NO319266B1 - Fremgangsmate ved fremstilling og utvinning av proteiner fra pro-proteiner i ett fremgangsmatetrinn samt anvendelse av fremgangsmaten til fremstilling av proteiner. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling og utvinning av proteiner ved kontrollert spaltning av pro-proteiner ved hjelp av en protease, som angitt i krav 1.

Et antall proteiner og enzymer i levende organismer fremstilles ved hjelp av cellulær biosyntese som inaktive versjoner i første trinn (pro-proteiner (forløperproteiner) eller pro-enzymer). Disse inaktive første trinns versjoner blir så ved behov omdannet til deres aktive former, f.eks. ved begrenset proteolysé. Således omdannes protrombin i det menneskelige legeme ved hjelp av protease faktor Xa i en protrombinase-kompleks-reaksjon til trombin. Den inaktive faktor X omdannes f.eks. ved hjelp av protease faktor IXa til aktiv faktor Xa.

Utvinningen av de aktiverte proteiner er av stor interesse såvel innen klinisk anvendelse som diagnostikk. De aktiverte proteiner i ren form kan så anvendes f.eks. ved styring av andre proteolytiske prosesser, såsom blodkoagulering ved hjelp av trombin i kirurgien, til terapi eller diagnose eller ved utvinning av spesifikke antistoffer.

De aktive proteiner kan utvinnes bare i meget begrensede mengder fra levende organismer, såsom f.eks. humant blod. Derfor omdannes pro-proteinene eller pro-enzymene mest in vitro ved innvirkning av egnede proteaser til de aktiverte former. En slik fremgangsmåte er kjent fra EP-0 378 798. Ifølge denne fremgangsmåte adsorberes protrombin fra humant plasma til en fast bærer, og materialet behandles med Ca<2+->ioner for således, sammen med proteasene som foreligger i plasma, å bevirke omdannelsen av protrombin til trombin.

En annen fremgangsmåte er beskrevet i EP-A-0 565 511, hvor pro-proteinet som skal aktiveres, immobiliseres ifølge en foretrukken utførelsesform på en bærer, og derefter blir omdannet til det aktive enzym ved hjelp av en løselig protease. For å kunne kontrollere denne omdannelse, gjennomføres den i nærvær av en detergent eller en kaotrop substans. For utvinning av de aktiverte proteiner kreves det imidlertid ytterligere rensetrinn, spesielt for å skille igjen proteasen.

Ifølge EP-A-0 541 507 omdannes protrombin i løselig form til trombin ved å tilsette koaguleringsaktive salter til en protrombinholdig oppløsning. Derefter renses trombin ytterligere ved hjelp av ioneutbytterkromatografi og/eller affinietskromatografi.

Ifølge EP-A-0 565 512 fremstilles trombin ved hjelp av en 150-minutters behandling av en protrombinholdig oppløsning med immobilisert trypsin. Anvendelsen av proteasen i immobilisert form muliggjør derved en lettere separasjon av proteasen efter aktiveringen.

Ifølge EP-A-0 416 890 aktiveres rekombinant humant protein C (fHPC) ved hjelp av en 2-timers behandling med på glass-perler immobilisert trombin. Separasjonen av aktivert rHPC fra immobilisert trombin skjer ved sentrifugering.

Fra EP-A2-367489 er det kjent protein-komplekser inne-holdende et protein adsorbert på en fast bærer. Proteinet kan være hirudin. Imidlertid har, ved anvendelse av proteaser for aktivering av pro-enzymer eller pro-proteiner, det problem vist seg at proteolyseprosessen ikke ender på trinnet av de aktiverte enzymer. Snarere hydro-lyseres mer og mer peptidbindinger ved proteasen i løpet av reaksjonen, og de aktiverte proteiner spaltes igjen til inaktive 1averemolekulære peptider (Kisiel und Hanahan, 1973, Biochim. Biophys. Acta 329, 221-232). Således er utbyttet i slike fremgangsmåter som kjent liten, og det frembringes f.eks. ved aktivering av protrombin til trombin ved trypsin bare en 50% utbytte (Kisiel und Hanahan, 1973, Biochim. Biophys. Acta 329, 221-232).

Det ble forsøkt, for å forbedre slike fremgangsmåter for akktiveringsreaksjon, å tilsette stabilisatorer såsom albumin eller glycin, for å minske ytterligere nedbrytning av de aktiverte proteiner (Landaburu et al. 1961, Am.J.Physiol. 201, 298-302).

En ytterligere ulempe ved disse fremgangsmåter består imidlertid i at det, selv om langsomt, allikevel finner sted en ytterligere nedbrytning til proteinfragmenter, og det dannes proteinblandinger som dessuten inneholder store mengder tilsetninger såsom detergenter eller glyserol. Det er således nødvendig med kostbare fremgangsmåter for rensning av de aktiverte enzymer.

Proteinfragmenter og detergenter eller kaotrope substanser ble ifølge EP-A-0 565 511 fjernet ved hjelp av relativt kostbare kromatografiske metoder.

Foreliggende oppfinnelse har således den oppgave å til-veiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av proteiner fra pro-proteiner med hvilke det kan oppnås et høyt utbytte av proteiner som på en enkel måte muliggjør en utvinning av proteiner med meget høy spesifikk aktivitet og renhet. Fremgangsmåten skal ikke være begrenset til bestemte utgangsløsninger, men skal kunne anvendes for et omfattende spektrum utgangsløsninger.

Denne oppgave løses ifølge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte for fremstilling og utvinning av proteiner ved kontrollert proteolytisk spaltning av pro-proteiner ved hjelp av en protease, som er karakterisert ved at en pro-proteinholdig oppløsning bringes i kontakt med en protease og en fast bærer som har en høyere affinitet til proteinet enn til pro-proteinet eller dets funksjonelle inaktive nedbrytningsprodukter, idet pro-proteinet spaltes proteolytisk til proteinet og proteinet separeres selektivt ved adsorpsjon til den faste bærer.

Fortrinnsvis anvendes en immobilisert protease. Denne har den fordel at den lett kan separeres fra oppløsningen.

