NO317346B1 - Fortrengningskromatografi av proteiner ved bruk av fortrengere med lav molekylvekt - Google Patents
Fortrengningskromatografi av proteiner ved bruk av fortrengere med lav molekylvekt Download PDFInfo
- Publication number
- NO317346B1 NO317346B1 NO19963420A NO963420A NO317346B1 NO 317346 B1 NO317346 B1 NO 317346B1 NO 19963420 A NO19963420 A NO 19963420A NO 963420 A NO963420 A NO 963420A NO 317346 B1 NO317346 B1 NO 317346B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- displacer
- protein
- chromatography
- stationary phase
- molecular weight
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 63
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title description 36
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 39
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 claims description 30
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 claims description 23
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 20
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 16
- -1 amino acid esters Chemical class 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 3
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical class NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 claims 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 34
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 25
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 22
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 16
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 15
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 9
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 6
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- NTTOTNSKUYCDAV-UHFFFAOYSA-N potassium hydride Chemical compound [KH] NTTOTNSKUYCDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910000105 potassium hydride Inorganic materials 0.000 description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N N-dimethylaminoethanol Chemical compound CN(C)CCO UEEJHVSXFDXPFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 4
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SBZXBUIDTXKZTM-UHFFFAOYSA-N diglyme Chemical compound COCCOCCOC SBZXBUIDTXKZTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N (1s,2s,3r,4r)-3-[[5-chloro-2-[(1-ethyl-6-methoxy-2-oxo-4,5-dihydro-3h-1-benzazepin-7-yl)amino]pyrimidin-4-yl]amino]bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carboxamide Chemical compound CCN1C(=O)CCCC2=C(OC)C(NC=3N=C(C(=CN=3)Cl)N[C@H]3[C@H]([C@@]4([H])C[C@@]3(C=C4)[H])C(N)=O)=CC=C21 GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N 0.000 description 2
- OYSVBCSOQFXYHK-UHFFFAOYSA-N 1,3-dibromo-2,2-bis(bromomethyl)propane Chemical compound BrCC(CBr)(CBr)CBr OYSVBCSOQFXYHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N L-arginine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ZDLDXNCMJBOYJV-YFKPBYRVSA-N L-arginine, methyl ester Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ZDLDXNCMJBOYJV-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001449 anionic compounds Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 150000001767 cationic compounds Chemical group 0.000 description 2
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000002275 isocratic elution chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N palladium;triphenylphosphane Chemical compound [Pd].C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 NFHFRUOZVGFOOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- NDQXKKFRNOPRDW-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-triethoxyethane Chemical compound CCOC(C)(OCC)OCC NDQXKKFRNOPRDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 1-[2-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-4,6-dihydroxyphenyl]-3-(4-hydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 ONBQEOIKXPHGMB-VBSBHUPXSA-N 0.000 description 1
- UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 1-[6-[2-[3-[3-[3-[2-[2-[3-[[2-[2-[[(2r)-1-[[2-[[(2r)-1-[3-[2-[2-[3-[[2-(2-amino-2-oxoethoxy)acetyl]amino]propoxy]ethoxy]ethoxy]propylamino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-[(2r)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanyl-1-oxopropan-2-yl Chemical compound O=C1C(SCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(=O)N[C@@H](CSC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)COCC(N)=O)CC(=O)N1CCNC(=O)CCCCCN\1C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2CC/1=C/C=C/C=C/C1=[N+](CC)C2=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C1 UNILWMWFPHPYOR-KXEYIPSPSA-M 0.000 description 1
- NAMDIHYPBYVYAP-UHFFFAOYSA-N 1-methoxy-2-(2-methoxyethoxy)ethane Chemical compound COCCOCCOC.COCCOCCOC NAMDIHYPBYVYAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910018072 Al 2 O 3 Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- MQIUGAXCHLFZKX-UHFFFAOYSA-N Di-n-octyl phthalate Natural products CCCCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCCC MQIUGAXCHLFZKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000612151 Dodecatheon Species 0.000 description 1
- 235000008166 Dodecatheon meadia Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001483 arginine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N bis(2-ethylhexyl) phthalate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC(CC)CCCC BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 1
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 1
- 229940126142 compound 16 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- CZWJWNQZTSMVAZ-ZDUSSCGKSA-N methyl (2s)-6-amino-2-(phenylmethoxycarbonylamino)hexanoate Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)OC)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 CZWJWNQZTSMVAZ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- OXUCOTSGWGNWGC-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCC[CH2-] OXUCOTSGWGNWGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000962 organic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011106 process-scale chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N pyridinium p-toluenesulfonate Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1.CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 ZDYVRSLAEXCVBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940041022 streptomycins Drugs 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical class NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012610 weak anion exchange resin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/422—Displacement mode
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/02—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C215/40—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton with quaternised nitrogen atoms bound to carbon atoms of the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
O ppfinnelsens felt
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rensing av et protein og en ny klasse dendritisk polymerbasert polyelektrolytt anvendelig for kromatografi av proteiner.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Fortrengningsmodusen av kromatografi ble først funnet i 1906 av Tswett som registrerte at prøvefortrengning registrerte opptrådde under betingelser av overlastet elueringskromatografi. 1 1943, utviklet Tiselius klassifiseringen av frontalkromatografi, elueringskromatografi og fortrengningskromatografi. Siden den tid har de fleste utviklinger og anvendelser, spesielt de i analytisk kromatografi, skjedd innen området elueringskromatografi og faktisk har uttrykket kromatografi uten ytterligere kvalifikasjon vanligvis referert til elueringskromatografi. Likevel, mens teorien og praksisen i elueringskromatografi har dominert litteraturen i de siste femti år, har teorien og utførelsen av fortrengningskromatografi opptatt en liten nisje innen kromatografivitenskapen.
De to typene kromatografi, eluering og fortrengning, blir lett adskilt både teoretisk og i praksis. Ved elueringskromatografi, blir en oppløsning av prøven som skal bli renset (for foreliggende oppfinnelse, et protein), satt på en stasjonær fase, vanligvis i en kolonne. Den mobile fasen blir valgt slik at prøven verken blir irreversibelt adsorbert eller totalt ikke adsorbert, men binder reversibelt. Etter som den mobile fasen strømmer over den stasjonære fasen, blir en likevekt etablert mellom den mobile fasen og den stasjonære fasen hvorved, avhengig av affiniteten for den stasjonære fasen, prøven passerer langs kolonnen med en hastighet som reflekterer dens affinitet i forhold til de andre komponentene som kan opptre i den opprinnelige prøven. Den forskjellige migreringsprosessen er skjematisk angitt i figur 1 og et typisk kromatogram er vist i figur 2. Spesielt bemerkelsesverdig ved standard elueringskromatografi er det faktum at elueringsmiddelfronten eller null kolonnevolum i isokratisk eluering, alltid løper foran prøven i kolonnen.
En modifikasjon og utvidelse av isokratisk elueringskromatografi er funnet i trinngradientkromatografi hvor en serie elueringsmidler med varierende sammensetning blir ledet over den stasjonære fasen. Ved ionebyttekromatografi, blir trinnforandringer i den mobile fasens saltkonsentrasjon og/eller pH benyttet for å eluere eller desorbere proteinene.
Fortrengningskromatografi er fundamentalt forskjellig fra desorpsjonskromatografi
(f.eks. affinitetskromatografi, trinngradientkromatografi). Fortrengeren, som har en affinitet som har høyere enn noen av fødekomponentene, konkurrerer effektivt for adsorbsjonssetene på den stasjonære fasen. Et viktig skille mellom fortrengning og desorpsjon er at fortrengerfronten alltid forblir bak den naboliggende fødesonen i erstatningsrekken, mens desorbentene (f.eks. salt, organiske modifikatorer) beveger seg gjennom fødesonen. Implikasjonen av denne forskjellen er meget signifikant ved at fortrengningskromatografi potensielt kan konsentrere og rense komponenter fra blandinger som har to separasjonsfaktorer, mens i desorpsjonskromatografi er relativt store separasjonsfaktorer generelt nødvendig for å gi tilfredsstillende oppløsning.
