NO316706B1 - Perfluoralkylketoninhibitorer av elastase, anvendelse derav, fremgangsmater for fremstilling av disse og preparat inneholdende forbindelsene - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som er inhibitorer av elastase, i særdeleshet human neutrofil elastase, som er anvendbare for et utall fysiologiske og sluttelige anvendelser, og fremgangsmåter for fremstilling av angitte inhibitorer.

Human neutrofil elastase har vært involvert som et middel som bidrar til vevdestruksjon assosiert med et utall inflammatoriske sykdommer slik som kronisk bronkitt, cystisk fibrose og reumatoid artritt. J.L. Malech and J.I. Gallin, New Engl. J. Med., 317(11), 687 (1987). Elastase utviser et bredt område av proteolytisk aktivitet mot et utall av binde-vevmakromolekyler innbefattende elastin, fibronectin, collagen og proteoglycan. Nærværet av enzymelastasen kan bidra til patologien av disse sykdommer.

Normalt plasma inneholder store mengder av proteaseinhibitorer som regulerer et utall av enzymer involvert i bindevev fornye Ise og inflammasjon. Eksempelvis er <x-l-proteinaseinhibitor (a-l-PI) en serinproteaseinhibitor som blokkerer aktiviteten av elastase. a-l-PI har oppnådd betydelig interesse fordi reduksjon i plasmanivåer til mindre enn 15 % av normalt er assosiert med tidlig utvikling av emfysem. I tillegg til plasma-avledede proteaseinhibitorer inneholder sekresjonsvæsker innbefattende bronkialv nasalt, servikalt slim og seminal væske, en endogen proteaseinhibitor kalt sekretorisk leukoproteaseinhibitor (SLPI) som kan inaktivere elastase, og som er antatt å spille en viktig rolle i opprettholdelsen av integriteten av epithelium i nærvær av inflammatoriske celleproteaser. I visse patologiske tilstander inaktiveres ot-l-Pl og SLPI av neutrofile oxidative mekanismer som tillater de neutrofile proteaser å virke i et hovedsakelig inhibitor-fritt miljø. Eksempelvis er bronkiale utskillingsvæsker fra pasienter med voksent respiratorisk nødsyndrom (ARDS) blitt funnet å inneholde aktiv elastase og a-l-PI som er blitt inaktivert ved oxydasjon.

I tillegg til oxidative mekanismer utviser neutrofiler ikke-oxidative mekanismer for å unngå inhibering av antiproteaser. Neutrofiler fra pasienter med kronisk granu-lomatøs sykdom er i stand til å nedbryte endotheliale celle-matriser i nærvær av et overskudd av a-l-PI• Det foreligger et betydelig in vitro bevis for at stimulerte neutrofiler kan binde tett til deres substrater slik at serum-antiproteaser effektivt utelukkes fra mikromiljøet av tett celle-substrat-kontakt. Innstrømningen av et stort antall av neutrofiler til et inflammatorisk sete kan resultere i betydelig vev-skade på grunn av proteolysen som oppstår i denne region.

Søkeren har fastslått at elastase er en av de primære neutrofile proteaser som er ansvarlige for brusk-matriksdegenerering som målt ved evnen til neutrofilt lysat, renset elastase og stimulerte neutrofiler til å nedbryte bruskmatriksproteoglycan. Enn videre har søkeren tidligere oppdaget peptidderivater som er anvendbare som elastaseinhibitorer som utøver verdifulle farmakologiske aktiviteter. Eksempelvis er peptidderivater som er anvendbare som elastaseinhibitorer hvori den terminale carboxylgruppe er blitt erstattet med en pentafluorethylcarbonyl (-C(0)C2F^)gruppe, og hvori den N-terminale aminosyre er substituert med forskjellige beskyttende grupper, beskrevet i Europa-patentsøknad OPI nr. 0529568, Peet et al., med publikasjonsdato 3. mars 1993, og Europa-paténtsøknad OPI nr. 0410411, Bey et al., med publikasjonsdato 30. januar 1991. På grunn av nye fremgangsmåter for fremstilling av perfluoralkylcarbonylpept4der har søkeren nylig funnet heptafluorpropylcarbonyl og nonafluorbutylcarbonylgrupper av elastaseinhibitorer.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som er kjennetegnet ved formelen

hvori

Pi er Val eller Nva;

P2 er Pro, Tic eller Tea;

P3 er Val, Nva, Ala eller bAla; og

P4 er Ala eller en binding,

eller et hydrat, isoster eller farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Forbindelsene av formel I utviser en anti-inflammatorisk effekt som er anvendbar ved behandling av gikt, reumatoid artritt og andre inflammatoriske sykdommer slik som voksent respiratorisk nødsyndrom, septicemia, disseminert intravaskulær koagulasjon, cystisk fibrose, kronisk bronkitt, kronisk .obstruk-tiv pulmonar sykdom, inflammatorisk tarmsykdom (i særdeleshet uleerativ colitt eller Crohns sykdom) og ved behandling av emfysem.

I en ytterligere utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse forbindelser som er kjennetegnet ved formelen

eller et hydrat, isoster eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori

Ri er -CH(CH3)2f-

P2 er Pro, Pip, Pro(4-0Bzl) eller Aze;

P3 er Ile, Val eller Ala;

P4 er Ala eller en binding,

X' er -CF2CF2CF3 eller -CF2CF2CF2CF3; og

K er

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer enn videre en ny fremgangsmåte for fremstilling av de foregående forbindelser, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved trinnene: (a) kopling av en aminosyreester av formelen NH2-CH(Ri) C(=0)0R2 hvori Ra er Ci-s-alkyl, med et egnet N-beskyttet peptid av formelen K' -P4-P3-P2-OH, hvori K' er i nærvær av et egnet koplingsmiddel og i nærvær av et egnet koplingsløsningsmiddel for å gi en egnet N-beskyttet peptidester; (b) omsetning av den egnede N-beskyttede peptidester med et egnet perfluoreringsmiddel i nærvær av en egnet alkalimetallbase og et egnet vannfritt løsningsmiddel.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Isosterer av forbindelsene av formel (I)

innbefatter de hvori (a) én eller flere av a-aminorestene av <P>2<_P>^-substituentene er i deres unaturlige konfigurasjon

(når det er en naturlig konfigurasjon) eller (b) når den normale peptidiske amidbinding [-C(=0)NH-] er modifisert,

slik som for eksempel for å danne -CH2NH- (redusert),

-COCH2- (keto) , -CH(OH)CH2- (hydroxy) , -CHtNH^I^- (amino) , -CH2CH2~ (hydrocarbon), -CH=CH- (alken). Fortrinnsvis skal en forbindelse ifølge oppfinnelsen ikke være i en isosterisk form, og i særdeleshet foretrekkes det at det er ingen modifisert peptidisk araidgruppe, men hvis det er det, er det foretrukket å holde de isosteriske modifikasjoner til et minimum.

Forbindelsene av formel (I) kan. danne farma-søytisk akseptable salter med enhver ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Illustrative uorganiske syrer som danner egnede salter innbefatter saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre, og sure metallsalter slik som natriummonohydrogenortofosfat og kaliumhydrogensulfat. Illustrative organiske syrer som danner egnede salter innbefatter mono-> di- og tricarboxylsyrene. Eksempler på slike syrer er for eksempel eddiksyre, glykolsyre, melkesyre, pyruvsyre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eple-syre, vinsyre, sitronsyre, ascorbinsyre, maleinsyre, hydroxy-maleinsyre, benzosyre, hydroxybenzosyre, fenyleddiksyre, kanelsyre, salicylsyre, 2-fenoxybenzosyre, og sulfonsyrer slik som methansulfonsyre og 2-hydroxyethansulfonsyre.

De naturlige aminosyrene, med unntak av glycin, inneholder et chiralt carbonatom. Med mindre annet spesifikt er angitt, er de foretrukne forbindelser de optisk aktive aminosyrer av L-konfigurasjonen, men søkeren tar imidlertid i betraktning at aminosyrene i forbindelsen med formel (I)-(IV) kan være enten D- eller L-konfigurasjonen eller kan være blandinger av D- og L-isomerene, innbefattende racemiske blandinger. De her kjente forkortelser for <x-aminosyrene er angitt i Tabell I.

Enn videre er de anerkjente forkortelser for a-aminosyrene angitt ved strukturer og navn angitt nedenfor som følger:

1,2,3,4-tetrahydro-3-isokinolincarboxylsyre Thiazolidin-4-carboxylsyre 4 Azetidincarboxy-lsyre Pipecolinsyre 4-hydroxypro1in 4-acetoxyprolin

4-benzyloxyprolin

Som ved enhver gruppe av strukturelt beslektede forbindelser som utviser en særlig generisk anvendelighet er visse grupper og konfigurasjoner foretrukne. Foretrukne forbindelser av formel (I) innbefatter følgende grupperinger.

Med hensyn til substituenten P, er forbindelser av formel (I) hvori P^ er Ala eller en binding, foretrukne. Forbindelser av formel (I) hvori P^ er en binding, er særlig foretrukne.

Med hensyn til substituenten P^ er forbindelser av formel (I) hvori P3 er Val eller Ala, foretrukne. Forbindelser av formel (I) hvori P3 er Val, er særlig foretrukne.

Med hensyn til substituenten P2 er forbindelser av formel (I) hvori P2 er Pro, Tic eller Tea, foretrukne. Forbindelser av formel (I) hvori P2 er Pro, er særlig foretrukne.

En foretrukken forbindelse med formel (I) innbefatter: N- [3-(3-pyridyl)propanoyl]-L-valylrN'-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1-methylethyl)-2-oxobutyl]-L-prolinamid.

Generelt kan forbindelsene av formel (I) fremstilles under anvendelse av standard kjemiske reaksjoner som analogt er kjent innen faget og som er vist i Reaksjonsskjerna A.

