiktsmessige konsentrasjon vil selegilinog hver av enantiomerene av DMS inhibere transport av frigitt dopamin i den neuronale synapse, og øke den relative aktivitet av denne neurotransmitter i synapsen. I denne henseende er S(+)DMS mere potent enn selegilin, som i sin tur er mere potent enn R(-)DMS. Denne effekt er en indikasjon på midler som er gunstige ved behandling av Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og oppmerksomhetssvikt hyperaktivitetsforstyrrelse ADHD: Attention Deficit Hyperactivity Disorder. Av de testede midler synes S(+)DMS å være det mest foretrukne med hensyn til behandling av ADHD.

Eksempel 6: Virkningen av R(-) og S(+) enantiomerene av desmetylselegilin (DMS) på

human blodplate MAO-B og marsvinhjerne MAO-B og MAO-A aktivitet Human blodplate MAO omfattes eksklusivt av type B isoformen av enzymet. I det foreliggende studium bestemte man inhiberingen av dette enzym med de to enantiomerer av DMS, og sammenlignet med inhiberingen som skyldes selegilin. I tillegg undersøkte det foreliggende studium de to enantiomerer av DMS for inhibitorisk aktivitet med hensyn til MAO-A og MAO-B i marsvin hippocampalt vev. Marsvinhjernevev er den beste dyremodell for studium av hjerne dopamin-metabolismen, enzymkinetikken av de mange former av MAO og de inhibitoriske egenskaper av nye midler som virker sammen med disse enzymer. De mange former av MAO i denne dyreart har identiske kinetiske egenskaper med dem som finnes i humant hjernevev. Endelige ble det injisert midler i marsvin for å bestemme i hvilken utstrekning de kan virke som inhibitorer av hjerne MAO in vivo.

B. Fremgangsmåte for testing:

Testsystemet anvendte in vitro omdanning av spesifikke substrater av MAO-A (<14>C-serotonin) og MAO-B (uC-fenyletylamin) ved humane blodplater og/eller marsvin hippocampale homogenater. Omdanningshastigheten av hvert substrat ble målt i nærvær av S(+)DMS, R(-)DMS eller selegilin, og sammenlignet med isozymaktiviteten i fravær av disse midler. Prosent inhibering ble beregnet utifrå disse verdier. Potensen ble evaluert ved å sammenligne den konsentrasjon av hvert middel som forårsaket en 50% inhibering (IC50-verdi).

I noen eksperimenter ble R(-)DMS, S(+)DMS eller selegilin administrert in vivo subkutant (s.c), en gang om dagen i 5 dager før avliving, fremstilling av enzym hippocampale homogenater, og in vitro analysen av MAO-A og MAO-B aktivitet. Disse eksperimenter ble gjennomført for å vise at DMS enantiomerene var i stand til å komme inn i hjernevevet og inhibere MAO aktiviteten.

C. Resultater

MAO-B inhibitorisk aktivitet in vitro

Resultater for MAO-B inhibering er vist i tabellene 7 og 8. ICso-verdier for MAO-B inhibering og potens sammenlignet med selegilin er vist i tabell 9.

Som observert var R{-)DMS 20-35 ganger mere potent en S(+)DMS som MAO-B inhibitor og begge enantiomerer var mindre potente enn selegilin.

MAO- A inhibitorisk aktivitet

Resultater oppnådd fra eksperimenter som undersøkte inhibering av MAO-A i marsvin hippocampus er sammenfattet i tabell 10, og ICso-verdier for de to enantiomerer av DMS og for selegilin er vist i tabell 11.

() potens sammenlignet med selegilin.

R(-)DMS var to ganger så potent som S(+)DMS som en MAO-A inhibitor, og begge var 20-40 ganger mindre potent enn selegilin. Dessuten var hvert av disse midler 2-3 størrelsesordener, dvs. 100 til 1000 ganger, mindre potente som inhibitorer av MAO-A enn inhibitorer av MAO-B i hippocampalt hjernevev. Selegilin og hver enantiomer av DMS kan derfor klassifiseres som selektive MAO-B inhibitorer i hjernevev.

Resultater av in vivo eksperimenter

Hver enantiomer av DMS ble administrert in vivo ved subkutan injeksjon en gang om dagen for fem påhverandre følgende dager, og inhibering av hjernen MAO-B aktivitet ble deretter bestemt. Under disse betingelser var R(-)DMS og S(+)DMS like potente som MAO-B inhibitorer, men ti ganger mindre potente enn selegilin. Resultater er vist i figur 9 og IC50 -verdier er sammenfattet i tabell 12.