Ved fortrengningskromatografi har elueringsmidlet (dvs. fortrengeren) høyere affinitet for den stasjonære fase enn noen av komponentene i blandingen som skal separeres. Dette i motsetning til elueringskromatografi hvor elueringsmidlet vanligvis har en lav affinitet. Den operasjonelle nøkkelfaktoren som skiller fortrengningskromatografi fra eluering eller desorpsjonskromatografi er anvendelsen av et fortrengningsmolekyl. Ved fortrengningskromatografi blir kolonnen først utlignet med et bæreoppløsningsmiddel under betingelser ved hvilke komponentene som skal separeres har relativt høy affinitet for den stasjonære fasen. Et stort volum av fortynnet fødeblanding kan så settes på kolonnen og de individuelle komponentene adsorberes til den stasjonære fasen. Det vil si at de går fra fødeoppløsningen til den stasjonære fasen og forblir der. Dersom alle komponentene skal bli skilt ved fortrengning, inneholder bæreoppløsningsmidlet som kommer ut fra kolonnen, ingen prøve. Prøven er nå i den stasjonære fasen og posisjonen til hver komponent i kolonnen er korrelert med dens relative affinitet for den stasjonære fasen. Konsepsjonelt kan man tenke seg at hvert molekyl av komponenten med høyest affinitet for den stasjonære fasen erstatter et molekyl fra en komponent som har lavere affinitet for et sete på den stasjonære fasen slik at de individuelle komponentene til sist vil bli anordnet i kolonnen i sekvens fra høyeste eller laveste affinitet.
Det vil noen ganger være fordelaktig å Ia noen av komponentene gå gjennom kolonnen med bæreoppløsningsmidlet; i dette tilfelle vil kun de tilbakeholdte fødekomponentene bli oppløst ved fortrengningskromatografi.
Straks prøven er lastet på kolonnen, blir en fortrengningsoppløsning innført. Fortrengningsoppløsningen omfatter en fortrenger i et passende oppløsningsmiddel. Fortrengeren er valgt slik at den har høyere affinitet for den stasjonære fasen enn noen av fødekomponentene. Med utgangspunkt at fortrengeren og den mobile fasen er passende valgt, slipper komponentene ut fra kolonnen som naboliggende firkantbølgesoner med høyt konsentrert rent materiale i rekkefølge for økende absorpsjonsaffinitet. Dette er vist skjematisk i figur 3. Etter sonene av rensede komponenter kommer fortrengeren ut fra kolonnen. Et typisk kromatogram fra fortrengningskromatografi er vist i figur 4. Det kan lett skilles fra kromatogrammet fra elueringskromatografi vist i figur 2 ved det faktum at fortrengeren følger etter prøven og at fødekomponentene slipper ut fra kolonnen som etter hverandre følgende "firkantbølge" soner med høyt konsentrert rent materiale. Til sist, etter at fortrengeren har kommet gjennom, blir kolonnen regenerert ved desorbering av fortrengeren fra den stasjonære fasen for å tillate den neste driftssyklus.
Fortrengningskromatografi har noen spesielt fordelaktige egenskaper for prosesskalakromatografi av biologiske makromolekyler, slik som proteiner. Først og sansynligvis mest signifikant, kan fortrengningskromatografi gi produktseparasjon og konsentrasjon i et enkelt trinn. Til sammenligning, resulterer isokratisk elueringskromatografi i produktfortynning under separering. For det andre, da fortrengningsprosessen opererer i den ikke-lineære regionen av likevektsisotermen, er høye kolonnelaster mulige. Dette tillater langt bedre kolonneutnyttelse enn elueringskromatografi. For det tredje, krever prosessen mindre oppløsningsmiddel enn en sammenlignbar elueringsprosess. For det fjerde, kan fortrengningskromatografi konsentrere og rense komponenter fra blandinger som har lave separasjonsfaktorer, mens relativt store separasjonsfaktorer er nødvendige for tilfredsstillende adskillelse ved desorpsjonskromatografi.
Med alle disse fordelene kunne man anta at fortrengningskromatografi ville være vidt benyttet. Imidlertid har fortrengningskromatografi slik den tradisjonelt er kjent, et antall ulemper sammenlignet med elueringskromatografi for rensing av proteiner. Uttrykket "protein" som vanlig forstått i teknikken og som benyttet her, refererer til polypeptider med molekylvekt på 10 kDa og mer; i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, blir polypeptider med molekylvekt lavere enn 10 kDa vanligvis referert til som oligopeptider. To av hovedproblemene er (1) regenerering av kolonnen og (2) nærværet av fortrenger i noen av de rensede fraksjonene.
Da fortrengningsprosessen benytter en forbindelse med høy affinitet som fortrenger, kan tiden for regenerering og reekvilibrering bli lang sammenlignet med elueringskromatografi. Videre er ofte relativt store mengder oppløsningsmiddel nødvendig under regenerering, noe som effektivt reduserer eventuelle fordeler i forhold til elueringskromatografi i forbruk av oppløsningsmiddel.
Det andre problemet med kontaminasjon av fortrengeren, har oppstått på grunn av at en felles egenskap ved fortrengere benyttet ved proteinseparasjon, nemlig deres relativt høye molekylvekt. Hertil har teknikken lært anvendelse av polyelektrolytter med høy molekylvekt for åfortrenge proteiner under den antagelse at (som forklart nedenfor) det er nødvendig å ha en stor polyelektrolytt for åsikre en høyere bindingskoeffisient enn proteinet som skal bli erstattet. Fortrengere med høy molekylvekt har begge ulempene angitt ovenfor; de binder tett til den stasjonære fasen og krever strenge betingelser for regenerering av kolonnen og spor av fortrengeren som kan kontaminere produktrfaksjonen er vanskelige å fjerne.
Det vil derfor være en fordel å ha en klasse fortrengere som ikke krever omfattende regenerering av kolonnen og som lett kan fjernes fra produktproteinet. Det er kjent et eksempel i teknikken på å benytte en 2 kilodalton poly(vinyIsulfonsyre) på polyetylenimidbelagt svak anionbytteresin for separering av konalbumin fra ovalbumin. Eksperimentene synes å ha vært vellykkede ved at de to proteiner har blitt separert (se Jen og Pinto, Journal of Chromatography 519, 87-98 (1990)]. Imidlertid synes separasjonen å ha blitt effektuert av en blandet mekanisme av eluerings- og fortrengningskromatografi som diskutert i en etterfølgende artikkel [se Jen og Pinto Journal of Chromatographic Sciences 29,478-484 (1991)] hvor forfatterne avviser poly(vinylsulfat)fortrenger til fordel for dekstransulfat med høyere molekylvekt. I denne andre publikasjonen, demonstrerer Jen og Pinto overlegenheten til større dekstransulfat i forhold til mindre polyvinylsulfat.
I en etterfølgende artikkel, viser Jen og Pinto [Reactive Polymers 19,145-161 (1993), s. 147] en tabell over alle fortrengere benyttet for fortrengningskromatografi av proteiner på stasjonære faser for ionebytting. I deres diskusjon av resultatene, konkluderer de som før med at 2 kDa polyvinylsulfatet delvis erstatter det andre proteinet og eluerer det første.
Det er nå overraskende funnet at flere klasser ladede forbindelser med lav molekylvekt kan virke meget effektivt som fortrengere for proteiner i fortrengningskromatografi.
O ppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for rensing av et protein, hvor nevnte protein er et polypeptid av molekylvekt 10 kDa eller mer, kjennetegnet ved at den omfatter å sette nevnte protein i et passende påsettingsoppløsningsmiddel på en ionebytters stasjonære fase og fortrenge nevnte protein fra den stasjonære fase ved fortrengningskromatografi ved å anvende en fortrenger med molekylvekt mindre enn 1620 kDa.
I en utførelsesform er den stasjonære fasen en ionebytterharpiks og fortrengeren er en kationisk forbindelse; i en annen utførelsesform er den stasjonære fasen en anionbytterharpks og fortrengeren er en anionisk forbindelse. I forskjellige foretrukne utførelsesformer er fortrengeren et poly(kvaternært ammonium)salt eller fortrengeren er en aminosyreester, aminosyreamid, N-acylaminosyre, peptidester, peptidamid eller en acylpeptid, foretrukket lavere alkylester eller amider av lysin, arginin, N^acylert lysin, eller N°-acylert arginin. Lavere alkyl refererer til lineære, forgrenede, cykliske, mettede hydrokarbonrester med 6 eller færre karboner. Fortrengeren kan også være et kationisk eller anionisk antibiotikum eller en dentritisk polymer. Når fortrengeren er en dendritisk polymer, er en foretrukket fortrenger
hvor X"er et motion, f.eks. halogen, sulfat, sulfonat, perklorat, acetat, fosfat eller nitrat.