P2~' P3~ og K-P^-gruppene kan kjedes til den fri aminogruppe av aminosyrederivatet av struktur (1). Det skal bemerkes at struktur (1) betegner P^-gruppen hvori den frie carboxylgruppe er blitt substituert med en '^"-gruppe som ovenfor definert. P2, P3°9 K~P4 kan kje<ies til den ubeskyttede, fri aminoforbindelse (P^-X) ved velkjente peptidkoplingsteknikker. Enn videre kan P^-, P2-, P3-og K-P4~ gruppene kjedes sammen i enhver rekkefølge så lenge den sluttelige forbindelse er K-P^-P^-P2~P'^-X. Eksempelvis kan K-<P>^ kjedes til P3 for å gi K-P^-P-j som kjedes til <P>j-<P>^<X; >eller K-P^ kan kjedes til P3-P2 og deretter kjedes til en egnet C-terminal beskyttet P^, og den C-terminale beskyttende gruppe omdannes til X.

Generelt forlenges peptider ved avbeskyttelse av oc-aminet av den N-terminale rest og kopling av neste egnede N-beskyttede aminosyre via en peptidbinding under anvendelse av de beskrevne metoder. Denne avbeskyttelse og koplings-prosedyre gjentas inntil den ønskede sekvens erholdes.

Denne kopling kan utføres med bestanddels-aminosyrene på en trinnvis måte som vist i Reaksjonsskjema A, eller ved konden-sasjon av fragmenter (to til flere aminosyrer), eller kombinasjon av begge fremgangsmåter, eller ved fast fase-peptidsyntese i henhold til metoden opprinnelig beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 1963, 85, 2149-2154, hvis beskrivelse herved er inkorporert ved referanse. Når en fast fase-synteseløsning anvendes, bindes den C-terminale carboxylsyre til en løselig bærer (vanligvis polystyren). Disse uløselige bærere inneholder en gruppe som vil reagere med aldehydgruppen for å danne en binding som er stabil overfor forlengelsesbetingelsene, men som lett spaltes senere. Eksempler på slike er: klor- eller brommethylharpiks, hydroxymethylharpiks og aminomethylharpiks. Mange av disse harpikser er kommersielt tilgjengelige med den ønskede C-terminale aminosyre allerede inkorporert.

Alternativt kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen syntetiseres under anvendelse av automatisert peptidsyntese-utstyr. I tillegg til det foregående er peptidsyntese beskrevet i Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. red. Pierce Chemical Co , Rockford, IL (1984): Gross, Meienhofer, Udenfriend, Red., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol 1, 2, 3, 5 og 9, Academic Press,

New York, 1980-1987; Bodanszky, "Peptide Chemistry:

A Practical Textbook", Springer-Verlag, New York (1988):

og Bodanszky et al. "The Practice of Peptide Synthesis" Springer-Verlag, New York (1984), hvis beskrivelse herved

er inkorporert ved referanse.

Kopling mellom to aminosyrer, én aminosyre og ett peptid, eller to peptidfragmenter kan utføres under anvendelse av standard koplingsprosedyrer slik som azidmetoden, blandet carbonsyre-carboxylsyreanhydrid (isobutylklorformialj-metoden, carbodiimid (dicyklohexylcarbodiimid, diisopropyl-carbodiimid, eller vannløselig carbodiimid)-metoden, aktiv ester (p-nitrofenylester, N-hydroxy-ravsyreimidoester)-metoden, Woodward-reagens K-metoden, carbonyldiimidazol-metoden, fosforreagenser slik som BOP-C1, eller oxydasjons-reduksjonsmetoder. Enkelte av disse metoder (spesielt carbodiimidmetoden) kan forbedres ved tilsetning av 1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysuccinimid, dimethylaminopyri-din eller lignende. Disse koplingsreaksjoner kan utføres i en oppløsning (væskefase) eller fast fase.

De funksjonelle grupper av konstituent-aminosyrene må generelt beskyttes under koplingsreaksjonene for å unngå dannelse av uønskede bindinger. De beskyttende grupper som kan anvendes er angitt i Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, New York (1981) og "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 3, Academic Press, New York (1981), hvis beskrivelse herved er inkorporert ved referanse.

oc-carboxylgruppen av den C-terminale rest beskyttes vanligvis, men må ikke beskyttes, med en ester som kan spaltes for å gi carboxylsyren. Beskyttende grupper som kan anvendes innbefatter: 1) alkylestere slik som methyl og t-butyl, 2) arylestere slik som benzyl og substituert benzyl, eller 3) estere som kan spaltes ved mild basebehandling eller milde reduktive midler slik som triklorethyl og fenacyl-estere.

a-aminogruppen av hver aminosyre som skal koples til den voksende peptidkjede må beskyttes. Enhver beskyttende gruppe kjent innen faget kan anvendes. Eksempler på slike innbefatter: 1) acyltyper slik som formyl, trifluor-acetyl, fthalyl og p-toluensulfonyl; 2) aromatiske carbamattyper slik som benzyloxycarbonyl (Cbz eller Z) og substituerte benzyloxycarbonyler, 1-(p-bifenyl)-1-methylethoxy-carbony1, og 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc); 3) alifatiske carbamattyper slik som tert-butyloxycarbonyl (Boe), ethoxy-carbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, og allyloxycarbonyl; 4) cykliske alkylcarbamattyper slik som cyklopentyloxycarbo-nyl og adamantyloxycaronbyl; 5) alkyltyper slik som tri-fenylmethyl og benzyl; 6) trialkylsilan slik som trimethyl-silan; og 7) thiol-holdige typer slik som fenylthiocarbonyl og dithiasuccinoyl. Den foretrukne ot-amino-beskyttende gruppe er enten Boe eller Fmoc, fortrinnsvis Boe. Mange aminosyrederivater egnet beskyttet for peptidsyntese, er kommersielt tilgjengelige.

Den a-aminogruppe-beskyttende gruppe av den nylig tilsatte aminosyrerest spaltes før koplingen av den neste aminosyre. Når Boc-gruppen anvendes er de valgte metoder trifluoreddiksyre, bar eller i diklormethan, eller HCl i dioxandiethyleter, eller ethylacetat. Det resulterende ammoniumsalt nøytraliseres deretter enten før koplingen eller in situ med basiske løsninger slik som vandige buffere, eller tertiære aminer i diklormethan eller dimethylformamid. Når Fmoc-gruppen anvendes er de valgte reagenser piperidin eller substituert piperidin i dimethylformamid, men ethvert sekundært amin eller vandige basiske løsninger kan anvendes. AvbeskytteIsen utføres ved en temperatur mellom 0° C og romtemperatur.

Enhver av aminosyrene som bærer sidekjedefunksjonaliteter må beskyttes under fremstillingen av peptidet under anvendelse av enhver av de ovenfor beskrevne grupper. Fagmannen vil forstå at valg og anvendelse av egnede beskyttende grupper for disse sidekjedefunksjonaliteter avhenger av aminosyren og nærvær av andre beskyttende grupper i peptidet. Valget av slike beskyttende grupper er viktig da den ikke må fjernes under avbeskyttelsen og koplingen av ot-amingruppen.

Når for eksempel Boe anvendes som den ot-amino-beskyttende gruppe er følgende sidekjedebeskyttende grupper egnet: p-toluensulfonyl (tosyl)-grupper kan anvendes for å beskytte aminosidekjedene av aminosyrer slik som Lys og Arg; p-methylbenzyl, acetamidomethyl, benzyl (Bzl) eller t-butyl-sulfonylgrupper kan anvendes for å beskytte de sulfid-holdige sidekjeder av aminosyrer slik som cystein, og benzyl (Bzl)-ether kan anvendes for å beskytte de hydroxyhoIdige sidekjeder av aminosyrer slik som Ser eller Thr.

Når Fmoc velges for a-aminbeskyttelse er vanligvis tert-butyl-basert beskyttende grupper akseptable. Eksempelvis kan Boe anvendes for lysin, tert-butylether for serin og threonin, og tert-butylester for glutaminsyre.

Så snart forlengelsen av peptidet er fullført fjernes alle av de beskyttende grupper. Når en syntese i væskefase anvendes, fjernes de beskyttende grupper på en hvilken

i som helst måte som bestemmes av valget av beskyttende grupper.

Disse prosedyrer er vel kjent for fagmannen.

Når en fast fasesyntese anvendes spaltes peptidet fra harpiksen vanligvis samtidig med fjerning av den beskyttende gruppe. Når Boc-beskyttelsesskjemaet anvendes i syntesen er behandling med vannfri HF-holdige additiver slik som dimethylsulfid, anisol, thioanisol eller p-cresol ved 0° C den foretrukne metode for spalting av peptidet fra harpiksen. Spaltingen fra peptidet kan også utføres med andre syrereagenser slik som trifluormethansulfonsyre trifluor-eddiksyreblandinger. Hvis Fmoc-beskyttelsesskjemaet anvendes spaltes den N-terminale Fmoc-gruppe med reagenser beskrevet tidligere. De andre beskyttende grupper og peptidet spaltes fra harpiksen under anvendelse av en løsning av trifluoreddiksyre og forskjellige additiver slik som anisol etc.

Alternativt kan forbindelsene av formel (I)' fremstilles under anvendelse av standard kjemiske reaksjoner analogt kjent innen faget og som vist i Reaksjonsskjema B.

Reaksjonsskjema B tilveiebringer et alternativt generelt synteseskjema for fremstilling av forbindelsene av formel (I)-(IV).

P2" P^- og K-P^-gruppene kan kjedes til den fri aminogruppe av aminoalkoholderivatet av struktur (2) som beskrevet tidligere i Reaks jonsskjema A under dannelse av peptidalkoholen av struktur (3) .

Alkoholfunksjonaliteten av peptidalkoholen av struktur (3) oxyderes deretter ved teknikker og prosedyrer vel kjent innen faget, slik som en Swern-oxydasjon under anvendelse av oxalylklorid eller trifluoreddiksyreanhydrid og dimethylsul-foxyd, under dannelse av forbindelsene av formel I.