Den pro-proteinholdige oppløsning behandles med proteasen i løpet av en kontaktvarighet som er tilstrekkelig til å frembringe en spaltning av pro-proteinet til protein, hvor det imidlertid i det vesentlige ennå ikke dannes noen ytterligere funksjonelt inaktive nedbrytningsprodukter av proteinet.

Det har vist seg at innvirkningstiden av proteasen på pro-proteinet er en viktig faktor for kvaliteten av proteinet som skal fremstilles, og at overholdelsen av en bestemt kontaktvarighet mellom protease/pro-protein under gitte parametre er viktig for fremstillingen av et bestemt protein. Kontaktvarigheten må velges slik at omdannelsen av pro-proteinet til protein skjer, at en ytterligere uønsket nedbrytning av proteinet ikke lengre kan skje, men at påvirkningen av proteasen på forhånd forhindres.

Kritiske parametre for bestemmelse av den optimale kontaktvarighet er således den anvendte protease, forholdet mellom pro-protein og protease og reaksjonstemperaturen. Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan hver fagmann uten videre bestemme de kritiske parametre samt deres optimering før reaksjonsstart, hvis det ikke allerede skulle være kjent fra teknikkens stand.

Den for fremstilling av et bestemt protein spesifikke kontaktvarighet bestemmes ved enkel variasjon av kontaktvarigheten i separate forsøkssatser. Herved analyseres de erholdte produkter, og derefter defineres den kontaktvarighet som bestemt kontaktvarighet, med hvilken et maksimum av ønsket protein og et minimum av ytterligere nedbrytningsprodukter hhv. ikke spaltet pro-protein kan oppnås.

Denne bestemte kontaktvarighet er selvfølgelig forskjellig fra system (pro-protein/protease) til system, men i mange systemer ligger den på under 24 timer. Som foretrukne påvirkningstider for proteasen har tidsrom på mellom 1 sekund og 24 timer, spesielt mellom 1 sekund og 5 timer, og spesielt foretrukket mellom 1 sekund og 30 minutter, utmerket seg.

For å holde kontaktvarigheten av proteasens påvirkning mest mulig eksakt, og for å forhindre proteinets videre ned- '. brytning, blir proteinet som er dannet ved proteasen, som ytterligere forholdsregel ifølge oppfinnelsen, efter proteasebehandlingen bundet direkte til en bærer som har en høyere affinitet til proteinet enn til pro-proteinet eller dets funksjonelt inaktive nedbrytningsprodukter. Således unngår proteinet en ytterligere påvirkning av proteasen i reaksjonsblandingen, og en ytterligere nedbrytning av proteinet vil ikke lengre finne sted.

Dette kan f.eks. bli mulig når man anbringer affinitets-bæreren for proteinet i den pro-protein- hhv. protease-holdige oppløsning, idet to kromatografiske søyler kobles efter hverandre, idet den (immobiliserte) protease befinner seg i den første søyle og den faste bærer for proteinet befinner seg i den.andre søyle, og eluatet fra den første søyle treffer direkte på innløpet av den andre søyle. Ifølge en foretrukken utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan - i tilfellet at proteasebehandlingen ikke har skjedd kvantitativt - det ikke-spaltede pro-protein som er blitt tilbake i oppløsningen, i en resirkulereringprosess på nytt bringes i kontakt med den (immobiliserte) protease, spaltes, og det dannede protein bindes til den selektive bærer. F.eks. kan dette skje ved å koble utløpet av den andre, selektive bærer med den første, protease-koblede søyle, idet det ikke-bundne pro-protein på nytt blir tilgjengelig for påvirkningen av proteasen. Disse trinn kan gjentas så lenge til hele pro-proteinet i det vesentlige er blitt spaltet til protein. Ved siden av den foretrukne kontinuerlige gjennomføring av proteasebehandlingstrinnet(ne) og adsorpsjonstrinnet(ne) er det naturlig også mulig å gjennomføre fremgangsmåten diskontinuerlig, idet den (immobiliserte) protease og den høy-selektive bærer for det tilsvarende protein befinner seg i én og samme beholder, idet man, når to forskjellige faste bærere kommer til anvendelsle, én av de to faste bærere kan fjernes selektivt (f.eks. ved at enten protease eller protein bindes til en magnetisk overflate eller til et fjernbart innskudd).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan selvfølgelig anvendes for alle protease-formidlede omdannelser av pro-proteiner til proteiner, fortrinnsvis ved fremstilling av enzymer fra pro-enzymer.

Til proteolytisk spaltning av pro-proteiner egner seg et antall proteaser, f.eks. chymotrypsin, dispase, endopep-tidase Arg-C, endoproteinase Lys-C, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Asp-N, faktor Xa, kallikrein, papain, pepsin, plasmin, pronase, proteinase K, staphylokoagulase, serin-proteaser av subtilisin-familien, såsom f.eks. keksin- eller furinartige proteaser, eller subtilisin, trombin, trypsin (spesielt humant, bovint, porcint), trypsinartig protease fra arthropoder eller mikroorga-nismer, såsom f.eks. streptomyces griseus-trypsin eller serin-proteaser fra giftslanger (venom-proteaser), såsom f.eks. protrombin-aktivatorer fra echis carinatus-gift og fra oxyuranus scutellatus-gift; aktivatorene for faktor X og faktor V fra Russel's viper-gift, eller protein C-aktivator Agkistrodon contortrix-gift. Fortrinnsvis anvendes som protease trypsin, chymotrypsin, kallikrein, dispase, endoproteinaser Glu-C, Lys-C eller Asp-N eller faktor Xa. Det kan selvfølgelig også anvendes rekombinante proteaser.

Proteasen blir - som angitt ovenfor - immobilisert fortrinnsvis på en fast bærer slik at proteasen i løselig form på intet tidspunkt kan reagere med pro-proteinet eller det dannede protein. For immobilisering av proteasen egner seg som naturlige eller syntetiske bærere, spesielt cellulose, sepharose, dekstraner, spesielt agarose, akrylater eller silikater.