Generelt kan fortrengeren fordelaktig være valgt blant elektrolytter hvis karakteristiske ladning (v) og likevektskonstant (K) er slik at når et koordinatsystem som representerer log K på ordinaten og v på absissen blir tegnet, har en linje konstruert fra et punkt A på ordinataksen gjennom et punkt definert ved K og v til fortrengeren, en større stigning enn en tilsvarende linje konstruert for det samme punkt A gjennom et punkt definert ved K og v til proteinet som skal bli renset. Punktet A tilsvarer i verdi til stigningen av fortrengerens operasjonslinje (A) i det aktuelle systemet. Dette vil bli forklart i større detalj nedenfor. Fortrengere med molekylvekt under 900 er spesielt fordelaktige.
Ifølge et trekk av oppfinnelsen angår den en fremgangsmåte for rensing av et protein omfattende setting av et protein i et passende oppløsningsmiddel på en stasjonær ionebyttefase og fortrenge proteinet fira den stasjonære fasen ved fortrengningskromatografi og anvendelse av en dendritisk polyelektrolyttfortrenger. Den stasjonære fasen kan være en kationisk ionebytteresin, i hvilket tilfelle polyelektrolytten vil være et polykation eller den stasjonære fasen kan være en anionbytteresin, i hvilket tilfelle polyelektrolytten vil være et polyanion. Fortrinnsvis, er polyelektrolytten et poly(kvatemært ammonium)salt. Andre foretrukne dentritiske polymerer er Ifølge et annet aspekt angår oppfinnelsen forbindelser med formelen
hvor R.<1>er lavere alkyl med seks eller færre karbonatomer, n er 2 til 6, og X er halogen, sulfat, sulfonat, perklorat, acetat, fosfat eller nitrat. Forbindelsene er anvendelige som fortrengere i fortrengningskromatografi.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 er en skjematisk representasjon av en standard isokratrisk lineær elueringskromatografi.
Figur 2 er et typisk kromatogram fra elueringskromatografi.
Figur 3 er en skjematisk representasjon av fortrengningskromatografi.
Figur 4 er et typisk kromatogram fra fortrengningskromatografi.
Figur 5 er en grafisk fremstilling av likevektskonstant (K) som funksjon av karakteristisk ladning (v) for to proteiner og to fortrengere ifølge oppfinnelsen. Figurene 6, 7 og 8 er kromatogrammer av proteiner ved anvendelse av fortrengere ifølge oppfinnelsen.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen inkludert foretrukne utførelsesformer
En bedre forståelse av den overraskende oppdagelsen at mindre molekyler kan benyttes effektivt som fortrengere i kromatografi av proteiner kan oppnås ved kort å betrakte en forbedret matematisk modell for fortrengningskromatografi.
Den steriske massevirknings (SMA) ionebyttemodellen utviklet av en av oppfinnerne beregner, i motsetning til andre modeller, eksplisitt de steriske effektene i multikom-ponentproteinlikevekt og er i stand til å forutsi kompleks oppførsel ved ionebytterfortrengningssystemer. Et oppløst makromolekylært stoff er som et protein eller polyelektrolytt antatt å ha en flerpunktsfesting til en ionebytteoverflate og et antall vekselvirkninger mellom absorbentoverflaten og et enkelt makromolekyl er definert som den karakteristiske ladningen til det oppløste molekyl. Den karakteristiske ladningen til et oppløst stoffer numerisk lik antallet saltmotioner fortrengt av det oppløste stoff fra ionebytteoverflaten ved adsorpsjon. Imidlertid, i tillegg til setene ved hvilke polyelektrolytten faktisk vekselvirker, hindrer et stort oppløst makromolekyl bundet til en ionebytteoverflate også sterisk adsorpsjon av makromolekyler av tilsvarende størrelse på seter under og i sammenheng med det bundede oppløste molekyl. Antallet sterisk hindrede saltmotioner på overflaten (pr. absorbert oppløst molekyl), som er utilgjengelig for utbytting med andre oppløste molekyler i fluidfasen, er definert som den steriske faktor til det adsorberte makromolekylet. Tidligere behandling av massevirkningsionebyttelikevekt har antatt at bindingen av et behandling av massevirkningsionebyttelikevekt har antatt at bindingen av et makromolekyl til adsorbentoverflaten kun påvirker et antall absorpsjonsseter lik dets karakteristiske ladning. Faktisk, spiller den steriske skjermingen av den stasjonære fasens seter en viktig rolle i den ikke-lineære adsorpsjonsoppførselen til makromolekyler i ionebyttesystemer.
Den støkiometriske utbyttingen av et oppløst molekyl (protein eller polyelektrolytt) og utbyttbare saltmotioner, kan representeres ved: hvor C og Q er konsentrasjonen til den mobile og stasjonære fase; vj er den karakteristiske ladningen til det oppløste stoff og indeksene i og s refererer til hhv. det oppløste molekyl og saltmotionet. Streken over Q angir bundede saltmotioner tilgjengelig for utbytting med det oppløste makromolekylet i oppløsningen. Likevektskonstanten Kffor det oppløste stoff adsorbert på ionebytteoverflaten er gitt ved
Likevektskonstanten er et mål på affiniteten til molekylet. Den elektronøytrale betingelsen på den stasjonære fasen er gitt ved den følgende relasjon:
Hvor o"j er den steriske faktor for fortrengeren eller proteinet.
Ved å sette ligning 3 inn i ligning 2 og omordne denne får man den følgende likevektsrelasjon for et enkelt protein eller fortrenger:
Ved å kjenne verdiene til motionkonsentrasjonen Cs til den mobile fasen, kolonneionebytterens kapasitet, A, og modellparameterne for hver komponent, kan man enkelt generere en enkelt komponents isoterm fra ligningen (4). De nødvendige modellparameterne for hver komponent er: karakteristisk ladning,\[, sterisk faktor, ai og likevektskonstant Kj. For å benytte denne modelle for forutsigelse av fortrengnings-oppførsel, er det nødvendig å bestemme modellparametere for proteinene og fortrengerne.
Ionebytterens kapasitet, A, kan bli målt in situ ved anvendelse av frontale kromatografiske teknikker [se Gadam et al., J. Chromatog. 630, 37-52 (1993)].
For proteinmolekyler som har signifikante saltsensitiv retensjonsoppførsel under lave til moderate saltkonsentrasjoner i den mobile fasen, kan lineær elueringskromatografi bli benyttet for å bestemme to av de tre SMA modellparameterene (dvs. karakteristisk ladning og likevektskonstant) ved anvendelse av veletablerte forhold for ionebyttesystemer [se Kopaciewicz et al., J. Chromatog. 266, 3 (1983)]. Lineære elueringseksperimenter ble utført i forskjellige saltkonsentrasjoner i mobil fase for å bestemme karakteristisk ladning (vj) og likevektskonstant (K|) ved følgende ligning:
hvor for log k' ved log Cs plot, stigning = -Vj; og skjæring = log (13 Kj<AV>i).
Etter å ha bestemt de karakteristiske ladninger og likevektskonstantene for proteinene, blir de gjenværende SMA parameterene, dvs. sterisk faktor, ai, for proteinene bestemt uavhengig fra et enkelt ikke-lineært frontalt kromatografisk eksperiment ifølge ligningen:
Mange proteiner viser signifikant høyere steriske faktorer i forhold til deres karakteristiske ladning, noe som ikke er overraskende i lys av konformasjonsmessige spenninger i proteinmolekylene. Straks SMA parameterene er oppnådd for et gitt protein, kan modellen benyttes for å generere adsorpsjonsisotermer ved en hvilken som helst saltkonsentrasjon.