Dette eksperiment viser at hver av enantiomerene av DMS vil trenge gjennom blod/hjernebarrieren og inhibere hjerne MAO-B etter parenteral in vivo administrering. Det demonstrerer også at potensforskjellene som MAO-B inhibitor observert in vitro mellom hver av DMS enantiomerene og selegilin, blir redusert under in vivo betingelser. Doseringene administrert i dette eksperiment var ikke tilstrekkelig til å inhibere MAO-A aktiviteten.

D. Konklusjoner:

R(-)DMS og S(+)DMS demonstrerer begge aktivitet som MAO-B og MAO-A inhibitorer. Hver enantiomer var selektiv for MAO-B. S(+)DMS var generelt mindre potent enn R(-)DMS, og begge enantiomerer av DMS var mindre potente enn selegilin tii å inhibere både MAO-A og MAO-B. Begge enantiomerer demonstrerte aktivitet etter in vivo administrering, hvilket indikerer at disse enantiomerer er i stand til å komme inn i hjernevev etter parenteral administrering. Disse midlers evne til å inhibere MAO-A eller MAO-B antyder at disse midler er av verdi som terapeutiske midler for Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller depresjon.

Eksempel 7: In vivo neurobeskyttelse ved enantiomerene av desmetylselegilin

Evnen til enantiomerene av DMS til å forebygge neurologisk forringelse ble undersøkt ved å administrere midlene til wobbler musen, en dyremodell for motor-neuronsykdommer, spesielt amyotrof lateral sklerose (ALS). Wobbler mus viser progressiv forverring av svakhet i forlemmene, forstyrrelser av ganglaget og bøyningssammentrekninger av musklene i forlemmene.

B. Testfremgangsmåte

R(-)DMS, S(+)DMS eller placebo ble administrert til wobbler-mus ved daglig intraperitoneal injeksjon i et tidsrom på 30 dager i en randomisert, dobbelt-blind studie. Ved slutten av denne tid ble musene undersøkt for gripestyrke, løpetid, hvilende bevegelsesaktivitet, og gradert for halvkvantitative abnormaliteter i pote-stillingen og halvkvantitative abnormaliteter ved gangen. Forskerene som fremstilte og som injiserte løsningene til dyrene og som analyserte adferdsforandringene, var forskjellige.

Analyser og gradering ble utført i alt vesentlig som beskrevet hos Mitsumoto et al., Ann. Neurol. 36:142-148 (1994). Gripestyrken i forpotene til en mus ble bestemt ved å la dyret gripe en tråd med begge poter. Tråden var forbundet med et gr dynamometer, og et drag ble anbragt på musens hale inntil dyret ble tvunget til å gi slipp på tråden. Avlesningen på dynamometeret i frigivingspunktet blir tatt som et mål på gripestyrken. Løpetiden defineres som den korteste tid som er nødvendig for å løpe en angitt avstand, foreksempel 2,5 fot, og den beste tid av flere forsøk blir registrert.

Abnormaliteter i pote-stilling graderes på en skala basert på graden av sammentrekning, og abnormaliteter i gangen blir gradert på en skala i området av normal gange til manglende evne t il å holde kroppen oppe ved anvendelse av potene.

Bevegelsesaktiviteten bestemmes ved overføring av dyrene til et under-søkelsesområde hvor gulvet er dekket med kvadratisk netting. Aktiviteten måles ved antallet kvadrater som passeres av en mus i et angitt tidsintervall, for eksempel 9 minutter.

C. Resultater

Ved begynnelsen av studien var ingen av gruppene forskjellige i noen av variablene, hvilket indikerer at de tre grupper var sammenlignbare på basislinjen. Vektforøkelsen var identisk i alle tre grupper, hvilket antyder at ingen vesentlige bivirkninger forekom i noen av dyrene. Tabell 13 sammenfatter forskjellene som ble observert i den gjennomsnittlige gripestyrke av forsøksdyrene:

Gripestyrken sank markert ved slutten av den første uke i alle dyr. Ved slutten av studiet var gripestyrken minst i kontrolldyrene, i området fra 0-15 gr, med et gjennomsnitt på 9 gr. R(-) gruppen hadde en gjennomsnittlig gripestyrke på 20 gr med verdier i området fra 0-63 gr. Den tredje gruppen, injisert med S(+)DMS hadde en gjennomsnittlig gripestyrke på 14 gr, med enkeltverdier fra 7 til 20 gr. Selv om variabiliteten i gripestyrken i de behandlende dyregrupper var til hinder for en meningsfull statistisk analyse av disse data, var den gjennomsnittlige gripestyrke målt i de DMS-behandlende dyr, høyere enn for kontrollene.