Ifølge en rutinemessig anvendbar, foretrukken utførel-sesform av oppfinnelsen pakkes den immobiliserte protease (protease-gelen) i en glassøyle og den pro-protein-holdige oppløsning filtreres gjennom protease-gelen. Flytehastigheten velges her slik at den bestemte kontaktvarighet mellom den immobiliserte protease og pro-proteinet holdes.

Det således aktiverte protein adsorberes ifølge denne utførelsesform direkte fra desorpsjonsresten (eluat) på en selektiv bærer. Med henblikk på en målrettet utvinning av det ønskede protein med høy renhet og høyt utbytte, skulle ikke-aktivert pro-protein helst ikke bindes av den spesifikke bærer og løpe uhindret gjennom søylen som inneholder den selektive bærer. For ytterligere aktivering bringes denne pro-protein-holdige fraksjon igjen under den bestemte kontaktvarighet i kontakt med protease-gelen, hvorpå ytterligere protein dannes, som så igjen adsorberes ved hjelp av den selektive bærer fra oppløsningen. På grunn av den kontinuerlige, kontrollerte aktivering på protease-gel og eluering samt den øyeblikkelige adsorpsjon av det aktiverte protein på den selektive andre bærer, omdannes pro-proteinet fullstendig til aktivert protein uten at aktivert protein spaltes ytterligere ved proteasen. Aktivert protein akkumulerer på den selektive bærer og kan derefter elueres fra bæreren.

Spesielt foretrukne proteiner som kan fremstilles med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er funksjonelt aktive blodkoaguleringsenzymer som fremkommer fra de inaktive forstadier av disse enzymer ved proteolytisk nedbrytning. F.eks. kan trombin ifølge oppfinnelsen fremstilles fra protrombin (faktor II), faktor IX fra pro-faktor IX, faktor IXa fra faktor IX, von Willebrand-faktor fra pro-von Willebrand-faktor, faktor Xa fra faktor X, aktivert protein C fra protein C, faktor XHIa fra faktor XIII, faktor Vila fra faktor VII, faktor Villa fra faktor VIII, og faktor Va fra faktor V.

Utgangsoppløsningene (pro-proteinholdige oppløsninger) er ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke begrenset til noen spesielt tilberedte oppløsninger. Foretrukne pro-proteinholdige oppløsninger inneholder imidlertid pro-proteinet i renset form, da således et spesielt rent protein-preparat blir mulig.

Pro-proteinholdige oppløsninger som inneholder pro-proteinet i blandinger med andre proteiner, er imidlertid likeledes egnet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, da forurensede proteiner på grunn av sin høye spesifisitet ikke utgjør noen signifikant forstyrrende faktor for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Fortrinnsvis anvendes således i foreliggende fremgangsmåte pro-proteinholdige oppløsninger av biologisk opprinnelse, spesielt plasma eller av plasma eller plasmafrakjsoner avledete oppløsninger.

Ifølge en ytterligere foretrukken utførelsesform av femgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes bioteknologisk fremstilte pro-proteinholdige oppløsninger, spesielt kulturrester, som er dannet av rekombinante cellekulturer, som utgangsoppløsninger.

Som selektive faste bærere for proteinet som skal fremstilles for adsorpsjon av de aktiverte proteiner, egner seg spesielt på en matrise immobilisert heparin, immobilisert benzamidin, immobilisert hirudin eller av hirudin avledete fragmenter og derivater, forskjellige immobiliserte proteiner eller peptider, spesielt spesifikke immobiliserte antistoffer.

Fra affinitetsbærerne elueres proteinet fortrinnsvis selektivt, slik at eventuelle andre proteiner, som likeledes - selv om i små mengder - skulle bli bundet til bærerne (spesifikt eller uspesifikt), separeres.

Innen rammen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det for inaktivering av eventuelt foreliggende infeksjonsfrem-kallende agenser, spesielt humanpatogene virus, gjen-nomføres ytterligere, generelt fra teknikkens stand kjente virusinaktiverings-forholdsregler.

Ifølge et andre aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelsen av femgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved fremstilling av proteiner fra pro-protein, fortrinnsvis av aktiverte enzymer fra pro-enzymer, spesielt fremstillingen av aktivert faktor II, aktivert faktor V, aktivert faktor VII, aktivert faktor VIII, faktor IX, aktivert faktor IX, aktivert faktor X, aktivert faktor XIII, von Willebrand-faktor og av aktivert protein C.

Den proteinholdige fraksjon som oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, egner seg - på grunn av sin høye renhet og sin høye speifikke aktivitet - på fremragende måte til fremstilling av et farmasøytisk preparat og kan - ut fra det eluerte protein — ved hjelp av de vanlige metoder forarbeides til et slikt farmasøytisk preparat. Farmasøytiske sammensetninger som inneholder et ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilt høy-rent protein, spesielt faktor Ila, faktor Va, faktor Vila, faktor Villa, faktor IX, faktor IXa, faktor Xa, faktor Xllla, aktivert protein C og/eller von Willebrand-faktor, samt eventuelt en eller flere fysiologisk aksepterbare bærere og/eller andre farmasøytiske tilsetningsstoffer kan dannes.

Valget av den selektive faste bærer for det dannede protein er et sentralt punkt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Som spesielt foretukken bærer har immobilisert hirudin-og derav avledete polypeptider og fragmenter (spesielt ved fremstilling av faktor Ila) vist seg fordelaktig.

Som spesielt egnet har de av hirudin avledete peptider vist seg å være, som stammer fra proteinets C-terminale område og som inneholder trombin-bindingsstedet. De utvalgte peptider som via svovel- eller aminogrupper er koblet til bæreren foretrekkes.

Ifølge en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen anvendes såvel renset human faktor II fra plasma (Prothrombin, Stago Diagnostica), samt renset rekombinant faktor II (Falkner, F.G., et al., Throm. Haemost. (1992), 68, 119-124), en proteinblanding som inneholder faktor II (Falkner, F.G., et al., Throm. Haemost. (1992), 68, 119-124) og renset faktor X (Boehringer Mannheim) som pro-preteinholdig oppløsning. Som protease anvendes her fortrinnsvis såvel immobilisert trypsin som immobilisert faktor Xa.