Mens bestemmelsen av karakteristisk ladning og likevektskonstant fra lineære elueringsdata går bra for moderat tilbakeholdte proteiner, er det meget vanskelig å karakterisere høyaffmitetsfortrengere på denne måte. Frontalkromatografi på den annen side, er veltilpasset for parameterestimeringer for disse høyaffinitetsforbindelsene. Den karakteristiske ladning for fortrengeren, vpj, kan bli bestemt fra den induserte saltgradienten ved anvendelse av den følgende ligning:
hvor nj er totalantallet fortrengte ioner, nj) er antallet mol fortrenger adsorbert på den stasjonære fase, Ctj er den mobile fasens konsentrasjon av polyelektrolyttfortrenger og ACSer trinnøkningen i den mobile fases motionkonsentrasjon etter fortrenger-adsorpsjon. Ved tilstrekkelig lav saltkonsentrasjon i mobil metter fortrengeren fullstendig den stasjonære fasens materiale. Frontaleksperimenter under disse betingelsene kan benyttes ved å bestemme den steriske faktor, ctq, fra den følgende ligning hvor A er ionebytterens kapasitet og Qr<jmax>er den maksimale av stasjonær fasekapasiteten til polyelektrolyttfortrengeren. Alternativt, kan den steriske faktoren bli bestemt ved måling f.eks. av sterisk hindrede natriumioner fortrengt av en ammoniumfront (analogt med målingen av ionebytterens kapasitet), nj, som gitt ved
Likevektskonstanten for ionebytterprosessen er definert ved ligning 2. Når den karakteristiske ladning og steriske faktor målt uavhengig som beskrevet ovenfor, blir et fronteksperiment benyttet for bestemmelse av likevektskonstanten Kj> Dette eksperimentet blir utført under relevante saltbetingelser i mobil fase hvor det oppløste stoff ikke fullstendig metter materialet. Likevektskonstanten ble direkte beregnet fra gjennomstrømningsvolumet ved anvendelse av uavhengig bestemte verdier for den karakteristiske ladning (vp) og sterisk faktor (cttj) ved ligningen
hvor R er kolonnens faseforhold og Cg er den initielle saltkonsentrasjonen i bæreren. Straks den karakteristiske ladning, steriske faktor og likevektskonstant er bestemt, kan isotermene til proteiner og polyelektrolytter bli simulert ved anvendelse av SMA formalismen beskrevet ovenfor.
Ifølge den konvensjonelle kunnskap basert på resultater observert med derivatiserte polysakkaridfortrengere, er en forbindelse med høy molekylvekt med relativt høy karakteristisk ladning og et høyt forhold mellom sterisk faktor til karakteristisk ladning, nødvendig for proteinfortrengningskromatografi. Det har derfor hittil ikke foreligget definerte kriterier for valg eller bestemmelse av effektivitet til en fortrenger i forhold til en annen. Ved anvendelse av den matematiske modellen beskrevet ovenfor, er det nå mulig å forutsi elueringsrekkefølgen til fødekomponentene som en funksjon av den karakteristiske ladning og likevektskonstanten til hver av komponentene, når stigningen av fortrengerens driftslinje er kjent.
Det matematiske kriteriet for effektiv fortrengningskromatografi kan rekonstrueres som en grafisk avsetning av log Kj vs. vj (se fig. 5). Elueringsrekkefølgen i den isotaktiske fortrengningsrekken kan så bli grafisk bestemt ved konstruksjon av linjer fra punktet på ordinataksen svarende til stigningen av fortrengerens driftslinje, A, gjennom hvert av punktene definert ved likevektsparametrene (karakteristisk ladning og likevektskonstant) til de oppløste stoffene. Elueringsrekkefølgen av fødekomponentene svarer til rekkefølgen mot klokken (dvs. økende stigninger) til disse "affinitets"-linjene. I ligning (12) er ( C\)^ konsentrasjonen av salt som fortrengeren møter (dvs. bærerens saltkonsentrasjon), Qder konsentrasjonen av fortrengeren på den stasjonære fasen og Cd er konsentrasjonen av fortrengeren i den mobile fasen.
Selv om man ikke ønsker å være bundet av denne hypotetiske konstruksjonen, synes det i samsvar med oppdagelsen at mindre molekyler kan være effektive fortrengere, idet størrelsen ikke er den kritiske parameteren. Ifølge teorien kan et hvilket som helst molekyl, hvis Ki og v[plasserer den mot klokken på et affinitetsplot fra proteinet som er av interesse, fungere som en effektiv fortrenger for det proteinet.
I samsvar med denne antagelsen har et antall fortrengere med lav molekylvekt blitt testet og funnet effektive for proteinfortrengning.
Dendritiske polymerer (også kjent som stjerneskuddpolymerer) er tredimensjonale, sterkt ordnede oligomere og polymere forbindelser dannet ved reiterative reaksjonssekvenser med utgangspunkt i små molekyler - "initiatorkjerner" slik som ammoniakk eller pentaerytritol. Ved valg av byggestener og fortsettelsesreaksjoner, kan kritiske molekyldesignparametere slik som størrelse, fasong, topologi, fleksibilitet og overflatekjemi bli presist kontrollert på molekylnivå. Prosessen går via diskrete trinn referert til som generasjoner. Dendrimer har tre forskjellige arkitektoniske trekk: (1) en initiatorkjemeregion, (2) indre soner inneholdende kaskadebindere av forgrenede celler med radiell sammenheng med initiatorkjernen, og (3) en ytre eller overflateregion av terminale grupper forbundet til den ytre generasjon.
Syntesen av en nulte (12), første (14) og andre [(16) vist i skjema 2] generasjons pentaerytritolbasert dendrimer ble utført som beskrevet i detalj senere. Nulte generasjon dendrimer er referert til for enkelhets skyld som PETMA4, PentaErytrityl (TriMetylAmmonium)4, første generasjon som PETMA12, og den andre som PETMA36.
SMA modell-likevektsparametere for den nulte, første og andre generasjons dendrimer ble estimert på en 50 x 50 mm LD. SCX kolonne ved anvendelse av frontalkromatografiske teknikker.
Som det kan ses fra tabell 1, binder omkring en tredjedel av det totale antallet ladninger på hver av dendrimene til overflaten. Den første generasjon (PETMA12) og den andre generasjon (PETMA36) dendrimerer har tilsvarende adsorpsjonsoppførsel, med tilsvarende verdier på arj/vD og Qdx vtj og marginal økning i Qdmed reduksjon i saltkonsentrasjonen. Som sett i tabell 1, har den andre generasjon dendrimer PETMA36 en relativt høyere karakteristisk ladning enn den første generasjon dendrimer, men en tilsvarende aj/vj forhold. Ifølge teorien, skulle PETMA36 virke som en effektiv fortrenger, og dette ble faktisk funnet å være tilfelle. En to-proteinfortrengningsseparasjon (a-chymotrypsinogen A og cytokrom C) ved anvendelse av PETMA36 ble utført i en 100 x 5 mm kationbyttekolonne. Det var et relativt godt samsvar mellom teori og eksperiment. Eksperimentet ble gjentatt ved anvendelse av renset (diafiltrert) første generasjons pentaerytritol PETMA12 som fortrenger. Disse fortrengninger indikerer at reduksjon av molekylvekt og antallet ladede grupper på dendrimerene synes å ha liten effekt på deres effektivitet som fortrengere. Ved å utvide forutsigelsen ett nivå videre, vil man anta at nulte generasjons dendrimer også ville virke som proteinfortrenger. Denne antagelsen går tvert i mot den konvensjonelle kunnskap om anvendelsen av polyelektrolytter med høy molekylvekt med høye karakteristiske ladninger som fortrengere for proteiner i ionebyttesystemer. (Nulte generasjons dendrimer har en nettoladning på 4, en karakteristisk ladning på 1,7 og en molekylvekt på 480 Da.).
Resultatene fra fortrengningskromatografien av to-proteinblandingen av a-chymotrypsinogen A og cytokrom-C med nulte generasjons dendritisk fortrenger er vist i figur 6. Som vist i figuren, ble en utmerket fortrengningsseparasjon av de to proteinene observert i sterkt konsentrerte naboliggende soner med skarpe grenser og relativt minimal blanding. Dette resultatet er revolusjonerende og er av stor signifikans for implementeringen av fortrengningskromatografi for storskalaproteinseparasjoner.
Det kan sees at nulte, første og andre generasjons dendritiske polyelektrolytter virker som effektive fortrengere for proteiner i ionebyttesystemer. Mer signifikant er evnen til forbindelser med lav molekylvekt slik som "nulte" generasjon dendrimer (molekylvekt 480) til å fortrenge relativt høymolekylære proteiner, meget spennende i sammenheng med å forstå fortrengningsfenomenet. Da molekylvekten og antallet ladede grupper i dendrimerene synes å ha liten effekt på deres effektivitet som fortrengere, kan det være mer fordelaktig å benytte en "nulte" generasjons dendrimer som fortrenger. Syntesen av disse molekylene er langt enklere og involverer færre trinn; de er således billigere. De har den ytterligere fordel ved enkel separering fra hvilke som helst fødekomponentsoner ved post-fortrengning, størrelsesbasert nedstrømsprosessering.