Løpetid, hvilende bevegelsesaktivitet, halvkvantitativ abnormalitetsgradering av potestilling, og halvkvantitativ abnormalitetsgradering av gangen ble også testet. Ingen av disse tester ga imidlertid data som antyder at noen av disse tre grupper adskiller seg fra de andre.

Eksempel 8: Immunsystemgjenoppretting ved R(-)DMS og S(+)DMS

Dette er en aidersrelatert svekkelse i immunologisk funksjon som forekommer i dyr og mennesker, og som gjør eldre individer mere mottagelige for smittsom sykdom og kreft. US-patentene 5.276.057 og 5.387.615 antyder at selegilin er anvendelig ved behandling av immunsystemdysfunksjon. De foreliggende eksperimenter ble foretatt for å bestemme hvorvidt R(-)DMS og S(+) også er anvendelige ved behandling av slik dysfunksjon. Det skal anerkjennes at en evne til å forsterke pasientens normale immunologiske forsvar ville være gunstig ved behandling av en rekke forskjellige akutte og kroniske sykdommer innbefattet kreft, AIDS og både bakteriell- og virusinfeksjon.

A. Testfremgangsmåte

De foreliggende eksperimenter anvendte en rottemodell for å undersøke evnen til R(-)DMS og S(+)DMS til å gjenopprette immunologisk funksjon. Rottene ble oppdelt i følgende eksperimentelle grupper;

1) unge rotter (3 mnd gamle, ikke injisert)

2) gamle rotter (18-20 mnd gamle, ikke injisert)

3) gamle rotter injisert med saltløsning

4) gamle rotter injisert med selegilin ved en dosering på 0,25 mg/kg kroppsvekt; 5) gamle rotter injisert med selegilin ved en dosering pål ,0 mg/kg kroppsvekt; 6) gamle rotter injisert med R(-)DMS ved en dosering på 0,025 mg/kg kroppsvekt; 7) gamle rotter injisert med R(-)DMS ved en dosering på 0,25 mg/kg kroppsvekt; 8) gamle rotter injisert med R(-)DMS ved en dosering på 1,0 mg/kg kroppsvekt; 9) gamle rotter injisert med S(+)DMS ved en dosering på 1,0 mg/kg

kroppsvekt.

Rottene ble injisert ip, daglig i 60 dager. De ble deretter holdt i en ytterligere «utvaskings-» periode på 10 dager, hvorunder ingen injeksjoner ble gitt. Ved slutten av denne tid ble dyrene avlivet og deres milt ble fjernet. Miltcellene ble deretter analysert for flere forskjellige faktorer som er indikative for immunsystemfunksjonen. Spesifikt ble standardtester anvendt for å bestemme følgende; 1) in vitro fremstilling av y-interferon i miltceller; 2) in vitro fremstilling av interleukin-2; 3) prosent av IgM-positive miltceller (IgM er markør for B-lymfocytter);

4) prosent av CD5-positive miltceller (CD5 er markør for T-lymfocytter).

B. Resultater

Effekten av injeksjoner av selegilin, R(-)DMS og S(+)DMS på interferonfremstilling ved rotte-miltceller er vist i figurene 10 og 11. Som vist i figur 10 er det en skarp nedgang i cellulær interferonfremstilling som forekommer med alder (sammenlign fremstilling ved celler fra unge dyr med fremstilling med celler fra gamle dyr eller fra gamle dyr injisert med saltløsning). Injeksjoner av selegilin, R(-)DMS og S(+)DMS førte alle til en delvis gjenoppretting av y-interferonnivået, med den mest dramatiske økning ved doseringer på 1,0 mg/kg kroppsvekt.

De samme data som vist i figur 10 er gjentatt i figur 11, unntatt at resultater for celler fra unge rotter er utelatt. Figuren viser mere klart den utstrekning i hvilken deprenyl, R(-)DMS og S(+)DMS er i stand til å gjenopprette y-interferonfremstillingen i miltcellene hos gamle rotter. Interferon-y er et multifunksjonelt protein som inhiberer virusreplikasjon, og regulerer flere forskjellige immunologiske funksjoner. Det påvirker klassen av antistoffer fremstilt av B-celler, oppregulerer klasse I og klasse II MHC kompleks antigener og øker effektiviteten av makrofagformidlet avliving av intracellulære parasitter.