Utgangsmaterialer for anvendelse i Reaksjonsskjema A og B er lett tilgjengelige for fagmannen. Eksempelvis er aminosyrer P2, P^ og K_P4 hvori K er hydrogen, kommersielt tilgjengelig, og linkerforbindelsen av struktur (LI) er beskrevet i J.Am. Chem. Soc, 114, 3157-3159 (1992). I tillegg er substituerte aminosyrer K-P4 hvori K er acetyl, succinyl, benzoyl, t-butyloxycarbonyl, carbobenzyloxytosyl, dansyl, isovaleryl, methoxysuccinyl, 1-adamantansulfonyl, 1-adamantanacetyl, 2-carboxybenzoyl, fenylacetyl, t-butyl-acetyl, bis [(1-nafthyl)-methyl]acetyl eller -A-Rz hvori

R zer en arylgruppe inneholdende 6, 10 eller 12 carbonatomer hensiktsmessig substituert med 1 til 3 medlemmer valgt uav-hengig fra gruppen bestående av fluor, klor, brom, jod, trifluormethyl, hydroxy, alkyl inneholdende fra 1 til 6 carbonatomer, alkoxy inneholdende fra 1 til 6 carbonatomer, carboxy, alkylcarbonylamino hvori alkylgruppen inneholder 1 til 5 carbonatomer, 5-tetrazolyl og acylsulfonamido (dvs. acylamino-sulfonyl og sulfonylaminocarbonyl) inneholdende fra 1 til 15 carbonatomer, forutsatt at når acylsulfonamido inneholder en arylgruppe, kan arylgruppen være ytterligere substituert med et medlem valgt fra fluor, klor, brom, jod og nitro; og slike andre terminale amino-beskyttende grupper som er funksjonelt ekvivalente dertil, beskrevet i Europa-patentsøknad OPI nr. 0363284, av 11. april 1990.

Utgangsaminoforbindelsene av struktur (1) er lett tilgjengelige for fagmannen. Eksempelvis er aminoforbindelser av struktur (1) hvori X er -CF2CF.j beskrevet i Europa-patentsøknad OPI nr. 0503203, av 16. september 1992. I tillegg er aminoforbindelser av struktur (1) hvori X er -CFjCF^ beskrevet i Europa-patentsøknad OPI nr. 0410411, av 30. januar 1991.

I tillegg kan andre utgangsmaterialer for anvendelse

i Reaksjonsskjema A og B fremstilles ved følgende syntesepro-sedyrer som er vel kjent av fagmannen.

Uttrykket "egnet koplingsmiddel" og "egnet koplings-løsningsmiddel" er ment å innbefatte ethvert av standardkoplinga-reagensene og løsningsmidlene som anvendes i standard koplingsprosedyrer definert ovenfor. På lignende måte er uttrykkene "egnet avbeskyttelsesmiddel" og "egnet organisk løsningsmiddel" beregnet på å innbefatte ethvert av de standard avbeskyttelses-midler og løsningsmidler som anvendes i standard avbeskyttelses-prosedyrer som beskrevet ovenfor. Beskyttede prosedyrer er beskrevet i Gassman, P.G., 0'Reilly, N.J., J. Org. Chem. 1987, 52, 2481 og Portella, C, Doussot, P., Dondy, B.( Synthesis 1992, 995.

De etterfølgende eksempler representerer

typiske synteser som beskrevet i reaksjonsskjemaene.

Som anvendt her har følgende uttrykk de angitte betydninger:

"g" angir gram; "mmol" angir millimol; "ml" angir milli-liter; "kp" angir kokepunkt; ,,<0>C'' angir grader Celsius;

"mmHg" angir millimeter kvikksølv; "ul" angir mikroliter;

"ug" angir mikrogram; og "uM" angir mikromolar; "DME"

angir 1,2-dimethoxyethan; "DCC" angir dicyklohexylcarbo-diintid; "t" angir timer; "DMF" angir N,N<1->dimethylformamid; "kons" angir konsentrert; "NMM" angir N-methylmorfolin,

"i vakuum" angir fjerning av løsningsmiddel under redusert trykk; "GC" angir gasskromatografi; "Rt" angir retensjons-tid.

Eksempel 1

Fremstilling av N-[( 1, 1- dimethylethoxy) carbonyl]- L- valyl- N'-[ 3- methoxy- l-( 1- methylethyl)- 2- oxopropyl]- L- prolinamid

Til en løsning av N-(tert-butyloxycarbonyl)-L-valyl-L-prolin (fra Advanced ChemTech. 3,1 g, 0,01 mol) og NMM (1,10 ml, 0,01 mol) i 100 ml CH2C12 ved -20° C ble det tilsatt isobutylklorformiat (1,30 ml, 0,01 mol) ved -20° C. Etter omrøring i 20 minutter ble en ytterligere ekvivalent NMM (1,10 ml, 0,01 mol) tilsatt, etterfulgt av tilsetning av L-valinmethylesterhydroklorid (1,67 g, 0,01 mol, Aldrich) som et fast materiale i én porsjon. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -20° C i ytterligere 1 time og fikk deretter oppvarmes til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter fortynnet med ytterligere 50 ml CH2C12 og ble vasket med 3 x 50 ml IN HC1, 2 x 50 ml mettet NaHC03 og 1 x 50 ml saltvann. Det resulterende organiske ekstrakt ble tørket (MgS04) og konsentrert i vakuum under dannelse av det ønskede produkt (MDL 104,259) (4,27 g, 100 %) som et hvitt skum. TLC Rf 0,33 (3:1 Et20-hexan ) FT-IR (KBr) 3553, 3537, 3520, 3510, 3310, 2968, 2935, 2876, 1741, 1687, 1631, 1527, 1440, 1390, 1367, 1338, 1309, 1244, 1203, 1172, 1114, 1093, 1043, 1016, 962, 923, 883, 831, 754, 665, 628, 603 cm-l; 1H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,22 (br d, 1H, J = 8,4 Hz, NH), 5,24 (br d, 1H. J

= 11,0 Hz, NH), 4,62 (dd, 1H, J = 8,2, 2,9 Hz, CH

4,43 (ca. dd, 1H, J = 8,6, 5,1 Hz, CH av Pro), 4,30 (dd,

1H, J = 9,5, 6,4 Hz, CH av Val), 3,75-3,70 og. 3,63-3,59

(pr m, 2H, CH2N), 3,7 (s, 3H, OMe), 2,36 (m, 1H, Ø-CH av Val), 2,17-1,91 (m. 5H, CH2CH2 og p-CH av Val), 1,43 (s,

9H, t-Bu), 1,00 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,95-0,90 (m, 9H,

3 X CH3); <1>3C CMR 8 172,5, 172,1, 170,9, 155,8, 79,5, 77,4, 77,1, 76,9, 76,8, 76,5, 59,9, 57,5, 56,7, 52,0, 47r6, 31,4, 31,0, 28,3, 28,2, 27,1, 25,1, 19,5, 18,9, 17,8, 17,3; MS

<CI/CH4) m/z (rel. intensitet) 428 (MH+, 22) , 372 (68) , 328

(100) .

Analyse beregnet for C2iH37<N>3°6<:>

C 58,99 H 8,72 N 9,83

Funnet: C 58,68 H 8,79 N 9,55

Eksempel 2

Fremstilling av N-[{ 1, 1- dimethylethoxy) carbonyll- L- valyl- N'-[ 3. 3. 4, 4, 4- pentafluor- 1-( 1- methylethvl)- 2- oxopropyl]- L-pfolinamid

Til en -78 o C løsning av produktet fra eksempel 1 (3,8 g, 9,0 mol) i 100 ml Et20 ble det tilsatt kondensert pentafluorethyljodid (5,5 ml, 48,0 mmol). Til blandingen ble det tilsatt methyllithium-lithiumbromidkompleks (28,5 ml, 42,0 mmol) i slik grad at den indre reaksjonstemperatur ble opprettholdt under -70° C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78° C i 0,5 time, kjølebadet ble fjernet og omrøringen ble fortsatt i 5 minutter. Blandingen ble helt over i 100 ml H20 og den vandige fase ble surgjort med IN HC1. Den vandige fase ble ekstrahert med ytterligere 100 ml Et20 og de kombinerte etherekstrakter ble tørket (MgSO^). Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum under dannelse av en uren gul olje som umiddelbart ble flashkromatografert (4,0 x 25 cm kolonne eluert med 3:1 Et20-hexan) under dannelse av det ønskede produkt (MDL 102,051) (1,95 g, 42 %) som et hvitt skum; <1>H NMR

(300 MHz, CDCI3) 8 7.60 (br c, 1H, J = 7,6 Hz, NH), 5,23 (br d, 1H, J = 9,2 Hz, NH), 4,94 (dd, IK, J = 7,6, 4,4 Hz, CH

av Val), 4,63 (dd, 1H, J = 8,1, 2,8 Hz, CH av Pro), 4,28 (dd, 1H, J = 9,3, 6,5 Hz, Q-CH av val), 3,81-3,69 og 3,64-3,54 (pr m, 2H, CH2N), 2,44-1,81 (serier av m, 6H, p-CH av Val, CH2CH2} , 1,44 (S, 9H, t-Bu), 1,02 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,98 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3), 0,88 (d, 3H, J = 6,8 Hz, CH3) ; "F NMR 8 -82,15

(s, CF3), -121,70 og -122,70 (AB kvartett, J = 296 Hz, CF2); MS (CI/CH4) m/z (rel.intensitet) 516 (MH+, 52), 460 (100), 416 (26).