Ifølge et ytterligere aspekt kan det dannes også et protein-kompleks som inneholder et protein, adsorbert på en fast bærer, fremstilt efter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, spesielt et trombinkompleks som inneholder trombin som er adsorbert på en fast bærer, fortrinnsvis på en fast bærer som inneholder hirudin eller av hirudin avledete fragmenter eller derivater.

I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan det benyttes en apparatanordning som består av en beholder (I) som inneholder en protease, og en beholder (II) som inneholder en fast bærer, idet (I) og (II) er forbundet direkte, hvilken apparatanordning anvendes ved gjennom-føring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i ett trinn. Fortrinnsvis er beholder (I) og (II) en søyle hvor utløpsstykket fra (I) er direkte koblet med innløpsstykket fra (II) og hvor utløpsstykket fra (II) eventuelt er forbundet med innløpsstykket fra (I).

Oppfinnelsen skal i det følgende forklares nærmere ved hjelp av de etterfølgende eksempler og de tilhørende tegningsfigurer.

På tegningen viser

fig. 1 den elektroforetiske analyse av proteolysepro-duktene fra rekombinant faktor II (rFII) ved trypsin ifølge eksempel 1;

fig. 2 avhengigheten av aktiviteten av den dannede rFIIa i E/ml fra flytehastighet (ml/min);

fig. 3 - fig. 11 de elektroforetiske resultater fra aktiveringen av Fil til Fila ifølge eksemplene 2 til 10; og

fig. 12 den elektroforetiske undersøkelse av aktiveringen av FX til FXa ifølge eksempel 11.

Eksempler:

Aktivitetsbestemmelser:

Aktivitetsbestemmelsen av faktor Ila (Fila) ble gjennomført fotometrisk i 50 mM tris-HCl-buffer, pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 % albumin, 7,5 mM EDTA, ved 37°C. Som substrat ble det anvendt det Fila spesifikke kromogene substrat AcOH-H-D-CHG-Ala-Arg-pNA (leveres av firma Pentapharm) med en konsentrasjon på 0,2 mM. Ved enzymatisk hydrolyse av para-nitroanilin (pNBA) som er frigjort fra substratet, ble det bestemt fotometrisk avhengig av tiden ved 405 nm. Under anvendelse av en Flla-konsentrasjonsstandard (firma Immuno AG) ble prøvens aktivitet bestemt ut fra hastigheten av substratets hydrolyse.

Aktivitetsbestemmelsen av faktor Xa (FXa) ble gjennomført fotometrisk i 50 mM tris-HCl-buffer, pH 7,8, 0,5% albumin, ved 37°C. Som substrat ble det anvendt det FXa-spesifikke kromogene substrat Bz-Ile-Glu(piperidyl)-Gly-Arg-pNA (leveres av firma Chromogenix) med en konsentrasjon på 0,3 mM. Fra substratet frigjort pNA ble det ved enzymatisk hydrolyse bestemt fotometrisk, avhengig av tiden ved 405 nm. Under anvendelse av en FXa-konsentrasjonsstandard (firma Immuno AG) ble prøvens aktivitet bestemt ut fra hastigheten av substratets hydrolyse.

Prøvebestemmelsen for naturlig faktor II og rekombinant faktor II (FII/rFII) hhv. FIIa/rFIIa ble gjennomført ved måling av absorpsjonen ved 280 nm under anvendelse av ekstinksjonskoeffisientene (1%, 1 cm) på 13,8 hhv. 17,9 (Human Protein Data, Ed. by A. Haeberli, VCH Weinheim, New York, 1992).

Proteinbestemmelsen for FX hhv. FXa ble gjennomført under måling av absorpsjonen ved 280 nm under anvendelse av en ekstinskjonskoeffisient (1%, 1 cm) på 12,4 (Human Protein Data, Ed. by A. Haeberli, VCH Weinheim, New York, 1992).

Bestemmelsen av proteinkonsentrasjonen av proteinblandinger ble gjennomført ved hjelp av Bradford-metoden (M. Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248-254) under anvendelse av et kommersielt system fra firma Bio-Rad.

Eksempel 1

Aktivering av protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin avhengig av kontaktvarigheten mellom protease og pro-protein.

4 ml rekombinant protrombin (rekombinant faktor II, rFII) med en konsentrasjon på 0,5 mg/ml (aktivitet 4 I.E. FII/ml) i 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, 150 mM NaCl, ble blandet med 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (Sigma, USA; 80 enheter trypsin/ml gel) og rørt ved romtemperatur. Efter 1 minutt og efter 5 minutter ble det tatt prøver og undersøkt på innhold på rekombinant trombin (rekombinant faktor Ila, rFIIa) (data sml. tabell 1).

De oppnådde prøver ble ved hjelp av denaturert elektroforese (Laemmli, Nature, Bd. 227:680-685, (1970)) undersøkt på deres proteinsammensetning. Resultatene er vist på fig. 1, idet i bane a er angitt molekylvektmarkøren, i bane b 1-minutt trypsinfordøyelse og i bane c 5-minutt tryp-sinfordøyelse.

Av disse resultater fremgår at trypsin rFII ble omdannet i rFIIa ved hjelp av spaltningen. Etter kun 1 minutt trypsininnvirkning på rFII med en aktivitet på 4 I.E./ml ble det ut fra dette dannet rFIIa med en aktivitet på 500 I.E./ml. Ved en innvirkningstid på 5 minutter var imidlertid den påviselige aktivitet av rFIIa meget liten. Den elektroforetiske analyse viser at det ved kun 1 minutt trypsininnvirkning på rFII foreligger en proteinblanding med molekylvekter ( i Da) på mellom 70000 og 20000, hvorved et protein med molekylvekt på mellom 31000 og 36000 dominerer. Da som kjent trombin i elektroforese har en molekylvekt på 33000, må det kunne antas at det ved proteinet med molekylvekt på 31000 - 36000 dreier seg om et oppstått trombin. Imidlertid er også rester på ikke-aktivert rFII (molekylvekt 70000) tilstede. Ved en inkubasjon på 5 minutter av rFII med trypsin kunne derimot bare lavere-molekylære peptider påvises i elektroforesen. Dette tyder på en nærmest fullstendig fordøyelse av rFII ved hjelp av trypsin, men uten at rFIIa akkumulerte.