Figur 12 viser effektene av injeksjoner på fremstilling av interleukin-2 i rotte-miltceller. Det kan observeres at både R(-)DMS og S(+)DMS er i stand til å gjenopprette fremstillingen til et nivå som observeres i celler fra unge dyr.

Effekten av injeksjoner på prosenten av miltceller som er IgM-positive, er vist i figur 13. Det ble funnet at både selegilin og R(-)DMS delvis gjenopprettet i IgM-positive celler til et nivå nærmere det som observeres i milten hos unge rotter. Det synes således at disse midler vil gjenopprette B-lymfocytt celletall.

Figur 14 antyder at injeksjon av enten 0,025 mg/kg av R(-)DMS eller S(+)DMS kan ha svakt øket prosenten av CD5 positive celler i miltene oppnådd fra gamle rotter. Hverken injeksjoner med selegilin eller med 0,25 eller 1,0 mg/kg av R(-)DMS syntes imidlertid å ha noen effekt.

C. Konklusjoner

Resultatene understøtter generelt den konklusjon at enantiomerene av DMS etterligner effektene av selegilin og immunsystemfunksjonen. Resultatene oppnådd med hensyn til fremstillingen av interferon IL-2 og på prosenten av IgM-positive miltceller understøtter dessuten den konklusjon at DMS enantiomerene er i stand til i det minst delvis å gjenopprette det aldersavhengige tap av immunsystemfunksjonen. Det synes således at R(-)DMS og S(+)DMS vil ha en terapeutisk gunstig effekt for sykdommer og tilstander forårsaket av nedsatt vertsimmunitet. Dette ville inkludere kreft, AIDS og smittsomme sykdommer av alle typer.

Eksempel 9: Eksempler på doseringsformer

A. Desmetylselegilinplaster

De to bestanddeler blir inngående blandet og støpt på en Scotchpak<®> 9723 polyester filmbaksidefolie og tørket. Baksidefolien kappes deretter til plastere, det påføres en Scotchpak<®> 1022 fluorpolymer slippeforing, og plastere forsegles hermetisk i metallfoliekonvolutter. Et plaster påføres daglig for å levere 1-5 mg av desmetylselegilin pr. 24 timer ved behandling av tilstander i et menneske frembragt ved neuronal degenerering eller neuronalt trauma som for eksempel Parkinsons sykdom.

B. Øyeløsning

Desmetylselegilin (0,1 g) som hydrokloridet, 1,9 borsyre og 0,004 gr av fenyl-kvikksølv II nitrat blir løst i sterilt vann qs 100 ml. Blandingen steriliseres og forsegles. Den kan anvendes oftalmologisk i behandling av tilstander frembragt ved neuronal degenerering eller neuronalt trauma som for eksempl optisk neuropati ved grønn stær og makulær degenering.

Eksempel 3: Intravenøs løsning

En 1% løsning fremstilles ved å løse 1 gr desmetylselegilin som hydrokloridet i tilstrekkelig 0,9% isotonisk saltløsning for å gi et sluttvolum på 100 ml. Løsningen blir bufferet til pH 4 med sitronsyre, forseglet og sterilisert for å tilveiebringe en 1% løsning passende for intravenøs administrering ved behandling av tilstander frembragt ved neuronal degenerering eller neuronalt trauma.

C. Transdermalt plaster

Et selvtverrbindende akrylbasert trykkfølsom klebemiddel blir tilsatt til en løsning av en kopolymer av metakrylsyre og dimetylaminoetylmetakrylat i et organisk løsningsmiddel så som metyletylketon. Dette støpes på en første metallfolie som lar seg fjerne, løsningsmidlene fordampes, og den belagte metallfolie plasseres på et polyester baksidesjikt, som fremsatt i EP-A 593807.