Eksempel 3

Fremstilling av N- [ ( 1, 1- dimethylethoxycarbonyl] - L- valyl- N'-[ 3, 3, 4, 4, 5, 5, 5- heptafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxopentyl] - L- prolinamid

Til en -78° C løsning av produktet fra eksempel 1 (3,8 g, 9,0 mmol) i 100 ml Et20 ble det dråpevis tilsatt, under N2, perfluorpropyljodid (6,6 ml, 48,0 mmol, fra Aldrich, stabilisert med Cu). Til denne blanding ble det tilsatt methyllithium-lithiumbromidkompleks (28,5 ml, 42,0 mmol) i en slik grad at den indre reaksjonstemperatur ble opprettholdt under -70° C. Reaksjonsblandingen ble orarørt ved -78° C i 1 time, kjølebadet ble fjernet og omrøringen ble fortsatt i 5 minutter. Blandingen ble helt over i 100 ml H20 og den vandige fase ble surgjort med IN HC1. Den vandige fase ble ekstrahert med ytterligere 100 ml Et20 og de kombinerte etheriske ekstrakter ble tørket (MgS04). Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum under dannelse av en uren gul olje som umiddelbart ble flashkromatografi (4,0 x 25 cm kolonne eluert med 3:1 Et20-hexan) under dannelse av

det ønskede produkt (MDL 103,830) (654 mg, 13 %)

som et hvitt skum; FT-IR (KBr) 3432, 3292, 2972,

2937, 2879, 2823, 2771, 2739, 2253, 1755, 1687, 1635, 1525, 1444, 1392, 1367, 1348, 1313, 1232, 1178, 1126, 1041, 1018, 966, 922, 910, 877, 837, 798, 756, 736, 667, 650, 632, 596 cm-l; 1H NMR (300 HHz, CDC13) 8 7,63 (d, 1H, J = 8,2 Hz, NH), 5,44 (d, 1H, J = 9,2 Hz, NH), 5,02 (dd, 1H, J = 7,8,

4,5 Hz, CH av Val), 4,64 (dd, 1H, J = 8,0, 3,0 Hz, CH .av Pro), 4,30 (dd, 1H, J = 9,2, 6,8 Hz, q-CH av Val), 3,80-

3,74 °9 3,66-3,60 (pr m, 2H, CH2N), 2,31-1,92 (serier av m, 6H, P-CH av Val, CH2CH2) , 1,44 (s, 9H, t-Bu), 1,02 (d, 3H, J = 7,0 Hz, CH3), 0,98 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH3), 0,94 (d,- 3Hr J = 6,7 Hz, CH3), 0,88 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH3) ; "C NMR 8 193,3, 193,0, 192,7, 172,9, 171,1, 155,7, 118,7, 115,8, 111,3, 108,9, 108,6, 108,2, 105,9, 79,6, 77,3, 77,2, 76,9, 76,6, 59,7, 59,3, 56,8, 47,8, 31,4, 29,0, 28,3, 26,9, 25,1, 19,9, 19,8, 19,7, 19,5, 19,4, 17,5, 17,4, 16,3, 16,1; "F NMR (376,3 MHz, CDC13) 6 -80,91 (t, CF3), -119,03 og

-120,43 (AB kvartett,J = 297 Hz, CF2), -126,62 (s, CF2):

MS (CI/CH4) m/z (rel .intensitet) 566 (MH+, 100). HRMS (C23H34F7N305) (M+) beregn. 565,2492, observert 566,2475.

Eksempel 4

Fremstilling av N-[( 1, 1- dimethylethoxy) carbonvl]- L- valvl- N'-13,3,4,4,5,5,6, 6, 6- nonafluor- 1-( 1- methylethvl)- 2- oxohexyl]-L- prolinamid

Til en -78° c løsning av produktet fra eksempel 1 (3,8 g, 9,0 mmol) i 100 ml vannfritt Et20 ble dråpevis tilsatt under N2, perfluorpropyljodid (7,6 ml, 48,0 mmol, fra Aldrich). Til denne blanding ble det tilsatt methyllithium-lithiumbromidkompleks (28,5 ml, 42,0 mmol) i en slik grad at en indre reaksjonstemperatur ble holdt under -70° C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved -78° C i 1 time, kjølebadet ble fjernet og omrøringen ble fortsatt i 5 minutter. Blandingen ble deretter helt over i 100 ml H^O og den vandige fase ble surgjort med IN HC1. Den vandige fase ble ekstrahert med ytterligere 100 ml Et20 og de kombinerte etheriske ekstrakter ble tørket (MgSO^). Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum under dannelse av en uren gul olje som umiddelbart ble flashkromatografert (4,0 x 25 cm kolonne eluert med 3:1 Et20-hexan) under dannelse av det ønskede produkt (MDL 1.05.731) (493 mg, 9%) som et hvitt skum; FT-IR (KBr) 3421, 3292, 2972, 2937, 2879, 2773, 1755, 1687, 1637, 1525, 1444, 1392, 1367, 1309, 1238, 1174, 1138, 1093, 1043, 1016, 960, 927, 875,

848, 744, 709, 690, 667, 653, 632, 599, 574 cm-l; "C NMR 5 173,0, 170,9, 155,7, 79,7, 77,2, 77,1, 76,9, 76,6, 59,7,

59.3, 56,8, 47,8, 31,3, 28,9, 2B,3, 26,7, 25,1, 19,8, 19,5, 17.4, 16,2; «F NMR (376,2 MHz, CDC13) 8 -81,35 (s, CF3),

-118,27 og -119,91 (AB kvartett, J = 297 Hz, CF2)r -123,09

(s, CF2), -125,97 (s, CF2); MS (CI/CH4) m/r (rel.

intensitet) 616 (MH*, 68), 560 (100), 516 (31).

Analyse beregnet for C^H^FgNjOg:

C 46,83 H 5,57 N 6,83

Funnet: C 46,32 H 5,65 N 6,66.

HRMS (<C>24<H>34<F>9<N>3<0>5) (<M+>) beregnet 616,2433,

observert 616,2435.

Eksempel 5

Fremstilling av N- L- valyl- N'-[ 3, 3, 4, 4, 5, 5, 5- heptafluor- l-( 1- methylethy1)- 2- oxopenty1]- L- prolinamid

I en omrørt løsning av produktet fra eksempel 3 (0,21 g, 0,37 mmol) i 10 ml EtOAc avkjølt i et is-vannbad ble det boblet HCl-gass i 4 timer. Boblingen ble stanset og reaksjonskolben ble korket med et tørkerør og fikk oppvarmes til omgivende temperatur under omrøring. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen konsentrert og behandlet azeotropt med CC14 og anbragt under et høyvakuum under dannelse av det ønskede produkt (185 mg, 100 %) som et hvitt fast materiale; <l>H NMR (300 MHz, CDC13) 5 8,29 (br s, 2H, NH2), 7,88 (br s, 1H, NH), 5,70 (m, 1H, CH), 4,89 (m, 1H, CH), 4,16-3,55 (en serie av m, 4H, CH, CH, CH2N), 2,40-1,94 (en serie av m, 5H, 6-CH av Val og CH2CH2), 1,13 (br s, 6H, 2 X CH3), 1,01 (d, 3H, J = 5,8 Hz, CH2), 0,94 (d, 3H, J = 4,8 Hz, CH3); <19>F NMR 6

-81,02 (s, CF3), -120,11 (s, CF2), -126,75 (s, CF2). '

Eksempel 6

Fremstilling av N-[ 4-( 4- morfolinylcarbonyl) benzoyl]- L- valyl-N'-[ 3, 3, 4, 4, 5, 5, 5- heptafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxopentyl]-L- prolinamid

Til en omrørt suspensjon av 4-(4-morfolinylcarbonyl) benzosyre (0,13 g, 0,53 mmol) og benzyltriethylammoniumklorid (1 mg, 0,004 mmol) i 20 ml 1,2-diklormethan ble det tilsatt thionylklorid (0,05 mi, 0,53 mmol) og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til tilbakeløpskokning. Etter 2,5 timer fikk reaksjonsblandingen avkjøles til romtemperatur og ble konsentrert i vakuum. Residuet ble deretter behandlet azeotropt med CCl^ og anbragt under vakuum under dannelse av en lysebrun olje (kvantitativ) som ble anvendt uten ytterligere rensing. I en separat rundkolbe ble en omrørt løsning av produktet fra eksempel 5 (185 mg, 0,37 mmol) i 10 ml CH2C12 avkjølt til -20° C. NMM (0,2 ml, 2,0 mmol) ble tilsatt, umiddelbart etterfulgt av dråpevis tilsetning av syrekloridet i 5 ml CH2C12 i en slik grad at den indre raksjonstemperatur ble opprettholdt ved -10° C eller lavere. Etter at tilsetningen var fullført fikk reaksjonsblandingen oppvarmes til romtemperatur. Etter 1,5 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med 20 ml CH2C12 og ble vasket med 2 x 20 ml IN HC1, 2 x 20 ml mettet NaHCOj og 1 x 20 ml saltvann. Tørking (MgS04) og konsentrer ing i vakuum ga 260 mg av en uren form av det ønskede produkt. Det urene hvite skum ble umiddelbart flashkromatografert (2 x 15 cm kolonne eluert med 1:27 MeOH-CH2Cl2) under dannelse av det ønskede produkt (MDL 105,495) (162 mg, 64%) som et hvitt skum; IR (KBr) 3431,

3323, 3049, 2970, 2935, 2877, 1755, 1693, 1631, 1529, 1437, 1394, 1346, 1300, 1278, 1259, 1232, 1161, 1118, 1068, 1014,

933, 896, 862, 842, 798, 785, 740, 686, 653, 628, 596 cnt-1;

1H NMR (300 HHz, CDCI3) 6 7,86 (d, 2H, J = 8,4 Hz, aryl),

7,52 (d, 1H, J = 8,4 Hz, NH)-, 7,46 (d, 2H, J = 8,3 Hz,

aryl), 7,12 (d, 1H, J = 8,7 Hz, NH), 5,04 (dd, 1H, J = 8,2,

4,2 Hz, a-CH av Val), 4,84 (dd, 1H, J = 8,6, 7,3 Hz, a-CH av Val), 4,62 (dd, 1H, J = 7,9, 2,9 Hz, CH av Pro), 3,94-3,37

(m, 10H, 2 X NCH2CH20 og NCH2 av Pro), 2,29-1,97 (serier av m, 6H, 2 X P-CH av Val og CH2CH2), 1,06 (d, 3H, J = 6,B Hz, CH3), 1,01 (d, 6H, J = 6,7 Hz, 2 X CH3), 0,86 (d, 3H, J =

6,9 Hz, CH3); "C NMR 8 172,2, 170,9, 169, 2, 166,3, 138,5, 135,1, 127,4, 127,3, 77,4, 77,1, 76,9, 76,5, 66,7, 59,9,

59,3, 55,9, 47,9, 31,8, 29,1, 27,0, 25,1, 19,8, 19,5, 17,8, 16,2; "F NMR (470,2 MHZ, CDC13) 8 -80,24 (t, J = 9 Hz,

CF3), -118,39 og -119,87 (dq, J = 295, 9 Hz, COCF2), -125,99 (AB m, CF2); MS (CI/CH4) m/z (rel. intensitet) 683 (MH+, 59), 367 (100).