Eksempel 2

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved immobilisert trypsin

En glassøyle (diameter 1 cm) ble fylt med 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel; dette tilsvarer en gelhøyde på 1,25 mm. Gjennom denne trypsin-agarosegel ble det pumpet rFII med forskjellige strømningshastigheter. rFII var oppløst til 0,5 mg/ml (3,5 I.E./ml) i 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, 150 mM NaCl. Strømningshastigheten av rFII-oppløsningen gjennom gelen ble variert mellom 0,05 ml/minutt og 1,0 ml/minutt. De enkelte eluater ble ved hjelp av elektroforese (sml. fig. 3) undersøkt på deres innhold på trombin-aktivitet (sml. fig. 2) og på deres proteinsammensetning. Ut fra strømningshastigheten og dimensjonen av trypsin-agarosegel-søylen (volum 0,1 ml gel; søylens diameter 1 cm; skikttykkelse 1,25 mm) fremkommer gjennomsnittlige kontakttider på 6 senkunder, 10 sekunder, 15 sekunder, 30 sekunder, 60 sekunder og 120 sekunder, ved tilsvarende strømningshastigheter på 1,0 ml/minutt, 0,6 ml/minutt, 0,4 ml/minutt, 0,2 ml/minutt, 0,1 ml/minutt og 0,05 ml/minutt, mellom rFII og det immobiliserte trypsin.

De på fig. 3 viste elektroforesebaner er anriket med følgende prøver: a: rFII;

b: strømningshastighet 1 ml/minutt;

c: strømningshastighet 0,6 ml/minutt;

d: strømningshastighet 0,4 ml/minutt;

e: strømningshastighet 0,2 ml/minutt;

f: strømningshastighet 0,1 ml/minutt;

g: strømningshastighet 0,05 ml/minutt;

h: molekylvektmarkør.

Fra resultatene fremgår at dannelsen av rFIIa fra rFII ved hjelp av trypsinfordøyelse er sterkt avhengig av strømningshastigheten, dvs. kontaktvarigheten mellom rFII og immobilisert trypsin. Den høyeste aktivitet på rFIIa ble oppnådd ved en strømningshastighet på 0,4 ml/minutt. Ved høyere strømningshastigheter (0,6 ml/minutt og 1 ml/minutt) ble utbyttene på rFIIa igjen mindre. Elektroforesen viser at ved disse strømningshastigheter ikke hele rFII ble omdannet proteolytisk i rFIIa ved hjelp av trypsin. Ved lavere strømningshastigheter (0,05 ml/minutt ved 0,2 ml/minutt) avtar mengden på rFIIIa likeledes. Den elektroforetiske undersøkelse viser at ved de forlengede kontakttider mellom rFII og immobilisert trypsin kun små mengder aktivt trombin akkumulerer, og med avtagende strømningshastighet oppstår inaktive, lavere-molekylære peptider.

Eksempel 3

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombin ved hjelp av affinitetskromatografi på Hirudin-tiol-sepharose.

4000 anti-trombin enheter (ATU) Hirudin (produseres av firma Pentapharm) ble redusert og derefter koblet til 1 ml aktivert tiol-sepharose i overensstemmelse med produsentforskriftene (Pharmacia). Hirudin-tiolsepharose (HTS) ble fylt i en glassøyle (diameter 1 cm).

Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet direkte med innløpet av HTS-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne utløpet av HTS-søylen forbindes med innløpet av TAG-søylen, hvorved det dannes et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med mM Tris/-HCl-buffer, pH 8,0.

rFII ble oppløst til 0,5 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, og pumpet gjennom TAG-søylen med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. Derfra ble væskestrømmen ført uten avbrekk direkte til HTS-søylen og efter passasje av HTS-søylen pumpet for andre gang ved hjelp av en pumpe igjen gjennom TAG-søylen og HTS-søylen. Derefter ble HTS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale), og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 500 mM NaCl (0,5 M NaCl-eluat). Derefter ble HTS-søylen eluert med 1,5 M KSCN i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (1,5 M KSCN-eluat).

Fraksjonene som ble oppnådd under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein) . I tabell 2 er resultatene fra rFII-aktiveringen fra eksempel 3 sammenfattet.

Fig. 4 viser den elektroforetiske undersøkelse av den beskrevne aktivering, idet bane a viser utgangsmaterialet (rFII), bane b 1,5 M KSCN-eluatet (rFIIa) og bane c en moleky1vektmarkør.

Resultatene viser at rFII ble omdannet effektivt i rFIIa ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 3. Dannet rFIIa akkumulerte på HTS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk rent form med en molekylvekt på 33000 og med en meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av HTS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.E. ren rFIIa. Dette tilsvarer en i det vesentlige kvantitativ omdannelse.

Eksempel 4

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på tiol-peptid-tiol-sepharose. 20 mg av et peptid (tiol-peptid, TP) med aminosyresekvens NH2-Cys-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-COOH ble i overensstemmelse med produsentforskriftene koblet til 1 ml aktivert tiol-sepharose (produseres av firma Pharmacia). Tiol-peptid-tiol-sepharose (TPTS) ble fylt på en glassøyle (diameter 1 cm) . Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet direkte med innløpet av TPTS-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne TPTS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens utløp, hvorved det dannes et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0.

rFII ble oppløst til 0,4 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0 og med en strømnings-hastighet på 0,8 ml/min pumpet gjennom TAG-søylén. Derfra

ble væskestrømmen uten avbrekk ført direkte på TPTS-søylen, og efter passasjen av TPTS-søylen ble den enda engang ved hjelp av en pumpe igjen pumpet gjennom TAG-søylen og TPTS-søylen. Derefter ble TPTS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer pH 6,5, 500 mM CaCl (0,5 M NaCl-eluat). Derefter ble TPTS-søylen eluert med 1,5 M KSCN i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (1,5 M KSCN-eluat). Fraksjonene som ble dannet under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombin-aktivitet/mg protein). De oppnådde resultater av rFII-aktiveringen er angitt i tabell 3.