Andre elektrolytter med lav molekylvekt synes å virke effektivt som fortrenger for proteiner. For eksempel kan modifiserte aminosyrer og ladningsbærende antibiotika her bli benyttet som fortrengere. Ved modifisert er det ment at aminosyren er forandret for å forandre den fra amfotert til enten kationisk (for kationfortrengningskromatografi) eller anionisk (for antionbyttekromatografi). Dette blir enklest oppnådd ved forestring av karboksylatet for å gi kationiske forbindelser eller acylering av aminet for å gi antioniske forbindelser.
Fortrengere hvis ladning er avledet fra karboksylat synes åvære meget effektive anioniske fortrengere på grunn av deres lavere karakteristiske ladning ved en pH som er vanlig benyttet i kromatografi; som et resultat vil de måtte ha en ekstremt høy likevektskonstant for å falle motsols fra de fleste proteiner av interesse på affinitetsplottet. Av denne grunn er blant aminosyrene, acylert taurinderivater sannsynlige kandidater for anioniske fortrengere.
Karboksyldeirvatiserte aminosyrer gir meget effektive kationiske fortrengere. For eksempel er karbobenzoksylysinmetylester, benzoylargininetylester (BAEE), argininmetylester og argininamid alle effektive fortrengere i fortrengningskromatografi av a-chymotrypsinogen og cytokrom-C. De to første har en enkel positiv ladning; argininmetylester og -amid har to positive ladninger og som et resultat en høyere affinitet for den stasjonære fasen. Adskillelsen av a-chymotrypsinogen og cytokrom-C i isotaktisk fortrengning er sammenlignbar med adskillelsen oppnådd ved anvendelse av fortrengere med høy molekylvekt slik som DEAE dekstran. Et eksempel på et fortrengningskromatogram av a-chymotrypsinogen A og cytokrom-C på en 8 mikrometer tykk kationbyttekolonne ved anvendelse av 45 mM benzoylargininetylester i en 50 mM saltoppløsning ved pH 6,0, er vist i figur 7. De modifiserte aminosyrefortrengerene kan anskaffes i meget ren form ved en kostnad som er en liten del av kostnaden ved fortrengere med høy molekylvekt. I tillegg gir deres mindre størrelse dem bedre transportegenskaper og hurtigere kinetikk.
Mange antibiotika har fordelen at de er små nok til å bli fjernet enkelt hvis de blir funnet i ønskede proteinfraksjoner, men i tillegg kan de ofte fordelaktig bli værende i proteinfraksjonen. For å oppnå den ønskede kombinasjonen av høy karakteristisk ladning og likevektskonstant, er det tydelig at antibiotika med en eller flere sterke dissosieringsfunksjonaliteter er spesielt nyttige. Slik antibiotika omfatter streptomyciner, som har to guanidinfunksjonaliteter. Et eksempel på et fortrengningskromatogram av a-chymotrypsinogen A og cytokrom C på en 8 mikrometer sterk kationbyttekolonne ved anvendelse av 45 mM streptomycinsulfat (molekylvekt 581) i en 30 mM saltoppløsning ved pH 6,0, er vist i figur 8. Demonstrasjonen av at aminosyreestere, dissosiert antibiotika og nulte generasjons dendrimerer, som alle har molekylvekt under 600, er høyt effektive fortrengere bekrefter at molekylvekter over 1620 ikke er nødvendig for fortrengere for proteinkromatografi. Faktisk er det ikke funnet noe tilfelle på at en ladet forbindelse med molekylvekt under 1620 ikke virket, så lenge den karakteristiske ladningen og likevektskonstanten var slik at SMA analysen (vist i figur 5 og forklart ovenfor) forutsa effektivitet.
En fortrengningsseparasjon av en to-komponentblanding ble også utført ved anvendelse av rå PETMA (12) som fortrenger i en 100 x 5 mm kationbyttekolonne. Selv om proteinkomponentene ble fortrengt og vel separert i tilstøtende soner, viste utslippsprofilen tilsvarende karakteristikker som tidligere fortrengninger med urene DEAE-dekstranfortrengere. Mer slående var cytokrom-C sonen betydelig mindre konsentrert i forhold til a-chymotrypsinogen A sonen. Tydeligvis bidro urenheter i fortrengeren til desorpsjon av proteinet og depresjon av deres isotermer. Det er derfor antatt fordelaktig å rense dendrimerene.
En egenskap ved dendrimerene er at forskjellige terminale grupper kan være på overflaten av dendrimerene. De terminale gruppene kan enkelt bli omdannet til funksjonaliteter som gir mulighet for forskjellige anvendelser og dendrimerene har en meget høy densitet i deres terminale grupper som er i deres endelige ytre lag. Når de organiske gruppene på overflaten til disse kompakte molekylene blir funksjonalisert for å være ladede grupper, slik som kvaternære ammoniumsalter og sulfonater, viser de høyere affinitet mot kromatografiske media enn noen proteiner, noe som gjør dem anvendelige som ny type fortrengere i kromatografisk separasjon. Syntesen av skjelettet til en dendritisk polyeter er vist i skjema 1 og dets funksjonaliseringsvei til nye poly(eter-amin)er er vist i skjema 2. Funksjonaliseringen av dendrimere forløpere for å gi anioniske dendrimerer (sulfonater) er vist i skjema 3. Den benyttede strategi i skjema 1 er en modifisert prosedyre avledet fra arbeidet til Hall og Padias [J. Org. Chem. 52, 5305 (1987)]. Pentaerytritol (PE) er også initiatorkjerne, men l-metyl-4-(hydroksymetyl)-2,6,7-trioksabicyklo-[2,2,2]-oktan (MHTBO) blir benyttet som byggesten i steden for hydroksymetylbicyklisk ortoformat (HTBO). N,N-dimetyletanolamin blir benyttet som synton for åintrodusere tertiære aminseter.
Fremstilling av dendrimere elektrolytter
Heksan, tetrahydrofuran (THF), og 2-metoksyetyleter (diglym) ble tørket over natrium og destillert rett før anvendelse. N,N-dimetylformamid (DMF) ble anskaffet fra Aldrich Chemical Co. i HPLC kvalitet. Alle andre oppløsningsmidler og reagenser blir benyttet uten ytterligere rensing hvis ikke annet er spesifisert i prosedyren.
Pentaerv trirj Itetrabromid, PE-Br(4) (forbindelse 1)
I en 1 1, trehalset rundbunnet flaske utstyrt med en mekanisk rører og et termometer ble det plassert pentaerytritol (26,0 g, 0,19 mol) og 200 ml pyridin. Omrøring ble initiert og til suspensjonen, avkjølt i et isbad, ble det tilsatt p-toluensulfonylklorid (152,52 g, 0,8 mol) som et fast stoff ved en slik hastighet at temperaturen ikke steg over 30°C. Etter at tilsetningen var fullstendig, ble den resulterende oppslemmingen omrørt ved 35-40°C i ytterligere to timer. Oppslemming ble så sakte tilsatt til den kraftig omrørte oppløsningen av 200 ml vann, 400 ml metanol og 160 ml konsentrert saltsyre. Det rå hvite pentaerytrityltoluensulfonatet ble ytterligere avkjølt ved tilsetning av mer is, filtrert med sug og vasket med 1 liter vann og 200 ml kald metanol i to porsjoner.
I en 1 1, trehalset rundbunnet flaske utstyrt med en mekanisk rører, et termometer og en kjøler ble det tilblandet noe vått pentaerytrityltoluensulfonat (omkring 140 g), natriumbromid (120 g, 1,16 mol) og 300 ml dietylenglykol. Blandingen ble så oppvarmet til 140-150°C med sakte omrøring og reagert ved denne temperaturen over natten. Etter å ha blitt avkjølt til omkring romtemperatur ble blandingen heilt i 400 ml vann under omrøring, utfellingen ble filtrert med sug og vasket med 500 ml vann. Råproduktet ble tørket under vakuum (1 torr) ved 50°C over natten og rekrystallisert fra aceton. Utbytte: 52 g (70%). Smp. 157-160°C.