Analyse beregnet for C3oH37F7N4°6'1'3 H20:

C 51,01 H 5,65 N 7,92

Funnet: C 51,34 H 5,27 N 7,87

Eksempel 7

Fremstilling av Boc- Val- CF2 CF3

En løsning av Boc-Val-OCH3 (2,27 g, 9,81 mmol) i Et20 (14 ml)/PhMe (11,3 ml) ble avkjølt til -50° C og ble behandlet med CF3CF2I (3,7 ml, 31,1 mmol, 3,2 ekv), og ble deretter ytterligere avkjølt til -60° C og ble dråpevis behandlet med methyllithium-lithiumbromidkompleks (55-min,

-60° C til -50° C; 1,5M i Et20, 20 ml, 30 mmol, 3,1 ekv).

Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt i 1 time, ble deretter dråpevis behandlet med isopropanol (20 min; < -50° C). Etter omrøring, i 30 minutter fik reaksjonsblandingen oppvarmes til 0° C og ble deretter helt over i 60 ml IM KHS04. Fasene ble separert og den vandige fase ble ekstrahert med 1 x 50 ml Et20. De organiske faser ble kombinert og tørket (MgSO^),

ble filtrert og filtratet ble fordampet i vakuum (romtemperatur, 15 irimHg) under dannelse av et hvitt fast materiale.

Det urene materiale utviste et forhold mellom ønsket

produkt og utgangsmateriåle på 3:1 med uten noen urenhet

>1% totalt område (GC). Det urene hvite faste materiale ble kromatografert på Si02 (40 g, 3 x 6,5 cm; hexan (400 ml) deretter 400 ml 10 % EtOAc/hexan) under dannelse av 2,22 g,

70 % utbytte, av det ønskede produkt. Dette faste materiale ble omkrystallisert fra hexan (40 ml, kokt under tilbakeløps-kjøling og deretter avkjølt til 0° C) under dannelse av 1,62 g, 57 %, av renset ønsket produkt >(MDL 101,286) (første masse; gjenværende materiale i mo rk dervæs1ken); R_ = 0,77 i 20 % EtOAc/hexan; sm.p. 69 - 70 C; H

NMR (CDC13) 5,0 (m, 1H), 4,8 (m, 1H), 2,3 (m, 1H), 1,44 (5,

9H), 1,1 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,84 (d, 3H, J = 6,9 Hz); 19F

NMR (CDCI3) -82,1 (s), -121,4 (d, J = 297 Hz), -122,8 (d, J

= 297Hz); IR (CHCI3) Vmaks 3443, 2976, 1753, 1716, 1500,

1369, 1234, 1197, 1163 cm-J; UV (MeOH) ^maks 225 nm (e =

754); CIMS (CH4) m/e (% relativ intensitet) 320 (M+H+,100) .

Analyse beregnet for C-^H^gNO^F,.:

C 45,14 H 5,68 N 4,39

Funnet: C 45,28 H 5,71 N 4,26

Eksempel 8

Alternativ fremstilling av Boc- Val- CF2 CF3

En blanding av 288,0 g (1,11 mol) Boc-Val N-methyl-O-methylhydroxaminsyre og 4,7 liter vannfritt Et20 ble ble fylt i en 12-liters 3-halskolbe utstyrt med en rører, termo-meter, tørriskjøler, gassfordelingsrør og kontinuerlig N2~ spyling. Den resulterende løsning ble avkjølt til -60° C til -65° C. Totalt 885,2 g (3,60 mol) C2F5I ble tilsatt via et gassfordelingsrør i løpet av ca. 30 minutter til løsningen av Boc-Val N-methyl-O-methylhydroxaminsyre mens temperaturen ble opprettholdt ved ca. -65° C. Umiddelbart etter full-førelse av gasstilsetningen ble totalt 2,39 liter 1,5M CH3Li'LiBr i 3,59 ml Et20 tilsatt i løpet av 1 time idet reaksjonstemperaturen ble opprettholdt ved -52° C til -58° C. Et bunnfall ble dannet etter at ca. 1/3 av CH^Li'LiBr var blitt tilsatt, men en fullstendig løsning var til stede ved slutten av tilsetningen. Den resulterende løsning ble omrørt ved -52° C til -58° C i 1 time. Reaksjonen ble overvåket ved GC (Rfc av MDL 101,286 =1,3 min, Rt av Boc-Val N-methyl-O-methylhydroxaminsyre = 5,1 min) og ble funnet å inneholde 7,2 % Boc-Val N-methyl-O-methylhydroxaminsyre. Totalt 255 ml (3,47 mol) aceton ble tilsatt i løpet av ca. 16 min idet reaksjonstemperaturen ble opprettholdt ved -52° C til -58° C, og den resulterende blanding ble omrørt i 10 minutter. Blandingen ble helt over i en 22 liters kolbe inneholdende 4,7 liter 0,75M KHS04 som var blitt avkjølt til ca. 0° C.

Det organiske lag ble fraskilt og ble vasket med 3 liter H20.

Det organiske lag ble tørket under anvendelse ; av 500 g MgSO^ og ble filtrert for å fjerne tørkemidlet. Filtratet ble konsentrert ved 40° C/100 torr til et halvfast materiale som veide 490 g. Det urene materiale ble oppløst i 1,2 liter hexan ved 45° C og ble langsomt avkjølt i løpet av ca. 30 minutter til -25° C til -30° C. Det faste materiale som krystalliserte ble filtrert fra og vasket med 250 ml hexan ved -30° C. Det erholdte MDL 101,286 ble vakuumtørket

(25° C/100 torr) under dannelse av 176,7 g. Filtratet ble

konsentrert ved 35°C/100 torr til et residuum som veide 153,5 g. Materialet ble anbragt på en Kugelrohr-destillasjonsapparatur og et forløp ble oppsamlet ved'

40° C/0,6 torr. Mottageren ble forandret og totalt 100,5 g urent MDL 101,286 ble oppsamlet ved 40° C - 60° C/0,6 torr. Det urene produkt ble oppløst i 500 ml hexan ved ca. 50° C. Den resulterende løsning ble avkjølt til -30° C. Det faste materiale som krystalliserte ble filtrert fra og vasket med

100 ml kald (-30° C) hexan. Produktet ble vakuumtørket ved 25° C/100 torr under dannelse av ytterligere 68,0 g MDL

101,286 i et totalt utbytte på 244,7 g (70 % utbytte) som

var 99,9 % rent ved GC.

Analyse beregnet for C12<H1>8<F>5<N0>3 (319,28):

C 45,14 H 5,68 N 4,39 Funnet: C 45,30, 45,49 H 5,50, 5,58 N 4,26, 4,35 Eksempel 9 N-[ 3-( 3- pyridy1) propanoyl]-L-valyl-N-[3, 3, 4, 4, 4- pentafluor- lr ( lrjne. thylethy 1) - 2- oxobuty 1 ] - L- prolinamid

i

a) Fremstilling av H- Val- CF2 CF3 «hydroklorid

Oppløs Boc-Val-CF2CF3 (350 mg, 1,1 mmol) i 50 ml

ethylacetat og avkjøl til 0° C. Behandl med hydrogenklorid-

gass i 5 minutter og omrør i 30 minutter. Fjern løsningsmid-let i vakuum under dannelse av tittelforbindelsen.

b) Fremstilling av Boc- Val- Pro- Val- CF2 CF3

Oppløs Boc-Val-Pro-OH (314 mg, 1,0 mmol) i 4 ml

methylenklorid og tilsett N-methylmorfolin (252 mg, 2,5 mmol). Avkjøl til -22° C og tilsett isobutylklorformiat (136 mg,

1,0 mmol). Omrør i 20 minutter og tilsett til H-Val-CF2CF3* hydroklorid (1,1 mmol). Omrør i 1 time ved -22° C, oppvarm til romtemperatur og omrør i 3 timer. Rens ved silicagel-kromatografi (40 % ethylacetat/hexan) under dannelse av 405 mg av tittelforbindelsen.

c) Fremstilling av H- Val- Pro- Val- CF2 CF3' hydroklorid

Oppløs Boc-Val-Pro-Val(CF2CF3) (385 mg, 0,74 mmol)

i 50 ml ethylacetat og avkjøl til 0° C. Behandl med hydrogenkloridgass i 5 minutter og omrør i 30 minutter. Fordamp løsningsmidlet i vakuum under dannelse av 334 mg av tittelforbindelsen .

d) Fremstilling av N-[ 3-( 3- pyridyl) propanoyl]- L- valyl- N-[ 3, 3, 4, 4, 4- pentafluor- 1-( 1- methylethy)- 2- oxobuty1]- L-prolinamid

Suspender 3-(3-pyridyl)propionsyre (174 mg, 1,15 mmol, Walker, F.A. et al., J.Amer.Chem.Soc., 102, 5530-5538

(1980)) i 15 ml methylenklorid. Tilsett N-methylmorfolin

(0,38 ml, 3,45 mmol) og triethylamin (0,32 ml, 2,30 mmol)

og avkjøl den resulterende klare, farveløse løsning til

-18° C. Tilsett isobutylklorformiat (0,15 mg, 1,15 mmol)

og omrør i 20 minutter. Tilsett deretter N-methylmorfolin (0,13 ml, 1,15 mmol) og H-Val-Pro-Val-CF2CF3-hydroklorid (520 mg, 1,15 mmol) og omrør ved -20° C i 1 time. Tillat reaksjonsblandingen å oppvarmes til romtemperatur, fortynn reaksjonsblandingen med ytterligere 35 ml methylenklorid og vask suksessivt med 3 x 20 ml IN HG1, 2 x 20 ml mettet NaHC03 og 1 x 20 ml saltvann. Tørk og konsentrer det urene produkt. Rens det urene produkt ved flashkromatografi (75:25saceton:EtOAc) under dannelse av tittelforbindelsen

som et hvitt fast skum. (Utbytte: 470 mg, 74 %, 3:1::LLL:LLD).