Den elektroforetiske analyse av aktiveringen av rFII til rFIIa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på tiol-peptid-tiol-sepharose er avbildet på fig. 5, idet bane a viser molekylvektmarkøren, bane b utgangsmaterialet (rFII) og bane c 1,5 M KSCN-eluatet.

Resultatene viser at rFII effektivt ble omdannet i rFIIa ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte. Dannet rFIIa akkumulerte på TPTS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk rent form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av TPTS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne femgangsmåte kunne det fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.E. rent rFIIa.

Eksempel 5

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombin ved affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose. 20 mg av et peptid (amino-peptid, AP) med aminosyre-sekvensen NH2-Lys-Pro-Gly-Pro-Gly-Ser-His-Ala-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-COOH ble i overensstemmelse med produsentforskriftene koblet til 1 ml aktivert CH-sepharose (Pharmacia). Amin-peptid-CH-sepharose (APCHS) ble fylt på en glassøyle (diameter 1 cm). Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet direkte med innløpet av APCH-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne APCHS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det dannes et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0.

rFII ble oppløst til 0,5 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0 og pumpet med en strømningshastighet på 0,8 ml/min gjennom TAG-søylen. Derfra ble væskestrømmen uten avbrekk ført direkte på APCHS-søylen og efter passasjen av APCHS-søylen pumpet en gang til ved hjelp av pumpen igjen gjennom TAG-søylen og APCHS-søylen. Derefter ble APCHS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (idet ikke-bundet materiale ble fjernet) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 500 mM NaCl (0,5 M NaCl-eluat). Derefter ble APCHS-søylen eluert med 1,5 M KSCN og 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (1,5 M KSCN-eluat). Fraksjonene som dannes under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og

spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). Resultatene av rFII-aktiveringen er satt opp i tabell 4.

På fig. 6 er den elektroforetiske analyse av aktiveringen

av rFII til rFIIa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose vist, idet bane a viser molekylvektmarkøren, bane b utgangsmateriale (rFII) og bane c 1,5 M KSCN-eluatet (rFIIa).

Resultatene viser at rFII ved hjelp av fremgangsmåten

ifølge eksempel 5 effektivt ble omdannet til rFIIa. Dannet rFIIa akkumulerte på APCHS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk ren form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av APCHS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne det fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.E. ren rFIIa.

Eksempel 6

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp

av immobilisert trypsin og utvinning av trombin ved hjelp av affinitetskromatografi på benzmidin-sepharose.

2 ml benzamidin-sepharose (BAS, firma Pharmacia) ble fylt på en glassøyle (diameter 1 cm). Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet direkte med innløpet av BAS-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne BAS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det oppstod et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0. rFII ble oppløst til 0,4 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, og pumpet gjennom TAG-søylen med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. Derfra ble væskestrømmen uten avbrekk ført direkte på BAS-søylen og efter passasje av BAS-søylen igjen pumpet gjennom TAG-søylen og BAS-søylen ved hjelp av pumpen. Derefter ble BAS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 150 mMNaCl (0,15 M NaCl-eluat). Derefter ble BAS-søylen eluert med 0,1 M benzamidin i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (0,1 M benzamidin-eluat). Fraksjonene som ble oppnådd under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). Resultatene av rFII-aktiveringen fremgår av tabell 5.

Fig. 7 viser den elektroforetiske analyse av aktiveringen av rFII til rFIIa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på benzamidin-sepharose, idet bane a er påført utgangsmaterialet (rFII), bane b 0,1 M benazmidin-eluatet (rFIIa) og bane c molekylvektmarkøren.

Resultatene viser at rFII ble effektivt omdannet i rFIIa ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 6. Dannet rFIIa akkumulerte på BAS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk rent form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av BAS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne det fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.E. rent rFIIa.

Eksempel 7

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på Heparin-sepharose.

2 ml Heparin-sepharose Fast Flow (HW, Pharmacia) ble fylt på en glassøyle (diameter 1 cm). Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet direkte med innløpet av HS-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne BAS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det oppstår et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0. rFII ble oppløst til 0,5 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, og pumpet gjennom TAG-søylen med en flytehastighet på 0,8 ml/min. Derfra ble væskestrømmen uten avbrekk ført direkte på HS-søylen og efter passasjen av HS-søylen en gang til pumpet gjennom TAG-søylen og HS-søylen ved hjelp av pumpen. Derefter ble HS-søylen skilt fra TAG-søytlen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale)

og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 150 mM NaCl (0,15 M NaCl-eluat). Derefter ble HS-søylen eluert med 0,5 m NaCl i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (0,5 M NaCl-eluat). Fraksjonene som ble dannet under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). I tabell 6 er resultatene av rFII-aktiveringen fra ekskempel 7 angitt.

Den elektroforetiske analyse av aktiveringen av rFII til rFIIa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på Heparin-sepharose er vist på fig. 8 hvor det i bane a er angitt utgangsmaterialet (rFII), i bane b 0,5 M NaCl-eluatet (rFIIa) og i bane c molekylvektmarkøren.

Resultatene viser at rFII ble effektivt omdannet i rFIIa ved hjelp av fremgangsmåten ifølge ekskempel 7. Dannet rFIIa akkumulerte på HS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk ren form med molekylvekt på 33000 og 35000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av HS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.W. rent rFIIa.

Eksempel 8

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin i en proteinblanding ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose.