1-mer> W-(hydroksymerj'I)-2,6,7-trioksabicyklo 12,2,2]oktan (MHTBO, forbindelse 2)
Pentaerytritol (13,6 g, 0,1 mol), trietylortoacetat (16,22 g, 0,1 mol, 18,3 ml), pyridin p-toluensulfonat (PPTS) (0,5 g, 2 mmol) og 100 ml dioktylftalat ble blandet i en 250 ml rundbunnet flaske utstyrt med et regulert destillasjonsapparat. Blandingen ble oppvarmet til 130-140°C og etanol ble sakte destillert av. Når mengden etanol var nær den teoretiske verdien, ble trykket redusert til mindre enn 0,1 torr og produktet ble destillert under vakuum. Det hvite produktet som ble destillert, krystalliserte i kjøleren for å gi 13,6-14,9 g MHTBO. Utbytte: 85-93%. Forbindelsen kan rekrystalliseres fra toluen, men kan bli benyttet direkte. Smp. 110-112°C.
PE-MBO(4) (forbindelse 3)
I en 500 ml trehalset flaske utstyrt med en mekanisk rører et termometer og en tilsetningstrakt, under argonatmosfære, ble kaliumhydrid (2,8 g, 0,07 mol, 8,0 g 35% suspensjon) vasket to ganger med heksan, vaskevannet ble dekantert av og 100 ml diglym ble tilsatt. Etter at blandingen var avkjølt til 0°C under omrøring, ble en oppløsning av 10,25 g (0,064 mol) MHTBO i 100 ml diglym tilsatt dråpevis og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Så ble en oppløsning av 5,82 g (0,015 mol) pentaerytrityltetrabromid i 100 ml diglym tilsatt dråpevis også ved romtemperatur. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 24 timer. Blandingen ble så heilt i 600 ml isvann og utfellingen ble filtrert, vasket med vann og tørket under vakuum (1 torr) ved 50°C over natten. Et hvitt fast stoff (8,2 g, 78%) ble oppnådd. Beilstein-test for bromid var negativ. Produktet ble til sist rekrystallisert fra 4:1 etylacetat/heksan. Utbytte: 5,86 g, 55%. Smp. 220°C svak krymping, 230-244X smelting.
PE-OH(12) (forbindelse 4)
I en 250 ml rundbunnet flaske ble PE-MBO(4) (6,0 g, 8,53 mmol) blandet med 100 ml metanol og 1 ml konsentrert HC1. Blandingen ble oppvarmet sakte til tilbakeløps-temperatur og holdt med tilbakeløpskjøling i l time. Metanol og metylacetat ble destillert av til omkring 1/3 av oppløsningsmidlet var igjen. Det hvite produktet ble filtrert og tørket. Utbytte: 4,86 g (8,0 mmol), 94%. Smp. 180°C med krymping, 220-235°C smelting.
PE-Tos(j 2) (forbindelse S)
I en 500 ml Erlenmeyer-kolbe ble PE-OH(12) (2,24 g, 3,68 mmol) oppløst i 40 ml pyridin og avkjølt til 0°C. En oppløsning av 21,2 g p-toluensulfonylklorid (0,11 mol, 30 ekv.) i 100 ml pyridin tilsatt dråpevis gjennom en tilsetningstrakt. Oppløsningen ble omrørt i ytterligere 1 time ved 0°C, så hensatt ved romtemperatur i 4 dager. Oppløsnings-midlet ble heilt i 500 ml isvann og oppløsningsmidlet ble dekantert av etter at utfellingen samlet seg på bunnen av begeret. Råproduktet, 9 g, ble tørket under vakuum (1 torr) ved 50°C over natten og ble så rekrystallisert fra 4:1 etanol/kloroform. Utbytte: 8,16 g (3,32 mmol), 90%. Smp. 130-133°C.
PE-Br(12) (forbindelse 6)
PE-Tos(12) (8,0 g, 3,25 mmol) ble oppløst i 50 ml N,N-dimetyIacetamid (DMAc) og 10,06 g NaBr (98 mmol, 30 ekv.) ble så tilsatt. Den resulterende suspensjonen ble omrørt og oppvarmet til 150°C og holdt ved denne temperaturen i ytterligere 1 time. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur og heilt i isvann. Utfellingen ble filtrert, vasket under vakuum (1 torr) over natten og rekrystallisert fra etylacetat. Utbytte: 3,40 g (77%). Smp. 150°C med krymping, 172-177°C smelting.
P£-MBO(12) (forbindelse 7)
I en 500 ml trehalset rundbunnet flaske med mekanisk rører, et termometer og en tilsetningstrakt under argonatmosfære ble kaliumhydrid (1,6 g, 40 mmol, 4,57 g 35% suspensjon) vasket med heksan to ganger, vaskevannet ble dekantert av og 100 ml DMF ble tilsatt. Blandingen ble avkjølt til 0°C og en oppløsning av 5,76 g MHTBO (forbindelse 2) (36 mmol, 24 ekv.) i 50 ml DMF ble tilsatt dråpevis. Den resulterende suspensjonen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Dodekabromid (2,05 g, 1,5 mmol) ble oppløst i 100 ml DMF ved 50°C og ble så hurtig tilsatt dråpevis til reaksjonsflasken umiddelbart mens den enda var varm. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 24 timer og så heilt i isvann inneholdende omkring 50 g natriumklorid. Utfellingen ble filtrert og tørket under vakuum (1 torr) ved 40°C, over natten. Råutbyttet var kvantitativt (3,45 g) og produktet ble renset ved kolonnekromatografi med silikagel som stasjonære fase og en blanding av 1:1 etylacetat/heksan som elueringsmiddel. Rf-verdi: 0,42. Utbytte: 2,9 g (1,25 mmol), 82%. Beilstein-testen for halogen var negativ. Smp.: 78°C med krymping, 88-90°C gelering, 170°C mykning.
PE-OH(36) (forbindelse 8)
I en 250 ml rundbunnet flaske ble det anbragt PE-MBO(12) (4,4 g, 1,9 mmol), 100 ml metanol og 1 ml konsentrert HC1. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 1 time. Metanol og metylacetat ble destillert av inntil kun 15 til 20 ml av oppløsningen forble og oppløsningen ble overført til et beger. Etter at resten av oppløsningsmidlet var avdampet fullstendig, ble sirupen tørket under vakuum (1 torr) for å gi et skum. Utbytte: 3,35 g (1,66 mmol), 88%. Smp. 75°C med krymping, 83-85°C gelering, 220-230°C mykning.
FE-Tos(36) (forbindelse 9)
I en 500 ml Erlenmeyer-kolbe ble PE-OH(36) (4,17 g, 2,05 mmol) oppløst i 180 ml pyridin og avkjølt til 0°C. En oppløsning av p-toluensulfonylklorid (29,4 g, 0,15 mol, 75 ekv.) i 200 ml pyridin ble tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt i ytterligere 1 time ved 0°C og så hensatt ved romtemperatur i 7 dager. Den brune oppløsningen ble heilt i 2 liter isvann og utfellingen ble filtrert og tørket under vakuum (1 torr) ved 40°C over natten. Utbytte: 14,36 g (1,88 mol), 92%. Smp.: 120°C med krymping, 220-245°C smelting.
PE-Br(36) (forbindelse 10)
I en 250 ml trehalset rundbunnet flaske ble det blandet 7,58 g (1,0 mmol) PE-Tos(36), 8,32 g (80 mmol, 80 ekv.) NaBr og 100 ml DM Ac. Blandingen ble omrørt og oppvarmet til 150°C og holdt ved denne temperaturen i 1 time. Så ble blandingen avkjølt til romtemperatur og heilt i 2 liter isvann under omrøring. Utfellingen ble filtrert, vasket med ytterligere 50 ml vann og tørket under vakuum (1 torr) ved romtemperatur over natten. Utbytte: 4,18 g, 98%. Smp. 48°C med krymping. 52-68°C smelting.
Tetrakis [((N,N-dimerylamino)etoksy)metyl]metan, PE-DMA(4) (forbindelse 11)
I en 500 ml trehalset, rundbunnet flaske utstyrt med en mekanisk rører, en tilsetningstrakt og et termometer ble kaliumhydrid (5,2 g, 0,13 mol, 14,8 g av en 35% suspensjon) vasket med heksan to ganger under argonatmosfaere og 100 ml DMF ble tilsatt. Når blandingen var avkjølt til 0°C ble en oppløsning av 10,7 g (0,12 mol, 6 ekv.) N,N-dimetyletanolamin i 100 ml DMF tilsatt dråpevis og omrørt ved romtemperatur i 3 timer. En oppløsning av 7,8 g (0,02 mol) pentaerytrityltetrabromid i 100 ml DMF ble tilsatt dråpevis. Blandingen ble oppvarmet ved 80°C og reagert ved 80-90°C i 12 timer. Så ble temperaturen øket til tilbakeløpstemperatur i ytterligere 12 timer. Den resulterende blandingen ble avkjølt til under 50°C og heilt i 300 ml isvann. Alt oppløsningsmidlet ble fjernet på rotavapor og resten ble ekstrahert med 800 ml etyleter i få porsjoner og de sammenslåtte ekstraktene ble tørket over MgS04- Etter at eter var avdampet, ble råproduktet destillert under vakuum (<0,1 torr) for å gi 5,7 g av en oljeaktig flytende PE-DMA(4). Forbindelsen ble ytterligere renset for å gi en klar vasske på en AI2O3kolonne ved bruk av en blanding av 4:1 etylacetat/heksan som elueringsmiddel. Rf-verdi: 0,57. Utbytte: 4,66 g, 59%. Kp.: 140-143°C (0,03 mmHg).