TLC Rf 0,42 (3:1::aceton:EtOAc):

1H NMR 8 8.49 (br s, 1H, aryl), 8.45 (br d, 1H, J = 4,2 Hz, aryl), 7,84 (br d, 1/4H, J = 7,7 Hz, NH), 7,53 (dt, 1H, J = 7,8, 1,7 Hz, aryl), 7,50 (br d, 3/4H, NH), 7,21 (dd, 1H, J

= 7,7. 4,8 Hz, aryl), 6,31 (br d, 3/4H, J ~ 8,9 Hz, NH),

6,24 (br d, 1/4H, J = 8,9 Hz, NH), 5,02-4,92 (m, 1H, CH),

4,67 (dd, 1/4H, J = 8,1, 2,1 Hz, a-CH av Pro), 4,63-4,55 (m,

1 3/4 H, a-CH av Pro og a-CH av Val), 3,87-3,72 og 3,70-

3,55 (pr m, 2H, CH2N), 3,07-2,87 og 2,63-2,50 (pr m, 4H,

aryl CH2CH2CO), 2,50-1,80 (m, 6H, 2XØ-CH og CH2CH2), 1,12-0,79 (serier av d, 12H, 4XCH3); <19>F NMR 6 -82,13 (s, CF3, major isomer), -82,17 (s, CF3, minor isomer), -121,53 og 122,71 (AB kvartett, J = 295 Hz, CF2, minor isomer), -121,59 og -122,61 (AB kvartett, J = 295 Hz, CF2, major isomer); MS (EI) m/z (rel intensitet) 548 (M+, 4), 401 (6), 233 (65), 205

(100), 134 (45), 106 (35), 70 (77).

Analyse (<C>25<H>33<F>5<N>4°4'<0>'3 H2°* C'H'N-

Eksempel 10

N-[ 3-( 3- pyridyl) propanoy1]- L- valyl- N-[ 3, 3, 4, 4, 5, 5, 5- heptafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxopentyl]- L- prolinamid

A) Fremstilling av Boe- Val- Pro- Val- OCHj

Tilsett isobutylklorformiat (1,30 ml, 0,01 mol) til en løsning av Boc-Val-Pro-OH (3,1 g, 0,01 mol, Advanced ChemTech) i 100 ml methylenklorid ved -20° C og omrør i 20 minutter. Tilsett en ytterligere ekvivalent N-methylmorfolin (1,10 ml, 0,01 mol). Tilsett L-valinmethylesterhydroklorid (1,67 g, 0,01 mol, Aldrich) som et fast materiale i én porsjon. Omrør reaksjonsblandingen ved -20° C i ytterligere 1 time og oppvarm deretter til romtemperatur. Fortynn med ytterligere 50 ml methylenklorid og vask med 3 x 50 ml

IN HC1, 2 x 50 ml mettet NaHC03 og 1 x 50 ml saltvann.

Tørk (MgSO^) det resulterende organiske ekstrakt og konsentrer i vakuum under dannelse av tittelforbindelsen som et hvitt skum. (Utbytte: 4,27 g, 100 %).

TLC Rf 0.33 (3:1 Et20-hexan) ; FT-IR (KBr) .3553, 3537, 3520, 3510, 3310, 2968, 2935, 2876, 1741, 1687, 1631, 1527, 1440, 1390, 1367, 1338, 1309, 1244, 1203, 1172, 1114, 1093, 1043, 1016, 962, 923, 883, 831, 754, 665, 628, 603 cm-1; lH NMR

(300 MHz, CDC13) 5 7,22 (br d, 1H, J = 8,4 Hz, NHJ, 5,24 (br d, 1H, J = 11,0 Hz, NH J , 4,62 (dd, 1H, J = 8,2, 2,9 Hz," CK

of Val), 4,4 3 (app. dd, 1H, J = 8,6, 5,1 Hz, CH av Pro),

4,30 (dd, 1H, J = 9,5, 6,4 Hz, CH av Val), 3,75-3,70 og 3,63-3,59 (pr m, 2H, CH2N), 3,7 (s, 3H, OMe), 2,36 (m, 1H,

p-CH av val), 2,17-1,91 (m, 5H, CH2CH2 og P~CHav. Val),

1,43 (s. 9H, t-Bu), 1,00 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,95-0,90 (m, 9H, 3 X CH3); "C CMR 5 172,5, 172,1, 170,9, 155,8,

79.5, 77,4, 77,1, 76,9, 76,8, 76,5, 59,9, 57,5, 56,7, 52,0, 47.6, 31,4, 31,0, 28,3, 28,2, 27,1, 25,1, 19,5, 18,9, 17,8, 17,3; MS (CI/CH4) m/z (rel intensitet) 428 (MH+, 22), 372 (68), 328 (100).

Analyse beregnet for C^H^N^Og:

C 58,99 H 8,72 N 9,83

Funnet: C 58,68 H 8,79 N 9,55

b) Fremstilling av Boc- Val- Pro- Val- CF^ CF^CF^

Tilsett perfluorpropyljodid (6,6 ml, 48,0 mmol fra

Aldrich, stabilisert med Cu) dråpevis under N2 til en -78° C løsning av Boc-Val-Pro-Val-OCH3) (3,8 g, 9,0 mmol) i 100 ml vannfri diethylether. Tilsett methyllithium*lithiumbromidkompleks (28,5 ml, 42,0 mmol) i en slik grad at den indre reaksjonstemperatur opprettholdes på under -70° C. Omrør reaksjonsblandingen ved -78° C i 1 time, fjern deretter kjølebadet og fortsett omrøringen i 5 minutter. Hell reaksjonsblandingen over i 100 ml H20 og surgjør den vandige fase med IN HC1. Ekstraher den vandige fase med ytterligere 100 ml diethylether og tørk (MgS04) de kombinerte etheriske ekstrakter. Fjern løsningsmidlet i vakuum og rens det resulterende gule skum ved flashkromatografi (4,0 x 25 cm kolonne eluert med 3:1 Et20-hexan) under dannelse av tittelforbindelsen som et hvitt skum. (Utbytte: 654 mg, 13 %).

FT-IR (KBr) 3423, 3292, 2972, 2937, 2879, 2823, 2771, 2739, 2253, 1755, 1687, 1635, 1525, 1444, 1392, 1367, 1348, 1313, 1232, 1178, 1126, 1041, 1018, 966, 922, 910, 877, 837, 798, 756, 736, 667, 650, 632, 596 cm-<1>; <*>H NMR (300 MHz, CDC13) 8 7,63 (d, 1H, J = 8,2 Hz, NH), 5,44 (d, 1H, J = 9,2 Hz,

NH), 5,02 (dd, 1H, J = 7,8, 4,5 Hz, CH av Val), 4,64 (dd,

1H, J = 8,0, 3,0 Hz, CH av Pro), 4,30 (dd, 1H, J = 9,2, 6,8 Hz, Q-CH av Val), 3,80-3,74 og 3,66-3,60 (pr m, 2K, CH2N), 2,31-1,92 (serier av m, 6H, p-CH av Val, CH2CH2), 1,44 (s,

9H, t-Bu), 1,02 (d, 3H, J = 7,0 Hz, CH3), 0,98 (d, 3H, J =

6,9 Hz, CH3), 0,94 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH3), 0,88 (d, 3H, J

= 6,9 Hz, CH3); ™ C NMR 8 193,3, 193,0, 192,7, 172,9,

171,1, 155,7, 118,7, 115,8, 111,3, 108,9, 108,6, 108,2,

105,9, 79,6, 77,3, 77,2, 76,9, 76,6, 59,7, 59,3, 56,8,

47,8, 31,4, 29,0, 28,3, 26,9, 25,1, 19,9, 19,8, 19,7, 19,5, 19,4, 17,5, 17,4, 16,3, 16,1; 19F NMR (376,3 MHz, CDCI3) 8

-80,91 (t, CF3), -119,03 og -120,43 (AB kvartett, J=297

Hz, CF2), -126,62 (s, CF2); MS (CI/CH4) m/z (rel.intensitet)

566 (MH+, 100). HRMS (C23H34F7N3Os) (M<+>)

Beregnet 566,2492. Observert 566,2475.

c) Fremstilling av H- Val- Pro- Val- CF2 CF2 CF3' hydroklorid

Bobl H Cl-gass inn i en omrørt løsning av Boc-Val-Pro-Val-CF2CF2CF3 (0,21 g, 0,37 mmol) i 50 ml ethylacetat og avkjøl på et is-vannbad. Behandl med hydrogenkloridgass i 4 minutter. Omrør reaksjonsblandingen i 1 time og oppvarm til omgivende temperatur. Konsentrer reaksjonsblandingen og behandl azeotropt med CC14. Anbring under et høyvakuum under dannelse av tittelforbindelsen som et hvitt fast materiale (Utbytte: 185 mg, 100 %).

IK NMR (300 MHz, CDCI3) 6 8,29 (br s, 2K, NH2), 7,88 (br s,

IK, NH), 5,70 (m, 1H, CH), 4,89 (m, 1H, CH), 4,16-3,55 (a serier av ra, 4K, CH, CH, CH2N), 2,40-1,94 (serier av m,

5H, p-CH av Val og CK2CK2), 1,13 (br s, 6H, 2 X CH3}, 1,01

(d, 3H, J = 5,8 Hz, CH3), 0,94 (d, 3H, J ~ 4,8 Hz, CK3);

19? NMR 5 -81,02 is, C?3), -120,11 (s, CF2), -126,75 (s,

CF2).

d) Fremstilling av 3-( 3- p<y>rid<y>l) <p>ropanoylklorid

Tilsett thionylklorid (0,05 ml, 0,53 mmol) til en

omrørt suspensjon av 3-(3-pyridyl)propionsyre (80,2 mg, 0,53 mmol) og benzyltriethylammoniumklorid (1 mg, 0,004 mmol) i 20 ml 1,2-diklorethan og oppvarm til tilbakeløpskokning i 2,5

timer. Avkjøl reaksjonsblandingen til romtemperatur og konsentrer i vakuum. Behandl residuet azeotropt med CC14 og anbring under vakuum. Anvend det resulterende syreklorid uten ytterligere rensing.

e) Fremstilling av N-[ 3-( 3- pyridyl) propanoyl]- L- valyl- N-[ 3, 3, 4, 4, 5, 5, 5- heptafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxopentyl]- L-prolinamid

Oppløs H-Val-Pro-Val-CF2CF^CF3-hydroklorid (185 mg, 0,37 mmol) i 10 ml methylenklorid og avkjøl til -20° C under 1 omrøring. Tilsett N-methylmorfolin (0,2 ml, 2,0 mmol) og tilsett dråpevis umiddelbart 3-(3-pyridyl)propanoylklorid i

5 ml methylenklorid i en slik grad at den indre reaksjonstemperatur opprettholdes ved -10° C eller mindre. Tillat reaksjonsblandingen å oppvarmes til romtemperatur etter full-) førelse av tilsetningen. Fortynn reaksjonsblandingen etter 1,5 timer ved romtemperatur med 20 ml methylenklorid og vask med 2 x 20 ml IN HC1, 2 x 20 ml mettet NaHC03 og 1 x 20 ml

saltvann. Tørk (MgS04) og konsentrer i vakuum under dannelse

av tittelproduktet i uren form. Rens umiddelbart det urene 5 produkt ved flashkromatografi (2 x 15 cm kolonne eluert med 1:27 MeOH-CH2Cl2) under dannelse av tittelforbindelsen.