En amino-peptid-CH-sepharose-søyle (APCHS-søyle) ble fremstilt slik som beskrevet i ekskempel 5. Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble direkte forbundet med innløpet av APCHS-søylen ved hjelp av en slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne APCHS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det oppstår et væskekretsløp. Begge søylen ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0. 4 ml av en proteinblanding (proteinkonsentrasjon 1,7 mg/ml) som inneholdt rFII (aktivitet 3,5 I.E./ml), i 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, ble pumpet gjennom TAG-søylen med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. Derfra ble væske-strømmen uten avbrekk ført direkte på APCHS-søylen, og efter passasjen av APCHS-søylen pumpet for andre gang igjen gjennom TAG-søylen og APCHS-søylen ved hjelp av pumpen. Derefter ble APCHS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 500 mM NaCl (0,5 M NaCl-eluat). Derefter ble APCHS-søylen eluert med 1,5 M KSCN i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (1,5 M KSCN-eluat). Fraksjonene som ble dannet under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). I tabell 7 vises resultatene av rFII-aktiveringen fra eksempel 8.

Fig. 9 viser den elektroforetiske analyse av aktiveringen av rFII til rFIIa i en proteinblanding ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose, idet bane a viser utgangsmaterialet (proteinblanding), bane b 1,5 M KSCN-eluatet (fRIIa) og bane c molekylvektmarkøren.

Resultatene viser at rFII i en proteinblanding effektivt ble omdannet til rFIIa ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 8. Dannet rFIIa akkumulerte på APCHS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk rent form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av APCHS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne det fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.e. ren rFIIa.

Eksempel 9

Aktivering av humant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på benzamidin-sepharose.

2 ml benzamidin-sepharose (BAS, Pharmacia) ble fylt i en glassøyle (diameter 1 cm). Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet med innløpet av BAS-søylen ved hjelp av en direkte slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne BAS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det dannes et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0.

Human faktor II (hFII) ble oppløst til 0,5 mg/ml (aktivitet 4 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0 og pumpet gjennom TAG søylen med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. Derfra ble væskestrømmen uten avbrekk ført direkte på BAS-søylen og efter passasjen av BAS-søylen pumpet for andre gang igjen gjennom TAG-søylen og BAS-søylen ved hjelp av pumpen. Derefter ble BAS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale), og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 150 mM NaCl (0,15 M NaCl-eluat). Derefter ble BAS-søylen eluert med 0,1 M benzamidin i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (0,1 benzamidin-eluat). Fraksjonene som ble oppnådd under aktiveringen, ble undersøkt på trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). Resultatene av FII-aktiveringen fra eksempel 9 fremgår av tabell 8.

Fig. 10 viser den elektroforetiske analyse av aktiveringen av hFII til Fila ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på benzamidin-sepharose, idet bane a viser mole-kyl vektmarkøren, bane b utgangsmaterialet (hFII) og bane c 0,1 M benzamidin-eluatet (Flia).

Resultatene viser at hFII effektivt ble omdannet i Fila ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 9. Dannet Fila akkumulerte på BAS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk ren form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av BAS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne det fra 1 I.E. Fil utvinnes mer enn 150 I.E. rent Flia.

Eksempel 10

Aktivering av rekombinant protrombin til trombin ved hjelp av immobilisert faktor Xa og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose.

En amino-peptid-CH-sepharose-søyle (APCHS-søyle) ble fremstilt slik som i eksempel 5. 30 mg av protease faktor Xa (Boehringer Mannheim) ble koblet til 1 ml CNBr-aktivert sepharose (pharmacia) slik som angitt i produsentforskriftene, og fylt på en glassøyle (diameter 1 cm) (XaS-søyle). Utløpet av XaS-søylen ble forbundet med innløpet av APCHS-søylen ved hjelp av en direkte slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne APCHS-søylens utløp forbindes med XaS-søylens innløp, hvorved det dannes et væske-kretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0.

rFII ble oppløst til 0,5 mg/ml (aktivitet 3,5 I.E./ml) i 4 ml 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0 og pumpet gjennom XaS-søylen med en strømningshastighet på 0,1 ml/min. Derfra ble væskestrømmen ført uten avbrekk direkte på APCHS-søylen, og efter passasjen av APCHS-søylen pumpet igjen for andre gang gjennom XaS-søylen og APCHS-søylen ved hjelp av

pumpen. Denne prosess ble gjentatt tre ganger. Derefter ble APCHS-søylen skilt fra XaS-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (hvorved ikke-bundet materiale ble fjernet) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 500 mM NaCl (0,5 NaCl-eluat). Derefter ble APCHS-søylen eluert med 1,5 M KSCN i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (1,5 KSCN-eluat). Fraksjonene som ble oppnådd under aktiveringen ble undersøktpå trombinaktivitet (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (trombinaktivitet/mg protein). I tabell 9 vises resultatene av rFII-aktiveringen fra eksempel 10.

Fig. 11 viser den elektroforetiske analyse av aktiveringen av rFII til rFIIa ved hjelp av immobilisert faktor Xa og utvinning av trombinet ved hjelp av affinitetskromatografi på amino-peptid-CH-sepharose, idet bane a viser molekyl-vektmarkøren, bane b utgangsmaterialet (rFII) og bane c 1,5 M KSCN-eluatet.

Resultatene viser at rFII også ved protease faktor Xa ble omdannet effektivt i rFIIa ved hjelp av fremgangsmåten ifølge eksempel 10. Dannet rFIIa akkumulerte på APCHS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk ren form med en molekylvekt på 33000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av EPCHS-søylen. Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kunne det fra 1 I.E. rFII utvinnes mer enn 150 I.E. ren rFIIa.