Tetrakis [((N^4,N-trimetylammoniumjodid)etoksy)metyl] metan, PE-TMA jodid(4)
(forbindelse 15)
I en 100 ml trehalset flaske ble det plassert PE-DMA(4) (2,3 g, 5,5 mmol) og 30 ml THF under en argonatmosfære. Oppløsningen ble avkjølt til 0°C og en oppløsning av CH3I (9,3 g, 66 mmol, 12 ekv., 4,1 ml) i 20 ml THF ble tilsatt dråpevis. Etter at tilsetningen var fullstendig, ble blandingen omrørt ved romtemperatur i fem ytterligere timer. Den gulaktige utfellingen ble filtrert, tørket over vakuum (1 torr) ved 60°C over natten og endelig rekrystallisert fra metanol. Forbindelsen var sterkt hygroskop. Utbytte: 3,84 g, 70%.
PE-DMA(12) (forbindelse 13)
Prosedyren er tilsvarende den benyttet for PE-DMA(4). Kaliumhydrid (2,8 g, 0,07 mol, 8.0 g av en 35% suspensjon) ble vasket med heksan to ganger under argonatmosfære og 100 ml DMF ble tilsatt. En oppløsning av 6 ml (0,06 mol, 5,34 g) N,N-dimetyletanolamin i 50 ml DMF ble tilsatt dråpevis ved 0°C og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. PE-Br(12) (2,72 g, 32 mmol) ble oppløst i 150 ml DMF ved 50°C og oppløsningen ble tilsatt dråpevis, mens den enda var varm gjennom en tilsetningstrakt. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 24 timer og heilt i
300 ml isvann. Etter at all DMF og vann var avdampet ble resten ekstrahert med 800 ml eter i flere porsjoner og tørket over MgS04. Eterporsjonen ble filtrert og konsentrert til omkring 200 ml. I en 300 ml trehalset flaske ble HC1 gass introdusert i oppløsningen og oppløsningsmidlet ble dekantert når ikke mer salt ble dannet. Saltet ble vasket med vannfri eter to ganger, tørket under argon i en halv time, oppløst i vann og gjort basisk til pH >10. Den resulterende vandige oppløsningen ble tørket på en rotavapor og resten ble ekstrahert med 500 ml eter og tørket over MgS04- Etter at eteren var avdampet ble 2.1 g relativt rent produkt oppnådd. Forbindelsen er en viskøs olje; kp. 220°C ved 0,02 torr. Utbytte: 72%.
PE-TMA-jodid(12) (forbindelse 14)
Prosedyren er identisk den benyttet for PE-TMA (jodid(4)). PE-DMA(12) (2,04 g, 1,4
mmol) ble oppløst i 60 ml THF. Ved 0°C ble en oppløsning av 3,2 ml (7,12 g, 50 mmol, 36 ekv.) CH3I i 20 ml THF tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i ytterligere 3 timer. Den gule utfellingen ble filtrert og tørket under vakuum (1 torr) ved 60°C over natten. Dette saltet kan ikke bli rekrystallisert fra metanol og ble ytterligere renset ved ultrafiltrering før det ble testet som en fortrenger. Utbytte: 3,74 g, 84%.
PE-DMA(36) (forbindelse 15)
Denne prosedyren er identisk med den benyttet for PE-DMA(12). Kaliumhydrid (2,8 g, 0,07 mmol, 8,0 g av 35% suspensjon) ble vasket to ganger med heksan og 100 ml DMF ble tilsatt. Ved 0°C ble en oppløsning av 6,4 ml (5,7 g, 64 mmol, 80 ekv.) N,N-dimetyletanolamin i 50 ml DMF tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. PE-Br(36) (3,43 g, 0,8 mmol) ble oppløst i 100 ml DMF og tilsatt dråpevis ved romtemperatur. Blandingen ble oppvarmet med tilbakeløpskjøling i 24 timer og heilt i 200 ml isvann. Etter at alt oppløsningsmidlet var fjernet ble resten ekstrahert med 800 ml eter. Polyaminet ble omdannet til et salt ved bobling av HC1 gass inn i eteroppløsningen og ble så frigjort ved å gjøre den vandige oppløsningen basisk til pH>10. Denne forbindelsen er en meget viskøs sirup og er sterkt hygroskop. Utbytte: 1,86 g,51%.
PE-TMA-jodid(36) (forbindelse 16)
Fremgangsmåten er også identisk med den benyttet for PE-TMA-jodid(4) og PE-TMA(12). PE-DMA(36) (1,79 g, 0,39 mmol) ble oppløst i 100 ml THF og avkjølt til 0°C. En oppløsning av 4,2 g (1,82 ml, 30 mmol, 75 ekv.) CH3I i 20 ml THF ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i ytterligere 3 timer. Utfellingen ble så filtrert og tørket under vakuum (1 torr) ved 60°C over natten. Utbytte: 2,8 g, 75%.
Claims (8)
1.
Fremgangsmåte for rensing av et protein, hvor nevnte protein er polypeptid av molekylvekt 10 kDa eller mer,karakterisert vedat den omfatter å sette nevnte protein i et passende påsettingsoppløsningsmiddel på en ionebytters stasjonære fase og fortrenge nevnte protein fra den stasjonære fase ved fortrengningskromatografi ved å anvende en fortrenger med molekylvekt mindre enn 1620 kDa.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den stasjonære fase er en kationbytterharpiks og nevnte fortrenger er et kationisk spesies, for eksempel (a) et poly(kvaternært)ammoniumsalt eller 00
hvor X"er et motion valgt blant gruppen omfattende halogen, sulfat, sulfonat, perklorat, acetat, fosfat og nitrat.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den stasjonære fase er en anionbytterharpiks og nevnte fortrenger er et anionisk spesies.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fortrengeren er: (a) valgt fra aminosyreestere, aminosyreamider, N-acylaminosyrer, peptidestere, peptidamider og N-acylpeptider, lavere alkylestere og amider av lysin, lavere alkylestere og amider av arginin, lavere alkylestere og amider av Not-acylert lysin og lavere lavere alkylestere og amider av Na-acylert arginin; eller (b) en dendritisk polymer; eller (c) et kationisk antibiotikum; eller (d) et anionisk antibiotikum.
5.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat fortrengeren er oppløst i et oppløsningsmid-delsystem og nevnte fortrenger er valgt fra elektrolytter hvis karakteristiske ladning (v) og likevektskonstant (K) er slik at når et koordinatsystem som representerer logK på ordinaten og v på abscissen blir fremstilt, har en linje konstruert fra et punkt A på ordinataksen gjennom et punkt definert ved K og v til fortrengeren en større stigning enn en tilsvarende linje konstruert fra det samme punkt A gjennom et punkt definert ved K og v av proteinet som skal renses, hvor punkt A i verdi tilsvarer stigningen til fortrengerens driftslinje (A) i nevnte oppløsningsmiddel hvori fortrengeren er oppløst.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fortrengeren er en dendritisk polyelektrolyttfortrenger.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat den stasjonære fasen er en kationbytterharpiks og nevnte polyelektrolyttfortrenger er et polykation, for eksempel et poly(kvaternært ammonium)salt.
8.