Eksempel 11

N-[ 3-( 3- pyridy1) propanoy1]- L- valy1- N-[ 3, 3, 4. 4. 5. 5, 6, 6. 6-nonafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxohexyl]- L- prolinamid

a) Fremstilling av Boc- Val- Pro- ValECF^ Cl^CF^CFa] Tilsett perfluorbutyljodid (7,6 ml, 48,0 mmol, fra Aldrich) dråpevis under N2 til en -78° C løsning av Boc-Val-Pro-Val[C02CH3] (3,8 g, 9,0 mmol) i 100 ml vannfri diethylether. Tilsett methyllithium-lithiumbromidkompleks i.en slik grad at den indre reaksjonstemperatur opprettholdes ved under -70° C. Omrør reaksjonsblandingen ved -78° C i 1 time, fjern deretter kjølebadet bg fortsett omrøringen i 5 minutter.

Hell reaksjonsblandingen over i 100 ml H20 og surgjør den vandige fase med IN HC1. Ekstraher den vandige fase med ytterligere 100 ml diethylether og tørk (MgS04) de kombinerte etheriske ekstrakter. Fjern løsningsmidlet i vakuum og rens den resulterende gule urene olje ved flashkromatografi (4,0 x 25 cm kolonne eluert med 3:1 Et20-hexan) under dannelse av tittelforbindelsen som et hvitt skum.! (Utbytte 493 g, 9 %) .

FT-IR (KBr) 3421, 3292, 2972, 2937, 2879, 2773, 1755, 1687, 1637, 1525, 1444, 1392, 1367, 1309, 1238, 1174; U38, 1093,

1043, 1016, 960, 927, 875, 848, 744, 709, 690, 667, 653,

) 632, 599, 574 cm"<*>; <13>C NMR 6 173,0, 170,9, 155,7, 79,7,

77,2, 77,1, 76,9, 76,6, 59,7, 59,3, 56,8, 47,8, 31,3, 28,9, 28^3, 26,7, 25,1, 19,8, 19,5, 17,4, 16,2; «F NMR (376,2 MHz. CDCI3) 6 -81,35 (s, CF3), -118,27 og -119,91 (AB

kvartett, J = 297 Hz, CF2), -123,09 (s, CF2), -125,97 (s,

5 CF2)f MS (CI/CH4) m/z (rel. intensitet) 616 (MH+, 68), 560

(100), 516 (31).

Analyse beregnet for C24H34FgN3°5:

C 46,83 H 5,57 N 6,83

Funnet: C 46,32 H 5,65 N 6,66.

HEMS (C24H34<F>9<N>3<0>5) (<M+>) beregnet 616,2433, observert 616,2435.

b) Fremstilling av H- Val- Pro- Val- CF2 CF2CF2 CF3• hydroklorid

Bobl HCl-gass i en omrørt løsning av Boc-Val-Pro-Val-CF2CF2CF2CF3 (245 mg, 0,40 mmol) i 50 ethylacetat og avkjøl på et is-vannbad. Behandl med hydrogenkloridgass i 4 minutter. Omrør reaksjonsblandingen i 1 time og oppvarm til omgivende temperatur. Konsentrer reaksjonsblandingen og behandl azeotropt med CC14. Anbring under høyvakuum under dannelse av tittelforbindelsen.

c) Fremstilling av N-[ 3-( 3- pyridyl) propanoyl]- L- valyl- N-[ 3, 3, 4, 4f5f5, 6, 6, 6- nonafluor- 1-( 1- methylethyl)- 2- oxohexyl]-L- prolinamid

Oppløs H-Val-Pro-Val-CF2C<F>2CF2CF3-hydroklorid (221,0 mg, 0,40 mmol) i 10 ml methylenklorid og avkjøl til

-20° C under omrøring. Tilsett N-methylmorfolin (0,2 ml, 2,0 mmol) og tilsett deretter umiddelbart dråpevis 3-(3-pyridyl)propanoylklorid i 5 ml methylenklorid i en slik grad av den indre reaksjonstemperatur opprettholdes ved -10° C eller mindre. Tillat reaksjonsblandingen å oppvarmes til romtemperatur etter fullførelse av tilsetningen. Fortynn reaksjonsblandingen etter 1,5 timer ved romtemperatur med

20 ml methylenklorid og vask med 2 x 20 ml IN HC1, 2 x 20 ml mettet NaHC03 og 1 x 20 ml saltvann. Tørk (MgS04) og konsentrer i vakuum under dannelse av tittelproduktet i uren form. Rens umiddelbart det urene produkt ved flashkromatografi

(2 x 15 cm kolonne eluert med 1:27 MeOH-CH2Cl2) under dannelse av tittelforbindelsen.

Som anvendt her refererer uttrykket "pasient" til et varmblodig dyr slik som et pattedyr som er angrepet av en bestemt inflammatorisk sykdomstilstand. Det skal forstås at marsvin, hunder, katter, rotter, mus, hester, kveg, sauer og mennesker er eksempler på dyr innen rammen for betydningen av uttrykket.

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" refererer til en mengde som er effektiv ved enkel eller multippel dose-administrering av pasienten, til å tilveiebringe lindring av symptomer assosiert med neutrofil—assosierte inflammatoriske sykdommer. Som anvendt her angir "lindring av symptomer" av en respiratorisk sykdom en reduksjon i strengheten overfor den som forventes i fravær av behandling, og indikerer ikke nødvendigvis en total eliminering eller legning av sykdommen. Ved bestemmelse av den terapeutisk effektive mengde eller dose taes et utall av faktorer i betraktning av den behand-lende lege, innbefattende, men ikke begrenset til: arten av pattedyr; dets størrelse, alder og generelle helse; den spesifikke sykdom som er involvert; graden av eller innbe-fattelsen eller strengheten av sykdommen; responsen av den individuelle pasient; den bestemte forbindelse som administreres; administreringsmåten; biotilgjengelighetskarak-teristika for det administrerte preparat; det valgte dose-regime; anvendelsen av ledsagende medikamentering og andre relevante omstendigheter.

En terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse

av formel (I) er forvénte-fe å variere fra ca. 0,1 milligram pr. kilogram kroppsvekt (mg/kg/dag) til ca. 100 mg/kg/ dag. Foretrukne mengder er forventet å variere fra ca. 0,5 til ca. 10 mg/kg/dag.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er også meget kraftige inhibitorer av elastase, i særdeleshet human neutrofil elastase. Det er antatt at forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviser deres inhiberende effekt via inhibering av enzymelastasen, og tilveiebringer derved lindring av elastase-formidlede sykdommer, innbefattende, men ikke begrenset til, emfysem, cystisk fibrose, voksent respiratorisk nødsyndrom, kronisk bronkitt, inflammatorisk tarmsykdom, septicemia. disseminert intravaskulær koagulasjon, gikt og rheumatoid artritt. Det skal imidlertid forståes at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset av noen bestemt teori eller fore-slått mekanisme for å forklare dens virksomhet i en sluttelig anvendelse.

Ved utførelse av behandling av en pasient angrepet av en sykdomstilstand som beskrevet ovenfor, kan en forbindelse av formel (I) administreres i enhver form eller måte som gjør forbindelsen biotilgjengelig i effektive mengder, innbefattende orale, aerosole og parenterale ruter. Eksempelvis kan forbindelsene av formel (I) administreres oralt, ved forstøvning, subkutant, intramuskulært, intra-venøst, transdermalt, intranasalt, rektalt, topisk og lignende. Oral eller aerosol administrering er generelt foretrukket. Fagmannen vedrørende fremstilling av formuleringer kan lett velge den riktige form og administreringsmåte avhengig av de bestemte karakteristika av den valgte forbindelse og den sykdomstilstand som skal behandles, graden av sykdommen og andre relevante omstendigheter. Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18nde utg. Mack Publishing Co.

(1990) .

Forbindelsene kan administreres alene eller i form av et farmasøytisk preparat i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser, hvis mengde og art bestemmes av løseligheten og de kjemiske egenskaper av den valgte forbindelse, den valgte administreringsrute og standard farmasøytisk praksis. Selv om forbindelsene ifølge oppfinnelsen er effektive i seg selv kan de formuleres og administreres i form av deres farmasøytisk akseptable salter, slik som for eksempel syreaddisjonssalter av stabilitetsformål, hensiktsmessig krystallisering, forøket løselighet og lignende.