Eksempel 11

Aktivering av faktor X til faktor Xa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av faktor Xa ved hjelp av affinitetskromatografi på benzamidin-sepharose. 2 ml benzamidin-sepharose {BAS, Pharmacia) ble fylt på en glassøyle (diameter 1 cm). Utløpet av en glassøyle (diameter 1 cm) som inneholdt 0,1 ml immobilisert trypsin-agarosegel (TAG), ble forbundet med innløpet av BAS-søylen ved hjelp av en direkte slangeforbindelse. Via en ventil og en pumpe kunne BAS-søylens utløp forbindes med TAG-søylens innløp, hvorved det dannes et væskekretsløp. Begge søyler ble ekvilibrert med 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0. 2 ml av en oppløsning av faktor X (FX, firma Boehringer Mannheim) ble oppløst til 0,5 mg/ml i 20 mM Tris/HCl-buffer, pH 8,0, og pumpet gjennom TAG-søylen med en .strømningshastighet på 0,5 ml/min. Derfra ble væske-strømmen uten avbrekk ført direkte på BAS-søylen, og efter passasjen av BAS-søylen pumpet for andre gang igjen gjennom TAG-søylen og BAS-søylen ved hjelp av pumpen. Derefter ble BAS-søylen skilt fra TAG-søylen, spylt med 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (for å fjerne ikke-bundet materiale) og derefter vasket med 50 mM Na-citratbuffer, pH 6,5, 150 mM NaCl (0,15 M Nacl-eluat). Derefter ble BAS-søylen eluert med 0,1 M benzamidin i 50 mM citratbuffer, pH 6,5 (0,1 M benzamidin-eluat). Fraksjonene som ble dannet under aktiveringen ble undersøkt på aktivitet av faktor Xa (I.E./ml), totalaktivitet (I.E.) og spesifikk aktivitet (aktivitet/mg protein). Resultatene av faktor X-aktiveringen fra eksempel 11 er angitt i tabell 10.

Fig. 12 viser den elektroforetiske analyse av aktiveringen av FX til FXa ved hjelp av immobilisert trypsin og utvinning av FXa ved hjelp av affinitetskromatografi på benzamidin-sepharose, idet bane a viser utgangsmaterialet (FX), bane b 0,1 M benzamidin-eluatet (FXa) og bane c molekylvektmarkøren.

Resultatene viser at FX ved hjelp av den i eksempel 11 beskrevne fremgangsmåte effektivt ble omdannet i FXa. Dannet FXa akkumulerte på BAS-søylen og ble oppnådd i elektroforetisk ren form med en molekylvekt på 32000 og med meget høy spesifikk aktivitet ved hjelp av spesifikk eluering av BAS-søylen.

Claims (29)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling og utvinning av proteiner fra pro-proteiner i ett fremgangsmåtetrinn, karakterisert ved at en pro-proteinholdig oppløsning bringes i kontakt med en protease og en fast bærer som oppviser en høyere affinitet til proteinet enn til pro-proteinet eller dets funksjonelt inaktive nedbrytningsprodukter, idet pro-proteinet spaltes proteolytisk til protein, og proteinet skilles selektivt ved adsorpsjon på den faste bærer.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at proteasen er immobilisert.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den pro-proteinholdige oppløsning behandles med proteasen under en forut bestemt kontaktvarighet som er tilstrekkelig til å frembringe en spaltning av pro-proteinet til protein, ved hvilken det i det vesentlige ikke dannes noen ytterligere funksjonelt inaktive nedbrytningsprodukter av proteinet.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 3, karakterisert ved at, etter kontakten med proteasen og separasjonen av proteinet, ikke-spaltet pro-protein som eventuelt fremdeles foreligger i oppløsningen bringes på nytt i kontakt med proteasen, at det dannede protein adsorberes på den faste bærer, og at disse trinn eventuelt gjentas så lenge til hele pro-proteinet i det vesentlige er spaltet til protein.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 4, karakterisert ved at proteasebehand-lingstrinnet (ene) og adsorpsjonstrinnet(ene) gjennomføres kontinuerlig.

6. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 5, karakterisert ved at pro-proteinet er et proenzym og proteinet er et enzym.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 til 6, karakterisert ved at kontaktvarigheten av pro-proteinet og proteasen maksimalt er 24 timer.

8. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 7, karakterisert ved at kontaktvarigheten av pro-protein og protease ligger mellom 1 sekund og 24 timer, fortrinnsvis mellom 1 sekund og 5 timer, spesielt foretrukket mellom 1 sekund og 30 minutter.

9. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 8, karakterisert ved at proteasen er valgt fra trypsin, chymotrypsin, faktor Xa, venom-protease, trombin, plasmin eller en serin-protease fra Subtilisin-familien, spesielt keksin- eller furinartige proteaser.

10. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 9, karakterisert ved at pro-proteinet er et inaktivt forstadium av en blodkoaguleringsfaktor, fortrinnsvis faktor II, faktor V, faktor VII, faktor VIII, pro-faktor IX, faktor IX, faktor X, faktor XIII, protein C eller von Willebrand-faktor, og at proteinet er et funksjonelt aktivt koaguleringsprotein.

11. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 10, karakterisert ved at det som pro-proteinholdig oppløsning anvendes en oppløsning som inneholder pro-proteinet i renset form.

12. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 t il 11, karakterisert ved at det som pro-proteinholdig oppløsning anvendes en oppløsning hvor proteinet foreligger i blanding med andre proteiner.

13. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 10 og 12, karakterisert ved at det som pro-proteinholdig oppløsning anvendes en oppløsning som er av biologisk opprinnelse.

14. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 13, karakterisert ved at det som pro-proteinholdig oppløsning anvendes plasma, en plasmafraksjon eller en derav avledet oppløsning.

15. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 12, karakterisert ved at det som pro-prøteinholdig oppløsning anvendes en oppløsning som er fremstilt ved hjelp av en bioteknologisk fremgangsmåte.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 15, karakterisert ved at det som pro-proteinholdige oppløsning anvendes en kulturrest som er frembrakt av en rekombinant cellekultur.

17. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 16, karakterisert ved at den faste bærer er valgt fra immobilisert hirudin eller fra hirudin avledete polypeptider eller derivater, immobilisert heparin, immobilisert benzamidin og immobiliserte proteiner eller peptider, spesielt immobiliserte antistoffer.

18. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 17, karakterisert ved at det på den faste bærer adsorberte protein elueres selektivt av bæreren.

19. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av proteiner fra pro-proteiner.

20. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktiverte enzymer fra pro-enzymer.

21. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor II.

22. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor V.

23. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor VII.

24. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor VIII.

25. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av faktor IX eller aktivert faktor IX.

26. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor X.

27. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert faktor XIII.

28. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av aktivert protein C.

29. Anvendelse av en fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1 til 18 ved fremstilling av von Willebrand-faktor.