Desmetylselegilin hydroklorid tilsettes til en løsning av ikke-tverrbundet akrylbasert trykkfølsom klebemiddel i et egnet organisk løsningsmiddel, som for eksempel etylacetat. Ytterligere løsningsmidler kan tilsettes, og varme og omrøring kan anvendes for å lette dannelse av dispersjon. Denne blir belagt på en andre metallfolie som lar seg fjerne, og løsningsmiddelet fordampet. Etter fjerning av metallfolien fra det tidligere fremstilte polyesterbelagte sjikt, blir den laminert til den belagte andre metallfolie som lar seg fjerne. Ytterligere selvtverrbindende akrylbasert trykkfølsomt klebemiddel og kopolymer av metakrylsyre og dimetylaminoetylmetakrylat i et organisk løsningsmiddel så som metyletylketon blir støpt på en tredje metallfolie som lar seg fjerne, og løsningsmiddelet fordampet. Den andre og tredje metallfolie blir fjernet, de resterende sjikt laminert, og det resulterende laminat skåret til plastere og emballert. De resulterende plastere vil ha en slippeforing som lar seg fjerne, et klebende sjikt som opprinnelig er fritt for desmetylselegilin, og et matrikssjikt inneholdende desmetylselegilin som hydrokloridet eller annet salt. Et ugjennomtrengelig baksidesjikt blir klebet til matrikssjiktet gjennom et mellomliggende klebesjikt i liket med klebesjiktet nærmest til slippeforingen som lar seg fjerne. Et plaster påføres daglig for å levere desmetylselegilin som den frie base ved behandling av tilstander hos et menneske frembragt ved neuronal degenerering eller neuronalt trauma, som for eksempel Parkinsons sykdom.

D. Oral doseringsform

Tabletter og kapsler inneholdende desmetylselegilin fremstilles fra følgende bestanddeler (mg/enhetsdose);

med et forhold på ca. 1:1 av sitronsyre og natriumcitrat.

Claims (19)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den er S(+)-desmetylselegilin eller et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt derav, for terapeutisk anvendelse.

2. Forbindelse ifølge krav 1, for anvendelse ved neurobeskyttelse eller neuronal redning.

3. Forbindelse ifølge krav 1, for anvendelse til gjenoppretting eiler forbedring av immunsystemfunksjonen.

4. Forbindelse ifølge krav 3, hvor immunsviktfunksjonen er AIDS, kreft eller bakterielle eller virale infeksjoner.

5. Forbindelse ifølge krav 1, for anvendelse ved behandling av en selegilinresponsiv sykdom slik som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse, postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardjv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma.

6. Forbindelse ifølge krav 5, for anvendelse ved behandling av Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller depresjon.

7. Forbindelse ifølge krav 5, for anvendelse ved behandling av ischemi eller hypoksi.

8. Forbindelse ifølge krav 5, for anvendelse i behandling av oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD).

9. Forbindelse ifølge ethvert av de foregående krav, som er et hydrokloridsalt.

10. Anvendelse av en forbindelse som definert i krav 1, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved neurobeskyttelse eller neuronal redning, for gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen, for behandling av en selegilinresponsiv sykdom slik som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD), postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor forbindelsen er et hydrokloridsalt.

12. Medikament, karakterisert ved at det som en aktiv bestanddel omfatter en forbindelse som definert i krav 1.

13. Medikament ifølge krav 12, tilpasset for systemisk administrering.

14. Medikament ifølge krav 13, tilpasset for parenteral, sublingual, buccal eller rektal administrering.

15. Medikament ifølge krav 12, tilpasset for transdermal administrasjon.

16. Medikament ifølge krav 12-15, hvor forbindelsen er hydrokloridsaltet.

17. Anvendelse av forbindelsen R(-)-desmetylselegilin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved neurobeskyttelse eller neuronal redning, for gjenoppretting eller forbedring av immunsystemfunksjonen, for behandling av en selegilin responsiv sykdom som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, depresjon, glaukom, makulær degenerasjon, ischemi, diabetisk neuropati, oppmerksomhetssvikt-hyperaktivitetsforstyrrelse, postpolio syndrom, multippel sklerose, impotens, narkolepsi, kronisk tretthetssyndrom, skallethet, senil demens, hypoksi, kognitiv dysfunksjon, negativ symptomatologi ved schizofreni, amyotrof lateral sklerose, Tourettes syndrom, tardiv dyskinesi, toksisk neurodegenerering, aldersavhengig degenerasjon, Cushings sykdom, schizofreni, CNS-skade forårsaket av hypoksi, hypoglykemi og ischemisk slag eller trauma.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor forbindelsen er et hydrokloridsalt.

19. Anvendelse ifølge krav 17, hvor immunsviktfunksjonen er AIDS, kreft eller bakterielle eller virale infeksjoner.