I en annen utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse preparater omfattende en forbindelse av

formel (I) i blanding eller på annen måte i assosiasjon i med én eller flere inerte bærere. Disse preparater er for

eksempel anvendbare som prøvestandarder, som hensiktsmessige midler for fremstilling av masseforsendelser eller som farmasøytiske preparater. En målbar mengde av en forbindelse

av formel (I) er en mengde som er lett målbar ved stan-dard prøveprosedyrer og teknikker som vel kjent innen faget. Målbare mengder av en forbindelse av (I) vil generelt variere fra ca. 0,001 % til ca. 7 5 % av preparatet på vektbasis. Inerte bærere kan være ethvert materiale som ikke nedbryter eller på annen måte reagerer kovalent med en forbindelse av formel (I), Eksempler på egnede inerte bærere er vann; vandige buffere slik som de som generelt er anvendbare ved væskekromatografianalyse med høy ytelse (HPLC); organiske løsningsmidler slik som acetonitril, ethylacetat, hexan og lignende; og farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

I særdeleshet tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse av formel (I) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

De farmasøytiske preparater fremstilles på velkjent måte innen det farmasøytiske fag. Bæreren eller eksipiensen kan være et fast, halvfast eller væskeformig materiale som kan tjene som en bærer eller et medium for den aktive bestanddel. Egnede bærere eller eksipienser er vel kjent innen faget. Det farmasøytiske preparat kan være tilpasset for oral, parenteral eller topisk bruk og kan administreres til pasienten i form av tabletter, kapsler, stikkpiller, løsnin-ger, suspensjoner eller lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt, for eksempel med et inert fortynningsmiddel eller med en spiselig bærer. De kan være innelukket i gelatinkapsler eller sammenpresset til tabletter. For oral terapeutisk administrering kan forbindelsene inkorporeres med eksipienser og anvendes i form av tabletter, pastiller, kapsler, eliksi-rer, suspensjoner, siruper, kjeks, tyggegummi og lignende. Disse preparater skal inneholde minst 4 % av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, den aktive bestanddel, men kan varieres avhengig av den bestemte form, og kan hensiktsmessig være mellom 4 % til 70 % av vekten av enheten. Mengden av forbindelsen tilstedeværende i preparater er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles slik at en oral doseringsenhets-form inneholder mellom 5,0 - 300 milligram av forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Tablettene, pillene, kapslene, pastillene og lignende kan også inneholde én eller flere av følgende adjuvanser: Bindemidler slik som mikrokrystallinsk cellulose, gummi-tragant eller gelatin; eksipienser slik som stivelse eller laktose, oppbrytende midler slik som alginsyre, "Primogel", maisstivelse og lignende;- smøremidler slik som magnesium-stearat eller "Sterotex"; glidemidler slik som kolloidalt siliciumdioxyd; og søtningsmidler slik som sukrose eller sakkarin kan tilsettes, eller et smaksgivende middel slik som peppermynte, methylsalicylat eller appelsinsmak. Når doseringsenhetsformen er en kapsel kan den i tillegg til materialer av den ovenfor angitte type inneholde en væskeformig bærer slik som polyethylenglykol eller en fettolje. Andre doseringsenhetsformer kan inneholde andre forskjellige materialer som modifiserer den fysikalske form av doserings-enheten, for eksempel som belegg. Således kan tabletter eller piller belegges med sukker, skjellakk eller andre enteriske belegningsmidler. En sirup kan i tillegg til foreliggende forbindelser inneholde sukrose som et søtnings-middel og visse konserveringsmidler, farvestoffer og smaksgivende midler. Materialer ved fremstilling av disse forskjellige preparater skal være farmasøytisk rene og ikke-toksiske i de anvendte mengder.

For parenteral terapeutisk administrering kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inkorporeres i en løsning eller suspensjon. Disse preparater skal inneholde minst 0,1 % av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, men kan varieres til å være mellom 0,1 og ca. 50 % av vekten derav. Mengden av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som er til stede i slike preparater er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles slik at en parenteral doseringsenhet inneholder mellom 5,0 og 100 milligram av forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Forbindelsene av formel (I) ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres med aerosol. Uttrykket aerosol anvendes for å angi et utall av systemer varierende av kolloidal art til systemer bestående av komprimerte for-pakninger. Avlevering kan skje med en forvæsket eller komprimert gass eller, med et egnet pumpesystem som avgir de aktive bestanddeler. Aerosoler av forbindelsene av formel (I)-(IV) kan avgis i enkel fase, bi-fase eller tri-fasé-systemer for å avgi den aktive bestanddel. Utlevering av aerosolen innbefatter den nødvendige beholder, aktivatorer, ventiler, underbeholdere og lignende. Foretrukne -aerosoler kan utvelges av fagmannen.

Forbindelsene av formel (I) ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk, og når dette foretas omfatter bæreren hensiktsmessig en løsning, salve eller gelbase.

Basen kan for eksempel omfatte Sn eller flere av følgende: petrolatum, lanolin, polyethylenglykoler, bivoks, mineral-olje, fortynningsmidler slik som vann og alkohol, og emul-ger ingsmidler og stabilisatorer. Topiske formuleringer kan inneholde en konsentrasjon av formel I eller dens farmasøytis-ke salt på fra 0,1 til ca. 10 % w/v (vekt pr. enhetsvolum).

Løsningene eller suspensjonene kan også innbefatte én eller flere av følgende adjuvanser: sterile fortynningsmidler slik som vann for injeksjon, saltvannsløsning, fett-oljer, polyethylenglykoler, glycerol, propylenglykol eller andre syntetiske løsningsmidler; antibakterielle midler slik som benzylalkohol eller methylparaben; antioxidanter slik som ascorbinsyre eller natriumbisulfitt; chelaterénde midler slik som ethylendiamintetraeddiksyre; buffere slik som acetater, citrater eller fosfater, og midler for juste-ring av tonisiteten slik som natriumklorid eller dextrose. Det parenterale preparat kan være innelukket i ampuller, engangssprøyter eller multiple doseampuller fremstilt av glass eller plast.

Human neutrofil elastase bestemmes in vitro under anvendelse av N-MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid, tilgjengelig kommersielt som substrat. Prøvebufferen, pH og utprøvningsteknikkene er lik de som er beskrevet av Mehdi et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 166, 595 (1990). Enzym renses fra humant sputum, selv om det nylig er blitt kommersielt tilgjengelig. Kinetisk karakterisering av umiddelbare inhibitorer foretas ved hjelp av Dixon-kurven, mens karakterisering av langsomt- og/eller tett-bindende inhibitorer gjør bruk av dataanalyseteknikker gjennomgått av Williams og Morrison. Syntesen og analytisk anvendelse av et høysensitivt og hensiktsmessig substrat av elastase er beskrevet i J. Bieth, B. Spiess and C.G. Wermuth, Biochemical Medicine, 11 (1974) 350-375. Tabell 2 sammenfatter evnen av utvalgte forbindelser ifølge oppfinnelsen til å inhibere elastase. I tabellen angir MCBz 4-(4-morfolinylcarbonyl)benzoyl og Pyr angir 3-(3-pyridyl)propa-noyl.

In vivo utprøvninger

Intratrakealt drypp av HNE i gnagere resulterer i akutt lungeskade som lett kan kvantifiseres ved måling av hemoglobin ("Hgb") i den bronkiale utskillingsvæske ("BAL");

Fletcher, D.S., et al., Am.Rev.Resp.Dis. 141, 672-677 (.1990). Virksomheten av forbindelsene av formel (I)-(IV) til å redusere pulmonar blødning og/eller utvise inhibering av human neutrofil elastase ("HNE") in vivo kan vises ved den pulmonare blødningsmodell i gnagere som illustrert i Fletcher, D.S., et al., Id. og Shah, S.K., et al., j.Med. Chem. 35, 3745-3754 (1992).

Eksempelvis kan hamstere forbehandles med N-[3-(3-pyridyl)propanoyl]-L-valyl-N'-[3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1-methylethyl)-2-oxobutyl]-L-prolinamid ("Pyr-Val-Pro-Val-CF2CF3") (10, 25 eller 50 mg/kg, oral administrering) 30 minutter før utfordring med HNE (20 ug, intratrakeal administrering). Dyrene kan avlives 1 time etter utfordring. For hamstere gitt en 25 mg/kg oral dose av Pyr-Val-Pro-Val-CF2CF3 30 minutter før intratrakeal utfordring med HNE, ble en 67 + 6 % inhibering av HNE-fremkalt pulmonar blødning som målt ved BAL Hgb, observert.

Claims (10)

1. Forbindelse, karakterisert ved formelen hvori PL er Val eller Nva; P2 er Pro, Tic eller Tea; P3 er Val, Nva, Ala eller bAla; og P« er Ala eller en binding, eller et hydrat, isoster eller farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Px er vai; ps er Va^ °9<p>* er en binding.

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at forbindelsen er N-[3-(3-pyridyl)propanoyl]-L-valyl-N*- [3,3,4,4,4-pentafluor-1-(1-methyl-ethyl) -2-oxobutyl]-L-prolinamid.

4. Forbindelse, karakterisert ved formelen eller et hydrat, isoster eller farmasøytisk akseptabelt salt derav, hvori Rx er -CH(CH3)2; P2 er Pro, Pip, Pro(4-0Bzl) eller Aze; P3 er Ile, Val eller Ala; P4 er Ala eller en binding, X<1> er -CF2CF2CF3 eller -CF2CF2CF2CF3; og K er

5. Forbindelse ifølge krav 4, karakterisert ved atP2er Pro; P3 er Val; og P* er en binding.

6. Preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 eller 4 og en bærer.

7. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 eller 4 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge ett av kravene 1-5, eventuelt i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer, for fremstilling av en human neutrofil elastaseinhibitor, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en neutrofil-assosiert inflammatorisk sykdom, eller for behandling av emfysem.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 eller 4, omfattende trinnene: (a) kopling av en aminosyreester av formelen NH2-CH (Ri) C (=0) 0R2 hvori R2 er Ci-6-alkyl, med et egnet. N-beskyttet peptid av formelen K<1->P,j-P3-P2-OH, hvori K' er i nærvær av et egnet kopl ing smi ddel og i nærvær av et egnet koplings løsningsmiddel for å gi en egnet N-beskyttet peptidester; (b) omsetning av den egnede N-beskyttede peptidester med et egnet per f luoreringsmiddel i nærvær av en egnet alkalimetallbase og et egnet vannfritt løsningsmiddel.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse ifølge krav 1 eller 4, omfattende trinnene: (a) omsetning av en egnet beskyttet aminosyreester av formelen Pg-NH-CH (Ri) C (=0) OR2 hvori R2 er Ci,6-alkyl og Pg er en egnet beskyttende gruppe, med et egnet perfluoreringsmiddel i nærvær av en egnet alkalimetallbase og et egnet vannfritt løsningsmiddel for å gi et egnet N-beskyttet perfluoralkylketon; (b) avbeskyttelse av det egnede N-beskyttede perfluoralkylketon med et egnet avbeskyttelsesmiddel i nærvær av et egnet organisk løsningsmiddel for å gi perfluoralkylketon; (c) kopling av perfluoralkylketonet med et egnet beskyttet peptid av formelen K' -P4-P3-P2-OH i nærvær av et egnet koplingsmiddel og i nærvær av et egnet koplingsløsningsmiddel.