Forbindelse,karakterisert vedat den har formelen hvor R<*>er lavere alkyl med seks eller færre karbonatomer, n er 2 til 6, og X er halogen, sulfat, sulfonat, perklorat, acetat, fosfat eller nitrat.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/197,146 US5478924A (en) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Displacement chromatography of proteins using low molecular weight displacers |
PCT/US1995/001966 WO1995022555A1 (en) | 1994-02-16 | 1995-02-16 | Displacement chromatography of proteins using low molecular weight displacers |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO963420L NO963420L (no) | 1996-08-15 |
NO317346B1 true NO317346B1 (no) | 2004-10-18 |
Family
ID=22728236
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19963420A NO317346B1 (no) | 1994-02-16 | 1996-08-15 | Fortrengningskromatografi av proteiner ved bruk av fortrengere med lav molekylvekt |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5478924A (no) |
EP (1) | EP0751952B1 (no) |
JP (1) | JP3995260B2 (no) |
CA (1) | CA2183160C (no) |
DE (1) | DE69531197T2 (no) |
NO (1) | NO317346B1 (no) |
WO (1) | WO1995022555A1 (no) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5478924A (en) * | 1994-02-16 | 1995-12-26 | Cramer; Steven M. | Displacement chromatography of proteins using low molecular weight displacers |
PL327920A1 (en) * | 1996-01-19 | 1999-01-04 | Cohesive Technologies | Highly efficient liquid chromatography process and chromatographic apparatus therefor |
WO1998006691A2 (en) | 1996-08-14 | 1998-02-19 | Warner-Lambert Company | Low molecular weight dendritic compounds as pharmaceutical agents |
US6239262B1 (en) * | 1998-01-07 | 2001-05-29 | Rensselaer Polytechnic Institute | Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems |
EP0943632A1 (en) * | 1998-03-18 | 1999-09-22 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne | Quaternary ammonium polymer, its preparation, its use for separating biomolecules |
US6573373B1 (en) * | 1999-06-29 | 2003-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | High affinity, low molecular weight displacers for oligonucleotide purification |
US6881540B2 (en) | 2000-02-23 | 2005-04-19 | Rensselaer Polytechnic Institute | High throughtput screening of potential displacer molecules |
US20050176937A1 (en) * | 2000-02-23 | 2005-08-11 | Rensselaer Polytechnic Institute | High throughput screening of potential displacer molecules |
AU2003213642A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-16 | Rensselaer Polytechnic Institute | High-affinity, low-molecular-mass displacers for ion-exchange chromatography |
US6749749B2 (en) | 2002-06-26 | 2004-06-15 | Isco, Inc. | Separation system, components of a separation system and methods of making and using them |
US7291395B2 (en) * | 2004-02-18 | 2007-11-06 | Dionex Corporation | Coated ion exchanged substrate and method of forming |
WO2006028433A1 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-16 | Dyer Gordon W | Use of compounds for the inhibition of proteins and uv protection |
GB2439875B (en) * | 2005-04-22 | 2010-10-20 | Waters Investments Ltd | Apparatus and methods for mass spectrometric directed purification of biopolymers |
WO2007053235A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Sachem, Inc. | Cation-exchange displacement chromatography process and cationic organic compounds for use as displacer compounds in cation-exchange displacement chromatography process |
US8496835B2 (en) * | 2005-12-02 | 2013-07-30 | Sachem, Inc. | Anion-exchange displacement chromatography process and anionic organic compounds for use as displacer compounds in anion-exchange displacement chromatography process |
KR101310815B1 (ko) * | 2006-03-16 | 2013-09-27 | 에치투엘 주식회사 | 중공사막 및 그의 제조방법 |
AU2007292253A1 (en) * | 2006-09-08 | 2008-03-13 | Wyeth | Arginine wash in protein purification using affinity chromatography |
AU2014226126B2 (en) | 2013-03-08 | 2019-02-14 | Genzyme Corporation | Continuous purification of therapeutic proteins |
CA2934620A1 (en) * | 2013-12-23 | 2015-07-02 | Xmicrobial, Llc | Microbicidal polymers and methods of use thereof |
TWI709569B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途 |
TWI709570B (zh) | 2014-01-17 | 2020-11-11 | 美商健臻公司 | 無菌層析法及製法 |
EP3843869A1 (en) | 2018-08-31 | 2021-07-07 | Genzyme Corporation | Sterile chromatography resin and use thereof in manufacturing processes |
JP7387155B2 (ja) * | 2019-11-21 | 2023-11-28 | 国立研究開発法人物質・材料研究機構 | イオン液体 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2946757A (en) * | 1955-05-02 | 1960-07-26 | George B Butler | Quaternary ammonium ion exchange resins of improved properties |
US3651231A (en) * | 1969-09-10 | 1972-03-21 | Upjohn Co | Process for preparing lactogenic factor |
US4352919A (en) * | 1981-02-02 | 1982-10-05 | Milliken Research Corporation | Aminoalkoxypentaerythritols |
US5156835A (en) * | 1987-01-30 | 1992-10-20 | Colgate-Palmolive Company | Antibacterial antiplaque oral composition |
US5028696A (en) * | 1988-10-28 | 1991-07-02 | Torres Anthony R | Ion exchange and separation method |
IT1232311B (it) * | 1989-09-04 | 1992-01-28 | Sclavo Spa | Metodo di purificazione di composti a struttura peptidica o pseudo peptidica a basso peso molecolare. |
US5478924A (en) * | 1994-02-16 | 1995-12-26 | Cramer; Steven M. | Displacement chromatography of proteins using low molecular weight displacers |
-
1994
- 1994-02-16 US US08/197,146 patent/US5478924A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-16 JP JP52191295A patent/JP3995260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-16 EP EP95910281A patent/EP0751952B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-16 DE DE69531197T patent/DE69531197T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-16 CA CA002183160A patent/CA2183160C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-16 WO PCT/US1995/001966 patent/WO1995022555A1/en active IP Right Grant
- 1995-10-19 US US08/545,457 patent/US5606033A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-15 NO NO19963420A patent/NO317346B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2183160C (en) | 1999-12-21 |
US5478924A (en) | 1995-12-26 |
NO963420L (no) | 1996-08-15 |
WO1995022555A1 (en) | 1995-08-24 |
US5606033A (en) | 1997-02-25 |
CA2183160A1 (en) | 1995-08-24 |
EP0751952B1 (en) | 2003-07-02 |
EP0751952A4 (en) | 1997-12-17 |
JPH09509178A (ja) | 1997-09-16 |
EP0751952A1 (en) | 1997-01-08 |
JP3995260B2 (ja) | 2007-10-24 |
DE69531197D1 (de) | 2003-08-07 |
DE69531197T2 (de) | 2004-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO317346B1 (no) | Fortrengningskromatografi av proteiner ved bruk av fortrengere med lav molekylvekt | |
Zhang et al. | Versatile ligands for high-performance liquid chromatography: an overview of ionic liquid-functionalized stationary phases | |
US11236125B2 (en) | Mixed bed ion exchange adsorber | |
JP4188832B2 (ja) | イオン交換体の製造 | |
KR20140084125A (ko) | 소수성 치환 크로마토그래피용 중성 양쪽성 이온 디스플레이서 분자 | |
US7189324B1 (en) | High-affinity, low molecular-mass displacers for ion-exchange chromotography | |
KR20140084127A (ko) | 소수성 치환 크로마토그래피용 양이온 디스플레이서 분자 | |
CA2899387A1 (en) | Purification of organic compounds using surrogate stationary phases on reversed phase columns | |
JPH03118393A (ja) | ペプチド又はプソイドペプチド構造の低分子量化合物の精製方法 | |
JP2010522696A (ja) | 化合物のエナンチオマー同士を分離するキラルセレクタ | |
US7320755B2 (en) | Method of preparing ligands for hydrophobic interaction chromatography | |
Xu et al. | Preparation of highly selective stationary phases for high-performance liquid chromatographic separation of enantiomers by direct copolymerization of monomers with single or twin chiral ligands | |
US6489421B1 (en) | Quaternary ammonium polymer, its preparation, its use for separating biomolecules | |
WO2015040635A2 (en) | Purification of organic compounds by surfactant mediated preparative hplc | |
Qu et al. | Fast separation of hen egg white protein with a phosphorylcholine type zwitterionic ion chromatography stationary phase | |
JP2006522332A (ja) | アフィニティリガンドの製造法 | |
JP5083990B2 (ja) | クロマトグラフィー用光学異性体分離剤及びその製造方法 | |
JP2011252723A (ja) | 有機ポリマーモノリスから構成される分離媒体、これを用いた逆相液体クロマトグラフィー用カラム、及びそれらの製造方法 | |
Chao et al. | Continuous Multiaffinity Separation of Proteins: Cyclic Processes | |
Giacometti et al. | Liquid Chromatography: Chapter 7. Protein and Peptide Separations |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |